DE69522203T2

DE69522203T2 - Sterilisation mit peressigsäure

Info

Publication number: DE69522203T2
Application number: DE69522203T
Authority: DE
Inventors: D. Kemp
Original assignee: Organogenesis Inc
Current assignee: Organogenesis Inc
Priority date: 1994-01-04
Filing date: 1995-01-04
Publication date: 2002-05-23
Anticipated expiration: 2015-01-05
Also published as: ES2161281T3; JPH09508103A; WO1995018529A1; PT738106E; JP3990408B2; MX9602545A; DE69522203D1; US5460962A; JP2005320336A; DK0738106T3; CA2179017C; CA2179017A1; EP0738106A1; JP3708961B2; ATE204122T1; EP0738106A4; EP0738106B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung ist auf dem Gebiet des Tissue Engineering. Die Erfindung betrifft die Sterilisation von Kollagen und Kollagengewebe, das zur Implantation, Reparatur oder Verwendung in einem Säugetierwirt verwendet wird. Die sterilisierenden Substanzen sind schwache oder verdünnte Konzentrationen von Peressigsäure in entweder neutralen Lösungen oder Lösungen mit hoher Ionenstärke, die eine Sterilisation des Kollagengewebes mit einem geringen Maß an Quellung und Auflösung ermöglichen, so daß das Kollagen seine strukturelle Integrität und biologische Umformbarkeit beibehält.

5 HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Tissue Engineering ist ein sich entwickelndes Gebiet, das Konstruktionsmethoden mit Prinzipien der Biowissenschaften vereint, um das Struktur- und Funktionsverhältnis in normalen und pathologischen Säugetiergeweben zu verstehen. Das Ziel von Tissue Engineering ist die Entwicklung und letztendliche Anwendung biologischer Substitute zur Wiederherstellung, Aufrechterhaltung oder Verbesserung von Gewebefunktionen. Skalak, R. und Fox. C.F., "Tissue Engineering", Alan R. Liss Inc. N.Y. (1988).
Eine Hauptkomponente dieser biologischen Substitute kann Kollagen oder Kollagengewebe sein. Während in diesem Bereich große Fortschritte gemacht wurden und weiterhin gemacht werden, gibt es einen ständigen Bedarf an einer Verbesserung sowohl der biologischen Substitute als auch der Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung. Gegenwärtig besteht ein Bedarf an einer Sterilisationsmethode, welche die biologischen und physikalischen Eigenschaften von Kollagen und Kollagengeweben aufrechterhält, die beim Tissue Engineering verwendet werden. Die Suche nach sterilisierenden Substanzen zur Sterilisation von Kollagen und Kollagengeweben hat zu der Anwendung einer Reihe verschiedener Verfahren geführt.
Physikalische Sterilisationsmethoden beinhalten Wärme, wie Kochen, Autoklavieren und Mikrowellen. Wärme koaguliert jedoch Weichteile. Zusätzlich denaturiert Wärme bei Temperaturen über 60 bis 65ºC das Kollagen. Gegenwärtig ist die Gamma-Bestrahlung die bevorzugte Technik zur Sterilisation von Gewebe, wobei zwischen 0,5 und 2,5 Megarad angewendet werden. Vor kurzem hat jedoch eine Studie gezeigt, daß Kollagen durch Gamma- Bestrahlung bei 1 Megarad beschädigt wird. Cheung et al., "The Effect of Gamma-Irradiation on Collagen Molecules Isolated Alpha Chains and Crosslinked Native Fibers", J. Biomedical Material Research, 24: 581-590 (1990). Diese geringeren Dosisbereiche werden verwendet, da Strahldosen von mehr als 2 Megarad eine schädliche biologische Wirkung haben. Schnell et al., "The Influence of Ionizing Radiation on Various Collagen-Containing Medical Products", Radiosterilization of Medical Products, Paper CM92, International Atomic Energy Agency, Wien (1967).
Bekannte chemische Sterilisationsverfahren erzeugen chemische Reaktionen, die Kollagen nicht nur sterilisieren, sondern auch vernetzen. Kollagen, das durch chemische Sterilisation vernetzt ist, ergibt ein Kollagengewebe, das steifer als unvernetztes Kollagen ist, sich weniger gut umformt, und eine immunologische Reaktion hervorrufen kann. So vernetzen die chemischen sterilisierenden Substanzen Formaldehyd und Glutaraldehyd Kollagen und verringern dessen Fähigkeit, sich nach einer Implantation umzuformen. Kato et al., Journal Biol. Jt. Surgery, 73: 561 (1991).
Zusätzlich sind nicht alle chemischen sterilisierenden Substanzen für die Kollagensterilisation geeignet. Ethyl und Isopropylalkohol sind nicht sporizid. Organische Quecksilberzubereitungen sind toxisch und haben eine schädigende Wirkung auf osteoinduktives Knochenprotein. Beta-Propiolacton ist nur zur Oberflächensterilisation wirksam und wurde wegen seiner Karzinogenität vom Markt genommen. Ethylenoxid wurde erfolgreich zur Sterilisation von Knochen verwendet, kann aber Weichteile auflösen.
Alle zuvor genannten Sterilisationstechniken haben einige Nachteile oder sind für die Sterilisation von Kollagen nur teilweise wirksam. Die ideale sterilisierende Substanz muß sterilisieren können, ohne die essentielle physikalische und biologische Eigenschaft des Kollagens zu verändern.
Peressigsäure ist eine bekannte germizide sterilisierende Substanz. In medizinischen Anwendungen werden wäßrige oder wäßrige-Ethanol-Peressigsäurelösungen für gewöhnlich zur Sterilisation der Oberflächen von Instrumenten verwendet. Malchesky, P.S., "Peracetic Acid and Its Application to Medical Instrument Sterilization", Artificial Organs, 17: 147-152 (1993). Die Sterilisation von Kollagengewebe durch Peressigsäure unter Anwendung dieser Techniken ist jedoch durch das Quellen und Auflösen des Kollagens nachteilig beeinträchtigt, welches durch den Säuregrad der Lösung verursacht wird.
Somit gibt es einen anhaltenden Bedarf an einer sterilisierenden Substanz, die Kollagen, das zur Verwendung als biologisches Substitut in Anwendungen des Tissue Engineering bestimmt ist, effektiv sterilisieren kann und die biologischen und physikalischen Eigenschaften des Kollagens oder des Kollagenmaterials aufrechterhält.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder haben entdeckt, daß die Verwendung schwacher oder verdünnter Konzentrationen von Peressigsäure entweder in neutralen Lösungen oder Lösungen mit hoher Ionenstärke das Quellen oder Auflösen von Kollagen und Kollagengewebe verhindern oder minimieren kann, so daß das Gewebe seine strukturelle Integrität und biologische Umformbarkeit beibehält. Diese Peressigsäurelösungen können erfolgreich zur Sterilisation biomedizinischer Produkte verwendet werden, die Kollagen oder Kollagengewebe enthalten, die zur Implantation, Reparatur oder Verwendung im Tissue Engineering bestimmt sind, ohne die Probleme, die mit herkömmlichen Sterilisationsmethoden verbunden sind.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder haben entdeckt, daß Peressigsäure, die in neutraler Lösung oder Lösung mit hoher Ionenstärke verdünnt ist, eine effektive sterilisierende Substanz für Kollagen und Kollagengewebe ist, die das Quellen und Auflösen des Gewebes verhindert oder minimiert. Peressigsäure ist ein starkes Oxidationsmittel, das im Handel in einer Konzentration von etwa 35% vertrieben wird. Eine schwach konzentrierte oder verdünnte Peressigsäurelösung enthält für gewöhnlich weniger als 5% Peressigsäure, vorzugsweise weniger als 1%, insbesondere in einem Bereich zwischen 0,1% bis 0,5%, und besonders bevorzugt weniger als 0,5%, insbesondere in einem Bereich zwischen 0,02% und 0,1%. Die Stärke der Peressigsäure in der verdünnten Peressigsäurelösung ist nicht kritisch, aber es wird die Verwendung einer geringeren Konzentration von Peressigsäure bevorzugt, so daß das Gewebe nicht beschädigt wird. Das Ausmaß der mikrobiologischen Last oder biologischen Belastung des Kollagens oder Kollagengewebes kann anzeigen, daß eine höhere Konzentration von Peressigsäure erforderlich ist, und die Lösung kann entsprechend eingestellt werden.
Die wäßrige Lösung, die zur Verdünnung der Peressigsäure verwendet wird, kann jede Lösung sein, die mit Kollagen kompatibel ist, zum Beispiel gepuffertes oder ungepuffertes Wasser oder Kochsalzlösung, oder Lösungen von Natriumchlorid. Die bevorzugte Lösung ist entweder eine gepufferte Lösung für ein leichteres Einstellen des pH-Wertes der verdünnten Peressigsäurelösung auf einen neutralen pH, oder eine Lösung von 1M Natriumchlorid. Es können auch Lagerungslösungen für die Kollagen enthaltenden Knochentransplantate zur Verdünnung der Peressigsäure verwendet werden; dies sind für gewöhnlich phosphatgepufferte Kochsalzlösungen.
In einem Ausführungsbeispiel dieser Erfindung wird der pH-Wert der schwach konzentrierten oder verdünnten Peressigsäurelösung zur Neutralisierung des pH-Wertes der Lösung eingestellt. Für gewöhnlich wird der pH-Wert der verdünnten Peressigsäurelösung zunächst mit einem pH-Meter oder einem pH-Papier gemessen. Dann wird die Lösung langsam durch Zugabe einer Base zu der Lösung neutralisiert. Die Einstellung des pH- Wertes wird einfacher ausgeführt, wenn zunächst die Base in einer wäßrigen Lösung gelöst wird. Dann wird der pH-Wert eingestellt, bis der pH-Wert der Lösung neutral ist. Wie hierin verwendet, soll der Begriff "neutraler pH-Wert" einen pH-Bereich von pH 6,0 bis 8,0 abdecken. Der bevorzugte pH-Bereich ist von pH 7,0 bis 7,5.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird die Sterilisationslösung aus Peressigsäure hergestellt, die in einer wäßrigen Lösung mit hoher Ionenstärke, für gewöhnlich einer hohen Salzkonzentration, verdünnt ist. Wie hierin verwendet, kann eine "hohe Salzkonzentration" jede Konzentration von Salz sein, die effektiv ein Quellen des Kollagens bei niederem pH-Wert verhindert. Vorzugsweise kann die wäßrige Lösung mit hoher Salzkonzentration jede Konzentration von 500 mM bis 3M aufweisen, vorzugsweise von etwa 1M bis etwa 2M. Das Salz, das in dieser Erfindung verwendet werden kann, kann Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kalziumchlorid und dergleichen sein. Der pH-Wert dieser verdünnten Peressigsäuresterilisationslösung mit hoher Salzkonzentration muß nicht eingestellt werden.
Der eigentliche Sterilisationsschritt wird durch Tränken oder Waschen des Kollagens oder Kollagengewebes mit der verdünnten Peressigsäuresterilisationslösung über einen Zeitraum und unter Bedingungen durchgeführt, die zur Sterilisation ausreichen. Die Dauer der Sterilisation hängt teilweise von der Größe und Art des zu sterilisierenden Kollagens oder Kollagengewebes, der Art der Anwendung der Sterilisationslösung und dem Maß der biologischen Belastung ab. Die Sterilisationsdauer beträgt für gewöhnlich 5 Minuten bis 30 Stunden.
Die Peressigsäuresterilisationslösung kann von dem Kollagen oder Kollagengewebe abgespült werden, für gewöhnlich mit sterilem Wasser, Kochsalz-, Puffer- oder Lagerungsmedien. Als Alternative kann das Gewebetransplantat direkt in steriles Lagerungsmedium ohne Spülen eingelegt werden.
Da Peressigsäure in verdünnten Mengen rasch degradiert, sollte die Peressigsäuresterilisationslösung vor deren Reduktion angewendet werden. Laut S. Block, Disinfection, Sterilization, and Preservation, 4. Auflage, Lea & Febiger (1993), Seite 176, verliert eine verdünnte Peressigsäurelösung von 1% zum Beispiel die Hälfte ihrer Stärke durch Hydrolyse innerhalb von 6 Tagen.
Kollagen und Kollagengewebe, das gemäß dieser Erfindung sterilisiert werden kann, umfaßt autogene, allogene und xenogene Materialien. Zu diesen biomedizinischen Materialien, die sterilisiert werden können, zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Venen, Bänder, Dermis, Herzklappen, glattes Muskelgewebe des Magens und die Submukosa des Dünndarms.
Kollagengewebe, wie hierin verwendet, umfaßt auch Kollagenmatrixstrukturen und -konstrukte. Da Kollagen ein Grundbaustein ist, der das Strukturgerüst für Dermis, Arterien, Venen, tubuläre Strukturen und die meisten anderen Organe des Menschen bildet, ist die Fähigkeit der sterilisierenden Peressigsäuresubstanz dieser Erfindung, Kollagen enthaltende Biomaterialien ohne Schädigung zu sterilisieren, wichtig.
Kollagengewebe, Matrixbiomaterial und -konstrukte, die als Implantate, zur Reparatur oder in einem Säugetierwirt verwendet werden, können von dem Wirt zu funktionellem Gewebe umgeformt werden. Dichtes Faserkollagen (DFC), wie in U.S. 5378469 beschrieben, ist ein homogenes, natürliches Kollagen, das von dem Wirt zu lebendem Gewebe und Organäquivalenten umgeformt werden kann. DFC kann in vielen Formen erzeugt werden, wodurch die Entwicklung vieler verschiedener Produkte auf Kollagenbasis möglich ist. Diese biomedizinischen Produkte haben zahlreiche Anwendungen in der Organ- und Gewebeersatztherapie, da sie so konstruiert sind, daß sie ihren Gegenstücken im menschlichen Körper ähnlich sind und eine natürliche Heilung fördern.
Obwohl die folgende Erfindung durch die folgenden Beispiele zum Zwecke der Klarheit und des Verständnisses veranschaulicht wird, soll sie nicht auf die Beispiele beschränkt sein.

BEISPIEL 1

Herstellung einer neutralen Peressigsäurelösung

Das folgende Beispiel beschreibt die Herstellung der sterilisierenden Substanz: neutrale Peressigsäurelösung.

Materialien:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4ºC
Peressigsäure (35% Konzentration)
10N Natriumhydroxid (NaOH)
Pasteurpipette und Kolben
1500 ml sterile Nalgene-Flasche
pH-Meter
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wurde aus 0,144 g Kaliumphosphat, monobasisch; 3,00 g Natriumphosphat, dibasisch (7H&sub2;O); 9,00 g Natriumchlorid; und 1 l gereinigtem Wasser hergestellt.

Vorgangsweise:

1. 349 ml PBS wurden in eine 500 ml sterile Nalgene-Flasche eingebracht.
2. 1,4 ml Peressigsäure wurden der PBS zugesetzt.
3. Die Flasche, welche die Peressigsäurelösung enthielt, wurde verschlossen und leicht geschüttelt.
4. Ein Rührstab wurde in die Flasche eingesetzt und die Flasche auf eine Rührplatte gestellt.
5. Der pH-Wert der Peressigsäurelösung wurde mit einem pH-Meter gemessen und zwischen pH 4,0-5,0 gelesen.
6. Die Lösung wurde durch Zutropfen von 10N NaOH unter Verwendung einer Pasteuerpipette neutralisiert, bis der pH-Wert zwischen 7,0 und 7,2 lag. Das Gesamtvolumen der zugegebenen NaOH-Lösung betrug etwa 0,4-0,8 ml Da die pH-Reaktion langsam war, wurde die NaOH-Lösung langsam zugegeben.
7. Das Lösungsvolumen wurde mit PBS bis zur 500 ml Anzeige erhöht, um eine Peressigsäure-Endkonzentration von 0,1% zu erreichen.

BEISPIEL 2

Herstellung einer Peressigsäurelösung hoher Ionenstärke

Das folgende Beispiel beschreibt die Herstellung der sterilisierenden Substanz: verdünnte Peressigsäurelösung hoher Salzkonzentration.

Materialien:

Peressigsäure (35% Konzentration)
Natriumchlorid (NaCl)
1500 ml sterile Nalgene-Flasche

Vorgangsweise:

1. 29,22 g NaCl wurden mit Wasser auf ein Volumen von 500 ml gelöst.
2. 1,4 ml 35% Peressigsäure wurden zugegeben, um eine 0,1% Lösung herzustellen.

BEISPIEL 3

Sterilisation eines Darmkollagenmaterial-Transplantats

Materialien:

Drei 1 Fuß (1') Schnitte von Schweinedarm-Kollagenmaterial Frisch zubereitete, sterile Peressigsäurelösungen, wie in Beispiel 1 und Beispiel 2 hergestellt
Sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)

Vorgangsweise:

1. Der Dünndarm eines Schweins wurde geerntet und dann, nachdem er zu einer Schicht bearbeitet worden war, mechanisch abgeschält und gereinigt, so daß die Tunica submucosa delaminiert und abgetrennt wurde. Die Submucosa wurde von dem Dünndarm durch mechanisches Quetschen des Rohmaterials zwischen gegenüberliegenden Walzen abgetrennt. Die Tunica submucosa des Dünndarms ist härter und steifer als das umgebende Gewebe und die Walzen quetschen die weicheren Komponenten von der Submucosa.
2. Drei Ein-Fuß (1 Fuß &sim; 30 cm)-Proben des gereinigten Schweinedarm-Kollagenmaterials wurden 16, 40 oder 62 Stunden (drei Proben für jede Zeitperiode) in 100 ml neutrale 0,1% Peressigsäurelösung getaucht, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden war.
3. Ein-Inch (1 Inch &sim; 2,54 cm)-Proben wurden von jeder ein Fuß Probe des Darm-Kollagenmaterials nach der Inkubation über die angemessene Zeit in neutraler 0,1% Peressigsäurelösung entnommen. Diese Proben wurden aseptisch entweder in eine sterile, tryptische Soja-Bouillon (TBS) oder in Thioglycollatmedien (Thio) überführt und dann vierzehn Tage bei 37ºC bzw. 30ºC inkubiert. Ein-Inch-Proben wurden auch von unbehandeltem Darmkollagenmaterial entnommen und auf gleiche Weise über vierzehn Tage in TSB oder Thio als Kontrolle inkubiert.

Ergebnisse:

Alle mit Peressigsäure behandelten Versuchstransplantatsproben, inkubiert über 16, 40 oder 62 Stunden, waren nach vierzehn Tagen entweder in TSB oder Thio steril. Schnitte von unbehandelten Kontrollen waren alle mit Klebstella pneumoniae und Escherichia coli kontaminiert, wie sich nach 14 Tagen entweder in TSB oder Thio zeigte.

BEISPIEL 4

Bakterielle Prüfung

Materialien:

Schweinedarm-Kollagenmaterial
Bacillus subtilis Sporen
Neutrale Peressigsäurelösung wie in Beispiel 1 beschrieben
Flüssige Thioglycollat-Bouillon (Thio)
Tryptische Soja-Bouillon (TSB)

Vorgangsweise:

1. Eine Probe von Darm-Kollagenmaterial, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde mit 2 Millionen B. subtilis Sporen pro Fuß Länge des Materials beimpft.
2. Ein-Fuß-Proben des beimpften Materials wurden in 150 ml neutrale 0,1% Peressigsäurelösung getaucht und 8 Stunden oder 16 Stunden (6 Proben für jede Zeitperiode) inkubiert.
3. Die Ein-Inch-Proben des Darm-Kollagenmaterials, das mit neutraler Peressigsäure behandelt worden war, und Kontrollen (die mit B. subtilis beimpft, aber nicht mit Peressigsäure behandelt waren) wurden aseptisch entweder in TSB oder Thio überführt und 14 Tage inkubiert (bei 37ºC bzw. 30ºC inkubiert).

Ergebnisse:

Alle mit Peressigsäure behandelten Proben von Darm-Kollagenmaterial waren steril.
Kontrollproben, die mit B. subtilis-Sporen versetzt waren, zeigten ein positives Wachstum in TSB nach 1 Tag Inkubation und in Thio nach 3 Tagen Inkubation.

BEISPIEL 5

Quellen von Darm-Kollagenmaterial in Peressigsäurelösungen

Materialien:

Schweinedarm-Kollagenmaterial
0,1% Peressigsäurelösung in Wasser pH 3,5)
0,1% Peressigsäurelösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 6,1)
0,1% Peressigsäure in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, neutralisiert auf pH 7,2, wie in Beispiel 1 beschrieben
0,1% Peressigsäurelösung in 1M Natriumchlorid, wie in Beispiel 2 beschrieben (pH 3,3)

Vorgangsweise:

Es wurden Schnitte von Darmkollagenmaterial (etwa 3 Inch lang) wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt und trocken getupft, gewogen und in 50 ml einer der obengenannten verdünnten Peressigsäurelösungen eingebracht (der Versuch wurde dreifach ausgeführt). Nach 19 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Proben in frische Lösung überführt und weitere 28 Stunden dort belassen. Dann wurden die Proben entnommen, zur Entfernung der Oberflächenflüssigkeit kurz abgetupft und erneut gewogen. Ergebnisse:
Die Probe von Darm-Kollagenmaterial, die 0,1% PA in Wasser ausgesetzt worden war, quoll gegenüber ihrem Gewicht vor der Inkubation um 46%. Die anderen Proben, die Peressigsäure entweder bei pH 6,1 oder 7,2 oder in 1M NaCl ausgesetzt worden waren, verloren im Vergleich zum Anfangsgewicht tatsächlich an Wasser.

BEISPIEL 6

Quellen von DFC in Peressigsäurelösungen

Materialien:

Dichte Faserkollagen- (DFC) Schicht, hergestellt wie in der Anmeldung, SerienNr. 07/772,579 beschrieben
0,1% Peressigsäurelösung in Wasser (pH 3,5)
0,1% Peressigsäurelösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 6,1)
0,1% Peressigsäure in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, neutralisiert auf pH 7,2, wie in Beispiel 1 beschrieben
0,1% Peressigsäurelösung in 1M Natriumchlorid, wie in Beispiel 2 beschrieben (pH 3,3)

Verfahren:

Schnitte von trockener DFC-Schicht (mehr als 6 Monate trocken gelagert) wurden gewogen und in 50 ml einer der obengenannten Lösungen eingebracht (der Versuch wurde zweifach ausgeführt). Nach 19 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Proben entnommen, zur Entfernung der Oberflächenflüssigkeit kurz abgetupft und erneut gewogen. Ergebnisse:
Die DFC-Probe in 0,1% Peressigsäure in Wasser quoll stärker als die anderen Proben. Diese Probe löste sich wegen der kovalenten Netzbildung nicht auf, die während der Lagerung von trockenen Kollagenmaterialien eintritt. Die Proben, die Peressigsäure ausgesetzt worden waren, entweder bei pH 6,1 oder 7,2, oder in 1M NaCl, quollen deutlich weniger als die Probe in 0,1% Peressigsäure in Wasser.

BEISPIEL 7

Schrumpftemperatur von DFC-Fäden, die verschiedenen Peressigsäurelösungen ausgesetzt wurden

Verfahren:

Fadenerzeugung:

Die Herstellung dichter Faserkollagen- (DFC) Fäden ist in U. S. 5,378,469 beschrieben. In diesem Versuch wurde eine 140 ml Spritze, die eine 5,0 mg/ml Kollagenlösung in 8,8 mM Essigsäure enthielt, in eine Spritzenpumpe geladen (Harvard Apparatus, South Natick, MA), die auf eine Infusion mit 2,50 ml/min eingestellt war. Ein Silikonschlauch (1/8 Inch ID) verband die Spritze mit einer stumpfen Nadel aus rostfreiem Stahl der Stärke 18, die in ein Ende einer 18 Fuß langen PVC Wanne mit 2 Inch Durchmesser getaucht war, welche 5 l 20% Polyethylenglykol (PEG), MG 8000 (Spectrum Chemicals, New Brunswick, NJ) in 94 mM dibasischem Natriumphosphat und 24 mM monobasischem Natriumphosphat bei pH 7,55 enthielt. Eine peristaltische Pumpe wurde zum Rezirkulieren der PEG-Lösung verwendet, so daß die Flüssigkeitsgeschwindigkeit an der Nadelspitze etwa 4 cm/sec betrug. Die zirkulierende PEG-Lösung zog das Kollagen von der Nadelöffnung weg, wodurch ein kontinuierliches Filament gebildet wurde. Das Kollagen gelierte bei Kontakt mit der Lösung mit neutralem pH, und der naszierende Faden begann aufgrund des osmotischen Druckgradienten zu dehydrieren, der zwischen dem Kollagen und der PEG-Lösung entstand. Die Koagulationswanne war so gestaltet, daß die Verweilzeit des Fadens in dem Bad etwa 4 Minuten betrug. Während sich der Faden ansammelte, wurde er manuell zu einer 6 Fuß langen Wanne übertragen, die mit 5,5 mM disbasischem Natriumphosphat, 0,5 mM monobasischem Kaliumphosphat und 75 mM NaCl bei pH 7,10 gefüllt war, und verblieb dort für 5 bis 10 Minuten.
Der Faden wurde dann teilweise dehydriert, indem er durch eine 2 Fuß lange Wanne geleitet wurde, die 70% Isopropanol enthielt, und unter Spannung getrocknet, indem er in einem Schrank, der mit Luftgebläse erwärmt wurde, über eine Reihe von Teflon-Riemenscheiben gezogen wurde. Zur Verhinderung einer Wärmedenaturierung des Kollagens wurde der Faden in Bewegung gehalten und war immer mindestens 15 cm von dem Gebläse entfernt. Schließlich wurde der Faden auf eine Horizonzal-Aufwickelvorrichtung gespult.
Die Spannung an dem Faden während der Trocknung war derart, daß sich seine Länge verdoppelte, bevor er trocken aus dem Schrank austrat. Die gesamte Verweildauer in dem Schrank betrug etwa 3 Minuten.
Sobald das Filament durch das gesamte System gefädelt war, konnte es kontinuierlich erzeugt werden; der Bediener mußte nur die Koagulations- und Spülbehälter mit ausreichender Vorratslänge gefüllt halten, um ein Aufwickeln zu ermöglichen.

Schrumpftemperaturmessung:

Die Schrumpftemperatur, ein Maß der Stabilität der Kollagendreifachhelix, wurde gemessen, indem eine 5 bis 7 cm Fadenschlinge, die mit 2,5 g in 1,0 mM monobasischem Kaliumphosphat, 11 mM dibasischem Natriumphosphat und 150 mM NaCl bei pH 7,30 beladen war, eingetaucht und bei 1ºC pro Minute bis zum Schrumpfen erwärmt wurde. Die Temperatur, bei welcher die Probe um mindestens 10% schrumpfte, wurde als Schrumpftemperatur aufgezeichnet.

Peressigsäurebehandlung:

Längen des Kollagenfadens wurden den folgenden Lösungen 20 Minuten ausgesetzt:
1) 0,1% Peressigsäurelösung in Wasser (pH 3,5);
2) 0,1% Peressigsäurelösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 6,1);
3) 0,1% Peressigsäure in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, neutralisiert auf pH 7,2, wie in Beispiel 1 beschrieben;
4) 0,1% Peressigsäurelösung in 1M Natriumchlorid, wie in Beispiel 2 beschrieben (pH 3, 3). Ergebnisse:
Die Schrumpftemperatur wurde durch die Behandlung mit Peressigsäure nicht beeinflußt. Die Kollagenfäden lösten sich in 0,1% Peressigsäure in Wasser auf, blieben aber in den anderen Lösungen intakt.
Die vorangehende Erfindung wurde zwar ziemlich ausführlich veranschaulichend und beispielhaft zum besseren Verständnis beschrieben, aber für den Fachmann ist offensichtlich, daß gewisse Änderungen und Modifizierungen im Umfang der beiliegenden Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims

1. Verfahren zum Sterilisieren von Kollagen oder Kollagengewebe, bei welchem das Kollagen oder Kollagengewebe mit einer Peressigsäurelösung in Kontakt gebracht wird, die das Kollagen oder Kollagengewebe ohne oder mit einem geringen Maß an Quellung und Auflösung sterilisiert, wobei die Lösung eine Peressigsäurekonzentration im Bereich von 0,02% bis 1,0% aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß:

i. die Lösung einen neutralisierten pH von 6,0 bis 8,0 hat, und/oder

ii. die Lösung eine Salzkonzentration von 1M bis 2M hat.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lösung eine Peressigsäurekonzentration von 0,1% hat.

3. Verwendung einer Peressigsäurelösung mit einer Peressigsäurekonzentration im Bereich von 0,02% bis 1,0% in der Herstellung eines Mittels zum Sterilisieren von Kollagen oder Kollagengewebe, dadurch gekennzeichnet, daß:

i. die Lösung einen neutralisierten pH von 6,0 bis 8,0 hat, und/oder

ii. die Lösung eine Salzkonzentration von 1M bis 2M hat.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Lösung eine Peressigsäurekonzentration von 0,1% hat.