DE69530625T2

DE69530625T2 - Reagenz zur Klassifizierung von Leukozyten

Info

Publication number: DE69530625T2
Application number: DE69530625T
Authority: DE
Inventors: Mami Ikeda; Yutaka Nagai; Katsuhiro Tsuchiya
Original assignee: Nihon Kohden Corp
Current assignee: Nihon Kohden Corp
Priority date: 1994-10-31
Filing date: 1995-10-31
Publication date: 2003-10-16
Anticipated expiration: 2015-11-01
Also published as: EP1006361A3; EP1052509B1; EP1006361A2; DE69529431T2; DE69521476T2; EP0709674A2; EP1052509A2; EP0709674A3; JP3324050B2; DE69530625D1; EP1058115B1; DE69529431D1; JPH08129012A; DE69530627T2; EP1058115A3; EP1006361B1; EP0709674B1; US5747343A; EP1058115A2; DE69530627D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reagens, das auf dem Gebiet der klinischen Untersuchung für die Klassifizierung von Blutzellen verwendet wird, insbesondere ein Reagens zum Verwenden in einer Methode für die Klassifizierung von Leukozyten, in welcher Blutzellen nach Lyse der Erythrozyten optisch gemessen werden, wobei ein Durchflusszytometer verwendet wird.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

In einer allgemein verwendeten Methode für die Klassifizierung und das Zählen von Leukozyten wird ein Erythrozytenlysewirkstoff (im weiteren als hämolytischer Wirkstoff bezeichnet), hauptsächlich bestehend aus einem quaternären Ammoniumsalz als kationischer oberflächenaktiver Stoff, zu einer verdünnten Blutlösung gegeben, um Membranen und zytoplasmatische Inhalte der Erythrozyten und Leukozyten aufzulösen, und die verbleibenden Leukozytenzellkerne werden gemessen, basierend auf der Coulterschen Theorie zur Zählung der Anzahl der Leukozyten. Da die Leukozyten in der geschrumpften Form betrachtet werden, hat diese Methode das Problem, dass Information zur Klassifizierung der Leukozyten nicht erhalten werden kann.
In einer Methode, die mit dem Ziel entwickelt wurde, dieses Problem durch Verbessern der Bestandteile des hämolytischen Wirkstoffs und ihrer Konzentrationen und Verlangsamen der Reaktion der Leukozyten zu lösen, werden Leukozyten in drei Gruppen, d. h. Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten klassifiziert, basierend auf dem Unterschied ihrer Lyserate und elektrischen Leitfähigkeit. Allerdings wurde in den vergangenen Jahren großes Gewicht auf die Entwicklung einer Methode gelegt, welche Leukozyten in fünf Gruppen, umfassend Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Eosinophile und Basophile, oder mindestens vier Gruppen, mit Ausnahme von Basophilen, klassifizieren kann, weil solch eine Methode durch Zählen der Blutleukozyten als individuelle Gruppen zur Diagnose von Krankheiten beitragen kann.
Andererseits wurde ein Durchflusszytometer für die Identifizierung und Analyse von Zellen und feinen Partikeln, basierend auf Lichtstreuung, verwendet. Wie in Abb. 10 gezeigt, ist ein Durchflussanalysierer 4 dieses zeilmessenden Gerätes (Durchflusszytometer) dafür bestimmt, die Streuung von Probenpartikeln zu messen. Eine Probenlösung, die zu messende Partikel enthält, wird in den Durchflussanalysierer 4 eingeführt, in welchem Laserstrahlen, die von einer Laserquelle 1 erzeugt werden, durch Strahlungsstreuungslinsen 2 und 3 gestrahlt werden, die Vorwärtsstreuung nach Stoppen des direkten Lichts durch einen Strahlungslichtstopper wird durch einen Vorwärtsstreuungsdetektor 9 über eine Vorwärtsstreuungsdetektionslinse 8 gemessen, und die durch den Detektor gemessene Spannungshöhe wird im Analysierer 10 aufgezeichnet. Andererseits wird die seitliche Streuung im Durchflussanalysierer 4 durch einen Seitenstreuungsdetektor 6 über eine Seitenstreuungsdetektionslinse 5 gemessen, und die vom Detektor gemessene Spannungshöhe wird im Analysierer 10 aufgezeichnet. Basierend auf den beiden Spannungshöhen im Analysierer 10 wird ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm (Streudiagramm) der Vorwärtsstreuung und der seitlichen Streuung auf einer Anzeigevorrichtung 11 angezeigt.
Eine solche Messung durch ein Durchflusszytometer kann zwar die Anzahl der Leukozyten zählen, es kann sie aber kaum in drei Gruppen klassifizieren, weil Leukozytenmembranen in signifikanter Menge lysiert werden, wenn der oben beschriebene hämolytische Wirkstoff verwendet wird, der sich hauptsächlich aus einem quaternären Ammoniumsalz als oberflächenaktiver Stoff zusammensetzt.
In einer Methode, in welcher Leukozyten durch Messen der Vorwärtsstreuung und seitlichen Streuung klassifiziert werden, wobei ein Durchflusszytometer verwendet wird, werden Leukozyten durch Zugeben eines hämolytischen Wirkstoffs, der Ammoniumoxalat als Hauptbestandteil enthält, zu einer verdünnten Blutlösung zum Bewirken einer selektiven Lyse von Erythrozyten in drei Gruppen, d. h. Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten, klassifiziert. Diese Methode benötigt allerdings 20 bis 30 Minuten für die Lyse der Erythrozyten, so dass sie nicht als eine Methode zur Behandlung einer großen Anzahl von Proben verwendet werden kann. Da die Verteilung jeder Leukozytengruppe nicht klar ist und Eosinophile in die Verteilung der Neutrophilen eingeschlossen sind, kann diese Methode außerdem Eosinophile nicht als einzelne Verteilung isolieren.
Um die oben beschriebenen Probleme zu lösen, wurde ein Leukozytenklassifizierungswirkstoff vorgeschlagen (cf. WO 88/09504), welcher mindestens einen oberflächenaktiven Stoff (im Folgenden manchmal nur als "aktiver Stoff" bezeichnet), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus polyoxyethylenhaltigen anionischen aktiven Stoffen und polyoxyethylenhaltigen nichtionischen aktiven Stoffen, enthält und welcher Leukozyten in drei bis fünf Gruppen klassifizieren kann.
Beide dieser polyoxyethylenhaltigen anionischen und nichtionischen aktiven Stoffe werden allgemein durch die Formel
R&sub1;-R&sub2;-(CH&sub2;CH&sub2;O)nA
wiedergegeben, worin R&sub1; eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 10 bis 22 Kohlenstoffatomen bedeutet, R&sub2; O,
oder COO bedeutet,
n eine ganze Zahl von 8 bis 30 ist, und A SO&sub3;Na, COONa, OSO&sub3;Na oder ONa im Fall eines anionischen aktiven Stoffs oder H im Fall eines nichtionischen aktiven Stoffs bedeutet.
Somit hat es eine relativ große Ethylenoxidadditionsmolzahl von 8 bis 30. So eine große Ethylenoxidadditionsmolzahl bedingt eine Verminderung der zytolytischen Aktivität. Wenn ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm erhalten wird, basierend auf den Ergebnissen der Messungen durch RF- und DC-Methoden unter Verwendung dieses Reagenzes, ist außerdem die Trennung von Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten schlecht und Eosinophile können nicht zur selben Zeit gemessen werden.
EP-0 424 871 bezieht sich auf eine Methode und ein Reagens zum Messen der Hämoglobinkonzentration und zum Zählen der Anzahl der Leukozyten in einer Blutprobe. Das offenbarte Reagens umfasst mindestens ein quaternäres Ammoniumsalz und mindestens eine kationische, nichtionische oder amphotere oberflächenaktive Substanz. Insbesondere ist Lauryldimethylaminoessigsäurebetain offenbart.
EP-0 316 453 bezieht sich auf eine Methode und ein Reagens zum Klassifizieren von Leukozyten. Das offenbarte Reagens umfasst mindestens eine oberflächenaktive Substanz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) einer oberflächenaktiven Substanz einer ersten Gruppe, welche eine anionische oberflächenaktive Substanz auf Polyoxyethylenbasis ist, und (b) einer oberflächenaktiven Substanz einer zweiten Gruppe, welche eine nichtionische oberflächenaktive Substanz auf Polyoxyethylenbasis ist. Die anionischen oberflächenaktiven Substanzen auf Polyoxyethylenbasis sind durch die allgemeine Formel R&sub1;-R&sub2;-(CH&sub2;CH&sub2;O)n-X wiedergegeben, wobei n eine ganze Zahl von 8 bis 30 ist.
EP-0 214 613 bezieht sich auf eine Methode und ein Reagens zum Bestimmen einer differenziellen Zählung weißer Blutzellen. Das offenbarte Reagens umfasst Formaldehyd oder Paraformaldehyd, einen oberflächenaktiven Zucker oder Zuckeralkohol und einen Puffer. Die offenbarten oberflächenaktiven Substanzen umfassen z. B. anionische oberflächenaktive Substanzen wie etwa Alkalimetalldodecylsulfate.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Leukozytenklassifizierungsreagens (einen hämolytischen Wirkstoff) bereit zu stellen, welches Erythrozyten innerhalb eines kurzen Zeitraums lysiert, wenn es zu einer Blutprobenlösung zugegeben wird.
Eine weitere Aufgabe ist, ein Verfahren zum Klassifizieren von Leukozyten unter Verwendung dieses Leukozytenklassifizierungsreagenzes bereit zu stellen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

In Anbetracht des Vorstehenden ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Leukozytenklassifizierungsreagens (einen hämolytischen Wirkstoff) bereit zu stellen, welches Erythrozyten innerhalb eines kurzen Zeitraums lysiert, wenn es zu einer Blutprobenlösung zugegeben wird, aber die Leukozyten während eines bestimmten Zeitraums nicht beschädigt, wobei sie ihren ursprünglichen Zustand oder annähernd den ursprünglichen Zustand beibehalten, so dass die Leukozyten durch Messen der Vorwärtsstreuung und seitlichen Streuung mittels eines Durchflusszytometers nach der Lyse der Erythrozyten direkt in vier Gruppen, nämlich Lymphozyten, Monozyten, Eosinophile und Neutrophile klassifiziert werden können.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Leukozytenklassifizierungsreagens bereit, welches mindestens einen oberflächenaktiven Stoff, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anionischen aktiven Stoffen und amphoteren aktiven Stoffen, in einer Menge enthält, die zum Klassifizieren von Leukozyten in einer Blutprobe durch Lysieren von Erythrozyten und Einwirken auf Leukozyten wirksam ist. Der vorstehend beschriebene amphotere aktive Stoff ist ein 2-Alkyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazoliniumbetain, das durch die Formel (4) wiedergegeben wird:
worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 6 bis 21 Kohlenstoffatomen bedeutet. Speziell ist der amphotere aktive Stoff 2-Alkyl(C&sub8;H&sub1;&sub7;-C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub7;)-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazoliniumbetain. Speziell ist der vorstehende anionische aktive Stoff ein anionischer aktiver Stoff vom Alkylsulfat-Typ, der durch die Formel (1) wiedergegeben wird:
R-O-SO&sub3;X (1)
worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 8 mit 18 Kohlenstoffatomen bedeutet und X Na, K, NH&sub4; oder HN(CH&sub2;CH&sub2;OH)&sub3; bedeutet;
oder ein polyoxyethylenhaltiger anionischer aktiver Stoff, der durch die Formel (2) wiedergegeben wird:
R-O-(CH&sub2;CH&sub2;O)n-SO&sub3;X (2)
worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen bedeutet, n eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist und X Na, K, NH&sub4; oder HN(CH&sub2;CH&sub2;OH)&sub3; bedeutet. Genauer gesagt wird der polyoxyethylenhaltige anionische aktive Stoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natriumpolyoxyethylen(3)-C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub3;-alkylethersulfat, Natriumpolyoxyethylen(3)-C&sub1;&sub1;&submin;&sub1;&sub5;-alkylethersulfat, Polyoxyethylen(3)alkyl-C&sub1;&sub1;&submin;&sub1;&sub5;-alkylethertriethanolamin und Natriumlaurylsulfat. Der anionische aktive Stoff kann auch ein anionischer aktiver Stoff vom Kokosfettsäure-Typ sein, welcher durch die Formel (3) wiedergegeben wird:
worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen bedeutet, X CH&sub2;SO&sub3; oder COO bedeutet und Y Na, K, NH&sub4; oder HN(CH&sub2;CH&sub2;OH)&sub3; bedeutet. Speziell ist der anionische aktive Stoff vom Kokosfettsäure-Typ Natriumkokosfettsäuremethyltaurin oder Natriumkokosfettsäuresarcosin.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Abb. 1 ist ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm, in welchem Natriumpolyoxyethylen(3)-C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub3;-alkylethersulfat als hämolytischer Wirkstoff verwendet wurde.
Abb. 2 ist ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm, in welchem Natriumpolyoxyethylen(3)-C&sub1;&sub1;&submin;&sub1;&sub5;-alkylethersulfat als hämolytischer Wirkstoff verwendet wurde.
Abb. 3 ist ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm, in welchem Natriumlaurylsulfat als hämolytischer Wirkstoff verwendet wurde.
Abb. 4 ist ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm, in welchem Natriumlaurylsulfat als hämolytischer Wirkstoff verwendet wurde und die Klassifizierung von Leukozyten bei pH 10 durchgeführt wurde.
Abb. 5 ist ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm, in welchem Natriumlaurylsulfat als hämolytischer Wirkstoff verwendet wurde und die Klassifizierung von Leukozyten bei pH 3 durchgeführt wurde.
Abb. 6 ist ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm, in welchem Natriumpolyoxyethylen(3)-C&sub1;&sub1;&submin;&sub1;&sub5;-alkylethersulfat als hämolytischer Wirkstoff verwendet wurde und die Klassifizierung von Leukozyten unter einem osmotischem Druck von 450 mOsm/kg H&sub2;O durchgeführt wurde.
Abb. 7 ist ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm, in welchem Natriumpolyoxyethylen(3)-C&sub1;&sub1;&submin;&sub1;&sub5;-alkylethersulfat als hämolytischer Wirkstoff verwendet wurde und die Klassifizierung von Leukozyten unter einem osmotischem Druck von 220 mOsm/kg H&sub2;O durchgeführt wurde.
Abb. 8 ist ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm, in welchem Natriumkokosfettsäuremethyltaurin als hämolytischer Wirkstoff verwendet wurde.
Abb. 9 ist ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm, in welchem 2-C&sub8;&submin;&sub1;&sub8;-Alkyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazoliniumbetain als hämolytischer Wirkstoff verwendet wurde.
In den oben beschriebenen Abbildungen bedeutet 0 die Erythrozytenhüllen, bedeutet 1 Lymphozyten, bedeutet 2 Monozyten, bedeutet 3 Neutrophile und bedeutet 4 Eosinophile.
Abb. 10 ist eine schematische Abbildung, die das optische System eines Durchflusszytometers zeigt, in welchem das Leukozytenklassifizierungsreagens der vorliegenden Erfindung verwendet wird.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Jeder anionische und amphotere oberflächenaktive Stoff kann in dem Leukozytenklassifizierungsreagens der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sofern sie die Lyse der Erythrozyten innerhalb einer kurzen Zeitspanne ermöglichen, wenn sie zu einer Blutprobenlösung gegeben werden, ohne eine Beschädigung der Leukozyten zu bewirken, um den ursprünglichen Zustand der Leukozyten oder annähernd den ursprünglichen Zustand zu erhalten.
In dem anionischen aktiven Stoff vom Alkylsulfat-Typ, der durch die Formel (1) wiedergegeben wird, hat die Gruppe R vorzugsweise 8 bis 18 Kohlenstoffatome. In dem oben beschriebenen polyoxyethylenhaltigen anionischen aktiven Stoff, der durch die Formel (2) wiedergegeben wird, hat R vorzugsweise 8 bis 18 Kohlenstoffatome und Ethylenoxidadditionsmolzahlen von 1 bis 5. Wasserstoff in der Alkyl- oder Alkenylgruppe R spielt eine bedeutende Rolle bei der Lyse der Zellen. Je länger die Kettenlänge von R ist, desto stärker ist die zytolytische Aktivität, wogegen die zytolytische Aktivität umso schwächer ist, je kürzer die Kette ist. Allerdings wird die Wasserlöslichkeit des oberflächenaktiven Stoffs geringer, wenn die Kettenlänge von R länger wird und der Stoff ist schwach löslich oder macht ein Hämolysat trübe. Die Anzahl der Kohlenstoffatome in der Gruppe R innerhalb des oben beschriebenen Bereichs gleicht diese Fälle miteinander aus. Wenn die durch n wiedergegebene ganze Zahl größer wird, steigt die Hydrophilie des Stoffs an, aber seine zytolytische Aktivität ist reduziert. Die Gruppe X spielt keine besondere Rolle bei der Reaktion an Blutzellen.
Die vorstehende Beschreibung, die sich auf die Kohlenstoffanzahl von R bezieht, gilt auch für den anionischen aktiven Stoff vom Kokosfettsäure-Typ, der durch die Formel (3) wiedergegeben wird, und somit weist dieser Rest vorzugsweise 8 bis 18 Kohlenstoffatome auf. Genau so wie vorstehend beschrieben spielen die beiden Gruppen X und Y in der Formel (3) keine besondere Rolle bei der Reaktion an Blutzellen.
Der amphotere aktive Stoff wirkt, abhängig vom pH-Bereich, als anionischer aktiver Stoff oder als kationischer aktiver Stoff und wirkt als anionischer aktiver Stoff, wenn er als ein hämolytischer Wirkstoff bei einem pH-Wert von 7 oder höher verwendet wird. In dem Betain-artigen amphoteren aktiven Stoff, der durch die Formel (4) wiedergegeben wird, hat R vorzugsweise 6 bis 21 Kohlenstoffatome.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird jede Blutprobe vor der Zugabe eines hämolytischen Wirkstoffs als Leukozytenklassifizierungsreagens mit einem gewöhnlichen Verdünner verdünnt, um eine gleichförmige Verteilung des Blutes zu bewirken. Solch ein Verdünner umfasst ein Mittel zum Einstellen des osmotischen Drucks, eine Puffersubstanz, einen Chelatbildner und einen antimikrobiellen Wirkstoff, aufgelöst in angemessenen Mengen destillierten Wassers, mit der folgenden typischen Zusammensetzung.

Verdünner

Natriumchlorid 9,0 g
Kaliumdihydrogenphosphat 0,91 g
Dinatriumhydrogenphosphat 9,55 g
EDTA 2 Na 0,3 g
Natrium-1-hydroxypyridin-2-thionat 0,25 g
destilliertes Wasser 1000 ml
Das Mittel zum Einstellen des osmotischen Drucks wird verwendet, um den osmotischen Druck der Blutprobenlösungen auf einem solchen Niveau einzustellen, dass die Blutzellen stabil existieren können, d. h. 250 bis 400 mOsm/kg H&sub2;O. Wenn der osmotische Druck höher als dieser Bereich ist, wird die hämolytische Aktivität stark, insbesondere wird die Lyse der Erythrozyten beschleunigt und Neutrophile schrumpfen ein wenig. Wenn andererseits der osmotische Druck niedriger als dieser Bereich ist, wird die hämolytische Aktivität schwach und die Menge der Erythrozytenhüllen (nicht lysierte Erythrozytenreste) wird besonders groß.
Es ist wünschenswert, dass die Puffersubstanz die Blutprobenlösungen innerhalb eines pH-Bereichs von ungefähr 6,8 bis 7,6 halten kann, so dass die Blutzellen stabil existieren können. Wenn jedoch ein hämolytischer Wirkstoff zu einer Blutprobenlösung gegeben wird, muss der pH-Wert innerhalb des Optimumbereichs des Wirkstoffs sein. Folgerichtig ist ein pH-Wert außerhalb des genannten Bereichs anwendbar, unter der Bedingung, dass er nicht das Ziel der vorliegenden Erfindung verhindert.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung kann auch erreicht werden durch vorheriges Zugeben des hämolytischen Wirkstoffs zu dem Verdünner oder durch direktes Zugeben einer angemessenen Menge des oberflächenaktiven Stoffs zu dem Verdünner ohne Verdünnung.
Der anionische aktive Stoff der vorliegenden Erfindung wirkt als hämolytischer Wirkstoff im Allgemeinen innerhalb des pH-Bereichs von 3 bis 11, und der amphotere aktive Stoff innerhalb des pH-Bereichs von 7 bis 11, wobei der Optimumbereich je nach der Art des Wirkstoffs variiert. Wenn der pH-Wert höher als dieser Bereich ist, wird die hämolytische Aktivität stark und bewirkt eine Lyse nicht nur der Erythrozyten, sondern auch der Leukozyten. Wenn andererseits der pH-Wert niedriger als dieser Bereich ist, wird die hämolytische Aktivität schwach, so dass die Trennung der Verteilungen der jeweiligen Leukozytenbestandteile schlecht wird.
Der Chelatbildner wird verwendet, um die Bildung von Chelatverbindungen mit Metallionen zu bewirken, um die Erzeugung eines durch Metallionen verursachten Niederschlags während der Lagerung des Verdünners für eine längere Zeitspanne oder während der Verwendung zu verhindern.
Der antimikrobielle Wirkstoff wird verwendet, um das Wachstum von Schimmelpilzen und Bakterien während langfristiger Lagerung des Verdünners zu verhindern.
Die Menge des hämolytischen Wirkstoffs, welcher den oben beschriebenen oberflächenaktiven Stoff als Hauptbestandteil enthält, welcher zu einer Blutprobe gegeben werden soll, die mit dem oben beschriebenen Verdünner verdünnt wird, variiert abhängig von der Art des oberflächenaktiven Stoffs. Im Allgemeinen nimmt jedoch die Menge der Hüllen zu, wenn die Konzentration des oberflächenaktiven Stoffs in der Blutprobenlösung so niedrig ist, dass die ganzen Erythrozyten nicht lysiert werden können. Andererseits werden nicht nur die Erythrozyten, sondern auch die Leukozyten lysiert, wenn die Konzentration des aktiven Stoffs hoch ist. Zusätzlich variiert die Zeit für die Hämolyse, abhängig von der zugegebenen Menge des hämolytischen Wirkstoffs. Die Zeit der Hämolyse wird kurz, wenn die zugegebene Menge groß ist, aber auch die Stabilitätsperiode der Leukozyten wird kurz. Folgerichtig ist es notwendig, die richtige Menge des zuzugebenden oberflächenaktiven Stoffs auszuwählen. Der Fachmann kann leicht die angemessene Konzentration des oberflächenaktiven Stoffs bestimmen. Zum Beispiel kann 1 ml eines hämolytischen Wirkstoffs, der durch Auflösen des polyoxyethylenhaltigen anionischen aktiven Stoffs, der durch die vorstehend beschriebene Formel (2) wiedergegeben wird, in destilliertem Wasser bis zu einer Konzentration von 0,05% hergestellt wird, zu einer Blutprobe gegeben werden, die durch Verdünnen von 50 ul Vollblut mit 2 ml des oben beschriebenen Verdünners erhalten wird. Die Menge des hämolytischen Wirkstoffs sollte abhängig von dem Verdünnungsverhältnis des Bluts und der Konzentration des oberflächenaktiven Stoffs bestimmt werden.
Beispiele der vorliegenden Erfindung sind im Folgenden zur Veranschaulichung angegeben.

BEISPIEL 1 (Beispiel, das nicht unter den Umfang der Ansprüche fällt)

Ein polyoxyethylenhaltiger anionischer aktiver Stoff, Natriumpolyoxyethylen(3)alkyl- (C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub3;-Gemisch)ethersulfat (C&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub3;-O-(CH&sub2;CH&sub2;O)&sub3;-SO&sub3;Na) wurde in diesem Beispiel als hämolytischer Wirkstoff verwendet.
Eine 1,75 g-Menge dieses anionischen aktiven Stoffs wurde in 1000 ml destilliertem Wasser aufgelöst, um als hämolytischer Wirkstoff zu dienen (wenn notwendig, kann eine angemessene Menge Natriumchlorid zu dem destillierten Wasser gegeben werden, zur Einstellung des osmotischen Drucks).
Eine 25 ul-Menge einer Blutprobe wurde mit 1 ml eines Verdünners verdünnt, welcher die folgende Zusammensetzung hat.
Natriumchlorid 9,0 g
Kaliumdihydrogenphosphat 0,91 g
Dinatriumhydrogenphosphat 9,55 g
EDTA 2 Na 0,3 g
Natrium-1-hydroxypyridin-2-thionat 0,25 g
destilliertes Wasser 1000 ml
Dann wurden 125 ul des oben genannten hämolytischen Wirkstoffs dazu gegeben. 10 Sekunden danach wurde die Stärke der Vorwärtsstreuung und der seitlichen Streuung gemessen, wobei ein Durchflusszytometer verwendet wurde, um ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm (Streudiagram) von Abb. 1 zu erhalten.
Wie in Abb. 1 gezeigt ist, wurden die Leukozyten klar in vier Gruppen klassifiziert, d. h. Lymphozyten (1), Monozyten (2), Neutrophile (3) und Eosinophile (4). In dieser Zeichnung stellt (0) die Erythrozytenhüllen dar.
Zusätzlich wurden dem in Abb. 1 gezeigten Diagramm entsprechende zweidimensionale Verteilungsdiagramme erhalten, wenn der oben beschriebene hämolytische Wirkstoff (Konzentration 0,175%) zu der oben beschriebenen verdünnten Blutlösung, innerhalb eines Bereichs von 100 bis 1000 ul, gegeben wurde. In diesem Fall kann das Ziel der vorliegenden Erfindung auch durch Zugeben des hämolytischen Wirkstoffs zu dem Verdünner im Voraus oder durch Zugeben einer angemessenen Menge des oben beschriebenen oberflächenaktiven Stoffs direkt zu dem Verdünner ohne Verdünnung erreicht werden.
Der oberflächenaktive Stoff aus diesem Beispiel wies das gleiche Ergebnis, wie in Abb. 1 gezeigt, innerhalb des pH-Bereichs von 3 bis 10 auf.
Hinsichtlich des osmotischen Drucks wurde das gleiche Ergebnis, wie in Abb. 1 gezeigt, auch innerhalb des Bereichs von 250 bis 400 mOsm/kg H&sub2;O erreicht.

BEISPIEL 2 (Beispiel, das nicht unter den Umfang der Ansprüche fällt)

Eine Klassifizierung von Leukozyten wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass ein polyoxyethylenhaltiger anionischer aktiver Stoff, Natriumpolyoxyethylen(3)alkyl(C&sub1;&sub1;&submin;&sub1;&sub5;-Gemisch)ethersulfat, als ein hämolytischer Wirkstoffbestandteil verwendet wurde und 2,5 g dieses anionischen aktiven Stoffs in 1000 ml destilliertem Wasser aufgelöst wurde, um als hämolytischer Wirkstoff verwendet zu werden, mit den Ergebnissen, die in Abb. 2 gezeigt sind. Als Ergebnis wurden die Leukozyten klar in vier Gruppen klassifiziert, ähnlich wie im Fall von Beispiel 1. Weiterhin wurden die gleichen Ergebnisse, gezeigt in Abb. 2, innerhalb des Zugabebereichs von 50 bis 300 ul (im Fall von 0,25% hämolytischen Wirkstoff), innerhalb des pH-Bereichs von 6 bis 10 und innerhalb des osmotischen Druckbereichs von 250 bis 400 mOsm/kg H&sub2;O, ähnlich wie im Fall von Beispiel 1 erhalten.

BEISPIEL 3 (Beispiel, das nicht unter den Umfang der Ansprüche fällt)

Eine Klassifizierung von Leukozyten wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass ein polyoxyethylenhaltiger anionischer aktiver Stoff, Natriumlaurylsulfat (C&sub1;&sub2;H&sub2;&sub5;OSO&sub3;Na) als aktiver Bestandteil des hämolytischen Wirkstoffs verwendet wurde und 5,0 g dieses anionischen aktiven Stoffs in 1000 ml destilliertem Wasser aufgelöst wurden, um als hämolytischer Wirkstoff verwendet zu werden, mit den in Abb. 3 gezeigten Ergebnissen. Als Ergebnis wurden die Leukozyten klar in vier Gruppen klassifiziert, ähnlich wie im Fall von Beispiel 1. Im Fall von 0,5% hämolytischen Wirkstoff wurden ferner die gleichen Ergebnisse, wie in Abb. 3 gezeigt, innerhalb des Zugabebereichs von 50 bis 200 ul, innerhalb des pH-Bereichs von 5 bis 8 und innerhalb des osmotischen Druckbereichs von 250 bis 400 mOsm/kg H&sub2;O, ähnlich wie im Fall von Beispiel 1 erhalten.

BEISPIEL 4 (Beispiel, das nicht unter den Umfang der Ansprüche fällt)

Es wurden Leukozytenklassifizierungstests auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 bis 3 beschrieben durchgeführt, wobei zwei Arten des polyoxyethylenhaltigen anionischen aktiven Stoffs verwendet wurden, der durch die oben beschriebene Formel (2) wiedergegeben wird, worin R 8 und 18 Kohlenstoffatome hat und n in beiden Arten 3 ist. In beiden Fällen wurden Streudiagramme ähnlich wie die in Abb. 1 bis 3 abgebildeten erhalten, in welchen Leukozyten klar in vier Gruppen, d. h. Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile und Eosinophile klassifiziert wurden.

VERGLEICHSBEISPIEL 1

Die Wirkungen der pH-Werte 10 und 3 auf die Klassifizierung von Leukozyten wurden geprüft, wobei ähnlich wie im Fall von Beispiel 3 Natriumlaurylsulfat als der aktive Bestandteil des hämolytischen Wirkstoffs verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in den Abb. 4 bzw. 5 gezeigt. Wie aus den in Abb. 4 gezeigten Ergebnissen ersichtlich ist, wird nur ein kaum messbares zweidimensionales Verteilungsdiagramm bei pH 10 erhalten, weil die hämolytische Aktivität zu stark wird, so dass Leukozyten und Erythrozyten zur selben Zeit lysiert werden. Andererseits wird, wie in Abb. 5 gezeigt ist, die hämolytische Aktivität bei pH 3 zu schwach, so dass befriedigende Ergebnisse aufgrund der schwachen Trennung der Leukozyten nicht erhalten wurden.

VERGLEICHSBEISPIEL 2

Die Wirkungen der osmotischen Drücke von 450 und 220 mOsm/kg H&sub2;O auf die Klassifizierung von Leukozyten wurden geprüft, wobei ähnlich wie im Fall von Beispiel 2 Natriumpolyoxyethylen(3)alkyl(C&sub1;&sub1;&submin;&sub1;&sub5;-Gemisch)ethersulfat als der aktive Bestandteil des hämolytischen Wirkstoffs verwendet wurde. Bei einem osmotischen Druck von 450 mOsm/kg H&sub2;O wurde die hämolytische Aktivität so stark, dass die Lyse der Erythrozyten besonders zügig erfolgte, aber auch die Lyse der Leukozyten erfolgte, und die Neutrophilen schrumpften ein wenig, so dass nur ein kaum messbares zweidimensionales Verteilungsdiagramm erhalten wurde, wie in Abb. 6 gezeigt ist, ähnlich wie im Fall des hohen pH-Werts, der in Abb. 4 gezeigt ist. Bei einem osmotischen Druck von 220 mOsm/kg H&sub2;O, wurde die hämolytische Aktivität andererseits so schwach, dass die Menge der Erythrozytenhüllen besonders groß wurde und die Ergebnisse deshalb nicht befriedigend waren, wie in Abb. 7 gezeigt ist.
Die gleichen Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Alkylgruppe R und die Ethylenoxidmolzahl n außerhalb der oben genannten Bereiche sind.

BEISPIEL 5 (Beispiel, das nicht unter den Umfang der Ansprüche fällt)

Ein anionischer aktiver Stoff vom Kokosfettsäure-Typ, Natriumkokosfettsäuremethyltaurin (R-CON(CH&sub3;)CH&sub2;CH&sub2;SO&sub3;Na) wurde als der aktive Bestandteil des hämolytischen Wirkstoffs verwendet.
Eine 5,8 g-Menge dieses anionischen aktiven Stoffs wurde in 1000 ml destillierten Wassers aufgelöst, um als hämolytischer Wirkstoff zu dienen (wenn notwendig, kann eine angemessene Menge Natriumchlorid zu dem destillierten Wasser gegeben werden, um den osmotischen Druck ähnlich wie im Fall von Beispiel 1 einzustellen).
Durch Wiederholen des Verfahrens von Beispiel 1 wurde ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm erhalten, das in Abb. 8 gezeigt ist.
Als Ergebnis wurden die Leukozyten klar in vier Gruppen klassifiziert, d. h. Lymphozyten (1), Monozyten (2), Neutrophile (3) und Eosinophile (4). In dieser Abbildung stellt (0) Erythrozytenhüllen dar.
Ähnlich wie im Fall von Beispiel 1 wurden, wenn der aktive Stoff in einer Konzentration von 0,58% verwendet wurde, dieselben Ergebnisse, die in Abb. 9 gezeigt sind, innerhalb des Zugabebereichs von 50 bis 300 ul, innerhalb des pH-Bereichs von 6 bis 9 und innerhalb des osmotischen Druckbereichs von 250 bis 400 mOsm/kg H&sub2;O erhalten.

BEISPIEL 6

Ein Betain-artiger amphoterer aktiver Stoff, 2-Alkyl(C&sub8;H&sub1;&sub7;-C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub7;-Gemisch)-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazoliniumbetain, das durch die folgende Formel wiedergegeben wird:
wurde als aktiver Bestandteil des hämolytischen Wirkstoffs verwendet.
Eine 3,6 g-Menge dieses amphoteren aktiven Stoffs wurde in 1000 ml destillierten Wassers aufgelöst, um als hämolytischer Wirkstoff zu dienen.
Durch Wiederholen des Verfahrens von Beispiel 5 würde ein zweidimensionales Verteilungsdiagramm erhalten, das in Abb. 9 gezeigt ist.
Als Ergebnis wurden die Leukozyten klar in vier Gruppen klassifiziert, ähnlich wie im Fall der Beispiele 1 bis 5.
Ebenfalls ähnlich wie im Fall von Beispiel 5 wurden, wenn der aktive Stoff in einer Konzentration von 0,36% verwendet wurde, die selben Ergebnisse, die in Abb. 9 gezeigt sind, innerhalb des Zugabebereichs von 75 bis 200 ul, innerhalb des pH-Bereichs von 7 bis 11 und innerhalb des osmotischen Druckbereichs von 250 bis 400 mOsm/kg H&sub2;O erhalten.

BEISPIEL 7

Leukozytenklassifizierungstests wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt, wobei zwei verschiedene Betain-artige amphotere aktive Stoffe verwendet wurden, die durch die oben beschriebene Formel (4), in welcher R 6 oder 21 Kohlenstoffatome hat, wiedergegeben werden. In beiden Fällen wurden zweidimensionale Verteilungsdiagramme, ähnlich wie die in Abb. 9 gezeigten, erhalten, in welchen Leukozyten klar in vier Gruppen, d. h. Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile und Eosinophile, klassifiziert wurden.
Deshalb kann gemäß der vorliegenden Erfindung das erfindungsgemäße Leukozytenklassifizierungsreagens Erythrozyten innerhalb einer kurzen Zeitspanne lysieren, wenn es zu einer verdünnten Blutlösung gegeben wird, aber es verursacht keine Beschädigung der Leukozyten, so dass der ursprüngliche Zustand der Leukozyten oder annähernd der ursprüngliche Zustand für eine gewisse Zeitspanne erhalten werden kann, und die Leukozyten können deshalb direkt in vier Gruppen durch einfache Verfahren und Konstruktionen klassifiziert werden, wobei somit große Wirkungen auf dem Gebiet der klinischen Untersuchung ausgeübt werden.

Claims

1. Leukozytenklassifizierungsreagens, welches mindestens einen oberflächenaktiven Stoff, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus amphoteren aktiven Stoffen, in einer Menge enthält, die zum Klassifizieren von Leukozyten durch Lysieren von Erythrozyten und Einwirken auf Leukozyten wirksam ist, wobei der amphotere aktive Stoff ein 2-Alkyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazoliniumbetain ist, das durch die Formel (4) wiedergegeben wird:

worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 6 bis 21 Kohlenstoffatomen bedeutet.

2. Reagens gemäß Anspruch 1, das weiterhin mindestens einen oberflächenaktiven Stoff, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anionischen aktiven Stoffen, in einer Menge umfasst, die zum Klassifizieren von Leukozyten durch Lysieren von Erythrozyten und Einwirken auf Leukozyten wirksam ist.

3. Reagens gemäß Anspruch 2, in welchem der anionische aktive Stoff ein anionischer aktiver Stoff vom Alkylsulfat-Typ ist, der durch die Formel (1) wiedergegeben wird:

R-O-SO&sub3;X (1)

worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen bedeutet und X Na, K, NH&sub4; oder HN(CH&sub2;CH&sub2;OH)&sub3; bedeutet.

4. Reagens gemäß Anspruch 2, in welchem der anionische aktive Stoff ein polyoxyethylenhaltiger anionischer aktiver Stoff ist, der durch die Formel (2) wiedergegeben wird:

R-O-(CH&sub2;CH&sub2;O)n-SO&sub3;X (2)

worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen bedeutet, n eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist und X Na, K, NH&sub4; oder HN(CH&sub2;CH&sub2;OH)&sub3; bedeutet.

5. Reagens gemäß Anspruch 2, in welchem der anionische aktive Stoff ein anionischer aktiver Stoff vom Kokosfettsäure-Typ ist, der durch die Formel (3) wiedergegeben wird:

worin R eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen bedeutet, X CH&sub2;SO&sub3; oder COO bedeutet und Y Na, K, NH&sub4; oder HN(CH&sub2;CH&sub2;OH)&sub3; bedeutet.

6. Reagens gemäß Anspruch 1, in welchem der amphotere aktive Stoff ein 2-Alkyl- (C&sub8;H&sub1;&sub7;-C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub7;)-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazoliniumbetain ist.

7. Reagens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, welches einen pH-Wert im Bereich von 3 bis 11 hat.

8. Reagens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, welches einen osmotischen Druck von 250 bis 400 mOsm/kg H&sub2;O hat.

9. Verfahren zum Klassifizieren von Leukozyten, welches das Zugeben des Leukozytenklassifizierungsreagenzes gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 zu einer Blutprobenlösung zum Lysieren von Erythrozyten und das Unterziehen des resultierenden Hämolysats einer Durchflußzytometrie zum Messen der Vorwärtsstreuung und der seitlichen Streuung umfasst.

10. Verwendung eines oberflächenaktiven Stoffs, ausgewählt aus anionischen aktiven Stoffen der Formel (1), (2) und (3), und amphoteren aktiven Stoffen der Formel (4), zum Herstellen eines Leukozytenklassifizierungsreagenzes.