DE69427403T2

DE69427403T2 - Peptide-familie, genannt xenoxine

Info

Publication number: DE69427403T2
Application number: DE69427403T
Authority: DE
Inventors: Tilman Achstetter; Hanno V.J. Kolbe; Guenther Kreil; Ulla B. Rasmussen
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1993-06-29
Filing date: 1994-06-28
Publication date: 2002-06-06
Anticipated expiration: 2014-06-29
Also published as: AU7128294A; AU696454B2; US6277822B1; WO1995001431A1; JPH09500265A; CA2166298A1; DK0706567T3; ES2157261T3; US20020111299A1; US6077827A; PT706567E; ATE201903T1; DE69427403D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Peptidfamilie, genannt Xenoxine, Mitglieder der Peptidfamilie sowie Verfahren zu deren Herstellung und die entsprechenden DNA-Sequenzen. Sie betrifft ebenso pharmazeutische Zusammensetzungen, welche diese Xenoxine enthalten sowie Diagnostiksysteme, welche die Xenoxine oder Anti-Xenoxin-Antikörper enthalten.
Es wurden bereits eine Anzahl wichtiger Peptide mit verschiedenen biologischen Funktionen aus der Haut oder aus Hautsekreten von Amphibien isoliert. (V. Erspamer et P. Melchiorri, Neuroendocrine Perspectives, E.E. Müller et Moleod, Eds., (Elsevier Science Publishers B.V.) 2, (1983), p 37; C.L. Bevins et coll.; Ann. Rev. Biochem. 59; (1990); p 395). Schon zu Beginn stellte sich heraus, dass verschiedene dieser Peptide sehr ähnlich oder sogar identisch mit Hormonen und Neurotransmittern der Säugetiere sind (V. Erspamer et coll., Trends Pharmacol. Sci. 1, (1980), p 391).
Die Haut- und die Hautsekrete von Fröschen gelten als eine Quelle von Peptiden mit interessanten pharmakologischen oder antibiotischen Eigenschaften. Insbesondere enthält die Haut von Xenopus laevis, einem Frosch afrikanischen Ursprungs, beträchtliche Konzentrationen verschiedener Peptide.
Die biologische Rolle, die diese Peptide, die man in dem durch die Drüsen und die Haut von Xenopus laevis sekretiertem Material findet, spielen, ist nur teilweise bekannt. Einerseits könnten diese Sekrete eine Schutzfunktion ausüben, da das sekretierte Material schädlich für Angreifer zu sein scheint. Andererseits enthält das sekretierte Material Peptide, die das Wachstum von Bakterien und Pilzen hemmt, und die sich somit wie Antibiotika auf der feuchten Haut des Frosches verhalten oder Infektionen während der Heilung von Wunden bekämpfen.
Diese antibiotischen Peptide enthalten im Allgemeinen zwischen 21 und 26 Aminosäuren, sind basisch und frei von Tyrosin. Die Aminosäuresequenzidentität der verschiedenen antibiotischen Peptide ist oftmals sehr begrenzt. Im Gegensatz dazu haben die Peptide ihre Konfiguration als amphipatische Alpha- Helix gemeinsam. Auf dem Niveau der Signalsequenzen mit ungefähr 20 Aminosäuren beträgt die Aminosäuresequenzidentität nur 55%. Jedoch werden konservierte Segmente gefunden, die den Signalsequenzen der verschiedenen antibiotischen Peptide gemeinsam sind. Außerdem weisen sie alle eine N-terminale Sequenz Arg-Xaa-Val-Arg auf, die die Wirkungsstelle eines Reifungsenzyms sein könnte.
Als weitere Beispiele isolierter und charakterisierter Peptide bei Xenopus laevis seien das Caerulein, Mitglied der Peptidfamilie Cholecystokin/Gastrin (Anastasi et coll., Brit. J. Pharmacol. 38, (1970), p 221); Spasmolysin I und II (W. Hoffmann, J. Biol. Chem. 263 (16), (1988), p 7686); Thyrotrophin freisetzendes Peptid (K. Richter et coll., EMBO J. 3(3), (1984), p 617) und Xenopsin (K. Araki et coll., Chem. Pharmacol. Bull. 21 (12), (1973), p 2801) genannt. Die Mehrzahl dieser Peptide sind Mitglieder einer Peptidfamilie, zu der unter anderem analoge Peptide mit Säugetierursprung gehören. Beispielsweise dienten Bombesin und Kassinin als Referenz zur jeweiligen Identifizierung des Gastrin freisetzenden Peptids und der Substanz K bei den Säugetieren (C.L. Bevins et coll, vi supra). Tatsächlich enthält das durch die Froschhaut sekretierte Material Peptide in reichlicher Menge, während bei den Säugetieren das analoge Peptid oftmals nur in geringer Menge vorliegt. Deshalb eignen sich die Froschpeptide zur Identifizierung von nützlichen Säugetierpeptiden.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Familie von Peptiden, welche als Xenoxine bezeichnet werden und wertvolle pharmazeutische Eigenschaften aufweisen, insbesondere die Eigenschaft, die Funktion von transmembranen Ionenkanälen zu beeinflussen, ohne dabei neurotoxische Wirkung aufzuweisen. Außerdem wird vermutet, dass diese Peptide die vorteilhafte Eigenschaft besitzen, die Wirkungen von Activin zu eliminieren.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Xenoxin, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Aminosäuresequenz aufweist, welche
a. wenigstens 8 Cysteine (Cys) enthält, die durch 4 Disulfidbrücken gemäß der Konfiguration Cys¹ mit Cys³, Cys² mit Cys&sup4;, Cys&sup5; mit Cys&sup6; und Cys&sup7; mit Cys&sup8; miteinander verbunden sind;
b. 0 bis 3 Aminosäuren auf der N-terminalen Seite des Cys¹, 9 bis 14 Aminosäuren zwischen den Cys¹ und Cys², 3 bis 7 Aminosäuren zwischen den Cys² und Cys³, 11 bis 18 Aminosäuren zwischen den Cys³ und Cys&sup4;, 1 bis 6 Aminosäuren zwischen den Cys&sup4; und Cys&sup5;, 7 bis 15, Aminosäuren zwischen den Cys&sup5; und Cys&sup6;, keine Aminosäuren zwischen den Cys&sup6; und Cys&sup7;, 3 bis 5 Aminosäuren zwischen den Cys&sup7; und Cys&sup8; und 0 bis 10 Aminosäuren auf der C-terminalen Seite des Cys&sup8; enthält; und
c. eine Identität der Aminosäuren in ihrer Anordnung von wenigstens 40% mit der unter der Nummer SEQ ID NO: 3 aufgeführten Aminosäuresequenz aufweist.
Die Bezeichnung Xenoxin bezieht sich auf ein kleines basisches Protein, welches die beschriebenen Eigenschaften aufweist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet die an einem Cysteinrest aufgeführte Nummer seine Position bezüglich anderer Cysteine in dem Xenoxin von N- nach C-terminal. Somit bezieht sich Cys¹ auf das erste Cystein in einem erfindungsgemäßen Xenoxin auf der N-terminalen Seite.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso intermediäre Peptide, die noch nicht ihre gefaltete Konformation angenommen haben, jedoch wenigstens 8 Cysteine enthalten, die sich durch 4 Disulfidbrücken gemäß der Konfiguration Cys¹ mit Cys³, Cys² mit Cys&sup4;, Cys&sup5; mit Cys&sup6; und Cys&sup7; mit Cys&sup8; verbinden können.
Aus diesem Grund betrifft die vorliegende Erfindung ein basisches Peptid, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Aminosäuresequenz aufweist, welche:
a. wenigstens 8 Cysteine enthält, die, wenn das Peptid seine zusammengefaltete Struktur annimmt, durch 4 Disulfidbrücken gemäß der Konfiguration Cys¹ mit Cys³, Cys² mit Cys&sup4;, Cys&sup5; mit Cys&sup6; und Cys&sup7; mit Cys&sup8; miteinander verbunden sind;
b. 0 bis 3 Aminosäuren auf der N-terminalen Seite des Cys¹, 9 bis 14 Aminosäuren zwischen den Cys¹ und Cys², 3 bis 7 Aminosäuren zwischen den Cys² und Cys³, 11 bis 18 Aminosäuren zwischen den Cys³ und Cys&sup4;, 1 bis 6 Aminosäuren zwischen den Cys&sup4; und Cys&sup5;, 7 bis 15 Aminosäuren zwischen den Cys&sup5; und Cys&sup6;, keine Aminosäure zwischen den Cys&sup6; und Cys&sup7;, 3 bis 5 Aminosäuren zwischen den Cys&sup7; und Cys&sup8; und 0 bis 10 Aminosäuren auf der C-terminalen Seite des Cys&sup8; enthält; und
c. eine Identität der Aminosäuren in ihrer Anordnung von wenigstens 40% mit der unter der Nummer SEQ ID NO: 3 aufgeführten Aminosäuresequenz aufweist,
oder ein von dieser Sequenz abgeleitetes Fragment.
Die bevorzugten Peptide der vorliegenden Erfindung enthalten 2 Aminosäuren auf der N-terminalen Seite des Cys¹, 10 bis 13 Aminosäuren zwischen den Cys¹ und Cys², 4 bis 6 Aminosäuren zwischen den Cys² und Cys³, 12 bis 17 Aminosäuren zwischen den Cys³ und Cys&sup4;, 1 bis 5 Aminosäuren zwischen den Cys&sup4; und Cys&sup5;, 8 bis 14 Aminosäuren zwischen den Cys&sup5; und Cys&sup6;, keine Aminosäure zwischen den Cys&sup6; und Cys&sup7;, 4 Aminosäuren zwischen den Cys&sup7; und Cys&sup8; und 2 Aminosäuren auf der C-terminalen Seite des Cys&sup8;.
Andere, ebenso bevorzugte Peptide der vorliegenden Erfindung weisen eine Aminosäureidentität von wenigstens 50%, besonders bevorzugt von wenigstens 60%, und, vorteilhafterweise, von wenigstens 70%, mit der unter Nummer SEQ ID NO: 3 aufgeführten Aminosäuresequenz auf.
Die besonders bevorzugten Peptide der vorliegenden Erfindung sind die Xenoxine, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche:
a. wenigstens 8 Cysteine enthält, die durch 4 Disulfidbrücken gemäß der Konfiguration Cys¹ mit Cys³, Cys² mit Cys&sup4;, Cys&sup5; mit Cys&sup6; und Cys&sup7; mit Cys&sup8; miteinander verbunden sind;
b. 0 bis 3 Aminosäuren auf der N-terminalen Seite des Cys¹, 13 Aminosäuren zwischen den Cys¹ und Cys², 6 Aminosäuren zwischen den Cys² und Cys³, 12 Aminosäuren zwischen den Cys³ und Cys&sup4;, 5 Aminosäuren zwischen den Cys&sup4; und Cys&sup5;, 14 Aminosäuren zwischen den Cys&sup5; und Cys&sup6;, keine Aminosäure zwischen den Cys&sup6; und Cys&sup7;, 4 Aminosäuren zwischen den Cys&sup7; und Cys&sup8; und 0 bis 10 Aminosäuren auf der C-terminalen Seite des Cys&sup8; enthält; und
c. eine Identität der Aminosäuren in ihrer Anordnung von wenigstens 80%, bevorzugt 90%, mit der unter der Numemr SEQ ID NO: 3 aufgeführten Aminosäuresequenz aufweist.
Die erfindungsgemäßen Peptide enthalten vorteilhafterweise 42 bis 86 Aminösäuren, bevorzugt 51 bis 75 Aminosäuren und, besonders bevorzugt, 62 bis 75 Aminösäuren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso Peptide mil 66 Aminosäuren, welche eine Identität der Aminosäuren in ihrer Anordnung von wenigstens 80%, bevorzugt wenigstens 90%, und, besonders bevorzugt, wenigstens 95%, mit der unter der Nummer SEQ ID NO: 3 aufgeführten Aminosäuresequenz aufweisen.
Als besonders bevorzugte Peptide seien beispielhaft das Peptid Xenoxin-1, welches unter der Nummer SEQ ID NO: 3 aufgeführt ist, sowie das Xenoxin-2 gemäß SEQ ID NO: 4 und das Xenoxin-3 gemäß SEQ ID NO: 5 genannt.
Um den Identitätsgrad der Aminosäuren zu bestimmen, werden die Cysteine derart aufgereiht, dass sie sich in identischer Position mit den Cysteinen der unter SEQ ID NO: 3 aufgeführten Aminosäuresequenz befinden und eine minimale Anzahl von Insertionen oder Deletionen eingeführt, um die Anordnung der Sequenzen zu maximalisieren. Somit werden die identischen Aminosäuren identifiziert, die sich in identischer Position befinden, darunter die Cysteine. Die Aminosäureidentität wird in Prozent ausgedrückt und gemäß folgender Formel (1) berechnet:
worin
n die Anzahl der identischen Aminosäuren ist,
66 die Anzahl der Aminosäuren der unter der Nummer SEQ ID NO: 3 aufgeführten Sequenz ist,
p die Anzahl der eingeführten Insertionen oder Deletionen ist.
Die erfindungsgemäßen Peptid können in Form ihrer nicht toxischen, pharmazeutisch geeigneten Säureadditionssalze vorliegen. Als Beispiele für pharmazeutisch geeignete Säuren seien die Mineralsäuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure usw., und die organischen Säuren, wie Sulfonsäuren und Carbonsäuren, sowie die Essigsäure, Milchsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Maleinsäure, Weinsäure, Ascorbinsäure, Zitronensäure usw., genannt.
Die erfindungsgemäßen Peptide können ebenso in Form ihrer Basenadditionssalze vorliegen, sofern sie freie Carboxylgruppen enthalten. Als Beispiele geeigneter pharmazeutischer Salze seien die Natriumsalze, Kaliumsalze, Calciumsalze oder Magnesiumsalze und die Derivate quaternärer Ammoniumsalze genannt.
Wenn die erfindungsgemäßen Peptide gleichzeitig Carboxylgruppen und freie Amingruppen enthalten, können sie in Form ihrer internen Salze oder in kombinierter Form der Additionssalze und interner Salze vorliegen.
Eine Familie der erfindungsgemäßen Xenoxine enthält Peptide, die von verschiedenen Amphibien- oder Säugetierarten stammen. Beispielhaft für die Amphibien seien die Arten genannt, die der Überordnung der Salienta angehören, wie die Frösche, Kröten, Laubfrösche usw., oder der Ordnung der Caudata, Urodela, wie die Salamander, Wassermolche usw., oder auch der Ordnung der Gymnophiona, Apoda, wie die Aale, Moränen usw.. Es ist außerdem möglich, die Xenoxine von Säugetieren, insbesondere von Mäusen, Schweinen oder dem Menschen, zu erhalten.
Den erfindungsgemäßen Xenoxinen sind pharmazeutische Eigenschaften bei den Säugetieren gemeinsam, die insbesondere auf ihren Interaktionen mit der Funktion von transmembranen Ionenkanälen und ihren Interaktionen mit dem Activin beruhen.
Die Identität der Aminosäuren der verschiedenen Xenoxine kann aufgrund der zwischen den Arten auftretenden oder allelischen Divergenzen variieren. Am häufigsten handelt es sich um konservative Substitutionen, welche die Konservierung der Skelettkonformation des Peptids erlauben. Bevorzugt tritt eine Substitution in den erfindungsgemäßen Xenoxinen an, im Vergleich zu der unter SEQ ID NO: 3 aufgeführten Sequenz, homologer Position mit einer Aminosäure auf, die eine bezüglich der hydrophoben Eigenschaften, der Ladung oder des Abstands äquivalente Funktion aufweist. Beispielsweise wird in der Gruppe der hydrophoben Aminosäuren zwischen Alanin, Isoleucin, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Tryptophan und Valin, in der Gruppe der polaren, nicht geladenen Aminosäuren unter Asparagin, Cystein, Glutamin, Glycin, Serin, Threonin und Tyrosin, unter den positiv geladenen Aminosäuren unter Arginin, Histidin und Lysin unter den negativ geladenen Aminosäuren unter Asparaginsäure und Glutaminsäure und unter der Gruppe der Aminosäuren mit äquivalenter Anordnung unter Alanin, Glycin und Serin gewählt.
Eine post-translationelle Modifikation, wie die Bildung von Disulfidbrücken zwischen den Cysteinen des Peptids, stabilisiert die gefaltete Konformation der Xenoxine, was die Ausübung ihrer pharmakologischen Wirkungen ermöglicht.
Die verschiedenen Disulfidbrücken bilden sich nicht zufällig aus. Wenn man das Zusammenrollen der Aminosäuresequenz erlaubt, verbinden sich die Disulfidgruppierungen jeweils zwischen zwei benachbarten Cysteinen in dem zusammengefalteten Peptid. Aus diesem Grund kann die Skelettkonformation des Peptids durch die Konfiguration der Disulfidbrücken beschrieben werden. Somit werden die Verbindungen, die sich zwischen den Cysteinen in dem zusammengefalteten Peptid ausbilden, beschrieben und die Anzahl der Aminosäuren zwischen den verschiedenen aufeinanderfolgenden Cysteinen in der Primärsequenz des Peptids angegeben.
Es existiert also eine doppelte strukturelle Ähnlichkeit zwischen den Peptiden der gleichen Familie, nämlich auf dem Niveau des Peptidskeletts und auf dem Niveau der Aminosäureidentität. Bei Vergleich zweier Peptide der gleichen Familie können Aminosäuresequenzen mit einer signifikanten Unterschiedlichkeit, sogar eine Aminosäureidentität von nur 40%, auftreten. Im Gegensatz dazu ist die Ähnlichkeit der Konfiguration der Cysteine, welche in die Bildung der Disulfidbrücken verwickelt sind, frappierend.
Die erfindungsgemäßen Xenoxine in vollständiger Form oder in Fragmentform können ebenso in komplexere chemische oder physiko-chemische Strukturen eingeführt werden, um ihre Wirkung zu erleichtern oder ihnen vorteilhafte therapeutische Eigenschaften zu verleihen, beispielsweise in eine Depotform oder Schutzform.
Die Erfindung betrifft ebenso nicht modifizierte, beispielsweise nicht glykosylierte, Xenoxine. Jedoch umfasst der Schutz ebenso modifizierte Xenoxine, beispielsweise glykosylierte, deglykosylierte oder durch Polyethylenglykol modifizierte Produkte.
Die erfindungsgemäßen Xenoxine können nach folgendem Verfahren isoliert werden:
a. Aufteilen des durch die Haut des Frosches sekretierten Materials in Fraktionen durch Ausfällung mit Hilfe von Ammoniumsulfat oder einem gleichwertigen Ausfällungsmittel,
b. Durchführen einer Gelpermeations-Chromatographie der Präzipitate, die sich zwischen 39- und 70%iger, bevorzugt zwischen 30- und 60%iger Ammoniumsulfatsättigung oder unter gleichwertigen Bedingungen bilden, und
c: Gewinnen der spät-eluierten peptidischen Fraktion.
Wenn gewünscht, kann die so erhaltene Xenoxinmischung anschließend gereinigt werden, insbesondere durch Kationenaustausch-HPLC und anschließende Umkehrphasen-HPLC.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammt das durch die Froschhaut sekretierte Material von Xenopus laevis.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Peptidfraktion vorteilhafterweise mit Hilfe von Ammoniumsulfat ausgefällt. Es können jedoch auch andere Ausfällungsmittel, wie Polyethylenglykol, Ethanol oder Natriumsulfat, verwendet werden. Es bleibt dem Fachmann überlassen, den Sättigungsbereich des notwendigen Ausfällungsmittels auszuwählen, um Präzipitate zu erhalten, welche einerseits frei von Proteinen und andererseits von Peptiden mit einem Molekulargewicht unter 10 kDa, bevorzugt 8 kDa, sind.
Normalerweise erlaubt die Gelpermeationschromatographie die Abtrennung von Molekülen in Anhängigkeit ihrer molekularen Größe. In dem erfindungsgemäßen Verfahren ermöglicht diese Chromatographie die Abtrennung aller Moleküle mit beträchtlicher molekularer Größe, der betreffenden Peptide, durch ausschließliches Sammeln der Fraktion, die spät aus der Säule eluiert wird.
Dafür kann jeder Permeationsgeltyp verwendet werden, der einen Fraktionierungsbereich über 10 kDa aufweist. Diese Art von Gel ist beispielsweise unter dem Namen Sephacryl 5200 (Pharmacia), Sephadex (Pharmacia), Fractogel (Merck) oder Toyopearl (Toso Haas), kommerziell erhältlich.
Ebenso können die erfindungsgemäßen Peptide chemisch durch die dem Fachmann bekannten Synthesemethoden synthetisiert werden. Es wird dabei auf E. Bayer, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30, (1991), p 113, Bezug genommen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Expression der Xenoxine in zellulären Systemen, die sich von dem natürlichen zellulären System, aus dem die stammen, unterscheiden.
Somit betrifft die Erfindung ebenso die isolierten DNA- Sequenzen, welche für die Xenoxine kodieren, sowie die Expressionskassetten dieser Sequenzen, die ihre Expression in der gewünschten Zelle gewährleisten.
Unter isoliertem DNA-Fragment wird ein DNA-Fragment verstanden, welches nicht mehr mit der Gesamtheit der natürlichen Bereiche verbunden ist, welche seine Expression in dem Organismus kontrollieren, aus dem es stammt, dass heißt im Fall des obigen Beispiels aus Xenopus leavis.
Unter den isolierten DNA-Sequenzen, die eine Sequenz enthalten, welche für ein erfindungsgemäßes Peptid kodiert, sei insbesondere die DNA genannt, die in der Identifikationsliste der Sequenzen unter der Nummer SEQ ID NO: 1 aufgeführt ist, insbesondere der Bereich der SEQ ID NO: 1 von Position 39 bis 290 und der Bereich der SEQ ID NO: 1 von Position 93 bis 290.
Die Erfindung betrifft Expressionskassetten dieser DNA- Sequenzen, welche für ein erfindungsgemäßes Peptid kodieren.
Eine derartige Expressionskassette enthält insbesondere ein isoliertes DNA-Fragment, welches unter der Kontrolle von Elementen platziert ist, welche seine Transkription und seine Translation in der betreffenden Wirtzelle ermöglichen.
Diese Kontrollelemente sind im Wesentlichen ein geeigneter Transkriptionspromotor sowie die Codons für die Initiation und das Ende der Translation. In bestimmten Fällen ist es außerdem vorteilhaft, einen Transkriptionsterminator und ein Peptidsignal oder eine Prä-Sequenz, ggf. gefolgt von einer Pro- Sequenz, anzufügen. Insbesondere ist die Pro-Sequenz des Defensins A von Phormia terranovae bevorzugt (Dimarcq et coll. EMBO J. 9 (1990) p 2507), welche in Eukaryotenzellen, insbesondere der Hefe, wie Saccharomyces cerevisiae, funktionell sind.
Die Erfindung betrifft ebenso eine Zelle, welche mit einer Expressionskassette, die ein erfindungsgemäßes DNA-Fragment enthält, transformiert ist. Die Expressionskassette kann in das Genom der Zelle integriert sein oder von einem geeigneten Expressionsvektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem viralen Vektor, getragen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Verwendung von Expressionsvektoren, welche verabreicht werden können, um die Xenoxine in situ beim Menschen oder Tier zu produzieren, insbesondere wenn der Vektor ein viraler Vektor oder synthetischer Vektor ist (beispielsweise Mischungen von Lipiden, wie den Liposomen).
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Peptids, welches aus der Kultivierung einer erfindungsgemäßen transformierten Zelle und der Gewinnung des Peptids aus der Kultur besteht.
Die Technologien, welche die Klonierung und Expression eines Fremdgens in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtzelle ermöglichen, sind dem Fachmann bekannt. Sie sind in den folgenden Beispielen veranschaulicht, wobei auch andere Vektoren und andere Wirtzellen verwendet werden können. Für den Fachmann ist es offensichtlich, einen geeigneten Transkriptionspromotor in Abhängigkeit des Wirts, in dem die Expression des DNA-Fragments gewünscht ist, und in Abhängigkeit des Vektors, in den die Expressionskassette eingefügt werden soll, auszuwählen.
In einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßem Peptids wird das isolierte DNA-Fragment in Wirtzellen exprimiert, welche die Sekretion der synthetisierten Peptide in das Kulturmedium und die Bildung der Disulfidbrücken ermöglichen. Beispielhaft seien die prokaryotischen Wirtzellen, wie E. coli, niedere Eukaryoten, wie Saccharomyces cerevisiae, oder höhere Eukaryotne, wie Mensch, Tier und Pflanze, genannt.
Um ein erfindungsgemäßes Peptid in das Sekretionssystem der Wirtzellen zu dirigieren, ist in der Expressionskassette eine Sequenz vorgesehen, die für einen Vorläufer des Peptids kodiert. Dieser Vorläufer enthält im Wesentlichen ein erfindungsgemäßes Peptid in reifer Form und ein Signalpeptid, welches durch eine peptidische Bindung an seinen NH2-Terminus gebunden ist. Ein Signalpeptid weist im Allgemeinen eine im Wesentlichen hydrophobe Aminosäuresequenz auf und hat die Funktion, die Sekretion zu fördern. Während des Translokationsprozesses wird dieses Signalpeptid durch ein Emzym, die Signalpeptidase, abgespalten. Somit wird ein reifes Peptid in das Kulturmedium oder in das Periplasma des Wirts sekretiert.
Das bevorzugt verwendete Signalpeptid stammt von Genen, von denen bekannt ist, dass sie für ein effizient sekretiertes Produkt kodieren. Beispielhaft seien das Signalpeptid der periplasmatischen Invertase SUC2 (R.A. Smith et coll., Science 229, (1885), p 1219; C.N. Chang et coll., Mol Cell. Biol. 6, (1986), p 1812), sowie die Signalpeptide Toxine "killer" von Kluyveromyces lactis (C. Baldazi et coll., EMBO J. 6, (1987), p 229) oder von Saccharomyces cerevisiae (M. Tokunaga et coll., Nucleic Acids Res. 16, (1988), p 7499) genannt. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass das Signalpeptid des Gens BGL2, welches von S. cerevisiae stammt (T. Achstetter et coll., Gene 110, (1992) p 25) und in den folgenden Beispielen verwendet wird, den Erhalt von sehr guten Ergebnissen ermöglicht. Dennoch können ebenso die natürlichen Signalpeptide der Xenoxine verwendet werden.
In bestimmten Fällen weist das erhaltene Peptid nicht die richtige Konfiguration auf; es kann somit notwendig sein, seine Umlagerung durch chemische Methoden zu bewirken, beispielsweise durch das In-Lösung-Bringen und das Umfalten durch beispielsweise Veränderung der pH- und Harnstoff-Bedingungen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso monoklonale oder polyklonale Anti-Xenoxin-Antikörper, welche durch die bekannten Verfahren erhalten werden können, sowie ihre Anwendung sowohl in der Therapie als auch im diagnostischen Bereich zur Identifizierung oder Quantifizierung der Xenoxine beim Menschen oder Tier. Die Auswahl der verwendbaren Techniken ist groß und bleibt dem Fachmann überlassen. Insbesondere seien die ELISA-Technik, die Markierungs- oder auch Fluoreszenz- Technik genannt.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ebenso Diagnostiksysteme, welche die Xenoxine oder entsprechende Antikörper verwenden.
Die erfindungsgemäßen Peptide können therapeutisch bei Säugetieren und insbesondere beim Menschen angewendet werden, wo ihre Eigenschaft ausgenutzt wird, die Funktion von transmembranen Ionenkanälen und des Activins beeinflussen zu können, ohne neurotoxische Wirkung zu haben.
Folglich betrifft die Erfindung ebenso:
eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff wenigstens ein erfindungsgemäßes Peptid enthält;
- die therapeutische Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptids.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist im Besonderen zur präventiven oder kurativen Behandlung von Krankheiten, wie beispielsweise herzbezügliche Arythmie aufgrund von Hoch- oder Niedrigdruck; fibrocystische Erkrankungen genetischen. Ursprungs, wie cystische Fibrose des Pancreas, besser bekannt unter dem Namen Mucoviscidose; Störungen, die mit einem Ungleichgewicht des humanen Choriongonadotrophins während der Schwangerschaft verbunden sind; Erkrankungen aufgrund einer unausgeglichenen Sekretion der Hormone FSH, STH und ACTH (Follicle Stimulating Hormones, Somatotropic Hormone und Adenocorticotropic Hormone); die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen ermöglichen ebenso eine Regulierung der Erythropoiese.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemäßen Peptide einschließen, können auf dem für die letztendliche Bestimmung jeweils geeignetestem Wege verabreicht werden, insbesondere auf oralem, parenteralem oder rektalem Weg.
Die für die orale Verabreichung verwendbaren pharmazeutischen Zusammensetzungen können fest oder flüssig sein, beispielsweise in Form von Tabletten (umhüllt oder nicht), Pillen, Dragees, Gelatinekapseln, Lösungen, Sirupe usw..
Ebenso handelt es sich bei den Zusammensetzungen, die für den parenteralen Verabreichungsweg geeignet sind, um die für diese Verabreichungsform bekannten pharmazeutischen Formen, beispielsweise um Lösungen, Suspensionen oder wässrige oder ölige Emulsionen, welche für intramuskuläre, intravenöse, intraperitoneale, subcutane Injektionen, oder die Aufnahme über die Schleimhaut, beispielsweise durch Spray, Salben usw., geeignet sind.
Für die rektale Verabreichung liegen die Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten, im Allgemeinen in Form von Zäpfchen vor.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können ebenso in Form hergestellt werden, die eine kontrollierte Freisetzung ermöglicht, und, in Abhängigkeit ihres Verabreichungsweges, in einer geschützten Form, die geeignet ist, einen zu schnellen Abbau des Peptids zu verhindern.
Die pharmazeutischen Formen, wie injizierbare Lösungen, injizierbare Suspensionen, Tabletten, Tröpfchen, Zäpfchen usw., werden gemäß den allgemein von den Pharmazeuten verwendeten Verfahren hergestellt. Die pharmazeutischen Formen umfassen ebenso Zusammensetzungen, welche die Freisetzung des aktiven Peptids auf progressive Weise ermöglichen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden mit einem festen oder flüssigen, nicht toxischen, pharmazeutisch geeigneten Träger und, gegebenenfalls, mit einem Dispersionsmittel, Aufschlussmittel, Stabilisator usw., gemischt. Ebenso können beispielsweise Süßungsmittel, Färbemittel usw. zugefügt werden. Der prozentuale Anteil des aktiven Produkts in der pharmazeutischen Zusammensetzung kann in sehr breiten Grenzen variieren, in Abhängigkeit des Patienten und des Verabreichungsweges, im Besonderen der Verabreichungshäufigkeit.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne diese einzuschränken, mit Bezug auf die Fig. 1 bis 4.
In Fig. 1 ist eine SDS-PAGE, angefärbt mit Coomassie-Blau, zweier verschiedener Reinigungsstufen dargestellt. (1) peptidische Fraktion, gewonnen nach Sephacryl-S300- Gelpermeationschromatographie; (2) molekularer Gewichtsmarker von niedrig bis hoch: Lysozym (14300), Trypsininhibitor (21500), Kohlenstoffanhydrase (30000), Ovalbumin (46000), Albumin aus Kälberserum (69000), Phosphorylase b (92500) und Myosin (200000); (3) Xenoxin-1, gereinigt durch Kationenaustausch-HPLC und Umkehrphasen-HPLC gemäß Beispiel 1.
In Fig. 2 ist ein Elutionsprofil dargestellt, erhalten nach Kationenaustausch-HPLC der peptidischen Fraktion, welche aus Hautsekret von Xenopus laevis stammt und durch Ammoniumsulfat-Präzipitation und anschließende Gelpermeations- Chromatographie unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen erhalten wurde. Die Fraktionen, welche jeweils Xenoxin- 1, Xenoxin-3 und Xenoxin-2 enthalten, sind durch aufeinanderfolgende Pfeile gekennzeichnet.
In Fig. 3 A ist die Anordnung von (a) Xenoxin-1 mit (b) dem Cytotoxin aus Naja naja kaouthia, Naja naja siamensis, einer Monokelkobra (S. Inoue et coll., FEBS Lett. 218, (1987), p 17) und (c) dem kurzen Neurotoxin d von Laticauda colubrina, einer Gelblippen-Meeresbungare (N. Tamiya et coll. Toxincon (Suppl. 3), (1983), p 445) dargestellt. Die Abstände (-) sind eingefügt und die Disulfidbrücken angezeigt.
In Fig. 3 B ist die Anzahl der Aminosäuren zwischen den aufeinanderfolgenden Cysteinen in den Primäresequenzen für drei Peptidfamilien, den Xenoxinen, Cytotoxinen und kurzen Neurotoxinen, dargestellt.
In Fig. 4 ist die Anordnung von Xenoxin-1 mit 27 Aminosäuren der N-terminalen Bindungsstelle mit 116 Resten des humanen Activinrezeptors dargestellt.

Beispiel 1: Reinigung und Charakterisierung der Xenoxine

1.1 Isolierung und Reinigung der Xenoxine

Xenopus laevis (Herpetologie Institute, DeRover, Niederlande) wird in belüfteten Kisten gehalten und mit gehackter Schweineleber ernährt. Alle 3 Wochen werden die Tiere einem leichten elektrischen Schock (15 V) ausgesetzt und die Sekrete ihrer Haut gemäß der durch C. Mollay et coll., Eur. J. Biochem. 160, (1986), p 31, beschriebenen Methode in eine 0,9%ige NaCl-Lösung gebracht. Der so extrahierte Schleim wird zwei aufeinander folgenden Extraktionen mit n-Butanol im gleichen Volumen unterzogen. Die unlösliche Fraktion wird durch 15- minütige Zentrifugation bei 15.000 Umdrehungen pro Minute (Sorvall RC-5B, Rotor SS34) abgetrennt. Zu dem Überstand wird anschließend Ammoniumsulfat gegeben und das zwischen 30- und 60%iger Sättigung ausfallende Material gewonnen. Dieser Niederschlag wird aufgelöst und in 50 mM Ammoniumacetat, pH 5,0, dialysiert und unter Verwendung einer Sephacryl-S300-Säule (2,7 cm · 120 cm; Pharmacia), welche mit dem gleichen Puffer equillibiert ist, einer Gelpermeationschromatographie unterzogen. Die peptidische Fraktion wird bei 280 nm detektiert und in Form eines großen Piks spät eluiert. Nur diese späte Fraktion wird gesammelt und lyophilisiert.
Es wird eine SDS-PAGE durchgeführt und mit Coomassie-Blau angefärbt, um zu bestätigen, dass die Moleküle mit einem Molekulargewicht über 10 kDa getrennt sind (siehe Fig. 1).
Die lyophilisierte peptidische Fraktion wird in 50 ml 5%igen Acetonitril in 20 mM Ammoniumacetat pH 4,6 aufgenommen und anschließend 15 Minuten bei 15.000 Umdrehungen pro Minute (Sorvall RC-5B, Rotor SS34) zertrifugiert. Der Überstand wird auf einem Millex-GV-Filter von 0,22 um (Millipore) filtriert und Aliquotes von 5 ml bei -80ºC eingefroren.
Ein 5-ml-Aliquot der Lösung wird in 90 ml CE1-Puffer (25% Acetoniltril in monobasischem 5 mM Kaliumphosphat, mit Hilfe von Phosphorsäure auf pH 3,0 eingestellt) verdünnt. Die Konduktivität der Lösung wird mit Hilfe des CE1-Puffers auf 8 mS eingestellt und, wenn nötig, der pH-Wert mit Hilfe von Phosphorsäure auf 3,0 eingestellt. Die so erhaltene Lösung wird in drei Aliquots aufgeteilt, die nacheinander einer Trennung durch Kationenaustausch-HPLC (Hochleistungsflüssigchromatographie) mit UV-Detektion bei 215 nm folgendermaßen unterzogen werden:
- Das Aliquot wird auf eine HPLC-Säule (Poly-Sulfoethylaspartamid-SCX; 9,4 mm · 200 mm; The Nest Group) mit einem Durchfluss von 1,6 mm/Min. geladen;
- die Säule wird mit CE1-Puffer gewaschen, bis sich die Basislinie bei 215 nm stabilisiert hat;
- ein Gradient von 0 bis 100% des CE2-Puffers (600 mM Kaliumchlorid in CE1-Puffer) wird 40 Minuten lang aufgetragen, um das adsorbierte Material zu eluieren, welches manuell in Fraktionen von 1,6 ml gesammelt wird;
- die Säule wird mit dem CE2-Puffer 10 Minuten lang gewaschen;
- ein Gradient von 100% CE2-Puffer bis 100% CE1-Puffer wird 5 Minuten lang aufgetragen; und
- die Säule wird 15 Minuten lang mit CE1-Puffer gewaschen.
Es werden das Xenoxin-1, welches zwischen 362 und 392 mM Kaliumchlorid nach 33,3 bis 35,3 Minuten eluiert; das Xenoxin- 3 (398-415 mM; 35,9-37,1 Minuten); und das Xenoxin-2 (415 -435 mM; 37,1-38,6 Minuten) erhalten, welche durch die aufeinanderfolgenden Pfeile in dem Diagramm der Fig. 2 gekennzeichnet sind.
Anschließend wird eine Trennungsstufe durch Umkehrphasen- HPLC (Hewlett Packard 1090A) mit UV-Detektion bei 205 nm durchgeführt. Dazu werden die einzelnen aus der Kationenaustausch-HPLC-Chromatographie stammenden Fraktionen direkt auf eine Vydac-C&sub1;&sub8;-Säule (10 mm · 250 mm; Vydac Separation Group), welche mit dem RP1-Puffer equlillibiert wurde (0,10% (v/v) Trifluoressigsäure (TFA) in deionisiertem Wasser, hergestellt durch das Wasserherstellungssystem von Millipore (Milli Q- Wasser)), mit einem Durchfluss von 1,5 ml/Minute geladen.
Für jede geladene Fraktion werden die Xenoxine aus der Säule nach folgendem Verfahren eluiert:
- 100% RP1-Puffer, 5 Minuten lang, zum Restabilisieren der Säule;
- ein Gradient von 100% RP1-Puffer bis 71,4% RP2-Puffer (30/70/0,10 (v/v/v) Milli-Q-Wasser/Acetonitril/TFA) wird 100 Minuten lang aufgetragen;
- die Säule wird mit 71,4%igem RP2-Puffer 10 Minuten lang gewaschen;
- ein Gradient von 71,4% RP2-Puffer bis 100% RP1-Puffer wird 5 Minuten lang aufgetragen; und
- die Säule wird mit 100% RP1-Puffer 15 Minuten lang gewaschen.
Die Fraktionen werden manuell gesammelt und die gereinigten und entsalzten Xenoxine mit Hilfe eines Speed Vac Concentraters (Savant) konzentriert und bei -20ºC gelagert.
Auf diese Weise werden, ausgehend von einem Hautsekret- Äquivalent von 150 Xenopus laevis, 800 ug Xenoxin-1, 650 ug Xenoxin-2 und 200 ug Xenoxin-3 gewonnen.

1.2 Charakterisierung der Xenoxine

1.2.1 Reduktion und Alkylierung

50 mg der gemäß Beispiel 1.1 gereinigten und konzentrierten Xenoxine werden in einem Alkylierungspuffer (250 mM Tris-HCl, pH 8,5; 6 M Guanidiniumchlorid; 1 mM EDTA) mit einer Konzentration von 250 ug/ml aufgenommen und anschließend mit einem Vortex homogenisiert und 5 Minuten beschallt. Anschließend werden 5 ul β-Mercaptoethanol in Milli-Q-Wasser (20/80 (v/v)) zugegeben, die Mischung unter Argon gebracht und bei 37ºC belassen. Nach zwei Stunden werden 10 ul 4-Vinylpyridin (4 VP; Janssen) zugegeben, die Mischung erneut unter Argon gebracht und bei Umgebungstemperatur belassen. Nach 2 Stunden wird die Reaktionsmischung eingefroren und bis zu ihrer Verwendung zum Verdau oder zur Entsalzung gelagert.

1.2.2 Verdau mit Clostripain (CL), Trypsin (T) oder Cyanbromid (CNBr)

Das Clostripain (Sigma) wird bei einer Konzentration von 1 mg/ml in CL-Puffer (Tris-HCl 100 mM, pH 7,5; Calciumdichlorid 1 mM, DTT 2,5 mM) bei 37ºC 2 Stunden lang aktiviert. 12 ug des gemäß Beispiel 1.1 hergestellten Xenoxins (alkyliert mit 4 VP, gemäß Beispiel 1.2.1, oder nicht alkyliert) werden in dem CL- Puffer 16 Stunden lang bei 37ºC mit einer Konzentration von 150 ug/ml und einem Gewichtsverhältnis Protease/Substrat von 1 : 10 inkubiert. Anschließend werden 8 ul Eisessigsäure und 70 ul RP1-Puffer (siehe oben) zugegeben. Die so erhaltene Lösung wird anschließend verwendet, um die Peptidkarte durch Umkehrsphasen-HPLC-Chromatographie, wie in folgendem Beispiel 1.2.3 beschrieben, zu bestimmen.
Das Trypsin (1 mg/ml in 1 mM HCl) (Boehringer) wird 10-fach in TR-Puffer (N-Ethylmorpholin-HCl, 100 mM, pH 8,3; Calciumdichlorid 0,1 mM) verdünnt. 25 ug des gemäß Beispiel 1.1 hergestellten Xenoxins (alkyliert mit 4 VP oder nicht alkyliert) werden 16 Stunden lang bei 37ºC mit einer Konzentration von 240 ug/ml und einem Gewichtsverhältnis Protease/Sustrat zwischen 1 : 5 und 1 : 100 inkubiert. Anschließend werden 2 ul des reinen TFA-Puffers und 100 ul RP1-Puffer zugegeben und die so erhaltene Lösung zur Bestimmung, der peptidischen Karte durch Umkehrsphasen-HPLC-Chromatographie, wie in Beispiel 1.2.3 beschrieben, verwendet.
40 ul einer Lösung (Gewicht/Volumen) aus 1% CNBr (Pierce) in 70%iger Ameisensäure werden zu 25 ug des gemäß Beispiel 1.1 hergestellten Xenoxins (alkyliert mit 4 VP oder nicht alkyliert) gegeben. Die Reaktion erfolgt 16 Stunden lang nach Zugabe von 300 ul Milli-Q-Wasser. Die Reaktionsmischung wird mit Hilfe eines Speed-Vac-Konzertrators getrocknet. Es werden 250 ul RP1-Puffer zugegeben. Die so erhaltene Lösung wird zur Bestimmung der peptidischen Karte durch Umkehrphasen-HPLC- Chromatographie, wie in Beispiel 1.2.3 beschrieben, verwendet.

1.2.3 Bestimmung der peptidischen Karte durch Umkehrphasen- HPLC-Chromatographie.

Die peptidische Karte wird durch Umkehrphasen-HPLC- Chromatographie mit Hilfe einer 1090A-HPLC-Einheit (Hewlett Packard) mit UV-Detektion bei 205 nm erstellt.
Die intakten Xenoxinmoleküle, ihre proteolytischen Fragmente sowie ihre mit 4 VP alkylierten Äquivalente werden auf eine Superspher-100C&sub1;&sub8;-HPLC-Säule (4 mm · 125 mm; Merck), welche mit 10 mM TFA in 10/90 (v/v) Acetonitril/Milli-Q-Wasser äquilibriert wurde, mit einem Durchfluss von 1 ml/Minute geladen. Die Peptide werden nach folgendem Protokoll eluiert:
- Die Säule wird mit 10 mM TFA in 10/90 (v/v) Acetonitril/Milli-Q-Wasser 15 Minuten lang gewaschen; und
- ein linearer Gradient bis zu 10 mM TFA in 50/50 (v/v) Acetonitril/Milli-Q-Wasser wird 40 Minuten lang aufgetragen.
Die eluierten Fraktionen werden manuell gesammelt und mit Hilfe eines Speed-Vac-Konzentrators konzentriert.
Die beobachteten Retentionszeiten sind in den Tabellen I, II und III wiedergegeben.

1.2.4 Bestimmung der Aminosäuresequenz

Die gemäß Beispiel 1.2.3 erhaltenen Peptide werden in einer 80%igen Ameisensäurelösung gelöst und die Bestimmung der N- terminalen Sequenz mit Hilfe einer Proteinsequenziervorrichtung des Typs 477A, verbunden mit einem Phenylthiocarbamid-Aminosäuren-HPLCl Analysator (Applied Biosystems Inc.) gemäß den Standardprotokollen durchgeführt. Die Ergebnisse der Sequenzierung sind in den folgenden Tabellen I, II und III wiedergegeben. Tabelle 1
(1) CNBR, CL oder T geben die verwendete proteolytische Methode an
a komplettes Molekül, es ist ausschließlich der analysierte Bereich dargestellt
b zwei peptidische Sequenzen sind parallel aufgeführt
c Peptid, erhalten aus einer unvollständigen Spaltung
d die mit X bezeichneten Reste sind nicht identifizierbar Tabelle 2
(1) CL oder T geben die verwendete proteolytische Methode an
a vollständiges Molekül, es ist nur der analysierte Bereich dargestellt
b die mit X bezeichneten Reste sind nicht identifizierbar Tabelle 3
(1) T geben die verwendete proteolytische methode an
a vollständiges Molekül, es ist ausschließlich der analysierte Bereich dargestellt
b die mit X bezeichneten Reste sind nicht identifizierbar
c drei peptidische Sequenzen sind parallel aufgeführt
d die kursiv gedruckten Aminosäuren sind von den Sequenzen des Xenoxin-1 und Xenoxin-2 abgeleitet

1.2.5 Massenspektrometrie

Die Massenspektrometriemessungen werden durch ESMS (Electrospray Mass Spectrometry) auf einem Massenspektrometer des Typs VG Bio Tech BioQ (VG Biotech Ltd.) durchgeführt. Die verwendeten Protokolle sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in A. Van Dorsselaer et coll., Biomed. Environ. Mass Spectrom. 19, (1990), p 692, beschrieben. Die berechneten Molekulargewichte sind als mittlere Werte, basierend auf den Atomgewichten der Elemente C, H, N, O und S angegeben: C = 12,011; H = 1,0079; N = 14,0067; O = 15,9994 und S = 32,06.
Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle IV wiedergegeben- Tabelle IV Massenspektrometrie
a Masse, entsprechend dem Hauptsignal; ein weniger intensives Signal ergibt eine Masse von 7243,8 ± 0,4 Da, wahrscheinlich auf Grund der Addition eines Sauerstoffatoms am ersten Methionin.
b Unter der Annahme, dass die vier Disulfidbrücken intakt sind.
c Es werden 8 4-VP-Verbindungen pro Protein angezeigt; für das Xenoxin-1 ergibt ein, weniger intensives Signal eine Masse von 8091,8 ± 0,9 Da, wahrscheinlich auf Grund der Addition eines Sauerstoffatoms.
d Reduziertes Xenoxin, alkyliert mit 8 4VP-Komponenten.
e TCTTMK, Cystein, verbunden mit IMSLPGEQITCCEGNMCNA, unter der Annahme, das die zwei Disulfidbrücken intakt sind.
f CVNLQANGIK, Cystein, verbunden mit CLTLR, unter der Annahme, dass die Disulfidbrücke intakt ist.
g IMSLPGEQITCCEGNMCNA, alkyliert durch 3 4VP-Verbindungen.
h CVNLQANGIK, alkyliert durch eine 4VP-Verbindung.
i FCASGR, alkyliert durch eine 4VP-Verbindung.
j CLTLR, alkyliert durch eine 4VP-Verbindung.
k ITCCEGNMCNA, alkyliert durch drei 4VP-Verbindungen.
l IMSLPGEK.

Beispiel 2: Klonierung der für die Xenoxine kodierenden komplementären DNA

Bezüglich der allgemeinen Techniken zur Manipulation von Nukleinsäuren und der molekularen Klonierung wird, wenn diese nicht detailliert im folgenden Beispiel beschrieben sind, auf Maniatis et coll. verwiesen (Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)).

2.1 Synthese der Oligonukleotid-Primer

Unter Verwendung einer Oligonukleotid-Synthesevorrichtung (ABI 380B (Applied Biosystems Inc.) wurden gemäß den Standardverfahren 0,2 uMol der folgenden Oligonukleotide synthetisiert. Die degenerierten Basen sind gemäß dem Einbuchstabencode der "International Union of Biochemistry" (I.U.B) ausgedrückt; I entspricht dem Inosin.
OTG3278 (5'-ATGTCGACCARGARTGYGCIAARGARGA-3'), Sense-Strang- Q-E-C-A-K-E-D mit Addition eines Restriktionsstelle SalI am 5'-Ende zur Vereinfachung der späteren Subklonierung (SEQ ID NO: 26); und
OTG3279 (5'-ATAAGCTTCACATRTTICCYTCRCARCA-3'), Antisense- Strang-C-C-E-G-N-M-C mit Addition einer HindIII-Site am 5'- Ende zur Vereinfachung der späteren Subklonierung (SEQ ID NO: 27).
Nach der Deprotektion werden die Oligonukleotide auf u- Bondapak-C&sub1;&sub8; (3,5 mm · 300 mm; Waters) mit Hilfe eines Acetonitril-Gradienten von 20% bis 30% in Gegenwart von 100 mM Triethylamin/Essigsäure, pH 6,9, gereinigt. Die Oligonukleotide werden unter den dem Fachmann gut bekannten Standardbedingungen detrityliert und mit Hilfe ihres UV-Spektrums zwischen 230 und 340 nm quantifiziert.

2.2 Gen-Amplifikation

Die Messenger-RNA von Xenopus laevis wird nach dem in K. Richter, et coll, J. Biol. Chem. 261, (1986), p 3676, beschriebenen Verfahren erhalten und dann einer inversen Transkription, initiiert durch die degenerierten Primer, unterzogen. Auf diese Weise wird die cDNA erhalten, die als Matrize für die Amplifikation dient. Dann wird eine Gen- Amplifikationsstufe durch PCR (Polymerase. Chain Reaction) mit 0,5 ug cDNA in 50 ul, enthaltend 250 ng Oligonukleotide OTG3278 (Sense-Strang) und OTG3279 (Antisense-Strang), welche gemäß Beispiel 2.1 synthetisiert wurden, sowie Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, Kaliumchlorid 10 mM, Magnesiumdichlorid 1,6 mM, DTT 1 mM, 200 uM jedes Desoxyribonukleosidtriphosphats (dATP, cCTP, dGTP und cITTP) (Pharmacia) und 2,5 Einheiten DNA-Polymerase AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus), durchgeführt. Eine Einheit entspricht der Menge Emzym, die die Synthese von 10 nMol DNA während 30-minütiger Inkubation ermöglicht. Es werden 30 Amplifikationszyklen gemäß folgendem Protokoll durchgeführt:

Bei den 5 ersten Zyklen:

- Denaturierung bei 93ºC, 1 Minute (3 Minuten bei dem ersten Zyklus);
- Hybridisierung der Primer bei 50ºC, 2 Minuten;
- Polymerisation bei 72ºC, 30 Sekunden, mit einem Anstieg der Temperatur von 1ºC alle 20 Sekunden;

Bei den 25 restlichen Zyklen:

- Denaturierung bei 93ºC, 1 Minute;
- Hybridisierung bei 60ºC, 1 Minute; und
- Polymerisation bei 72ºC, 45 Sekunden.

2.3 Analyse

Eine Elektrophorese auf Agarosegel (1%) eines 5-ul- Aliquots des PCR-Produkts zeigt eine große Bande bei etwa 120 Basenpaaren.

2.4 Klonierung der PCR-cDNA

Die übrige DNA wird einem Verdau mittels der Restriktionsemzyme HindIII und SalI (Gibco-BRL) unterzogen; anschließend werden die DNA-Fragmente nach ihrer Größe mit Hilfe von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (Agarose Typ II Sigma) getrennt. Die so getrennte DNA wird gereinigt und in einen Bakteriophagen M13 gemäß den Standardverfahren kloniert. Die so klonierten PCR-cDNA-Fragmente werden als Sonde für das Screening der cDNA-Bank der Haut von Xenopus laevis verwendet.

2.5 Screening der cDNA-Bank der Haut von Xenopus laevis

Unter Verwendung des PCR-cDNA-Fragments PCR1 eines gemäß Beispiel 2.4 hergestellten Klons wird eine ³²P-markierte Sonde hergestellt. Die Sequenz der PCR1-Insertion ist in der Sequenzliste unter der Nummer SEQ ID NO: 28 wiedergegeben. PCR1 wird mit α[³²P] dATP (Amersham) gemäß der Zufallsprimer-Methode (Boehringer Mannheim) markiert.
Für das Screening wird die cDNA-Bank der Haut von Xenopus laevis, eingebaut in den Expressionsvektor λgt11, gemäß Kuchler et coll., J. Biol. Chem. 265, (1990), p 11731, verwendet. Es werden Gefäße mit etwa 2 · 10&sup4; Phagenplaques angelegt und ein Abdruck auf Nitrocellulosefilter BA85 (Schleicher & Schüll) gemacht.
Die bedruckten Filter werden anschließend mit der Sonde PCR1 ³²P in 2 · SET (Natriumchlorid-EDTA-Tris-HCl), 10 · Denhardt-Lösung und 0,1% SDS bei 55ºC hybridisiert.
Die positiven Klone werden in zwei aufeinanderfolgenden Screenings verwendet.

2.6 Sequenzierung der cDNA-Klone

Die DNA der positiven Phagen wird isoliert und die cDNA- Insertionen gemäß den Standardverfahren in M13TG130-Vektoren subkloniert (Kieny et coll., Gene 26, (1983), p 91).
Die Segtenzierung dieser cDNA-Insertionen wird gemäß der enzymatischen Methode von Sanger et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, (1977), p 5463, mit Hilfe eines Sequenase-Kits (US Biochemical Corp.) durchgeführt.
Es wurde die Nukleotidsequenz eines Klons mit einer cDNA- Insertion, bestehend aus 462 Basenpaaren, etabliert. Diese Sequenz ist in der Sequenzliste unter der Nummer SEQ ID NO: 1 wiedergegeben und enthält einen offenen Leseraster, welcher für das Prä-Xenoxin-1, welches 84 Aminosäuren enthält, kodiert. Das Peptid Prä-Xenoxin-1, welches aus der cDNA-Sequenz abgeleitet ist, beginnt mit einem Initiationsmethionin, kodiert von dem Codon ATG (bp 39 bis 41), gefolgt von einem Signalpeptid von 18 Aminosäuren, welches der Sequenz des reifen Xenoxin-1 vorangeht. Die Aminosäuresequenz des abgeleiteten reifen Xenoxin-1 entspricht exakt der vollständigen Aminosäuresequenz, welche durch den Abbau nach Edman des gemäß Beispiel 1.1 gereinigten Xenoxins-1 bestimmt wird, und ist in der Sequenzliste unter der Nummer SEQ ID NO: 3 wiedergegeben.
Das Polyadenylierungs-Signal AATAAA findet sich 12 Basenpaare stromaufwärts des 3-Endes.

2.7 Analyse der Peptidsequenzen

Die Sequenzen der Xenoxine wurden mit der Datenbank SWISS- PROT/PIR/GBTRAN Release 24 unter Verwendung von PROSCAN, Ver. 6.0, des Programms DNA STAR (DNA STAR Inc.) verglichen.
Diese Recherche erlaubt lediglich die Identifizierung der Peptidfamilien, welche eine strukturelle Ähnlichkeit auf dem Niveau des Peptidskeletts, jedoch nicht auf dem Niveau der Aminosäureidentität, aufweisen. Wie in Fig. 3 A dargestellt, beträgt die Identität lediglich 25,9% mit einem repräsentativen Mitglied der Familie der Cytotoxine und lediglich 21,3% mit einem kurzen Neurotoxin, obwohl die Konfiguration der Disulfidbrücken die gleiche ist. Neben den Cysteinen sind nur das Asn&sup5;, Thr¹&sup4; und Asn&sup7;¹ in den drei Peptidfamilien konserviert. Die Gly²&sup0;, Pro&sup5;&sup0; und Lys&sup5;¹, die den Cytotoxinen und kurzen Neurotoxinen gemeinsam sind, sind, im Vergleich zu den Xenoxinen, nicht konservative Substitutionen. Die Arg&sup4;¹ und Gly&sup4;² sind bei den Xenoxinen deletiert.
Was die Anzahl der Aminosäurenen zwischen den Cysteinen betrifft, wird auf Fig. 3 B Bezug genommen. Bei den drei Familien ist die Anzahl auf der N-terminalen Seite bis zu dem Cys³ und vom Cys&sup6; bis zum C-Terminus vergleichbar. Im Gegensatz dazu ist bei den. Xenoxinen die Anzahl der Reste zwischen den Cys³ und Cys&sup4; kleiner und zwischen den Cys&sup4; und Cys&sup5; und zwischen den Cys&sup5; und Cys&sup6; größer.
Wie in Fig. 4 dargestellt, hat der C-terminale Bereich der. Xenoxine (Cys³&sup7; bis Asn&sup6;&sup5;, 29 Reste), welcher die Cys&sup4; bis Cys&sup8; enthält, eine Aminosäureidentität von 50% mit 27 Aminosäuren (Cys&sup8;&sup5; bis Asn¹¹¹) des humanen Activinrezeptors. Auf der N- terminalen Seite der Xenoxine findet sich keine Sequenzidentität, auch nicht auf dem Niveau der Cysteine.

Beispiel 3: Herstellung der rekombinanten Xenoxine

3.1 Konstruktion eines Xenoxin-Expressionsvektors

Die erfindungsgemäßen Xenoxine können durch die Methoden der Gentechnik erhalten werden, insbesondere unter Verwendung der Hefen Saccharomyces cerevisiae als Wirtzellen.
Dazu wird ein DNA-Fragment, welches für das reife Xenoxin- 1, welches unter der Nummer SEQ ID NO: 1 wiedergegeben ist, kodiert, von der Base an Position 93 bis zu der Base an Position 290 synthetisiert und in den Bakteriophagen M13TG131. (M. P. Kieny et coll., Gene 26, (1983), p 91), kloniert.
Es wird ein Expressionsplasmid des Xenoxins-1 konstruiert, welches die Synthese und Sekretion durch S. cerevisiae gemäß der internationen Patentanmeldung PCT/FR90/00306, welche die Signalpeptide, die für die Sekretion eines heterologen Proteins durch die Hefe verwendet werden können, beschreibt, ermöglicht.
Das ShpI-SmaI-Fragment von 1045 Basenpaaren des Bakteriophagen M13TG3846, beschrieben in Beispiel 1.E. der genannten internationalen Patentanmeldung, wird in den Vektor M13TG3869 (beschrieben in Beispiel 1.D. der gleichen Anmeldung), welcher zuvor mit SphI und SmaI verdaut worden ist, überführt. Auf diese Weise wird der Vektor M13TG4801 erhalten, welcher:
- den Promotor des MFα1-Gens, gefolgt von einem ATG-Codon,
- die Sequenz XII (siehe PCT/FR/90/00306),
- die mutierte "Pro-Sequenz des MFα1-Gens, gefolgt von den Codons, welche für Lys-Arg kodieren,
- die Sequenz, welche für rHV2Lys47 kodiert, enthält.
Um die Sequenz, welche für rHV2Lys47 kodiert, durch die Sequenz zu ersetzen, die für das Xenoxin-1 kodiert, wird eine HindIII-Site in die Sequenz eingeführt, welche für die mutierte "Pro"-Sequenz von MFα1 kodiert, gemäß Beispiel 3.B. der internationalen Anmeldung.
Anschließend wird ein HindIII-BamHI-Fragment, welches die für das Xenoxin-1 kodierende Sequenz trägt, in den zuvor mit HindIII und BamHI behandelten Vektor eingeführt, um die für rHV2Lys47 kodierende Sequenz zu entfernen.
Das SphI-SalI-Fragment von M13TG4803 wird in das an den Stellen SphI und SalI geöffnete Plasmid pTG3828 eingeführt (siehe Beispiel 1.B. der internationen Anmeldung), wodurch der Expressionsvektor des Xenoxins-1 erhalten wird, welcher
- die Sequenz des URA3-Gens, deren Promotor deletiert ist (URA3-d),
- den Promotor des MFα1-Gens, gefolgt von einem ATG,
- die Sequenz XII als Signalpeptid,
- die mutierte "Pro"-Sequenz des MFα1-Gens, gefolgt von den für Lys-Arg kodierenden Codons,
- die für das Xenoxin-1 kodierende Sequenz,
- den Transkritionsterminator des für die PGK der Hefe kodierenden Gens,
- ein Fragment von pBR322, welches die Replikation und Selektion bei E. coli ermöglicht,
- ein Fragment des Plasmids 2u, welches strukturelle Elemente aufweist, die für die Replikation und mitotische Teilung in der Hefe notwendig sind,
enthält.
Es wird ein Stamm von S. cerevisae transformiert, der unter den bekannten Bedingungen kultiviert wird.
3.2 Konstruktion von pTG8709 und Analyse des in das Kulturmedium sekretierten reifen Xenoxins-1
Durch PCR wird die für das reife Xenoxin-1 kodierende Sequenz, die mit einer EagI-Site an 5' und einer SalI-Site an 3' versehen ist, amplifiziert. Als Matrize werden M13TG4414 oder pTG4414 (Kolbe et coll., J. Biol. Chem., 268, (1993) p 16458) und die Primer:
OTG5770:
5'-TACGTCGGCCGTTACAAGAGACTGAAATGTGTGAATTTACAAGCG-3' und
OTG5771:
5'-AGTTTGTCGACTCAAGCATTGCACATGTTTCCT-3'
verwendet.
Das so erzeugte Fragment wird in den zuvor mit EagI und. SalI verdauten Vektor M13TG9800 integriert, wodurch M13TG8703 erhalten wird. Der Vektor M13TG9800 stammt von M13TG131 ab, in den für die Expression eines Proteins von Interesse wesentliche Elemente eingefügt sind, dass heißt:
- der Promotor des MFα1-Gens, gefolgt von einem ATG-Codon (Inokuchi et coll., Mol, Cell. Biol. 7 (1987) p 3185)
- die Prä-Sequenz BGL2 (β-Glucanase 2; Klebl et Tanner, J. Bacteriol., 171 (1989) p. 6259
- die Pro-Sequenz des Defensins A (Dimarq et coll., EMBO J. 9 (1990) p. 2507), in die als stille Mutation eine EagI-Site am 3'-Ende eingefügt wurde (wodurch die vorhergehenden Codons abgedeckt werden, welche für die Rest Lys-Arg an 3' kodieren)
- die Restriktionsstellen zur Insertion einer DNA-Sequenz von Interesse.
Das aus M13TG8703 isolierte SphI-SalI-Fragment, welches die Expressionskassette des reifen Xenoxins-1 enthält, wird zwischen die gleichen Stellen von pTG4812 eingefügt, wodurch pTG8709 erhalten wird. Der Vektor pTG4812 stammt von pTG3828 ab, enthält jedoch außerdem eine Kassette für die Expression des Hefegens KEX2, welche auf Höhe der Verbindungsstelle des 2u-Bereichs und des pBR322-Bereichs eingefügt ist.
pTG8709 wird in einen Saccharomyces cerevisiae-Stamm transformiert. Beispielhaft seien TGY47.1 (MATα, pra1, prb1, prc1, cps1, ura3-delta5, leu2-3, leu 2-112, his) oder TGY73.4, welcher von dem vorherigen Stamm abstammt, jedoch eine Prototrophie für das Leucin aufweist (Leu&spplus;), genannt.
Es wird ein Transformand TGY73.4/pTG8709 ausgewählt, der bei 28ºC in Minimal-Selektionsmedium (0,67% Stickstoffbasen für Hefen YNB (Yeast Nitrogen Base) ohne Aminosäuren, 1% Casaminosäuren, 2% Glukose und 2% Bactoagar) kultiviert wird.
Nach 60 Stunden Kultur wird der Kulturüberstand durch Ultrafiltration auf YM2-Membran/Zentrifugation gemäß den konventionellen Techniken konzentriert. Das Konzentrat wird einer denaturierenden Elektrophorese auf Polyacrylamidgel (15,3% Polyacrylamid) unterzogen. Diese Proteine werden auf eine PVDF-Membran übertragen und das Material, welches dem erwarteten Molekulargewicht entspricht (etwa 7 kDa), einer Sequenzierung der N-terminalen Aminosäuren unterzogen.
In der Mehrheit wird eine Sequenz erhalten, die der erwarteten N-terminalen Sequenz des reifen Xenoxins-1 entspricht.

Sequenzliste

(1) Allgemeine Information:
(iii) Anmelder:
(A) Name: Transgene S.A.
(B) Straße: 11, Rue de Molsheim
(C) Stadt: Strassburg Cedex
(E) Land: Frankreich
(F) Postleitzahl: 67082
(G) Telefon: (33) 88 27 91 00
(H) Telefax: (33) 88 22 58 07
(ii) Titel der Erfindung: Peptidfamilie, genannt Xenoxine
(iii) Anzahl der Sequenzen: 28
(iv) Computerlesbare Form:
(A) Trägertyp: Floppy Disk
(B) Computer: IBM PC-kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) Information für die SEQ ID NO: 1:
(i) Sequenzeigenschaften,
(A) Länge: 462 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekultyp: cDNA für mRNA
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lage: 39..293
(D) Weitere Auskünfte: /Start-Codon = 39 /Produkt = "Prä-Xenoxin-1" /Anmerkung = "Das Signalpeptid enthält die 18 ersten Aminosäurereste"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 1:
(2) Information für die SEQ ID NO: 2:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 84 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 2:
(2) Information für die SEQ ID NO: 3:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 66 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 3:
(2) Information für die SEQ ID NO: 4:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 66 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 4:
(2) Information für die SEQ ID NO: 5:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 66 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 5:
(2) Information für die SEQ ID NO: 6:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 37 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..37
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Analysierter Bereich des Xenoxins-1, alkyliert"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 6:
(2) Information für die SEQ ID NO: 7:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 43 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..43
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Xenoxin-1, alkyliert, Fragment CNBR1(1)"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 7:
(2) Information für die SEQ ID NO: 8:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 31 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..31
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Xenoxin-1, alkyliert, Fragment CNBR1(2)"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 8:
(2) Information für die SEQ ID NO: 9:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 8 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschäften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1.. 8
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Xenoxin-1, alkyliert, Fragment CL1(1)"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 9:
(2) Information für die SEQ ID NO: 10:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 12 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..12
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Xenoxin-1, alkyliert, Fragment CL1(2)"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 10:
(2) Information für die SEQ ID NO: 11:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 6 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..6
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Xenoxin-1, Fragment T1(1)"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 11:
(2) Information für die SEQ ID NO: 12:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..19
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Xenoxin-1, Fragment T1(2)"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 12:
(2) Information für die SEQ ID NO: 13:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 13 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..13
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Xenoxin-1, alkyliert, Fragment CNBR2(1)"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 13:
(2) Information für die SEQ ID NO: 14:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..16
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Xenoxin-1, alkyliert, Fragment CNBR2(2)"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 14:
(2) Information für die SEQ ID NO: 15:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 18 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..18
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Xenoxin-1, alkyliert, Fragment CL2"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 15:
(2) Information für die SEQ ID NO: 16:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 56 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..56
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Analysierter Bereich von Xenoxin-2, alkyliert"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 16:
(2) Information für die SEQ ID NO: 17:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 47 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..47
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Analysierter Bereich von Xenoxin-2"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 17:
(2) Information für die SEQ ID NO: 18:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 11 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..11
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Xenoxin-2, alkyliert, Fragment CL3"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 18:
(2) Information für die SEQ ID NO: 19:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 8 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..8
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Xenoxin-2, Fragment T3"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 19:
(2) Information für die SEQ ID NO: 20:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..20
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Analysierter Bereich des Xenoxins-3, alkyliert (1)"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 20:
(2) Information für die SEQ ID NO: 21:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..20
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Analysierter Bereich des Xenoxins-3, alkyliert (2)"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 21:
(2) Information für die SEQ ID NO: 22:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 20 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..20
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Analysierter Bereich des Xenoxins-3, alkyliert (3)"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 22:
(2) Information für die SEQ ID NO: 23:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 6 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..6
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Xenoxin-3, alkyliert, Fragment T4"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 23:
(2) Information für die SEQ ID NO: 24:
(i) Sequenzeigenschaften:,
(A) Länge: 19 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..19
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Xenoxin-3, alkyliert Fragment T5"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 24:
(2) Information für die SEQ ID NO: 25:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 19 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: Peptid
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Peptid
(B) Lage: 1..19
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Xenoxin-3, alkyliert Fragment T6"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 25:
(2) Information für die SEQ ID NO: 26:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 28 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 20
(D) Weiter Auskünfte: /Mod-Base = i
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Misc Feature
(B) Lage: 1..28
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Oligonukleotid OTG3278"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 26:
ATGTCGACCA RGARTGYGCN AARGARGA
(2) Information für die SEQ ID NO: 27:
(1) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 28 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Modifizierte Base
(B) Lage: 17
(D) Weiter Auskünfte: /Mod-Base = i
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Misc Feature
(B) Lage: 1..28
(D) Weitere Auskünfte: /Anmerkung = "Oligonukleotid OTG3279"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 27:
ATAAGCTTCA CATRTTNCCY TCRCARCA
(2) Information für die SEQ ID NO: 28:
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 149 Basenpaare
(B) Typ: Nukleinsäure
(C) Anzahl der Stränge: einfach
(D) Konfiguration: linear
(ii) Molekültyp: cDNA
(ix) Zusätzliche Eigenschaften:
(A) Name/Schlüssel: Misc Feature
(B) Lage: 1..149
(D) Weitere Auskünfte: /Produkt = "PCR1" /Anmerkung = "cDNA-PCR-Fragment für das in Beispiel 2.5 beschriebene Screening"
(xi) Beschreibung der Sequenz SEQ ID NO: 28:

Claims

1. Peptid, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz aufweist, welche:

a. wenigstens 8 Cysteine enthält, die durch 4 Disulfidbrücken gemäß der Konfiguration Cys¹ mit Cys³, Cys² mit Cys&sup4;, Cys&sup5; mit Cys&sup6; und Cys&sup7; mit Cys&sup8; miteinander verbunden sind;

b. 0 bis 3 Aminosäuren auf der N-terminalen Seite des Cys¹, 9 bis 14 Aminosäuren zwischen den Cys¹ und Cys², 3 bis 7 Aminosäuren zwischen den Cys² und Cys³, 11 bis 18 Aminosäuren zwischen den Cys³ und Cys&sup4;, 1 bis 6 Aminosäuren zwischen den Cys&sup4; und Cys&sup5;, 7 bis 15 Aminosäuren zwischen den Cys&sup5; und Cys&sup6;, keine Aminosäure zwischen den Cys&sup6; und Cys&sup7;, 3 bis 5 Aminosäuren zwischen den Cys&sup7; und Cys&sup8; und 0 bis 10 Aminosäuren auf der C- terminalen Seite des Cys&sup8; enthält; und

c. eine Identität der Aminosäuren in ihrer Anordnung von wenigstens 40% mit der unter der Nummer SEQ ID NO: 3 aufgeführten Aminosäuresequenz aufweist.

2. Peptid, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz aufweist, welche:

a. wenigstens 8 Cysteine enthält, die, wenn das Peptid seine zusammengefaltete Struktur annimmt, durch 4 Disulfidbrücken gemäß der Konfiguration Cys¹ mit Cys³, Cys² mit Cys&sup4;, Cys&sup5; mit Cys&sup6; und Cys&sup7; mit Cys&sup8; miteinander verbunden sind;

3. Peptid gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz 2 Aminosäuren auf der N-terminalen Seite des Cys¹, 10 bis 13 Aminosäuren zwischen den Cys¹ und Cys², 4 bis 6 Aminosäuren zwischen den Cys² und Cys³, 12 bis 17 Aminosäuren zwischen den Cys³ und Cys², 1 bis 5 Aminosäuren zwischen den Cys&sup4; und Cys&sup5;, 8 bis 14 Aminosäuren zwischen den Cys&sup5; und Cys&sup6;, keine Aminosäure zwischen den Cys&sup6; und Cys&sup7;, 4 Aminosäuren zwischen den Cys&sup7; und Cys&sup8; und 2 Aminosäuren auf der C-terminalen Seite des Cys&sup8; enthält.

4. Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz eine Aminosäureidentität von wenigstens 50%, bevorzugt wenigstens 60%, mit der unter der Nummer SEQ ID NO: 3 aufgeführten Aminosäuresequenz aufweist.

5. Peptid gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäureidentität wenigstens 70% beträgt.

6. Peptid gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz aufweist, die 0 bis 3 Aminosäuren auf der N-terminalen Seite des Cys¹, 13 Aminosäuren zwischen den Cys¹ und Cys², 6 Aminosäuren zwischen den Cys² und Cys³, 12 Aminosäuren zwischen den Cys³ und Cys&sup4;, 5 Aminosäuren zwischen der Cys&sup4; und Cys&sup5;, 14 Aminosäuren zwischen den Cys&sup5; und Cys&sup6;, keine Aminosäure zwischen Cys&sup6; und Cys&sup7;, 4 Aminosäuren zwischen den Cys&sup7; und Cys&sup8; und 0 bis 10 Aminosäuren auf der C-terminalen Seite des Cys&sup8; enthält, und eine Identität der Aminosäuren in ihrer Anordnung von wenigstens 80%, bevorzugt 90%, mit der unter der Nummer SEQ ID NO: 3 aufgeführten Aminosäuresequenz aufweist.

7. Peptid gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Aminosäureidentität auf wenigstens eine der unter den Nummern SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 aufgeführten Sequenzen bezieht.

8. Peptid gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäureidentität wenigstens 95% mit der unter der Nummer SEQ ID NO: 3 aufgeführten Aminosäuresequenz beträgt.

9. Peptid gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz die unter der Nummer SEQ ID NO: 3 aufgeführte Sequenz umfasst.

10. Verfahren zur Herstellung eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Isolierung des Peptids, ausgehend von durch die Haut eines Frosches, bevorzugt Xenopus laevis, sekretiertem Material,

a. das durch die Haut des Frosches sekretierte Material durch Ausfälllung mit Hilfe von Ammoniumsulfat oder einem gleichwertigen Ausfällungsmittel in Fraktionen teilt,

b. die sich zwischen 30- und 70%iger, bevorzugt zwischen 30- und 60%iger Ammoniumsulfatsättigung oder unter gleichwertigen Bedingungen bildenden Präzipitate einer Gelpermeationschromatographie unterwirft und

c. die spät eluierte peptidische Fraktion gewinnt,

und, wenn notwendig,

d. diese Peptidfraktion einer HPLC-Ionenaustauschchromatographie und gegebenenfalls einer anschließenden HPLC- Umkehrphasenchromatographie unterwirft.

11. Isoliertes DNA-Fragment, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Sequenz aufweist, welche für ein Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 kodiert.

12. DNA-Fragment gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Sequenz aufweist, welche für den Vorläufer eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 kodiert.

13. DNA-Fragment gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz für eine der unter den Nummern SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 aufgeführten Aminosäuresequenzen kodiert.

14. DNA-Fragment gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nukleinsäuresequenz aufweist, welche für die unter der Nummer SEQ ID NO: 1 aufgeführte Aminosäuresequenz kodiert und sich von der Base an Position 93 bis zur Base an Position 290 erstreckt.

15. DNA-Fragment gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nukleinsäuresequenz aufweist, welche für die unter der Nummer SEQ ID NO: 1 aufgeführte Aminosäuresequenz kodiert und sich von der Nukleinsäure an Position 39 bis zur Nukleinsäure an Position 290 erstreckt.

16. Expressionskassette eines isolierten DNA-Fragments gemäß einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Fragment unter der Kontrolle von Elementen platziert ist, die seine Transkription und/oder Translation in der betreffenden transformierten Zelle ermöglichen.

17. Expressionskassette gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie außerdem eine Prä- und eine Pro-Sequenz, insbesondere die Pro-Sequenz des Defensin A von Phormia terranovae, enthält.

18. Expressionskassette gemäß Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein DNA-Fragment gemäß Anspruch 12 enthält.

19. Zelle, welche mit einer Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18 transformiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionskassette entweder in das Genom der transformierten Zelle integriert ist oder von einem Expressionsvektor getragen wird.

20. Transformierte Zelle gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine S. cerevisiae- oder E. coli- Zelle handelt.

21. Transformierte Zelle gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Säugetierzelle handelt.

22. Verfahren zur Herstellung eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man eine transformierte Zelle gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21 in einem geeigneten Medium kultiviert und das Peptid aus der Kultur gewinnt.

23. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Human- oder Tiermedizin, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff wenigstens ein Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, einen Vektor, enthaltend eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18, oder eine transformierte Zelle gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21 enthält.

24. Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 erkennt.

25. Diagnostik-System, welches ein Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 oder einen Antikörper gemäß Anspruch 24 enthält.