DE69520111T2

DE69520111T2 - Schätzung des Fragmentierungsmusters von Kollagen in Körperflüssigkeiten und Diagnose von mit dem Kollagenmetabolismus zusammenhängenden Störungen

Info

Publication number: DE69520111T2
Application number: DE69520111T
Authority: DE
Inventors: Martin Bonde; Per Qvist
Original assignee: Osteometer Biotech AS
Current assignee: Immunodiagnostic Systems Nordic AS
Priority date: 1994-10-17
Filing date: 1995-10-16
Publication date: 2001-09-06
Anticipated expiration: 2015-10-17
Also published as: EP0787301B1; ATE199185T1; WO1996012193A1; ES2154739T3; US6372442B1; DE69520111D1; JPH10507266A; AU3746295A; EP0787301A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Schätzen des Fragmentierungsmusters von Kollagen in Körperflüssigkeiten. Ferner betrifft die Erfindung analytische Systeme, die dann zum Einsatz zu bringen sind, wenn das Fragmentierungsmuster des Kollagens bestimmt werden soll. Weiterhin betrifft die Erfindung noch die Verwendung der oben stehend genannten Verfahren zur Diagnostik und zur Charakterisierung der Anwesenheit von Störungen, die im Zusammenhang mit dem Stoffwechsel der Knochen stehen.
Die Erkrankungen der Knochen, darunter die Osteoporose, stellen eine zunehmende Belastung für die Gesellschaft dar. In den Vereinigten Staaten von Amerika dürften für das Jahr 1992 die Gesamtkosten im Hinblick auf die Osteoporose, die alleine auf Verletzungen beruhen, auf eine Höhe von mindestens 10 Milliarden US - Dollar zu schätzen sein [Riggs in: New England J. of Medicine, 327, S. 620-627 (1992)].
Die Osteoporose wie auch eine Anzahl anderer Erkrankungen des Knochens ist durch ein erhöhtes Ausmaß an Knochenverlust im Vergleich zu dem Grad an entsprechendem Verlust bei einer gesunden Population gekennzeichnet. Es wurde aufgezeigt, dass das Ausmaß des Verlustes in ganz hohem Ausmaß mit dem Risiko einer künftigen Fraktur korreliert (Christiansen et al.: "Prediction of future fracture risk" in: Christiansen et al. (Herausgeb.), Proceedings, (1993), 4. Internationales Symposium über die Osteoporose, Hongkong, Osteopress Aps., (1993), S. 52-54). Aus diesem Grunde stellt das Ausmaß an Verlust einen wichtigen Parameter für die Schätzung dar, um eine Diagnose derartiger Erkrankungen durchzuführen.
Eine Schlüsselrolle für die Bestimmung des Ausmaßes an Verlust spielt dabei die Schätzung der Resorptionsrate des Knochens. Obwohl die Verlustrate die Nettodifferenz zwischen den jeweiligen Raten der Knochenbildung und der Knochenresorption darstellt, hat es sich bestätigt, dass die Stoffe zum Markieren der Resorption von Knochenmaterial alleine schon ein gutes Mittel zum Schätzen des Ausmaßes an Verlust (an Knochen) darstellen (Bonde et al.: "Immunoassay for Quantifying Type 1 Collagen Degradation Products in Urine Evaluated" in Clin. Chem. 40, Heft 11, (1994), Seiten 2022-2025 in Endocrinology and Metabolism. Die Einschätzung des Verlustes an Knochen wird allerdings dadurch verbessert, dass auch Mittel zum Markieren der Bildung von Knochen mit eingeschlossen werden (Qvist et al. in American Society of Bone and Mineral Research, Abstract # B 419, (1994), Kansas City).
In der Vergangenheit wurden Analysensätze entwickelt, um den Abbau von Kollagen laufend in vivo verfolgen zu können, und zwar in der Weise, dass verschiedene biochemische Mittel zur Markierung gemessen wurden; dabei stellten einige unter ihnen Abbauprodukte des Kollagens dar.
Beispielsweise wird Hydroxyprolin, die eine sich im Großen und Ganzen auf Kollagen beschränkende Aminosäure darstellt und das hauptsächliche Strukturprotein in Knochen und allen anderen Bindegeweben bildet, im Harn ausgeschieden. Es ist bekannt, dass dessen Ausscheidungsrate (d. h. des Hydroxyproteins) unter bestimmten Bedingungen erhöht ist, und zwar in nennenswerter Weise bei der Paget's Erkrankung, einer Stoffwechselstörung des Knochens, bei welcher der Umsatz an Knochen in außerordentlicher Weise erhöht ist, wie weiter unten noch zu diskutieren sein wird.
Aus diesem Grunde wurde das im Harn vorkommende Hydroxyprolin bislang in ganz verbreiteter Weise als ein Stoff zur Markierung in Form einer Aminosäure im Hinblick auf den Abbau des Kollagens zum Einsatz gebracht, siehe Singer, F. R. et al. in Metabolic Bone Disease, Band II (Herausgeber Avioli, L. V., sowie Kane, S. M.), S. 489-575 (1978), Academic Press, New York.
Das US-Patent Nr. 3 600 132 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Hydroxyprolin in Körperflüssigkeiten, wie zum Beispiel im Serum, Harn, Lumbalflüssigkeit und anderen interzellulären Flüssigkeiten, um die Abweichungen bei dem Stoffwechsel des Kollagens laufend zu überwachen. In dem Patent wird darauf hingewiesen, dass das Hydroyprolin mit einem erhöhten Aufbau des Kollagens einhergeht oder umgekehrt, sein Abbau mit pathologischen Bedingungen verknüpft ist, wie zum Beispiel bei der Paget'- schen Erkrankung, dem Marfan'schen Syndrom, der unvollständigen Knochenbildung (Osteogenesis imperfecta) oder dem neoplastischen (geschwulstbildenden) Wachstum in Geweben auf Basis von Kollagen und bei verschiedenen Formen von Zwergwuchs (Nanismus).
Bisher wurde die Resorption von Knochen, die im Zusammenhang mit der Paget'schen Erkrankung steht, auch in der Weise laufend überwacht, dass kurze Peptide mit einem Gehalt an Hydroxyprolin gemessen wurden, die in dem Harn im Gefolge des Abbaus von Koh lagen im Knochen ausgeschieden werden, vgl. Russell et al. in Metab. Bone Dis. sowie Rel. Res. 4 und 5, 2250262, (1981) sowie Singer, F. R. et al., wie oben angeführt.
In dem Fall von Paget'scher Erkrankung wird die erhöhte Ausscheidung des Hydroxyprolins im Harn wahrscheinlich im Großen und Ganzen durch den Abbau an Knochen verursacht, wobei jedoch das Hydroxyprolin im allgemeinen nicht als ein spezifischer Indikator (Index) für den Abbau an Knochen herangezogen werden kann. Eine große Menge an Hydroxyprolin im Harn kann aus der Neusynthese von Kollagen herrühren (beträchtliche Mengen an neu gebildetem Protein werden abgebaut und wieder ausgeschieden, ohne jemals in die Struktur des Gewebes eingebaut zu werden), sowie aus dem Umsatz von bestimmten Proteinen des Blutes wie auch anderer Proteine stammen, die einen Gehalt an Hydroxyprolin aufweisen.
Des Weiteren werden etwa 80% des freien Hydroxyprolins, das aus dem Abbau von Proteinen stammt, in der Leber verstoffwechselt und erscheinen somit niemals in dem Harn, siehe Kiviriko, K. I. in Int. Rev. Connect. Tissue Research 5: 93 (1970), sowie Weiss, P. H, und Klein, L. J. in Clin. Invest. 48: 1, (1969). Das Hydroxyprolin stellt ein gutes Mittel zum Markieren von Osteoporose dar, da es für Kollagen im Knochen sogar in dem Falle spezifisch ist, dass es für die Resorption von Knochen keine Spezifität zeigt; allerdings ist diese Verbindung schwierig in der Handhabung.
Das Hydroxylysin und seine Abkömmlinge in Form von Glykosiden, die jeweils eine Besonderheit im Hinblick auf kollagene Proteine darstellen, wurden in der Weise in Betracht gezogen, dass sie als Mittel zum Markieren des Abbaus an Kollagen exakter sind als das Hydroxyprolin. Wahrscheinlich jedoch stellen das Hydroxylysin und dessen Glycoside aus denselben Gründen, wie sie oben stehend im Hinblick auf das Hydroxyprolin dargelegt worden sind, in gleicher Weise unspezifische Mittel zum Markieren der Resorption von Knochen dar, vgl. Krane, S. M. und Simon, L. S. in: Develop. Biochem., 22: 185, (1981).
Andere Wissenschaftler untersuchten die Verbindung 3--Hydroxypyridin in Form eines Vernetzers als Indikator (Indexzahl) des Abbaus von Kollagen bei Erkrankungen von Gelenken, vgl. im Hinblick auf den Hintergrund lediglich beispielhaft Wu und Eyre in: Biochemistry, 23: 1850, (1984), und Black et al in: Annals of the Rheumatic Diseases, 45, S. 969-973, (1986) sowie Seibel et al. in: The Journal of Dermatology, 16, Seite 964, (1989). Im Gegensatz zu der vorliegenden Erfindung hydrolisierten diese früheren Wissenschaftler Peptide aus Körperflüssigkeiten und hielten im Anschluss daran Ausschau nach der Anwesenheit freier Reste von 3 - Hydroxypyridin.
In der EP - 0 394 296 und in dem US - Patent Nr. 4 973 666 und dem US - Patent Nr. 5 140 103 wurden Analysenverfahren zur Bestimmung des Abbaus von Kollagen vom Typ I, II und III offenbart. Diese Patente beschränken sich jedoch auf Fragmente des Kollagens mit einem Gehalt an dem 3-Hydroxypyridin als Vernetzungsmittel. Des Weiteren erfordern die oben stehend erwähnten Analysenverfahren diffizile und komplizierte Reinigungsschritte aus dem Urin im Hinblick auf die Fragmente des Kollagens mit einem Gehalt an 3-Hydroxypyridin, die zur Herstellung von Antikörpern und für Antigene in den Analysenverfahren zum Einsatz gelangen.
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt stehen hur äußerst wenige klinische Werte zur Verfügung, die im Hinblick auf den Lösungsansatz zur Verwendung gelangen, wie er in dem US- Patent Nr. 4 973 666 und dem US - Patent Nr. 5 140 103 beschrieben ist. Insbesondere wurden bislang keine Werte publiziert, welche im Zusammenhang mit der Korrelation zwischen der Harnkonzentration (gemäß einer Bestimmung anhand von Verfahren, wie sie in den obenstehend erwähnten Patenten beschrieben sind) an 3 - Hydroxypyridin mit einem Gehalt an Telopeptiden des Kollagens vom Typ I und dem tatsächlichen Verlust an Knochen (gemäß der Bestimmung anhand wiederholter Messungen mittels der Knochen- Densiometrie) stehen. Die Anwesenheit von 3 - Hydroxypyridin mit einem Gehalt an Telopeptiden im Harn setzt die ordentliche Bildung dieser spezifischen vernetzenden Struktur im Knochengewebe zu verschiedenen Zeitpunkten vor dem Prozess der Resorption von Knochenmaterial voraus. Es stehen nur äußerst wenige Informationen über diese Vorgänge zur Verfügung, so dass es wünschenswert wäre, diese Abhängigkeit von der exakten Bildung der vernetzten Struktur zu umgehen.
Die WO-A-9 221 698 beschreibt die Erkennung verschiedener Abbauprodukte des Kollagens, zum Beispiel verschiedene Telopeptide des Kollagens vom Typ I anhand von immunologischen Hilfsmitteln. Der Anteil an Peptid, das mit einem beschriebenen monoklonalem Antikörper in Reaktion tritt, kann in Korrelation zu der Menge an anderen Peptiden stehen, die in größeren Mengen auftreten; dieser Anteil kann auch in Korrelation zu dem Ausmaß an Knochenresorption stehen.
In der britischen Patentanmeldung Nr. 2 205 643 wird berichtet, dass der Abbau des Kollagens vom Typ II in dem Körper in quantitativer Weise dadurch bestimmt werden kann, dass die Konzentration an einem am Stickstoffatom endständigen Telopeptid des Kollagens vom Typ III in einer Körperflüssigkeit gemessen wird. Bei diesem Verfahren werden solche Antikörper zum Einsatz gebracht, die gegen, an dem Stickstoffatom endständige, Telopeptide erzeugt werden und durch einen Abbau von Kollagen vom Typ III mittels bakterieller Kollagenase freigesetzt wurden, wobei diese Telopeptide markiert werden und dann bei dem Analysenverfahren zur Verwendung gelangen.
Von Schröter-Kermani et al. werden in Immunol. Invest., 19, S. 475-491, (1990) Systeme auf Basis von immunologischen Messungen beschrieben, die auf CNBr - Fragmente des Kollagens vom Typ I und 1I gestützt sind. Dabei gelangt ein Kollagen zur Verwendung, das mit Pepsin solubilisiert wurde, wobei die Telopeptide in dem Gewebe belassen werden, vgl. die obenstehend erwähnte Britische Patentanmeldung Nr. 2 205 543.
Die Entwicklung eines monoklonalen Antikörpers, der sich gegen das Kollagen von dem Typ I, das mit Pepsin solubilisiert wurde, richtet, ist in Werkmeister et al. in Eur. J. Biochem., 1987., S. 439-443, (1990) beschrieben. Der Antikörper wird für das immunohistochemische Anfärben von Gewebesegmenten sowie für die Messung des Gehaltes an Kollagen in Zellkulturen zum Einsatz gebracht. Die Messungen werden nicht im Zusammenhang mit Körperflüssigkeiten ausgeführt.
Die Europäische Patentanmeldung Nr. 0 505 210 beschreibt die Entwicklung von Reagenzien auf Basis von Antikörpern anhand der Immunisierung mit gereinigten vernetzten, an dem Kohlenstoffatom endständigen, Telopeptiden aus dem Kollagen vom Typ I. Das Immunogen wird durch die Solubilisierung von Kollagen aus dem menschlichen Knochen mit bakterieller Kollagenase hergestellt. Die auf diese Weise hergestellten Antikörper sind dazu befähigt, mit den vernetzten wie auch den nicht - vernetzten Telopeptiden in Reaktion zu treten, wobei die Vernetzungsmittel von Pyridinolin verschieden sind.
In der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO 91/09114 sind bestimmte synthetische Peptide offenbart, die dazu verwendet werden, die zelluläre Adhäsion an ein festes Substrat zu fördern. Die Verwendung der synthetischen Peptide als immunologische Reagenzien wird darin nicht erwähnt.
Es gibt eine Anzahl von Berichten, die darauf hinweisen, dass der Abbau des Kollagens in der Weise gemessen werden kann, dass bestimmte Propeptide des Kollagens quantitativ ermittelt werden. Die Propeptide unterscheiden sich von den Telopeptiden und der α-helikalen Region der inneren Masse des Kollagens in der Weise, dass sie in dem Molekül in Form des Prokollagens lokalisiert sind, wobei ein weiterer Unterschied im Zeitpunkt ihrer in vivo-Spaltung zu sehen ist, vgl. das US-Patent Nr. 4 504 587, das US-Patent Nr. 4 312 853, sowie Pierard et al. in: Analytical Biochemistry 141, S. 127-136, (1984); Niemela in Clin. Chem. 31-38, S. 1301-1304, (1985) und Rohde et al. in European Journal of Clinical Investigat., 9, S. 451-459, (1979).
Sowohl in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 298 210 als auch in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 339 443 ist die immunologische Bestimmung des Peptids von Prokollagen vom Typ III und von Fragmenten daraus beschrieben. In der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 465 104 ist ferner ein Verfahren offenbart, das auf der Messung des Prokollagens beruht.
Die Verwendung von synthetischen Peptiden mit Sequenzen, die sich von dem Kollagen vom Typ IX ableiten und zur Entwicklung von immunologischen Reagenzien bestimmt sind, ist in der PCT - Patentanmeldung Nr. WO 90 / 08 195 offenbart. Desgleichen wird in dieser Anmeldung der Einsatz von auf diese Weise hergestellten Antikörpern beschrieben, die zur Bestimmung von Fragmenten des Kollagens vom Typ IX in Körperflüssigkeiten produziert worden sind.
Das US-Patent Nr. 4 778 768 betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Veränderungen, die in Knorpelgewebe von Gelenken ablaufen, wobei dieses Verfahren die quantitative Bestimmung von Monomeren des Proteoglykans oder von antigenen Fragmenten daraus in einer Probe aus Synovialflüssigkeit mit einschließt.
Von Dodge werden in J. Clin. Invest., 83, S. 647-661, (1981) Verfahren zur Analyse des Abbaus von Kollagen von dem Typ II offenbart, wobei ein polyklonales Antiserum zur Verwendung gelangt, das in spezieller Weise mit unbeschädigten Alpha - Ketten und Peptiden reagiert, die mittels Cyanogenbromid abgeleitet sind und aus menschlichen und Rinderkollagenen von dem Typ II stammen. Die Abbauprodukte des Kollagens wurden zwar nicht in einer Körperflüssigkeit erkannt, aber histochemisch mittels Anfärbung von Zellkulturen, d. h. durch eine Erkennung "in situ" erfaßt.
In der WO 94/03813 wird ein kompetitiver immunologischer Analysensatz zur Erkennung von Kollagen oder Fragmenten des Kollagens in einer Probe beschrieben, worin ein Bindungspartner mit einem Gehalt an einem synthetischen linearen Peptid, das der nichthelikalen, an einem Kohlenstoffatom endständigen oder an dem Stickstoffatom endständigen Domäne des Kollagens entspricht, mit einem Antikörper gegenüber dem linearen synthetischen Peptid und der Probe inkubiert wird, wobei darin die Bindung des Antikörpers an den Bindungspartner bestimmt wird.
Die WO 95/08115 betrifft Analysenverfahren, bei denen die Fragmente des Kollagens in einer Körperflüssigkeit durch die Reaktion mit einem Antikörper bestimmt werden, der mit einem synthetischen Peptid in Reaktion treten kann. Die Gehaltsbestimmung kann in Form eines kompetitiven Analysensatzes vorliegen, bei dem die Probe und ein derartiges Peptid mit einem Antikörper, möglicherweise auch mit einem polyklonalen Antikörper konkurrieren, wobei der Antikörper gegen Fragmente des Kollagens gerichtet ist, die durch den Abbau des Kollagens mittels der Kollagenase erhalten wurden. In alternativer Weise kann es sich auch um eine Gehaltsbestimmung handeln, bei der ein Antikörper, möglicherweise ein monoklonaler Antikörper, zum Einsatz gebracht wird, der gegen ein derartiges synthetisches Peptid gerichtet ist.
Ein besonderes Peptidfragment, das von uns in der Körperflüssigkeit gefunden wurde, insbesondere im Harn, weist die folgende Formel auf:
In der oben stehenden Formel stellt K-K-K eine Quervernetzung dar, die zum Beispiel eine Vernetzung des Hydroxypyridins darstellen kann, aber auch jegliche andere, in der Natur vorkommende Vernetzung darstellen kann, und in spezieller Weise jegliche beliebige dieser von Last et al. in: Int. J. Biochem., Band 22, Nr. 6, Seite 559-564, (1990), diskutierten Vernetzungen darstellen kann.
In der EP - 0 394 296 wurde über ein längeres Peptidfragment unter Einschluss des obenstehend genannten kürzeren Fragments berichtet.
In einem der Analysenverfahren zur Resorption von Knochen (CrossLapstM), das in der WO 95/08115 beschrieben wurde, werden Fragmente des Kollagens vom Typ I mit einem Gehalt an einer spezifischen Sequenz aus acht Aminosäuren des Telopeptids C aus dem Kollagen vom Typ I quantitativ bestimmt, siehe auch Bonde et al. in: Immunoassay zur quantitativen Bestimmung von Abbauprodukten des Kollagens vom Typ I im Urin, mit einer Berwertung in Clin. Chem. 40-11, S. 2022-2025, (1994) aus "Endocrinology and Metabolism".
Ein anderes Analysenverfahren zur Bestimmung der Knochenresorption, das in der WO 94 / 038 113 beschrieben wurde, betrifft alle Fragments mit einem Gehalt an einer Struktur auf Basis von Pyridinolin und einem Gehalt an zwei Peptidketten der N-Telopeptide des Kollagens vom Typ I, siehe auch Hanson et al. in "A specific immunoassay for monitoring human bone resorption" ("Ein spezieller Immunoassay für die laufende Überwachung der Resorption menschlicher Knochen"): quantitative Bestimmung von vernetzten N-Telopeptiden des Kollagens vom Typ I im Urin, Journal of Bone and Mineral Research, Band 7, Nr. 11, (1992). Wir sind der Ansicht, dass die zu einer Reaktion befähigten Fragmente bei diesen beiden Analysenverfahren eine beträchtliche Streubreite im Hinblick auf ihre Größe und ihren Gehalt an vernetzenden Molekülen, zum Beispiel an Pyridinolin, an dem Chromogen nach Ehrlich und an Pyrrolstruktoren aufweisen.
Verschiedene Untersuchungen wurden angestellt, um die Ergebnisse zu vergleichen, bei denen ein Analysenverfahren gemäß dem Stand der Technik bei den gleichen Proben zum Vergleich mit einem anderen Analysenverfahren zum Einsatz gebracht wurde. Der Zweck dieser Untersuchungen bestand immer schon darin, die Verlässlichkeit dieser Analysenverfahren in Form von Messungen des Ausmaßes der Resorption von Knochen zu erhärten, vgl. zum Beispiel Garnero et al., Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 70, Nr. 3, S. 780-785.
Während bei den Untersuchungen dieses Typs auf die Signifikanz im Zusammenhang mit den Ähnlichkeiten der Ergebnisse geachtet wird, die anhand der unterschiedlichen Analysenverfahren erzielt werden, sind wir dagegen der Ansicht, dass diese es versäumen, die wertvollen Informationen im Hinblick auf den Ursprung und die Ursachen der Resorption von Knochen bei den individuellen Patienten in Betracht zu ziehen, die sich anhand der Unterschiede bei diesen Ergebnissen herausarbeiten lassen.
Das genaue Fragmentierungsmuster des Kollagens vom Typ I in vivo ist bislang noch nicht in vollständiger Weise durchleuchtet worden. Es kannte aber aufgezeigt werden, dass das Fragmentierungsmuster des Kollagens von dem Typ I anhand des Musters der Reaktionsfähigkeit bei den Techniken auf Basis von Messungen mittels der Gelfiltration in signifikanter Weise bei solchen Frauen unterschiedlich ist, welche einer gegen die Resorption gerichteten Therapie unterzogen worden waren, und zwar im Vergleich zu solchen Frauen, die eine andere Therapie verordnet bekommen hatten, siehe Garnero et al. in: American Society of Bone and Mineral Research, Abstract 134, Kansas City, (1994). Es konnte auch noch aufgezeigt werden, dass das Fragmentierungsmuster bei den unbehandelten Frauen (nicht publizierte Beobachtungen) in signifikanter Weise variiert.
Des Weiteren konnte von uns nunmehr die Tatsache erhärtet werden, dass sich diese Unterschiede bei den Fragmentierungsmustern durch die Unterschiede in den Ergebnissen widerspiegeln, die unter Einsatz verschiedener immunologischer Analysenverfahren auf Basis von Abbauprodukten des Knochenkollagens erhalten wurden.
Durch die vorliegende Erfindung wird nunmehr ein Verfahren zum Schätzen des Fragmentierungsmusters von Kollagen, vorzugsweise des Kollagens vom Typ I in einer Körperflüssigkeit geschaffen, welches das Untersuchen einer Probe der genannten Körperflüssigkeit anhand von mindestens zwei unterschiedlichen immunologischen Testverfahren umfasst, wobei durch jedes dieser Verfahren die Menge einer jeweiligen Population aus aufgespaltenen Kollagenprodukten in der genannten Probe gemessen wird und die Ergebnisse aus diesen genannten Messungen miteinander verglichen werden.
Auf diese Weise kann im Falle einer Diagnose auf die Messungen der Fragmente des Kollagens vom Typ I abgezielt werden, wobei mehr Nachdruck auf solche gelegt wird, die einen "pathologischen" Charakter haben können und wobei weniger Nachdruck auf die Fragmente gelegt wird, die im Zusammenhang mit einer "gesunden" Erneuerung des Skeletts gebildet werden.
Dabei wird auch verständlich, dass die Population von aufgespaltenen Produkten, welche durch die jeweiligen Testverfahren erkannt werden, miteinander überlappen können. In der Tat kann eine dieser genannten Populationen in Form einer Unterpopulation vorliegen, die sich vollständig innerhalb der anderen genannten Population befindet.
Die Anwendung einer Vergleichsberechnung, zum Beispiel durch die Bildung der Verhältniszahl zwischen der Konzentration spezifischer Fragmente und der Konzentration anderer Fragmente oder der Summe von Fragmenten ist in diesem Zusammenhang aufgrund der Tatsache außerordentlich relevant, dass eine hohe Resorptionsrate von Knochenmaterial wahrscheinlich bei einer "gesunden" Erneuerung des Skeletts auftreten kann, und zwar selbstverständlich unter der Voraussetzung, dass die Bildungsrate von Knochen ebenso in hohem Maße abläuft. Ein Analysenverfahren könnte in Form eines Beispiels zur Messung der Gesamtmenge von Abbauprodukten verwendet werden, wogegen ein anderes Analysenverfahren in bevorzugter Weise Moleküle erkennen könnte, die während eines "normalen" oder "regulären" Abbaus von Kollagen erzeugt werden. Durch Erstellung der Indexzahl zwischen den beiden Analysenverfahren wird in indirekter Weise eine Information darüber zu erhalten sein, welche Menge an Kollagenfragmenten vorliegt, die durch einen "pathologischen" Abbau des Kollagens, zum Beispiel durch eine Knochenmetastase, gebildet worden sind. Eine parallele diagnostische Beziehung besteht auf dem Gebiet, bei dem das Risiko von Arteriosklerose eingeschätzt wird. In diesem Falle wird die Gesamtmenge an Cholesterin und an den Unterfraktionen des Cholesterins in Form von HDL und LDL gemessen.
Gemäß der Erfindung lassen sich die Ergebnisse in bevorzugter Weise dadurch vergleichen, dass sie mathematisch zur Bildung einer numerischen Indexzahl miteinander kombiniert werden, zum Beispiel dadurch, dass ihr Verhältnis zueinander in Betracht gezogen wird.
Das Verhältnis (der Quotient), das (der) zwischen der Konzentration an den Fragmenten, die bei zwei voneinander unabhängigen immunologischen Testverfahren der Resorption von Knochen gemessen wurde, liefert eine Indexzahl, die von dem Fragmentierungsmuster des Kollagens vom Typ I abhängig ist und die sich aus diesem Grunde für diagnostische Zwecke in Bezug auf die Störungen zum Einsatz bringen lässt, die mit dem Stoffwechsel des Kollagens in Zusammenhang stehen.
Eine numerische Indexzahl, die aus zwei oder mehr Testverfahren abgeleitet wurde, lässt sich mit einem besonderen, identifizierten Fragmentierungsmuster gewünschten Falls verknüpfen, und zwar dadurch, dass Fragmente des Kollagens in der Probe voneinander abgetrennt werden, zum Beispiel durch die HPLC oder durch Gelfiltration sowie anhand der Messung von Mengen an Peptid in den spezifischen Fraktionen, je nach Wunsch auch durch Identifizierung der fraglichen Peptide. Dieses Vorgehen ist jedoch nach der Praxis der Erfindung nicht unbedingt notwendig.
Es können auch in einfacher Weise die Ergebnisse anhand der besonderen numerischen Indexzahl mit den besonderen Typen von Patienten miteinander in Verbindung gebracht werden. Dieses Vorgehen kann in der Weise erfolgen, dass eine Reihe von Proben des bekannten Typs ausgewählten Paaren oder einer größeren, vielfältigen Anzahl von Testverfahren unterzogen wird, wobei auf diese Weise eine Datenbank mit diesen Ergebnissen aufgebaut wird. Im Anschluss daran kann das Fragmentierungsmuster einer unbekannten Probe als typisch für eine besondere Klasse von Proben identifiziert werden, die zuvor schon ausgetestet wurden. Der Ausdruck "Patiententyp" umfasst sowohl gesunde Patienten unterschiedlichen Alters und / oder unterschiedlichen Geschlechtes als auch Patienten mit einem oder mehreren pathologischen Zuständen oder einer abnormalen Befindlichkeit.
Im Einklang mit der Erfindung umfasst in bevorzugter Weise eine jede der genannten Populationen an aufgespaltenen Produkten auch Spaltprodukte von Telopeptiden des Kollagens vom Typ I.
Vorzugsweise besteht eine der genannten Populationen aus aufgespaltenen Produkten mit einem Gehalt an Peptiden, die eine oder mehrere der folgenden Aminosäuresequenzen des menschlichen Kollagens vom Typ I umfassen:
Asp-Glu-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly - Sequ. Ident. Nr. 2
Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg - Sequ. Ident. Nr. 3
Gln-Tyr-Asp-Gly-Lys-Gly-Val-Gly - Sequ. Ident. Nr. 4
Gly-Met-Lys-Gly-His-Arg - Sequ. Ident. Nr. 5
Gly-Ile-Lys-Gly-His-Arg - Sequ. Ident. Nr. 6
Gly-Phe-Lys-Gly-Ile-Arg - Sequ. Ident. Nr. 7
Gly-Leu-Pro-Gly-Leu-Lys-Gly-His-Asn - Sequ. Ident. Nr. 8
Eine dieser derartigen Populationen kann auch Peptide enthalten, die eine oder mehr der folgenden Aminosäuresequenzen des menschlichen Kollagens vom Typ II aufweisen:
Glu-Lys-Gly-Pro-Asp - Sequ. Ident. Nr. 9
Glu-Val-Lys - Sequ. Ident. Nr. 10
Pro-Gly-Val-Lys-Gly - Sequ. Ident. Nr. 11
Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Glu - Sequ. Ident. Nr. 12
Gly-Gln-Lys-Gly-Glu-Pro - Sequ. Ident. Nr. 13
oder Gly-Asp-Ile-Lys-Asp-Ile-Val - Sequ. Ident. Nr. 14
oder eine oder mehrere der folgenden Aminosäuresequenzen des menschlichen Kollagens vom Typ III:
Asp-Val-Lys-Ser-Gly-Val - Sequ. Ident. Nr. 15
Gly-Lys-Ala-Gly-Gly-Phe-Ala - Sequ. Ident. Nr. 16
Gly-Phe-Pro-Gly-Met-Lys-Gly-His-Arg - Sequ. Ident. Nr. 17
oder Gly-Ala-Ala-Gly-Ile-Lys-Gly-His-Arg - Sequ. Ident. Nr. 18
Es können auch noch ähnliche Sequenzen mit Iso-Asparaginsäure erkannt werden, welche die Asparaginsäure ersetzt.
Vorzugsweise wird durch eines der Testverfahren die Menge an der Population von aufgespaltenen Produkten gemessen, die durch einen Gehalt an der Iso-Asparaginsäure gekennzeichnet sind.
Die genannte Population kann auch Spaltprodukte umfassen oder aus solchen bestehen, die eines oder mehrere Peptide der Sequenz EKAH * GGR enthalten, worin das Zeichen * die Iso-Asparaginsäure bedeutet und K Teil an einer Vernetzung im Kollagen oder das Lysin ist.
Eines der Testverfahren kann die Bestimmung der Menge an dem Peptid gemäß der Formel 2 (siehe unten) umfassen, die in der genannten Körperflüssigkeit vorhanden ist:
worin K-K-K jede beliebige in der Natur vorkommende Vernetzung bedeutet und * die Iso-Asparaginsäure bedeutet oder es sich um eines oder mehrere Peptide handelt, wobei ein Epitop mit eingebaut ist, das in dem Peptid gemäß der Formel 2 vorhanden ist und welches die Iso-Asparaginsäure enthält.
Die genannte Bestimmung lässt sich auch unter Verwendung eines immunologischen Bindungspartners durchführen, der für eine besondere Art von Verbindung mit einem Gehalt an der Iso-Asparaginsäure spezifisch ist und in der Probe während des Bestimmungsvorganges anwesend ist.
Der immunologische Bindungspartner kann auch in Form eines Antikörpers vorliegen, der gegen ein lineares Peptid gerichtet ist, wobei das Peptid einer Sequenz innerhalb des Kollagens entspricht, die Iso-Asparaginsäure enthält und welche in der genannten Aminosäuresequenz die Asparaginsäure in der genannten Kollagensequenz ersetzt. Es kann sich auch um einen Antikörper handeln, der gegen ein Fragment des Kollagens gerichtet ist und im Hinblick auf seine Affinität für ein derartiges, eine Iso-Asparaginsäure enthaltendes Peptid ausgewählt ist.
Mit Hilfe dieses einen oder auch mittels eines anderen der genannten Testverfahren lässt sich in bevorzugter Weise eine Population von Spaltprodukten messen, die Peptide enthalten, welche eine Beziehung zu solchen Peptiden aufweisen, die in dem genannten einen Testverfahren anhand der Anwesenheit von Asparaginsäure an Stelle der Iso-Asparaginsäure erkannt worden sind.
Die Erfindung schließt auch ein Kit zur Verwendung bei der Schätzung des Fragmentierungsmusters von Kollagen vom Typ I in einer Körperflüssigkeit mit ein, wobei dieser Reagenzsatz (Kit) einen immunologischen Bindungspartner für eine erste Population aus aufgespaltenen Produkten des Kollagens vom Typ I, einen immunologischen Bindungspartner für eine zweite Population aus aufgespaltenen Produkten des Kollagens vom Typ I und gewünschten Falls einen oder mehrere Bestandteile des Reagenzsatzes zur Gehaltsbestimmung mit einschließen, wobei diese Bestandteile aus Puffersubstanzen, Waschlösungen, synthetischen Peptidverbindungen, anti-idiotypischen Antikörpern, Konjugaten aus Antikörper plus Enzym, Substraten für Konjugate aus Antikörper plus Enzym, Vergleichsproben mit Körperflüssigkeit, standardisierten Lösungen und solchen Lösungen, welche die Reaktion des Enzymkonjugates zum Stillstand bringen.
Im Einklang mit einer besonders bevorzugten Praxis gemäß der Erfindung hat es sich herausgestellt, dass spezifische Fragmentierungsmuster des Kollagens vom Typ I gemäß der Bestimmung in Harnproben mittels Techniken der Gelfiltration in der Weise eingeschätzt werden können, dass eine Verhältniszahl zwischen den Ergebnissen gebildet wird, die unter Verwendung von zwei immunologischen Testverfahren erhalten wurden; dabei handelt es sich bei diesen beiden Testverfahren sowohl um Testverfahren der Knochenresorption als auch um solche zur Messung der Abbauprodukte des Kollagens vom Typ I. Ein erstes dieser Testverfahren ist auf einen polyklonalen Antikörper gestützt, und ist beschrieben in Bonde et al. "Immunologischer Reagenziensatz zur quantitativen Bestimmung der Abbauprodukte im Urin gemäß einer Bewertung" in Clin. Chem. 40 / 11, S. 2022-2025, (1994) aus "Endocrinology and Metabolism". Das zweite Testverfahren stützt sich auf einen monoklonalen Antikörper, wobei dieses Verfahren in Fledelius et al. in American Society of Bone and Mineral Research, Abstract C 344, Kansas City, (1994) beschrieben wird. Diese beiden Testverfahren sind auch in der WO 95 / 08 115 beschrieben.
Gemäß der Beobachtungen unter Einsatz von Versuchen auf Basis der Gelfiltration anhand von Urinproben variiert der Abbau des Kollagens vom Typ I von dem einen Individuum zu dem anderen nicht nur in quantitativer Hinsicht, sondern auch in qualitativer Beziehung. Um nun die qualitativen Unterschiede bei dem Abbau des Kollagens vom Typ I in einer quantitativen Art und Weise zum Ausdruck zu bringen, lässt sich eine Verhältniszahl zwischen den Ergebnissen bilden, die bei jedem einzelnen der oben stehend erwähnten Testverfahren erhalten wurden, und zwar bei der Erkennung unterschiedlicher Abbaufragmente des Kollagens vom Typ I.
Dieses Verhältnis lässt sich dazu verwenden, zwischen den Urinproben zu unterscheiden, die eine an sich identische Deutung bei dem einen oder dem anderen Testverfahren ergeben würden, siehe die Tabelle 1, und ist aus diesem Grunde für diagnostische Zwecke von Nutzen.
Das Verfahren der Bildung der relevanten Verhältniszahl zwischen den Testverfahren der Knochenresorption wird in der Weise in Erwägung gezogen, dass sich diese zur Diagnostik von Störungen des Stoffwechsels von Kollagen einsetzen lässt, und zwar in analoger Weise zu der Diagnose und der Einschätzung des Risikos von Arteriosklerose, d. h. durch die Messung des Gesamtcholesterins und seiner Unterfraktionen (HDL, LDL) und durch die Bildung der jeweils relevanten Verhältniszahlen zwischen den Unterfraktionen und dem Gesamtcholesterin.
Kurz gesagt, die Testverfahren, auf die oben stehend Bezug genommen ist, sind auf ein immobilisiertes, synthetisches Peptid mit einer Aminosäuresequenz gestützt, die in einem Teil des an dem Kohlenstoffatom endständigen Telopeptids der αI-Kette des Kollagens vom Typ I zu finden ist: (Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg = 8AS [Aminosäuren]). Zur Herstellung des polyklonalen Antikörpers, der in dem ersten Testverfahren zum Einsatz gelangte, wurden Kaninchen mit Kollagen immunisiert, das mit Kollagenase behandelt worden war, wobei auch Antikörperseren ausgewählt wurden, die mit den acht Aminosäuren (8AS) eine Reaktion zeigten.
Zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers des zweiten Testverfahrens wurden die Kaninchen mit den acht Aminosäuren (8AS) immunisiert, die mit BSA (Rinderserumalbumin) konjugiert waren, wobei eine Raktion auf Basis von Carbo-di-imid in zwei Schritten zur Verwendung gelangte.
Zum Überziehen der Mikrotiterplatten wurde das Peptid mit den acht Aminosäuren mit Thyreoglobulin unter Verwendung von Glutaraldehyd konjugiert, vgl. Soinila S., Mpitsos G. J., Soinila J, in "Immunohistochemie der Enkephaline": Modelluntersuchungen an Konjugaten auf Basis von Haptenträger und Fixierungsverfahren, vgl. J. Histochem. & Cytochem., (1992), 2, S. 231-239. Während der Inkubation der Proben mit diesen Antikörpern findet eine Konkurrenz zwischen dem immobilisierten Peptid und den Spaltprodukten des Kollagens vom Typ I im Urin statt. In dem Maße, in dem der Gehalt an Peptid in der Lösung ansteigt, werden umso weniger Antikörper an das immobilisierte Peptin anbinden, was zu einer Abnahme der optischen Dichte führt.
In überraschender Weise hat es sich herausgestellt, dass der polyklonale Antikörper unter Bedingungen des Testverfahrens in dem Harn in selektiver Weise solche Peptide erkennt, die alle oder einige der Sequenz der acht Aminosäuren (8 AS) enthalten, bei denen die Asparaginsäure in der Sequenz aus acht Aminosäuren durch die Iso-Asparaginsäure (Iso-8 AS) ersetzt ist. An Stelle eines derartigen polyklonalen Antikörpers kann aus diesem Grunde auch ein solcher polyklonaler Antikörper zum Einsatz gebracht werden, der für die Reaktionsfähigkeit mit dem Peptid der Sequenz Iso-8 AS oder einem monoklonalen Antikörper ausgewählt ist, der gegen diese (Peptid)Seduenz aus den acht Aminosäuren (Iso-8 AS) gerichtet ist.
Auf diese Weise haben wir nun ermittelt oder entdeckt, dass ein bestimmter Anteil an den Peptidfragmenten in der Körperflüssigkeit zu den Peptiden gemäß der äquivalenten Formel in Beziehung steht, zum Beispiel die Peptide gemäß der Formel 1, und zwar durch deren Austausch von Asparaginsäure gemäß der Formel gegen die Isoasparaginsäure.
Es wurde früher berichtet, dass die Isomerisierung der Asparaginsäure eine spontane Reaktion darstellt, die unter physiologischen Bedingungen abläuft, siehe beispielsweise Brennan et al. in Protein Science, (1993), 2, S. 331-338 oder Galletti et al. in Biochem.J., (1995), 306, S. 313-325, oder Lowenson et al. in Blood Cells, (1988), 14, S. 103-117 sowie Oliya et al. in Pharmaceutical Research, Band 11, Nr. 5, (1994), S. 751.
Die oben stehend genannte Entdeckung gibt einen Hinweis darauf, dass diese Isomerisierung auch in dem Knochengewebe abläuft, wobei das Ausmaß der Isomerisierung aus diesem Grunde einen Marker für das Alter des betreffenden Knochengewebes darstellt, wie auch zu erwarten ist.
Ferner liefert die Anwesenheit der Isomerisierung in derartigen Peptidfragmenten des Knochens die Bestätigung dafür, dass die Peptidfragmente in der Tat aus dem Abbau des Knochens herrühren und nicht aus irgend einer anderen Quelle stammen, wie zum Beispiel in Zusammenhang mit dem Abbau von neu gebildetem Kollagen, das niemals in die Knochen eingebaut worden war.
In bevorzugter Weise wird deshalb eines der Testverfahren unter Verwendung eines immunologischen Bindungspartners ausgeführt, der für eine besondere Verbindungsart mit einem Gehalt an Iso-Asparaginsäure spezifisch und in der Probe während der Prozedur vorhanden ist, vorzugsweise in Form des genannten Peptids gemäß der Formel 2 oder eines Peptids, worin ein Epitop eingebaut ist, das in dem Peptid gemäß der Formel 2 anwesend ist und das die Iso-Asparaginsäure enthält.
Der immunologische Bindungspartner mag in Form eines monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers vorliegen. Das Erfordernis, wonach der immunologische Bindungspartner für die spezielle Verbindungsart mit einem Gehalt an Iso-Asparaginsäure spezifisch sein soll, ist so zu verstehen, dass der immunologische Bindungspartner zwischen der einen genannten speziellen Verbindungsart und der anderen speziellen Verbindungsart mit einem Gehalt an der analogen Asparaginsäure in einem solchen Ausmaß einen Unterschied ausmacht, dass er im Zusammenhang mit dem Testverfahren einen Nutzen bringt.
Geeignete immunologische Bindungspartner schließen auch Fragmente von Antikörpern mit ein, die zur Bindung der gleichen antigenen Determinante unter Einschluss von Fab-, Fab'- sowie F(ab')02 - Fragmenten befähigt sind.
In bevorzugter Weise stellt der immunologische Bindungspartner einen Antikörper dar, der gegen ein lineares Peptid gerichtet ist, vorzugsweise ein synthetisches Peptid, wobei eine Entsprechung zu einer Sequenz innerhalb des Kollagens im Vergleich zu der Iso-Asparaginsäure vorliegt, welche in der genannten Aminosäuresequenz die Asparaginsäure in der genannten Sequenz des Kollagens ersetzen soll.
Jedes einzelne Testverfahren kann vielfältige Formen annehmen, einschließlich von ELISA, RIA oder IRMA, wobei die Vorgehensweisen für diese zu sehr bekannt sind, als dass hier eine Beschreibung gerechtfertigt wäre.
Bei einem ELISA-Test dieses Typs lässt sich das synethetische Peptid auf einem festen Träger immobilisieren. Eine Probe lässt sich mit einem polyklonalen Antikörper oder einem monoklonalen Antikörper für das synthetische Peptid in Kontakt mit dem festen Träger inkubieren, wobei nach dem Waschen noch ein mit Peroxydase konjugierter (aufdeckender) Antikörper hinzugefügt werden kann. Nach der weiteren Inkubation wird eine Lösung auf Basis eines Peroxydase-Substrats hinzugefügt. Aufgrund der Konkurrenz hemmen die in der Probe mit dem Antikörper reaktionsfähigen Peptide die Reaktion mit der Peroxydase.
In dem Falle, dass das synthetische Peptid zum Einsatz gebracht wird, um einen monoklonalen immunologischen Bindungspartner auf den Plan zu rufen, braucht dieses synthetische Peptid kein konkurrierendes Agens in dem Testverfahren zu sein. Zum Beispiel kann das mit Kollagenase behandelte Kollagen gereinigt und auf dem festen Träger immobilisiert werden, wobei sich ein ELISA-Test unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers durchführen lässt.
Es können auch Antikörper hergestellt werden, die jeweils für eines oder mehrere Peptide selektiv sind, die Asparaginsäure enthalten, sowie selektiv sind für deren analoge Verbindungen mit einem Gehalt an Iso-Asparaginsäure. Sodann ist es möglich, ein Testverfahren sowohl für Varianten des Peptids als auch für die Peptide selbst durchzuführen. Die relative Menge an Iso-Asparaginsäure wird einen Hinweis auf das Alter des Knochens liefern, der gerade abgebaut wird. In entsprechender Weise wird durch die Erfindung ein Verfahren zur Verfügung gestellt, bei dem Informationen im Hinblick auf die Resorption des Kollagens bei einem Patienten erhalten werden, wobei auch die Messung der relativen Mengenanteile von mindestens einem Peptid mit einem Gehalt an Asparaginsäure in einer Körperflüssigkeit mit umfasst ist, wobei das Peptid aus dem Kollagen und einem entsprechenden Peptid mit einem Gehalt an Iso-Asparaginsäure stammt.
Die Erfindung lässt sich sowohl bei Menschen als auch bei Tieren anwenden.
Geeignete Körperflüssigkeiten schließen beispielsweise menschlichen Urin, menschliches Blut oder Serum oder Plasma und Synovialflüssigkeit mit ein. Dabei wird in Betracht gezogen, dass das Verfahren auch beispielsweise bei Speichel und Schweiß zum Einsatz gebracht werden kann. Die Körperflüssigkeit lässt sich auch in der Form, wie sie vorliegt, zum Einsatz bringen oder sie lässt sich vor dem Kontaktierungsschritt reinigen. Dieser Reinigungsschritt lässt sich unter Verwendung einer Anzahl von standardisierten Vorgehensweisen ausführen, und zwar unter Einschluss, jedoch nicht unter ausschließlicher Beschränkung, einer Adsorption und Elution über eine Kartusche, der Molekularsieb-Chromatographie, der Dialyse, des Ionenaustausches, der Chromatographie auf Basis von Tonerde, der Chromatographie auf Basis von Hydroxyapatit sowie von Kombinationen dieser Verfahren.
Die Erfindung wird unten stehend in detaillierterer Form beschrieben. Es wird auf die angefügten Zeichnungen Bezug genommen, worin:
Fig. 1 die immunologische Reaktionsfähigkeit der Fraktionen aus Urin eines Kindes mit 11 Jahren zeigt, die mittels der Chromatographie auf Basis der Gelfiltration abgetrennt wurden;
Fig. 2 ähnliche Ergebnisse zeigt, die bei einer 53-jährigen Frau erhalten wurden;
Fig. 3 ein Histogramm der Ergebnisse darstellt, die gemäß dem Beispiel 4 bei Krebspatienten erhalten wurden und
Fig. 4 äquivalente Ergebnisse aus den Vergleichsversuchen darstellt.
Bei den bevorzugten Ausgestaltungen der Verfahren gemäß der Erfindung wird ein oder werden beide Testverfahren durch die Hemmung mittels des ELISA-Tests (ein immunoabsorbierendes Testverfahren in Verbindung mit einem Enzym) durch das in Kontaktbringen einer Probe mit einem synthetischen Peptid, das eine Sequenz aufweist, die aus dem Kollagen stammt, sowie mit einem Antikörper durchgeführt, der mit dem synthetischen Peptid eine Immunreaktion zeigt. Das synthetische Peptid wird auf einem festen Träger immobilisiert. Der Antikörper kann gegen das synthetische Peptid gerichtet sein oder sich gegen die Abbauprodukte des Kollagens richten und dann einem Auslese-(Screening)-Verfahren mittels des Einsatzes eines derartigen synthetischen Peptids unterworfen werden.
Die Gewinnung synthetischer Peptide lässt sich gemäß der Vorgehensweisen durchführen, welche in dem Stand der Technik wohlbekannt sind, zum Beispiel durch Techniken der Peptidsynthese auf Basis einer Festphase, die für gewöhnlich unter dem Begriff "Merrifield synthesis" beschrieben sind. Es lassen sich auch die klassischen Techniken in der Lösungsphase zur Anwendung bringen. Die interessanten Sequenzen schließen potentielle Zentren für die Vernetzung des Kollagens mit ein, siehe zum Beispiel Kühn, K., in: "Immunchemie der extrazellulären Matrix", 1, S. 1-29, (1982), Eyre, D. R., in Ann. Rev. Biochem., 53, S. 717-748, (1984) oder das US-Patent Nr. 5 140 103. Beispiele derartiger Peptidsequenzen sind unten stehend angegeben.
Im Hinblick auf die synthetischen Peptide ist es möglich, einen oder mehrere Aminosäurereste auszulassen (oder hinzuzufügen), und zwar aus den (oder zu den) Sequenzen mit dem vernetzbaren Zentrum, und zwar ohne wesentlichen Verlust der Fähigkeit, (a) Antikörper hervorzurufen, welche das Analoge zur Iso-Asparaginsäure, d. h. des entsprechenden nativen Kollagenfragments erkennen, oder (b) die Bindung derartiger Antikörper an das genannte Analogon des nativen Fragments hemmen. Es ist auch möglich, längere Kollagenfragmente und / oder chimäre Peptide zum Einsatz zu bringen, welche die Antikörper hervorrufen, wobei es prinzipiell nicht notwendig ist, das gleiche Peptid als das Immunogen und den Konkurrenten bei einem konkurrierenden Testverfahren einzusetzen.
Die Verfahren zur Herstellung sowohl der monoklonalen als auch der polyklonalen Antikörper sind in dem Stande der Technik wohlbekannt, siehe beispielsweise Campbell, A. M. in "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology" (Labortechniken in der Biochemie und Molekularbiologie), Band 12, (1986). Es ist auch möglich, Antikörper gegen synthetische Peptide durch die Immunisierung zu gewinnen. Es ist jedoch aufgrund des relativ geringen Molekulargewichts dieser Verbindungen bevorzugt, dass das Hapten mit einem Trägermolekül konjugiert wird. Geeignete Trägermoleküle schließen, jedoch ohne ausdrückliche Beschränkung darauf, Rinderserum - Albumin, Thyreoglobulin, Ovalbumin, Tetanus-Toxoid, und das Hämocyanin der sog. "Schlüsselloch"-Nacktschnecke (eine Fissurella-Art) mit ein. Als bevorzugter Träger dient das Rinderserum Albumin. Um das Hapten in seiner höchst immunogenen Form dem Antikörper darzubieten, der Zellen des immunisierten Tieres produziert, lässt sich eine Anzahl von alternativen Protokollen für die Kupplung zum Einsatz bringen. Geeignete Vorgehensweisen schließen, jedoch ohne jegliche Beschränkung darauf, das Glutaraldehyd, das Carbodiimid sowie das Periodat mit ein. Das Glutaraldehyd und Carbodiimid stellen die bevorzugten Bindungsmittel dar.
Die Herstellung der Antikörper lässt sich anhand von herkömmlichen Techniken durchführen, einschließlich der Immunisierung mit Kollagenfragmenten oder synthetischen Peptiden, die mit einem Träger konjugiert sind. Zur Verbesserung der immunogenen Wirkung wird das Immunogen in bevorzugter Weise vor der Injektion mit einem Adjuvans vermischt. Beispiele für diese Adjuvantien schließen, jedoch ohne ausdrückliche Beschränkung darauf, dass Aluminiumhydroxid, das Freund'sche Adjuvans, sowie immunstimulierende Komplexe (ISCOMs) mit ein. Die immunstimulierenden Komplexe lassen sich gemäß des Verfahrens herstellen, das von Morein, B. et af. in Nature, 308, S. 457-460, (1984), beschrieben ist.
Es lassen sich entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper gegenüber dem Hapten auf dem Trägermolekül produzieren. Für die Gewinnung von monoklonalen Antikörpern werden in bevorzugter Weise Mäuse immunisiert. Aus der immunisierten Maus werden Milzzellen entnommen, homogenisiert und im Anschluss daran mit Krebszellen in Anwesenheit von Polyethylenglykol zur Gewinnung einer Zellhybride verschmolzen, welche monoklonale Antikörper produziert, die für Peptidfragmente spezifisch sind, welche sich aus dem Kollagen herleiten. Geeignete Krebszellen schließen, jedoch ohne ausdrückliche Beschränkung darauf, Mylom-, Hepatom-, Karzinom- sowie Sarkomzellen mit ein. Detaillierte Beschreibungen der Gewinnung von monoklonalen Antikörpern sind von Goding, J. W., in "Monoclonal Antibodies" zur Verfügung gestellt: Prinzipien und Praxis (Principles and Practice), (1986). Ein bevorzugtes Protokoll für das Auswahlverfahren (Screening), das vorausgeht, umfasst den Einsatz von synthetischen Peptiden, die mit einem Träger konjugiert sind und mit welchen die feste Oberfläche einer Mikrotiterplatte überzogen ist.
Für die Gewinnung von polyklonalen Antikörpern, die mit Peptidfragmenten, die aus Kollagen stammen, zur Reaktion befähigt sind, lassen sich verschiedene Tierarten immunisieren. Geeignete Arten schließen, jedoch ohne ausdrückliche Beschränkung darauf, Hühner, Kaninchen und Ziegen mit ein. Hühner und Kaninchen sind dabei bevorzugt.
Die auf diese Weise gewonnenen Antikörper lassen sich daraufhin durchmustern, ob sie für die Verwendung gemäß der Erfindung geeignet sind, und zwar durch das Austesten auf ihre Fähigkeit zur Reaktion mit einem synthetischen Peptid, das die Iso-Asparaginsäure enthält und die geeignete Sequenz aufweist.
Die Antikörperfragmente werden durch Verfahren hergestellt, die gemäß dem Stand der Technik bekannt sind, vgl. E. Ishikawa in: Journal of Immunoassay, 3, S. 209-327, (1983).
Dementsprechend ist es durch den Einsatz eines immunologischen Testverfahrens mit den Antikörpern, wie sie gemäß oben stehender Beschreibung gewonnen wurden, möglich, eine biologische flüssige Probe ohne vorherige Fraktionierung oder Hydrolyse zu analysieren. Die Spezifität für das gewünschte Kollagen in der biologischen Flüssigkeit lässt sich bei dem Aufbau des Testverfahrens durch den Antikörper in Kombination mit der Verwendung eines synthetischen Peptids unterstützen (und zwar eines Peptids, gegen welches der produzierte Antikörper gerichtet ist, oder bei jedem beliebigen anderen Anlass, bei welchem der Antikörper in immunochemischer Weise eine Reaktionsfähigkeit zeigt).
In alternativer Weise lässt sich das immunologische Testverfahren unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers durchführen. Die grundlegende Idee dieses Aufbaus des Testverfahrens besteht darin, die Spezifität des Testverfahrens von dem Antigen (dem synthetischen Peptid gegenüber dem Kollagen) in Richtung Antikörper (aus dem Kaninchen-Antiserum gegenüber dem monoklonalen Antikörper) zu verschieben. Unter Einsatz dieses Aufbaus des Testverfahrens besteht keine Notwendigkeit, einen weiteren Gebrauch von einem synthetischen Peptid zu machen. Diese Version des immunologischen Testverfahrens wird in geeigneter Weise so durchgeführt, dass die Patientenprobe oder eine standardisierte Lösung mit einer Lösung, welche den mit Peroxydase konjugierten Antikörper enthält, auf einer Mikrotiterplatte inkubiert wird, die mit dem Kollagen, das mit der Kollagenase behandelt wurde, im Vorgriff überzogen wurde. Nach dem Waschen werden die Näpfchen der Platte in der Dunkelheit mit einer Substratlösung inkubiert. Die Farbreaktion wird mittels des Zusatzes einer Stopperlösung zum Stillstand gebracht, wobei zum Schluss das Ausmaß der Absorption gemessen wird.
Die immunologischen Testverfahren als solche lassen sich unter Verwendung einer beliebigen Vorgehensweise durchführen, die aus einer Vielfalt von standardisierten Testprotokollen ausgewählt wurden, die im allgemeinen in dem Stand der Technik bekannt sind. Gemäß dem Verständnis im Allgemeinen wird das Testverfahren so aufgebaut, dass es auf der Wechselwirkung zwischen dem spezifischen, immunologischen Bindungspartner und dem gewünschten Analyten für die Spezifität beruht, und dabei einige Mittel benutzt werden, um den durch den Analyten und den immunologischen Bindungspartner gebildeten Komplex zu erkennen. Der immunologische Bindungspartner lässt sich mit einem festen Träger komplexieren und als immunologischer Bindungspartner einsetzen, der im Hinblick auf den Analyten eine Festhaltefunktion ausübt. Dieses Protokoll kann in direkter Form ablaufen, wonach die Bildung des Komplexes aus dem Analyten und dem immunologischen Bindungspartner erkannt wird, zum Beispiel anhand eines fluoreszierenden, radioaktiven oder enzymatischen Markierungsmittels, oder es kann in der Weise ablaufen, dass ein konkurrierendes Format vorliegt, bei dem ein markierter Standard mit dem Analyten um den immunologischen Bindungspartner konkurriert. Das Format kann auch in der Weise aufgebaut sein, dass es ein Testverfahren auf Basis der Agglutination darstellt, wobei der Komplex auch durch die Zugabe eines geeigneten Fällungsmittels zu dem Reaktionsgemisch ausgefällt werden kann. Der spezifische Aufbau des Protokolls im Hinblick auf den immunologischen Test ist gegenüber einer breiten Vielfalt an Auswahlmöglichkeiten offen, wobei die Anzahl der klinischen Testvorrichtungen oder Protokolle, die im Stand der Technik zur Verfügung stehen, außerordentlich hoch ist. Im Hinblick auf die Vielfalt derartiger Protokoll sei auf das US-Patent Nr. 5 001 225 verwiesen.
Die Antikörper und die aufdeckenden Reagentien zur Durchführung eines immunologischen Testverfahrens unter Einsatz von standardisierten Erkennungsprotokollen, beispielsweise der Markierung auf Basis von radioaktiven Isotopen, der Markierung auf Basis von Fluoreszenzstoffen oder auf Basis von ELISA, entweder in einem direkten oder konkurrierenden Format, können zweckmäßigerweise in Form von Reagenziensätzen zur Verfügung gestellt werden, welche die notwendigen Komponenten und Anweisungen für das Testverfahren mit umfassen. Bei einer der Ausgestaltungen gemäß der Erfindung umfasst ein derartiger Reagenziensatz (Kit) eine Mikrotiterplatte, die mit einem relevanten, synthetischen Peptid überzogen ist, sowie standardisierte Lösungen zur Herstellung einer Standardkurve, eine Vergleichsprobe von Urin oder einer anderen Körperflüssigkeit für die Austestung der Qualität des analytischen Durchgangs, Antikörper von Kaninchen, wobei diese Antikörper mit dem oben stehend erwähnten synthetischen Peptid zur Reaktion befähigt sind, sowie Immunoglobuline, die gegen Kaninchen gerichtet und mit Peroxydase konjugiert sind, eine Substratlösung, eine Stopperlösung, eine Pufferlösung zum Waschen und ein Handbuch mit den Anweisungen.
Aufgrund der Tatsache, dass die immunologischen Testverfahren unter Verwendung von Antikörpern und spezifischen synthetischen Peptiden aufgebaut werden können, lassen sich die Verhältniszahlen der entsprechenden Sequenzen der Kollagenfragmente in einer geeigneten biologischen Flüssigkeit bestimmen, ebenso wie auch deren individuelle Konzentrationen und auch deren Gesamtmenge. Auf diese Weise lässt sich das Testverfahren so aufbauen, dass es Antikörper mit einschließt, was eine Bestimmung der verschiedenen Peptide mit einem Gehalt an Iso-Asparaginsäure und gewünschten Falls der nativen Peptidsequenzen oder zur Bestimmung einer einfachen Peptidsequenz mit einem Gehalt an Iso-Asparaginsäure sowie einer entsprechenden oder unterschiedlichen nativen Peptidsequenz, oder auch jeder beliebigen gewünschten Kombination davon möglich macht.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, jedoch keinerlei Beschränkung auferlegen.

Allgemein

Für die praktische Durchführung der in den folgenden Beispielen beschriebenen Testverfahren wurde eine Standardprobe oder unbekannte Probe mit 15 ul in Duplikaten in die geeigneten Näpfchen in der vorher beschichteten ELISA-Platte pipettiert. Im Anschluss daran wurden 100 ul Antikörperlösung in jedes Näpfchen hinzugefügt, die Platte mit einer Folie zum Versiegeln bedeckt und bei Raumtemperatur 60 min lang auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert. Sämtliche folgenden Vorgehensweisen wurden ebenso bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Inkubierung wurden die Platten dreimal mit verdünnter Waschpufferlösung gewaschen.
Mit Peroxid konjugierter Antikörper (HRP-konjugierte Ziegenantikörper gegenüber Kanichen-IgG, in einer Menge von 100 ul pro Näpfchen) wurde hinzugegeben und die hermetisch abgedichteten Näpfchen 60 min lang auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert. Danach erfolgte eine weitere Waschprozedur und 100 ul der TMB-Substratlösung wurden in allen Näpfchen hinzugefügt, welche luftdicht verschlossen und 15 min lang inkubiert wurden. Die Enzymreaktion wurde nach 15 min durch die Zugabe von 100 ul Stopperlösung zum Stillstand gebracht. Die optische Dichte wurde an einem ELISA-Ablesegerät bei einer Wellenlänge von 450 nm abgelesen.
Es wurde eine Eichkurve auf einem logarhithmisch-linearen Graphik-Papier durch Plotten der jeweiligen hauptsächlichen Absorptionspunkte der fünf Standards (0,1-5,0 ug/ml) erzeugt. Die Konzentration der Äquivalente gegenüber dem synthetischen Peptid (Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg) wurden bei den jeweiligen Patientenproben durch die Interpolation anhand der Eichkurve bestimmt.
Das Pipettierschema, ebenso wie auch die Inkubationen und die Waschschritte für das Testverfahren unter Einsatz des monoklonalen Antikörpers (ASbAY) waren genau die selben wie bei dem Testverfahren unter Einsatz des polyklonalen Antikörpers.

Beispiel 1

Gelfiltration des Harns von Kindern und erwachsenen Frauen

Es wurden eine Urinprobe von einem Kind im Alter von 11 Jahren und eine Urinprobe von einer Frau im Alter von 53 Jahren auf entsprechende Säulen zur Gelfiltration appliziert. Es wurden 0,75 ml Urin in die jeweils identischen Säulen mit den Maßen 900 · 10 mm und einem Gehalt von 58 ml superfeinem Sephadex-Gel G 25 von der Pharmacia, Uppsala in Schweden, injiziert. Die Elution wurde bei einer Durchflussrate von 0,22 ml/min unter Verwendung eines Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,4 in einer Konzentration von 25 mol pro Liter durchgeführt und mittels eines UV - Detektorgerätes bei einer Wellenlänge von 280 nm laufend überwacht. Die aufgesammelten Fraktionen (jeweils 1,6-1,8 ml pro Fraktion) wurden in dem Gerät CrossLaps- LTM - ELISA analysiert, vgl. hiezu Bonde et al. in: Clin. Chem. 40/11, S. 2022-202 5, (1994), "Endocrinology and Metabolism".
Wie aus der Fig. 1 ersichtlich ist, zeigt der Harn des Kindes mit 11 Jahren lediglich einen größeren Gipfel nach annäherungsweise 56 ml. Bei der Betrachtung des Elutionsprofils aus dem Urin der Frau mit einem Alter von 53 Jahren werden zwei unterschiedliche Gipfel beobachtet, wobei der erste Gipfel bei 53 ml und der andere Gipfel Nr. 2 bei 64 ml erscheinen. Diese Beobachtungen geben einen Hinweis darauf, dass es zwischen den unterschiedlichen Patienten einen Unterschied bei der Verteilung der Fragmente des Kollagens vom Typ I gibt. Es sieht so aus, als ob der Harn dieses Kindes einen gewissen Mangel an den kürzeren Fragmenten aufweisen würde, denn dieser Urin weist keinen zweiten Gipfel auf, wie er nach einer Menge von 64 ml in dem Urin der erwachsenen Frau zu finden ist.

Beispiel 2

Immunologische Testverfahren an Urinproben von Kindern und erwachsenen Frauen

Die Urinproben von acht Frauen im Alter zwischen 23 und 56 Jahren und acht Kindern im Alter von 8 bis 12 Jahren wurden im Zusammenhang mit den beiden immunologischen Testverfahren analysiert, und zwar auf Basis eines polyklonalen und eines monoklonalen Testverfahrens, wie sie oben stehend beschrieben wurden. Die Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse einer jeden Urinprobe. Ferner wird darin das Verhältnis der Werte wiedergegeben, die bei den beiden Systemen anhand einer Probe erhalten wurden. Die Werte der Kinder liegen sämtlich in dem Bereich zwischen 0,82-1,12, wogegen die Werte der erwachsenen Frauen in dem Bereich zwischen 0,14 und 0,25 liegen. Jeder in der Tabelle wiedergegebene Wert ist auf drei unabhängige Tests in den beiden Bestimmungsverfahren gestützt. Tabelle 1

Beispiel 3

Paget'sche Krankheit

Die gleichen beiden immunologischen Testverfahren wurden bei Proben von bekannten Patienten mit der Paget schen Krankheit und einer Vergleichskontrolle zum Einsatz gebracht. Die Ergebnisse in der unten stehenden Tabelle 2 zeigen auf, dass die unterschiedlichen Fragmentierungsmuster jeweils eine Verhältniszahl liefern, welche die Voraussetzung dafür liefern, dass die Proben voneinander unterschieden werden zu können. Tabelle 2
Kreuz-"LAPs" = polyklonal
MABA7 = monoklonal

Beispiel 4

Brustkrebs mit einer sekundären Knochenmetastase

Die gemäß dem Beispiel 3 zum Einsatz gelangten Testverfahren wurden mit Urinproben von Patienten durchgeführt, die an Brustkrebs und an sekundären Knochenmetastasen litten, wobei diese auch mit Vergleichskontrollen von gesunden Patienten ausgeführt wurden. Es hat sich herausgestellt, dass das Verhältnis der Ergebnisse im Hinblick auf die gesunde Population zwischen 0,1 und 0,4 betrug, wogegen 50% der Proben von den Patienten mit den Knochenmetastasen eine Verhältniszahl von mehr als 0,4 aufwiesen. Die Ergebnisse sind in den Fig. 3 und 4 dargestellt.

AUFLISTUNG DER SEQUENZEN:

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER (PATENTINHABER):
(A) NAME: OSTEOMETER BIO TECH A/S
(B) STRASSE: OSTEOPARK, HERLEV HOVEDGATE 207
(C) STADT: HERLEV
(E) LAND: DÄNEMARK
(F) POSTLEITZAHL (ZIP): DK - 2730
(II) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG:
"SCHÄTZUNG DES FRAGMENTIERUNGSMUSTERS VON KOLLAGEN IN KÖRPERFLÜSSIGKEITEN UND DIE DIAGNOSE VON STÖRUNGEN, DIE IM ZUSAMMENHANG MIT DEM STOFFWECHSEL DES KOLLAGENS STEHEN".
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 18
(IV) ZUR COMPUTER LESBAREN FORM:
(A) ART DES SCHREIBMEDIUMS: FLOPPY DISKETTE
(B) COMPUTER: IBM KOMPATIBLER PC
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS 1 MS-DOS
(D) PROGRAMM: PATENTIN RELEASE # 1,0; VERSION # 1, 30 (EPO)
(VI) INFORMATION ZUR PRIORITÄTSANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: DK 1194 / 94
(B) TAG DER EINREICHUNG 17. OKTOBER 1994
(VI) INFORMATION ZUR PRIORITÄTSANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: GB 9 506 050
(B) TAG DER EINREICHUNG 24. MÄRZ 1995
(2) INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT. NR. 1:
(i) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: H AMINOSÄUREN
(5) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE): LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(v) TYP DES FRAGMENTS: ENDSTÄNDIG AM C-ATOM
(vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
(A) ORGANISMUS: MENSCH
(B) GEWEBSTYP: KOLLAGEN
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR. 1:
(2) INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT. NR. 2:
(i) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 7 AMINOSÄUREN
(5) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE): LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR. 2:
(2) INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT. NR. 3:
(i) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 8 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE): LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR. 3:
(2) INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT. NR. 4:
(i) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 8 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE): LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR. 4:
(2) INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT. NR. 5:
(i) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 6 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE): LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR. 5:
(2) INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT. NR. 6:
(i) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 6 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE): LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR. 6:
(2) INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT. NR. 7:
(i) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 6 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE): LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR. 7
(2) INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT. NR. 8:
(i) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 9 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE): LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR. 8:
(2) INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT. NR. 9:
(i) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 5 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE): LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR. 9:
INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT. NR. 10:
(i) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 3 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE: LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR. 10:
(2) INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT. NR. 11:
(i) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 5 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE): LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR. 11:
(2) INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT, NR. 12:
(I) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 6 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE): LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR. 12:
(2) INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT. NR. 13:
(i) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 6 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE): LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR. 13:
(2) INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT. NR. 14:
(i) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 7 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE): LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR. 14:
(2) INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT. NR. 15:
(i) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 6 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE): LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR. 15:
(2) INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT. NR. 16:
(i) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 7 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE): LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR. 16:
(2) INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT, NR. 17:
(i) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 9 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE): LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR. 17:
(2) INFORMATION ÜBER DIE SEQUENZ IDENT. NR. 18:
(i) MERKMALE DER SEQUENZ:
(A) LÄNGE: 9 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGFORM: EINFACH
(D) ANORDNUNG (TOPOLOGIE): LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PEPTID
(xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQUENZ IDENT. NR, 18:
15

Claims

1. Verfahren zum Schätzen des Fragmentierungsmusters von Kollagen in einer Körperflüssigkeit, wobei das Verfahren folgende Maßnahmen aufweist: Untersuchen einer Probe der genannten Körperflüssigkeit anhand von mindestens zwei unterschiedlichen immunologischen Testverfahren, durch die jeweils die Menge an einer ersten und einer zweiten Population aus aufgespaltenen Kollagenprodukten in der genannten, von einem einzelnen Kollagentyp abgeleiteten Probe gemessen wird sowie Vergleichen der Ergebnisse aus den genannten Messungen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem jede der genannten Populationen aus aufgespaltenen Produkten solche Produkte aufweist, die aufgespaltene Produkte des Kollagens vom Typ I darstellen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem jede der genannten Populationen aus aufgespaltenen Produkten solche Produkte aufweist, die aufgespaltene Produkte aus Telopeptiden des Kollagens darstellen.

4. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem mindestens eine der genannten Populationen aus aufgespaltenen Produkten stammt, welche Peptide enthalten, die eine oder mehrere der folgenden Aminosäuresequenzen des Humankollagens vorn Typ I aufweisen:

Asp-Glu-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly

Gly-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg

Gln-Tyr-Asp-Gly-Lys-Gly-Val-Gly

Gly-Met-Lys-Gly-His-Arg

Gly-Ile-Lys-Gly-His-Arg

Gly-Phe-Lys-Gly-Ile-Arg

Gly-Leu-Pro--Gly-Leu-Lys-Gly-His--Asn.

5. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem mindestens eine der genannten Populationen aus aufgespaltenen Produkten stammt, welche Peptide enthalten, die eine oder mehrere der folgenden Aminosäuresequenzen des Humankollagens vom Typ II aufweisen:

Glu-Lys-Gly-Pro-Asp

Gly-Val-Lys

Pro-Gly-Val-Lys-Gly

Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Glu

Gly-Gln-Lys-Gly-Glu-Pro oder

Gly-Asp-Ile-Lys-Asp-Ile-Val

und / oder die eine oder mehrere der folgenden Aminosäuresequenzen des Humankollagens vom Typ III aufweisen:

Asp-Val-Lys-Ser-Gly-Val

Gly-Lys-Ala-Gly-Gly-Phe-Ala

Gly-Phe-Pro-Gly-Met-Lys-Gly-His-Arg oder

Gly-Ala-Ala-Gly-Ile-Lys-Gly-His-Arg.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die genannten Ergebnisse in der Weise verglichen werden, dass sie mathematisch so kombiniert werden, dass sie einen numerischen Index (eine Indexzahl) bilden.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem durch eines der genannten Testverfahren die Menge an einer Population aus aufgespaltenen Produkten gemessen wird, die durch den Gehalt an Iso-Asparaginsäure gekennzeichnet ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die genannte Population entweder solche aufgespaltene Produkte enthält oder aus solchen aufgespaltenen Produkten besteht, die ein oder mehrere Peptide der Sequenz EKAH * GGR enthält, in welcher das Zeichen * die Iso- Asparaginsäure bedeutet und K den Anteil einer Vernetzung von Kollagen darstellt, oder Lysin bedeutet.

9. Verfahren nach Anspruch 8, das die Bestimmung der Menge an dem Peptid gemäß der Formel 2 (siehe unten) umfasst, das in der genannten Körperflüssigkeit vorhanden ist:

worin K-K-K jede beliebige natürlich vorkommende Vernetzung darstellt und das Zeichen * die Iso-Asparaginsäure bedeutet, oder aus einem oder mehreren Peptiden mit einem inkorporierten Epitop besteht, das in dem Peptid gemäß der Formel 2 vorhanden ist, welches Iso-Asparaginsäure enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, bei dem die genannte Bestimmung unter Verwendung eines immunologischen Bindungspartners durchgeführt wird, der für eine Iso- Asparaginsäure enthaltende bestimmte Art (Verbindungsart/Spezies) spezifisch ist, die in der Probe während der Bestimmung vorhanden ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem der immunologische Bindungspartner einen Antikörper darstellt, der gegen ein lineares Peptid gebildet worden ist, das einer Sequenz innerhalb des Kollagens mit Iso-Asparaginsäure entspricht, die in der genannten Aminosäuresequenz die Asparaginsäure in der genannten Kollagensequenz ersetzt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, bei dem mittels eines oder des anderen genannten Testverfahrens eine Population aus aufgespaltenen Produkten mit einem Gehalt an Peptiden gemessen wird, die mit solchen in Beziehung stehen, die in dem genannten einen Testverfahren anhand der Anwesenheit von Asparaginsäure an Stelle der Iso-Asparaginsäure aufgespürt worden sind.

13. Reagenzsatz (Kit) zur Verwendung bei der Schätzung des Fragmentierungsmusters von Kollagen vom Typ I in einer Körperflüssigkeit, wobei der Reagenzsatz folgende Merkmale aufweist: einen ersten immunologischen Bindungspartner für eine erste Population aus aufgespaltenen Kollagenprodukten, einen zweiten immunologischen Bindungspartner für eine zweite Population aus aufgespaltenen Kollagenprodukten, die von dem Kollagen des gleichen Typs wie die genannte erste Population abstammt, sowie gegebenenfalls einen oder mehrere Bestandteile des Testkits, die ausgewählt sind aus Puffersubstanzen, Waschlösungen, synthetischen Peptiden, anti-idiotypischen Antikörpern, Konjugaten aus Antikörper plus Enzym, Substraten für Konjugate aus Antikörper plus Enzym, Vergleichsproben mit Körperflüssigkeit, Standardlösungen sowie Lösungen, welche die Reaktion des Enzym-Konjugats zum Stillstand bringen.