DE69520383T2

DE69520383T2 - Quaternäre ammonium immunogenische Konjugate und Immuntest-Reagenz

Info

Publication number: DE69520383T2
Application number: DE69520383T
Authority: DE
Inventors: Alan R. Craig
Original assignee: Dade Behring Inc
Current assignee: Dade Behring Inc
Priority date: 1994-02-18
Filing date: 1995-01-30
Publication date: 2001-10-31
Anticipated expiration: 2015-01-31
Also published as: US5492841A; JP2731739B2; EP0668504B1; JPH07260784A; DE69520383D1; EP0668504A1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf quartäre Ammoniumgruppen enthaltende immunogene Konjugate, die zum Hervorbringen von Antikörpern und zur Durchführung von Immunoassay geeignet sind.

Hintergrund der Erfindung

Spezifische Bindungsreaktionen, wie Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, werden in Immunoassays ausgiebig verwendet, um zahlreiche Analyten, die in biologischen Flüssigkeiten vorhanden sind, nachzuweisen und/oder zu quantifizieren. Immunoassays wurden für die Bestimmung von polyvalenten Antigenen sowie von Haptenen entwickelt.
Von besonderem Interesse für klinisch-diagnostische Zwecke sind Haptene, die zu verschiedenen Klassen von Wirkstoffen einschließlich sogenannten "Drogen" gehören. Beispiele für solche häufig missbrauchten "Drogen" sind Amphetamine, Barbiturate, Benzodiazepame, Cocain, Methadon, Methaqualon, Opiate, Phencyclidin (PCP), Propoxyphen, Tetrahydrocannabinol (THC) und Verbindungen mit verwandten Strukturen.
Die Herstellung von Antikörpern, die in Immunoassays für die Bestimmung solcher Haptene geeignet sind, ist insofern kompliziert, als diese relativ kleinen Moleküle zwar als Epitope wirken können, aber für sich allein im allgemeinen nicht in der Lage sind, eine Immunantwort hervorzurufen. Um Antikörper zu erhalten, die für besondere interessierende Haptene spezifisch sind, ist es also häufig notwendig, ein geeignetes Wirtstier mit einem immunogenen Konjugat des interessierenden Haptens oder eines Derivats davon und einem Träger zu immunisieren. Verschiedene bekannte Träger sind Polyaminosäuren, wie Proteine und Polypeptide. Zu den häufig eingesetzten Trägern gehören Schlitzschnecken-Hämocyanin (KLH), Rinderserumalbumin (BSA), Ovalbumin und Kürbiskernglobulin.
Immunogene Konjugate, die zum Hervorbringen von Antikörpern gegen Haptene einschließlich Haptenen mit einer Aminfunktion geeignet sind, werden hergestellt, indem man ein interessierendes Hapten so modifiziert oder derivatisiert, dass es eine reaktive Gruppe, wie eine Carboxygruppe, enthält, um seine Bindung an eine funktionelle Gruppe, wie eine Amingruppe, einer immunogenen Trägersubstanz, wie eines Proteins, zu erleichtern.
FR-A-2561660, das das Veröffentlichungsdatum 26. März 1984 aufweist und an Geffard ausgegeben wurde, offenbart ein Immunogen gegen eine Haptengruppe, die eine Cholineinheit enthält, das hergestellt wird durch Umsetzen einer Amin- oder Carboxygruppe eines antigenen Moleküls mit einer Verbindung der Formel Y-X&sub2;-CO-Z', wobei X&sub2; eine Alkylgruppe ist, Z' entweder eine OH-Gruppe oder eine Schutzgruppe ist und Y eine funktionelle Gruppe ist, die mit einer Amin- oder Carboxygruppe eines Makromoleküls zu reagieren vermag, und anschließende Veresterung der resultierenden gekoppelten Verbindung mit Cholin.
Das US-Patent Nr. 4,490,473, das am 25. Dezember 1984 an Brunhouse ausgegeben wurde, offenbart N,N,N-Trimethylammoniumphenyl-Verbindungen, die über eine Aminoverknüpfung des Antikörpers mit einem Antikörper konjugiert sind. Diese Verbindungen werden als Reagentien offenbart, die für Sandwichassays geeignet sind.
Das US-Patent Nr. 4,078,049, das am 7. März 1978 an Felix et al. ausgegeben wurde, offenbart ein Antigen, das 6-Aminocapronsäure(2-trimethylaminoethyl)- ester umfasst, der über eine Peptidbindung, die von der 6-Aminogruppe und den im immunogenen Träger enthaltenen Carboxygruppen gebildet wird, kovalent an ein immunogenes Trägermaterial gebunden ist.
EP-A-0191536, Visser et al., mit dem Veröffentlichungsdatum 20. August 1986 offenbart Immunogene, die eine antigene Determinante, die an ein amphiphiles Adjuvansmolekül gekoppelt sind, sowie gegebenenfalls freie amphiphile Adjuvansmoleküle umfassen.
Das US-Patent Nr. 3,709,868, das am 1. Januar 1973 an Spector ausgegeben wurde, offenbart die Kopplung eines Opiumalkaloidhaptens mit immunogenen Trägerproteinen über die Carboxygruppe eines Carboxyniederalkylderivats der phenolischen Hydroxygruppe des Alkaloids mit einer freien Aminogruppe im Protein, was eine kovalente Peptidbindung ergibt, so dass ein Opiumalkaloidantigen entsteht.
Keine dieser Literaturstellen offenbart ein quartäre Ammoniumgruppen enthaltendes immunogenes Konjugat, das hergestellt wird, indem ein Hapten oder Derivat davon an einen immunogenen Träger gekuppelt wird, indem man eine zur Bindung an den Träger befähigte bifunktionelle Verknüpfungsgruppe an eine tertiäre Amingruppe bindet, die in dem Hapten oder seinem Derivat vorhanden ist.
Haptene oder Derivate davon können auch mit nichtimmunogenen Trägern, wie Reportern, konjugiert sein, so dass man Reporterreagentien erhält, die für Immunoassays geeignet sind. Konjugate von Haptenen und einer festen Phase, wie Latexteilchen, können Latexteilchenreagentien ergeben, die in verschiedenen bekannten Teilchenagglutinierungs-Immunoassayformaten verwendet werden können (siehe z. B. DE-A-27 49 956). Zum Beispiel offenbaren das am 30. August 1983 an Craig et al. ausgegebene US-Patent Nr. 4,401,765 und das am 30. Oktober 1984 an Craig et al. ausgegebene US-Patent Nr. 4,480,042 Reagentien mit Kern-Hülle-Polymerteilchen mit hohem Brechungsindex, die interessierende biologische Verbindungen umfassen, die an Teilchen gekoppelt sind, sowie die Verwendung dieser Teilchenreagentien in Lichtstreuungsteilchenagglutinierungs- oder -inhibitionsimmunoassays.
Quartäre Ammoniumverbindungen können unter Verwendung bekannter Methoden, die die Alkylierung des Stickstoffatoms beinhalten, aus tertiären Aminen hergestellt werden. Die Alkylierung kann im allgemeinen durch Reaktion mit einem Alkylhalogenid erreicht werden. Das Amin kann aliphatisch oder aromatisch sein. Solche quartären Ammoniumverbindungen haben die allgemeine Formel [R&sub4;N&spplus;]X&supmin;, wobei R&sub4; vier Nichtwasserstoff-Substituentengruppen darstellt und X ein Halogenidanion ist. Siehe zum Beispiel R. T. Morrison und R. N. Boyd, Organic Chemistry, 6. Aufl., Seite 854, Prentice Hall Inc. (1992).
Quartäre Ammoniumgruppen enthaltende Reporterreagentien, bei denen es sich um Konjugate von Reportern und Reportern oder Derivaten davon, die eine tertiäre Aminfunktion enthalten, handelt, wurden bisher noch nicht offenbart.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die quartäre Ammoniumgruppen enthaltenden immunogenen Konjugate und Reporterreagentien der vorliegenden Erfindung bieten gegenüber bekannten immunogenen Konjugaten und Reporterreagentien erhebliche Vorteile. Die quartäre Ammoniumgruppen enthaltenden immunogenen Konjugate der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Antikörper gegen ein breites Spektrum von Haptenen einschließlich aller Haptene oder Derivate davon, die eine tertiäre Amingruppe enthalten, hervorzubringen, und die Konjugate können in einer großen Vielfalt von Immunoassayformaten angewendet werden.

Diese Erfindung bezieht sich auf:

(1) ein quartäre Ammoniumgruppen enthaltendes Konjugat, das geeignet ist zum Hervorbringen von Antikörpern gegen ein Hapten, das keine quartäre Ammoniumgruppe enthält, oder in einem Immunoassay zum Nachweis der Anwesenheit und/oder zur Bestimmung der Menge eines Haptens, das keine quartäre Ammoniumgruppe enthält, in einer Testprobe, wobei das Hapten, das keine quartäre Ammoniumgruppe enthält, eine tertiäre Amingruppe aufweist oder so derivatisiert werden kann, dass es eine tertiäre Amingruppe aufweist, wobei das eine quartäre Ammoniumgruppe enthaltende Konjugat die Formel
((Q&spplus;-L-Z-)-x-M)B&supmin;
hat, wobei
Q&spplus; eine cyclische oder acyclische quartäre Ammoniumgruppe ist, die aus einer kovalenten Verknüpfung eines Linkers mit dem Hapten hervorgegangen ist;
L ein Linker ist, der 1 bis 20 Kohlenstoffatome und Heteroatome einschließlich nicht mehr als 6 Heteroatomen umfasst, die in einer geradkettigen oder verzweigten Kette angeordnet sind und/oder Ringstrukturen enthalten, wobei nicht mehr als zwei Heteroatome in Folge miteinander verknüpft sind;
Q&spplus; mit L an der tertiären Aminogruppe des Haptens verknüpft ist;
-Z- eine Restgruppe ist, die aus -C=O-, -CH=, -N=N-, -NH-, -NHCH&sub3;-, -NH-S=C-, SO&sub2;-, -O-C=O- und -C=O-NH-NH&sub2; ausgewählt ist;
x größer oder gleich 1 ist;
M ein Träger ist;
B&supmin; ein Anion ist; und
(Q&spplus;-L-Z) kovalent an M gekoppelt ist;
(2) ein quartäre Ammoniumgruppen enthaltendes Konjugat, wie es oben in (1) definiert ist, wobei der Träger aus Proteinen, Glycoproteinen, Polypeptiden, Kohlenhydraten und Latexteilchen ausgewählt ist;
(3) ein quartäre Ammoniumgruppen enthaltendes Konjugat, wie es oben in (1) definiert ist, wobei der Träger ein Latexteilchen ist;
(4) ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen das eine quartäre Ammoniumgruppe enthaltende Konjugat, wie es oben in (1) bis (3) definiert ist, wobei das Verfahren das Injizieren des eine quartäre Ammoniumgruppe enthaltenden Konjugats in geeignete Wirtstiere umfasst;
(5) einen Immunoassay zum Nachweis der Anwesenheit und/oder zur Bestimmung der Menge eines Haptens, der die Schritte des Immobilisierens des immunogenen Konjugats, wie es oben in (2) definiert ist, auf einer festen Phase und des anschließenden Durchführens irgendeiner bekannten Immunoassayvorschrift umfasst; und
(6) einen Teilchenagglutinierungs-Immunoassay zur Bestimmung eines Haptens in einer Testprobe, der folgendes umfasst: das Inkubieren des eine quartäre Ammoniumgruppe enthaltenden Konjugats, wie es oben in (3) definiert ist, der Testprobe und eines Agglutinierungsmittels sowie das photometrische Messen der erhöhten Teilchengröße, die sich aus der Agglutinierung ergibt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf quartäre Ammoniumgruppen enthaltende Konjugate, die für Immunoassay und zum Hervorbringen von Antikörpern geeignet sind. Diese Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Herstellung entweder monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, wobei sich das Verfahren solche quartäre Ammoniumgruppen enthaltende Konjugate als Immunogene zu Nutze macht. Außerdem bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Immunoassays, die sich solche quartäre Ammoniumgruppen enthaltenden immunogenen Konjugate zu Nutze macht.
Die immunogenen Konjugate der vorliegenden Erfindung sind quartäre Ammoniumverbindungen, wie sie oben definiert sind.
"Hapten" bedeutet jedes Molekül, das als Epitop wirken kann, das aber für sich allein nicht in der Lage ist, eine Immunantwort hervorzurufen. Um eine geeignete Antikörperreaktion hervorzurufen, kann ein Hapten, typischerweise durch kovalente Bindung, an einen immunogenen Träger gebunden werden, so dass ein immunogenes Konjugat entsteht, das Antikörper hervorbringen kann, die für das Hapten spezifisch sind.
Das bei der Herstellung des immunogenen Konjugats der vorliegenden Erfindung verwendete Hapten kann ein tertiäres Amin (tertiäres-Amin-Hapten) sein, oder es kann ein Hapten sein, das so derivatisiert werden kann, dass es eine tertiäre Aminfunktion aufweist. Vorzugsweise ist das in der vorliegenden Erfindung verwendete Hapten ein tertiäres-Amin-Hapten, das keine Derivatisierung erfordert. Beispiele für solche tertiäres-Amin-Haptene sind Strukturen, die zu verschiedenen Wirkstoffklassen gehören, wie den verschiedenen Drogenklassen einschließlich zum Beispiel Cocain, Methadon, Methaqualon, Opiaten, Phencyclidinen (PCP) und Propoxyphenen sowie anderer Wirkstoffe, wie Chinidin, Procanimid, N-Acetylprocanimid (NAPA) und Antidepressiva in Form tricyclischer Amine. Diese Wirkstoffklassen umfassen den genannten Wirkstoff, z. B. Cocain, sowie verwandte Strukturen wie die unten in Tabelle 1 gezeigten. Immunogene Konjugate, die unter Verwendung eines dieser tertiäres-Amin-Haptene synthetisiert wurden, werden bevorzugt. Beispiele für Haptene, die so derivatisiert werden können, dass tertiäre Amine entstehen, sind Drogen wie Amphetamine und Benzodiazepame. Solche Haptene enthalten typischerweise Amingruppen, die unter Verwendung bekannter Methoden derivatisiert werden können. Die Strukturen ausgewählter Haptene, die zur Herstellung der immunogenen Konjugate der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Amphetamine und verwandte Strukturen Cocain und verwandte Wirkstoffe Methadon und verwandte Strukturen Methaqualon und verwandte Strukturen Mit Methaqualon verwandte Strukturen Opiate und verwandte Strukturen Phenclidin Propoxyphen und verwandte Strukturen Mit Pronoxyphen verwandte Strukturen Chinidin und verwandte Verbindungen
Tertiäre Amine können durch die bekannte Reaktion hergestellt werden, die im allgemeinen als Alkylierung von Aminen bezeichnet wird. Diese Reaktion ist unten gezeigt:
wobei A ein Nichtwasserstoff-Substituent ist und X ein Halogenid ist.
Ein Amin kann mit einem Alkylderivat, das gegenüber Nucleophilen reaktiv ist, reagieren. Das Produkt ist das Amin der nächsthöheren Klasse. Eines der an das Stickstoffatom gebundenen Wasserstoffatome wird durch die Alkylgruppe ersetzt. Das Amin kann aliphatisch oder aromatisch, primär (1º), sekundär (2º) oder tertiär (3º) sein. Das Alkylderivat kann geradkettig oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt sein und kann Heteroatome wie Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff enthalten. Das bevorzugte Alkylderivat enthält eine geradkettige Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Zu den geeigneten Derivaten gehören Halogenide, vorzugsweise Bromide und Iodide, und andere gute Abgangsgruppen, wie Toluolsulfonate.
Die quartäre Ammoniumgruppen enthaltenden Konjugate der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden, indem man ein Hapten in Form eines tertiären Amins (oder ein Hapten, das so derivatisiert wurde, dass es eine tertiäre Aminfunktion aufweist) über eine Verknüpfungsgruppe kuppelt, die zur Bindung an einen Träger geeignet ist.
Ein Hapten in Form eines tertiären Amins kann mit einer Verknüpfungsgruppe derivatisiert werden, wobei man die oben beschriebene Alkylierungsreaktion verwendet, so dass ein Hapten in Form eines quartären Ammoniumsalzes entsteht, das eine positive Ladung aufweist, die durch irgendein negatives Ion (X&supmin;) ausgeglichen wird.
Die Verknüpfungsgruppe kann Alkyl oder Aryl, geradkettig oder verzweigt sein und kann Kohlenstoff- und Heteroatome enthalten. Verknüpfungsgruppen, die zur Bindung an einen Träger geeignet sind, können reaktive Gruppen enthalten, die so mit dem Träger reagieren können, dass das Haptenderivat in Form der quartären Ammoniumverbindung kovalent an den Träger bindet. Beispiele für geeignete reaktive Gruppen sind -CO&sub2;H, -NH&sub2;, -NCO, -CONHNH&sub2;, -CNOR, -CHO, -Br, -I, -NCS, -OCOCl, -SO&sub2;Cl, -OCSCl und -NHCH&sub3;. Die bevorzugte Verknüpfungsgruppe ist eine bifunktionelle Verknüpfungsgruppe, die 1-20 Atome umfasst und eine reaktive -CO&sub2;-Gruppe zur Verknüpfung mit dem Träger und eine Halogenidgruppe für die Umsetzung mit dem tertiären Amin des Haptens oder seines Derivats enthält.
Das immunogene Konjugat kann über verschiedene Verknüpfungen mit dem Hapten oder Haptenderivat in Form der quartären Ammoniumverbindung verknüpft werden, wobei die oben beschriebenen reaktiven Gruppen verwendet werden, einschließlich zum Beispiel Amid-, Imin-, Diazo-, Alkyl-, Harnstoff-, Thioharnstoff-, Carbamat- und Thiocarbamatverknüpfungen. Der Linker L und der Rest Z resultieren aus der Reaktion der Verknüpfungsgruppe mit dem Träger.
Der bevorzugte Linker ist eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Atomen. Der Rest Z resultiert aus der Bindung der reaktiven Gruppe der Verknüpfungsgruppe des Haptens in Form der quartären Ammoniumverbindung an den Träger.
Beispiele für geeignete Restgruppen Z sind zum Beispiel C=O, C=NH, NH, NHCH&sub3;, N=N, SO&sub2; und CH&sub2;. Die bevorzugte Restgruppe Z ist C=O, die sich aus der Reaktion einer reaktiven Carboxygruppe an der Verknüpfungsgruppe mit einer Amingruppe an einer Polyaminosäure ergibt.
"Träger" bedeutet: 1) jedes Substrat, das das Hapten dazu befähigen kann, in einem geeigneten Wirtstier eine Immunantwort auszulösen, und 2) jede nichtimmunogene Substanz, die als Reporter verwendet werden kann. Beispiele für Träger sind verschiedene Polyaminosäuren, wie Proteine, Polypeptide, Glycoproteine sowie Kohlenhydrate, Hefepolysaccharide und feste Phasen, wie Latexteilchen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Träger um Rinderserumalbumin (BSA). Beispiele für andere geeignete Träger sind Hämocyanin, Schlitzschnecken-Hämocyanin (KLH), Ovalbumin, Rinder-γ-globulin, synthetische Polyaminosäuren mit ausreichenden reaktiven Gruppen. Vorzugsweise ist der Träger über eine im Träger vorhandene Aminogruppe mit dem Linker verknüpft.
Der Index x kann jede Zahl sein, die größer oder gleich 1 ist, und wird je nach der zwischen dem tertiären Amin (über den Linker) und dem Träger eingesetzte Verknüpfung variieren. Wenn die reaktive Gruppe oder die Verknüpfungsgruppe zum Beispiel eine Carboxygruppe ist, hängt die Zahl x von der Anzahl der in dem Träger vorhandenen Amingruppen ab.
Das bevorzugte Konjugat mit quartären Ammoniumgruppen der vorliegenden Erfindung hat die Struktur:
((Q&spplus;-L-Z-)-x-M)B&supmin;
wobei Q eine quartäre Ammoniumgruppe ist, die von einem Hapten in Form eines tertiären Amins und vorzugsweise von einem der in Tabelle 1 abgebildeten Wirkstoffe, der keine Derivatisierung erfordert, um eine tertiäre Aminfunktion aufzuweisen, abgeleitet ist, L ein Linker ist, der 1-10 Atome aufweist, wie -CH&sub2;-, und Z eine Gruppe der Art C=O ist und x größer oder gleich eins, vorzugsweise größer als eins, ist und B vorzugsweise I&supmin; oder Br&supmin; ist. Folgendes sind Beispiele für bevorzugte Konjugate mit quartären Ammoniumgruppen: Methadon-Konjugat Cocain-Konjugat Methaqualon-Konjugat
Die obigen Konjugate veranschaulichen die Verwendung der Amidbindung zur Verknüpfung eines Haptens in Form einer quartären Ammoniumverbindung, die den Linker CH&sub2; aufweist, wobei der Rest Z C=O ist und das gezeigte NH von der Amingruppe des Trägers abgeleitet ist.
Vorzugsweise ist das quartäre Haptenderivat Ammonium, das unter bekannten Bedingungen, die normalerweise zur Bildung von Amidbindungen verwendet werden, an den Träger gekoppelt ist. Das Haptenderivat in Form der quartären Ammoniumverbindung kann zur Verknüpfung mit der Amingruppe des Trägers mit einer Verknüpfungsgruppe umgesetzt werden, die eine Carboxygruppe aufweist, wie Ethylbromacetat (BrCH&sub2;CO&sub2;C&sub2;H&sub5;).
Andere Verknüpfungen zwischen der Verknüpfungsgruppe und dem Träger, wie Imin-, Diazo-, Alkyl-, Harnstoff-, Thioharnstoff-, Carbamat- und Thiocarbamatverknüpfungen, können ebenfalls unter bekannten Bedingungen und mit bekannten Verfahren hergestellt werden.
Quartäre Ammoniumgruppen enthaltende Konjugate, bei denen der Träger ein Reporter, wie ein Latexteilchen, ist, können hergestellt werden, indem man zuerst ein tertiäres Hapten oder Haptenderivat durch Anbringen einer geeigneten bifunktionellen Verknüpfungsgruppe derivatisiert, wie es oben beschrieben ist, und dann die Verknüpfungsgruppe über ihre reaktive Gruppe an eine funktionelle Gruppe an dem Teilchen bindet. Alternativ dazu kann das quartäre Ammoniumgruppen enthaltende Konjugat der vorliegenden Erfindung auch hergestellt werden, indem man ein Hapten oder Haptenderivat in Form eines tertiären Amins, das eine tertiäre Aminfunktion aufweist, direkt mit einem Teilchen umsetzt, das geeignete funktionelle Gruppen für die Verknüpfung mit dem tertiären Amin des Haptens oder seines Derivats aufweist. Zum Beispiel offenbart das an Craig et al. ausgegebene US-Patent Nr. 4,480,042 Polystyrol/Polyglycidylmethacrylat-Latexteilchen, die direkt mit dem tertiären Amin des Haptens oder seines Derivats verknüpft werden können. Die Verknüpfungsreaktion, die die Alkylierung von Aminen durch Epoxide mit bekannten Methoden beinhaltet, ist unten gezeigt:
Die quartäre Ammoniumgruppen enthaltenden Konjugate der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um mit bekannten Antikörpererzeugungs- und -durchmusterungsverfahren Antikörper hervorzubringen. Das Immunogen kann in geeignete Wirtstiere injiziert werden, um die Erzeugung von Antikörpern zu stimulieren. Die so erzeugten Antikörper können zur direkten Verwendung in spezifischen Bindungsreaktionen mit dem Hapten oder nahe verwandten Analoga entnommen werden, oder sie können zuerst mit einem von mehreren bekannten Mitteln, wie Affinitätschromatographie, aus Tierserum gereinigt werden. Alternativ dazu können die aus dem geimpften Wirt entnommenen Immunlymphocyten auch unter Verwendung der Konjugate dieser Erfindung durchmustert werden, um solche Zellen auszuwählen, die auf das quartäre Ammoniumgruppen enthaltende Konjugat ansprechen. Diese können dann mit geeigneten Myelomzellen fusioniert werden, so dass Hybridome entstehen, die monoklonale Antikörper erzeugen können. Verfahren der Zellfusion, Selektion und Proliferation sind wohlbekannt und sind im allgemeinen Modifikationen der Verfahren von Kohler et al., Nature, Vol. 256, 495-497 (1975).
Es ist bekannt, dass die Natur der Bindung zwischen dem Hapten und dem Träger eines immunogenen Konjugats die Fähigkeit des Konjugats beeinflussen kann, für den Nachweis des Haptens geeignete Antikörper hervorzubringen. Überraschenderweise sind die quartäre Ammoniumgruppen enthaltenden immunogenen Konjugate der vorliegenden Erfindung in der Lage, Antikörper mit geeignet hoher Spezifität für den Nachweis und/oder die Quantifizierung eines interessierenden Haptens hervorzubringen.
Die Konjugate der vorliegenden Erfindung können in Immunoassays zur Bestimmung eines Haptens verwendet werden. Zum Beispiel können Immunoassays mit dem quartäre Ammoniumgruppen enthaltenden immunogenen Konjugat der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, wobei man das immunogene Konjugat mit einem unbekannten Hapten um Bindungsstellen an einem Antikörper gegen das Hapten konkurrieren lässt. Das immunogene Konjugat kann auf einer festen Phase immobilisiert sein, oder die spezifischen Bindungsreaktionen können in Lösung erfolgen. Wenn eine Abtrennung nicht umgesetzter Reagentien gewünscht wird, werden die Reaktionen am leichtesten mit dem auf einer festen Phase immobilisierten immunogenen Konjugat durchgeführt.
Immunoassays, bei denen die immunogenen Konjugate der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, können auch in einem nichtkompetitiven Format durchgeführt werden, wobei man einen Überschuss an markiertem spezifischen Antikörper verwendet, der mit dem unbekannten Hapten reagieren soll. Bei diesem Ansatz wird das quartäre Ammoniumgruppen enthaltende Konjugat an einen festen Träger gebunden und verwendet, um ungebundenen markierten spezifischen Antikörper zu entfernen. Die Menge des Markers, der in Lösung bleibt oder an die feste Phase gebunden ist, kann als Hinweis auf die Menge des vorhandenen unbekannten Haptens gemessen werden.
Die quartäre Ammoniumgruppen enthaltenden immunogenen Konjugate der vorliegenden Erfindung umfassen Konjugate von Haptenen mit nichtimmunogenen Trägern, wie Reporterverbindungen, und können zum Beispiel Reporterreagentien umfassen, bei denen es sich um fluoreszenzmarkierte, chemilumineszente oder enzymmarkierte quartäre Ammoniumgruppen enthaltende immunogene Konjugate handelt. Solche reportermarkierten Reagentien können verwendet werden, um ein Hapten in einer Testprobe nachzuweisen und/oder zu quantifizieren, wobei man irgendein bekanntes Immunoassayformat verwendet. Zu diesen bekannten Immunoassayformaten gehören heterogene und homogene, kompetitive und nichtkompetitive Formate.
Die immunogenen Konjugate der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Antikörper hervorzubringen, die wiederum in irgendeinem bekannten Immunoassayformat verwendet werden können, bei dem spezifische Bindungsreaktionen eingesetzt werden. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung werden gegen die quartäre Ammoniumgruppen enthaltenden immunogenen Konjugate hergestellt, wie es oben beschrieben ist, und können in jedem bekannten Immunoassayformat verwendet werden. Solche Immunoassays können in verschiedenen Testproben von biologischen Flüssigkeiten durchgeführt werden; dazu gehören zum Beispiel Serum, Plasma, Blut, Urin und Speichel.
Immunoassays, bei denen Antikörper verwendet werden, die gegen die quartäre Ammoniumgruppen enthaltenden immunogenen Konjugate der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, können mehrere bekannte Formate haben und können heterogen oder homogen, kompetitiv oder nichtkompetitiv sein. Beispiele für geeignete Immunoassays sind bekannte ELISA (enzyme linked immunosorbent assays), Sandwichimmunoassays, Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays, nephelometrische Assays und Teilchenagglutinierungs-Immunoassays, wie solche, bei denen Latexteilchen eingesetzt werden. Die eingesetzten Antikörper können mit Reportern, wie Enzymen, markiert sein oder ohne weitere Modifikation verwendet werden.
Bei einem Teilchenagglutinierungsassay wird die Änderung der Trübung gemessen, die durch die Teilchenagglutinierung oder deren Hemmung verursacht wird. Quartäre Ammoniumgruppen enthaltende immunogene Konjugate, bei denen der Träger ein Latexteilchen ist, können so hergestellt werden, wie es oben beschrieben ist. Durch die Agglutinierung oder Hemmung der Reaktion solcher Konjugate mit Agglutinierungsmitteln wie einem Hapten in einer Testprobe können Antikörper potentiometrisch bestimmt werden. Die Reaktion kann durch direkte Konkurrenz zwischen den Teilchenreagentien und dem Hapten oder durch Reaktion des Haptens mit Antikörper und anschließender Zugabe des Teilchenreagens durchgeführt werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung eines quartäre Ammoniumgruppen enthaltenden Methadon-Haptens für ein immunogenes Konjugat

A. Herstellung von Methadon (freie Base)

Methadon (freie Base) wurde für den weiter unten beschriebenen Schritt B hergestellt, indem man 10 g Methadon-Hydrochlorid in 100 ml warmem Wasser von ungefähr 50ºC löste und die freie Base aus der Lösung auskristallisierte, indem man langsam 20 ml einer gesättigten wässrigen Kaliumcarbonatlösung, pH 12,2, unter Rühren zu der Methadon-Hydrochlorid-Lösung gab. Nachdem die Kristallisation beendet war, wurden die Methadonkristalle abfiltriert und in etwa 75 ml Ethanol (EtOH) wieder aufgelöst. Danach wurde das Methadon durch die Zugabe von 200 ml Wasser ausgefällt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Die resultierende Ausbeute an Methadon betrug 8,79 g Methadon oder ungefähr 98%.

B. Herstellung von N-Carboxymethylmethadonethylesterbromid

N-Carboxymethylmethadonethylesterbromid wurde wie folgt hergestellt:
Zu 3,1 g Methadon (freie Base), das hergestellt wurde, wie es oben in Schritt A beschrieben ist, wurden 1,11 ml Ethylbromacetat gegeben, das in 10 ml warmem (ungefähr 40ºC) Ethylacetat aufgelöst worden war. Man ließ das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur reagieren, um das tertiäre Aminderivat N-Carboxymethylmethadonethylesterbromid herzustellen. Dann wurde das Gemisch auf 60ºC erhitzt und 1 h lang auf dieser Temperatur gehalten. Das erhitzte Gemisch wurde dann mit 10 ml Ether gemischt, und das feste N-Carboxymethylmethadonethylesterbromid wurde abfiltriert und mit ungefähr 30 ml Ether gewaschen. Dann wurde das N-Carboxymethylmethadonethylesterbromid 5 h lang im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an N-Carboxymethylmethadonethylesterbromid betrug 4,887 g oder ungefähr 100%.

C. Herstellung von N-Carboxymethylmethadonbromid (CMM)

Ein quartäres Ammoniumderivat von Methadon, das zur Herstellung eines immunogenen Konjugats für einen Immunoassay für Methadon geeignet ist, N-Carboxymethylmethadonbromid (CMM), wurde wie folgt hergestellt:
Das oben in Schritt B hergestellte quartäre Ammoniumderivat N-Carboxymethylmethadonethylesterbromid wurde mit 2 ml 5 M Natronlauge (NaOH) und 15 ml Wasser gemischt. Dieses Gemisch wurde dann 5 h lang bei 50ºC erhitzt. Während des Erhitzens löste sich das anfangs feste N-Carboxymethylmethadonethylesterbromid auf. Die resultierende Lösung wurde dann eingefroren und lyophilisiert. Das Äquivalentgewicht des N-Carboxymethylmethadonbromids, d. h. ohne Abtrennung von Natriumbromid, betrug 460 g. Die Ausbeute an N-Carboxymethylmethadonbromid betrug 4,21 g oder ungefähr 91,6%.

Beispiel 2

Herstellung eines immunogenen Konjugats eines quartären Ammoniumderivats von Methadon

Ein immunogenes Konjugat eines quartären Ammoniumderivats von Methadon und eines immunogenen Trägers, Schlitzschnecken-Hämocyanin (KLH), wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens hergestellt.
Ein immunogenes Konjugat von N-Carboxymethylmethadon/KLH wurde wie folgt hergestellt:
Eine Menge von 179 mg Disuccinimidylcarbonat (DSC) wurde in 3 ml trockenem Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, um eine 0,5 mM Lösung von DSC in DMSO herzustellen. Die DSC-Lösung wurde zu 138 mg eines Gemischs gegeben, das CMM und NaBr in einem Stoffmengenverhältnis von 1 : 1 enthielt, die in 3 ml DMSO gelöst waren (0,3 mM Lösung des Gemischs von CMM und Naßr in DMSO). Das CMM wurde unter Verwendung des oben in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens hergestellt. Man ließ das Reaktionsgemisch 1 h lang stehen.
Ein Volumen von 1,6 ml des entstehenden Reaktionsgemischs wurde unter Rühren zu einer Lösung von 50 mg des immunogenen Proteinträgers Schlitzschnecken-Hämocyanin (KLH) gegeben, das in 10 ml Wasser gelöst war. Man ließ das resultierende Gemisch 3,5 h lang ungestört stehen und dialysierte es dann über Nacht gegen 10 l Wasser.

Beispiel 3

Herstellung eines monoklonalen Anti-Methadon-Antikörpers gegen ein quartäre Ammoniumgruppen enthaltendes immunogenes Methadonkonjuqat

Für die Herstellung von antikörpererzeugenden Hybridomzellen wurden Standard-Hybridomtechniken verwendet. Das wie oben in Beispiel 2 beschrieben hergestellte immunogene Konjugat N-Carboxymethylmethadon/KLH wurde in Wirtsmäuse injiziert, um eine Antikörperproduktion hervorzurufen, dann wurden die Milzzellen aus den geimpften Mäusen mit Myelomzellen fusioniert, so dass antikörpererzeugende Hybridome entstanden, und ein Antikörper gegen Methadon zur Verwendung in einem Immunoassay für Methadon wurde selektiv herausgesucht. Das verwendete Verfahren war im wesentlichen dasselbe wie das von Geltosky im US-Patent Nr. 4,524,025 und von Kohler und Milstein, Nature, Vol. 256, 495-497 (1975), beschriebene.

Beispiel 4

Inhibitionsassay für Methadon unter Verwendung eines monoklonalen Anti-Methadon-Antikörpers, der aus einem quartäre Ammoniumgruppen enthaltenden immunogenen Methadonkonjugat hergestellt wurde

Näpfe einer Immulon-II-96-Napf-Polystyroimikrotiterplatte (Dynatec, USA) wurden mit jeweils 50 ul eines immunogenen Methadon/Ovalbumin-Konjugats in einer Konzentration von 5 ug/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Sigma Chemical Co., Milwaukee, Wi.), pH 7,2, beschichtet und über Nacht 18 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden die Platten dreimal mit PBS, pH 7,2, gewaschen. Eine Menge von 200 ul PBS, das 3% Fraktion V BSA (Sigma Chemical Co., Wisconsin, USA) enthielt, pH 7,2, wurde in jeden Napfgegeben und 120 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Behandlung blockierte alle verbleibenden adsorptiven Stellen in Plattennäpfen, die nicht von dem Konjugat besetzt waren, so dass die unspezifische Adsorption von anschließend zugegebenen Reagentien verhindert wurde. Dann wurden die Platten dreimal mit PBS, pH 7,2, gewaschen und bis zur Verwendung bei einer Temperatur von 4ºC aufbewahrt.
Ein Inhibitionsimmunoassay wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Ein Assaypuffer wurde verwendet, der 3% BSA in PBS und 0,05% GAFACTM (GAF Corp., USA) enthielt, pH 7,2. (Anstelle von GAFAC können auch andere Tenside, wie Triton® X-100 (Rohm & Haas Corp., Pa, USA), verwendet werden.) Der wie oben in Beispiel 3 beschrieben hergestellte Anti-Methadon-Antikörper wurde in dem Assaypuffer ungefähr 1 : 10 verdünnt. Eine Menge von 50 ul des verdünnten Anti-Methadon-Antikörpers wurde mit einem gleichen Volumen wässrigem Methadon-Hydrochlorid bei einer Konzentration wie in demselben Assaypuffer vorgemischt. Dann wurde eine Menge von 75 ul dieses Gemischs in jeden Napf der beschichteten Mikrotiterplatte übertragen und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde das Gemisch durch dreimaliges Waschen mit PBS, pH 7,2, entfernt, und anschließend wurden 100 ul Konjugat von Ziegen- Antimaus-Antikörper/Meerrettich-Peroxidase (HRP) (Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, Ca), hinzugefügt. Die Platten wurden 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde das HRP-Konjugat durch Waschen mit Assaypuffer entfernt, und 100 ul einer Stammlösung eines chromogenen Substrats, ABTS (Kirkegaard und Perry Laboratories in Gaithersburg, Md, USA), wurden in jeden Mikrotiterplattennapfgegeben und 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die resultierende Änderung der optischen Dichte wurde unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Lesegeräts in einem Wellenlängenbereich von 405-490 nm gemessen. Die Ergebnisse des Inhibitionsassays für Methadon sind unten in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Hemmung der Bindung des Anti-Methadon-Antikörpers an immunogenes Methadon/Ovalbumin-Konjugat durch Methadon

Methadon (ng/ml) optische Dichte (mExtinktionseinheiten)

0,00 421
0,017 438
0,51 425
1,52 433
4,57 414
13,70 380
41,20 343
124,00 255
370,00 147
1111,00 65
3333,00 35
Die Ergebnisse in Tabelle 2 weisen darauf hin, dass Anti-Methadon-Antikörper, die gegen immunogene Konjugate von N-Carboxymethylmethadon/KLH erzeugt wurden, an ein immunogenes Methadon/Ovalbumin-Konjugat binden, das an einer festen Phase immobilisiert ist, und dass die quartäre Ammoniumgruppen enthaltenden Konjugate der vorliegenden Erfindung für Immunoassays für Methadon geeignet sind.

Beispiel 5

Herstellung eines quartäre Ammoniumgruppen enthaltenden Methadon-Latexteilchenreagens

Eine Menge von 400 ul einer 0,2 M wässrigen Lösung von Methadon-Hydrochlorid (Sigma Chemical Co., WI, USA) wurde zu einem Gemisch gegeben, das 200 ul einer 0,1 M wässrigen Lösung von Ethylendioxydiethylamin (Fluka Chemical Co., USA) und 4,4 ml 40 mM Natriumtetraborat-Decahydrat (Sigma Chemical Co., WI, USA) mit 2,2% Rhodofac RE-610 (Rhone Poulenc Corp., NJ, USA) enthielt. Zu der resultierenden Suspension gab man 5 ml eines Gemischs von 60 nm großen Polystyrol/Polyglycidylmethacrylatlatex-Teilchen mit einem Feststoffgehalt von 20%. Die Teilchen wurden unter Verwendung eines Verfahrens hergestellt, das im wesentlichen demjenigen ähnlich war, das im US-Patent Nr. 4,480,042 offenbart ist, welches am 30. Oktober 1984 an Craig et al. ausgegeben wurde.
Das Gemisch wurde 18 Stunden lang auf 70ºC erhitzt und dann mit 10 ml eines Waschpuffers verdünnt, der aus 150 mM Phosphatpuffer von pH 7,8 mit 0,5% Rhodofac bestand. Das Gemisch wurde in einer RC-28S-Sorval®-Zentrifuge (E. I. du Pont de Nemours and Company, DE, USA) mit 28 000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Sediment wurde mit Hilfe eines Sonikators in 20 ml Waschpuffer resuspendiert. Die Zentrifugations- und Resuspensionsschritte wurden noch dreimal wiederholt.

Beispiel 6

Immunoassay unter Verwendung von quartäre Ammoniumgruppen enthaltendem Methadon-Latexteilchenreagens

Ein Assaypuffer wurde hergestellt, der 2,62 g/l Dinatriumhydrogenphosphat- Monohydrat, 11,5 g/l, wasserfreies Natriumdihydrogenphosphat, 0,6% Rhodofac und 3% PEG 8000 enthielt, wobei der pH-Wert auf 7,2 eingestellt wurde. Die wie oben beschrieben hergestellten Latexteilchen wurden im Assaypuffer 1 : 50 verdünnt, so dass eine Latexreagenslösung entstand.
Eine Stammlösung wurde hergestellt, die 160 ug/ml gereinigten monoklonalen Antikörper gegen Methadon, welcher unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Hybridomtechniken hergestellt wurde, in 150 mM Natriumchlorid, 100 mM Natriumphosphat und 1% BSA bei pH 5,5 enthielt.
Kalibratorlösungen von Methadon-Hydrochlorid wurden hergestellt, indem man 1 mg/ml Konzentrat von Methadon-Hydrochlorid in Wasser mit einem Puffer verdünnte, der 15 mM Natriumphosphatpuffer mit 0,35% Rhodofac enthielt.
Der Assay wurde unter Verwendung eines Cobas-Bio-Diagnoseinstruments (Roche Diagnostics, NJ, USA) durchgeführt. Das Instrument war so programmiert, dass es 3 ul der wie oben beschrieben hergestellten Kalibratorlösung mit 150 ul der wie oben beschrieben hergestellten LatexreagensLösung und 51 ul Wasser mischte. Dieses Gemisch wurde 30 s lang inkubiert, um es bis auf 37ºC zu bringen, und anschließend wurden 20 ul der oben beschriebenen Lösung des gereinigten monoklonalen Antikörpers hinzugefügt. Die Änderung der optischen Dichte wurde nach 240 s Reaktionszeit aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Methadon (ug/ml) Änderung der optischen Dichte (Milliextinktion)

0 483
0,5 453
1,0 393
2,5 356
5,0 259
10 145
25 44,5
50 22
Die Ergebnisse in Tabelle 3 weisen darauf hin, dass freies Methadon mit dem immunogenen Konjugat oder Methadon-Teilchenreagens um die Bindung mit dem Anti-Methadon-Antikörper konkurriert, so dass die Anwesenheit von freiem Methadon zu einer Abnahme oder Hemmung der Teilchenagglutinierung führt, und dass das verwendete Methadon-Teilchenreagens als Reagens in einem Teilchenagglutinierungs-Immunoassay für die Bestimmung von Methadon geeignet ist.

Claims

1. Quartäre Ammoniumgruppe enthaltendes Konjugat, das geeignet ist zum Hervorbringen von Antikörpern gegen ein Hapten, das keine quartäre Ammoniumgruppe enthält, oder in einem Immunoassay zum Nachweis der Anwesenheit und/oder zur Bestimmung der Menge eines Haptens, das keine quartäre Ammoniumgruppe enthält, in einer Testprobe, wobei das Hapten, das keine quartäre Ammoniumgruppe enthält, eine tertiäre Amingruppe aufweist oder so derivatisiert werden kann, dass es eine tertiäre Amingruppe aufweist, wobei das eine quartäre Ammoniumgruppe enthaltende Konjugat die Formel

((Q&spplus;-L-Z-)-x-M)B&supmin;

hat, wobei

Q&spplus; eine cyclische oder acyclische quartäre Ammoniumgruppe ist, die aus einer kovalenten Verknüpfung eines Linkers mit dem Hapten hervorgegangen ist;

L ein Linker ist, der 1 bis 20 Kohlenstoffatome und Heteroatome einschließlich nicht mehr als 6 Heteroatomen umfasst, die in einer geradkettigen oder verzweigten Kette angeordnet sind und/oder Ringstrukturen enthalten, wobei nicht mehr als zwei Heteroatome in Folge miteinander verknüpft sind;

Q&spplus; mit L an der tertiären Aminogruppe des Haptens verknüpft ist;

-Z- eine Restgruppe ist, die aus -C=O-, -CH=, -N=N-, -NH-, -NHCH&sub3;-, - NH-S=C-, -SO&sub2;-, -O-C=O- und -C=O-NH-NH&sub2; ausgewähft ist;

x größer oder gleich 1 ist;

M ein Träger ist;

B&supmin; ein Anion ist; und

(Q&spplus;-L-Z) kovalent an M gekoppelt ist.

2. Quartäre Ammoniumgruppe enthaltendes Konjugat gemäß Anspruch 1, wobei der Träger aus Proteinen, Glycoproteinen, Polypeptiden, Kohlenhydraten und Latexteilchen ausgewählt ist.

3. Quartäre Ammoniumgruppe enthaltendes Konjugat gemäß Anspruch 1, wobei der Träger ein Latexteilchen ist.

4. Quartäre Ammoniumgruppe enthaltendes Konjugat gemäß Anspruch 1, wobei das Hapfien aus Cocain, Methadon, Methaqualon, Propoxyphen, Phencyclidin, Amphetamin, Benzodiazepam, Chinidin, Procanimid, N- Acetylprocanimid und tricyclischen Aminen ausgewählt ist.

5. Quartäre Ammoniumgruppe enthaltendes Konjugat gemäß Anspruch 1, wobei der Linker aus -CH&sub2;CO- und -CH&sub2;COHCO- ausgewählt ist.

6. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen das eine quartäre Ammoniumgruppe enthaltende Konjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Verfahren das Injizieren des eine quartäre Ammoniumgruppe enthaltenden Konjugats in geeignete Wirtstiere umfasst.

7. Immunoassay zum Nachweis der Anwesenheit und/oder zur Bestimmung der Menge eines Haptens, der die Schritte des Immobilisierens des immunogenen Konjugats gemäß Anspruch 2 auf einer festen Phase und des anschließenden Durchführens irgendeiner bekannten Immunoassayvorschrift umfasst.

8. Teilchenagglutinierungs-Immunoassay zur Bestimmung eines Haptens in einer Testprobe, der folgendes umfasst: das Inkubieren des eine quartäre Ammoniumgruppe enthaltenden Konjugats gemäß Anspruch 3, der Testprobe und eines Agglutinierungsmittels sowie das photometrische Messen der erhöhten Teilchengröße, die sich aus der Agglutinierung ergibt.