DE69428054T2

DE69428054T2 - HUMANE OXALYL-CoA DECARBOXYLASE

Info

Publication number: DE69428054T2
Application number: DE69428054T
Authority: DE
Inventors: Mark D. Adams; Timothy A. Coleman; Henrik Olsen
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-05-18
Filing date: 1994-05-18
Publication date: 2002-06-06
Anticipated expiration: 2014-05-19
Also published as: EP0764204A1; EP0764204B1; DE69428054D1; EP0764204A4; AU7470494A; WO1995031537A1; JPH10500019A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft kürzlich identifizierte Polynucleotide, durch solche Polynucleotide codierte Polypeptide, die Verwendung solcher Polynucleotide und Polypeptide, wie auch die Herstellung solcher Polynucleotide und Polypeptide. Insbesondere ist das Polypeptid der vorliegenden Erfindung menschliche Oxalyl-CoA-Decarboxylase.
Es liegen Anhaltspunkte vor, die nahe legen, dass die Bildung von Calciumoxalatsteinen im Harn von den Sättigungsgraden sowohl des Calciums als auch des Oxalats abhängig ist, womit die Kontrolle eines oder beider dieser Ionen in Individuen, die für eine Steinbildung im Harntrakt (Urolithiasie) anfällig sind, wichtig erscheint. Urolithiasie ist ein allgemeines Harnwegsproblem, das mehr als 10% der U.S.-Bevölkerung betrifft (Sierakowski, R. et al., Invest. Urol., 15: 438-441 (1978)). Harnsteine werden üblicherweise entsprechend ihrer Zusammensetzung eingeteilt, wobei man am häufigsten den Calciumstein (70%) antrifft, der aus Calciumoxalat alleine oder Calciumoxalat gemischt mit Calciumphosphat zusammengesetzt ist. Obwohl die Ausfällung von Calciumoxalat von einem sowohl mit Calcium- als auch mit Oxalationen im metastabilen Zustand gesättigten Harn abhängig ist, wurde so argumentiert, dass die Oxalatkonzentration für die Bildung der Harnwegs- Calciumoxalatsteine von größerer Bedeutung ist.
Die überwiegende Menge des Oxalats im Plasma und Harn leitet sich aus dem Metabolismus von Ascorbinsäure, Glyoxylat und zu einem geringeren Grad von Tryptophan ab (Nath, R. et al., Pergamon Press, S. 55-58 (1984)). Darüber hinaus werden zwischen 10 und 20% aus der Nahrung absorbiert, insbesondere durch Aufnahme von Blattgemüsen und Pflanzenmaterialien. Glücklicherweise scheint das meiste Nahrungsoxalat durch intraluminales Calcium gebunden zu werden und wird als unlösliches Salz ausgeschieden. Somit gibt es eine umgekehrte Beziehung zwischen aufgenommenen Calcium und absorbierten Oxalat (Ernest D.L. et al., Gastroenterology, 66: 1114-1122 (1964)).
Entweder eine anormale Synthese oder eine Hyperabsorption von Oxalat kann einen ernsten Zustand herbeiführen, der als Hyperoxalurie bezeichnet wird (Liedtke, R.R. et al., Urol. Res., 16: 188-189 (1988)). Obwohl dieser Zustand eine genetische Grundlage haben kann, bleibt eine überaus große Zahl der Fälle idiopatisch (Nath, R. et al., Pergamon Press, S. 55-58 (1984)). Ob die zugrunde liegende Ursache eine Störung im Calciumoxalat- Metabolismus ist oder nur in angestiegenen Mengen Oxalat liegt, es gibt einen starken Zusammenhang zwischen angestiegenen Mengen des Harnwegoxalats und der Calciumoxalatstein-Krankheit beim Menschen.
Die Grundlage der Steinbildung im Harntrakt und Wege zur Behandlung dieser Funktionsstörung waren kürzlich das Thema einer intensiven Untersuchung. Ein aus Pflanzen stammendes Oxalyl-CoA-Decarboxylasegen wurde in menschliche Zellen eingeschleust, um die Oxalatkonzentration im Plasma und im Harn herabzusetzen. Das Oxalyl-CoA- Decarboxylasegen wurde aus dem Bakterium Oxalobacter formigenes cloniert. Lung H.Y. et al., Am. J. Kidney Dis., 17: 381-5 (1991).
Dementsprechend würde ein Enzym, das die Oxalatmenge im Plasma und nachfolgend im Harn erniedrigt, das Auftreten von Calciumoxalatsteinbildung verringern.
Entsprechend einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neues reifes Polypeptid bereitgestellt, welches menschliche Oxalyl-CoA-Decarboxylase ist.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Polynucleotide (DNA oder RNA) bereitgestellt, die solche Polypeptide codieren.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung solcher Polypeptide mittels Rekombinationstechniken bereitgestellt.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verwendung solcher Polypeptide, oder solcher Polypeptide codierenden Polynucleotide, für die Herstellung von Medikamenten, die z.B. zur Verhinderung der Calciumoxalatsteinbildung und Hyperoxalurie nützlich sind, bereitgestellt.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Antikörper gegen solche Polypeptide bereitgestellt.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sollten dem Fachmann aus den hierin gegebenen Lehren erkennbar werden.
Die folgenden Abbildungen dienen der Veranschaulichung der Ausführungsformen der Erfindung.
Fig. 1 zeigt die cDNA-Sequenz und die entsprechende daraus abgeleitete Aminosäuresequenz des reifen Oxalyl-CoA-Decarboxylase-Polypeptides. Es wurde die Dreibuchstaben-Standardabkürzung für Aminosäuren verwendet.
Fig. 2 ist ein Vergleich zwischen den Aminosäuresequenzen der Oxalyl-CoA- Decarboxylase aus Bakterium Oxalobacter formigenes (obere Zeile) und des Polypeptids, das durch die Polynucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung codiert wird (untere Zeile).
Fig. 3 zeigt die. Ergebnisse einer Elektrophorese menschlicher Oxalyl-CoA- Decarboxylase an einem Gel nach der in vitro-Transkription/Translation. Bahn 1 ist eine Plasmidmatrize, die menschliche Oxalyl-CoA-Decarboxylase codiert. Bahn 2 ist eine PCR- erzeugte Matrize, die menschliche Oxalyl-CoA-Decarboxylase codiert und M steht für einen Molekulargewichtsmarker.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte Nucleinsäure (Polynucleotid) bereitgestellt, die das reife Polypeptid mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz aus Fig. 1 oder das reife Polypeptid codiert, das durch die cDNA des mit der ATCC Hinterlegungsnummer 75715 am 18. März 1994 hinterlegten Clons codiert wird.
Das Polynucleotid dieser Erfindung wurde in einer aus der menschlichen Pankreas stammenden cDNA-Bank entdeckt. Es enthält ein offenes Leseraster, das ein reifes Protein von 578 Aminosäuren codiert. Das Protein der vorliegenden Erfindung ist auf Aminosäureniveau zu 50-60% homolog zur Oxalyl-CoA-Decarboxylase aus dem Bakterium Oxalobacter formigenes. Die, Homologie beginnt bei der Aminosäure 8 des Bakterienenzyms (siehe Fig. 2).
Das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann in Form von RNA oder in Form von DNA vorliegen, wobei DNA cDNA, genomische DNA und synthetische DNA einschließt. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein, und wenn sie einzelsträngig ist, kann es der codierende oder nichtcodierende (Antisense-)Strang sein. Die codierende Sequenz, die das reife Polypeptid codiert, kann identisch sein mit der in Fig. 1 gezeigten codierenden Sequenz oder der des hinterlegten Clons, oder kann als Ergebnis der Redundanz oder Degenerierung des genetischen Codes eine davon verschiedene Sequenz sein, die das gleiche reife Polypeptid codiert wie die DNA von Fig. 1 oder die hinterlegte cDNA.
Das Polynucleotid, welches das reife Polypeptid von Fig. 1 codiert oder das durch die hinterlegte cDNA codierte reife Polypeptid kann einschließen: nur die codierende Sequenz für das reife Polypeptid; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid und eine zusätzliche codierende Sequenz, wie eine Leader- oder sekretorische Sequenz oder eine Proproteinsequenz; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid (und gegebenenfalls eine zusätzliche codierende Sequenz) und eine nichtcodierende Sequenz, wie Introns oder eine nichtcodierende Sequenz 5' und/oder 3' der codierenden Sequenz für das reife Polypeptid.
Somit umfasst der Begriff "ein Polypeptid codierendes Polynucleotid" sowohl ein Polynucleotid, das nur eine codierende Sequenz für das Polypeptid beinhaltet, als auch ein Polynucleotid, das eine zusätzliche codierende und/oder nichtcodierende Sequenz einschließt. Somit umfasst die vorliegende Erfindung Polynucleotide, die das gleiche reife Polypeptid, wie in Fig. 1 gezeigt, codieren.
Wie hier vorstehend zum Ausdruck gebracht wird, kann das Polynucleotid eine codierende Sequenz aufweisen, die eine natürlich vorkommende allelische Variante der in Fig. 1 gezeigten codierenden Sequenz ist oder der codierenden Sequenz des hinterlegten Clons. Wie in dem Fachgebiet bekannt ist, ist eine allelische Variante eine alternative Form einer Polynucleotidsequenz, die eine Substitution, Deletion oder Addition eines oder mehrerer Nucleotide aufweisen kann, die die Funktion des codierten Polypeptids nicht wesentlich verändern.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können auch eine codierenden Sequenz aufweisen, die im Raster mit einer Marker-Sequenz fusioniert ist, welche die Reinigung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung ermöglicht. Die Marker-Sequenz kann ein durch einen pQE-9-Vektor bereitgestelltes Hexahistidinanhängsel ("tag") sein, das die Reinigung des mit dem Marker fusionierten reifen Polypeptids im Falle eines bakteriellen Wirts ermöglicht, oder die Marker-Sequenz kann zum Beispiel ein Hämagglutinin (HA)-Anhängsel sein, wenn ein Säugerwirt, z.B. COS-7-Zellen, verwendet wird. Das HA-Anhängsel entspricht einem vom Influenza-Hämagglutinin-Protein abgeleiteten Epitop (Wilson, I. et al., Cell, 37: 767 (1984)).
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Polynucleotide, die mit den hierin vorstehend beschriebenen Sequenzen hybridisieren, wenn mindestens 70% Identität zwischen den Sequenzen besteht. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Polynucleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren. So wie er hier verwendet wird bedeutet der Ausdruck "stringente Bedingungen", dass Hybridisierung nur eintritt, wenn zwischen den Sequenzen mindestens 95%, vorzugsweise mindestens 97% Identität gegeben ist. Die Polynucleotide, die bei einer bevorzugten Ausführungsform mit den hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren, codieren Polypeptide, die im wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität beibehalten, wie das durch die cDNA von Fig. 1 oder die hinterlegte cDNA codierte reife Polypeptid.
Die hier angesprochene(n) Hinterlegung(en) werden aufrechterhalten unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für Patentierungsverfahren.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Oxalyl-CoA-Decarboxylase-Polypeptid, welches die aus Fig. 1 abgeleitete Aminosäuresequenz aufweist oder die durch die hinterlegte cDNA codierte Aminosäuresequenz aufweist.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinantes Polypeptid, ein natürliches Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid sein, vorzugsweise ein rekombinantes Polypeptid.
Die Polypeptide und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt in isolierter Form bereitgestellt und sind vorzugsweise zur Homogenität gereinigt.
Der Ausdruck "isoliert" bedeutet, dass das Material aus seiner ursprünglichen Umgebung (z.B. der natürlichen Umgebung, wenn es in der Natur vorkommt) entfernt wurde. Beispielsweise ist ein in einem lebenden Tier vorhandenes natürliches Polynucleotid oder Polypeptid nicht isoliert, wenn jedoch das gleiche Polynucleotid oder Polypeptid von einigen oder den gesamten im natürlichen System coexistierenden Materialien getrennt vorliegt, ist es isoliert. Solche Polynucleotide können Teil eines Vektors sein und/oder solche Polynucleotide oder Polypeptide können Teil einer Zusammensetzung und noch zu isolieren sein, insofern als ein solcher Vektor oder die Zusammensetzung nicht Teil ihrer natürlichen Umgebung sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung enthalten, Wirtszellen, die mit Vektoren der Erfindung gentechnisch verändert wurden, und die Herstellung von Polypeptiden der Erfindung durch Rekombinationstechniken.
Wirtszellen werden mit den Vektoren der Erfindung, die zum Beispiel Clonierungsvektoren oder Expressionsvektoren sein können, gentechnisch verändert. (z.B. transduziert oder transformiert oder transfiziert). Der Vektor kann zum Beispiel in Form eines Plasmids, eines Viruspartikels, eines Phagens usw. vorliegen. Die veränderten Wirtszellen können in herkömmlichen Nährmedien, die zur Aktivierung von Promotoren, zur Selektion der Transformanten oder zur Amplifikation der Oxalyl-CoA-Decarboxylasegene passend modifiziert sind, kultiviert werden. Die Kultivierungsbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert und ähnliche sind diejenigen, die für die Expression ausgewählter Wirtszellen bisher verwendeten wurden, sie sind für den Durchschnittsfachmann erkennbar.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können für die Herstellung von Polypeptiden mittels Rekombinationstechniken eingesetzt werden. So kann beispielsweise das Polynucleotid in einem beliebigen einer Vielzahl von Expressionsvektoren für die Expression eines Polypeptids eingeschlossen sein. Derartige Vektoren schließen chromosomale, nichtchromosomale und synthetische DNA-Sequenzen ein, z.B. Derivate von SV-40; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Baculovirus; Hefeplasmide; von Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA abgeleitete Vektoren; virale DNA, wie die des Vaccinia-Virus, Adenovirus, Hühnerpockenvirus und Pseudorabies. Es kann jedoch jeder andere Vektor verwendet werden, solange er replizierbar und im Wirt lebensfähig ist.
Die passende DNA-Sequenz kann mittels einer Vielzahl von Arbeitsweisen in den Vektor eingeschleust werden. Im allgemeinen wird die DNA-Sequenz mit Verfahren, die in dem Fachgebiet bekannt sind, in (eine) passende Schnittstelle(n) einer Restriktionsendonuclease eingefügt. Derartige Verfahren werden als innerhalb des Fachwissens liegend betrachtet.
Die DNA-Sequenz ist, um die mRNA-Synthese zu steuern, im Expressionsvektor an (eine) geeignete Kontrollsequenz(en) (Promotor) funktionsfähig gekoppelt. Als repräsentative Beispiele für solche Promötoren können erwähnt werden: LTR- oder SV 40-Promotor, der E.coli-lac- oder trp-Promotor, der PL-Promotor des Lambda-Phagen und andere für die Steuerung der Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder ihren Viren bekannte Promotoren. Der Expressionsvektor enthält zudem eine Ribosomen- Bindungsstelle zur Einleitung der Translation und einen Transkriptionsterminator. Der Vektor kann auch geeignete Sequenzen für die amplifizierende Expression einschließen.
Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise ein oder mehrere selektierbare Markierungsgene, um eine phänotypische Eigenschaft für die Selektion von transformierten Wirtszellen zu erlangen, wie eine Dihydrofolat-Reductase- oder Neomycinresistenz für eukaryontische Zellkulturen, oder wie eine Tetracyclin- oder Ampicillinresistenz in E.coli.
Der Vektor, der sowohl die hierin vorstehend beschriebene geeignete DNA-Sequenz als auch eine geeignete Promotor- oder Kontrollsequenz enthält, kann zur Transformation eines geeigneten Wirts eingesetzt werden, um dem Wirt die Expression des Proteins zu erlauben.
Als repräsentative Beispiele für geeignete Wirte können erwähnt werden: Bakterienzellen, wie E.coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Pilzzellen, wie Hefe; Insektenzellen, wie Drosophila und Sf9; tierische Zellen, wie CHO, COS oder Bowes Melanom; Pflanzenzellen usw.. Die Auswahl eines geeigneten Wirts aus den hier gegebenen Lehren wird als innerhalb des Fachwissens liegend angesehen.
Die vorliegende Erfindung schließt insbesondere auch rekombinante Konstrukte ein, die eine oder mehrere der vorstehend ausführlich beschriebenen Sequenzen umfassen. Die Konstrukte umfassen einen Vektor, wie einen Plasmidvektor oder viralen Vektor, in den eine Sequenz der Erfindung in Vorwärts- oder Rückwärts-Orientierung eingefügt wurde. Bei einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform umfasst das Konstrukt weiterhin Regulationssequenzen, die zum Beispiel einen mit der Sequenz funktionsfähig gekoppelten Promotor einschließen. Eine große Anzahl geeigneter Vektoren und Promotoren sind dem Fachmann bekannt und im Handel erhältlich. Die folgenden Vektoren sind als Beispiele genannt. Bakteriell: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRITS (Pharmacia). Eukaryontisch: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Es kann jedoch jedes andere Plasmid oder jeder andere Vektor verwendet werden, soweit sie im Wirt replizierbar und lebensfähig sind.
Die Promotorregionen können ausgewählt werden aus einem beliebigen erwünschten Gen unter Verwendung von CAT (Chloamphenicol-Transferase)-Vektoren oder anderen Vektoren mit selektionsfähigen Markern. Zwei geeignete Vektoren sind pKK232-8 und pCM7: Besonders zu nennende bakterielle Promotoren schließen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL und trp ein. Eukaryontische Promotoren schließen CMV, unmittelbar früh, HSV-Thymidin-Kinase, frühes und spätes SV40, LTRs vom Retrovirus und Maus- Metallothionein-I ein. Die Auswahl des geeigneten Vektors und Promotors liegt innerhalb des Wissensstandes eines Fachmannes.
Bei einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegenden Erfindung Wirtszellen, die das vorstehend beschriebene Konstrukt enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Zelle wie eine Säugerzelle, oder eine niedere eukaryontische Zelle wie eine Hefezelle sein, oder die Wirtszelle kann auch eine prokaryontische Zelle wie eine Bakterienzelle sein. Das Konstrukt kann in die Wirtszelle durch Calciumphosphat- Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion oder Elektroporation (Davis, L., Dibner, M., Battey, L, Basic Methods in Molecular Biology, (1986)) eingeführt werden.
Die Konstrukte in den Wirtszellen können auf herkömmliche Weise dazu verwendet werden, Genprodukte herzustellen, die durch die rekombinante Sequenz codiert werden. Alternativ können die Polypeptide der Erfindung mittels eines herkömmlichen Peptidsynthesegeräts synthetisch hergestellt werden.
Reife Proteine können in Säugerzellen, Hefe-, Bakterien- oder anderen Zellen unter der. Kontrolle eines geeigneten Promotors exprimiert werden. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls eingesetzt werden, um solche Proteine unter Verwendung der RNA's, die von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung abgeleitet sind, herzustellen. Geeignete Clonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung mit prokaryontischen und eukaryontischen Wirten sind beschrieben von Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989).
Die Transkription der DNA, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, durch höhere Eukaryonten wird verstärkt, wenn eine Enhancer-Sequenz in den Vektor eingefügt wird. Enhancer sind cis-agierende Elemente der DNA, gewöhnlich etwa 10 bis 300 bp, die auf den Promotor einwirken und seine Transkription verstärken. Beispiele schließen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunkts bp 100 bis 270, einen frühen Promotor-Enhancer des Cytomegalovirus, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunkts und die Adenovirus-Enhancer ein.
Im allgemeinen schließen rekombinante Expressionsvektoren Replikationsstartpunkte und selektierbare Marker ein, die eine Transformation der Wirtszelle ermöglichen, z.B. das Ampicillinresistenzgen von E. coli und das S. cerevisiae-TRP1-Gen, und einen Promotor, der von einem hochexprimierten Gen abgeleitet ist und die direkte Transkription einer Struktursequenz stromabwärts lenkt. Solche Promotoren können von Operons abgeleitet sein, die glycolytische Enzyme codieren, wie 3-Phosphoglycerat-Kinase (PGK), α-Faktor, saure Phosphatase oder Hitzeschock-Proteine, unter anderen. Die heterologe Struktursequenz wird zusammengesetzt in einer geeigneten Phase mit Translationsinitiatoren und Terminationssequenzen, und vorzugsweise einer Leader-Sequenz, die befähigt ist, die Sekretion des translatierten Proteins in den periplasmatischen Raum oder das extrazelluläre Medium zu leiten. Die heterologe Struktursequenz kann gegebenenfalls ein Fusionsprotein codieren, das ein N-terminales Identifikationspeptid einschließt, das die gewünschten Eigenschaften vermittelt, z.B. Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts.
Brauchbare Expressionsvektoren für die bakterielle Verwendung werden konstruiert durch Insertion einer strukturellen DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Protein codiert, zusammen mit geeigneten Translationsinitiierungs- und -terminationssignalen in einer funktionsfähigen Lesephase mit einem funktionellen Promotor. Der Vektor umfasst einen oder mehrere phänotypische selektierbare Marker und einen Replikationsstartpunkt, um die Aufrechterhaltung des Vektors sicherzustellen und um, falls gewünscht, die Amplifikation innerhalb des Wirts zu vermitteln. Geeignete prokaryontische Wirte für die Transformation schließen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Arten innerhalb der Gattung Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus ein, obwohl wahlweise auch andere verwendet werden können.
Bei einem repräsentativen Beispiel können Expressionsvektoren, die für bakterielle Verwendung brauchbar sind, einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsstartpunkt umfassen, die von den im Handel erhältlichen Plasmiden abgeleitet sind, die genetische Elemente des gut bekannten Clonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) umfassen. Solche handelsüblichen Vektoren schließen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein. Diese Abschnitte des pBR322-Grundgerüsts werden mit einem geeigneten Promotor und der Struktursequenz kombiniert, die exprimiert werden soll.
Nach der Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und dem Wachsenlassen des Wirtsstammes bis zu einer entsprechenden Zelldichte wird der ausgewählte Promotor mit geeigneten Mitteln induziert (z.B. Temperaturverschiebung oder chemische Induktion) und die Zellen werden für einen zusätzlichen Zeitraum kultiviert.
Die Zellen werden typischerweise durch Zentrifugieren geerntet, mit physikalischen oder chemischen Mitteln aufgebrochen und der resultierende Rohextrakt wird für die weitere. Reinigung zurückbehalten.
Die für die Expression von Proteinen eingesetzten mikrobiellen Zellen können mit jeder geeigneten Methode aufgebrochen werden, einschließlich Einfrier-Auftau-Zyklus, Beschallung, mechanisches Aufbrechen oder durch die Verwendung von Zell-lysierenden Mitteln; derartige Methoden sind dem Fachmann gut bekannt.
Verschiedene Zellkultursysteme von Säugetieren können ebenfalls eingesetzt werden, um ein rekombinantes Protein zu exprimieren. Beispiele für Expressionssysteme bei Säugetieren schließen ein: die COS-7-Linien von Affennierenfibroblasten, beschrieben von Gluzman, Cell, 23: 175 (1981), und andere Zeillinien, die befähigt sind, einen kompatiblen Vektor zu exprimieren, z.B. die C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- und BHK-Zelllinien. Expressionsvektoren bei Säugetieren umfassen einen Replikationsstartpunkt, einen geeigneten Promotor und Enhancer und ebenso alle notwendigen Ribosomen-Bindungsstellen, Polyadenylierungsstellen, Spleißdonor- und -acceptorstellen, Terminationssequenzen der Transkription und 5'-flankierende nichttranskribierte Sequenzen. DNA-Sequenzen, die von der SV40-Spleißung abgeleitet sind, und Polyadenylierungsstellen können dazu verwendet werden, um die erforderlichen nichttranskribierten genetischen Elemente zu liefern.
Die Oxalyl-CoA-Decarboxylase-Polypeptide können aus den rekombinanten Zellkulturen durch Verfahren wiedergewonnen und gereinigt werden, die Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustausch-Chromatographie, Phosphocellulose-Chromatographle, hydrophobe Chromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie und Lektin-Chromatographie einschließen. Protein- Neufaltungsschritte können, falls nötig, bei der Vervollständigung der Konfiguration des reifen Proteins verwendet werden. Schließlich kann Hochdruckflüssigchromatographle (HPLC) für die Endreinigungsschritte eingesetzt werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können von Natur aus reine Produkte oder ein Produkt chemischer Syntheseverfahren sein oder mittels Rekombinationstechniken aus einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt (zum Beispiel, über Bakterien-, Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und Säugetierzellen in Kultur) hergestellt worden sein. Abhängig von dem bei dem Rekombinations-Herstellungsverfahren eingesetzten Wirt können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glycosyliert oder nichtglycosyliert sein. Die Polypeptide der Erfindung können auch einen Anfangs-Methionin-Aminosäurerest einschließen.
Das Oxalyl-CoA-Decarboxylase-Polypetid der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um die Bildung von Harnsteinen durch Herabsetzen des Oxalationenspiegels im Plasma oder Harn zu verhindern.
Das Oxalyl-CoA-Decarboxylase-Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch zur Behandlung oder zur Verhütung von Hyperoxalurie eingesetzt werden. Hyperoxalurie ist charakterisiert entweder durch eine abnormale Synthese oder durch Hyperabsorption von Oxalat, die durch Abbau der Oxalationen verhindert werden kann und durch eine Verhinderung dieser Störung.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind nützlich für die Identifizierung anderer Moleküle, die eine ähnliche biologische Wirkung aufweisen. Ein Beispiel für einen Suchtest umfasst das Isolieren der codierenden Region des Oxalyl-CoA-Decarboxylasegens unter. Verwendung der bekannten DNA-Sequenz zur Synthese einer Oligonucleotidsonde. Markierte Oligonucleotide mit einer zu der des Gens der vorliegenden Erfindung komplementären Sequenz können zum Durchsuchen einer Genbank menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA verwendet werden, um festzustellen, mit welchen Teilen der Genbank die Sonde hybridisiert.
Die Oxalyl-CoA-Decarboxylase-Polypeptide können auch zur Expression solcher Pelypeptide in vivo eingesetzt werden, was oft als "Gentherapie" bezeichnet wird.
So können zum Beispiel Zellen eines Patienten mit einem Polynucleotid (DNA oder RNA), das eine Oxalyl-CoA-Decarboxylase ex vivo codiert, gentechnisch verändert werden, die dann dem für eine Behandlung mit dem Polypeptid vorgesehenen Patienten zugeführt werden. Solche Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt. Zum Beispiel können Zellen durch ein dem Fachmann bekanntes Verfahren gentechnisch verändert werden, indem ein Retroviruspartikel verwendet wird, das die RNA enthält, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert.
Auf ähnliche Weise können die Zellen in vivo gentechnisch verändert sein, um das Polypeptid in vivo zu exprimieren, zum Beispiel mittels Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Wie dem Fachmann bekannt ist, kann dem Patienten eine Erzeugerzelle verabreicht werden, die den Retroviruspartikel erzeugt, das die RNA, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, enthält, um die Zellen in vivo gentechnisch zu verändern und das Polypeptid in vivo zu exprimieren. Diese und andere Verfahren für die Verabreichung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung mittels derartiger Methoden sollten für den Fachmann aus den Lehren der vorliegenden Erfindung ersichtlich werden. Zum Beispiel kann das Expressionsvehikel für die gentechnisch veränderten Zellen ein anderes als ein Retrovirus sein, zum Beispiel ein Adenovirus, das dazu verwendet werden kann, nach der Kombination mit einem geeigneten Übertragungsvehikel die Zellen in vivo gentechnisch zu verändern.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger eingesetzt werden. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge des Polypeptids und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Arzneimittelzusatz. Solche Träger schließen physiologische Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und deren Kombinationen ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Diese Zubereitungen sollten zur Art der Verabreichung passen.
Die Arzneimittel können in einer günstigen Weise verabreicht werden, wie auf topischen, intravenösen, intraperitonealen, intramuskulären, subkutanen, intranasalen oder intradermalen Wegen. Oxalyl-CoA-Decarboxylase wird in einer zur Behandlung und/oder Prophylaxe der spezifischen Indikation ausreichenden Menge verabreicht. Im allgemeinen wird die Oxalyl-CoA-Decarboxylase in einer Menge von mindestens etwa 10 ug/kg Körpergewicht verabreicht werden und wird in den meisten Fällen in Mengen verabreicht werden, die 8 mg/kg Körpergewicht pro Tag nicht übersteigen. In den meisten Fällen reicht die Dosierung von etwa 10 ug/kg bis 1 mg/kg Körpergewicht täglich, wobei die Verabreichungswege, Symptome usw. in Betracht zu ziehen sind.
Die Polypeptide oder die Zellen, die sie exprimieren, können als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern dazu verwendet werden. Diese Antikörper können zum Beispiel polyclonale oder monoclonale Antikörper sein. Zur Herstellung solcher Antikörper können verschiedene auf dem Fachgebiet bekannte Arbeitsweisen verwendet werden.
Antikörper die gegen die Polypeptide erzeugt werden, die einer Sequenz der vorliegenden Erfindung entsprechen, können durch direkte Injektion des Polypeptides in ein Tier oder durch Verabreichen des Polypeptids an ein Tier, vorzugsweise kein Mensch, erhalten werden. Der so erhaltene Antikörper wird dann das Polypeptid selbst binden. Auf diese Weise kann sogar eine Sequenz, die nur ein Fragment des Polypeptids codiert, verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die das gesamte reife Polypeptid binden. Solche Antikörper können dazu verwendet werden, um das Polypeptid aus dem Gewebe zu isolieren, welches das Polypeptid exprimiert.
Für die Herstellung monoclonaler Antikörper kann jedes Verfahren verwendet werden, das Antikörper durch kontinuierliche Zelllinien-Kulturen erzeugt. Beispiele schließen die Hybridomtechnik (Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), die Triomtechnik, die Hybridomtechnik menschlicher B-Zellen (Kozboret al., 1983; Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridomtechnik zur Erzeugung menschlicher monoclonaler Antikörper (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Seiten 77-96) ein.
Die für die Herstellung von Einzelketten-Antikörper beschriebenen Verfahren (U.S. Patent 4,946,778) können für die Erzeugung von immunogenen Polypeptidprodukten dieser Erfindung angepasst werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen diagnostischen Test zum Nachweis einer Anfälligkeit für Hyperoxalurie. Ein derartiger Test kann durch den Nachweis von Oxalyl- CoA-Decarboxylase-Mengen in einer Probe, wie einer Blut- oder Serumprobe, im Harn usw. durchgeführt werden. Die Menge an Oxalyl-CoA-Decarboxylase kann zum Beispiel nachgewiesen werden durch eine Immuntest-Technik, mittels auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren. Ein Beispiel für einen derartigen Test ist ein Sandwich-Test, der zwei Antikörper verwendet, die spezifisch für das Oxalyl-CoA-Decarboxylaseantigen sind, vorzugsweise monoclonale Antikörper, von denen ein Antikörper markiert ist, z.B. durch Kupplung an eine geeignete Markierung, wie z.B. an ein Indikatorenzym, z.B. Meerrettich-Peroxidase. Der nichtmarkierte Antikörper befindet sich bevorzugt auf einem festen Träger. Wenn Antigen vorhanden ist, wird das Antigen an beide Antikörper gebunden. Nach der Bindung des Peroxidase-gekuppelten Antikörpers an das Antigen, kann die Peroxidase zur Erzeugung eines gefärbten Produkts verwendet werden, das messbar ist und dessen Konzentration zur Menge des Antigens in einer Probe in Beziehung steht. Aufgrund der katalytischen Natur des Enzyms wird das Signal durch das System deutlich verstärkt. Eine geringe Oxalyl-CoA- Decarboxylasemenge zeigt Anfälligkeit für Hyperoxalurie an.
Die vorliegende Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben. Alle Teile oder Mengen sind auf Gewicht bezogen, sofern nichts anderes angegeben ist.
Um die folgenden Beispiele leichter verstehen zu können, werden bestimmte häufig vorkommende Methoden und/oder Begriffe beschrieben.
"Plasmide" werden durch den Kleinbuchstaben p gekennzeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Zahlen vorangestellt sind und/oder folgen. Die Startplasmide hierin sind entweder im Handel oder auf einer nicht eingeschränkten Basis öffentlich erhältlich, oder können aus den im Handel erhältlichen Plasmiden gemäß veröffentlichten Verfahren konstruiert werden. Darüberhinaus sind zu den beschriebenen Plasmiden äquivalente Plasmide in der einschlägigen Technik bekannt und werden normalerweise für den Fachmann erkennbar sein.
"Verdauung" der DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur bei bestimmten Sequenzen in der DNA wirkt. Die hierin verwendeten verschiedenen Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich und ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Erfordernisse werden so eingesetzt, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Für analytische Zwecke werden typischerweise 1 ug Plasmid - oder DNA-Fragment mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 ul Pufferlösung verwendet. Für die Isolierung von DNA-Fragmenten für die Plasmidkonstruktion, werden typischerweise 5 bis 50 ug DNA mit 20 bis 250 Einheiten Enzym in einem größeren Volumen verdaut. Geeignete Puffer- und Substratmengen für spezielle Restriktionsenzyme sind vom Hersteller angegeben. Gewöhnlich werden Inkubationszeiten von etwa 1 Std. bei 37ºC verwendet, können aber entsprechend den Instruktionen der Lieferanten variieren. Nach der Verdauung wird die Reaktion unmittelbar einer Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel unterworfen, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
Die Größentrennung der gespaltenen Fragmente erfolgt unter Verwendung eines 8%igen Polyacrylamidgels, beschrieben von Goeddel, D. et aL, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980).
"Oligonucleotide" bezieht sich entweder auf Einzelstrang-Polydesoxynucleotide oder auf zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die chemisch synthetisiert sein können. Solche synthetischen Oligonucleotide haben kein 5'-Phosphat und werden nicht an andere Oligonucleotide ohne Zugabe eines Phosphats mit einem ATP in Anwesenheit von Kinase ligieren. Ein synthetisches Oligonucleotid wird an ein Fragment ligieren, das nicht dephosphoryliert worden ist.
"Ligierung" bezieht sich auf ein Verfahren zur Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei Doppelstrang-Nucleinsäurefragmenten. (Maniatis, T., et al., Id., S. 146). Sofern nicht anders angegeben, kann die Ligierung unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4 DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 ug von annähernd äquimolaren Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente ausgeführt werden.
Sofern nichts anderes angegeben ist, wird die Transformation durchgeführt, wie in dem Verfahren von Graham, F. and Van der Eb, A., Virology, 52 : 456-457 (1973) beschrieben.

Beispiel 1

Bakterielle Expression und Reinigung der Oxalyl-CoA-Decarboxylase

Die DNA-Sequenz, die die Oxalyl-CoA-Decarboxylase codiert (ATCC # 75715), wird zu Beginn amplifiziert unter Verwendung von PCR-Oligonucleotidprimern, die den 5'- und 3'-Sequenzen des verarbeiteten Oxalyl-CoA-Decarboxylaseproteins entsprechen (minus der Signalpeptid-Sequenz) und zusätzliche Nucleotide, die NcoI beziehungsweise Bg1II entsprechen, würden den 3'- beziehungsweise 5'-Sequenzen hinzugefügt. Die Primer, die für die Erzeugung des PCR-Fragment verwendet wurden, codieren zusätzlich zu den Restriktionsschnittstellen die OmpA-Leader-Sequenz in der Sequenz, die die menschliche Oxalyl-CoA-Decarboxylase codiert. Der 5'-Oligonucleotidprimer hat die Sequenz 5'- GACTTCATGAAAAAGACAGATATCGCAATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTA CCGTTGCGCAAGCTGCTCCGGACAGTAACTTCGCAGAG-3', enthält eine BspHI-Restriktionsenzym-Schnittstelle gefolgt von den 21 Nucleotiden des menschliche Oxalyl-CoA- Decarboxylasegens; die 3'-Sequenz 3'-CAGTTCTAGACATATTAGAGCGGGTCAGCC-5' enthält komplementäre Sequenzen zur Restriktionsenzym-Schnittstelle von Bgl II, ein Translations-Stop-Codon und die letzten 20 Nucleotide der Sequenz, die die menschliche Oxalyl-CoA-Decarboxylase codiert. Die Schnittstellen des Restriktionsenzyms entsprechen den Restriktionsenzym-Schnittstellen im bakteriellen Expressionsvektor pQE-60 (Qiagen, Inc. 9259 Eton Ave., Chatsworth, CA 91311). pQE-60 codiert Antibiotikaresistenz (Ampr), einen bakteriellen Replikationsstartpunkt (ori), einen IPTG-regulierbaren Promotor-Operator (P/O), eine Ribosomenbindungsstelle (RBS), ein 6-His-Anhängsel und Restriktionsenzym- Schnittstellen. pQE-60 wurde dann mit NcoI und Bgl II verdaut. Die amplifizierten Sequenzen wurden in pQE-60 ligiert und im Raster mit der Sequenz eingefügt, die das Histidinanhängsel und die RBS codiert. Das Ligierungsgemisch wurde dann verwendet, um den E. coli-Stamm M15/rep 4, erhältlich von Qiagen unter dem Handelsnamen M15/rep 4, zu transformieren. M15/rep4 enthält multiple Kopien des Plasmids pREP4, das den lacI-Repressor exprimiert und auch Kanamycinresistenz (Kanr) verleiht. Die Transformanten wurden durch ihre Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, und Ampicillin/Kanamycin-resistente Kolonien wurden selektiert. Die Plasmid-DNA wurde isoliert und durch Restriktionsanalyse bestätigt. Clone, die die gewünschten Konstrukte enthielten, wurden über Nacht (O/N) in Flüssigkultur in LB-Medium, ergänzt mit sowohl Amp (100 ug/ml) als auch Kan (25 ug/ml) wachsen gelassen. Die (O/N)-Kultur wurde dazu verwendet, eine große Kultur in einem Verhältnis von 1 : 100 bis 1 : 250 anzuimpfen. Die Zellen wurden bis zu einer optischen Dichte 600 (O.D.&sup6;&sup0;&sup0;) zwischen 0,4 und 0,6 wachsen gelassen. Dann wurde IPTG (Isopropyl-B-Dthiogalactopyranosid) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugesetzt. IPTG induziert durch Inaktivierung des lacI-Repressors eine Freisetzung des P/O, was zu einer erhöhten Genexpression führt. Die Zellen wurden zusätzliche 3 bis 4 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren (20 Min. bei 6000xg) geerntet. Das Zellpellet wurde in der chaotropen Substanz 6 molares Guanidin-HCl löslich gemacht. Nach dem Klären wurde gelöste Oxalyl-CoA-Decarboxylase aus dieser Lösung durch Chromatographie über eine Nickel-Chelat-Säule gereinigt unter Bedingungen, die eine feste Bindung der Proteine ermöglicht, die das 6-His-Anhängsel enthalten. (Hochuli, E. et al., Genetic Engineering, Principles & Methods, 12: 87-98 (1990). Die Protein-Renaturierung außerhalb von GnHCl kann nach verschiedenen Protokollen ausgeführt werden. (Jaenicke, R. and Rudolph, R., Protein Structure - A Practical Approach, IRL Press, New York (1990)): Die Oxalyl-CoA- Decarboxylase (95% rein) wurde mit 6 molarer Guanidin-HCl, pH 5,0 aus der Säule eluiert und zur Renaturierung auf 3 molare Guanidin-HCl 100 mM Natriumphosphat, 10 mM Glutathion (reduziert) und 2 mmolares Gluthathion (oxidiert) eingestellt.

Beispiel 2

Expression menschlicher Oxalyl-CoA-Decarboxylase durch in vitro-Transkription und -Translation

Die in vitro-Transkription und. -Translation der Oxalyl-CoA-Decarboxylase wurde unter Verwendung des TNT-gekuppelten Reticulocyten-Lysatsystems (Promega, Madison, WI) durchgeführt. Die die Oxalyl-CoA-Decarboxylase codierende cDNA wurde in der Richtung von EcoRI zu XhoI cloniert, wobei die EcoRI-Stelle das 5'-Ende des Gens und die XhoI-Stelle das 3'-Ende des Gens definiert. Das Gen wurde in der T3-Richtung eingefügt. T3 definiert eine Bakteriophagen-RNA-Polymerase, die einen spezifischen Promotor erkennt und die DNA in eine mRNA transkribiert. Ein Kaninchen-Reticulocytenlysat wird mit T3 RNA- Polymerase ergänzt und führt die Expression des Proteins mit einem T3-Promotor unter Verwendung der T3 RNA-Polymerase dazu, die Botschaft zu transkribieren und das Reticulocytenlysat dazu, die entstehende RNA zu translatieren. Durch Einführung radioaktiver Aminosäuren in das translatierte Produkt, kann die Proteinexpression unter Verwendung einer SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese, gefolgt von Autoradiographie, analysiert werden. Im Speziellen werden 1 ug des die Oxalyl-CoA-Decarboxylase-DNA enthaltenden Plasmids bei 30ºC 1 Stunde mit dem Reticulocytenlysat, T3 RNA-Polymerase und [³&sup5;S]-Methionin inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Translationen mittels SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Bei 55 kDa war ein auffallendes Translationsprodukt sichtbar.

SEQUENZ-PROTOKOLL

(1) ALGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: OLSEN, ET AL.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Menschliche Oxalyl-CoA-Decarboxylase
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) KORESPONDENZ-ADRESSE:
(A) ADRESSAT: CARELLA, BYRNE, BAIN, GILFILLAN, CECCHI, STEWART-& OLSTEIN
(B) STRASSE: 6 BECKER FARM ROAD
(C) STADT: ROSELAND
(D) STAAT: NEW JERSEY
(E) LAND: USA
(F) ZIP: 07068
(v) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) MEDIUM-TYP: 3.5 ZOLL-DISKETTE
(B) COMPUTER: IBM PS/2
(C) BETRIEBSSYSTEM: MS-DOS
(D) SOFTWARE: WORD PERFECT 5.1
(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDEDATUM: hiermit beantragt
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vii) DATEN DER FRÜHEREN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDEDATUM:
(viii) ANWALT/VERTRETER INFORMATION:
(A) NAME: FERRARO, GREGORY D.
(B) REGLSTRIERUNGSNUMMER: 36,134
(C) BEZUG/LISTEN-NUMMER: 325800-80
(ix) TELEKOMMUNIKATIONS-INFORMATION:
(A) TELEFON: 201-994-1700
(B) TELEFAX: 201-994-1744
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN
(A) LÄNGE: 1882 BASENPAARE
(B) TYP: NUCLEINSÄURE
(C) STRANGFORM: EINZELSTRANG
(D) TOPOLOGIE: LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN
(A) , LÄNGE: 578 AMINOSÄUREN
(B) TYP: AMINOSÄURE
(C) STRANGTYP:
(D) TOPOLOGIE: LINEAR
(ii) MOLEKÜLTYP: PPOTEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2:

Claims

1. Polynucleotid, ausgewählt aus folgender Gruppe:

(a) Polynucleotide, die die reife Form des Polypeptids codieren, das die in Fig. 1 gezeigte abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt;

(b) Polynucleotide, welche die codierende Sequenz, wie in Fig. 1 dargestellt, besitzen, die die reife Form des Polypeptids codiert;

(c) Polynucleotide, welche das Polypeptid codieren, das die Aminosäuresequenz der reifen Form des Polypeptids besitzt, das von der cDNA, die in ATCC 75715 enthalten ist, codiert wird;

(d) Polynucleotide, welche die codierende Sequenz der cDNA besitzen, die in ATCC 75715 enthalten ist, die die reife Form des Polypeptids codiert;

(e) Polynucleotide, die ein Polypeptid codieren, das von einem Polynucleotid nach einer der Definitionen (a) bis (d) codiert wird, ausgenommen das N-terminale Methionin;

(f) Polynucleotide, welche ein Polypeptid codieren, das von Polynucleotiden nach einer der Definitionen (a) bis (d) codiert wird, in dem ein oder mehrere Aminosäurereste durch konservierte Aminosäurereste ersetzt sind und die ein Polypeptid mit Oxalyl-CoA-Decarboxylase-Aktivität codieren;

(g) Polynucleotide, nach einer der Definitionen (a) bis (d), wobei eines oder mehrere Nucleotide deletiert oder hinzugefügt werden, und die ein Polypeptid mit Oxalyl-CoA-Decarboxylase-Aktivität codieren;

(h) Polynucleotide, welche ein antigenes Fragment eines Polypeptids codieren, welches von einem Polynucleotid nach einer der Definitionen (a) bis (d) codiert wird; und

(i) Polynucleotide, deren komplementärer Strang hybridisiert und zu mindestens 70% identisch ist mit einem Polynucleotid, wie in einer der Definitionen (a) bis (d) definiert, und die ein Polypeptid mit Oxalyl-CoA-Decarboxylase-Aktivität codieren; oder der komplementäre Strang eines Polynucleotids nach einer der Definitionen (a) bis (1).

2. Polynucleotid nach Anspruch 1, welches DNA ist.

3. DNA nach Anspruch 2, welche genomische DNA ist.

4. Polynucleotid nach Anspruch 1, welches RNA ist.

5. Vektor, welcher das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.

6. Vektor nach Anspruch 5, in welchem das Polynucleotid funktionell mit den Expression kontrollierenden Sequenzen verknüpft ist, die die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen erlauben.

7. Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 5 oder 6 genetisch verändert wurde.

8. Verfahren zur Herstellung einer Oxalyl-CoA-Decarboxylase, umfassend die Züchtung der Wirtszelle nach Anspruch 7 und die Gewinnung des Polypeptids, welches von dem Polynucleotid codiert wird, aus der Kultur.

9. Verfahren zur Produktion von Zellen, welche in der Lage sind, eine Oxalyl- CoA-Decarboxylase zu exprimieren, umfassend die genetische Veränderung von Zellen mit dem Vektor nach Anspruch 5 oder 6.

10. Polypeptid, welches von einem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird oder gemäß dem Verfahren nach Anspruch 8 erhältlich ist.

11. Antikörper gegen das Polypeptid nach Anspruch 10.

12. Nueleinsäuremolekül, welches mit einem Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert.

13. Arzneimittel, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder das Polypeptid nach Anspruch 10 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

14. Diagnosemittel, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 12 oder den Antikörper nach Anspruch 11.

15. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 10 oder eines Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung gegen Harnsteinbildung oder zur Behandlung und/oder Vermeidung von Hyperoxalurie.

16. Verfahren zum Nachweis einer Anfälligkeit für Hyperoxalurie, umfassend:

(a) Nachweis der Menge des Polypeptids nach Anspruch 10 in einer Probe; oder

(b) Identifizierung der Konzentration von Oxalyl-CoA-Decarboxylase in der Probe; und

(c) Bestimmung, ob der Wirt eine Anfälligkeit für Hyperoxalurie hat.