DE69515743T2

DE69515743T2 - Materialien und methoden die sich auf mit casein kinase i wechselwirkende proteine beziehen

Info

Publication number: DE69515743T2
Application number: DE69515743T
Authority: DE
Inventors: J. Demaggio; F. Hoekstra
Original assignee: Icos Corp
Current assignee: Icos Corp
Priority date: 1994-01-21
Filing date: 1995-01-23
Publication date: 2000-11-02
Anticipated expiration: 2015-01-24
Also published as: JP3468523B2; EP0690874B1; WO1995019988A1; CA2158749A1; US5728806A; US5846764A; ATE190984T1; JPH08509132A; EP0690874A1; DE69515743D1; ES2146749T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen die Identifizierung von Proteinen, hierin als TIH-Proteine bezeichnet, die mit Casein-Kinase-I-Isoformen wechselwirken, und die Isolierung von Polynukleotiden, die für dieselben codieren.

HINTERGRUND

Proteinkinasen sind posttranslationale, enzymatische Regulatoren des zellulären Metabolismus. Wenn sie einmal aktiviert sind, übertragen diese Enzyme Phosphat von ATP auf Substratproteine und beeinflussen hierdurch die Eigenschaften von Substratmolekülen. Es gibt vier große Klassen Proteinkinasen, einschließlich Serin/Threonin-Kinasen, Tyrosin-Kinasen, multi-spezifische oder dual-spezifische Kinasen und Histidin-Kinasen [Hunter, et al., Meth. Enzymol. 200: 3-37 (1991)]. Zusätzlich zu dem(n) Aminosäurerest(en) des Substrats, der (die) vorzugsweise durch die Kinase phosphoryliert wird (werden), beruht die Zuordnung eines Enzyms zu einer individuellen Klasse auf seiner Primärstruktur, seinem Bedarf an regulatorischen Untereinheiten, seinem Bedarf für second messengers und seiner spezifischen biochemischen Aktivität. Siehe Hunter et al., oben, und Hanks und Quinn, Meth. Enrymol., 200: 38- 62 (1991).
Serin/Threonin-Proteinkinasen sind weiterhin auf der Grundlage des Regulationsmodus der Enzyme und der Quartärstruktur der aktiven Enzyme in Enzymfamilien aufgeteilt worden [Edelmann, et al., Ann. Rev. Biochem. 56: 567-613 (1987)]. Enzyme innerhalb der Serin/Threonin-Proteinkinasen-Familie können sich in den Substraten, die sie phosphorylieren, den spezifischen Phosphorylierungsstellen, die sie erkennen, ihrem Regulationsmodus und ihrer subzellulären Verteilung unterscheiden. Zum Beispiel phosphoryliert Proteinkinase A (PKA) Zielsubstrate mit der Erkennungs/Phosphorylierungssequenz R-R-X-S(P)-Y (SEQ ID NO: 1) [Pearson and Lemp, Meth. Enzymol. 200-62-81 (1991)], wobei S(P) den phosphory lierten Rest repräsentiert. Die Aktivität von PKA wird lokalisiert durch Ziel-Untereinheiten (genannt Verankerungsproteine oder AKAPs, in einer Übersicht behandelt von Hubbard und Cohen, T. LB. S. 18: 172-177, 1993). Mitglieder der Casein-Kinase-I (CKI)-Familie andererseits erkennen und phosphorylieren Serine und Threonine nahe sauren Resten in Substratproteinen. Die Gene, die für die Hefe-, Ratten-, bovinen und menschlichen Isoformen von Casein-Kinase-I-Aktivität codieren, sind strukturell ähnlich, und die Isoformen weisen mehr als 35%, und häufig mehr als 50% Homologie (Identität) über ihre katalytischen Domänen auf, im Vergleich zu dem Prototyp CKI-Protein, HRR25, von S. cerevisiae, und werden hierin als "HRR25-artige" Proteine bezeichnet. Dieser Grad an Identität ist signifikant größer als die erwarteten 25%, die beim Vergleich zweier per Zufall gewählter Proteinkinasen [Hanks und Quinn, oben] gefunden werden. Die HRR25-DNA-Sequenz wird in Hoekstra, et al., Science 253: 1031-1034 (1991) offenbart; Hefe-CKI1 und -CKI2-DNA-Sequenzen in Wang et al., J. Mol. Biol. Cell, 3: 275-286 (1992), entsprechend den Hefesequenzen YCK2 bzw. YCK1 in Robinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 28-32 (1992); partielle bovine CKIα, CKIβ-, CKIγ- und CKIδ-DNA-Sequenzen und eine homologe CKIα-DNA-Sequenz voller Länge in Rowles, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 9548-9552 (1991); eine Ratten-CKIB-DNA- Sequenz voller Länge in Graves, et al., J. Biol. (Ehem., 268: 6394-6401 (1993); und eine partielle menschliche erythroide CKIα-DNA-Sequenz in Brockman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 9454-9458 (1992).
Die Proteinkinase HRR25 von S. cerevisiae ist eine der umfassender charakterisierten Isoformen der CKI-Familie [Hoekstra, oben]. Mutationen in dem HRR25-Gen resultieren in einer Vielzahl an Defekten, die Zellzyklus-Verzögerungen, die Unfähigkeit; DNA-Strangbrüche ordentlich zu reparieren, und charakteristische morphologische Veränderungen einschließen. Die Natur dieser Effekte impliziert, daß HRR25 und andere CKI-Isoformen eine signifikante Rolle beim zellulären Wachstum spielen.
Die Wichtigkeit von Proteinphosphorylierung und Proteinkinasen in Gesundheits- und Krankheitszuständen ist in den Fällen offensichtlich, bei denen die Expression einer bestimmten Kinase schiefgelaufen ist; z. B. entsteht chronische myelogene Leukämie aus einer Translokation, die das Bruchstellen-Cluster-Region(BCR)-Gen neben das ABL-Tyrosin- Kinase-Gen setzt, was zu einem Fusionsprotein führt, das die aktivierte Proteinkinase umfaßt [siehe Übersicht, Bishop, et al., Cell 64: 235-288 (1991)]. Zusätzlich sind viele Onkogene, wie etwa Mos [Watson, et al., Proc. Natl., Acad. Sci., (USA) 79: 4078-4082 (1982)], Src [Ander son, et al., Mol. Cell. Biol. 5: 1122-1129 (1985)] und Raf [Bonner, et al., Nucl. Acids Res. 14: 1009-1015 (1986)] Proteinkinasen.
Die meisten Proteinkinasen phosphorylieren eine Vielzahl von Substraten in vivo, was eine Diversität an Antworten auf physiologische Reize ermöglicht [in einem Übersichtsartikel behandelt in Edelman et al., oben]. Jedoch zeigt die breitere Substratspezifität, die bei vielen Proteinkinasen in vitro gesehen wird, einschließlich einer Aktivität gegenüber nicht- physiologischen Substraten, an, daß zelluläre Mechanismen in vivo existieren müssen, um die Spezifizät dieser Enzyme zu kontrollieren. Ein Verständnis der regulatorischen Mechanismen, die diese Kinasen und die spezifische Rolle der Kinasen in Gesundheits- und Krankheitszuständen leiten, erfordert die Identifizierung von Substraten, regulatorischen Proteinen und Lokalisier/Targeting-Proteinen, die mit den Kinasen wechselwirken.
Somit existiert auf dem Gebiet ein Bedarf, Proteine zu identifizieren, die mit Mitgliedern der Casein-Kinase-I-Familie von Enzymen wechselwirkt, und die wechselwirkenden Proteine hinsichtlich ihrer Aminosäure- und codierenden DNA-Sequenzen zu charakterisieren. Eine solche Information würde für die Produktion der Proteine auf großem Maßstab sorgen, die Identifizierung von Zellen ermöglichen, die die Kinasen natürlich produzieren, und die Produktion von Antikörpern erlauben, die spezifisch mit den Kinasen reaktiv sind. Darüber hinaus würde eine Aufklärung der Substrate, Regulation und der Lokalisierung dieser Proteinkinasen zu einem Verständnis der Kontrolle von normalem und malignem Zellwachstum beitragen und Informationen bereitstellen, die für die Entwicklung von therapeutischen Mitteln essentiell ist, welche zur Intervention in anomalem und/oder malignem Zellwachstum nützlich sind.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es werden Verfahren offenbart zum Identifizieren von Proteinen, bezeichnet als TIH- Proteine, die mit CKI-Isoformen wechselwirken [d. h. HRR25-Casein-Kinase-I von S. cerevisiae und HRR25-artige Proteinkinasen mit wenigstens 35% Aminosäurehomologie zu HRR25 innerhalb der katalytischen Domäne] und zum Isolieren von Polynukleotiden, die für die TIH-Proteine codieren. Ein gegenwärtig bevorzugtes Verfahren umfaßt die Schritte: a) Transformieren oder Transfizieren von geeigneten Wirtszellen mit einem DNA-Konstrukt, das ein Reportergen unter der Kontrolle eines Promotors umfaßt, reguliert durch einen Tran skriptionsfaktor mit einer DNA-Bindungsdomäne und einer Aktivierungsdomäne; b) Exprimieren einer Hybrid-DNA-Sequenz in den Wirtszellen, die für eine erste Fusion eines Teils oder einer gesamten CKI-Isoform und entweder der DNA-Bindungsdomäne oder der Aktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors codiert; c) Exprimieren einer Bibliothek von zweiten Hybrid-DNA-Sequenzen in den Wirtszellen, die für zweite Fusionen eines Teils oder den ganzen vermuteten CKI-Isoform-Bindungsproteinen und entweder der DNA- Bindungsdomäne oder der DNA-Aktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors codiert, welche nicht in der ersten Fusion eingebaut ist; d) Nachweisen der Bindung von CKI-Isoform- Bindungsproteinen an die CKI-Isoform in einer bestimmten Wirtszelle durch Nachweisen der Produktion eines Reportergen-Produkts in der Wirtszelle; und e) Isolieren von zweiten Hybrid-DNA-Sequenzen, die für CKI-Isoform-Bindungsprotein von der bestimmten Wirtszelle codieren. Variationen des Verfahrens, bei denen die Reihenfolge, in der die CKI-Isoformen und vermuteten CKI-Isoform-Bindungsproteine an Transkriptionsfaktordomänen verschmolzen werden, d. h. am aminoterminalen oder carboxyterminalen Ende der Transkriptionsfaktordomänen, werden in Erwägung gezogen. In einer bevorzugten Version des Verfahrens ist der Promotor der lexA-Promotor, die DNA-Bindungsdomäne ist die lexA-DNA-Bindungsdomäne, die Aktivierungsdomäne ist die GAL4-Transaktivierungsdomäne, das Reportergen ist das lacZ-Gen, und die Wirtszelle ist eine Hefe-Wirtszelle.
Variationen des Verfahrens erlauben die Identifizierung von entweder kleinen Molekülen, die die Wechselwirkung zwischen einer CKI-Isoform und einem CKI-wechselwirkenden Protein inhibieren. Ein bevorzugtes Verfahren, um Kleinmolekül-Inhibitoren zu identifizieren, umfaßt die Schritte: a) Transformieren oder Transfizieren geeigneter Wirtszellen mit einem DNA- Konstrukt, das ein Reportergen unter der Kontrolle eines Promotors umfaßt, der reguliert wird durch einen Transkriptionsfaktor, welcher eine DNA-Bindungsdomäne und eine Aktivierungsdomäne hat; b) Exprimieren einer ersten Hybrid-DNA-Sequenz in den Wirtszellen, die für eine erste Fusion eines Teils oder einer ganzen CKI-Isoform und entweder der DNA- Bindungsdomäne oder der Aktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors codiert; c) Exprimieren einer zweiten Hybrid-DNA-Sequenz in den Wirtszellen, die für eine zweite Fusion eines Teils oder eines ganzen bekannten CKI-Isoform-Bindungsproteins und entweder der DNA-Bindungsdomäne oder der DNA-Aktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors codiert, die nicht in der ersten Fusion eingebaut ist; d) In-Kontakt-Bringen der Zellen mit einer vermuteten Inhibitor-Verbindung; und e) Identifizieren von modulierenden Verbindungen als diejenigen Verbindungen, die die Produktion des Reportergen-Produkts verändern im Ver gleich zur Produktion des Reportergen-Produkts in der Abwesenheit der modulierenden Verbindung.
Ein alternatives Identifizierungsverfahren zum Nachweisen von Proteinen, die an eine CKI- Isoform binden, umfaßt die Schritte: a) Transformieren oder Transfizieren geeigneter Wirtszellen mit einer Hybrid-DNA-Sequenz, die für eine Fusion zwischen einem vermuteten CKI- Isoform-Bindungsprotein und einem Liganden codiert, der zur Hochaffinitätsbindung an einen spezifischen Gegenrezeptor in der Lage ist; b) Exprimieren der Hybrid-DNA-Sequenz in den Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen; c) Immobilisieren des Fusionsproteins, das durch die Wirtszellen exprimiert wird, durch Exponieren des Fusionsproteins gegenüber dem spezifischen Gegenrezeptor in immobilisierter Form; d) In-Kontakt-Bringen einer CKI- Isoform mit dem immobilisierten Fusionsprotein; und e) Nachweisen der CKI-Isoform, die an das Fusionsprotein gebunden ist, unter Verwendung eines Reagens, das für die CKI-Isoform spezifisch ist. Gegenwärtig bevorzugte Liganden/Gegenrezeptor-Kombinationen zur Ausübung des Verfahrens sind Glutathion-S-Transferase/Glutathion, Hämagglutinin/Hämagglutinin-spezifische Antikörper, Polyhistidin/Nickel und Maltose-bindendes Protein/Amylose.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso neue, aufgereinigte und isolierte Polynukleotide bereit (z. B. DNA-Sequenzen und RNA-Transkripte), die für die TIH1- oder -3-Proteine codieren, die CKI- und/oder HRR25-Bindungseigenschaften besitzen, die den TIH1- oder -3- Proteinen inhärent sind. Bevorzugte DNA-Moleküle der Erfindung schließen cDNA, genomische DNA und ganz oder partiell chemisch synthetisierte DNA-Moleküle ein. Gegenwärtig bevorzugte Polynukleotide sind die DNA-Moleküle, dargestellt in SEQ ID NO: 2 (TIH1), und 6 (TIH3), die für die Polypeptide von SEQ ID NO: 3 (TIH1) bzw. 7 (TIH3) codieren. Ebenso werden rekombinante Plasmid- und virale DNA-Konstrukte (Expressionskonstrukte) bereitgestellt, die TIH-Polypeptid-codierende Sequenzen umfassen, die operativ an ein homologes oder heterologes transkriptionsregulatorisches Element oder Elemente verknüpft sind.
Als ein weiterer Aspekt der Erfindung werden prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen, die mit DNA-Sequenzen der Erfindung transformiert oder transfiziert sind, bereitgestellt, welche TIH1- oder -3-Polypeptide exprimieren. Wirtszellen der Erfindung sind besonders nützlich für eine Produktion auf großem Maßstab von TIH-Polypeptiden, die aus den Wirtszellen oder dem Medium, in welchem die Wirtszellen wachsen gelassen werden, isoliert werden können.
Ebenso offenbart werden aufgereinigte und isolierte TIH-Polypeptide, Fragmente und Varianten davon (d. h. Deletions-, Additions- oder Substitutionsanaloge). Beispiel-TIH- Polypeptide sind wie dargestellt in SEQ ID NO: 3 (TIH1), 5 (TIH2) und 7 (TIH3). Neue TIH- und TIH-Varianten-Produkte können als Isolate aus natürlichen Ursprüngen erhalten werden, werden aber bevorzugt mit rekombinanten Prozeduren erzeugt, bei denen Wirtszellen beteiligt sind. Posttranslationale Verarbeitungsvarianten von TIH-Polypeptiden können erzeugt werden durch Variieren der Wirtszelle, die für die rekombinante Produktion und/oder das Verarbeiten nach der Isolierung ausgewählt wird. Variante TIH-Polypeptide können Analoge umfassen, bei denen eine oder mehrere der Aminosäuren deletiert oder ersetzt sind: (1) ohne Verlust, und bevorzugt mit Verstärkung, von biologischen Eigenschaften oder biochemischen Eigenschaften, die für TIH-Polypeptide spezifisch sind, oder (2) mit einer spezifischen Behinderung einer charakteristischen Protein/Protein-Wechselwirkung.
Ebenso umfaßt von der Verbindung sind Antikörper-Substanzen (z. B. monoklonale und polyklonale Antikörper, Antikörper mit einzelner Kette, chimäre Antikörper, CDR-verpflanzte Antikörper und ähnliche), die spezifisch immunreaktiv mit TIH1- oder -3-Polypeptiden sind. Antikörpersubstanzen sind nützlich z. B. zur Aufreinigung von TIH1- oder -3-Polypeptiden und zur Isolierung, mittels immunologischem Expressions-Screening, von Polynukleotiden homologer und heterologer Spezies, die für TIH1- oder -3-Polypeptide codieren. Hybridom- Zellinien, die Antikörper produzieren, die für TIH1- oder -3-Polypeptide spezifisch sind, werden ebenso umfaßt von der Erfindung. Techniken zum Produzieren von Hybridomen, die monoklonale Antikörper ausscheiden, sind auf dem Gebiet gut bekannt. Hybridom-Zellinien können erzeugt werden nach Immunisieren eines Tieres mit aufgereinigten TIH1- oder -3- Polypeptiden oder Varianten davon.
Der wissenschaftliche Wert der Information, der durch die Offenbarung von DNA- und Aminosäure-Sequenzen der vorliegenden Erfindung beigetragen wird, ist manifest. Als eine Reihe von Beispielen, Kenntnis der genomischen DNA-Sequenzen, die für Hefe-TIH-Polypeptide codieren, erlaubt das Screening einer cDNA oder genomischen DNA von anderen Spezies, um Homologe der Hefe-Polypeptide nachzuweisen. Screening-Prozeduren, einschließlich DNA/DNA- und/oder DNA/RNA-Hybridisierung und PCR-Amplifizierung, sind Standard auf dem Gebiet und können verwendet werden, um Gegenstücke der Hefe-TIH-Pölypeptide heterologer Spezies zu isolieren, sowie um Zelltypen zu bestimmen, die diese Homologe exprimieren.
DNA- und Aminosäure-Sequenzen der Erfindung machen ebenso die Analyse von TIH- Epitopen möglich, die aktiv an Kinase/Protein-Wechselwirkungen teilnehmen, sowie von Epitopen, die solche Wechselwirkungen regulieren können. Die Entwicklung von Mitteln, die für diese Epitope spezifisch sind (z. B. Antikörper, Peptide oder kleine Moleküle), die Proteinkinase-Proteinsubstrat-Wechselwirkung, Proteinkinase-regulatorische-Untereinheit- Wechselwirkung und/oder Proteinkinase-Protein-Lokalisiermolekül-Wechselwirkung verhindern, inhibieren oder nachahmen, werden von der Erfindung in Betracht gezogen. Es wird erwartet, daß therapeutische Zusammensetzungen, die die Mittel umfassen, beim Modulieren der CKI/TIH-Protein-Wechselwirkungen nützlich sind, welche beim Zellwachstum in Gesundheits- und Krankheitszuständen, z. B. Krebs und Virusbezogenen Pathologien, beteiligt sind.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Zahlreiche andere Gesichtspunkte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bei Betrachtung der folgenden detaillierten Beschreibung derselben offensichtlich sein, wobei auf die Zeichnung Bezug genommen wird, bei der:
Fig. 1 ein Western-Blot ist, der die Assoziation von HRR25-Casein-Kinase I von S. cerevisiae mit affinitätsaufgereinigtem TIH2 demonstriert.
Fig. 2 ein Aminosäure-Sequenz-Vergleich zwischen TIH1 und Enzymen ist, von denen bekannt ist, daß sie bei der Entfernung von fehlerhaften Nukleotiden teilnehmen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Es werden Verfahren zum Identifizieren von Proteinen offenbart, die mit CKI-Isoformen wechselwirken, und wird durch die folgenden Bespiele illustriert, die die Isolierung und Charakterisierung von Genen betreffen, die für TIH-Polypeptide codieren. Insbesondere betrifft Beispiel 1 die Isolierung von DNA-Sequenzen, die für TIH-Polypeptide aus einer genomi schen Hefebibliothek codieren, unter Verwendung einer Dihybrid-Screening-Technik. Beispiel 2 betrifft die Analyse der Wechselwirkung zwischen TIH-Polypeptiden- und verschiedenen CKI-Isoformen aus Hefe. Beispiel 3 betrifft die Wechselwirkung zwischen einer CKI- Isoform aus Hefe, einschließlich Mutanten und Fragmenten davon, und Kinesinen. Beispiel 4 beschreibt die Analyse der Wechselwirkung zwischen TIH-Polypeptiden und menschlichen CKI-Isoformen. Beispiel 5 betrifft die Isolierung genomischer DNA-Sequenzen voller Länge, die für TIH-Polypeptide der Erfindung codieren. Beispiel 6 beschreibt die Konstruktion einer TIH-Knockout-Mutante in Hefe. Beispiel 7 betrifft die Analyse von S. cerevisiae- HRR25/TIH-Polypeptiden-Wechselwirkungen, unter Verwendung von Affinitätsaufreinigungs- und Western-Blotting-Techniken. Beispiel 8 stellt einen Vergleich auf Aminosäure- Ebene zwischen TIH1 und Enzymen bereit, die als beim Abbau von oxidativ geschädigten Nukleotiden beteiligt identifiziert worden sind, wodurch sie die Genauigkeit der Replikation verstärken. Auf Stoff, der nicht Teil der Erfindung, wie beansprucht, bildet, wird nur zu Vergleichszwecken in den Beispielen Bezug genommen.

Beispiel 1

Zelluläre Bestandteile, die mit CKI-Isoformen wechselwirken, wurden mit einem Dihybrid- Screening-Verfahren identifiziert, das einen transkriptionellen Transaktivator in Hefe wiederherstellt. [Ein ähnlicher "Two-hybrid"-Assay wurde ursprünglich beschrieben in Fields und Song, Nature, 340: 245-246 (1989) und vor kurzem in Yang et af, Science 257: 681-682 (1992) und Vojtek et al., Cell, 74: 205-214 (1993).] In dem Assay werden "Köder"- Bestandteile (d. h. CKI-Isoformen) an die DNA-Bindungsdomäne eines Transkriptionsfaktors fusioniert (z. B. das IexA-Protein) und "Jagd"-Bestandteile (d. h. vermutete CKI- wechselwirkende Proteine) werden an die Transktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors (z. B. GAL4) fusioniert. Rekombinante DNA-Konstrukte, die für die Fusionsproteine codieren, werden in einer Wirtszelle exprimiert, die ein Reportergen enthält, das an Promotorregulatorische Elemente fusioniert ist (z. B. eine lexA-DNA-Bindungsstelle), die von dem Transkriptionsfaktor erkannt wird. Die Bindung eines Jagd-Fusionsproteins an ein Köder- Fusionsprotein bringt die GAL4-Transaktivierungsdomäne und die lexA-DNA- Bindungsdomäne zusammen, was die Wechselwirkung des Komplexes mit der lexA-DNA- Bindungsstelle ermöglicht, die sich dem β-Galactosidase-Reportergen am nächsten befindet, was damit transkriptionelle Transaktivierung wiederherstellt und β-Galactosidase-Aktivität erzeugt. In Abwandlungen des Verfahrens kann der "Jagd"-Bestandteil an die DNA- Bindungsdomäne von GAL4 fusioniert und die "Köder"-Bestandteile nachgewiesen und durch Fusion an die Transaktivierungsdomäne von GAL4 analysiert werden. Ebenso könnten Abwandlungen dieses Verfahrens die Reihenfolge verändern, in der "Köder"- und "Jagd"- Bestandteile an Transkriptionsfaktor-Domänen fusioniert werden, d. h. "Köder"- und "Jagd"- Bestandteile können an die Amino-terminalen oder Carboxy-terminalen Enden der Transkriptionsfaktordomänen fusioniert werden.
Um Gene zu identifizieren, die für Proteine codieren, die mit HRR25-CKI-Proteinkinase von S. cerevisiae wechselwirken, wurde eine Plasmid-Bibliothek, die für Fusionen zwischen der Hefe-GAL4-Aktivierungsdomäne und genomischen Fragmenten von S. cerevisiae ("Jagd"- Bestandteilen) auf Wechselwirkung mit einer DNA-Bindungsdomänen-Hybride gescreent, die das E. coli lexA-Gen enthielt, fusioniert an HRR25 ("Köder"-Bestandteil). Die Fusionen wurden in Plasmid pBTMI 16 konstruiert (Geschenk von Bartell und Fields, SUNY), das das Hefe-TRP1-Gen, einen 2u Replikationsursprung, und ein Hefe-ADHI-Promotor enthält, der die Expression der E. coli lexA-DNA-Bindungsdomäne antreibt (Aminosäuren 1 bis 202).
Plasmid pBTM116::HRR25, das das lexA::HRR25-Fusionsgen enthält, wurde in mehreren Schritten konstruiert. Die DNA-Sequenz, die für das Anfangsmethionin und die zweite Aminosäure von HRR25 codiert, wurde in eine Smal Restriktionsstelle mittels stellengerichteter Mutagenese unter Verwendung eines MutaGene Mutagenese-Kit von BioRad (Richmond, California) verändert. Die DNA-Sequenz von HRR25 wird in SED ID NO: 8 dargestellt. Das für die Mutagenese verwendete Oligonukleotid wird unten dargestellt, wobei die Smal Stelle unterstrichen ist.
(SEQ ID NO: 9)
Nach Verdau mit Smal wurde das resultierende veränderte HRR25-Gen in das Plasmid pBTMI 16 an der Smal Stelle ligiert, um das lexA::HRR25 Fusionskonstrukt zu erzeugen.
Wechselwirkungen zwischen Köder- und Jagd-Fusionsproteinen wurden in dem Hefe- Reporter-Stamm CTY10-5d nachgewiesen (Genotyp = MÄTa ade2 trp1-901 leu2-3, 112 his 3-200 gal4 gal80 URA3::lexA op-lacZ.) [Luban, et al., Cell 73: 1067-1078 (1993)], der eine lexA-Bindungsstelle trägt, die die Transkription von lacZ steuert. Der Stamm CTY10-5d wur de zuerst mit Plasniiid pBTMI 16::HRR25 mittels einer Lithiumacetat-vermittelten Transformation transformiert [Ito, et al., J. Bacteriol. 153: 163-168 (1983)]. Die resultierenden Transformanten wurden dann mit einer genomischen Jagd-Hefebibliothek transformiert, die als GAL4-Fusionen im Plasmid pGAD erzeugt worden war [Chien, et al., Proc: Natl. Acad. Sci (USA) 21: 9578-9582 (1991)], um die exprimierten Proteine aus der Bibliothek auf eine Wechselwirkung mit HRR25 zu screenen. Insgesamt 500.000 Doppel-Transformanten wurden auf β-Galactosidase-Expression getestet durch Replika-Plattieren auf Nitrocellulosefilter, Lysieren der replizierten Kolonien durch Schnellfrieren der Filter in flüssigem Stickstoff und Inkubieren der lysierten Kolonien mit dem blauen chromogenen Substrat 5-Brom-4-chlor-3- indolyl-β-D-galactoside (X-gal). Die β-Galactosidase-Aktivität wurde gemessen unter Verwendung von Z-Puffer (0,06 M Na&sub2;HPO&sub4;, 0,04 M NaH&sub2;PO&sub4;, 0,01 M KCl, 0,001 M MgSO&sub4;, 0,05 M β-Mercaptoethanol), der X-gal in einer Konzentration von 0,002% enthielt [Guarente, Meth. Enzymol. 101: 181-191 (1983)]. Die Reaktionen wurden abgestoppt durch Flotieren der Filter auf 1M Na&sub2;CO&sub3;, und positive Kolonien wurden anhand ihrer dunkelblauen Farbe identifiziert.
Bibliothek-Fusionsplasmide (Jagd-Konstrukte), die dem Reporter-Stamm blaue Farbe verliehen, mit-abhängig von der Anwesenheit des HRR25/DNA-Bindungsdomänen- Fusionsproteinpartners (Köder-Konstrukt), wurden identifiziert. Die Sequenz, die der Fusionsstelle in jedem Bibliotheksplasmid angrenzte, wurde durch Erweitern der DNA-Sequenz von der GAL4-Region bestimmt. Der verwendete Sequenzierprimer ist unten dargestellt.
(SEQ ID NO: 10)
Eine DNA-Sequenz wurde unter Verwendung eines Sequenase-Version-II-Kit (US Biochemicals, Cleveland, Ohio) oder mittels automatisiertem DNA-Sequenzieren mit einem ABI373A- Sequenzierer (Applied Biosystems, Foster City, California) erhalten.
Vier Bibliotheksklone wurden identifiziert, und die Proteine, für die sie codierten, werden hierin als TIH-Proteine 1 bis 4 bezeichnet, für Targets Interacting with HRR25-like protein kinase isoforms. Der TIH1-Teil des TIH1-Klon-Insert entspricht den Nukleotiden 1528 bis 2580 von SEQ ID NO: 2; der TIH2-Teil des TIH2-Klon-Insert entspricht Nukleotiden 2611 bis 4053 von SEQ ID NO: 4; der TIH3-Teil des TIH3-Klon-Insert entspricht Nukleotiden 248 bis 696 von SEQ ID NO: 6; und der TIH4-Teil des TIH4-Klon-Insert ist in SEQ ID NO: 11 dargestellt und entspricht Nukleotiden 1763 bis 2305 von SEQ ID NO: 28. Auf der Grundlage der DNA-Sequenz-Analyse der TIH-Gene wurde bestimmt, daß TIH1 und- TIH3 neue Sequenzen waren, die für kein Proteinmotiv, das in der GenBank Datenbank vorhanden war (8. Juli 1993), repräsentativ waren. Die TIH2-Sequenzen wurden in der Datenbank als einem offenen Leserahmen aus Hefe ähnlich identifiziert, der keine identifizierte Funktion hat. (GenBank HinterlegungsNr. Z23261, offener Leserahmen YBL0506). TIH4 repräsentierte ein Fusionsprotein zwischen GAL4 und dem Carboxy-terminalen Teil des Kinesin-artigen Proteins KIP2. KIP2 hat eine hoch konservierte Region, die eine Kinesin-artige Motordomäne auf Microtubulus-Basis enthält [Roofet al., J. Cell. Biol. 118(1): 95-108 (1992)]. Die Isolierung der entsprechenden genomischen Klone voller Länge für TIH1 bis TIH3 wird in Beispiel 5 beschrieben.

Beispiel 2

Um die Spezifität der Wechselwirkung und die Regionen der Wechselwirkung zwischen CKI- Isoformen und den TIH-Proteinen zu erforschen, wurden Köder-Konstrukte, die mutante oder fragmentarische HRR25-Isoformen oder andere Hefe(NUF1 und Hhp1)-CKI-Isoformen, fusioniert an die lexA-DNA-Bindungsdomäne, umfaßten, auf ihr Transkriptions- Transaktivierungspotential in dem Dihybrid-Assay untersucht.

Plasmid-Konstruktionen

Um ein Plasmid zu konstruieren, das eine katalytisch inaktive HRR25-Proteinkinase enthält, wurde HRR25-DNA, die für eine Lysin-zu-Arginin-Mutation bei Rest 38 (der ATP- Bindungsstelle) von HRR25 codiert [DeMaggio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89(15): 7008-7012 (1992)], mittels stellengerichteten Mutagenese-Standard-Techniken erzeugt. Die resultierende DNA wurde dann mittels einer PCR-Reaktion amplifiziert, die eine Smal Restriktionsstelle einfügte (unterstrichen in SEQ ID NO: 12) vor dem HRR25 ATG unter Verwendung eines mutagenen Oligonukleotids:
(SEQ ID NO: 12)
und des Oligonukleotids stromabwärts, das eine BamHI-Stelle (unterstrichen) einfügte:
(SEQ ID NO: 13).
Die Reaktionen schlossen 200mM Tris-HCl (pH 8,2), 100mM KCl, 60mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 15 mM MgCl&sub2;, 1% Triton X-100, 0,5 um Primer, 100 ng Matrize, 200 uM dNTP und 2,5 Einheiten Polymerase ein. Die Reaktionen wurden für 30 Zyklen durchgeführt. Die Reaktionen wurden mit einer 4-minütigen Behandlung bei 94ºC begonnen, und alle Zyklen waren 1 Minute bei 94ºC zum Denaturieren, 2 Minuten bei 50ºC zum Annealen und 4 Minuten bei 72ºC zur Extension. Das resultierende Amplifizierungsprodukt wurde mit Smal verdaut und an der Smal Stelle von pBTM116 ligiert, um das Plasmid zu erzeugen, das als pBTMI 16::HRR25K→R bezeichnet wird, das für lexA-Sequenzen codiert, die 5' an HRR25- Sequenzen fusioniert sind.
Um ein pBTMI 16-Plasmid zu konstruieren, das für ein Fragment einer katalytischen Domäne von HRR25 codiert, wurden zwei Runden stellengerichteter Mutagenese durchgeführt, um eine Smal Stelle anstelle des Anfangs-ATG und zweiten Codons der HRR25-DNA und eine BamHI-Stelle bei Nukleotid 1161 (siehe SEQ ID NO: 8) oder Aminosäure 397 von HRR25 einzuführen. Das mutagene Oligonukleotid, das verwendet wurde, um die 5' SmaI- Restriktionsstelle (unterstrichen) einzuführen, war:
(SEQ ID NO: 14),
und das Oligonukleotid, das verwendet wurde, um die 3'- oder stromabwärts befindliche BamHI-Stelle (unterstrichen) bei Rest 397 zu erzeugen, war;
(SEQ ID NO: 15).
Das resultierende Produkt wurde mit SmaI-BamHI verdaut, und das Fragment, das für die HRR25-katalytische Domäne codiert (entsprechend Nukleotiden 2 bis 1168 von SEQ ID NO: 8) wurde in Plasmid pBTM116 subkloniert, das mit denselben Enzymen linearisiert worden war, um das Plasmid zu erzeugen, das als pBTM116::Kinasendomäne bezeichnet wird, das für lexA-Sequenzvn codiert, die 5' an HRR25 Sequenzen fusioniert sind.
Um ein pBTMI 16-Plasmid zu konstruieren, das das nicht-katalytische Domänen-Fragment von HRR25 enthält, wurde eine SmaI-Stelle (unterstrichen) bei Nukleotid 885 (Aminosäure 295) eingeführt unter Verwendung von stellengerichteter Mutagenese mit dem folgenden Oligonukleotid:
(SEQ ID NO: 16).
Das resultierende Produkt wurde mit SmaI und BamHI verdaut, und das Fragment, das für die HRR25-nicht-katalytische Domäne codiert (entsprechend Nukleotiden 885 bis 1485 von SEQ ID NO: 8) wurde in Plasmid pBTM116 subkloniert, das mit denselben Enzymen linearisiert worden war, um das Plasmid zu erzeugen, das als pBTM116::Nicht-katalytisch bezeichnet wird, das für /exA-Sequenzen codiert, die 5' an HRR25-Sequenzen fusioniert sind.
Um eine Fusion mit der S. cerevisiae-NUF1-Isoform von CKI in Plasmid pBTM116 zu konstruieren, wurde eine SmaI-Stelle (unterstrichen) durch stellengerichtete Mutagenese anstelle des Anfangs-ATG und des zweiten Codons von NUF1-DNA (SEQ ID NO: 17) unter Verwendung des Oligonukleotids eingeführt:
(SEQ ID NO: 18).
Das resultierende Produkt wurde -mit SmaI und BamHI verdaut, und das NUF1-Fragment wurde in pBTM116 ligiert, das mit denselben Enzymstellen linearisiert worden war, um das Plasmid zu erzeugen, das als pBTM116::NUF1 bezeichnet wird, das für /exA-Sequenzen codiert, die 5' an NUF 1-Sequenzen fusioniert sind.
Um eine Fusion mit der S. pombe Hhp1-Isoform von CKI im Plasmid pBTM116 zu konstruieren, wurde eine SmaI-Stelle (unterstrichen) mittels stellengerichteter Mutagenese anstelle des Anfangs-ATG und des zweiten Codons von Hhp1-DNA (SEQ ID NO: 19) unter Verwendung des Oligonukleotids eingeführt:
(SEQ ID NO: 20)
Das resultierende Produkt wurde mit SmaI und BamHI verdaut, und das HhpI-Fragment wurde in pBTM116 ligiert, das mit denselben Enzymen linearisiert worden war, um Plasmid pBTM116::Hhp1 zu erzeugen, das für lexA-Sequenzen codiert, die 5' an Hhp1-Sequenzen fusioniert sind.

Assays

Um Protein/Protein-Wechselwirkungsniveaus zwischen Wildtyp- und mutanten CKI- Isoformen und TIH-Proteinen der Erfindung zu messen, wurden Standard-Hefe- Paarungstechniken verwendet, um Hefestämme zu erzeugen, die alle paarweisen Kombinationen der Isoformen und TIH-Proteine enthielten. Alle CKI-Isoform-codierenden Plasmide auf pBTM116-Basis wurden in Hefe mittels Lithiumacetat-vermittelten Transformationsverfahren transformiert und Transformanten wurden auf SD-Tryptophan-Medium (Bio101, La Jolla, CA) selektioniert. Der Hefestamm CTY10-Sd, der für Transformationen auf pBTMl 16-Basis verwendet wurde, war vom Paarungstyp α. Alle für TIH-Protein-codierenden Plasmide auf pGAD-Basis, beschrieben in Beispiel 1, wurden unter Verwendung des Lithiumacetatverfahrens in Hefe transformiert, und Transformanten wurden auf SD-Leucin-Medium selektioniert. Der Hefestamm, der für Transformationen auf der pGAD-Basis verwendet wurde, war vom Paarungstyp α. Dieser MATa-Stamm ist zu CTY10-5d isogen und wurde durch Einführen des HO-Gens unter Verwendung von Plasmid pGALHO [Jenson und Herskowitz, Meth. Enzymol. 194: 132-146 (1991)] in einer Lithiumacetat-vermittelten Transformation konstruiert, wobei das HO-Gen mit Galactose induziert wird, um eine Paarungtyp-Umwandlung zu verursachen, und indem man den Stamm nicht-selektiv wachsen läßt, um einen Abkömmling zu isolieren, der den Paarungstyp umgeschaltet hatte.
Um paarweise Kombinationen zwischen Plasmiden auf pBTM116-Basis und Plasmiden auf pGAD-Basis zu konstruieren, wurden Hefestämme gegensätzlicher Paarungstypen replikaplattiert in einem Kreuzmuster auf YEPD-Medium (Bio101) und für 18 Stunden sich paaren gelassen. Diploide Zellen wurden durch ein zweites Replika-Plattieren auf SD-Leucin, - Tryptophan-Medium selektioniert, um auf Zellen zu selektionieren, die Plasmide vom sowohl pBTM116-Typ als auch vom pGAD-Typ enthielten. Die isolierten Diploide ließ man in flüssigem SD-Leucin, -Tryptophan-Medium auf eine Zelldichte von 2 · 107 Zellen/ml wachsen, und das Niveau der Wechselwirkung der Kinase und dem wechselwirkenden Protein, bestimmt anhand der β-Galactosidase-Aktivität, wurde aus Zellen bestimmt, die durch die Zugabe von 3 Tropfen Chloroform und 50 ul 0,1% SDS zu 2 · 106 Zellen, die in 0,1 ml Z- Puffer suspendiert waren, und durch darauffolgendes Zugeben von 0,2 ml des chromogenen Substrats o-Nitrophenyl-β-D-galactosid lysiert wurden. β-Galactosidase-Assays wurden durch Zugabe von 0,5 ml 1M Na&sub2;CO&sub3; beendet, und die Aktivität wurde durch Ablesen der Extinktion bei 420 nm unter Verwendung eines Milton Roy Spektrophotometers (Rochester, New York) gemessen. Bei diesem Assay ist der Grad der Protein/Protein-Wechselwirkung direkt dem Niveau der β-Galactosidase-Aktivität proportional. Die erhaltenen relativen β- Galactosidase-Aktivitätsmessungen sind in Tabelle 1 angegeben, bei denen ein Wert von < 5 anzeigt, daß das Niveau der β-Galactosidase-Aktivität nicht größer als der Hintergrund war, und ein Wert von 10 zeigt ein leicht nachweisbares Niveau der Aktivität an. Die Werte wurden auf Kontrollen mit Vektor alleine normalisiert. Tabelle 1 Hefe-CKI/TIH-Protein-Wechselwirkungen
Die Resultate zeigen eine signifikante Wechselwirkung zwischen HRR25-Proteinkinase und den TIH-Genen. Weiterhin schien die Wechselwirkung eine aktive Proteinkinase zu erfordern; die Region von HRR25, die mit den TIH-Proteinen wechselwirkte, befindet sich auf der Proteinkinasen-Domäne von HRR25. TIH-Proteine der Erfindung wechselwirkten ebenso mit anderen CKI-Isoformen. Zum Beispiel wechselwirkte TIH3 mit NUF1, und; TIH2 und TIH3 wechselwirkten mit HhpI.

Beispiel 3

Da HRR25-Mutanten (hrr25) Chromosomen-Segregationsdefekte zeigen, und weil Kinesine bei der Chromosomen-Segregation beteiligt sind, wurde die Wechselwirkung mehrerer verschiedener Kinesine mit den CKI-Köder-Fusionen, beschrieben in Beispiel 2, untersucht. Bis heute schließt die Kinesin-Genfamilie in Hefe Proteine ein, bezeichnet als KIP1 (Roofet al., oben), KIP2 (Roofet al., oben), CIN8 [Hoyt et al., J. Cell. Biol. 11(1): 109-120 (1992)] und KAR3 [Meluh et al., Cell 60(6): 1029-1041 (1990)], ein. Um die Jagd-Kinesin-Fusions- Plasmide zu konstruieren, wurden genomische Klone von KIP1, KIP2, CINB und KAR3 zuerst isoliert und dann in Plasmid pGAD subkloniert, das die transaktivierende Domäne von GAL4 enthält. Wechselwirkungen der CKI-Köder-Fusionen mit der TIH4-Jagd-Fusion (pGAD::TIH4), beschrieben in Beispiel 1, wurden miteinander untersucht.

Plasmid-Konstruktion

KIP1-Sequenzen wurden aus S cerevisiae genomischer DNA unter Verwendung der folgenden zwei Primer amplifiziert:
(SEQ ID ND: 21) und
(SEQ ID NO: 22).
Das amplifizierte Fragment wurde mit ³²P durch Zufalls-geprimtes Markieren (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) markiert und verwendet, um eine genomische Hefebibliothek zu screenen, die in dem Plasmid pRS200 (ATCC 77165) konstruiert worden war, mittels Kolonie-Hybridisierung. Hybridisierungen wurden bei 65ºC für 18 Stunden in 6X SSPE (20X SSPE ist 175,3 g/l NaCl, 27,6 g/l NaH&sub2;PO&sub4;.H2), 7,4 g.l EDTA, pH 7,4, 100 ug/ml Lachs- Samen-Träger-DNA, SX Denhardts Reagens (50 · Denhardts ist 5% Ficoll, 5% Polyvinylpyrrolidon, 5% bovines Serumalbumin), 0,1% SDS und 5% Natriumdextransulfat durchgeführt. Die Filter wurden viermal in 0,1X SSPE, 1% SDS gewaschen. Jede Waschung war bei 65ºC für 30 Minuten. Zwei Runden stellengerichteter Mutagenese wurden dann, wie in Bei spiel 2 beschrieben, durchgeführt, um BamHI-Stellen am Anfang und Ende der KIP1- Codierungssequenz einzuführen (SEQ ID NO: 23). Die Mutagenese wurde unter Verwendung des Muta-gene Mutagenese-Kit, Version 2, durchgeführt (BioRad). Das Oligonukleotid zum Einführen einer BamHI-Stelle (unterstrichen) anstelle des KIP1-ATG und des zweiten Codons war:
(SEQ ID NO: 24)
und das Oligonukleotid, das für ein Stopp-Codon (doppelt unterstrichen) und eine BamHI- Stelle (unterstrichen) codierte, war:
(SEQ ID NO: 25).
Das resultierene KIP1-Produkt wurde mit BamHI verdaut und in pGAD unmittelbar stromabwärts von GAL4-Sequenzen kloniert, und das Plasmid wurde pGAD::KIP1 genannt.
KIP2-Sequenzen wurden aus S. cerevisiae genomischer DNA unter Verwendung der folgenden zwei Primer amplifiziert:
(SEQ ID NO: 26) und
(SEQ ID NO: 27).
Das amplifizierte Fragment wurde mit ³²P durch Zufalls-geprimtes Markieren markiert und verwendet, um eine genomische Hefebibliothek zu screenen, die in dem Plasmid YCp50 (ATCC 37415) konstruiert worden war, durch Kolonie-Hybridisierung. Die Hybridisierungen und Waschungen waren wie oben für KIP1 beschrieben. Zwei Runden stellengerichteter Mutagenese wurden durchgeführt, um BamHI-Stellen am Anfang und Ende der KIP2- codierenden Sequenzen einzuführen (SEQ ID NO: 28). Das Oligonukleotid zum Einführen einer BamHI-Stelle (unterstrichen) anstelle des KIP2-ATG und des zweiten Codons war:
(SEQ ID NO: 29),
und das Oligonukleotid, das für eine BamHI-Stelle (unterstrichen) codierte, war:
(SEQ ID NO: 30).
Das resultierende KIP2-Produkt wurde mit BamHI verdaut und in pGAD unmittelbar stromabwärts von GAL4-Sequenzen kloniert, und das Plasmid wurde pGAD::KIP2 genannt.
CIN8-Sequenzen wurden aus S. cerevisiae genomischer DNA unter Verwendung der folgenden zwei Primer amplifiziert:
(SEQ ID NO: 31) und
(SEQ ID NO: 32).
Das amplifizierte Fragment wurde mit ³²P durch Zufalls-geprimtes Markieren markiert und verwendet, um eine genomische Hefebibliothek zu screenen, die in dem Plasmid pRS200 (ATCC 77165) konstruiert worden war, mittels Kolonie-Hybridisierung. Hybridisierungen und Waschungen waren wie oben für KIP1 beschrieben. Zwei Runden stellengerichteter Mutagenese wurden durchgeführt, um BamHI-Stellen am Anfang und Ende der CIN8- codierenden Sequenzen einzuführen (SEQ ID NO: 33). Das Oligonukleotid, das zum Einführen einer BamHI-Stelle (unterstrichen) anstelle des CIN8-ATG und des zweiten Codons verwendet wurde, war:
(SEQ ID NO: 34),
und das Oligonukleotid stromabwärts, das für eine BamHI-Stelle (unterstrichen) und ein Stopp-Codon (doppelt unterstrichen) codierte, war:
(SEQ ID NO: 35).
Das resultierende CIN8-Produkt wurde mit BamHI verdaut und in pGAD ummittelbar stromabwärts von den GAL4-Sequenzen kloniert, und das Plasmid wurde pGAD::CIN8 genannt.
KAR 3 wurde aus S. cerevisiae genomischer DNA unter Verwendung der folgenden zwei Primer amplifiziert:
(SEQ ID N0; 36) und
(SEQ ID NO: 37).
Das amplifizierte Fragment wurde mit ³²P durch Zufalls-geprimtes Markieren markiert und verwendet, um eine genomische Hefebibliothek zu screenen, die in dem Plasmid pRS2OO (ATCC 77165) konstruiert worden war, durch Kolonie-Hybridisierung. Hybridisierungen und Waschungen waren wie oben beschrieben für KIP1. Zwei Runden stellengerichteter Mutagenese wurden durchgeführt, um BamHI-Stellen am Anfang und Ende der KAR3-codierenden Sequenzen (SEQ ID NO: 38) einzuführen. Das Oligonukleotid zum Einführen einer BamHI- Stelle (unterstrichen) anstelle des KAR3-ATG und zweiten Codons war:
(SEQ ID NO: 39),
und das Oligonukleotid, das für eine BamHI-Stelle (unterstrichen) und ein Stopp-Codon (doppelt unterstrichen) codierte, war:
(SEQ ID NO: 40).
Das resultierende KAR3-Produkt wurde mit BamHI verdaut und in pGAD unmittelbar stromabwärts von GAL4-Sequenzen kloniert, und das Plasmid wurde pGAD::KAR3 genannt.
Die Jagd-Plasmide wurden in Hefe durch Lithiumacetat-vermittelte Transformation transformiert, und die Transformanten wurden mit Hefestämmen, die für CKI-Isoformen codierten, wie in Beispiel 2 beschrieben, gepaart. β-Galactosidase-Aktivität der CKI-Isoform/TIH- enthaltenden Stämme wurde aus Zellen bestimmt, die durch Zugabe von 3 Tropfen Chloroform und 50 ul 0,1% SDS zu 2 · 106 Zellen, die in 0,1 ml Z-Puffer suspendiert waren, und durch darauffolgendes Zugeben von 0,2 ml des chromogenen Substrats o-Nitrophenyl-β-D- galactosid lysiert wurden. β-Galactosidase-Assays wurden durch Zugabe von 0,5 ml 1 M Na&sub2;CO&sub3; beendet, und die Aktivität wurde durch Lesen der Extinktion bei 420 nm unter Verwendung eines Milton Roy Sprectophotometers (Rochester, New York), gemessen. Bei diesem Assay ist der Grad der Protein/Protein-Wechselwirkung dem Niveau der β- Galactosidase-Aktivität direkt proportional. Die Resultate des Assays werden als Einheit der β-Galactosidase-Aktivität in Tabelle 2 präsentiert. Tabelle 2 β-Galactosidase-Aktivität, die aus CKI-Isofaxm/Kinesin-Wechselwirkung resultiert
Die Resultate zeigen an, daß HRR25 mit allen vier Hefe-Kinesinen und TIH4 wechselwirken kann. Kinesine KIP2 und CIN8 wechselwirken mit der katalytischen Domäne von HRR25, während Kinesine KIP1 und KAR3 mit Kinase-inaktivem HRR25 und mit der nichtkatalytischen Domäne von HRR25 wechselwirken, was nahelegt, daß die Kinase/Substrat- Interaktion durch eine starke Bindung an enzymatische Aktivität fortschreitet. Zusätzlich zeigen die Resultate, daß HRR25 mit dem Carboxy-terminalen Teil von TIH4 oder, weil TIH4 KIP2 entspricht, KIP2 wechselwirkt.

Beispiel 4

Assays wurden ebenso durchgeführt, um zu bestimmen, ob menschliche CKI-Isoformen mit den TIH-Proteinen der Erfindung wechselwirken würden. Zwei menschliche CKI-Isoformen, CKIα3 (CKIα3Hu) und CKIδ (CKIδHu), wurden für diese Analyse ausgewählt. Die menschlichen CKI-Gene wurden an die GAL4-DNA-Bindungsdomäne fusioniert, die zuvor in das Plasmid pAS inseriert worden war [Durfee, et al., Genes and Development 7: 555-569 (1993)], um pAS::CKIα3 und pAS::CKIδ zu erzeugen.
Insbesondere wurde die für die CKIα3Hu-Isoform codierende DNA (SEQ ID NO: 41) einer stellengerichteten Mutagenese unter Verwendung des mutagenen Oligonukleotids unterzogen:
(SEQ ID NO: 42)
um eine NdeI-Stelle (unterstrichen) anstelle des CKIα3Hu-Anfangsmethionins und des zweiten Codons zu erzeugen, und die resultierende DNA wurde mit NdeI verdaut und in Plasmid pAS an einer NdeI-Stelle ligiert, die sich unmittelbar stromabwärts von GAL4-Sequenzen befand.
CKIδHu-DNA (SEQ ID NO: 43) wurde in pAS durch Amplifizieren der CKIδ cDNA mit mutagenen Oligonukleotid-Primern eingeführt, die BamHI-Stellen enthielten. Die Oligonukleotide, mit den BamHI-Stellen unterstrichen, die verwendet wurden, waren:
(SEQ ID NO: 44),
das das Anfangsmethionin und das zweite Codon ersetzte, und
(SEQ ID NO: 45).
Reaktionen schlossen 200 mM Tris HCl (pH 8,2), 100 mM KCl, 60 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 15 mM MgCl&sub2;, 1% Triton X-100, 0,5 uM Primer, 100 ng Matrize, 200 uM dNTP und 2,5 Einheiten Polymerase ein. Die Reaktionen wurden für 30 Zyklen durchgeführt. Die Reaktionen wurden bei 94ºC für 4 Minuten gestartet, und alle darauffolgenden Zyklen waren 1 Minute bei 94ºC zum Denaturieren, 2 Minuten bei 50ºC zum Annealen und 34 Minuten bei 72ºC zur Extension. Das amplifizierte Produkt wurde mit BamHI verdaut und in BamHI-verdautes pAS unmittelbar stromabwärts von GAL4-Sequenzen ligiert, um Plasmid pAS:CKIδ zu erzeugen.
Die resultierenden Köder-Plasmide wurden in Hefe transformiert durch Lithiumacetat- vermittelte Transformation, und die Transformanten wurden mit TIH-codierenden Hefestämmen, wie in Beispiel 2 beschrieben, gepaart. β-Galactosidase-Aktivität der CKIα3HU- oder CKIδHu-enthaltenden/TIH-enthaltenden Stämme wurde durch Replika-Plattieren von Zellen auf Hybond-N0,45u-Filter (Amersham, Arlington Heights, 1L) nachgewiesen, indem man die Zellen auf den Filtern bei 30ºC für 18 Stunden wachsen ließ, die Kolonien durch Einfrieren der Filter in flüssigem Stickstoff lysierte, und die Filter auf Whatman-Filterpapier inkubierte, das in Z-Puffer, der 0,002% X-gal enthielt, eingeweicht worden war. Die Reaktionen wurden durch Einweichen der Filter in 1 M Na&sub2;CO&sub3; beendet, und die Protein/Protein- Wechselwirkung wurde durch Untersuchen auf eine chromogene Umwandlung von X-gal zu Blau durch β-Galactosidase-Aktivität bewertet. Die Resultate des Assays, bestimmt durch visuelles Screenen auf Entwicklung einer blauen Farbe, sind unten in Tabelle 3 präsentiert. Tabelle 3 β-Galactosidase-Aktivität, die aus der menschlichen CKI/TIH-Wechselwirkung resultiert
Diese Resultate zeigen an, daß eine Wechselwirkung zwischen den TIH-Proteinen der Erfindung und den CKI-Isoformen nicht auf Hefe-Isoformen beschränkt ist. CKIδHu wechselwirkte mit TIH2. Damit kann erwartet werden, daß CKI/TIH-Wechselwirkungen zwischen menschlichen CKIs und ihren verwandten TIH-Proteinen stattfinden.

Beispiel 5

Genomische Klone voller Länge, die für die Hefe-TIH1-, -TIH2- und -TIH3-Proteine codieren, wurden aus einer genomischen Hefe-Bibliothek isoliert. Um die genomischen Klone zu identifizieren, wurden radioaktiv markierte PCR-Fragmente von den pGAD-Plasmiden hergestellt, die TIH1-, TIH2- und TIH3-Fusionsgene, beschrieben in Beispiel 1, enthielten. Die Sequenz des unidirektionalen Oligonukleotids, das verwendet wurde, um die Klone zu amplifizieren, war:
(SEQ ID NO: 46).
PCT-Reaktionen schlossen 200 mM Tris HCl (pH 8,2), 100 mM KCl, 60mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, lSmM MgCl&sub2;, 1% Triton X-100, 0,5 uM Primer, 100 ng Matrize, 200 uM dNTP und 2,5 Einheiten Polymerase ein. Die Reaktionen wurden für 30 Zyklen durchgeführt. Die ersten fünf Zyklen enthielten 50 uCl von jeweils ³²P-dCTP und ³²P-TTP. Am Anfang des sechsten Zyklus wurden nicht-radioaktiv markierte dCTP und dTTP auf eine 200 uM Endkonzentration zugegeben. Die Reaktionen wurden bei 94ºC für 4 Minuten gestartet, und alle darauffolgenden Zyklen wurden für 1 Minute bei 94ºC zur Denaturierung, 2 Minuten bei 50ºC zum Annealen und 4 Minuten bei 72ºC zur Extension durchgeführt. Die resultierenden PCR- Produkte wurden dann als Sonden beim Kolonie-Hybridisierungs-Screening verwendet.
Der genomische TIH1-Klon voller Länge wurde aus einer YCp50-Plasmid-Bibliothek (ATCC 37415) isoliert. Die genomischen TIH2- und TIH3-Klöne voller Länge wurden aus einer genomischen λ-Bibliothek [Riles, et al., Genetics 134: 81-150 (1993)] isoliert. Eine Hybridisierung zum Screenen einer YCp50-Bibliothek wurde bei 65ºC für 18 Stunden in 6X SSPE (20X SSPE ist 175,3 g/l NaCl, 27,6 g/l NaH&sub2;PO&sub4;H2), 7,4 g.l EDTA, pH 7,4, 100 ug/ml Lachs- Samen-Träger-DNA, 5X Denhardts Reagens (SOX Denhardts ist 5% Ficoll, 5% Polyvinylpyrrolidon, 5% bovines Serumalbumin), 0,1% SDS und 5% Natriumdextransulfat durchgeführt. Die Filter wurden viermal in 0,1X SSPE, 1% SDS gewaschen. Jede Waschung war bei 65ºC für 30 Minuten. Die Hybridisierungsbedingungen für das Screenen einer λ-Bibliothek waren 18 Stunden bei 64ºC in 1X HPB (0,5 M NaCl, 100 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 5 mM Na&sub2;EDTA), 1 % Natriumsarkosyl, 100 ug/ml Kalbsthymus-DNA. Die Filter wurden zweimal für 15 Sekunden gewaschen, einmal für 15 Minuten und einmal für 15 Sekunden, alles bei Zimmertemperatur in 1 mM Tris-HCl (pH 8,0). Die Sequenzen der genomischen TIH1-, TIH2- und TIH3- Klone wurden mittels automatisiertem DNA-Sequenzieren mit einem ABI 373A-Segenzierer (Applied Biosystems) bestimmt. Nukleotidsequenzen, die für die genomischen TIH1-, TIH2- und TIH3-Klone voller Länge bestimmt worden sind, sind in SEQ ID NO: 2, 4 bzw. 6 dargelegt; die abgeleiteten Aminosäuresequenzen für TIH1, TIH2 und TIH3 sind in SEQ ID NO: 3, 5 bzw. 7 dargelegt. Datenbanksuchen bestätigten die Resultate aus Beispiel 1, daß die TIH1 - und TIH3-Gene neue Proteine codierten, die keine signifikante Homologie zu irgendeinem Protein in der GenBank-Datenbank zeigten.

Beispiel 6

Um die Aktivität der TIH-Proteine zu charakterisieren und um zu bestimmen, ob die TIH- Proteine an einem HRR25-Signalgebungs-Weg teilnehmen, wurde eine chromosomale TIH1- Deletionsmutante durch homologe Rekombination konstruiert.
Spezifisch wurde die TIH1-Mutation durch Subklonieren eines 1,7 kb SalI-BamHI-Fragment, das das genomische TIH1-Gen umfaßt, in Plasmid pBluescript II SK (Statagene, La Jolla, CA) konstruiert. Der resultierende Subklon wurde mit EcoRV und PstI verdaut, um 0,5 kb des TIH1-Gens (Nukleotide 1202 bis 1635 von SEQ ID NO: 2) zu deletieren, und in diese Region wurde ein 2,2 kb SmaI-PstI-Fragment ligiert, das das S. cerevisiae LEU2-Gen enthielt. Isolierte DNA aus dem resultierenden Plasmid-Konstrukt wurde mit BamHI verdaut, um das Plasmid zu linearisieren, und 10 ug dieser Probe wurden verwendet, um einen diploiden Hefestamm, der heterozygot für HRR25 ist (M4T α /MAT α ade2/ade2 can1/can1 his 3- 11,15/his3-11,15 leu2-3,112/leu2-3, 112trp1-1/trp1-1 ura3-1/ura3-I HRR25/hrr25:: URA3), zu Leu&spplus; zu transformieren. Die Transformation wurde unter Verwendung von Lithiumacetatvermittelten Prozeduren durchgeführt, und Transformanten wurden auf SD-Leucine-Medium (Bio 101) selektioniert. Die Hefe-Transformation mit linearisierter DNA resultiert in einer homologen Rekombination und Gen-Ersatz [Rothstein, Meth. Enzymol. 194: 281-301 (1991)]. Stabile Leu&spplus;&supmin;Kolonien wurden replikaplattiert auf Sporulierungs-Medium (Bio101) und bei 30ºC für fünf Tage wachsen gelassen. Sporen wurden mikro-analysiert auf YEPD-Medium (Bio101) unter Verwendung eines Tetraden-Analyse-Apparats [Sherman and Hicks, Meth. Enzymol. 194: 21-37 (1991)], und isolierte einzelne Sporen ließ man keimen und über drei Tage zu Kolonien wachsen.
Vier Kolonie-Typen wurden aufgrund zufälliger meiotischer Segregation der heterozygoten TIH1- und HRR25-Mutationen, die in dem Stamm vorlagen, nachgewiesen. Die hrr25- Deletionsmutation in dem Elternstamm beruhte auf einem Ersatz des HRR25-Gens durch das Hefe-URA3-Gen, und die TIH1-Mutation beruht auf dem Ersatz mit LEU2. URA3 und LEU2 verleihen Uracil bzw. Leucinprototropie. Die Kolonietypen werden durch Segregation der Mutationen in die folgenden genotypischen Konfiguration repräsentiert: (i) Wildtypzellen sind HRR25 TIH1; (ii) HRR25-Mutanten sind hrr25::URA3 TIH1; (iii) TIH1-Mutanten sind HRR25 tih1::LEU2; und (iv) HRR2I5 TIH1-Doppelmutanten sind hrr25::URA3 tih1::LEU2. Standard-physiologische Analysen der mutanten Hefe-Defekte wurden durchgeführt [Hoekstra et al., oben].
TIH1-Deletionsmutanten wiesen Phänotypen auf, die identisch zu Mutationen in HRR25 waren, einschließlich langsamer Wachstumsrate, DNA-Reparaturdefekten und abweichender zellulärer Morphologie, was anzeigt, daß die TIH-Proteine an demselben Weg wie HRR25 oder an Wegen, die ähnliche Effekte haben, teilnehmen. Darüber hinaus waren tih1 hrr25 Doppelmutanten nicht lebensfähig.

Beispiel 7

Um die DihybridtScreen-Analyse der Wechselwirkung zwischen CKI-Proteinkinasen und TIH-Proteinen zu bestätigen, wurde ein biochemisches Verfahren entwickelt, um die Wechselwirkung nachzuweisen. Dieses Verfahren beruhte auf einer Affinitätsaufteinigung eines Bestandteils in der Wechselwirkung, gefolgt von Western-Blotting, um das Vorhandensein des wechselwirkenden Bestandteils in der affinitätsaüfgereinigten Mischung nachzuweisen. Das TIH2-Gen wurde verwendet, um ein TIH2/Glutathion-S-Transferase (GST)- Fusionsprotein zu konstruieren, das affinitätsaufgereinigt werden konnte mit Glutathion- Agarose (Pharmacia, Uppsala, Schweden). Andere nützliche Ligand/Gegenrezeptor- Kombinationen schließen z. B. Influenza-Virus-Hämagglutinin [Field et al., Mol. Cell Biol. 8(5): 2159-2165 (1988)]/Hämagglutinin-spezifischer Antikörper (Berkeley Antibody Company, Richmond, CA), Polyhistidin/Nickel-Affinitäts-Chromatographie (Novagen, Madison, WI) und Maltose-bindendes Protein/Amylose-Chromatographie (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) ein.
Um das GST::TIH2-Fusionsprotein zu konstruieren, wurden die 5'- und 3'-Termini des TIH2- Gens mittels Mutagenese-Prozeduren auf DNA-Amplifizierungsbasis modifiziert. Die amplifizierenden Oligonukleotide führten XbaI- und HindIII-Stellen zur Erleichterung beim Subklonieren ein. Die Oligonukleotide, mit unterstrichenen Restriktionsstellen, die zur Amplifizierung verwendet wurden, waren:
(SEQ ID NO: 47) und
(SEQ ID NO: 48).
Reaktionen schlossen 200mM Tris-HCl (pH 8,2), 100 mM KCl, 60 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 15 mM MgCl&sub2;, 1% TritonX-100, 0,5 uM Primer, 100 ng Matrize, 200 uM dNTP und 2,5 Einheiten Polymerase ein. Die Reaktionen wurden für 30 Zyklen durchgeführt. Die Reaktionen wurden bei 94ºC für 4 Minuten gestartet, und alle darauffolgenden Zyklen waren 1 Minute bei 94ºC zur Denaturierung, 2 Minuten bei 50ºC zum Annealen und 4 Minuten bei 72ºC zur Extension.
Das resultierende amplifizierte Produkt wurde mit XbaI und HindIII verdaut, und das Fragment wurde in das GST-enthaltende Plasmid pGEXKG subkloniert, das ein Galactose- induzierbares GST-Gen enthielt, um pGEXKG::TIH2 zu erzeugen. Dieses Plasmid enthält, zusätzlich zu den unmittelbar stromaufwärts zu den TIH2-Sequenzen fusionierten GST- Sequenzen, URA3- und LEU2-selektionierbare Marker für die Hefetransformation. Das Plasmid pGEXKG::TIH2 wurde dann mit einer Lithiumacetat-vermittelten Transformation in Hefestamm W303 [Wallis, et al., Cell 58: 49-419 (1989)] transformiert, und Ura&spplus;- Transformanten wurden auf SD-URA-Medium (Bio101) selektioniert. Um das GST::TIH2- Fusionsprotein zu isolieren, wurde 100 ml SD-URA-Medium mit der transformierten Hefe beimpft und auf eine Dichte von 1 · 10&sup7; Zellen/ml in der Anwesenheit von Galactose wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation pellettiert, in Lyse-Puffer gewaschen [IOmM Natriumphosphat pH 7,2, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1% Trasylol (Miles), 1 mM Dithiothreitol, 1 mM Benzamidin, 1 mM Phenylmethylsulphonylfluorid, 5 mM EDTA, 1 ug/ml Pepstatin, 2 ug/ml Pepstatin A, 1 ug/ml Leupeptin, 100 mM Natriumvanadat und 50 mM NaF], resuspendiert in 1 ml Lyse-Puffer und durch Vortexen für 5 Minuten mit 10 g Glasperlen lysiert. Das Roh-Lysat wurde durch Zentrifugation bei 100.000 · g für 30 Minuten geklärt. Fünfzig ul 50% Glutathion-Agarose(Pharmacia)-Schlamm wurden dem Extrakt zugegeben und die Mischung für 1 Stunde inkubiert. Die Agarose wurde durch einen 10-sekündigen Lauf in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge pellettiert, der Überstand entfernt und das Agarose-enthaltende Pellet mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Das Pellet wurde in 50 ul 2X Protein-Gel-Probenpuffer resuspendiert, für 2 Minuten gekocht, und 12,5 ul wurden durch ein 10% Polyacrylamidgel elektrophoresiert. Gel-fraktionierte Proteine wurden durch Elektroblotten auf Immobilon-P-Membranen übertragen (Millipore, Bedord, MA), und HRR25 wurde durch Sondieren der Membran mit einem Kaninchen- Antikörper [De Maggio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 7008-7012 (1992)], der gegen HRR25 gezogen worden war, nachgewiesen. Der Western-Blot wurde auf Immunreaktivität unter Verwendung eines mit alkalischer Phosphatase-konjugierten sekundären Antikörpers und colorimetrischer Entwicklung (BioRad) entwickelt.
Ein Photo des Gels ist in Fig. 1 dargestellt, bei dem das näherungsweise 58 kD HRR25- Protein in Assoziation mit TIH2-Protein nachgewiesen wurde.

Beispiel 8

Um die Neuheit des identifizierten TIH1-Proteins zu bestätigen, wurde eine Datenbanksuche der Proteinsequenzen durchgeführt, über die zuvor berichtet worden war. Wie in Fig. 2 gezeigt, bei der Teile der Aminosäuresequenz von TIH1 (Aminosäuren 128 bis 161 in SEQ ID NO: 3), menschlichem Hum80DP (Aminosäuren 31 bis 63) [Sakumi, et all, J Biol. Chem. 268: 23524-23530 (1993)], E. coli MutT (Aminosäuren 32 bis 64) [Akiyama, et al., Mol. Gen. Genet. 206: 9-16 (1989)], viralem C11 (Aminosäuren 122 bis 154) [Strayer, et äl., Virol. 185: 585-595 (1991)] und viralem VD10 (Aminosäuren 122 bis 154) [Strayer et al., (1991, oben)] jeweils dargestellt sind, zeigte ein Sequenzvergleich, daß TIH1 ein charakteristisches Sequenzmotiv enthält, das mit Enzymen assoziiert ist, die aktiv bei der Entfernung oxidativ geschädigter Nukleotide aus dem Kern teilnehmen, wodurch die Genauigkeit der DNA- Replikation erhöht wird. Enzyme mit dieser Aktivität sind in einem weiten Bereich von Organismen identifiziert worden, einschließlich Prokaryoten, Eukaryoten und Viren [Koonin, Nucl. Acids Res. 21: 4847 (1993)].
Es ist gezeigt worden, daß HRR25-Enzymaktivität bei der Reparatur von DNA teilnimmt, die durch Strahlung geschädigt ist, jedoch ist die Rolle von HRR25 bei dem Reparatur-Prozeß nicht bestimmt worden. Die Tatsache, daß TIH1 eine Aminosäuresequenz hat, die ähnlich derjenigen von Enzymen ist, die in der Lage sind, geschädigte abzubauen, zeigt an, daß TIH1 wahrscheinlich mit HRR25 bei dem DNA-Reparaturprozeß wechselwirkt. Inhibitorverbindungen, die in der Lage sind, die Wechselwirkung zwischen HRR25 und TIH1 zu stören oder zu unterbinden, wären somit besonders nützlich bei einer gezielten Krebs- und antiviralen Therapie. Das Abliefern eines Inhibitors an kanzeröse oder Virus-infizierte Zellen würde die Rate der replikativen Mutation in den Zellen erhöhen, wodurch die Wahrscheinlichkeit eines induzierten Zell-Selbstmords erhöht würde. Zusätzlich würde das gezielte Abliefern eines Inhibitors erhöhte Empfindlichkeit der kanzerösen oder Virus-infizierten Zellen gegenüber einer Behandlung mit herkömmlicher Chemotherapie und/Strahlungstherapie selektiv verleihen, wodurch der Chemotherapie- und/oder Radiotherapie-therapeutische Index erhöht wird.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER: DeMaggio, Anthony J. Hoekstra, Merl F.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Materialien und Methoden die sich auf mit Casein Kinase I wechselwirkende Proteine beziehen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 53
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) EMPFÄNGER: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray & Borun
(B) STRASSE: 6300 Sears Tower, 233 South Wacker Drive
(C) ORT: Chicago
(D) STAAT: Illinois
(E) LAND: Vereinigte Staaten von Amerika
(F) POSTLEITZAHL: 60606-6402
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Version 1.25
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG:
(C) KLASSIFIKATION:
(vii) DATEN DER VORANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: US 081184,605
(B) ANMELDETAG: 21.01.1994
(viii) INFORMATION ZUM ANWALT:
(A) NAME: Noland, Greta E.
(B) REGISTRIERNUMMER: 35,302
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 27866/32437
(ix) INFORMATION ZUR TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: 312/474-6300
(B) TELEFAX: 312/474-0448
(C) TELEX: 25-3856

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2625 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 796..2580
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 595 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LÄNGE: 6854 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 2050..4053
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 668 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2814 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..696
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 232 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1485 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 34 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 543 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 35 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 34 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 32 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 32 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 3628 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2468 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 34 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare,
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 5093 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 45 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare,
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG ID NO: 27:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2870 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 3883 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 53 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 36:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 37:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ 115 NO: 37:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 38:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 3466 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 38:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 39:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 42 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 39:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 40:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 45 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 41:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 2385 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang.
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 41:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 42:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 34 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 42:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 43:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 3505 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 43:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 44:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 44:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 45:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 45:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 46:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 46:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 47:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 47:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 48:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 31 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 48:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 49:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 33 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 49:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 50:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 33 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 50:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 51:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 33 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 51:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 52:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 33 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 52:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 53:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 33 Aminosäuren
(B) ÄRT: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 53:

Claims

1. Ein aufgereinigtes und isoliertes Polynukleotid, das für die in SEQ ID NO: 3 dargestellte TIH1-Aminosäuresequenz codiert.

2. Polynukleotid nach Anspruch 1, das eine DNA ist.

3. DNA nach Anspruch 2, die eine cDNA ist.

4. DNA nach Anspruch 2, die eine genomische DNA ist.

5. DNA nach Anspruch 2, die eine chemisch synthetisierte DNA ist.

6. Ein aufgereinigtes und isoliertes, für TIH1 codierendes Polynukleotid voller Länge, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die umfaßt:

a) die in SEQ ID NO: 2 dargestellte DNA, und

b) eine DNA, die unter stringenten Bedingungen an den Protein-codierenden Teil der DNA von a) hybridisiert.

7. Ein aufgereinigtes und isoliertes TIH1-Polynukleotid, das die in SEQ ID NO: 2 dargestellte TIH1-DNA-Sequenz umfaßt.

8. Ein DNA-Expressionskonstrukt, das eine DNA nach Anspruch 2, 6 oder 7 umfaßt.

9. Eine Wirtszelle, die mit einer DNA nach Anspruch 2, 6 oder 7 transformiert ist.

10. Ein Verfahren zum Produzieren eines TIH1-Polypeptids, das umfaßt: Wachsenlassen einer Wirtszelle nach Anspruch 9 in einem geeigneten Medium und Isolieren von TIH1-Polypeptid aus besagter Wirtszelle oder dem Medium ihres Wachstums.

11. Aufgereinigtes und isoliertes TIH1-Polypeptid, das im wesentlichen die in SEQ ID NO: 3 dargestellte TIH1-Aminosäuresequenz umfaßt.

12. Ein Antikörper, der in der Lage ist, spezifisch an TIH1 zu binden.

13. Antikörper nach Anspruch 12, der ein monoklonaler Antikörper ist.

14. Eine Hybridom-Zellinie, die einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 13 produziert.

15. Ein aufgereinigtes und isoliertes Polynukleotid, das für die in SEQ ID NO: 7 dargestellte TIH3-Aminosäuresequenz codiert.

16. Polynukleotid nach Anspruch 15, das eine DNA ist.

17. DNA nach Anspruch 16, die eine cDNA ist.

18. DNA nach Anspruch 16, die eine genomische DNA ist.

19. DNA nach Anspruch 16, die eine ganz oder partiell chemisch synthetisierte DNA ist.

20. Ein aufgereinigtes und isoliertes, für TIH3 codierendes Polynukleotid voller Länge, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die umfaßt:

a) die in SEQ ID NO: 6 dargestellte DNA, und

21. Ein aufgereinigtes und isoliertes TIH3-Polynukleotid, das im wesentlichen die in SEQ ID NO: 6 dargestellte, für TIH3-Protein codierende Sequenz umfaßt.

22. Ein DNA-Expressionskonstrukt, das eine DNA nach Anspruch 16 umfaßt.

23. Eine Wirtszelle, die mit einer DNA nach Anspruch 16 transformiert ist.

24. Ein Verfahren zum Produzieren eines TIH3-Polypeptids, das umfaßt: Wachsenlassen einer Wirtszelle nach Anspruch 23 in einem geeigneten Medium und Isolieren von TIH3-Polypeptid aus besagter Wirtszelle oder dem Medium ihres Wachstums.

25. Aufgereinigtes und isoliertes TIH3-Polypeptid, das im wesentlichen die in SEQ ID NO: 7 dargestellte TIH3-Aminosäuresequenz umfaßt.

26. Ein Antikörper, der in der Lage ist, spezifisch an TIH3 zu binden.

27. Antikörper nach Anspruch 26, der ein monoklonaler Antikörper ist.

28. Eine Hybridom-Zellinie, die den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 27 produziert.