DE69423243T2

DE69423243T2 - Stoffe zur aufhebung von arzneimittelresistenzen

Info

Publication number: DE69423243T2
Application number: DE69423243T
Authority: DE
Inventors: Orsolya Csuka; Maria Magocsi; Imre Mezo; Istvan Palyi; Balazs Sarkadi; Janos Seprodi; Istvan Teplan; Zsolt Vadasz; Borbola Vincze
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-05-12
Filing date: 1994-05-12
Publication date: 2000-11-02
Anticipated expiration: 2014-05-13
Also published as: DK0770091T3; US6297216B1; AU6760694A; EP0770091B1; WO1995031474A1; ES2146651T3; DE69423243D1; ATE190065T1; AU693791B2; EP0770091A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf Verbindungen zum Überwinden der Resistenz, welche ein Patient gegenüber Therapeutika aufbauen kann.[0001]
Die Behandlung von vielen Krankheiten kann durch die Resistenz gegenüber dem gewählten therapeutischen Arzneimittel ernsthaft limitiert sein. Die Chemotherapie zum Beispiel, während allgemein eine effektive Behandlung gegen menschliche Krebserkrankungen, ist behindert, wenn ein Patient gegenüber dem Chemotherapeutikum resistent wird. In einer speziellen Form der Arzneimittelresistenz, genannt "Multidrug Resistance", werden die Zellen nicht nur gegen das verabreichte Chemotherapeutikum resistent, sondern gleichzeitig gegen einen weite Kollektion von strukturell und funktionell nicht verwandten Arzneimitteln (siehe Ford et al. Pharmacological Reviews, 42: 155-199, 1992).[0002]
Die Ursache der "Multidrug" Resistenz ist das Erscheinen eines integralen Glykoproteins in der Plasmamembran der Zielzelle, z. B. einer Tumorzelle (Abb. 1). Das Protein fungiert als ein "Multidrug" Transporter und wird variierend "Multidrug"-Resistenz 1 Protein (MDR1), P- Glykoprotein (pleiotropes Glykoprotein), Pgp oder P-170 genannt. MDR1 besteht aus 1280 Aminosäureresten und enthält 12 Transmembransegmente sowie zwei Nukleotidbindedomänen. Es ähnelt stark prokaryontischen und eukaryontischen Mitgliedern von sogenannten ABC (ATP Bindekassette) Transportern oder Transport-ATPasen (siehe Endicott et al., Annu. Rev. Biochem. 58: 137-171, 1989; Higgins, Annu. Rev. Cell. Blei. 8: 67-113, 1992)[0003]
MDR1 dient natürlicherweise zum, und ist hoch exprimiert in Geweben, die normalerweise dafür verantwortlich sind, giftige Materialien und Abfallprodukte aus den Zellen (z. B. Lung, Niere und Leber) auszuschleusen und hydrophobe Verbindungen der exokrinen oder endokrinen Drüsen zu sekretieren (Gottesman et al., J. Blei. Chem. 263: 12163-12166, 1988; Higgins et al., supra). Übereinstimmend mit seiner natürlichen Funktion katalysiert MDR1 eine ATP-abhängige Ausschleusung von verschiedenen zytotoxischen Wirkstoffen der Zelle, z. B. vinca Alkaloide, Anthrazykline und andere natürliche Antibiotika, hierdurch aufrecht erhaltend deren zelluläres Niveau bei einer subtoxischen Konzentration. Wenn somit durch Tumorzellen exprimiert, stößt MDR1 zytotoxische chemotherapeutische Agentien aus und erlaubt somit der Tumorzelle, die Antikrebsbehandlungen auch bei hohen Wirkstoffdosen zu überleben. Einen solchen Ausschleusungsmechanismus nicht besitzende "gewöhnliche" Zellen können zur gleichen Zeit eine tödliche Arzneimittelexposition erhalten. Sich aus, das MDR1 Protein normalerweise exprimierenden Geweben, entwickelnde Tumore zeigen oft eine primäre Arzneimittelresistenz, während in anderen Tumoren sich eine sekundäre Arzneimittelresistenz nach Chemotherapie entwickeln kann.[0004]
Das Phänomen der "Multidrug" Resistenz ist nicht auf Tumorzellen begrenzt. MDR1 und seine Homologen werden in einer breiten Vielzahl von Zelltypen einschließend parasitischer Protozoen exprimiert. Folglich ruft die Überexpression eines Mitglieds der MDR1-Proteinfamilie Hindernisse bei einer breiten Vielzahl parasitischer Krankheiten einschließend Malaria, afrikanischer Schlafkrankheit und anderer hervor (Campbell et al., Chemotherapy of Parasitic Diseases, Plenum Press: NY, 1986; Henderson et al., Mol. Cell. Biol. 12: 2855-65, 1992). MDR1 wird auch durch Endothelzellen der menschlichen kapillaren Blutgefäße an der Blut-Hirn- und der Blut-Hoden-Schranke (Ford et al. supra, at 159) exprimiert.[0005]
Es ist bekannt, dass Verapamil, ein Arzneimittel, dass die spannungsabhängigen Kalziumkanäle blockiert, die Aktivität der MDR1-gebundenen ATPase bei einer Konzentration von 1 bis 20 pH stimuliert, sie aber bei einer Konzentration über 100 pH (Sarkadi et al. J. Biol. Chem. 267: 4854-4858, 1992) inhibiert. Während zwischen diesen Konzentrationen das Verapamil die Ausschleusung von Antitumorarzneimitteln blockiert, begrenzt seine hohe Giftigkeit ernsthaft seine klinische Verwendung (Solary et al. Leukemia 5: 592-597, 1991; Dalton et al. J. Clin. Oncology 7: 415-418, 1989).[0006]
Golovina, T. N. et al. beschreiben in SU-A-1544778 die Herstellung von verschiedenen Peptiden, darunter BOC- Leu-Tyr-OMe, welches strukturell nahe den durch die vorliegende Erfindung offenbarten Peptiden ist. Dennoch werden keine Hinweise auf die mögliche biologische Aktivität der besagten Peptide offenbart.[0007]

Zusammenfassung der Erfindung

Allgemein zeichnet sich die Erfindung durch chemische Zusammensetzungen aus, welche die "Multidrug" Resistenz in einem Säuger, z. B. einem Menschen, und in Mikroorganismen, die in einem Säuger Krankheit hervorrufen, reduzieren oder überwinden. Die Verbindungen, genannt "Formel(I)" Verbindungen oder Reversine, sind hydrophobe Peptidderivate, welche effektiv mit zytostatischen Arzneimitteln an dem MDR1 Protein kompetitieren, wodurch sie die Arzneimittelresistenz reduzieren oder eliminieren.[0008]
"Multidrug" Resistenz, wie hier verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit der Zellen, Resistenz zu einem breiten Bereich von strukturell und funktionell nicht verwandten Arzneimitteln zu entwickeln. Diese tritt durch den nach außen gerichteten Transport des Arzneimittels der Zelle, des durch das MDR1 Glykoprotein oder seiner Homologen vermittelten Transportes auf. Der Ausdruck "Multidrug" Resistenz wird auch für die Kreuzresistenz zwischen Arzneimitteln, welche durch die "Reversin" Verbindungen der Erfindung gegenläufig beeinflusst wird (siehe unten). Bevorzugt ist die "Multidrug" Resistenz dem Zustand zuzuordnen, welcher abhängig ist von der Expression oder Überexpression des MDR1 Proteins oder seiner Homologen und/oder von der Genamplifikation des menschlichen mdr1 oder seiner Homologen. Sowohl die primäre als auch die sekundäre "Multidrug" Resistenz sind eingeschlossen. Wenn die Arzneimittelresistenz "primär" ist, hat die Zelle keine vorherige Exposition zu einem Mitglied der Gruppe der Arzneimittel erfahren, doch zeigt sie innewohnende Resistenz zu diesen. Wenn die Arzneimittelresistenz "sekundär" ist, wurde die Zelle nur zu einem Arzneimittel oder zu nur einer Untergruppe von zwei oder mehreren, aber nicht notwendigerweise zu der gesamten Gruppe von Arzneimitteln die von der Kreuzresistenz betroffen sind, exponiert.[0009]
Die Verbindungen der Erfindung, nachfolgend Reversine genannt, haben die Formel (I):[0010]
X¹n-X²-X³(X&sup4;)n-X&sup5;
worin
n ist 0 oder 1 und jedes n ist gleich oder verschieden;
X¹ ist BOC, BOC-Asu, Z-Asu, Benzyloxycarbonyl, Glu(OBzl), Trp-OMe, Trp-Phe-OMe, Phe-Trp-OMe, Phe-Phe-OtBu, Trp- Trp-OtBu, Indolacetyl, Benzoyl, ein Alkylamin mit 1-4 Kohlenstoffen, Dibenzylamid, Tryptamid, 1-Amino- Adamantan, Aminomethylcyclohexan, Indolin, Phenylethylamid oder Dicyclohexylamid;
X² ist Glu(OBzl), Asp(OBzl), Succinyl, O,O- Dibenzoyltartaroyl, Diphenoyl, Muconyl, Thx, Cpa, Asu, Nal, Pen, Phg, Dbt, Lys(BOC), Lys(Z), Cys(Bzl), Thr(Bzl), Glu(OtBu), tert.-Leu, Leu, Nle, Pro, Phe, Tyr(Bzl), oder Ser(Bzl);
X³ ist Asp, Asu, Lys, Glu, Trp, Thx, Cpa, Nal, Pen, Phg, Dbt, Glu(OtBu), tert.-Leu, Leu, Nle, Pro, Tyr, Phe, or Tyr(Bzl);
X&sup4; ist BOC-Glu(OBzl), Glu(OBzl), Asu, OBzl, Bzl, BOC, BOC- Lys(BOC), Z-Glu(OtBu), Asp(OBzl), Asp(OBz)-OBzl, Benzyloxycarbonyl, O-(cyclohexyl), Fluoroenylmethylester, Glu(OtBn), Glu(OtBu)-OBzl, 1- Amino-Adamantan, Aminomethylcyclohexan, Indolin, Phenylethylamid oder Dicyclohexylamid; und
X&sup5; ist OMe, OBzl, OtBu, Phe-OMe, -O-(cyclohexyl), Trp-OMe, (Chlorophenyl)-Isobutylamid, Fluoroenylmethylester, ONp, 1-Aminoadamantan, Aminomethylcyclohexan, Indolin, Phenylethylamid oder Dicyclohexylamid,
unter der Bestimmung, dass die besagte Formel (I) nicht BOC- Leu-Tyr-OMe ist und wenn X² Glu(OBzl), Asp(OBzl), Thx, Cpa, Asu, Nal, Pen, Phg, Dbt, Lys(Boc), Lys(Z), Cys(Bzl), Thr(Bzl), Glu(OtBu), tert.-Leu, Leu, Nle, Pro, Phe, Tyr(Bzl) oder Ser(Bzl) ist, dann muß X¹ tert.-Butyloxycarbonyl, BOC- Asu, Z-Asu, Benzyloxycarbonyl, Indolacetyl oder Benzoyl sein und wenn X² Succinyl, O,O-Dibenzoyltartaroyl, Diphenoyl oder Muconyl ist, dann muß X¹ Glu(OBzl)-(OBzl), Trp-OMe, Trp-Phe- OMe oder Phe-Trp-OMe sein.
[0011] Formel (I) Verbindungen enthaltend Aminosäuren mit sowohl L oder D Konfiguration fallen innerhalb des Bereiches der Erfindung.
[0012] Die Seitenketten der Aminosäuren schützende Gruppen können durch eine oder mehrere Halogenatome, z. B. Chloro-Z oder Bromo-Z substituiert werden. Solche Blockiergruppen sind bekannt. Eine Benzylestergruppe kann durch eine oder mehrere Nitrogruppen in der zweiten oder vierten Position des Benzenringes substituiert sein.
[0013] Die hier verwendeten Abkürzungen sind dem Fachmann bekannt (siehe z. B. J. Biol. Chem. 241: 527, 1966; J. Biol. Chem. 247: 977 1972). Andere hier verwendete Abkürzungen sind wie folgt:
AM: Acetoxymethylester,
Asu: Aminobernsteinsäure oder Aminosuccinoyl,
BOC: tert. -Butyloxycarbonyl,
Bzl: Benzyl,
Cpa: 4-Chlorophenylalanyl,
Cys: Cysteinyl,
Dbt: Dibromotyrosyl,
DBTA: Dibenzoyltartaroyl,
DCC: Dicyclohexylcarbodiimid,
DCU: Dicyclohexylharnstoff,
DIC: Diisopropylcarbodiimid,
DMF: Dimethylformamid,
HPLC: Hochdruckflüssigchromatographie,
MDR1: Produkt des "Multidrug" Resistenzgens,
Me: Methyl,
Nal: Maphthylalanyl,
Nle: Norleucyl,
m. p.: Schmelzpunkt,
OPFP: Pentafluorophenyl,
Onp: p-Nitrophenyl,
Pen: Penicillinalanyl,
Phe: Phenylalanyl,
Phg: Phenylglycyl,
Pro: Prolyl,
Rf: Retentionsfaktor,
SUC: Succinyl,
TEA: Triethylamin,
THF: Tetrahydrofuran,
Thr: Threonyl,
Thx: Thyroxyl,
TLC: Dünnschichtchromatographie,
Trp: Tryptophyl,
Z: Benzyloxycarbonyl.
[0014] In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kann X¹ BOC, Glu(OBzl)-OBzl, Z oder (D-Phe-Trp-OMe) sein; X² kann Asp(OBzl), Succinyl, Glu(OBzl) oder DBTA sein; X³ kann Lys, Glu, Asp oder Phe sein; X&sup4; kann Z, OBzl, BOC-Glu(OBzl), BOC- Lys(BOC) oder Z-Glu(OtBu) sein oder X³ und X&sup4; in Kombination können Lys[BOC-Glu(OBzl)] sein und X&sup5; kann OtBu, OBzl, OMe, oder Trp-OMe sein.
[0015] Bevorzugte Formel (I) Verbindungen der Erfindung schließen die Peptidderivate BOC-Asp(OBzl)-Lys(Z)-OtBu (Reversin 121); Succinyl-bis[Glu(OBzl)-OBzl]; Z-D-Glu(OBzl)- D-Asp(OBzl)-OBzl; DBTA-bis(D-Phe-Trp-OMe); DBTA- [Glu(OBzl)&sub2;]&sub2;; Nα,N&epsi;-bis[BOC-Glu(Bzl)]-Lys-OMe (Reversin 205); BOC-Tyr(Bzl)-Tyr(Bzl)-OMe; BOC-D-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OtBu; BOC-Glu(OBzl)-Lys(Z)-OtBu; BOC-Glu(OBzl)-Lys(Z)-OMe; Nα,N&epsi;- bis[BOC-Lys(BOC)]-Lys-OMe oder Nα,N&epsi;-bis[Z-Glu(OtBu)]-Lys-OMe ein, sind aber nicht darauf begrenzt.
[0016] Jede der verschiedenen Verbindungen der Erfindung kann mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder einem Hilfsstoff kombiniert sein. Die verschiedenen Verbindungen der Erfindung können auch mit einem Arzneimittel, z. B. einem Chemotherapeutikum, Antiparasitikum oder antibiotischen Arzneimittel zur bequemen gemeinsamen Verabreichung der Reversinverbindung und des Arzneimittels zu einem Patienten kombiniert werden. Das Reversinmolekül kann außer dem Inhibieren der MDR1 Aktivität auch als ein Hilfsstoff zum Verstärken der Aktivität des Arzneimittels agieren. Ein "Arzneimittel", wie hier verwendet, schließt eine Medikation, ein Pharmazeutikum oder eine Substanz, welche für die Verwendung in der Diagnose, der Heilung, der Linderung, der Behandlung oder der Vorbeugung der Krankheit gedacht ist, ein oder ist allgemein gedacht zum Beeinflussen der Struktur oder der Funktion des Körpers eines Säugers.
[0017] Die Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Herstellung jeder der verschiedenen Formel (I) Verbindungen der Erfindung ein. Das Verfahren beinhaltet das Erstellen einer Kombination von einem oder mehreren der X¹n, X², X³, X&sup4;n, X&sup5; oder X¹X² in einer Lösung, z. B. durch Auflösen der Kombination, z. B. eines oder mehrerer der X¹n, X², X³, X&sup4;n, X&sup5; oder X¹X² in einer Lösung; das Kühlen der Lösung; das Einstellen des pH der Lösung zum neutralen Bereich, z. B. ein pH von 4-8, bevorzugt pH 6-8 oder einschließlich zwischen pH 7 und 8 und dem Reinigen der Formel (I) Verbindung aus der Lösung. Unter "Reinigen" ist extrahieren, filtern, verdampfen, fällen, waschen, umkristallisieren, isolieren durch Chromatographie oder irgendwelche anderen Mittel des Isolierens der gewünschten "Reversin" Verbindung aus der Reaktionsmischung zu verstehen. Das Verfahren kann weiterhin einen zusätzlichen Reinigungsschritt zum Entfernen jeglicher Verunreinigungen des Endproduktes, z. B. einen Gelfiltrationsschritt oder ein Chromatographieschritt (siehe Methoden, unten) einschließen. Das Verfahren kann auch oder weiterhin einschließen einen Schritt der aktiven Esterkupplung oder eines Schrittes der Dicyclohexylcarbodiimidkondensation, gekennzeichnet durch die folgende Parameter: Kühlen durch Eiswasser, 10% Überschuß an DCC, pH zwischen 7-8 mit einer tertiären Base (z. B. Triethylamin, N-Methylmorpholin, Diisopropylethylamin) eingestellt. In bestimmten Fällen wird zur Aktivierung und zum Vermeiden einer möglichen Razemisierung 1-Hydroxybenzotriazol als Zusatz verwendet (W. Loning et al. Chem Ber. 103: 2024, 1970).
[0018] Die Verbindungen der Erfindung können auch im Verfahren zum Reduzieren der Aktivität eines "Multidrug" Transporterproteins oder seiner Homologen in einem Säuger verwendet werden. Das Verfahren schließt das Verabreichen einer Menge irgendeiner der verschiedenen Formel(I) Verbindungen der Erfindung in einer therapeutisch effektiven Menge zu dem Säuger ein. Das Verfahren des Reduzierens der Aktivität des MDR1 kann zum Absenken der Resistenz zu einem Arzneimittel verwendet werden, wo das Arzneimittel ein oder mehrere, z. B. mindestens ein, zwei oder drei Arzneimittel einschließt, welche chemotherapeutische Arzneimittel, antiparasitische Arzneimittel oder antibiotische Arzneimittel sind. Unter "Säuger" ist ein Mensch, ein domestiziertes Tier, z. B. eine Katze oder ein Hund oder ein landwirtschaftliches Tier, z. B. eine Kuh, Schwein, Schaf, Pferd oder Geflügel gemeint. Ein "chemotherapeutisches Arzneimittel" schließt ein jegliches Arzneimittel, gedacht, um gegen eine Tumorzelle gerichtet zu sein und sie abzutöten, z. B. neoplastische maligne oder benigne Tumorzellen in einem Säuger ein. Ein "antiparasitisches Arzneimittel" schließt ein Arzneimittel ein, das auf das Agens einer parasitischen Infektion, z. B. Ascaris, Enterobius oder Hakenwurm, Fadenwurm, Bandwurm, Schistosoma, Geißelwurm, Protozoen, z.B intestinale oder extraintestinale Amöben, Giardia, Malaria, Toxoplasma oder Trichomonas gerichtet sein soll. Ein "antibiotisches Arzneimittel" schließt Substanzen ein, welche zu den Pilzen gehörende oder bakterielle Mikroorganismen inhibieren oder abtöten, z. B. Actinomycin. Beispiele für Arzneimittel innerhalb des Bereiches der Erfindung schließen die in Tabelle 1 aufgeführten Substanzen genauso wie irgendwelche chemotherapeutischen, antiparasitischen und antibiotischen Arzneimittel, welche klinisch hervortreten oder deren therapeutische Effekte durch primäre oder sekundäre "Multidrug" Resistenz hervorgerufen durch MDR1 begrenzt sind (Fort et al. supra; durch Referenz hierdurch eingearbeitet) ein, aber sind nicht darauf begrenzt.
[0019] Die Erfindung schließt auch ein Produkt, enthaltend (a) eine Verbindung des Anspruches 1 oder 2 und (b) eine weitere pharmazeutisch aktive Substanz zur gemeinsamen Verabreichung zum Absenken der Resistenz zu der weiteren pharmazeutisch aktiven Substanz in einem Säuger ein.
[0020] Zytotoxische Arzneimittel, welche durch das MDR1 Protein oder seine Homologen ausgeschleust werden, schließen die in Tabelle 1 gezeigten Verbindungen ein, aber sind nicht darauf begrenzt. Tabelle 1
[0021] Das Verfahren, die Aktivität eines MDR1 Proteins oder seiner Homologen in einem Säuger zu reduzieren, wird auch verwendet, die Verabreichung eines Arzneimittels durch Membranen, welche verschiedene Substanzen von einem gegebenen Zelltyp oder Gewebe ausschließen, zu ermöglichen. Insbesondere können Reversine zum Erleichtern des Transportes eines Arzneimittels durch die Blut-Hirn-Schranke oder durch die Blut-Hoden-Schranke benutzt werden. Unter der "Blut-Hirn-Schranke" und der "Blut-Hoden-Schranke" ist die endothele Zellauskleidung, welche selektiv permeabel oder nicht permeabel für Substanzen jeweils außerhalb des Gehirns oder der Hoden sind, gemeint.
[0022] Ein "Multidrug"-Transporterprotein (MDR1), wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Glykoprotein, das an der Membran vieler Zelltypen, welches zum Ausschleusen verschiedener Substanzen der Zelle agiert, vorhanden ist. Beim Menschen wird MDR1 gewöhnlich als das P-Glykoprotein, P-170 oder Pgp bezeichnet und wird durch das mdr1 Gen kodiert. Es werden auch Homologe des MDR1, welche Mitglieder der MDR1 Proteinfamilie in anderen Organismen sind, z. B. Prokaryonten oder niederen Eukaryonten, z. B. bakteriellen, pilzlichen, parasitischen Organismen und Hefe oder anderen Organismen, welche innerhalb eines Säugerkörpers residieren, eingeschlossen. Homologe innerhalb der MDR1 Proteinfamilie haben, d. h. durch das Transportieren hydrophober zytotoxischer Verbindungen aus der Zelle, dieselbe Funktion wie MDR1 für Zellen der anderen Organismen. Allgemein ist das Verfahren der Erfindung darauf gerichtet, die Aktivität von Mitgliedern der MDR1 Proteinfamilie zu inhibieren, welche durch eine Reversinverbindung, wie das durch die Tests unten gezeigt wird, beeinflusst werden.
[0023] Eine "therapeutisch effektive Menge", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Menge, welche effektiv beim Reduzieren der Aktivität des "Multidrug" Transporterproteins ist; eine Menge, welche effektiv beim Absenken der Resistenz des Säugers zu einem Arzneimittel oder zu einer Gruppe von Arzneimitteln ist oder einer Menge, welche effektiv für das Ermöglichen der Absorption eines Arzneimittels durch die Blut-Hirn-Schranke ist. Eine "effektive Menge" kann durch die Tests unten normiert werden. Durch "Ermöglichen" ist das Erhöhen der Gesamtmenge des Arzneimittels, welches absorbiert wird oder die Fraktion des Arzneimittels, welches absorbiert wird, gemeint.
[0024] Der Ausdruck "Reduzieren", wie hier verwendet, bedeutet entweder das komplette oder teilweise Inhibieren der MDR1 Aktivität. Mit "Reduzieren" ist auch das Erniedrigen, Absenken oder Überwinden der Effekte der Arzneimittel- oder der "Multidrug" Resistenz gemeint, so dass weniger Arzneimittel von der Zielzelle transportiert wird oder so, dass eine größere Konzentration des Arzneimittels in der Zelle akkumuliert. Der Ausdruck "Reduzieren", wie hier verwendet, umfasst sowohl das Behandeln als auch das Vorbeugen des Auftretens einer Arzneimittel, z. B. einer "Multidrug"-Resistenz in einem Säuger. Das Niveau der in einer Zelle oder in einem Zielgewebe vorliegenden MDR1 Aktivität wird durch die unten angegebenen Tests gemessen. Dies wiederum erlaubt die Akkumulation des Arzneimittels zu höheren Konzentrationen in der Zelle, als das in der Abwesenheit der "Reversin" Verbindung möglich sein würde.
[0025] Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen ersichtlich.

Detaillierte Beschreibung

[0026] Wir beschreiben zuerst kurz die Zeichnungen.

Zeichnungen

[0027]
Abb. 1 ist eine schematische Darstellung des MDR1 Proteins in seiner Membranumgebung.
Abb. 2 ist eine computererzeugte Darstellung der Sekundärstruktur des "Reversin" 121 Moleküls, BOC- Asp(OBzl)-Lys(Z)-OtBu.
Abb. 3 ist ein Graph, der die Arzneimittelstimulation der menschlichen MDR1-ATPase Aktivität in isolierten Insektenzellmembranen zeigt.
Abb. 4 ist ein Diagramm, das die Stimulierung der Vanadat-sensitiven menschlichen MDR1-ATPase Aktivität in den isolierten Membranen der Sf9 Zellen durch Verapamil und Reversine zeigt.
Abb. 5 ist ein Säulendiagramm, das die Effekte der Reversine auf die Fura-2 Aufnahme in NIH 3T3 Fibroplasten zeigt.
Abb. 6 ist ein Säulendiagramm, das die Inhibierung der Fura-2 AM Beladung in MDR-1 exprimierenden Fibroplasten durch mit MDR-1 wechselwirkenden Agentien zeigt.
Abb. 7 ist eine Fotographie, die den Effekt des Verapamils auf die Farbstoffbeladung in MDR-1 exprimierenden Fibroplasten zeigt, wobei die Einzelzellaufnahmetechnik zur Fluoreszenzfarbstoffaufnahme angewendet wird. Die obere Reihe zeigt die NIH 3T3 Kontrollzellen; die mittlere und die untere Reihe zeigt MDR1-3T3 Zellen. In der unteren Reihe enthält das Medium auch 25 uM Verapamil.
Abb. 8 ist eine graphische Darstellung der Fluoreszenzfarbstoffaufnahme der Kontrollzellen (A) gegenüber der Fluoreszenzfarbstoffaufnahme in der Gegenwart von 5 uM "Reversin" 205 (B).
Abb. 9 ist ein Säulendiagramm, das den Effekt verschiedener Vorbehandlungen und Waschungen auf die Fluoreszenzfarbstoffaufnahme in 3T3-MDR Zellen zeigt.
Abb. 10A und 10B sind graphische Darstellungen des Effektes von "Reversin" 205 und Verapamil auf mit Adriamycin (A) oder Vincristin (B) behandelte arzneimittelsensitive und "Multidrug" resistente kultivierte menschliche Tumorzellen (K562). K562 Kontrolle, + K652 + 5 uMR, K562 + 10uM Verap, K562 MDR, MDR + 5 uMR, K562 MDR + 10 uMV.
Abb. 11A und 11B sind graphische Darstellungen des Effektes von "Reversin" 121 (A) und 205 (B) auf die Vinblastinsensitivität der arzneimittelsensitiven (KB3) und "Multidrug" resistenten (KBV1) kultivierten menschlichen Tumorzellen. KB3 Kontrolle, + KB3 + 2 ug/ml R, KB3 + 10 ug/ml R, KBV1 Kontrolle, KBV1 + 2 ug/ml R, KBV1 + 10 ug/ml R.

"Reversin" Verbindungen

[0028] Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, chemisch "umkehrende" Agentien oder Chemosensibilisatoren bereitzustellen, um das klinische Problem der "Multidrug" Resistenz anzugehen. Zu diesem Zweck konstruierten die Anmelder einen Satz von neuen hydrophoben, auf Peptiden basierenden, Reversine genannte Moleküle.
[0029] Reversine inhibieren effektiv die Ausschleusung von therapeutischen Arzneimitteln. Sie sind effektiv bei niedriger Konzentration, nicht toxisch und reversibel. Reversine belassen den Organismus auch ohne nachteilige Nebeneffekte und verstärken in einigen Fällen sogar selbst die Aktivität der Arzneimitteltherapie. Sie können in hoher Reinheit, in großen Mengen und zu relativ niedrigen Kosten hergestellt werden. Reversine sind besonders vorteilhaft für das Verhindern der Resistenz gegenüber Antikrebs- Arzneimitteln, ohne dass ernsthafte Nebeneffekte in anderen Geweben hervorrufen werden und ohne dass irreversibel die wichtige natürliche physiologische Funktion des MDR1 Transportproteins selbst unterbrochen wird.

Herstellungsmethoden

[0030] Reversine sind aus natürlich vorkommenden L- Aminosäuren mit sperrigen aromatischen Gruppen oder Alkylgruppen und Carboxyamid- oder Carbonsäureestergruppen bestehende Peptidderivate. Die hydrophoben Seitenketten der Moleküle verstärken deren Wechselwirkung mit dem MDR1 Transporter, für welchen sie ein Substrat sind. Auch die Gesamtgröße des Moleküls beeinflusst diese Wechselwirkung. Dipeptide und Tripeptide werden bevorzugt. Eine computeranalysierte Sekundärstruktur eines bevorzugten Dipeptids, "Reversin" 121, ist in Abb. 2 veranschaulicht.
[0031] Im allgemeinen werden Reversine über eine geeignete Fragmentkondensationsreaktion, die von dem chemischen Charakter des Aminosäureteils in der hergestellten Verbindung abhängt, synthetisiert. Reversine werden über traditionelle stufenweise Kondensationsverfahren (The Peptides: Methods of peptide synthesis, Eds. E. Schoder, K. Lubke, Acad. Press, NY, 1966; The Peptides: Analysis, synthesis and biology, Ed. By E. Gross, J. Meienhofer, Acad. Press, NY, 1979) oder über automatisierte Festphasen- Peptidsyntheseverfahren, welche relativ großmaßstäblich und nicht teuer sind, synthetisiert. Reversine werden auch über dem Fachmann bekannte Verfahren und wie durch die Beispiele 1 bis 12 unten angegeben hergestellt.
[0032] Jedes der Beispiele 1 bis 12 unten wird aus Aminosäuren hergestellt, welche zu einem gewünschten Grad geschützt wurden. Die Ausgangsmaterialien werden in apolaren Lösungsmitteln, z. B. DMF, Acetonitril oder DMSO aufgelöst. Die Kondensationsreaktionen werden in Lösung oder durch Leitung der Lösung über eine Festphasensäule durchgeführt. Die Lösung wird gekühlt, z. B. auf 0 bis 10ºC und der pH wird im neutralen Bereich mit z. B. Triethylamin, N- Methylmorpholin, Trimethylamin oder Diisopropylethylamin eingestellt, und man läßt das Produkt sich langsam, z. B. durch Rühren über Nacht bilden. Schließlich wird die "Reversin" Verbindung aus der Reaktionsmischung, z. B. durch Filtration des Präzipitates oder durch Abdampfen der Mutterlösung gereinigt, und das Produkt wird gewaschen.
[0033] Die Endprodukte können eine zusätzliche Reinigung erhalten, um jegliche Verunreinigungen der "Reversin" Verbindung zu entfernen. Der letzte Reinigungsschritt kann eine oder eine Kombination der folgenden Verfahrensweisen einschließen: Ethylacetat; Gelfiltration; präparative Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC); Mitteldruck- Säulenchromatographie oder Silicagel-Säulenchromatographie. Die Reinheit der erhaltenen Peptide wird durch Dünnschichtchromatographie-(TLC)-Analyse bestimmt.
[0034] In den folgenden Beispielen wurden die Rf Werte durch TLC auf Kieselgelplatten (DC Alufolien von Merck) erhalten, wobei die folgenden Lösungsmittelgemische (in den Beispielen werden die Lösungsmittelgemische durch die unten aufgelisteten Nummern zu identifizieren) verwendet:
(1) Aceton : Toluol 1 : 1
(2) Chloroform : Essigsäure; Benzeol 85 : 10 : 5
(3) Essigsäure : Benzol, 1 : 7
(4) Ethylacetat : Pyridin : Essigsäure : Wasser, 240 : 20 : 6 : 11.
[0035] Im allgemeinen sind Reversine nur geringfügig in Wasser löslich (maximale Löslichkeit ist etwa 10 ug/ml), während sie in Dimethylsulfoxid (DMSO), Glycerol oder Ethanol beliebig löslich sind. Beim Test eines "Reversins" in einem zellulären in vitro "Screening"-Test erhöht die Anwesenheit von Serum in dem Kulturmedium die Löslichkeit des "Reversins".
[0036] Die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele werden zur Veranschaulichung der Verfahren zur Herstellung der "Reversin" Verbindungen der Erfindung angeführt.

Beispiel 1

Herstellung von BOC-Asp(OBzl)-Lys(Z)-OtBu (Reversin 121)

[0037] Nach Auflösen von 1 mmol von BOC-Asp(OBzl)-OH Aminosäurederivat (molare Masse = 323) in 50 ml DMF wurden unter Rühren und Kühlen mit Eiswasser 1,1 mmol DCC (molare Masse = 206) und anschließend 1 mmol N&epsi;-Carbobenzoxylysin tert.-Butylesterhydrochlorid (molare Masse = 371) zugegeben. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde zu 7-8 mit Triethylamin eingestellt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Präzipitat wurde abfiltriert, und die Mutterlösung wurde verdampft. Nach Aufnehmen des Restes in 150 ml Ethylacetat wurde der Extrakt jeweils dreimal mit 120 ml 10%iger Zitronensäurelösung, anschließend dreimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich dreimal mit gesättiger Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen der Ethylacetatphase über wasserfreiem Natriumsulfat und Abfiltrieren des Trocknungsmittels wurde die organische Phase verdampft und der Rest aus 30%igem Alkohol umkristallisiert, um das Titelprodukt zu erhalten. Schmelzpunkt: 128-129ºC, Rf(4) = 0,9. Die mögliche Konformation des "Reversin" 121 ist in Abb. 2 gezeigt.
[0038] Die molare Masse des "Reversin" 121 ist 641,5.

Beispiel 2

Herstellung von Succinyl-bis[Glu(OBzl)-OBzl]

[0039] Zu einer 1 mmol Dibenzylglutamathydrochlorid (molare Masse = 362) in 50 ml DMF enthaltenden Lösung wurden unter Rühren und Kühlen mit Eiswasser 0,5 mmol Bis(pentafluorophenyl)succinat hinzugefügt. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde zwischen 7 und 8 mit Triethylamin eingestellt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Anschließend wurde das Präzipitat abfiltriert, die Mutterlösung verdampft und der Rest in 150 ml Ethylacetat aufgenommen. Die organische Lösung wurde aufeinanderfolgend jeweils dreimal mit 120 ml 10%iger Zitronensäurelösung, dreimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen der Ethylacetatphase über wasserfreiem Natriumsulfat und Abfiltrieren des Trocknungsmittels wurde die organische Phase verdampft und der Verdampfungsrückstand aus wässrigem Alkohol umkristallisiert, um das weiße kristalline Titelprodukt zu erhalten, Schmelzpunkt 106 bis 107ºC, Rf(4) = 0,9.

Beispiel 3

Herstellung von Z-D-Glu(OBzl)-D-Asp(OBzl)-OBzl

[0040] Zu einer 1 mmol des Aminosäurederivates Z-D- Glu(OBzl)-OH (molare Masse = 372) in 50 ml DMF enthaltenden Lösung wurden unter Rühren und Kühlen mit Eiswasser 1,1 mmol DCC and anschließend 1 mmol H-D-Asp(OBzl)-OBzl Hydrochlorid (molare Masse = 349) hinzugefügt. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde zwischen 7 und 8 mit Triethylamin eingestellt und die Mischung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Nach Abfiltrieren des Präzipitates wurde die Mutterlösung verdampft und der Rest in 150 ml Ethylacetat aufgenommen. Die organische Lösung wurde aufeinanderfolgend jeweils dreimal mit 120 ml 10%iger Zitronensäurelösung, dreimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen der Ethylacetatphase über wasserfreiem Natriumsulfat wurde das Trocknungsmittel abfiltriert und die organische Phase verdampft, um die Titelverbindung als ein schwach gelbes kristallines Produkt, Rf(4) = 0,9 zu erhalten.

Beispiel 4

Herstellung von DBTA-bis(D-Phe-Trp-OMe)

[0041] Zu einer 1 mmol des Dipeptidhydrochlorids D-Phe-Trp- OMe (molare Masse = 401.8) in 50 ml DMF enthaltenden Lösung wurden unter Rühren und Kühlen mit Eiswasser zuerst 1,1 mmol DCC und dann nachfolgend 0,5 mmol des DBTA-(OPFP)&sub2; aktiven Esters (molare Masse 696) hinzugefügt. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde zwischen 7 und 8 mit Triethylamin eingestellt und die Mischung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Anschließend wurde das Präzipitat abfiltriert, die Mutterlösung verdampft und der Rest in 150 ml Ethylacetat aufgenommen. Die organische Lösung wurde aufeinanderfolgend jeweils dreimal mit 120 ml 10%iger Zitronensäurelösung, dreimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen der Ethylacetatphase über wasserfreiem Natriumsulfat und Abfiltrieren des Trocknungsmittels wurde die organische Phase verdampft, um die Titelverbindung als einen schaumähnlichen amorphen Verdampfungsrückstand, Rf(4) = 0,9 zu erhalten.

Beispiel 5

Herstellung von DBTA-[Glu(OBzl)&sub2;]&sub2;

[0042] Zu einer 1 mmol des aktiven Esters DBTA-(OPFP)&sub2; (molare Masse = 696) in 50 ml DMF enthaltenden Lösung wurden unter Rühren und Kühlen mit Eiswasser 2 mmol Glu(OBzl)&sub2; Tosylat (molare Masse = 500) und anschließend 0,28 ml (2 mmol) Triethylamin hinzugefügt. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde zwischen 7 und 8 mit Triethylamin eingestellt und die Mischung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Anschließend wurde das Präzipitat abfiltriert und nach Verdampfen der Mutterlösung wurde der Rest in 150 ml Ethylacetat aufgenommen. Die organische Lösung wurde aufeinanderfolgend jeweils dreimal mit 120 ml 10%iger Zitronensäurelösung, dreimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen der Ethylacetatphase über wasserfreiem Natriumsulfat wurde das Trocknungsmittel abfiltriert und die organische Phase verdampft, um die Titelverbindung als einen öligen Rest, Rf (4) = 0,9, zu erhalten.

Beispiel 6

Herstellung von Nα,N&epsi;-bis[BOC-Glu(OBzl)]-Lys-OMe (Reversin 205)

[0043] Verfahren A: Zu einer 1 mmol des Aminosäurederivates BOC-Glu(OBzl)-OH (molare Masse = 337) in 50 ml DMF enthaltenden Lösung wurden unter Rühren und Kühlen in Eiswasser 1,1 mmol DCC und 1 mmol des Aminosäurederivates Lys-OMe Dihydrochlorid (molare Masse = 228) hinzugefügt. Nach Einstellen des pH-Wertes zwischen 7 und 8 mit Triethylamin wurde die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Anschließend wurde das Präzipitat abfiltriert und die Mutterlösung verdampft. Der Rest wurde in 150 ml Ethylacetat aufgenommen und aufeinanderfolgend jeweils dreimal mit 120 ml 10%iger Zitronensäure, dreimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen der Ethylacetatphase über wasserfreiem Natriumsulfat wurde das Trocknungsmittel abfiltriert und die organische Phase verdampft. Nach Umkristallisierung des Verdampfungsrückstandes aus wässrigem Alkohol wurde die Titelverbindung als ein schwach gelbes kristallines Produkt erhalten. Schmelzpunkt: 79-81ºC, Rf(1) = 0,7, Rf(4) = 0,95.
[0044] Verfahren B: Ein zweites Verfahren der Herstellung von Nα,N&epsi;-bis[BOC-Glu(OBzl)]-Lys-OMe ist gemäß der Handlungsweise des Beispiels 11, ausgenommen, dass 5,03 g des aktiven Aminosäureesters BOC-Glu(OBzl)-OPFP als das Ausgangsmaterial verwendet wurde und die anderen Bestandteile in den Mengen 1.15 g Lys-OMe Dihydrochlorid, 20 ml DMF und 1,38 ml Triethylamin verwendet wurden.
[0045] Die molare Masse des "Reversins" 205 ist 875,5.

Beispiel 7

Herstellung von BOC-Tyr(Bzl)-Tyr(Bzl)-OMe

[0046] In einer 986 mg des Aminosäurederivates BOC-Tyr(Bzl)- ONp (molare Masse = 491) in 50 ml DMF enthaltenden Lösung wurden unter Rühren und Kühlen mit Eiswasser zuerst 682 mg H-Tyr(Bzl)-OMe-Hydrochloridsalz (molare Masse = 384) und anschließend 0,28 ml Triethylamin hinzugefügt. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde mit Triethylamin zwischen 7 und 8 eingestellt und die Mischung bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Nach Verdampfen der Mutterlösung wurde der Rest in 50 ml Ethylacetat aufgenommen. Die organische Lösung wurde aufeinanderfolgend dreimal mit 2 N KHSO&sub4; Lösung, dreimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen der Ethylacetatphase über wasserfreiem Natriumsulfat wurde das Trocknungsmittel abfiltriert. Die organische Phase wurde verdampft, um ein Öl zu ergeben, welches aus der Mischung von Ethanol : Wasser (7 : 3) zum Erhalt der Titelverbindung kristallisiert werden kann. Rf(1): 0,95; (Rf(4): 0,9; Schmelzpunkt = 161-163ºC.

Beispiel 8

Herstellung von BOC-D-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OtBu

[0047] Zu einer 10 mmol des Aminosäurederivates BOC-D- Ser(Bzl)-OH (molare Masse = 294) in 20 ml DMF enthaltenden Lösung wurden zuerst 11 mmol DCC (molare Masse = 206), 3,5 g H-Lys(Z)-OtBu Hydrochloridsalz (molare Masse = 336) hinzugefügt. Anschließend wurde unter Rühren und Kühlen in Eiswasser 1,13 ml Triethylamin hinzugefügt. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde durch Verwendung von Triethylamin zwischen 7 und 8 eingestellt und die Mischung bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Nach Verdampfen der Mutterlösung wurde der Rest in 50 ml Ethylacetat aufgenommen. Die organische Lösung wurde aufeinanderfolgend mit 2 N KHSO&sub4; Lösung, dreimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen der Ethylacetatphase über wasserfreiem Natriumsulfat und Abfiltrieren des Trocknungsmittel wurde die organische Phase verdampft, um die Titelverbindung als Öl zu erhalten, welches in Petroleumether trituriert wurde, Rf(4): 0,85; Rf(5): 0,65.

Beispiel 9

Herstellung von BOC-Glu(OBzl)-Lys(Z)-OtBu

[0048] Zu einer 2,12 g BOC-Glu(OBzl)-OFFP aktiven Aminosäuresters (molare Masse = 503) in 20 ml DMF enthaltenden Lösung wurden zuerst 744 mg H-Lys(Z)-OtBu Hydrochloridsalz (molare Masse = 371), dann 0,28 ml Triethylamin unter Rühren und Kühlen durch Eiswasser hinzugefügt. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde durch Verwendung von Triethylamin zwischen 7 und 8 eingestellt und die Mischung bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Nach Verdampfen der Mutterlösung wurde der Rest in 30 ml Ethylacetat aufgenommen. Die organische Lösung wird aufeinanderfolgend dreimal mit 10%iger Zitronensäure, dreimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen der organischen Phase über wasserfreiem Natriumsulfat wurde das Trocknungsmittel abfiltriert und die organische Phase verdampft, um ein Öl zu ergeben, welches anschließend in Petroleumether trituriert und aus Ethanol mit Wasser zum Erhalt der Titelverbindung kristallisiert wurde. Rf(1): 0,95; Schmelzpunkt = 79-91ºC.

Beispiel 10

Herstellung von BOC-Glu(OBzl)-Lys(Z)-OMe

[0049] Zu einer 2,1 g des aktiven Aminosäureesters BOC- Glu(OBzl)-OPFP (molare Masse = 503) in 10 ml DMF enthaltenden Lösung wurde zuerst 1,3 g H-Lys(Z)-OMe- Hydrochloridsalz (molare Masse = 329) zugefügt. Anschließend wurden unter Rühren und Kühlen mit Eiswasser 0,28 ml Triethylamin hinzugefügt. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde zwischen 7 und 8 mit Triethylamin eingestellt und die Mischung bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Nach Verdampfen der Mutterlösung wurde der Rest in 50 ml Ether aufgenommen. Die organische Lösung wurde aufeinanderfolgend dreimal mit 2 N KHSO&sub4; Lösung, dreimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen der organischen Phase über wasserfreiem Natriumsulfat wurde das Trocknungsmittel abfiltriert und die organische Phase verdampft, um ein Öl zu ergeben, welches in Petroleumether trituriert und aus Ethanol mit Wasser zum Erhalt der Titelverbindung kristallisiert wurde. Rf(1) = 0,80; Rf(4): 0,85; Rf(5): 0,90; Schmelzpunkt = 102-105ºC.

Beispiel 11

Herstellung von Nα,N&epsi;-bis[BOC-Lys(BOC)]-Lys-OMe

[0050] Zu einer 5,12 g des aktiven Aminosäureesters BOC- Lys(BOC)-OPFP (molare Masse = 512) in 50 ml DMF enthaltenden Lösung wurde zuerst 1,15 g Lys-OMe-Dihydrochloridsalz (molare Masse = 231) hinzugefügt. Anschließend wurden unter Rühren und Kühlen mit Eiswasser 1,38 ml Triethylamin hinzugefügt. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wurde zwischen 7 und 8 mit Triethylamin eingestellt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Nach Verdampfen der Mutterlösung wurde der Rest in 50 ml Ether aufgenommen. Die organische Lösung wurde aufeinanderfolgend dreimal mit 2 N KHSO&sub4; Lösung, dreimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich dreimal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen der organischen Phase über wasserfreiem Natriumsulfat wurde das Trocknungsmittel abfiltriert und die organische Phase zum Erhalt der Titelverbindung als Öl verdampft. Rf(1): 0,90; Rf(4): 0,90.

Beispiel 12

Herstellung von Nα,N&epsi;-bis[Z-Glu(OtBu)]-Lys-OMe

[0051] Nα,N&epsi;-bis[Z-Glu(OtBu)]-Lys-OMe wurde entsprechend der Verfahrensweise von Beispiel 11 hergestellt, ausgenommen, dass 2,5 g des aktiven Aminosäureesters Z-Glu(OtBu)-OPFP als Ausgangsmaterial verwendet wurde und die anderen Bestandteile in den Mengen 0,6 g Lys-OMe Dihydrochlorid, 25 ml DMF und 0,1 ml Triethylamin verwendet wurden. Die Titelverbindung ist ein weißes kristallines Material. Rf(1): 0,70; Rf(4): 0,75; Schmelzpunkt = 83-84ºC.

Verfahren zur Demonstration der Effektivität der Reversine

[0052] Jede der verschiedenen "Reversin" Verbindungen der Erfindung kann auf ihre Fähigkeit, die Aktivität des MDR1- Proteins gemäß den folgenden in vitro und in vivo Verfahren zu reduzieren, getestet werden. Zusätzlich zu den unten festgesetzten Instruktionen und Experimenten, ist jedes Verfahren durch eine oder mehrere Publikationen, die sämtlich unter Bezugnahme hier eingeschlossen sind, unterstützt.

A. In vitro Verfahren

[0053] Zwei Testsysteme wurden zum spezifischen Prüfen der Fähigkeit einer "Reversin" Verbindung, mit dem menschlichen MDR1 Protein zu interagieren, entwickelt. Das erste System misst die ATPase Aktivität von MDR1, während das zweite System das Niveau von einem Fluoreszenzindikator, ausgeschleust durch das MDR1 Protein, misst.

1. ATPase Test

[0054] Die MDR1-ATPase Aktivierung reflektiert im ersten Test die Wechselwirkung und die relative Affinität, die MDR1 für eine Kandidatenverbindung hat. Die MDR1-ATPase wird durch zytotoxische Arzneimittel, wie z. B. Vincristin stimuliert, während sie insensitiv ist gegenüber Chemikalien, die nicht durch das MDR1 Protein transportiert werden. Die MDR1-ATPase wird auch durch bekannte chemosensibilisierende Agentien, wie z. B. den die "Multidrug" Resistenz umkehrenden, wahrscheinlich mit der Arzneimittelausschleusung des "Multidrug" Transportes kompetetierenden Agentien Verapamil und Chinin (Abb. 3) stimuliert. Durch Messen dieser MDR1-ATPase wurde so ein relativ einfaches in vitro Testsystem verfügbar zum Prüfen direkter Arzneimittelwechselwirkungen mit dem MDR1 Protein (Sarkadi et al. J. Biol. Chem. 267: 4854-4858, 1992).
[0055] Der Test wurde durch Exprimieren des menschlichen MDR1 Proteins in Spodoptera frugiperda Insektenzellen entwickelt. Die kultivierten Zellen wurden mit einem Baculovirus, in welchen die cDNA des menschlichen MDR1 gentechnisch eingeschleust worden war, infiziert. Die rekombinanten virusinfizierten Zellen produzieren, richtig gefaltet und funktionell in die Membran inseriert, eine große Menge des MDR1 Proteins. Zusätzliche, die Konstruktion dieser rekombinanten Stämme betreffende Details werden durch Germann et al. (Biochemistry 29: 2295-2303, 1988) und Sarkadi et al. (1992 supra) geliefert.
[0056] Messungen des Effektes von Reversinen auf die MDR1- ATPase Aktivität werden wie folgt und gemäß den durch Sarkadi et al. (1992, supra) gelieferten Methoden durchgeführt.
MDR1 ATPase Messungen:
[0057] Spodoptera frugiporda (Sf9) Zellen wurden mit einem das menschliche MDR1 Gen tragenden rekombinanten Baculovirus infiziert und gemäß den zuvor beschriebenen Methoden kultiviert (Germann et al. 1990 supra; Sarkadi et al. 1992 supra). Die virusinfizierten Sf9 Zellen wurden abgeerntet, ihre Membranen isoliert und wie beschrieben gelagert (Sarkadi et al. J. Biol. Chem. 267: 4854-4858, 1992). Die in diesen Membranen gemessene Menge des ATP- Verbrauchs reflektiert die ATP-abhängige Transportfunktion des "Multidrug" Transporters. Die ATPase Aktivität der isolierten Sf9 Zellmembranen wurde geschätzt durch Messen der Freisetzung anorganischen Phosphates (Pi). Zur Durchführung dessen wurde eine Membransuspension (etwa 10 ug des Membranproteins) bei 37ºC in 0,1 ml eines 50 mM Tris-Mes (pH 6,8), 2 mM EGTA, 2 mM DTT, 50 mM KCl und 5 mM Natriumazid enthaltenden Mediums inkubiert. Durch die Zugabe von 5 mM MgATP wurde die ATPase Reaktion gestartet. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 0,1 ml 5%iger SDS Lösung gestoppt und die Menge des Pi unmittelbar bestimmt. Die ATPase Aktivität wurde durch die, durch einen sensitiven kolorimetrischen Test zwischen 0 Minuten (Reaktion unmittelbar mit SDS gestoppt) und 20 Minuten Inkubationsperioden in Pi Niveaus erhaltene Differenz geschätzt. Die Datenpunkte zeigen die Mittelwerte von Dreifachbestimmungen in einem repräsentativen Experiment. Die in Abwesenheit und Anwesenheit von Vanadat (100 uM) gemessenen Differenzen zwischen den ATPase Aktivitäten sind aufgezeichnet. Isolierte Membranen von nicht infizierten oder von β- Galaktosidase infizierten Sf9 Zellen wiesen keine arzneimittelstimulierte ATPase Aktivität auf (Abb. 3).
[0058] Als die Reversine 121 und 205 in dem ATPase Testsystem, getestet wurden, stimulierten sie deutlich die MDR1-ATPase, waren aber bei signifikant (ein bis zwei Größenordnungen) kleineren Konzentrationen als die bekannten umkehrenden Agentien Verapamil und Chinin effektiv. Die halbmaximal aktivierende Konzentration (Ka) von Verapamil war ungefähr 1 uM, während der Ka Wert für Reversin 121 ungefähr 60 nM und dieser Wert für Reversin 205 ungefähr 30 nM war (Abb. 4). Somit scheint der "Multidrug" Transporter mit einer außergewöhnlich hohen Affinität mit den Reversinen wechselzuwirken. Bei höheren Konzentrationen (über 1 uM) an Reversin 205 wurde, wie in Abb. 4 gezeigt, eine starke Inhibierung der MDR1-ATPase beobachtet.

2. Fluoreszenztest:

[0059] Der zweite Test basiert auf der Messung der Fluoreszenzfarbstoffaufnahme in intakte Zellen. Fluoreszenzfarbstoffe werden oft verwendet, um intrazelluläre Kalzium- oder pH-Veränderungen anzuzeigen. Eine effektive Technik für die zelluläre Farbstoffbeladung ist die Anwendung von Acetoxy-Methylester (AM) Derivaten. Diese außerhalb der Zelle nicht fluoreszierenden hydrophoben Farbstoffester werden durch intrazelluläre Esterasen in hydrophile fluoreszierende freie Säuren gespalten. Dieses intrazelluläre "trapping" des freien Farbstoffes und der kontinuierlich einwärts gerichtete Gradient der AM Verbindungen resultieren in der Akkumulation von großen Mengen an Fluoreszenzindikator innerhalb der Zelle.

Zellkultivierung

[0060] NIH 3T3 Zellen wurden unter Standardbedingungen in D- MEM Medium kultiviert. MDR1-transfizierte Zellen (NIH MDR1 G185) wurden wie beschrieben präpariert und auf ihre arzneimittelresistenten Eigenschaften hin charakterisiert (Ambdukar et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8472-8476, 1993; Bruggemann et al. J. Biol. Chem. 267: 21020-21026, 1992; Sarkadi et al. 1992 supra). Vor jedem Experiment wurden die Zellen trypsinbehandelt, anschließend gewaschen und in D-MEM Medium bei 37ºC gelagert. KBV1 (MDR1&spplus;) und KB3 (MDR1&supmin;) menschliche Tumorzellen wurden ebenfalls in D-MEM kultiviert, wobei menschliche Tumorzellen K562 in RPMI Medium, angereichert mit 10% FCS angezogen wurden.
[0061] Die Effekte der Reversine 121 und 205 auf die MDR1 Funktion in intakten Zellen wurde durch einen Fluoreszenzfarbstoffausschleusungstest (Abb. 5) untersucht. Mit menschlicher MDR1 cDNA transfizierte und menschliches MDR1 Protein exprimierende Maus NIH 3T3 Fibroblasten schleusen aktiv die hydrophoben AM Derivate der Fluoreszenzfarbstoffe, z. B. Fura2-AM aus (Homolya et al. J. Biol. Chem. 29: 21493-21496, 1993; Hollo et al. Bioch. Bioph. Acta 1191; 384-388, 1994) aus. Ähnliche Experimente können mit MDR1-exprimierenden menschlichen Tumorzellen ausgeführt werden. Verapamil Vincristin und die Reversine 121 und 205 inhibieren diese Farbstoffausschleusung höchstwahrscheinlich durch Kompetitieren mit dem Farbstoff an dem Transporter. In den hier gezeigten Experimenten wurden maximal wirksame Konzentrationen der Reversine verwendet. Jedoch agieren die Reversine auch bei um mindestens eine Größenordnung niedrigeren Konzentrationen als Verapamil.
[0062] Mit menschlichem MDR1 transfizierte Mausfibroplasten und MDR1-exprimierende menschliche Tumorzellen schleusen aktiv die AM-Formen der verschiedenen Fluoreszenzindikatoren aus, wodurch das Niveau der intrazellulären Fluoreszenz in Zellen mit aktiven "Multidrug" Transport erniedrigt wird. Die Akkumulation des Fluoreszenzfarbstoffes ist somit in solchen Zellen stark inhibiert. Diese MDR1-spezifische AM- Farbstoffausschleusung wird durch kompetitierende Substrate und Inhibitoren des MDR1-Transporters, z. B. durch Verapamil, Vincristin, Natriumorthovanadat und einem monoklonalen anti-MDR1 Antikörper blockiert. Im Gegensatz dazu haben diese Agentien keinen Effekt auf die Farbstoffakkumulation in Fibroplasten, welche MDR1 nicht überexprimieren (Abb. 6). Siehe auch Kessel et al. (Cancer Res. 51: 665-670, 1991); Neyfakh et al. (Exp. Cell. Res. 174: 168-176, 1988) und Sarkadi et al. (J. Biol. Chem. 268: 21493-21496, 1993).

Fluoreszenzstudien:

[0063] Die Farbstoffaufnahme wurde durch Inkubieren von 2 · 10&sup6; Zellen/ml D-MEM Medium bei 37ºC in der Gegenwart von 0,5 uM Fura-2 AM (zugegeben in 5 mM Stocklösung in DMSO), anschließendem schnellen Abzentrifugieren der Zellen (15 sec, 12.000 · g) und Abspülen des Pellets mit HPM1 Medium (enthaltend 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,4 mM MgCl&sub2;, 0,04 mM CaCl&sub2;, 10 mM HEPES-Na (pH 7,4), 10 mM NaHCO&sub3;, 10 mM Glukose und 5 mM Na&sub2;HPO&sub4;) gemessen. Die Zellen wurden in 2 ml HPM1 resuspendiert, und die Fluoreszenz wurde unter schnellem Rühren in einem Hitachi F-4000 Fluoreszenzspektrophotometer gemessen. Die Anregungswellenlänge war 340 nm und die Emission wurde bei 410 nm gemessen. Die maximale Fluoreszenz und Farbstoffkonzentration wurden nach der Zugabe von 0,5% Triton X-100 und 2 mM CaCl&sub2; zu dem Medium gemessen. Die Farbstoffkonzentration wurde basierend auf den Messungen der Fluoreszenz des Farbstoffes der freien Säure in dem selben Instrument unter identischen Bedingungen kalibriert.

Fluß-zytometrische Messungen:

[0064] Die Fluoreszenzmessungen wurden unter Verwendung von einem Cytoronabsolut-Gerät (Ortho Diagnostic Systems, NJ) in 60 Sekunden-Meßperioden ausgeführt. Die Anregung wurde auf 488 nm eingestellt. Die grüne Fluoreszenz wurde mit einem Filter mit einem Bereich von 515 bis 548 nm gemessen, während die rote Fluoreszenz oberhalb von 620 nm gemessen wurde.
[0065] Mit dieser Methode können die Arzneimittelwechselwirkungen mit dem MDR1 Protein durch Verfolgen der zellulären Fluoreszenz gemessen werden, was eine flusszytometrische oder Einzelzell-Bilddetektion der Funktion des MDR1 in Tumorzellen erlaubte. Wie in den Einzelzellaufnahmen von Abb. 7 gezeigt, werden die das MDR1 Protein exprimierenden Fibroplasten im Gegensatz zu den Kontrollzellen nicht mit einem Fluoreszenzfarbstoff beladen, während Verapamil, welches den "Multidrug" Transporter inhibiert, die Farbstoffaufnahme wiederherstellt.
[0066] Beim in vitro Testen des Effektes von Reversinmolekülen auf die Fluoreszenzfarbstoffaufnahme und die Arzneimittelresistenz in verschiedenen MDR1- transfizierten und "Multidrug" resistenten Tumorzellinien deuteten diese Experimente auf eine starke inhibitorische Wirkung der Arzneimittelausschleusung durch niedrige Konzentrationen der Reversine hin, was wiederum eine spezifische Wechselwirkung des "Multidrug" Transporters mit diesen Molekülen zeigt.

Bindungsexperimente:

[0067] Die relative Fähigkeit der Reversine, an das MDR1 Protein zu binden oder von der Zellmembran entfernt zu werden, wird durch Auswaschexperimente gemessen (Abb. 9). NIH 3T3-MDR1 Zellen wurden mit 15 uM Verapamil, 5 uM Reversin 121 oder 5 uM Reversin 205 für 5 Minuten vorbehandelt, was eine komplette Inhibition der Farbstoffausschleusung durch MDR1 mit 1% Serum in dem Medium hervorrief. Die Zellen wurden einmal mit dem Standardinkubationsmedium gewaschen und für 5 Minuten bei 800 g zentrifugiert. Die Farbstoffaufnahme wurde anschließend mit oder ohne den Zusatz von 15 pH Verapamil während der Aufnahmeperiode gemessen. Die Vorinkubation mit Verapamil hatte, wie gezeigt, keinen Effekt auf die Farbstoffaufnahme, während sowohl Reversin 121 als auch Reversin 205 einen größeren Effekt sogar nach dem Waschen der Zellen hatten. Verapamil konnte somit durch eine einzige Waschung eliminiert werden, während 121 und 205 effektiv an MDR1 gebunden verblieben.
Prüfen der Reversinaktivität durch seine Fähigkeit, die Zytotoxizität, hervorgerufen durch andere Agentien zu verstärken
[0068] Eine andere Methode zum Test der Fähigkeit von Reversinen, die Arzneimittelresistenz zu inhibieren, ist die Zytotoxizität von Arzneimitteln in "Multidrug" resistenten menschlichen Tumorzellinien zu messen. Da MDR1 normalerweise die Konzentration von zytotoxischen Agentien auf subtoxische Konzentrationen durch Ausschleusen dieser aus der Zelle erniedrigt, könnte erwartet werden, dass die Inhibition von MDR1 die Zytotoxizität verstärkt.
[0069] In diesen Studien wurden Adriamycin, Vincristin und Vinblastin wirksam zytotoxisch in ursprünglich nicht wirksamen Konzentrationen in der Gegenwart von 1-10 ug/ml der Reversine 121 oder 205. Die Abb. 10A und 105 präsentieren solch ein Experiment für Reversin 205, verwendend K562 menschliche erythroblastoide Tumorzellen und ihre Adriamycin-selektierte "Multidrug" resistente Unterlinie. In dem in Abb. 11(A) gezeigten Experiment wurde gefunden, dass Reversin 121 zytotoxisch, sogar ohne den Zusatz von Vinblastin in den MDR1-exprimierenden Zellen (aber nicht in den Kontrollzellen) ist. Solch ein kollateraler toxischer Effekt (welcher in der nutzlos ATP- konsumierenden Funktion des Arzneimitteltransporters begründet sein könnte) kann von großem Vorteil bei der Behandlung arzneimittelresistenter Tumore sein.

Anwendung des in vitro Fluoreszenztestes zur klinischen Diagnose

[0070] Unter Verwendung des gleichen, oben beschriebenen Fluoreszenzfarbstoffausschleusungstestes wurden die in vitro Effekte der Reversine auf die "Multidrug" resistenten Leukozyten eines Leukämiepatienten studiert. Nach Blutentnahme vom Patienten und dem Isolieren weißer Blutzellen durch Zentrifugation wurden die Zellen isoliert. Durch Biopsie können Zellen von anderen Tumortypen isoliert werden. Ein Flusszytometer wurde zum Messen der Fluoreszenzfarbstoff-beladung der individuellen Zellen, für welche zuvor gezeigt wurde, dass sie MDR1 exprimieren, in Abwesenheit oder Anwesenheit von Reversin 205 (Abb. 8) verwendet. Die Aufnahme des Fluoreszenzfarbstoffes veranschaulicht unter diesen Bedingungen die Aufnahme der zytotoxischen Arzneimittel in die Tumorzellen. Die Fluoreszenzfarbstoffaufnahme wurde bei 37ºC für 10 Minuten gemessen. In Abb. 8 hatten die MDR1 enthaltenden Zellen in dem Kontrollexperiment eine niedrige Fluoreszenzfarbstoffaufnahme (A), während die Zugabe von 5 pM Reversin 205 die Farbstoffausschleusung durch MDR1 (B) blockierte. Dadurch erhöhte Reversin 205 signifikant die Farbstoffaufnahme und erbrachte eine gleichmäßig hohe Fluoreszenz in den Leukozyten. Weitere Details zu diesen Methoden werden durch Hollo at al., supra geliefert.

Zusätzliche in vitro Verfahren:

[0071] Zusätzliche in vitro Verfahren zum Screening der Fähigkeit einer Reversin-Verbindung, als ein chemosensibilisierendes Agens für die Umkehr der "Multidrug" Resistenz zu agieren, werden durch Ford et al., supra, in den Tabellen 1-6 geliefert.

B. In vivo Verfahren

[0072] In vivo Tierstudien für die Wirksamkeit der Reversine können durchgeführt werden, wobei jedes geeignete dem Fachmann bekannte Tiermodellsystem verwendet werden kann. Ein Beispiel eines geeigneten Systems ist das Maus P388 Leukämiemodellsystem (Tsurouo et al., supra). Dieses Tiermodell ist weithin zum Testen des Effektes zytotoxischer antileukämischer Agentien oder Antwort-modifizierender Verbindungen akzeptiert.
[0073] Durch Inzucht erzeugte Mäuse (DBA · black F1) erhielten durch intraperitoneale Injektion 10&sup6; P388 Leukämiezellen. Das Überleben der Mäuse wurde verfolgt. Die Mäuse wurden mit P388 Kontrollzellen wie auch mit P388 Zellen, welche unter Arzneimittelexposition selektiert wurden, injiziert. Die Arzneimittelexposition induzierte die Überexpression des MDR1 Proteins (P388-MDR Zellen).
[0074] In einem Versuch hatten die Mäuse eine mittlere Überlebenszeit von 14-16 Tagen (sie starben an einer allgemeinen, durch die P388 Zellen hervorgerufenen Leukämie). Die mit den P388 Zellen injizierten Mäuse wurden mit Doxorobicin (Adriamycin) in einer Dosis von 1 mg/kg/Tag für 6 Tage nach der Injektion der P388 Zellen behandelt. Die Resultate zeigten, dass Adriamycin in dem Fall der mit den Kontroll P388 Zellen injizierten Mäusen die Überlebenszeit verlängerte, wobei ein Zeitraum von 30 Tagen überschritten wurde. Im Gegensatz dazu hat die Adriamycintherapie die Lebenszeit der mit P388-MDR Zellen injizierten Mäuse nicht signifikant verlängert. Reversin kann den Tieren in einer Dosis von 2 mg/kg verabreicht werden, ein Niveau, welches keinen toxischen Effekt auf die Kontrolltiere, wie oben diskutiert, ausübt.
[0075] Ein anderes Testsystem besteht darin, ähnliche Versuche unter Verwendung von menschlichen Xenotransplantaten bei nackten Mäusen durchzuführen. Menschliche Erythroleukämie-Zellen (K562) werden in tolerante Mäuse injiziert. Die sich entwickelnde Leukämie wird mit zytotoxischen Verbindungen mit oder ohne eine Reversinkandidatenverbindung behandelt.
[0076] Ein anderes Tiermodellsystem zum Testen der Fähigkeit einer Reversinverbindung zum Umkehren der "Multidrug" Resistenz ist, eine transgene Maus, welche das menschliche MDR1 Gen, z. B. in ihrem Knochenmark exprimiert, zu verwenden (Pastan et al. FASEB Jour. 5: 2523-2528, 1991).
[0077] Klinische Versuche am Menschen können gemäß den dem Fachmann bekannten Methoden durchgeführt werden. Zum Beispiel liefert Dalton et al. Methoden zum Testen des Chemosensibilisators Verapamil auf seine Fähigkeit, die Resistenz zu einem Chemotherapeutikum zu modifizieren. (Jour. Clin. Oncol. 7: 415-424, 1989). Zusätzliche Verfahren zu den Reversinen für das Durchführen klinischer Versuche am Menschen schließen ein, aber sind nicht darauf begrenzt, jene, die durch Berenbaum et al. (Pharmacol. Rev. 41: 93-141, 1989); Benson et al. (Cancer Treat. Rep. 69: 795-799, 1985); Cairo et al. (Cancer Res. 49: 1063-1066, 1989); Fine et al. (J. Clin. Oncol. 5: 489-495, 1987); Frishman et al. (J. Cardiol. 50: 1180-1184, 1982); Miller et al. (J. Clin. Oncol. 6: 880-888, 1988); Ozols et al. (J. Clin. Oncol. 5: 641-647, 1987); and Presant et al. (Am. J. Clin. Oncol. 9: 355-357, 1986) beschrieben sind.

Therapeutische Verwendung von Reversinen

[0078] Die Reversine der Erfindung können therapeutisch zum Inhibieren der in vivo Aktivität des MDR1 Proteins bei einem Patienten angewandt werden, der unter einer Arzneimittelresistenz oder schwachen Arzneimittelabsorption leidet. Eine wirksame Menge des Reversins kann dem Patienten intravenös oder oral gemäß konventionellen Verfahren in der Form einer Kapsel, Flüssigkeit, Tablette, Puder oder Pille verabreicht werden. Das Reversin kann auch in eine implantierte oder in eine oral verabreichte Vorrichtung zur verzögerten Freisetzung inkorporiert werden.
[0079] Das Reversin kann für die therapeutische Verwendung durch Vermischen der Verbindung mit pharmazeutischen Trägern und/oder Zusätzen, welche die Löslichkeit, die Absorption, den Geschmack oder die Struktur des Trägers oder seiner Inhalte, z. B. physiologischer Kochsalzlösung, Öl, z. B. veredeltes Sojabohnenöl, Gelatine, Glyzerin oder gereinigtes Wasser verbessern, hergestellt werden.
[0080] Eine geeignete Dosierung ist zwischen 50 ug/kg und 100 mg/kg. Eine wirksame und sichere Dosierung kann durch konventionelle Methoden oder durch die hier gelehrten Methoden oder durch Kalibrierung gegenüber einem gegebenen Patienten auf einer individuellen Basis bestimmt werden.
[0081] Es wurde gefunden, dass Verbindungen der Formel (I) gemäß unserer Erfindung jeweils zum Stimulieren in einer Konzentration von 0,03 uM oder zum Inhibieren in Konzentrationen von 1 bis 5 uM der Aktivität des MDR1 Proteins fähig sind. Die stimulierenden Konzentration sind 1 bis 3fach, die inhibitorischen Konzentrationen sind 1 bis 2- fach niedriger als die korrespondierenden Konzentrationen der aus der Literatur bekannten Substanzen, z. B. Verapamil.
[0082] Die Sicherheit der Reversine für die Verabreichung am Menschen kann in geeigneten Tiermodellen eingegrenzt werden. Zum Beispiel wurde die akute und subakute in vivo Toxizität von Reversinen an Laborratten überprüft. Die Lösungen der Reversine 121 und 205 wurden wie folgt präpariert und verabreicht. Typ A Lösungen enthielten 50 ug/ml Reversin 121 oder 205 in 20%igem Ethanol in physiologischer Kochsalzlösung. Typ B Lösungen enthielten 1 mg/ml in Glycerol, enthaltend 10% Ethanol. Typ A Lösungen (0,5 ml) wurden intravenös zu drei Laborratten, jede 200 bis 250 g wiegend (etwa 100 bis 125 ug/kg), zweimal täglich für drei Tage verabreicht. Typ B Lösungen (0,5 ml) wurden ähnlichen Ratten (2-2,5 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion zweimal täglich für drei Tage gegeben. Kontrollratten erhielten dieselben Lösungen ohne die Reversine. Während der drei Tage der Injektionen und in einer darauffolgenden zweiwöchigen Periode wurde keine akute oder subakute Toxizität der Verbindungen beobachtet.
[0083] Zusätzliche Tests der Toxizität können anhand der Methoden von Pastan et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4486-4490, 1988) und Tsuruo et al (Cancer Res. 43: 2905- 2910, 1983) ausgeführt werden.
[0084] Andere Ausführungsformen liegen innerhalb der Ansprüche, die unten ausgeführt sind.

Claims

1. Eine Verbindung mit der Formel (I):

X¹n-X²-X³(X&sup4;)n-X&sup6; (I)

wobei

n 0 oder 1 ist, und jedes n gleich oder unterschiedlich ist;

X¹ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus tert.- Butyloxycarbonyl, BOC-Asu, Z-Asu, Benzyloxycarbonyl, Glu(OBzl)-(OBzl), Trp-OMe, Trp-Phe-OMe, Phe-Trp-OMe, Phe- Phe-OtBu, Trp-Trp-OtBu, Indolacetyl, Benzoyl, Alkylamin mit 1-4 Kohlenstoffen, Dibenzylamid, Tryptamid, 1- Aminoadamantin, Aminomethylcyclohexan, Indolin, Phenylethylamid und Dicyclohexylamid besteht;

X² aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Glu(OBzl), Asp(OBzl), Succinyl, O,O-Dibenzoyltartaroyl, Diphenoyl, Muconyl, Thx, Cap, Asu, Nal, Pen, Phg, Dbt, Lys(BOC), Lys(Z), Cys(Bzl), Thr(Bzl), Glu(OtBu), tert.-Leu, Leu, Nle, Pro, Phe, Tyr(Bzl) und Ser(Bzl) besteht;

X³ aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Asp, Asu, Lys, Glu, Trp, Thx, Cpa, Nal, Pen, Phg, Dbt, Glu (OtBu), tert.-Leu, Leu, Nle, Pro, Tyr, Phe and Tyr(Bzl) besteht;

X&sup4; aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus BOC- Glu(OBzl), Glu(OBzl), OBzl, Bzl, BOC, BOC-Lys(BOC), Asu, Z- Glu(OtBu), Asp(OBzl), Asp(OBz)-OBzl, Benzyloxycarbonyl, O- (Cyclohexyl), Fluorenylmethylester, Glu(OtBu), Glu(OtBu)- OBzl, 1-Aminoadamantin, Aminomethylcyclohexan, Indolin, Phenylethylamid und Dicyclohexylamid besteht; und

X&sup5; aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus OMe, OBzl, OtBu, Phe-OMe, Trp-OMe, -O-(cyclohexyl), (Chlorophenyl)- Isobutylamid, Fluorenylmethylester, ONp, 1-Aminoadamantan, Aminomethylcyclohexan, Indolin, Phenylethylamid und Dicyclohexylamid besteht,

mit der Massgabe, dass die Formel (I) nicht BOC-Leu- Tyr-OMe ist, und,

wenn X² Glu(OBzl), Asp(OBzl), Thx, Cpa, Asu, Nal, Pen, Phg, Dbt, Lys(Boc), Lys(Z), Cys(Bzl), Thr(Bzl), Glu(OtBu), tert.-Leu, Leu, Nle, Pro, Phe, Tyr(Bzl) oder Ser(Bzl) ist, dann X¹ tert.-Butyloxycarbonyl, BOC-Asu, Z-Asu, Benzyloxycarbonyl, Indoleacetyl oder Benzoyl sein muß, und

wenn X² Succinyl, O,O-Dibenzoyltartaroyl, Diphenoyl oder Muconyl ist, dann X¹ Glu(OBzl)-(OBzl), Trp-OMe, Trp-Phe-OMe oder Phe-Trp-OMe sein muß.

2. Eine Verbindung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Verbindung der Formel (I) BOC-Asp(OBzl)-Lys(Z)-OtBu, Succinyl-bis[Glu(OBzl)-OBzl], Z-D-Glu(OBzl)-D-Asp(OBzl)- OBzl, DBTA-bis(D-Phe-Trp-OMe), DBTA-[Glu(OBzl)&sub2;]&sub2;, Nα,Nα- bis[BOC-Glu(OBzl)]-Lys-OMe, BOC-Tyr(Bzl)-Tyr(Bzl)-OMe, BOC- D-Ser(Bzl)-Lys(Z)-OtBu, BOC-Glu(OBzl)-Lys(Z)-OtBu, BOC- Glu(OBzl)-Lys(Z)-OMe, Nα,Nα-bis[BOC-Lys(BOC)]-Lys-OMe oder Nα,Nα-bis[Z-Glu(OtBu)]-Lys-OMe ist.

3. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel (I) wie in Anspruch 1 definiert in Beimengung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.

4. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung der Formel (I) wie in Anspruch 1 definiert und eine weitere pharmazeutisch aktive Substanz umfasst.

5. Ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) wie in Anspruch 1 definiert, umfassend Kondensieren X¹n, X², X³, X&sup4;n, X&sup5; und/oder X¹nX² durch an sich bekannte Verfahren in der Peptidchemie in einer gewünschten Reihenfolge, um die gewünschte Verbindung der Formel (I) zu erhalten, gefolgt von deren Reinigung.

6. Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Verfahren das Koppeln aktiver Ester umfaßt.

7. Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Verfahren eine Dicyclohexylcarbodiimid-Kondensation umfaßt.

6. Eine Verbindung der Formel (I) wie in Anspruch 1 definiert zur Verwendung in der Therapie.

9. Eine Verbindung der Formel (I) wie in Anspruch 1 definiert zur Verwendung beim Reduzieren der Aktivität des Multiarzneimittel-Transportproteins in einem Säugetier.

10. Eine Verbindung der Formel (I) wie in Anspruch 1 definiert zur Verwendung beim Reduzieren der Resistenz gegen ein Arzneimittel.

11. Eine Verbindung nach Anspruch 10, wobei das Arzneimittel aus der Gruppe ausgewählt wird, die ein Chemotherapeutikum, ein Antiparasitikum und ein Antibiotikum umfasst.

12. Eine Verbindung nach Formel (I) wie in Anspruch 1 definiert zur Verwendung beim Erleichtern der Verabreichung eines Arzneimittels durch die Blut-Gehirnschranke oder durch die Blut-Hodenschranke.

13. Ein Produkt, das (a) eine Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 und (b) eine weitere pharmazeutisch aktive Substanz zur gemeinsamen Verabreichung enthält, um die Resistenz gegen die weitere pharmazeutisch aktive Substanz in einem Säugetier zu reduzieren.