DE69434569T2

DE69434569T2 - Verfahren zur erhöhung der überlebensrate von neuronen und dafür verwendbare mittel

Info

Publication number: DE69434569T2
Application number: DE69434569T
Authority: DE
Inventors: Leslie Graham BARRETT
Original assignee: Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research
Current assignee: Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research
Priority date: 1993-10-18
Filing date: 1994-10-18
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2014-10-19
Also published as: ATE312175T1; EP1683863A2; CA2174425A1; DE69434569D1; US6174869B1; EP0724589A1; EP0724589B1; JP4281926B2; US5837694A; WO1995011253A1; JPH09503512A; EP1683863A3; EP0724589A4

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Neuronen und insbesondere auf ein Verfahren zur Erhöhung oder Verstärkung der Überlebensrate derselben. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Mittel in Form von Stoffzusammensetzungen, die für die Erleichterung des Überlebens von Neuronen geeignet sind.
Bibliographische Einzelheiten zu den Veröffentlichungen, auf die in dieser Beschreibung mittels Zahlen Bezug genommen wird, sind am Ende der Beschreibung zusammengefasst. Sequenz-Identifikationsnummern (SEQ ID Nr.) für die Nucleotidsequenzen, auf die in der Beschreibung Bezug genommen wird, sind nach der Literaturliste definiert.
Wenn der Zusammenhang nichts anderes erfordert, soll in der gesamten Beschreibung das Wort "umfassen" oder Variationen wie "umfasst" oder "umfassend" implizieren, dass ein angegebenes Element oder eine ganze Zahl oder eine Gruppe von Elementen oder ganzen Zahlen mit eingeschlossen ist, aber nicht, dass irgendein anderes Element oder eine andere ganze Zahl oder eine andere Gruppe von Elementen oder ganzen Zahlen ausgeschlossen ist.
Es hat sich gezeigt, dass mehrere lösliche trophische Faktoren eine Wirkung auf das Überleben von Neuronen in vivo ausüben. Viele dieser Faktoren wirken direkt auf das sich entwickelnde Neuron innerhalb zum Beispiel der Hinterwurzelganglien (DRG). Ein Faktor von besonderer Bedeutung ist der Nervenwachstumsfaktor (NGF; 1). Die Wirkungen des NGF werden wenigstens zum Teil durch trkA vermittelt, den hochaffinen NGF-Rezeptor. Ein anderer Rezeptor, der niederaffine NGF-Rezeptor p75^NGFR, ist ein Rezeptor, dessen Funktion nur unvollständig charakterisiert ist. Es hat sich gezeigt, dass der p75^NGFR-Rezeptor die Affinität von trkA zu NGF erhöht (12), und Arbeiten von Lee et al. (2) lassen vermuten, dass p75^NGFR für die Entwicklung von sensorischen Neuronen erforderlich ist. Die Verabreichung von NGF kann zwar ein therapeutisches Potential bezüglich der Erleichterung des Überlebens von Neuronen haben, doch ist NGF ein multifunktionelles Molekül, das eine Reihe von Zielzellen beeinflusst. Es besteht daher ein Bedürfnis nach einer spezifischen Ansteuerung von neuronalen Zellen.
In Arbeiten, die zur vorliegenden Erfindung führten, strebten die Erfinder danach, die Funktion von p75^NGFR näher zu charakterisieren, indem sie den Rezeptor in sensorischen Neuronen, die von Hinterwurzelganglien ausgehen, in verschiedenen Stadien der Entwicklung herunterregulierten. Die Erfinder fanden überraschend heraus, dass eine Senkung des Niveaus der p75^NGFR-Expression in sensorischen Neuronen die Überlebensrate von postnatalen (P) sensorischen Neuronen des zweiten Tags (P2) in Abwesenheit von exogenem NGF erhöht, obwohl die Herunterregulierung der p75^NGFR-Expression das NGF-vermittelte Überleben von sensorischen Neuronen im embryonalen (E) Stadium der zielgerichteten Innervation verhindert.
Dementsprechend betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erleichterung des Überlebens von Neuronen bei einem Tier, wobei das Verfahren das Herunterregulieren der Expression eines Rezeptors auf den Neuronen für einen neurotrophen Faktor umfasst, der zum neurotropher-Faktorvermittelten Überleben von Neuronen befähigt ist.
Die vorliegende Erfindung wird hier beispielhaft dargestellt und beschrieben anhand des Rezeptors p75^NGFR und eines seiner Effektormoleküle, d.h. NGF. Dies geschieht jedoch unter der Voraussetzung, dass sich die vorliegende Erfindung auf alle neurotrophen Rezeptoren erstreckt, die bezüglich der Förderung des Überlebens von Neuronen, wie es gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt wurde, analog zu p75^NGFR und seinen Effektormolekülen, zu denen NGF und BDNF (brain-derived neurotrophic factor) gehören, wirkt. Neuronen, die von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden, sind solche, die p75^NGFR exprimieren oder die Fähigkeit zu seiner Expression haben. Der Ausdruck "Erleichterung des Überlebens von Neuronen" soll die Erhöhung oder Verstärkung der Überlebensrate von Neuronen oder die Rettung von Neuronen nach, während oder vor neurodegenerativen Zuständen, wie sie mit Krankheit und/oder Verletzungen verbunden sind, umfassen. Die "Rettung von Neuronen" umfasst die Aufrechterhaltung des differenzierten Zustands eines Neurons, wie zum Beispiel die Aufrechterhaltung des cholinergisch differenzierten Zustands eines Neurons. Diesbezüglich stellt daher ein damit zusammenhängender Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erleichterung der Rettung von Neuronen bei einem Tier bereit, wobei das Verfahren das Herunterregulieren der Expression eines Rezeptors auf den Neuronen für einen neurotrophen Faktor umfasst, der zur neurotropher-Faktor-vermittelten Rettung von Neuronen befähigt ist.
Dementsprechend wird in einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erleichterung des Überlebens von Neuronen bereitgestellt, die den Rezeptor p75^NGFR bei einem Tier exprimieren, wobei das Verfahren das Heunterregulieren der p75^NGFR-Expression in diesen Neuronen umfasst.
Zu den Neuronen, die p75^NGFR exprimieren oder die Fähigkeit zu seiner Expression haben und die unter die vorliegende Erfindung fallen, gehören unter anderem sensorische Neuronen, sympathische Neuronen, cholinergische Neuronen des zentralen Nervensystems (und insbesondere Neuronen des basalen Vorderhirns, die bei Alzheimer-Krankheit betroffen sind), motorische Neuronen und Neuronen des Kleinhirns sowie Neuronen in der Substantia nigra und im Striatum, die an der Parkinson-Krankheit beteiligt sind.
Vorzugsweise ist das Tier ein Säuger, wie ein Mensch, Nutztier (z.B. Schaf, Schwein, Rind, Pferd oder Ziege), Haustier (z.B. Hund oder Katze), Laborversuchstier (z.B. Maus, Ratte, Kaninchen oder Meerschweinchen) oder gefangenes Wildtier. Am meisten bevorzugt ist das Tier ein Mensch.
Der Ausdruck "Herunterregulieren" wird in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst die Senkung der Zahl der Rezeptoren pro Zelle, die Senkung der Zahl der funktionsfähigen Rezeptoren pro Zelle und/oder die Blockierung vorhandener Rezeptoren auf einer Zelle. In jedem Fall führt die herunterregulierte Expression zu einer erhöhten Überlebensrate von sensorischen Neuronen. Die Analyse der Expression des p75^NGFR-Rezeptors kann durch jedes zweckmäßige Mittel überwacht werden, wie unter anderem durch die Verwendung von markierten Antikörpern und/oder durch eine Analyse der Genexpression.
Vorzugsweise erfolgt die Erleichterung des Überlebens von Neuronen im Stadium der zielgerichteten Innervation oder danach.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Herunterregulieren auf dem genetischen Niveau durch Verwendung von Antisense-Nucleinsäuremolekülen. In einer besonderen beispielhaft erwähnten Ausführungsform sind die Antisense-Nucleinsäuremoleküle Antisense-Oligonucleotide. Im Allgemeinen werden kurze Oligonucleotide verwendet, die je nach ihrer Zielsequenz etwa 5 bis etwa 50 Nucleotide aufweisen. Vorzugsweise haben die Oligonucleotide eine Länge von etwa 10 bis weniger als etwa 26 Nucleotide. Vorzugsweise sind die Antisense-Oligonucleotide auf den 5'-Endteil des p75^NGFR-Gens oder einen Bereich, der das Stopcodon des p75^NGFR-Gens umfasst und/oder daran angrenzt, gerichtet.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich jedoch auch auf größere Nucleinsäuremoleküle, die in der Lage sind, die mRNA der p75^NGFR-Strukturgensequenz anzusteuern, oder ein Gen, das die p75^NGFR-Expression reguliert.
Eine damit zusammenhängende Ausführungsform betrifft ein Verfahren zum Herunterregulieren des niederaffinen Rezeptors des Nervenwachstumsfaktors (NGF) p75^NGFR, auf einem Neuron, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen des Neurons mit einer wirksamen Menge eines Antisense-Oligonucleotids gegen das p75^NGFR codierende Gen während einer Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, um die Expression von p75^NGFR so weit zu reduzieren, dass das Überleben des Neurons erleichtert wird, umfasst.
Insbesondere wird ein Verfahren zum Herunterregulieren des niederaffinen Rezeptors des Nervenwachstumsfaktors (NGF), p75^NGFR, auf einem Neuron bereitgestellt, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen des Neurons mit einer wirksamen Menge eines Antisense-Oligonucleotids gegen das p75^NGFR codierende Gen während einer Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, um die Expression von p75^NGFR so weit zu reduzieren, dass die Überlebensrate des Neurons in Abwesenheit von exogen zugeführtem NGF erhöht, verstärkt oder in anderer Weise erleichtert wird, umfasst.
Die Oligonucleotide sind vorzugsweise chemisch so modifiziert, dass eine verbesserte oder erhöhte Stabilität in vitro und/oder in vivo (z.B. gegenüber der Wirkung von Nucleasen) erleichtert wird und/oder eine orale Bioverfügbarkeit ermöglicht wird, so dass ein Übergang durch die Blut-Hirn-Schranke ermöglicht und/oder der therapeutische Index erhöht wird. Weiterhin kann die chemische Modifikation die Verabreichung an das betroffene Tier oder nach der Verabreichung den Durchtritt der Oligonucleotide zum betroffenen Gewebe erleichtern. Zum Beispiel können die Oligonucleotide Linker, Marker oder andere Effektormoleküle, wie Transferrin-Rezeptor-Antikörper, tragen. Besonders bevorzugte Oligonucleotide sind Phosphorothioat-Oligonucleotide, da Phosphorothioate gegen Nucleasen resistent sind, was zu einer hohen Stabilität sowohl in vitro als auch in vivo beiträgt (3). Alternativ dazu können die Oligonucleotide auch mit lipophilen Gruppen konjugiert (13), mit meso-Tetracarboxyporphin konjugiert (14), mit Poly-L-lysin konjugiert (15) oder über Poly-L-lysin mit einem Protein konjugiert (16) sein. Die Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung können mit jedem geeigneten Mittel an das betroffene Tier verabreicht werden; dazu gehören der intravenöse, intramuskuläre, intranasale, rektale, intraperitoneale, intrazerebrale, intrathekale oder subkutane Verabreichungsweg, auch über Liposomen oder retrograden Transport oder lokal an Stellen der Schädigung oder Verletzung peripherer Nerven, wie durch Verwendung einer Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung, wie Gel-foam. Da die Oligonucleotide gegenüber dem betroffenen Tier, wenn überhaupt, nur wenig Toxizität aufweisen, können sie in jeder geeigneten Konzentration verabreicht werden, vorausgesetzt, dass ausreichend viele Antisense-Moleküle die Zielstelle erreichen. Geeignete Kon zentrationsbereiche sind für die in-vivo-Verwendung etwa 0,01 μM bis > 2000 μM, besonders bevorzugt etwa 0,05 μM bis etwa 1500 μM und ganz besonders bevorzugt etwa 0,1 μM bis etwa 1000 μM. Für die topische Verwendung, subkutane Verwendung oder lokale Verwendung können ähnliche Konzentrationen verwendet werden, doch wären auch höhere Konzentrationen für die Behandlung des Zustands nicht nachteilig.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Oligonucleotid bereitgestellt, das die Expression von p75^NGFR in Neuronen herunterregulieren kann. Insbesondere kann das Oligonucleotid der vorliegenden Erfindung die Expression von p75^NGFR in Neuronen so herunterregulieren, dass es nach dem Stadium der zielgerichteten Innervation zu einer erhöhten, verstärkten oder in anderer Weise erleichterten Überlebensrate von Neuronen kommt.
Die Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung können anhand der Ansteuerung fast jeden Teils der p75^NGFR-mRNA ausgewählt werden, wobei das bevorzugte Oligonucleotid und die bevorzugte Länge des Oligonucleotids zu einer Abnahme von wenigstens 30%, besonders bevorzugt wenigstens 50% und ganz besonders bevorzugt wenigstens 60% oder mehr bezüglich des Expressionsniveaus von p75^NGFR in Neuronen führen.
Die bevorzugten Oligonucleotide sind 5'-ACCTGCCCTCCTCATTGCA-3' (SEQ ID Nr. 1), das den 5'-Endteil des p75^NGFR-Gens (hier auch als "5'-AS" bezeichnet) ansteuert, und 5'-AGTGGACTCGCGCATAG-3' (SEQ ID Nr. 4), das den Bereich ansteuert, der das Stopcodon des p75^NGFR-Gens umfasst und/oder daran angrenzt (hier auch als "3'-AS" bezeichnet), einschließlich beliebiger oder aller Mutanten, Derivate, Homologen oder Analoga davon, die mit wenigstens einem Teil der p75^NGFR-mRNA hybridisieren oder einen Duplex bilden können. Zweckmäßigerweise ist das bevorzugte Oligonucleotid ein Phosphorothioat-Oligonucleotid oder ist in sonstiger Weise chemisch modifiziert, wie es oben erwähnt ist.
Dementsprechend stellt ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Oligonucleotid bereit:

(i) das in der Lage ist, die Expression von p75^NGFR in Neuronen herunterzuregulieren; und
(ii) das in der Lage ist, unter Bedingungen niedriger Stringenz mit dem reversen Komplement von SEQ ID Nr. 1 zu hybridisieren; oder
(iii) das in der Lage ist, unter Bedingungen niedriger Stringenz mit dem reversen Komplement von SEQ ID Nr. 4 zu hybridisieren.

Um das Stringenzniveau zu definieren, kann zweckmäßigerweise auf Maniatis et al. (17) auf den Seiten 387-389, worauf hier ausdrücklich Bezug genommen wird, verwiesen werden, wobei die offenbarten Waschschritte als Bedingungen hoher Stringenz gelten. Eine niedrige Stringenz ist hier definiert als 4-6x SSC/0,1-0,5% (w/v) SDS bei 37-45 °C während 2-3 Stunden. Je nach der Quelle und der Konzentration der an der Hybridisierung beteiligten Nucleinsäure können auch alternative Stringenzbedingungen eingesetzt werden, wie Bedingungen mittlerer Stringenz, als welche hier 1-4x SSC/0,25-0,5% (w/v) SDS bei ≥ 45 °C während 2-3 Stunden gilt, oder Bedingungen hoher Stringenz, als welche hier 0,1-1x SSC/0,1% (w/v) SDS bei ≥ 60 °C während 1-3 Stunden gilt.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung, Verstärkung oder sonstigen Erleichterung der Überlebensrate von Neuronen, die p75^NGFR exprimieren, bereitgestellt, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen von Neuronen mit einer wirksamen Menge eines Oligonucleotids, das im Wesentlichen eine Antisense-Sequenz zu wenigstens einem Teil der p75^NGFR-mRNA aufweist, unter ausreichenden Bedingungen, so dass das Oligonucleotid in die Neuronen eindringt und die Expression von p75^NGFR herunterreguliert, umfasst. Nach dem Herunterregulieren der p75^NGFR-Expression wird die Überlebensrate von Neuronen erhöht, verstärkt oder in anderer Weise erleichtert. Dies ist in Abwesenheit von exogen zugeführtem NGF besonders offensichtlich. Vorzugsweise findet das Überleben der Neuronen im Stadium der zielgerichteten Innervation oder danach statt.
In einer damit zusammenhängenden Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verzögerung des Fortschreitens eines neurodegenerativen Zustands, der mit Krankheit und/oder Verletzung bei einem Säuger verbunden ist, bereit, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antisense-Oligonucleotids, das die Expression von p75^NGFR auf Neuronen herunterregulieren kann, an den Säuger umfasst.
In einer weiteren damit zusammenhängenden Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung von neurodegenerativen Zuständen, die mit Krankheit und/oder Verletzung bei einem Säuger verbunden sind, bereit, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antisense-Oligonucleotids während einer Zeit und unter Bedingungen, die ausreichen, um die Expression von p75^NGFR auf Neuronen herunterzuregulieren, an den Säuger umfasst. Das Herunterregulieren des p75^NGFR-Rezeptors auf Neuronen fördert die Rettung von Neuronen nach dem Einsetzen eines neurodegenerativen Zustands, einer Krankheit oder einer Verletzung. Der neurodegenerative Zustand beinhaltet den Verlust des Phänotyps, zum Beispiel den Verlust des cholinergischen Phänotyps, der damit verbunden ist, dass ein Neuron undifferenziert wird. Dies wird allgemein als ein Stadium vor dem Zelltod angesehen. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung die Behandlung von neurodegenerativen Zuständen, die dadurch gekennzeichnet ist, dass der Verlust des Phänotyps und/oder der Zelltod bei Neuronen reduziert oder verhindert wird oder die Neuronen davor gerettet werden.
Die Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung können insofern "homolog" sein, als sie nach der mRNA-Sequenz des p75^NGFR-Rezeptors des zu behandelnden Tiers gestaltet sind, oder sie können "heterolog" sein, wenn das Oligonucleotid auf einer Spezies beruht und mit der mRNA einer anderen Spezies kreuzhybridisiert. Wenn die p75^NGFR codierende genetische Sequenz zum Beispiel bei zwei Tierarten ähnlich ist, kann ein auf der einen Spezies beruhendes Oligonucleotid in einem ausreichenden Ausmaß kreuzhybridisieren, um die Expression des p75^NGFR in der anderen Spezies herunterzuregulieren.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Tieren mit beschädigten Neuronen oder einer potentiellen weiteren Schädigung von Neuronen bereit, wobei es sich bei den Neuronen um solche handelt, die p75^NGFR exprimieren. Die Schädigung oder potentielle Schädigung kann von einer Verletzung oder Krankheit herrühren. Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Behandlung von Zuständen wie Zerebralparalyse, traumainduzierte Paralyse, mit einem Schlaganfall verbundene vaskuläre Ischämie, neuronalen Tumoren, Motorneuronerkrankung, Parkinson-Krankheit, Chorea Huntington, Alzheimer-Krankheit, multiple Sklerose und peripheren Neuropathien, die mit Diabetes, Schwermetall- oder Alkoholvergiftung, Nierenversagen und/oder Infektionskrankheiten, wie Herpes, Röteln, Masern, Windpocken, HIV und/oder HTLV-1 in Zusammenhang stehen.
Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung eines Tiers, wie eines Menschen oder anderen Säugers, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Herunterregulieren der Expression von p75^NGFR durch zum Beispiel ein oder mehrere Oligonucleotide, die eine Antisense-Sequenz zu wenigstens einem Teil der p75^NGFR-mRNA oder einen funktionell ähnlichen oder analogen Rezeptor in sensorischen Neuronen aufweisen, umfasst, vorzugsweise, aber nicht ausschließlich im Stadium der zielgerichteten Innervation oder danach.
Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird dem Tier ein Mittel, das die Expression von p75^NGFR herunterregulieren kann, in einer wirksamen Menge, um die Expression des Rezeptors herunterzuregulieren, verabreicht. Im Allgemeinen und vorzugsweise ist das Mittel ein Antisense-Oligonucleotid, das so gestaltet ist, dass es mit wenigstens einem Teil der p75^NGFR-mRNA hybridisiert oder einen Duplex bildet, was zu einer reduzierten p75^NGFR-Expression führt.
Die Verabreichung des Mittels, wie etwa in Form von Oligonucleotiden, kann auf jedem herkömmlichen Weg erfolgen, zum Beispiel durch intravenöse oder intrazerebrale Verabreichung oder durch topische Verabreichung während oder nach einem chirurgischen Eingriff. Es kann notwendig sein, das Mittel so zu behandeln, dass die Wirkung von Enzymen des Wirtstiers reduziert wird. Wenn das Mittel zum Beispiel ein Oligonucleotid umfasst, ist das Oligonucleotid zweckmäßigerweise phosphorothioatiert. Zu den alternativen Formen der Verabreichung gehören die Gentherapie und/oder die Verwendung von viralen Vektoren, wie HSV-Vektoren.
Die vorliegende Erfindung beruht zum Teil auf dem überraschenden Ergebnis, dass p75^NGFR in sensorischen Neuronen nach dem Stadium der zielgerichteten Innervation in der Lage ist, ein Apoptosesignal zu vermitteln, aber vor der zielgerichteten Innervation zusammen mit trkA für das NGF-vermittelte Überleben von sensorischen Neuronen erforderlich ist. Ohne die vorliegende Erfindung auf eine bestimmte Theorie oder Wirkungsweise festlegen zu wollen, fällt das Umschalten der Funktion von p75^NGFR in diesem späten Stadium der Zellentwicklung mit einer Abnahme des Niveaus der trkA-Expression in sensorischen Ganglien zusammen, was darauf hinweist, dass p75^NGFR mit trkA zusammenwirkt, um das neuronale Überleben in Gegenwart von NGF zu vermitteln, dass p75^NGFR aber, wenn es nicht mit trkA assoziiert ist, in Abwesenheit einer wirksamen Menge von NGF in vivo als Todessignal wirken kann. Die Überlebensrate von Neuronen kann daher durch eine oder mehrere der Maßnahmen Herunterregulieren der Expression von p75^NGFR, Hochregulieren der Expression von trkA und/oder Zuführen von exogenem NGF oder anderer geeigneter neurotropher Faktoren erhöht, verstärkt oder in anderer Weise erleichtert werden.
Dementsprechend betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung das Hochregulieren der Expression von trkA, um dadurch dessen Wechselwirkung mit p75^NGFR zu modulieren. Im Allgemeinen wird gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung die trkA-Expression mit Hilfe von genetischen Mitteln oder durch Verwendung von Agonisten hochreguliert. Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung können weiterhin die Zugabe von exogenem NGF oder anderer geeigneter neurotropher Faktoren, wie BNDF, umfassen.
Der Ausdruck "Hochregulieren" wird in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst die Erhöhung der Zahl der Rezeptoren pro Zelle, die Erhöhung der Zahl der funktionsfähigen Rezeptoren pro Zelle und/oder die Verstärkung der Aktivität vorhandener Rezeptoren pro Zelle.
Die Wirkungen der vorliegenden Erfindung bezüglich der Erhöhung, Verstärkung oder sonstigen Erleichterung der Überlebensrate von Neuronen nach dem Stadium der zielgerichteten Innervation kann in vitro oder in vivo leicht gezeigt werden. Ein besonders zweckmäßiges in-vivo-Modell beinhaltet die Hüftnervaxotomie bei Ratten. Bei diesem Verfahren wird der linke Hüftnerv bei neugeborenen Ratten axotomiert, und der proximale Stumpf des Hüftnervs wird mit Antisense-Oligonucleotiden oder anderen Mitteln, die die p75^NGFR-Expression herunterregulieren können, behandelt.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann p75^NGFR in einem Assay für p75^NGFR-bindende Moleküle und vorzugsweise kleine Moleküle zur Verwendung als Agonisten oder Antagonisten der Cytokin-Rezeptor-Bindung verwendet werden. Vorzugsweise werden Zellen, die rekombinantes p75^NGFR exprimieren, als Grundlage des Assays verwendet.
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Oligonucleotids, das die Expression von p75^NGFR in Neuronen herunterregulieren kann, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugers mit beschädigten Neuronen.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin anhand der folgenden nichteinschränkenden Figuren und/oder Beispiele beschrieben.
In den Figuren sind:
1A eine photographische Darstellung nach der Autoradiographie von P2-Maus-DRG-Zellen, die mit Antisense-Oligonucleotiden behandelt wurden, welche 5' mit ³⁵S markiert waren.
1B eine photographische Darstellung von Phasenkontrast- und Immunfluoreszenzphotos von Zellen aus einer Kontrollkultur (mit Sense-Oligonucleotid behandelt; obere Bilder) und aus einer Antisense-behandelten Kultur (untere Bilder).
1C eine graphische Darstellung, die die Frequenzverteilung der p75^NGFR-Immunfärbung bei Sense- und Antisense-behandelten sensorischen Neuronen von P2-Ratten nach 2 Tagen in Kultur zeigt.
2 eine graphische Darstellung des Verlusts von DRG-Neuronen nach 2 Tagen in Kultur in Gegenwart von NGF und des p75^NGFR-Antisense-Oligonucleotids, ausgedrückt relativ zur Anzahl von Neuronen, die in Gegenwart des entsprechenden Sense-Oligonucleotids überlebten.
3 eine photographische Darstellung von Phasenkontrast-mikroskopischen Aufnahmen von P2-Mauszellen nach 2 Tagen in Kultur in Abwesenheit von NGF in Gegenwart von 5 μM Sense-Oligonucleotid (oben), 1 μg/ml Cycloheximid (Mitte) und 5 μM Antisense-Oligonucleotid (unten). Die Sense-behandelten Zellen weisen verschiedene Stadien der Apoptose einschließlich Schrumpfung, Einkerbung, cytoplasmatischer Körnigkeit und Kondensation sowie Membranzerstörung auf. Eine erhöhte Überlebensrate trat sowohl bei Cycloheximid- als auch bei Antisense-Kulturen auf. Aufgrund einer Hemmung der Proteinsynthese entwickelten Cycloheximid-behandelte Zellen keine Neuriten, obwohl sie ein phasenhelles und gesundes Erscheinungsbild beibehielten. Antisense-Kulturen zeigen einen großen Anteil an gesunden Zellen mit zahlreich vorhandenen Neuriten.
4A eine graphische Darstellung, die die Wirkung von Antisense- und Sense-Oligonucleotiden auf eine verlängerte Kultur von DRG-Neuronen von E19-Mäusen zeigt. Zum Zeitpunkt des Ausstreichens wurden Oligonucleotide sowie NGF in einer Konzentration von 1 ng/ml hinzugefügt, um die Zellen anfangs am Leben zu halten (dies war bei P2-Zellen unnötig). Es gab keinen Unterschied in der Überlebensrate von Zellen während der ersten zwei Tage, aber nach verlängerter Kultur trat eine erhöhte Überlebensrate in der Antisense-behandelten Gruppe auf. Die Werte an jedem Punkt sind Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (n = 6).
4B eine graphische Darstellung der Analyse der Entwicklungsmodulation der trkA-Expression in Maus-DRG durch RT-PCR (Reverse-Transcriptase-PCR). trkA-mRNA war in den Stadien E15 und E19 vorhanden, aber in P2 nicht nachweisbar. Frisch seziertes DRG wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –70 °C aufbewahrt, bevor in 4 M Guanidiniumthiocyanat homogenisiert und über einem Cäsiumchlorid-Polster ultrazentrifugiert wurde. RNA (100 ng) aus jeder Probe wurde eine Stunde lang bei 42 °C mit AMV-Reverser-Transcriptase inkubiert, und ein Fünftel der Reaktionsprodukte wurde für die PCR verwendet (30 Cyclen, 1-min-Schritte von 94 °C, 55 °C und 72 °C in 100 μM mit 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Cetus, USA)). Die Primer waren:
TAGGCGGTCTGGTGACTTCGTTG (5') (SEQ ID ID. 2) und
ACATAGAGCTCCGTCAGGTTCCC (3') (SEQ ID ID. 3)
mit einem vorausgesagten Amplifikationsprodukt von 163 bp (bezogen auf die Ratten-trkA-Sequenz [6]).
5 eine graphische Darstellung, die die Verhinderung des Todes von verletzten sensorischen Neuronen in vivo durch p75^NGFR-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotide zeigt. C8, zervikal; L5, lumbal.
6 eine graphische Darstellung, die eine Überlebensreaktion neuronaler Zellen aus DRG in vitro unter Verwendung von zwei p75^NGFR-Antisense-Oligonucleotiden zeigt. Zum Vergleich verwendete Kontrollen beinhalten ein Nicht-Oligonucleotid und ein Nonsense-Oligonucleotid (verwürfeltes Antisense-Oligonucleotid).
7 eine photographische Darstellung von Schnitten von ipsilateralen (B) und kontralateralen Hinterwurzelganglien (A), die mit Avidin-Peroxidase angefärbt wurden, um die Anwesenheit von biotinylierten Oligonucleotiden nach Injektion derselben in einen Hüftnerv nachzuweisen.
8A eine photographische Darstellung von Schnitten von Hinterwurzelganglien, die immunhistochemisch bezüglich der Anwesenheit von p75^NGFR angefärbt wurden. Die Schnitte wurden von intakten (nichtaxotomierten) Hinterwurzelganglien (links) und von Hinterwurzelganglien von Ratten nach der Axotomie und in-vivo-p75^NGFR-Antisense-Behandlung (rechts) angefertigt.
8B eine graphische Darstellung des Herunterregulierens von p75^NGFR in vivo nach der Antisense-Behandlung im Vergleich zu Kontrollen.
9 eine graphische Darstellung der Todesrate in vitro nach NGF-Entzug bei PC-12-Zellen mit unterschiedlichen Niveaus der p75^NGFR-Expression.
10 eine graphische Darstellung des Überlebens in vitro nach NGF-Entzug bei PC-12-Zellen, die mit p75^NGFR-Antisense (SEQ ID Nr. 1)(5 μM) oder -Nonsense (SEQ ID Nr. 9)(5 μM) behandelt wurden.
Beispiel 1
Herstellung von Oligonucleotiden
Sense- und Antisense-Oligonucleotide wurden durch Standard-Syntheseverfahren hergestellt. Wenn notwendig, wurden Oligonucleotide durch HPLC gereinigt, in Acetonitril eluiert, lyophilisiert und in H₂O rekonstituiert, um flüchtige Verunreinigungen zu entfernen, und dann vor der Verwendung weiter durch Filtration über Sephadox-G25-Gel gereinigt. Bevorzugte Oligonucleotide sind Phosphorothioat-Oligonucleotide.
Beispiel 2
Herunterregulation der Expression des p75^NGFR-Rezeptors
Die Expression des p75^NGFR-Rezeptors in sensorischen Neuronen von DRG wurde in verschiedenen Stadien der Entwicklung herunterreguliert, indem man p75^NGFR-Antisense-Phosphorothioat-Oligonucleotide verwendete. Phosphorothioate wurden anhand ihrer Resistenz gegenüber Nucleasen gewählt, was ihnen eine außergewöhnlich hohe Stabilität sowohl in vitro als auch in vivo verleiht (3). Um das Eindringen von Oligonucleotiden in Zellen zu erleichtern, wurden die Zellen nach der Bildung einer Einzelzellsuspension und vor dem Ausstreichen in Gegenwart von Oligonucleotiden verrieben. Die autoradiographische Analyse zeigte, dass Oligonucleotide in wenigstens 65% der Neuronen eindrangen. 1A zeigt die Ergebnisse der Autoradiographie von P2-Maus-DRG-Zellen, die mit 35S-5'-markierten Antisense-Oligonucleotiden behandelt wurden. Der Marker wurde unter Verwendung von T4-Polynucleotid-Kinase in die Oligonucleotide eingebaut. Kulturen wurden 2 Tage lang mit Oligonucleotiden inkubiert, in Emulsion eingetaucht und 7 Tage lang auf Röntgenfilm einwirken gelassen. Die Mehrzahl der Neuronen nahm markierte Oligonucleotide auf, während dies für nur wenige der Gliazellen galt. Die "Halo"-Wirkung um markierte Zellen herum spiegelt die Verdünnung der Emulsion über den großen, abgerundeten Neuronen wider.
Die Wirksamkeit der p75^NGFR-Antisense-Oligonucleotide wurde durch Immunfärbung von Kulturen von sensorischen Neuronen aus 2 Tage alten (P2) Ratten mit einem Anti-p75^NGFR-Antikörper und 2 Tage nach der Behandlung mit entweder Antisense-, Sense- oder unspezifischen Oligonucleotiden bewertet.
Die Ergebnisse sind in 1B gezeigt, die die entsprechenden Phasenkontrast- und Immunfluoreszenzphotos von Zellen aus einer Kontrollkultur (mit Sense-Oligonucleotid behandelt; obere Bilder) und aus einer Antisense-behandelten Kultur (untere Bilder) zeigt. Während die Kontrollkultur eine starke p75^NGFR-Expression sowohl am Zellrumpf als auch an den Fortsätzen zeigte, war die Expression bei den Antisense-behandelten Zellen und ihren Fortsätzen zu vernachlässigen. Die streifenförmige Färbung, die das Neuron in der Antisense-Kultur umgibt, stellt die p75^NGFR-Expression in Gliazellen dar, die eine geringere Herunterregulation als bei Neuronen zeigten. Obwohl die Mehrzahl der Überlebensassays in Mauszellen durchgeführt wurde, wurden hier Rattenzellen (deren Präparate im Unterschied zu Mauspräparaten einen hohen Anteil an Gliazellen enthielten) verwendet, da der monoklonale Antikörper Maus-p75^NGFR nicht nachweist. Einzelzellsuspensionen von P2-Ratten-DRG-Zellen wurden so hergestellt, wie es zuvor beschrieben wurde (4), und eine Minute lang in einer Gilson-Mikropipette in Gegenwart von Oligonucleotiden verrieben, auf fibronektinbeschichteten Kunststoff-Objektträgern ausgestrichen und zwei Tage lang in Gegenwart von 1 ng/ml NGF inkubiert. Dann wurden sie gewaschen, bevor sie mit einem monoklonalen Antikörper gegen p75^NGFR (MC192, Boehringer, Deutschland) und einem mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugierten Schaf-Anti-Maus-Antikörper (Silenus, Australien) inkubiert wurden. Dann wurden die Zellen gewaschen, bevor sie in 4-Vol.-%igem Paraformaldehyd fixiert wurden. Der Strich stellt 25 μm dar. Die Ergebnisse zeigen, dass nach der Antisense-Behandlung eine große Zahl von Neuronen ein sehr niedriges Niveau der Rezeptorexpression aufwiesen (1B).
Dann wurde eine quantitative Analyse der Expressionsniveaus durchgeführt. Die Analyse wurde an 40 Zellen aus jeder Kategorie durchgeführt. Das Anfärben erfolgte unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers MC192 und eines biotinylierten Schaf-Anti-Maus-Antikörpers (Vector Laboratories, USA) sowie eines Peroxidase-Färbungs-Kits (Vectastain Elite Kit, Vector Laboratories, USA) nach Fixierung mit Paraformaldehyd. Die Färbeintensität wurde unter Verwendung eines computerisierten Bildanalysesystems (Leading Edge, Australien) quantifiziert, auf einer willkürlichen linearen Skala von 0 bis 100 ausgedrückt, und die Zellen wurden entlang dieser Skala in eine von vier Kategorien eingeteilt. Zellen in der untersten Kategorie (0-25) hatten eine Färbung, die vom Hintergrund praktisch nicht zu unterscheiden war, und der Anteil dieser Zellen nahm von 9% in Kontrollkulturen auf 48% in Antisense-Kulturen zu. Die Ergebnisse sind in 1C gezeigt und offenbaren eine erhebliche Reduktion der Expression des p75^NGFR-Rezeptors in einem Anteil der Antisense-behandelten Neuronen im Vergleich zu Sense-Kontrollen.
Die Zahl der Neuronen, die p75^NGFR auf Hintergrundniveau exprimierten, nahm von < 10% bei Sense-behandelten Kulturen auf > 45% bei den Antisensebehandelten Kulturen zu. Eine empfindlichere Analyse unter Verwendung von kleineren Dichteunterteilungen als in 1C würde ein geringeres Ausmaß der Herunterregulation nachweisen und somit einen höheren Prozentsatz an Zellen ergeben, die p75^NGFR herunterregulieren.
Beispiel 3
Wirkung auf das Überleben von sensorischen Neuronen nach einer Antisense-Behandlung
Die Wirksamkeit der Antisense-Behandlung wurde in Beispiel 2 festgestellt. Dann wurde die Wirkung auf das Überleben von sensorischen Neuronen bestimmt, die von Mäusen im Alter im Bereich von E12 bis P2 abgeleitet waren. 2 zeigt den Verlust von DRG-Neuronen nach 2 Tagen in Kultur in Gegenwart von NGF (Boehringer, Deutschland) und des p75^NGFR-Antisense-Oligonucleotids (RAT AS, gezeigt in der Legende zu Tabelle 1), ausgedrückt relativ zur Anzahl von Neuronen, die in Gegenwart des entsprechenden Sense-Oligonucleotids überlebten. Man erkennt, dass die Antisense-Behandlung die NGF-abhängige Überlebensrate in E12 und E15, aber nicht wesentlich in E19 oder P2 senkte. Einzelzellen wurden hergestellt und mit dem geeigneten Oligonucleotid wie bei 1B behandelt und in geringer Zelldichte (ungefähr 50 Zellen pro Napf für E15-P2, 300 für E12) in Terasaki-Platten in Monomed (CSL, Australien) plus 10 Vol.-% fetales Kälberserum ausgestrichen. Die Zahl der Zellen wurde zu Beginn und am Ende der Experimente bestimmt, und das Überleben der Neuronen, das anhand von phasenmikroskopischen Kriterien der neuronalen Morphologie, der Phasenhelligkeit, der cytoplasmatischen Integrität und der Nichtkörnigkeit beurteilt wurde, wurde bestimmt. Um die Richtigkeit des Zählverfahrens festzustellen, wurden die Zählungen anfangs "blind" von 2 erfahrenen Zellzählern durchge führt, in fast allen Fällen mit einer engen Übereinstimmung der Ergebnisse. Dieser Vergleich der Zählergebnisse durch verschiedene Beobachter wurde in Abständen wiederholt, um zu gewährleisten, dass die Genauigkeit beibehalten wurde. Balken und Fehlerbalken stellen Mittelwerte und Standardabweichungen für 6 oder mehr individuelle Assays dar. Die Oligonucleotidkonzentration betrug 10 μM bei E12 und 5 μM in allen anderen Stadien (10 μM erwies sich bei E12 als optimal).
Es zeigte sich, dass die Überlebensrate von sensorischen Neuronen im Stadium E12 und E15 in Gegenwart einer hohen Konzentration (z.B. > 5 ng/ml) von exogen hinzugefügtem NGF durch Behandlung mit Antisense-Oligonucleotiden im Vergleich zu Neuronen, die mit Sense(oder Nonsense)-18mer-Oligonucleotiden behandelt wurden, merklich gesenkt wurde (2). Es gab jedoch keine wesentliche Abnahme der Überlebensrate von sensorischen Neuronen im Stadium E19 und P2 nach der Antisense-Behandlung (2), obwohl sich gezeigt hat, dass DRG-Neuronen bis wenigstens P2 in hohem Maße NGF-abhängig bleiben (4, 5). Dieses Ergebnis zeigte, dass sensorische Neuronen im Stadium der Zielfeldinnervation p75^NGFR für das NGF-vermittelte Überleben erfordern, während sensorische Neuronen in späteren Entwicklungsstadien unbeeinflusst scheinen, obwohl, wie oben gezeigt, die Antisense-Behandlung die p75^NGFR-Expression in P2 erheblich reduzierte. Diese Ergebnisse zeigten auch, dass die relative Häufigkeit von p75^NGFR-Molekülen auf P2-Neuronen für das NGF-vermittelte Überleben nicht erforderlich war, was vermuten lässt, dass dieser Rezeptor vielleicht eine andere Rolle in der Zellfunktion spielt.
Beispiel 4
Um die Rolle von p75^NGFR näher zu untersuchen, wurden Antisense-behandelte Neuronen in Abwesenheit von zugesetztem NGF kultiviert. Wie erwartet, führte dies zum schnellen Tod von E12- und E15-Neuronen. Überraschenderweise jedoch zeigten die sensorischen P2-Neuronen eine merkliche Erhöhung (> 50%) ihrer Überlebensrate im Vergleich zu Sense-Kontrollen (3 und Tabelle 1). Die apoptotische Natur des DRG-Zelltods in P2 wurde durch die Fähigkeit von Cycloheximid bestätigt, den Tod bei nicht mit NGF behandelten Zellen zu verhindern (3). Bei einer Dosis-Wirkungs-Analyse wurde festgestellt, dass die Antisense-vermittelte Überlebensrate bei einer Antisense-Konzentration von 5 μM optimal war. (Die Überlebensrate betrug 19 ± 4% ohne Antisense, 29 ± 3% bei 0,5 μM, 47 ± 5% bei 2 μM, 50 ± 5% bei 5 μM und 31 ± 6% bei 10 μM Antisense). Diese Wirkung wurde in der vorliegenden Analyse ausgeschlossen, indem man Sense- und Antisense-behandelte Kulturen anstelle von nicht mit Oligonucleotiden behandelten Kontrollen als Kontrollen verwendete. Eine erhöhte Überlebensrate wurde bei allen sieben Antisense-Experimenten beobachtet, bei denen sensorische Neuronen von P2-Mäusen beteiligt waren, und ähnliche Wirkungen wurden bei sensorischen Neuronen von Ratten und Hühnern beobachtet, die in einem vergleichbaren Entwicklungsstadium entnommen wurden (Tabelle 1). Weiterhin wurde insofern eine Spezies-Sequenzspezifität beobachtet, als die Hühner-Antisense-Sequenz keine Wirkung auf Rattenzellen, aber eine dramatische Wirkung auf Hühnerzellen hatte. Sowohl Hühner- als auch Ratten-Antisense-Oligonucleotide verstärkten die Überlebensrate bei Mäusen, doch war die Wirkung bei der Rattensequenz ausgeprägter. Bei mehreren Spezies erhöhte das Herunterregulieren von p75^NGFR also die Überlebensrate der Zellen, was impliziert, dass dieser Rezeptor in einem speziellen Entwicklungsstadium den Zelltod fördert. Die Immunfärbung bestätigte, dass überlebende Zellen in Antisense-Kulturen eine merkliche Herunterregulation von p75^NGFR zeigten. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass diese Wirkung auf die Gegenwart eines unidentifizierten Liganden im Serum zurückzuführen war, wurde das Experiment in Abwesenheit von Serum wiederholt. Die Erhöhung der Überlebensrate aufgrund der Antisense-Behandlung war in Abwesenheit von Serum nicht reduziert. Weiterhin war der Überlebenseffekt anscheinend unabhängig von einer Kontamination durch Gliazellen, da die Kontamination durch Gliazellen in Abwesenheit von Serum vernachlässigbar war. Selbst in Anwesenheit von Serum trat der Überlebenseffekt sowohl in Rattenkulturen (erhebliche Kontamination durch Gliazellen) als auch in Mauskulturen (Kontamination durch Gliazellen kleiner als 10%) auf. Die Fähigkeit von Antisense-Sequenzen, die Überlebensrate ohne Serum und unabhängig vom Grad der Kontamination durch Gliazellen zu fördern, spricht gegen die Deutung, dass es einen anderen Liganden gibt oder dass das Herunterregulieren von p75^NGFR die Überlebensrate dadurch fördert, dass es die Bindung eines größeren Anteils von hypothetischen Spurenmengen von NGF in den Kulturen an trkA ermöglicht. Die letztere Möglichkeit wurde dadurch definitiv ausgeschlossen, dass gezeigt wurde, dass die Zugabe von Anti-NGF-Antikörper den Antisense-induzierten Überlebenseffekt nicht reduzierte (Tabelle 1).
Beispiel 5
Analyse des Umschaltens der p75^NGFR-Funktion
Das ungefähre Stadium, in dem das Umschalten der p75^NGFR-Funktion erfolgt, wurde durch Experimente aufgeklärt, die an sensorischen Maus-Neuronen im E19-Stadium durchgeführt wurden. In diesem Fall verstärkte die Behandlung mit Antisense-Oligonucleotiden in Abwesenheit von NGF ihre Überlebensrate nicht (Tabelle 1). Wenn sie jedoch anfangs in Gegenwart von geringen Konzentrationen an NGF (1 ng/ml) kultiviert wurden, um ihre kurzfristige Überlebensrate zu fördern, verhielten sich die Antisense-behandelten Neuronen anschließend ähnlich wie P2-Neuronen und zeigten eine signifikante Erhöhung der Überlebensrate im Vergleich zu Sense-Kontrollen, was mit der Zeit in Kultur offensichtlicher wurde (4). Diese Ergebnisse beweisen, dass etwa im E19-Stadium eine fundamentale Veränderung der p75^NGFR-Funktion von einer Vermittlung der Neuronen-Überlebensrate zur Einleitung des Zelltodes stattfindet. Die Fähigkeit, den Zelltod in P2 zu fördern, wurde nur in Abwesenheit einer hohen Konzentration von exogen hinzugefügtem NGF beobachtet.
Beispiel 6
Der p75^NGFR-Rezeptor ist wichtig für die Übermittlung des Überlebenseffekts von NGF während der Phase der neuronalen Zielfindung (ungefähr E13 bis E17). Da trkA während dieser Zeit in hohem Maße exprimiert wird (7), steht dieses Ergebnis im Einklang mit der Hypothese, dass der hochaffine NGF-Rezeptor sowohl p75^NGFR als auch trkA erfordert. Die Rolle von p75^NGFR bei der Vermittlung der NGF-Reaktion zu diesem Zeitpunkt ist wahrscheinlich nicht auf seine postulierte Lokalisierungs- oder Rekrutierungsrolle zurückzuführen (9), da die Zellen in diesen Experimenten in einer hohen Konzentration von NGF schwammen, und eine Lokalisierungsrolle wäre überflüssig. Es zeigte sich, dass p75^NGFR in der frühen postnatalen Zeit eine entgegengesetzte Rolle spielt, nämlich die der Förderung des Zelltods, aber nur in Abwesenheit von hohen NGF-Konzentrationen. Die Umkehrung der Rolle von p75^NGFR fällt mit dem Herunterregulieren von trkA-mRNA in P2-DRG auf Niveaus, die durch PCR nicht mehr nachgewiesen werden können, zusammen (4B). Eine Hypothese, um diese Ergebnisse zu erklären, besteht darin, dass p75^NGFR in Gegenwart von trkA mit diesem wechselwirkt und einen hochaffinen Komplex bildet, der das NGF-Überlebenssignal übermitteln kann, dass es aber in Abwesenheit von trkA als konstitutives Todessignal wirkt. Es kann also sein, dass p75^NGFR ein Signal für programmierten Zelltod vermittelt, aber nur wenn NGF fehlt oder in geringer Konzentration vorhanden ist. Bei in-vitro-Experimenten bedeutet "hohe Konzentrationen" an NGF höhere als die endogenen Konzentrationen, wie > 3-5 ng/ml und vorzugsweise > 20 ng/ml. Eine "niedrigere Konzentration" bedeutet normale endogene Konzentrationen. Die Anwesenheit von NGF kann verhindern, dass p75^NGFR die Apoptose induziert. Dies würde auch die NGF-Abhängigkeit von P2-DRG-Neuronen trotz der Abwesenheit von trkA erklären. Die Mechanismen, gemäß denen p75^NGFR die Apoptose einleiten kann und NGF diesen Vorgang verhindert, sind unklar.
Beispiel 7
In-vivo-Modell
Junge Wistar-Ratten beiderlei Geschlechts am 4. postnatalen Tag (P4) liefern ein zweckmäßiges in-vivo-Modell zum Testen der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung. Die Jungtiere wurden unter eisinduzierter Anästhesie operiert. Die linken Hüft- und Armnerven jedes Jungtiers wurden freigelegt und unter Verwendung einer Iridektomieschere axotomisiert. Der proximate Stumpf des Hüftnervs wurde mit einem 1 mm³ großen Stück mit Pluronic-Gel (z.B. 20%) getränktem Gelschaum (Upjohn), der Sense- oder Antisense-Oligonucleotide oder PBS enthielt, umwickelt. Der kontralaterale Hüftnerv und DRG dienten als intakte Kontrollseite. Eine Naht mit 5-0-Ethicon-Seide wurde verwendet, um den Hauteinschnitt zu schließen. Dann wurden die Jungtiere gewärmt, bis sie voll bei Bewusstsein waren, und dann wurden sie zu ihren Müttern zurückgegeben. Die Wirksamkeit der Hüftnerv-Axotomie war anhand der postoperativen Ataxie des Hinterbeins zu erkennen, und die Vollständigkeit der Nervendurchtrennung wurde durch postmortale Sektion bestätigt.
Nach 5 Tagen wurden die Tiere tief anästhetisiert und dann transkardial mit 4-Vol.-%igem Paraformaldehyd und 0,5%igem (w/v) Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumphosphatpuffer bei pH 7,3 perfundiert. Unmittelbar nach der Perfusion wurde die Wirbel, die über den lumbalen DRGs liegen, entfernt, und das ganze Tier wurde über Nacht in dasselbe Fixiermittel eingetaucht. Am nächsten Tag wurden das linke (axotomisierte) und rechte (intakte) L5- oder C8-DRG entnommen und weitere 24 h lang nachfixiert. Diese DRGs wurden dann dehydratisiert und in Paraffin eingebettet. Serien von 8 μm dicken Schnitten wurden angefertigt und auf gelatinisierten Objektträgern montiert und in 0,1%igem (w/v) Kresylviolett angefärbt.
Neuronen, die einen erkennbaren Nucleolus aufwiesen, wurden bei einer 400fachen Endvergrößerung mit einer Netzplatte gezählt, die in das Okular eines Leitz-Mikroskops eingesetzt wurde. Zählungen wurden an jedem fünften oder zehnten Schnitt durchgeführt. Die Rohzählergebnisse wurden um mehrfache Nucleoli und dann um aufgespaltene Nucleoli korrigiert, wobei man die Formel nach Abercrombie verwendete. Messungen des mittleren Nucleolusdurchmessers zeigten, dass axotomisierte Neuronen keine geschrumpften Nucleoli aufwiesen. Der Anteil der verlorenen Neuronen wurde wie folgt als Prozentwert berechnet:
Um eine genaue Abschätzung des neuronalen Verlusts zu gewährleisten, wurden zwei Schritte durchgeführt. Erstens betrug die Schnittdicke etwa das Vierfache der größten Nucleolushöhe. Dieser Faktor liegt weit oberhalb des kritischen Faktors von 1,5, der benötigt wird, um zu gewährleisten, dass der Abercrombie-Korrekturfaktor zuverlässig ist und kein schwerer systematischer Fehler auftritt (10). Zweitens wurden stets kontralaterale Kontrollen verwendet, und alle Vergleiche zwischen Tieren beruhten auf Verhältnis- und nicht auf Absolutwerten. Wenn Verhältniswerte verwendet werden, ist der Korrekturfaktor nach Abercrombie nicht notwendig, da alle in das Zählergebnis einfließenden systematischen Fehler beiden Seiten gemeinsam sein sollten und sich herauskürzen, wenn das Verhältnis berechnet wird.
Die Mittelwerte und die Standardfehler des Mittelwerts (SE) wurden für jede Gruppe berechnet, und statistische Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bestimmt, indem man den Student-t-Test verwendete.
Beispiel 8
Überlebensrate von Neuronen in vitro in Gegenwart von p75^NGFR-Antisense-Oligonucleotiden
P2-Maus-DRG-Neuronen wurden wie oben beschrieben präpariert und kultiviert, und die Überlebensrate wurde nach 4 Tagen in Gegenwart einer hohen Konzentration (etwa 50 ng/ml) NGF (ohne Oligonucleotide) oder eines von zwei verschiedenen p75^NGFR-Antisense-Oligonucleotiden (ohne NGF) bewertet. Die Oligonucleotide waren 5'-ACCTGCCCTCCTCATTGCA-3' (SEQ ID Nr. 1), das in 6 als "5-AS" bezeichnet ist, und 5'-AGTGGACTCGCGCATAG-3' (SEQ ID Nr. 4), das in 6 als "3-AS" bezeichnet ist.
Ein Kontroll-Nonsense-Oligonucleotid (verwürfeltes Antisense-Oligonucleotid) mit der Sequenz 5'-CTCCCACTCGTCATTCGAC-3' (SEQ ID Nr. 9) wurde ebenfalls verwendet. Die Überlebensrate wurde durch Anwendung von entweder NGF oder p75^NGFR-Antisense-Oligonucleotiden verstärkt, während die Anwendung eines Kontrolloligonucleotids mit statistischer Sequenz die Überlebensrate im Vergleich zu der "kein-Oligo"-Gruppe nicht erhöhte (6).
Eine 26mer-Antisense-Sequenz zu Ratten-p75^NGFR auf der Grundlage der 5'-Bereiche (5'-CATTGCACGCCTCCGGCGTCAGCGCT-3', SEQ ID Nr. 8) wurde in getrennten Experimenten versucht und erwies sich als wirksam, aber weniger als das oben beschriebene 18mer.
Die meisten der verwendeten Oligonucleotide wurden aus mehr als einer Synthese über die Dauer der Experimente hinweg erhalten, und in jedem Fall war die Wirkung der Oligonucleotide aus verschiedenen Synthesen konstant. Die Oligonucleotide wurden durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt, in Acetonitril eluiert, zweimal Iyophilisiert und in H₂O rekonstituiert, um flüchtige Verunreinigungen zu entfernen, und dann vor der Verwendung durch Filtration auf Sephadex-G25-Gel weiter gereinigt.

* p < 0,05, Student-t-Test.
** p < 0,05 für jedes von 7 Experimenten.

Beispiel 9
Aufbau von neuronalen Zelllinien, die definierte Mengen von p75^NGFR exprimieren
Die folgenden Zelllinien wurden erzeugt:

1) PC12-2CL: Diese Linie wies eine sehr geringe p75^NGFR-Expression auf und stirbt dementsprechend nicht, wenn NGF entzogen wird.
2) PC12-2CH: Mäßiges Niveau der p75^NGFR-Expression, aber recht schneller Tod, wenn NGF entzogen wird.
3) PC12-4A und PC12-4B: Hohes Niveau der p75^NGFR-Expression und rascher Tod nach NGF-Entzug.
4) PC12-4BS: Sehr hohes Niveau der p75^NGFR-Expression und sehr rascher Tod nach NGF-Entzug.
5) PC12-4BRS: Höchstes Niveau der p75^NGFR-Expression und äußerst rascher Tod nach NGF-Entzug.

1) PC12-4BRS: Sehr hohe p75^NGFR-Expression.
PC12-Zellen wurden durch Elektroporation stabil mit einem p75^NGFR-Expressionskonstrukt transfiziert. Die Zellen wurden durch Elektroporation mit der "geo"cDNA (die ein Neomycin-Resistenz-Gen mit dem Gen für beta-Galactosidase kombiniert) cotransfiziert. Kolonien wurden in Gegenwart von Geneticin erhalten und kloniert, wobei man neue Zelllinien erhielt, die dann charakterisiert wurden. Anfangs wurden die Zellen unter Verwendung von Immunoperoxidase nach Fixierung auf p75^NGFR angefärbt, und auf dieser Basis wurden zwei Linien für die weitere Entwicklung ausgewählt. Diese wurden dann einer FACS-Sortierung und Amplifikation unterzogen, und die oberen 15% der p75^NGFR-exprimierenden Zellen wurden zurückgehalten, so dass man eine Linie mit hohem Expressionsniveau (PC12-4AS und PC12-4BS) erhielt. Einige Zellen wurden zurückgehalten, in Kultur expandiert, und der FACS-Sortierungsvorgang wurde dreimal wiederholt, so dass man eine PC12-Variante erhielt, die p75^NGFR auf sehr hohem Niveau exprimiert (PC12-4BRS). In jeder Runde der FACS-Sortierung wurden nur die oberen 15% der p75^NGFR-exprimierenden Zellen zurückgehalten. Es war stets notwendig, die Zellen in hoher Serumkonzentration und in Abwesenheit von NGF zu halten, um die Entwicklung eines neuronalen Phänotyps zu verhindern.
Nach jeder Sortierung wurden Zellen im oberen 15%-Intervall der p75^NGFR-Expression in Aliquoten eingefroren.
PC12-4AS-, PC12-4BS- und PC12-4ARS-Zellen wurden aufgetaut, in Kultur gezüchtet, und es wurde durch Anfärben mit Immunoperoxidase gezeigt, dass sie p75^NGFR-Expression auf hohem Niveau beibehalten.
PC12-2C-Zellen mit hoher und niedriger Expression wurden aus transfizierten Kontroll-PC12-Zellen erhalten, d.h. Zellen, die mit dem geo-Gen, aber nicht mit p75^NGFR transfiziert waren. Sie exprimierten daher nur das endogene p75^NGFR-Gen. Diese wurden sortiert, und die 15% Zellen mit der höchsten Expression wurden isoliert und sowohl sofort für Experimente verwendet als auch in Aliquoten eingefroren. Diese Zellen wurden PC12-2CH genannt. Ähnlich wurden die 15% Zellen mit dem geringsten Expressionsniveau isoliert und sowohl sofort für Experimente verwendet als auch in Aliquoten eingefroren. Diese Zellen wurden PC12-2CL genannt. Eine Northern-Blot-Analyse bestätigte die Niveaus der p75^NGFR-Expression in jeder Linie. In absteigender Reihenfolge der p75^NGFR-Expression: PC12-4BRS, PC12-4B, PC12-2CH, PC12-2CL.
Beispiel 10
p75^NGFR-induzierter Zelltod und Rettung durch Herunterregulieren der p75^NGFR-Expression durch Antisense-Oligonucleotide
Bei PC12-Zellen kann die Differenzierung zu Neuronen induziert werden, indem man Serum entzieht und NGF hinzugibt. Sie werden dann NGF-abhängig und sterben nach NGF-Entzug ab.
Um die Rolle des p75^NGFR näher zu analysieren, wurden die in Beispiel 9 beschriebenen neuronalen Zelllinien analysiert. Diese Zelllinien wurden so gestaltet, dass sie definierte Mengen an p75^NGFR exprimierten, aber in allen anderen Aspekten identisch waren.
Ein NGF-Entzugs-Experiment wurde durchgeführt, wobei man drei dieser Zelllinien verwendete:
PC12-4BRS (höchste p75^NGFR-Expression)
PC12-2CH (hohe p75^NGFR-Expression)
PC12-2CL (niedrige p75^NGFR-Expression)
Nach dem Entzug von NGF überlebten die Zellen mit niedriger p75^NGFR-Expression, während diejenigen mit höheren Niveaus starben. Weiterhin nahm die Todesrate mit steigender p75^NGFR-Expression zu (7). Ab dem Zeitpunkt des NGF-Entzugs (wenn der Zelltod beginnt) wurde Anti-NGF-Antikörper hinzugefügt, um die Deutung auszuschließen, dass p75^NGFR als "NGF-Schwamm" wirkte.
Diese Ergebnisse zeigten, dass p75^NGFR den neuronalen Tod in einer Zelllinie induziert, die normalerweise sowohl p75^NGFR als auch trkA exprimiert. Überdies ist es der Überschuss an p75^NGFR, der bei der Induktion des Todes entscheidend ist. Wenn es im Überschuss vorhanden war, induzierte p75^NGFR den Tod, und die Todesrate hing von der Menge an p75^NGFR ab.
Ein Antisense-Experiment wurde ebenfalls durchgeführt. Durch die Behandlung mit p75^NGFR-Antisense-Oligonucleotid wurde die Überlebensrate von PC12-Neuronen (die p75^NGFR auf normalem Niveau exprimieren) in Abwesenheit von NGF erhöht (8).
Beispiel 11
In-vivo-Modelle zum Testen von Antisense-Oligonucleotiden
Die folgenden in-vivo-Modelle für Nervenverletzungen können verwendet werden, um das Antisense-Oligonucleotid der vorliegenden Erfindung zu testen.
1) Verletzung durch Durchtrennung von peripheren Nerven und Verletzung durch Zerquetschen von peripheren Nerven
Diese Läsionen induzieren den Tod von sensorischen und motorischen Neuronen. Beide Läsionen werden bei Hüft- und Armnerven erzeugt, und Neuronenzählungen werden bei spinalen Neuronen auf dem L5- bzw. C8-Niveau unternommen. Die Wichtigkeit dieser Läsionsmodelle besteht darin, dass die betroffenen Neuronen p75^NGFR exprimieren und NGF-empfindlich sind.
2) Fimbria-Fornix-Läsion
Diese wird durch stereotaktische Ablation durchgeführt, die spezielle Geräte und Fachkenntnisse erfordert. Dies gilt als bestes Tiermodell, um Alzheimer-Krankheit bei Ratten zu untersuchen: Die Fimbria-Fornix-Läsion induziert den Tod der cholinergischen Vorderhirnneuronen, die die hauptsächlichen p75^NGFR-exprimierenden Neuronen im Gehirn sind und die der primäre Brennpunkt der Alzheimer-Krankheit sind.
Beispiel 12
Aufnahme und Transport von Antisense-Oligonucleotiden durch Neuronen
Es zeigte sich, dass biotinylierte Antisense-p75^NGFR-Oligonucleotide von axotomisierten sensorischen Neuronen retrograd transportiert werden. Sensorische Neuronen in den lumbalen Hinterwurzelganglien lassen sich normalerweise nicht auf Biotin anfärben. Nach der Injektion von biotinmarkierten Antisense-p75^NGFR-Oligonucleotiden in den proximalen Stumpf des Hüftnervs sind jedoch viele Neuronen biotinpositiv (7). In diesen Experimenten wurden biotinylierte Oligonucleotide in den proximalen Stumpf des durchtrennten Hüftnervs von neugeborenen Ratten injiziert, und der Stumpf wurde abgebunden. Die Injektionen wurden unter Verwendung einer Glasmikropipette mit Spitzendurchmessern im Bereich von 50-100 mm durchgeführt, und der Inhalt wurde mit pneumatischen Mitteln mit Hilfe eines Picospritzers ausgestoßen. Nach 7 Tagen wurden die Tiere schnell mit 2% Paraformaldehyd perfundiert, und die ipsilateralen und kontralateralen L4- und L5-Hinterwurzelganglien wurden entfernt. Die Ganglien wurden in Tissue-Tek gelegt und in stickstoffgekühltem Isopentan eingefroren. Schnitte in einer Dicke von 10 mm wurden angefertigt und auf AES-beschichteten Objektträgern montiert und unter Verwendung des Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexes (Vectstain Elite Kit, Vector Laboratories) angefärbt.
Beispiel 13
In-vivo-Herunterregulierung von p75^NGFR durch Antisense-Oliaonucleotide
Durch die Behandlung mit Antisense-p75^NGFR-Oligonucleotide wurde die Expression von p75^NGFR-Protein in axotomisierten sensorischen Neuronen in den lumbalen Hinterwurzelganglien reduziert. In intakten Hinterwurzelganglien (die nicht mit Antisense-Oligonucleotiden behandelt wurden) gab es eine große Zahl von p75^NGFR-positiven Neuronen (8A), während es in den axotomisierten Hinterwurzelganglien, die mit p75^NGFR-Antisense-Oligonucleotiden behandelt wurden, eine merkliche Reduktion der Anzahl der p75^NGFR-positiven Zellen gab. Der niedrigaffine NGF-Rezeptor wurde nach Fixierung des Gewebes in Paraformaldehyd und Methanol unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers MC 192 (Boehringer Mannheim) sichtbar gemacht.
Die Wirkung von p75^NGFR-Antisense-Oligonucleotiden auf die Expression von p75^NGFR wurde quantifiziert, indem man p75^NGFR-positive Hinterwurzelganglienzellen nach Behandlung mit PBS, Sense- und Antisense-Oligonucleotiden zählte. Die Prozentanteile der p75^NGFR-positiven Neuronen in lumbalen Hinterwurzelganglien sind in 8B gezeigt. In den PBS- und Sense-Kontrollgruppen sind ungefähr 64% der sensorischen Neuronen p75^NGFR-positiv. Man beobachtet jedoch eine drastische Reduktion der Anzahl von p75^NGFR-positiven Zellen bei Tieren, die mit Antisense-p75^NGFR-Oligonucleotiden behandelt wurden. Die Gesamtzahl der Neuronen, die pro Gruppe gezählt wurden, betrug 224(PBS), 233(Sense), 163 (Antisense).
Beispiel 14
Die Verhinderung des in-vivo-Verlusts von axotomisierten sensorischen Neuronen wurde nach der Behandlung mit p75^NGFR-Antisense-Oligonucleotiden nachgewiesen (5). Der Armnerv (mediane oder ulnare Nerven) oder der Hüftnerv wurden bei 3 Tage alten Ratten durchtrennt und mit kleinen Gelfoam- Stücken von ungefähr 1 mm³ behandelt, die mit 20%iger Pluronic-Gellösung (BASF), die PBS oder 50 μM Oligonucleotid enthielt, getränkt waren.
5 fasst das Ausmaß des Verlusts von axotomisierten sensorischen Neuronen bei zervikalen (C8) und lumbalen (L5) Hinterwurzelganglien zusammen. Bei den Sense- und PB5-behandelten Kontrolltieren betrug der Verlust etwa 40%. Die Behandlung mit Antisense-Oligonucleotiden reduzierte den Verlust jedoch drastisch in beiden Ganglien auf etwa 15%, was eine Rettung von 70% der Neuronen, die ansonsten gestorben wären, darstellt.
Die verwendeten Oligonucleotide waren wie folgt: Ratten-3'-AS (SEQ ID Nr. 4) und Ratten-3'-Sense (SEQ ID Nr. 5).
Nach 5 Tagen wurden die Tiere transkardial mit 2%igem Paraformaldehyd perfundiert, das zervikale (C8) und das lumbale (L5) DRG wurden herausgeschnitten, und die Neuronen wurden gezählt, wie es in Beispiel 7 beschrieben ist. Statistische Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit Hilfe des Student-t-Tests abgeschätzt.
Tabelle 1
Legende zu Tabelle 1
Verstärkung der Überlebensrate von Antisense-behandelten DRG-Neuronen nach 48-60 Stunden in Abwesenheit von NGF. Experimente wurden in Anwesenheit von 10% FBS durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist. Lebensfähige Zellen wurden jeweils für die Antisense- und die Kontrollkultur nach dem Ausstreichen und nach 48-60 Stunden in einzelnen Terasaki-Näpfen gezählt. Die Ergebnisse sind als Erhöhung der Überlebensrate mit Antisense-Behandlung im Vergleich zu den Kontrollkulturen ausgedrückt (die entweder Sense oder Nonsense-Oligonucleotide enthielten: In zahlreichen Experimenten wurde festgestellt, dass es keinen Unterschied in der Überlebensrate zwischen den Sense- (SEQ ID Nr. 5) und den Nonsense-Kulturen (SEQ ID Nr. 7) (statistische Sequenz) gab), um die zusätzlichen Variationen auszuschließen, die zwischen den Überlebensraten bei Nicht-Oligonucleotid-behandelten Kulturen und Oligonucleotid-behandelten Kontrollkulturen beobachtet wurden. Repräsentative absolute Überlebensraten aus einem der P2-Maus-DRG-Experimente mit Serum waren 21,6% (unbehandelt), 28,9% (Nonsense), 51% (Antisense), 48% (NGF 5 ng/ml, kein Oligonucleotid) und 64% (NGF 50 ng/ml). Antisense-Oligonucleotide (5 μM) gegen Ratten-p75^NGFR-mRNA (Ratten-AS (SEQ ID. Nr. 4)) erhöhten die Überlebensrate von P2-Mausneuronen in 7 Experimenten um durchschnittlich 58%, obwohl in einigen Experimenten auch Erhöhungen von ungefähr 100% beobachtet wurden. Ein monoklonaler Anti-NGF-Antikörper (Boehringer, Deutschland) wurde bei 4 der P2-Experimente hinzugefügt, und es zeigte sich, dass er diesen Effekt nicht reduzierte. Eine Erhöhung der Überlebensrate trat auch bei Mauskulturen auf, bei denen die Hühner-Antisense-Sequenz (Hühner-A5 (SEQ ID Nr. 6)) verwendet wurde, wenn auch in geringerem Maße als bei der Ratten-AS. Bei P2-Ratten-Neuronen verursachte nur Ratten-A5 eine Erhöhung der Überlebensrate, während Hühner-AS in der Lage war, die Überlebensrate in Kulturen von E11-Hühner-DRG-Neuronen zu erhöhen (entwicklungsmäßig ähnlich dem P2-Stadium bei der Ratte). Die Überlebensrate-verstärkende Wirkung der p75^NGFR-Antisense-Behandlung trat bei Maus-DRG in E12, E15 oder E19 nicht auf. In allen Fällen wurden 18-mer-Phosphorothioat-Oligonucleotide verwendet, und die gewählten Sequenzen waren gegen das 3'-Ende des codierenden Bereichs gerichtet.
Der Fachmann wird sich darüber im Klaren sein, dass die hier beschriebene Erfindung auch anderen Variationen und Modifikationen als den hier spezielle beschriebenen zugänglich ist. Man sollte sich darüber im Klaren sein, dass die Erfindung alle solche Variationen und Modifikationen umfasst. Die Erfindung umfasst auch alle Schritte, Merkmale, Zusammensetzungen und Verbindungen, auf die in dieser Beschreibung einzeln oder kollektiv Bezug genommen oder hingewiesen wird, sowie beliebige und alle Kombinationen von irgend zwei oder mehr der Schritte oder Merkmale.
Literatur

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Sequenzprotokoll

Claims

Antisense-Oligonucleotid zu dem Gen, das den Rezeptor des Nervenwachstumsfaktors (NGF) mit niedriger Affinität p75^NGFR codiert, welches wie in SEQ ID Nr. 1 definiert ist oder unter Bedingungen hoher Stringenz mit dem reversen Komplement von SEQ ID Nr. 1 hybridisiert, zur Verwendung bei der Prophylaxe und/oder Behandlung von neurodegenerativen Zuständen, die mit Krankheit und/oder Verletzung bei einem Säuger verbunden sind, wobei das Antisense-Oligonucleotid die Expression von p75^NGFR in einem Neuron herunterreguliert.
Antisense-Oligonucleotid zu dem Gen, das den Rezeptor des Nervenwachstumsfaktors (NGF) mit niedriger Affinität p75^NGFR codiert, welches wie in SEQ ID Nr. 4 definiert ist oder unter Bedingungen hoher Stringenz mit dem reversen Komplement von SEQ ID Nr. 4 hybridisiert, zur Verwendung bei der Prophylaxe und/oder Behandlung von neurodegenerativen Zuständen, die mit Krankheit und/oder Verletzung bei einem Säuger verbunden sind, wobei das Antisense-Oligonucleotid die Expression von p75^NGFR in einem Neuron herunterreguliert.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 1, das etwa 10 bis weniger als etwa 26 Nucleotide umfasst und auf den 5'-Endteil des p75^NGFR-Gens gerichtet ist.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 2, das etwa 10 bis weniger als etwa 26 Nucleotide umfasst und auf einen Bereich gerichtet ist, der das Stopcodon des p75^NGFR-Gens umfasst und/oder diesem benachbart ist.
Oligonucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, das ein Phosphorothioat-Oligonucleotid ist oder das mit lipophilen Gruppen, Mesotetracarboxyporphin, Poly-L-lysin oder über Poly-L-lysin mit einem Protein konjugiert ist.
Oligonucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Neuronen sensorische Neuronen, sympathische Neuronen, cholinerge Neuronen des zentralen Nervensystems, motorische Neuronen oder Kleinhirnneuronen sind.
Oligonucleotid gemäß einem der vorstehenden Ansprüche zur Verwendung zur Erleichterung des Überlebens von Neuronen bei einem Säuger.
Oligonucleotid gemäß Anspruch 7, wobei der Säuger ein Mensch, ein Nutztier, ein Laborversuchstier oder ein gefangenes Wildtier ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen gelgetränkten Schaum umfasst, der ein Oligonucleotid enthält, das in der Lage ist, die Expression von p75^NGFR in Neuronen herunterzuregulieren, wobei das Oligonucleotid wie in SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 4 definiert ist oder unter Bedingungen hoher Stringenz mit dem reversen Komplement von entweder SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 4 hybridisieren kann.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 9, wobei das Oligonucleotid ein Phosphorothioat-Oligonucleotid ist.
Verwendung eines Oligonucleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, das in der Lage ist, die Expression von p75^NGFR in Neuronen herunterzuregulieren, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prophylaxe von neurodegenerativen Zuständen, die mit Krankheit und/oder Verletzung bei einem Säuger verbunden sind.
Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei der Säuger unter einem Zustand leidet, der aus Zerebralparalyse, traumainduzierter Paralyse, mit einem Schlaganfall verbundener vaskulärer Ischämie, neuronalen Tumoren, Motorneuronerkrankung, Parkinson-Krankheit, Chorea Huntington, Alzheimer-Krankheit, multipler Sklerose und peripheren Neuropathien ausgewählt ist.
Oligonucleotid: (i) das in der Lage ist, die Expression von p75^NGFR in Neuronen herunterzuregulieren; und (ii) unter Bedingungen hoher Stringenz mit dem reversen Komplement von SEQ ID Nr. 1 hybridisiert.