DE69505610T2

DE69505610T2 - Fraktionierung des Albumins bei niedriger Temperatur unter Verwendung von Sodiumcaprylat als Trennwirkstoff

Info

Publication number: DE69505610T2
Application number: DE69505610T
Authority: DE
Inventors: Robert A. Goldsboro North Carolina 27530 Tenold
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Priority date: 1994-08-10
Filing date: 1995-08-01
Publication date: 1999-03-25
Anticipated expiration: 2015-08-02
Also published as: DK0696595T3; CA2155630A1; ATE172744T1; ES2123874T3; CN1120439A; KR960006939A; CA2155630C; JPH08176010A; US5561115A; KR100418821B1; AU684202B2; EP0696595A1; EP0696595B1; AU2839095A; CN1150004C; DE69505610D1; JP3874029B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ganz allgemein die Herstellung Plasma-stämmiger therapeutischer Protein-Lösungen und insbesondere die Herstellung von selektiv stabilisiertem Tier- oder Humanserumalbumin (HSA), alpha-1-Protease-Inhibitor (Alpha-1 PI) und von Antithrombin III (AT-III) aus Serum oder Plasma.
Das Cohn-Fraktionierungsverfahren, bei dem Ethanol, Temperatur, pH, Protein-Konzentration, Ionenstärke und Zeit genutzt und angewandt werden, um unerwünschte Proteine bei der Albumin-Herstellung unlöslich zu machen, wurde ursprünglich 1946 veröffentlicht, und es bleibt ein erstrangiges Verfahren in den Vereinigten Staaten zur Verarbeitung von Plasma (Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68, 459 (1946)). Die von T. Gerelough anschließend durchgeführte Anwendung von 95% Ethanol im bzw. beim Cohn-Franktionierungsverfahren verringerte die erforderlichen Verfahrensvolumina stark, wodurch die entsprechenden Herstellkosten gesenkt werden konnten. Das Verfahren von Gerelough stellt ebenfalls ein anerkanntes Standardverfahren in den Vereinigten Staten zur Plasma-Fraktionierung dar (US 2 710 294; 2 710 293 (1955)). In Europa wurde von H. Nitschamann und P. Kistler ein kürzeres Verfahren zur Bearbeitung von Albumin beschrieben; allerdings gelang es mit dem entstandenen Produkt nicht, die von den Agenturen der Vereinigten Staaten in der damaligen Zeit aufgestellten Regelvorschriften zu erfüllen (Vox Sang., 5, 272 (1960)).
Bei in den Vereinigten Staaten durchgeführten Plasma- Fraktionierungsverfahren sind seit der Veröffentlichung von Cohn et al. in 1946 Cohn-Verfahren angewandt worden. Demzufolge ermutigten weder die Interessenslage noch eine entsprechende Notwendigkeit die Hersteller, alternative Albumin-Fraktionierungsverfahren über einen Zeitraum von mehr als 20 Jahren aufzufinden, auszuarbeiten und zu identifizieren (M. Steinbuch, Vox Sang., 23, 92 (1972)). Da ferner mit herkömmlichen Fraktionierungsverfahren Albumin erzeugt wurde, das erfolgreich pasteurisiert (durch Erhitzen 10 h lang bei 60ºC) werden konnte, um Viren zu inaktivieren, bestanden nur eine geringe Motivation und viel Vorsicht unter den Albumin-Herstellern bezüglich der Suche nach alternativen und verbesserten Fraktionierungsverfahren.
Danach untersuchte in 1972 M. Steinbuch die Befähigung verschiedener sich von Ethanol unterscheidender Reagentien zur Auftrennung von Plasma- Proteinen über Ausfällungen. Unter Verwendung der Cohn-Fraktion III als Ausgangsmaterial untersuchte Steinbuch das Fällungsvermögen von Caprylsäu re, welche früher dazu verwendet worden war, Albumin zu stabilisieren (M. Steinbuch, Vox Sang. 23 : 92-106, 1972, Yu L. Hao, US 4 222 934, 1980) und anschließend Lipid-umhüllte Viren zu inaktivieren (Seng et al., US 4 939 176, 1990). Als Ergebnis dieser Untersuchungen entwickelten Wissenschaftler später verschiedene Verfahren zur Reinigung von IgG, IgA, alpha-1 saurem Glycoprotein und von Prealbumin, wobei herausgefunden wurde, daß die Fällungsreaktion in hohem Maße Temperatur- und pH-abhängig war.
Bei der Humanimmunoglobulin-Herstellung wird Caprylsäure ganz allgemein als ein wirksames Fällungsagens für die meisten Plasma-Proteine bei pH 4,8 erachtet, solange Parameter wie Temperatur und Ionenstärke optimiert sind (Steinbuch et al., Preparative Biochemistry 3(4), 363-373 (1973)). Demgemäß haben Steinbuch et al. ein Verfahren zur Isolierung von IgG aus Säugetierseren unter Verwendung von Caprylsäure beschrieben, wobei herausgefunden wurde, daß eine umfängliche Nicht-Immunoglobulin-Fällung am besten bei geringfügig sauren pH-Werten, aber nicht unterhalb pH 4,5 erhalten wird (Steinbuch et al., Arch. Biochem. Biophys. 134, 279-294 (1969)).
Habeeb et al. wandten die Caprylsäure-Fällung an, um Plasma-stämmiges IgG zu erhalten, das frei von Aggregaten, Plasmin und von Plasminogen, nur gering wirksam bei der Gegenkomplimentaktivität und lagerstabil war (Preparative Biochemistry 14 (1), 1-17 (1984)). Auch ist IgA als ein routinemäßiges Nebenprodukt bei der Fraktionierung aus Cohn-Fraktion III hergestellt worden, und zwar auf der Grundlage der IgA-Löslichkeit mit Caprylsäure, die bei pH 4,8 vorliegt (Prejaudier et al., Vox Sang. 23, 165-175 (1972)). Fraktion III stellt ausserdem ein Ausgangsmaterial zum Erhalt von IgM-angereicherten Plasma-Fraktionen dar.
Natriumcaprylat ist auch zur Reinigung von Albumin verwendet worden. Gemäß diesen Verfahren wird Natriumcaprylat zur verfahrenstechnischen Behandlung von Plasma zugefügt und schützt Albumin, wenn der Verfahrensstrom hohen Temperaturen ausgesetzt ist. Extreme Temperaturen denaturieren nicht nur Verfahrensstrom-Globuline, sondern erzeugen oft kontaminante Neo- Antigene (Schneider et al., US 4 156 681 (1979); Institute Merieux, US 3 992 367).
Cohn-Fraktion III wurde auch mit Caprylsäure behandelt, um Ceruloplasmin, ein alpha-Globulin, das den Plasma-Kupfer-Transport erleichtert, auszufällen. Bei dieser zum Erhalt von Ceruloplasmin angewandten Verfahrensweise wurden Denaturierungsstufen unter Einschluß von Ethanol oder Aceton vermieden, das Produkt ist auf diese Weise jedoch nur aus Pferde-, Maul tier-, Kaninchen-, Ziegen-, Schaf- und Baboon-Plasma erhalten worden (M. Steinbuch, Vox Sang. 23, 92-106 (1972)).
Gegenwärtig weisen die technische Literatur und die einschlägige Patentliteratur zahlreiche Albuminherstellverfahren, die Natriumcaprylat als Stabilisierungsmittel betreffen, und Reinigungsverfahren unter Einschluß einer Caprylsäure-Fällung auf, um Immunoglobuline aus Plasma-stämmiger Cohn-Fraktion III zu erhalten. Allerdings sind keine Literaturstellen bekannt, betreffend die Anwendung von Natriumcaprylat als Trennungsmittel bei der Albuminherstellung, um Albumin von unerwünschten Globulinen und von Herstellrückständen abzutrennen.
In überraschender Weise sind auch signifikante Vorteile bei der Albuminherstellung mit Natriumcaprylat zur Abtrennung des Albumins von unerwünschtem Material, anstatt der Anwendung eines Ethanol-Fällungsmittels, aufgefunden worden. Erste verkürzt die Auftrennung mit Natriumcaprylat die herkömmlichen Albuminherstellverfahren, was die Handhabung des Produkts vereinfacht und entsprechend die Albuminausbeute um 25% oder mehr verbessert. Entsprechende Albuminausbeuten sind im wesentlichen frei von Aluminium und weisen Monomergehaltsmengen von 97% oder mehr auf. Zweitens verringert die Trennung mit Natriumcaprylat deutlich die Zeit, die benötigt wird, um die Albuminherstellung vollständig durchzuführen, wodurch die auf Ausrüstungsgegenstände bezogenen Herstellkosten um mindestens 65% herabgesetzt werden. Drittens verbessert die Trennung mit Natriumcaprylat die Ausbeuten von alpha-1 PI und von AT-III aus Cohn-Fraktion II + III und ist ganz allgemein energetisch wirtschaftlicher als herkömmliche Verfahren zur Herstellung von Plasma-Produkten. Schließlich, und wahrscheinlich am wichtigsten, wird durch die Trennung mit Natriumcaprylat der Ethanolverbrauch deutlich herabgesetzt und die Verwendung von Aceton bei der Albuminherstellung vollständig eliminiert, wodurch eine Verschmutzung der Umwelt mit schädlichen und umweltunverträglichen Lösungsmittelrückständen weitgehend vermieden wird. Die aufgefundenen Erkenntnisse werden nun im Detail diskutiert und beschrieben.
Durch die vorliegende Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von im wesentlichen monomerem, Aluminiumfreien Albumin unter Verwendung von Natriumcaprylat als Trennungsmittel angegeben und zur Verfügung gestellt.
Die Verwendung von Natriumcaprylat unterbricht herkömmliche Plasma- Fraktionierungen entweder bei der Cohn-Fraktion II + III- oder der -Fraktion IV-1-Effluensstufe. Gemäß der Erfindung wird Natriumcaprylat zu einem kolloidalen Effluensmaterial gegeben, das das gewünschte Albumin und die unerwünschten Nicht-Albumin-Proteine und Kontaminantien enthält.
Nach Anhebung von Temperatur und pH wird die Mischung dann ca. 6 h lang inkubiert, und man läßt Natriumcaprylat als Trennungsmittel einwirken, wobei die kolloidale Lösung in einen Überstand, enthaltend Albumin, und in eine disperse Phase, enthaltend unerwünschte Nicht-Albumin-Proteine (z. B. Globuline) und Herstellrückstände, gebrochen wird. Die mit Natriumcaprylat behandelte Suspension wird dann zentrifugiert, und es wird DEAE-Sephadex zur Unterstützung der Filtration zugefügt. Die Suspension wird sodann filtriert, auf 12% Protein ultrafiltriert, mit 0,02 M Natriumcaprylat diafiltriert, geerntet und zur Sterilfiltration zusammengefaßt. Nachdem die sterile Masse den Sterilitätstest durchlaufen hat, wird das Albumin in Endbehälter abgefüllt.

Fig. 1: Fließschema

Die Figur ist ein Fließschema, das den Unterschied der vorliegenden Erfindung zu einer herkömmlichen Albuminherstellung gemäß der Cohn- Fraktionierungsverfahrensweise aufzeigt. Im Fließschema sind nur diejenigen Cohn-Fraktionierungsstufen herausgestellt, die nötig sind, um den Unterschied des offenbarten, abgekürzten Albuminherstellverfahrens zu bzw. von in die Länge gezogenen Cohn-Fraktionierungsverfahren aufzuzeigen. Die Dauer in Stunden für die jeweiligen Verfahrensstufen für das Verfahren gemäß dem Stand der Technik sind bezogen auf 20 Sharples-Zentrifugen und in den meisten anderen Fällen auf 1000 Liter von in der jeweiligen Verfahrensstufe vorhandenem Plasma.

Definition von Begriffen:

1. Trennungsmittel, wie hierin verwendet, bedeutet eine Substanz, die, bei Zugabe zu Plasma-Protein-Mischungen bei der Albuminherstellung, ein Suspensionskolloid erzeugt, das aus zwei getrennten Phasen besteht: einem Überstand, der Albumin enthält, und einer opaleszenten dispersen Phase, die agglomerierte Proteinpartikel, einschließlich alpha- und beta- Globulinen enthält.
2. Fällungsmittel, wie hier verwendet, bedeutet eine Substanz, die, bei Zugabe zu Plasma-Protein-Mischungen bei der Albuminherstellung, dazu befähigt ist, Lösungsmaterial reversibel unlöslich zu machen, wenn der pH-Wert der Lösung innerhalb eines spezifischen Bereichs liegt.
3. Nicht-Albumin-Proteine, wie hierin verwendet, bedeuten alle Nicht-Albumin-Proteine, vorrangig alpha-, beta- und gamma-Globuline und saure Glycoproteine.
4. Herstellrückstände, wie hier verwendet, bedeuten Nicht-Protein- Kontaminantien und schließen vorrangig mehrwertige Metallionen wie Aluminium und Herstellösungsmittel wie Ethanol ein.
5. Albumin-haltige Lösung, wie hier verwendet, bedeutet entweder Cohn-Fraktion III + III-Effluens oder Cohn-Fraktion IV-1-Effluens.

Materialien und Verfahren

Materialien:

1. Das Ausgangsmaterial für die offenbarte Erfindung, d. h. Cohn- Fraktion IV-1-Effluens, wurde gemäß dem herkömmlichen Cohn-Plasma- Fraktionierungsverfahren hergestellt und stammte aus Quellenplasma, fraktioniert von Miles Inc. in Clayton, North Carolina.
2. Quellenplasma wurde aus voll gescreentem Plasma gemäß dem derzeitigen Screening-Verfahren von Miles hergestellt, was innerhalb der zugelassenen Betriebsanlagen von Miles in Clayton, North Carolina, durchgeführt wurde.
3. Nur endgültig erhitzte Proben wurden evaluiert und bewertet, um das vorliegende Verfahren unterstütztend zu verfolgen. Die auf dem einschlägigen Gebiet tätigen Durchschnittsfachleute erkennen, daß Protein- Verschiebungen bei der endgültigen Pasteurisierungsbehandlung nicht mit heutigen Testverfahren vorweggenommen werden können.
4. Testverfahren, die von den CBER und ausländischen Regierungsvorschriften gefordert werden, ergaben die Testkriterien für das endgültige Produktmaterial im Behälter.

Verfahren:

1. Reinheitsbestimmungen
A. Celluloseacetat-Elektrophorese (CAE) wurde zur Bestimmung des Vorliegens bzw. Vorhandenseins von Proteinen, die sich von Albumin unterschieden, herangezogen.
B. Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) wurde angewandt, um Vorhandensein bzw. Vorliegen von Aggregaten und weitere Protein- Molekulargewichte zu bestimmen.
C. Albumin-Filtrat-Trübung wurde gemessen in nationalen Trübungseinheiten (NTU) unter Einsatz eines Hach-Nephelometers.

Beispiel I

Das verbesserte Albuminherstellverfahren beginnt mit vier Standard- Cohn-Fraktionierungsstufen. Zuerst wird Humanplasma gesammelt, aufgetaut und zentrifugiert. Das gebildete Kryopräzipitat wird geerntet und verarbeitet, um Faktor VIII-Konzentrat herzustellen, wobei die Effluenstemperatur auf ca. -2ºC unter Zugabe von 95% Ethanol enthaltendem Essigsäure-Puffer mit pH 4,0 (Puffer A) herabgesetzt wird.
Nach Beendigung der Alkohol-Zugabe weist die entstandene Suspension, d. h. die Cohn-Fraktion I, ca. 8 Volumen% Ethanol und einen pH-Wert von 7,3 auf, bei einer Verdünnung von 1 : 5 mit Kochsalzlösung oder destilliertem Wasser, Eine Hauptmenge an Plasma-Fibrinogen wird innerhalb einer Reaktionsdauer von 2 h ausgefällt.
Fraktion I mit 8% wird zentrifugiert, um die gebildeten Feststoffe zu beseitigen. Die Effluens-Fraktion I wird dann auf Fraktion II + III mit 20% durch die langsame Zugabe von Ethanol enthaltendem Puffer A gebracht, und es wird die Temperatur des Materials auf ca. -5ºC herabgesetzt. Der endgültige pH-Wert des Plasma beträgt ca. 6,8. Nach einer Reaktionszeit von ca. 2 h wird Fraktion II + III mit 20% zentrifugiert, und es wird rohe II + III- Paste, enthaltend die gamma-Globulin-Fraktion, isoliert. Diese Paste wird später zur Herstellung von IGIV und ISG verarbeitet.
Das entstandene Cohn-Fraktion II + III-Effluens wird sodann mit kaltem Essigsäurepuffer behandelt, wobei ein pH-Wert der Suspension von ca. 5,2 erreicht wird, bei Verdünnung auf 1 : 10 mit destilliertem Wasser. Das Effluens wird für eine Reaktionsdauer von ca. 6 h inkubiert, wobei ausgefällt und denaturiert wird. Dann werden alpha-Globuline und weitere unlösliche Proteine geerntet, und es wird das entstandene Präzipitat zur Herstellung von Alpha-1 PI und von AT-III verwendet.
Gemäß herkömmlicher Fraktionierungsverfahren wird Fraktion IV-1- Effluens zu Cohn-Fraktion IV-4 weiterverarbeitet, um in erster Linie hitzeinstabile alpha- und beta-Globuline zu beseitigen, und jene wird dann nacheinander viermal mit Ethanol ausgefällt, vor entweder einer Trocknung mit Aceton, einer Lyophilisierung, Dünnfilmverdampfung oder einer Ultra- und Diafiltration.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird als nächstes Natriumcaprylat zum Cohn-Fraktion IV-1-Effluens gegeben, wobei es alpha- und beta-Globuline durch Benetzungsvorgänge unlöslich macht oder Albumin von diesen unerwünschten Proteinen abtrennt. Natriumcaprylat fungiert auch als ein antivirales Agens und ermöglicht ausserdem die mechanische Abtrennung von Albumin.
Ca. 10 g Natriumcaprylat pro Liter werden zum Fraktion IV-1-Effluens gegeben, das auf ca. 25 bis 35ºC erwärmt wird, wobei gleichzeitig der pH- Wert der Lösung auf ca. 5,4 bis 5,8 ansteigt. Die Reaktion ist in 6 h oder mehr beendet, währenddessen der pH-Wert bei ca. 5,3 bis 5,6, vorzugsweise jedoch bei 5,4, gehalten wird.
Eine Erhöhung der Temperatur der Lösung trägt dazu bei, Natriumcaprylat aufzulösen, um die Reaktion zu beenden. Eine Anhebung des pH-Wertes verbessert die Albuminausbeute, da sich pH-Werte von weniger als ca. 5,4 an den isoelektrischen Bereich des Albumins annähern, welcher unterhalb des bevorzugten pH-Bereichs liegt, was infolgedessen zu Albuminverlusten führen könnte. Allerdings kann ein pH-Wert von mehr als ca. 5,8 zur Auflösung wärmeinstabiler Globuline führen, wodurch deren Flucht bzw. Eindringen in das Endprodukt ermöglicht würden. Die Gesamtinkubationszeit nach der Natriumcaprylat-Zugabe beträgt ca. 6 h.
Die mit Natriumcaprylat behandelte Lösung wird dann auf ca. 18ºC oder weniger abgekühlt, um ein bakterielles Wachstum zu inhibieren, und es wird zentrifugiert. Danach wird ca. 1 g DEAE-Sephadex dem Effluens zur Unterstütztung der Filtration zugefügt. Das Caprylat-Effluens wird dann durch 0,2 um Tiefen- und Membranfilter geklärt, wobei das DEAE-Filtrat erzeugt wird (siehe Fig. 2). Der pH-Wert des entstandenen Filtrats wird dann auf Neutralität (pH = 6,8 bis 7,2) mit Natriumcarbonat angehoben.
Gemäß herkömmlicher Verfahren verbessert sich, bei Anhebung des pH- Wertes des sauren Filtrats auf Neutralität, die Trübung der Lösung. Trübungswerte von 12 NTU und höher treten gewöhnlich bei pH 5,5 auf und erniedrigen sich auf ca. 8 NTU, wenn der pH-Wert auf über 5,5 angehoben wird. Dieses Phänomen wird dadurch hervorgerufen, daß vom isoelektrischen Punkt kontaminierender Globuline abgewichen wird.
Gemäß der hier offenbarten Erfindung liegen die Trübungswerte des DEAE-Filtrats bei ca. 3 NTU oder weniger, und bei Anhebung des pH-Wertes auf 6,8 gibt es keine wesentliche Trübungswertänderung, sogar nach 10 h oder mehr bei 60ºC.
Somit beeinflußt die auf Neutralität eingestellte Anhebung des pH- Wertes des mit Natriumcaprylat behandelten Filtrats die Trübungswerte nicht. Vielmehr behalten Filtrate aus mit Natriumcaprylat behandeltem IV-1- Effluens einen Trübungswert von 5 NTU oder weniger bei, sogar bei einem erhöhten pH-Wert, da die Filtrate im wesentlichen frei von kontaminanten Globulinen nach Inkubation mit Natriumcaprylat sind.
Das mit DEAE-Sephade geklärte Filtrat wird dann mit Ultrafiltern vom Rhomicon-Typ ultrafiltriert und gegen mindestens 7 Austauschvolumina Natriumcaprylat-Diafiltrationspuffer diafiltriert, um Metall-Kontaminantien, Ethanol und Salze zu beseitigen. Der Diafiltrationspuffer wird im Hinblick auf die endgültige Albuminkonzentration im Abfüllbehälter zubereitet. Beträgt die gewünschte endgültige Albumin-Konzentration 25%, wird dann beispeilsweise ein 0,02 M Natriumcaprylat-Diafiltrationspuffer verwendet. Soll die endgültige Albuminkonzentration 5 betragen, wird ein 0,004 M Natriumcaprylat-Diafiltrationspuffer benötigt. Die Anwendung von 30000 Molekulargewicht (MWCO)-Ultrafiltrationsmedien ergibt ausgezeichnete Fließgeschwindigkeiten und entsprechende Durchsätze.
Albumin wird dann mit herkömmlichen Verfahrenstechniken ultrafiltriert, um die gewünschte endgültige Behälter-Albuminkonzentration zu erreichen. Die Zielkonzentration muß hinreichen, um ein Abspülen der Ausrüstung mit Diafiltrationspuffer zu ermöglichen, um danach 25, 20, 7 oder 5% Albumin Endkonzentrationen zu ergeben. Schließlich wird das Konzentrat sterilfiltriert, zum Freigabetest zusammengefaßt und in Endbehälter abgefüllt.
Unter den vielen Bedingungen, die die vorliegende Erfindung beeinflussen, sind Temperatur, pH, Natriumncaprylat-Konzentration und Reaktionszeit. Es wurde ein Versuch an Cohn-Faktion-Effluens IV-1 durchgeführt, wobei 1 Parameter zu einem Zeitpunkt variiert wurde, um die Idealtemperatur der Caprylat-Reaktion herauszufinden und festzulegen. Temperaturen im Bereich von 20ºC wurden ausprobiert, und es erwies sich, daß ein trübes Produkt im Endbehälter erzeugt wurde. Auch wurde eine Reaktionszeit von 6 h willkürlich ermittelt, da die Verarbeitung großer Albumin-Volumina verschiedene Zeiträume erfordert, die benötigt werden, um die Reaktionen zu beenden.
Die Erfindung war von den vorgenannten Tests und den Auswirkungen von Hitze auf Albumin abhängig.

Beispiel II

Bank-Anteilsmengen waren aus 100 bis 200 l Cohn-Fraktion IV-1-Effluens zusammengesetzt. Einige Bank-Anteilsmengen wurden verarbeitet, um wünschbare Parameter zu ermitteln und festzulegen. Der endgültige Akzeptanztest wurde auf Trübungswerte bezogen, nachdem das Albumin 10 h lang bei 60ºC erhitzt wurde.
Eine hochgefahrene Anteilsmenge von Albumin wurde aus Cohn-Fraktion IV-1 verarbeitet. In dieser Anteilsmenge wurden 1100 l Effluens-Cohn- Fraktion IV-1 auf 25% Albumin-Endkonzentration in den Behältern unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens verarbeitet.
Ergebnisse
Das hier beschriebene Verfahren ergab die folgenden Daten beim Hochfahren:
Protein-Konzentration: 24,03% Protein
CAE: 100% Albumin
pH: 6,78
Wärmestabilitätsduplikat:
(50 h @ 57): Durchlauf
Aluminium: 7,53 ppb
PKA: 1% der Bezugsgröße
Zitrat: weniger als 5 ppm
Trübung: 2,6 NTU
Natrium: 152 Meq/l
HPLC:
Monomer: 97,58%
Dimer 2,42%
Viskosität: 7,98 CPS
Dichte: 1,0699
Pyrogen (3 Kaninchen): 0,2 Gesamt von Allen
Caprylat: 0,086 M, selektiv gebunden *
* Eine Zwei-Volumina-CWFI-Diafiltration verringert diese Gehaltsmenge auf ca. 0,07 molar.
Es ist belegt worden, daß Humanserumalbumin, ein breit angewandtes therapeutisches Reagens, schneller, wirksamer und billiger herstellbar ist, und zwar durch Verwendung von Natriumcaprylat zur Abtrennung von Albumin von unerwünschten Proteinen und Herstellrückständen. Ausserdem wird durch die hier beschriebene Natriumcaprylat-Albumin-Fraktionierung die Verwendung von Lösungsmitteln wie von Aceton vermieden, wodurch die Umwelt nicht mit chemischen Lösungsmitteln belastet wird; mit dem Verfahren werden auch die Herstell- und Ausrüstungskosten verringert, die Produktionszeit für das Albumin im Endbehälter herabgesetzt und die Ausbeute von Albumin und weiterer Plasma-stämmiger Produkte wie von Alpha-1 PI und von AT-III erhöht.
Ferner ist herausgefunden worden, daß Albumin, durch molekulare Anziehung, die Menge von in Albumin-Endlösungen zurückgehaltenem Natriumcaprylat natürlich selektiert und bindet. Nach der Natriumcaprylat-Zugabe bleibt der Trübungswert der Albumin-Lösungen unterhalb 5 NTU, sogar nach anschließender Filtration, Ultrafiltration, Diafiltration und Pasteurisierung bei 60º über 10 h. Demzufolge steigert Natriumcaprylat die Produktstabilität wäh rend des Herstellverfahrens, wie belegt durch die niedrigen Trübungswerte nach der Zugabe von Natriumcaprylat, und es schützt Albumin vor einem thermischen Abbau während der Endbehandlung durch Hochhitzepasteurisierung, was ein Ansteigen der Trübung bei Langzeitlagerung verhindert.
Bei herkömmlichem Albuminherstellverfahren wird gewöhnlich Acetyl-dl- tryptophan, ein berüchtigtes Carcinogen, oder Natriumchlorid zur Sterilisierung von Albumin angewandt. Allerdings sind weder das Tryptophan noch Natriumchlorid dazu befähigt, sowohl die kurzzeitige als auch die langzeitige Albumin-Stabilität zu steigern bzw. zu verbessern. Albumin wird nicht an Tryptophan gebunden, nichts desto weniger schützt aber Tryptophan die strukturelle Integrität von Albumin, wenn es hohen Temperaturen ausgesetzt wird. Im Gegensatz dazu, wird Albumin stark an Natriumchlorid gebunden, mit Natriumchlorid gelingt es aber nicht, Albumin zu schützen, wenn es hohen Temperaturen ausgesetzt ist. Somit erfüllt Natriumcaprylat, zusätzlich zur Abtrennung des Albumins von unerwünschtem Material, die zweifache Funktion, die Albumin-Stabilität sowohl während als auch nach dem Herstellverfahren zu verbessern und beizubehalten.
Im Lichte der obigen Beispiele und Ausführungen wird der Durchschnittsfachmann verschiedene mögliche Modifikationen und Abänderungen der offenbarten Erfindung erkennen. Daher dienen die angegebenen Beispiele lediglich der Erläuterung der Erfindung, die nur auf die folgenden Ansprüche eingeschränkt sein sollte.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung Plasma-stämmiger therapeutischer Lösungen aus einer Mischung von Plasma-Proteinen, wobei man Natriumcaprylat als Abtrennmittel zur Anwendung bringt, um Albumin von Nicht-Albumin- Proteinen und begleitenden Herstellrückständen abtrennt, worin der pH-Wert der Albuminhaltigen Lösung ca. 5,25 bis 5,6 beträgt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Plasma-stämmigen therapeutischen Lösungen Albumin-Lösungen, Alpha-1 Protease-Inhibitor und Antithrombin III umfassen.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Nicht-Albumin Proteine aus einer Lösung ausgewählt sind, die gamma-, alpha- und beta-Globuline und saure Glycoproteine umfaßt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Herstellrückstände mehrwertige Metallionen und Lösungsmittel umfassen.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei Natriumcaprylat zur Albuminhaltigen Lösung bei einer Temperatur im Bereich von ca. 20 bis 30ºC zugegeben wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei Natriumcaprylat zur Albuminhaltigen Lösung in einer Menge von ca. 0,04 bis 0,08 M Natriumcaprylat zugegeben wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die mit Natriumcaprylat behandelte Lösung über einen Zeitraum von ca. 2 bis 8 h inkubiert wird.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei man die Albumin-haltige Lösung auf einen pH-Wert von ca. 5,4 bis 5,6 bringt, sie auf eine Temperatur von ca. 20 bis 30ºC erhöht und vermischt, wobei Natriumcaprylat zugegeben wird, um eine Konzentration von ca. 0,04 bis ca. 0,08 M einzustellen, und wobei über eine Zeitdauer von ca. 2 bis 8 h inkubiert wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Mischung von Plasma- Proteinen entweder Cohn-Fraktion II + III Effluens oder Cohn-Fraktion IV-1- Effluens umfaßt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei man die Albumin-haltige Lösung auf einen pH-Wert von ca. 5, 4 bringt, sie auf ca. 30ºC erwärmt, mit annähernd 0,06 M Natriumcaprylat behandelt und sie ca. 6 h lang inkubiert.