DE69413817T2

DE69413817T2 - Faktor vii-peptide

Info

Publication number: DE69413817T2
Application number: DE69413817T
Authority: DE
Inventors: Lars N-0267 Oslo Orning; Kjell Steinar N-0262 Oslo Sakariassen; Ross Wentworth N-0380 Oslo Stephens
Original assignee: Nycomed Imaging AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1993-06-18
Filing date: 1994-06-17
Publication date: 1999-06-10
Anticipated expiration: 2014-06-18
Also published as: FI956055L; DK0703923T3; EP0703923B1; ATE171950T1; CZ334095A3; US5962418A; HUT74873A; HU9503593D0; CN1125450A; SK156395A3; WO1995000541A1; CA2164422A1; AU6975594A; FI956055A7; NO955067L; JPH08511794A; EP0703923A1; DE69413817D1; NZ267453A; NO955067D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptidreagenzien und Zusammensetzungen davon, die die Bildung von Blutgerinnseln verhindern.
Blutgerinnung steht in Zusammenhang mit einer Reihe oder Kaskade aktivierender Reaktionen, die letztendlich zur Bildung des Fibringerinnsels führen. Die zur Fibrinbildung führende Kaskade kann auf zwei verschiedene Arten ausgelöst werden: durch Kontakt mit anomalen Oberflächen (der "intrinsische Pfad") oder durch Traumatisierung der Blutgefäße, was eine Sekretion des Lipoproteins verursacht, das als "Gewebefaktor" oder TF bekannt ist (der "extrinsische Pfad"). Die vorliegende Erfindung betrifft in erster Linie den extrinsischen Blutgerinnungspfad.
TF ist ein integrales Membranprotein, das bei vielen Zelltypen auftritt. Zellen, die jedoch konstitutiv TF exprimieren, wie z.B. die Muskelzellen der Gefäßintima sind normalerweise Blut nicht ausgesetzt (siehe Edgington et al., Thromb. Haemostas. 66(1): 67-69 (1991)). Daher scheint die Initiierung des extrinsischen Blutgerinnungspfades entweder die Zerstörung der Blutgefäßwände (siehe Almus et al., Blood 76: 354-360 (1990)) und/oder die Aktivierung der endothelialen Zellen oder Monozyten notwendig zu machen, um TF zu exprimieren (siehe Edwards et al., Blood 54: 359-370 (1979) und Bevilaqua et al., PNAS USA 83: 4533-4537 (1986)). Eine Zerstörung der Blutgefäßwand kann aufgrund einer Zerklüftung eines atherosklerotischen Plaques auftreten, wodurch Gewebemakrophagen und glatte Muskelzellen dem Blut ausgesetzt werden (siehe Wilcox et al., PNAS USA 86: 2839-2843 (1989)). TF kann auch als Folge einer Verletzung der Blutgefäße während der Thrombolysetherapie, der Transplantationschirurgie, der mechanischen Wiederherstellung der Gefäßdurchgängigkeit oder ähnlichen Techniken freigesetzt werden. Andererseits kann TF-Exprimierung in endothelialen Zellen oder Monozyten bei Sepsis aufgrund der Produktion von Tumornekrosefaktor-α oder Interleukin-1 induziert werden (siehe Edwards et al., a.a.O., und Gregory et al., J. Clin. Invest. 76: 2440-2445 (1985)).
Die Serinprotease Faktor VIIa (FVIIa) ist am extrinsischen Blutgerinnungspfad beteiligt. FVIIa wird durch Proteolyse aus seinem inaktiven Proenzym Faktor VII (FVII) durch andere Bestandteile im Blutgerinnungsprozess, einschließlich Faktor Xa, Faktor XIIa, Faktor IXa oder Thrombin, gebildet. Es wurde berichtet, dass die Aktivierung von FVII zu FVIIa bedeutend verbessert ist, wenn FVII an seinen Cofaktor Gewebefaktor (TF) gebunden ist (siehe Nemerson, Semin. Hematol. 29(3): 170-176 (1992)). Auch haben Yamamoto et al. vorgeschlagen, dass es sich bei der Umwandlung von FVII zu FVIIa um einen autokatalytischen Prozess handeln kann (siehe J. Biol. Chem. 267(27): 19089-19094 (1992)).
FVIIa bildet mit TF einen Komplex in Gegenwart von Calciumionen, und der FVIIa/TF-Komplex katalysiert im nächsten Schritt des Blutgerinnungsprozesses auf dem extrinsischen Pfad die Umwandlung von Faktor X in seine aktive Form, Faktor Xa.
Die Struktur von FVII wurde untersucht und Hagen et al., in PNAS USA 83: 2412-2416 (1986) haben über die cDNA-Sequenz berichtet. FVII ist ein Vitamin K-abhängiges Protein, und es wurde, mittels Analogie zu anderen Vitamin K-abhängigen Proteinen, eine mutmaßliche γ- Carboxylglutaminsäure- (Gla)-Domäne am aminoterminalen Ende identifiziert. Wiederum durch Analogie zu anderen Vitamin K-Proteinen wurde vorhergesagt, dass die Gla-Domäne notwendig ist, um an TF zu binden (siehe Hagen et al., oben). Auf die Gla-Domäne folgen zwei potentielle Wachstumsfaktor (GF)-Domänen. In der Literatur wurde jedoch keinerlei Funktion für die GF-Domänen vorgeschlagen.
Man hat nahegelegt, dass die Aktivierung des extrinsischen Pfades der Blutgerinnselbildung das primäre Ereignis für die Fibrinbildung ist (siehe Weiss et al., Blood 71: 629-635 (1988) und Weiss et al., Blood 73: 968-975 (1989)) und daher von äußerster Wichtigkeit bei der Pathogenese arteriosklerotischer Gewebsveränderungen und bei Wiederverschluss und der Restenose, die auf Endarteriektomie folgt, ist. Trotz des Bedarfs stehen jedoch keine wirksamen therapeutischen Mittel zur Verfügung, die in die Aktivierung dieses Pfades eingreifen können (siehe Shepard, TIBTECH 2: 80-85 (1991)).
In der EP 446 797 beschreiben Behringwerke ein synthetisches Peptid, das von der Aminosäuresequenz von Faktor VIIa abgeleitet ist. Diese Peptide können zur Immunisierung und zur Reinigung von bestimmten Antikörpern verwendet werden.
In der WO93/09804 beschreibt The Scribbs Research Institute Polypeptid- und Antipeptid-Antikörper, welche die Serinprotease- Enzymaktivität inhibieren können. Die Polypeptid- und Antipeptid- Antikörper können von der Blutgerinnungs-Serinprotease Faktor VIIa abgeleitet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide und Analoga oder Salze davon, welche die Assoziation von FVII oder FVIIa mit TF inhibieren. Durch die Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide wird die Bildung des FVIIa/TF-Komplexes eingeschränkt und damit die Aktivierung des Faktors X reduziert.
Bestimmte bei der Blutgerinnungstherapie verwendbare Peptide sind in der WO-A-91/07432 des Board of Regents; The University of Texas System, offenbart. Die offenbarten Peptide treten entweder im Bereich zwischen der Gla- und der ersten GF-Domäne oder in der katalytischen Domäne von FVII oder FVIIa auf. Obwohl die Inhibierung der FVIIa/TF- Komplexbildung diskutiert wird, verursachen die in der WO-A-91/07432 offenbarten Peptide diesen Effekt durch Inhibierung der Gla-Funktion. Solche Peptide sind daher in ihrer Wirkung unspezifisch, da andere physiologische Proteine Gla-Domänen aufweisen, wie z.B. Protein C, das eine enge Sequenzhomologie zur Gla-Domäne von FVII aufweist. Deshalb würde die Funktion des Protein C auch durch die in der WO-A- 91/07432 offenbarten Peptide in nicht wünschenswerter Weise gestört.
In der WO-A-90/03390 schlägt Corvas Inc. vor, dass bestimmte von der Aminosäuresequenz von FVII (oder FVIIa) abgeleitete Peptide zur Prävention der Wirkung des voll gebildeten FVIIa/TF-Komplexes verwendbar sein können. Insbesondere offenbart die WO-A-90/03390 zwei Peptidsequenzen als diesbezüglich wirksam. Die Sequenz -VGHFGV- basiert auf den Aminosäuren mit den Nummern 372-377 von FVII, die sich in der Nähe des Carboxy-Terminus befinden. Die andere Sequenz ist -SDHTGTKRSCR-, entsprechend den Aminosäuren Nr. 103-113 von FVII, die Teil der zweiten GF-Domäne ist. Corvas Inc. deuten an, dass diese Peptide und Analoga davon die vom FVIIa/TF-Komplex initiierte Kaskadenreaktion inhibieren.
Außerdem wird in Tabelle 1 auf Seite 14 der WO90/03390 gezeigt, dass von den verschiedenen Regionen der zweiten GF-Domäne nur SDHTGTKRSC (103 bis 112) aktiv war und dass die anderen Regionen, nämlich Aminosäuren 50 bis 101 und 114 bis 127, vollkommen inaktiv bei der Inhibierung der Aktivierung von Faktor X durch Faktor VII und Gewebefaktor waren.
Entgegen der von Corvas Inc. mitgeteilten Ergebnisse, haben wir jedoch gezeigt, dass die Region SDHTGTKRSC von 103 bis 112 ein eher schwacher Inhibitor der Bindung von Faktor VII an Gewebefaktor ist und dass bestimmte der als inaktiv bezeichneten Regionen tatsächlich stark aktiv sind.
Unser anfänglicher Befund war, dass eine Punktmutation bei FVII, wobei die Aminosäure Glutamin in Position 100 durch Arginin ersetzt war, bei 16 norwegischen FVII-Mangel-Patienten beobachtet wurde und nahelegte, dass diese Region des FVII-Moleküls wichtig für FVII- Aktivität ist. Wir stellten zunächst fest, dass die Aminosäuresequenz 91-102 besonders aktiv war und dass diese nützlicherweise auch die Aminosäuren 103 und 104 umfasst. Danach fanden wir, dass die Aminosäuresequenz 114-127; ebenfalls in der GF-Domäne, relativ aktiv war, während die Corvas-Sequenz 103-112 nur mäßige Aktivität aufwies.
Anschließend fanden wir, dass die Aminosäuresequenz synergistisch bei der Verbesserung der inhibitorischen Wirkung der Peptide der Sequenz 91 bis 104 wirkte und dass der Hauptnutzen der von der Region 72-81 abgeleiteten Peptide in solchen synergistischen Kombinationen besteht.
Ferner wurde gefunden, dass Fragmente der obigen Sequenzen inhibitorisch wirken und dass im Allgemeinen Fragmente von 5 oder mehr Aminosäuren der obigen Sequenzen zur Inhibierung der FVII-Aktivität verwendbar sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher Peptide, umfassend die Aminosäuresequenzen der Formeln
- CVNENGGCEQYCSD- IA
- FCLPAFEGRNCE- und IB
- RCHEGYSLLADGVSCT- IC
sowie Peptidfragmente davon, insbesondere Fragmente mit 5 oder mehr Aminosäuren, Ester, Amide, Salze, cyclische Derivate davon, funktionelle Analoga davon und verlängerte Peptidketten, die an den Enden der obigen Sequenzen oder Fragmente Aminosäuren oder Peptide tragen, zur Verwendung bei der Prävention oder Inhibierung der Bildung eines funktionellen TF/FVIIa-Komplexes.
Nach einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Peptide der Sequenzen IA, IB und/oder IC wie oben definiert bereitgestellt, mit Ausnahme der Peptide
CVNENGGCEQYC IIA
CLPAFEGRNC und IIB
CHEGYSLLADGVSC IIC.
Wo es angebracht ist, werden die Verbindungen der Formel IA, IB und IC und ihre verschiedenen Derivate und Fragmente aus Gründen der Einfachheit als Peptid IA-Verbindungen, Peptid IB-Verbindungen und Peptid IC- Verbindungen bezeichnet.
Fragmente der Peptidsequenzen der Formel IA, IB und/oder IC umfassen insbesondere
- VNENG- -NGGCEQYCSD-
- ENGGC- -GGCEQYCSD-
- GGCEQ- und
- CEQYV-, worin eines der terminalen Cysteine durch Valin ersetzt ist.
Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dass Aminosäure 95 in den Peptiden der Aminosäuresequenz 91 bis 104 wichtig ist, und dass das Peptid der Sequenz 95 bis 104 der bislang aktivste getestete Inhibitor ist. Es handelt sich um NGGCEQYCSD.
Die Peptide der Formeln IIA, IIB und IIC sind nicht umfasst, da sie in der WO90/03390 der Corvas Inc. offenbart wurden, obwohl festgestellt wurde, dass sie keine inhibitorische Aktivität aufweisen. Es gibt in der WO90/03390 gar keinen Hinweis darauf, dass es von Nutzen sein könnte, irgend welche verwandte Peptide herzustellen, einschließlich Fragmente oder Extensionen davon, um sie bei der Bekämpfung von Blutgerinnungsstörungen zu verwenden.
Basierend darauf, dass die WO90/03390 fälschlicherweise keine inhibitorische Aktivität für die Peptide der Formeln IIA und IIB berichtete, betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung die therapeutische oder diagnostische Verwendung der oben definierten Verbindungen der Formeln IA und/oder IB, um Gewebefaktor zu binden und somit das Binden von Gewebefaktor an FVII zu verhindern oder zu inhibieren. Im Falle der Peptid IC-Verbindungen werden diese nur zusammen mit Peptid IA- oder Peptid IB-Verbindungen verwendet. Um der Klarheit willen wird betont, dass Verbindungen der Formeln IIA, IIB und IIC bei solcher Verwendung mit umfasst sind.
Gemäß einem weiteren Gegenstand der Erfindung werden Peptide der Formeln IA und/oder IB wie oben definiert gegebenenfalls in Kombination mit Peptiden der Formel IC wie oben definiert bereitgestellt.
Nach einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung der oben definierten Verbindungen der Formeln IA und/oder IB, gegebenenfalls zusammen mit Peptiden der Formel IC, oder Analoga oder Salze der besagten Verbindungen für die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Prävention oder Inhibierung der Bildung eines funktionellen TF/FVII(a) -Komplexes.
Wie oben gezeigt, handelt es sich bei den Peptiden der Sequenz der Formel IA um die aktivsten, aber ihre Aktivität kann synergistische verbessert werden, indem man sie zusammen mit Peptiden der Formeln IB und/oder IC und Fragmenten und anderen Derivaten davon verwendet. Bei solcher kombinierten Verwendung können die Peptide einfach zusammengemischt oder kovalent gebunden werden, beispielsweise über Disulfidbindungen zwischen den Cysteinresten oder durch Spacer- Peptide.
Ester der erfindungsgemäßen Peptide umfassen C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylester und leicht abspaltbare Estergruppen, wie jene, die im Folgenden als geschützte Carboxylgruppen aufgeführt sind.
Aminosäuren oder an den Termini der erfindungsgemäßen Peptide angebrachte Peptide können funktionelle Gruppen, wie Schutzgruppen, tragen.
Salze der erfindungsgemäßen Peptide umfassen physiologisch verträgliche Salze, wie z.B. Säureadditionssalze, wie Hydrochloride.
In den oben genannten Sequenzen wird der standardisierte Einbuchstaben-Code verwendet, um auf jede natürlich vorkommende Aminosäure zu verweisen. Dieser Code ist Standard-Fachnomenklatur und kann in jedem Standard-Biochemiebuch, wie "Biochemistry" Stryer, herausgegeben von W.H. Freeman und Co., gefunden werden.
Funktionelle Analoga solcher Peptide gehören zum Schutzbereich der vorliegenden Erfindung. Dem Fachmann ist bekannt, das bestimmte Aminosäuren funktionell äquivalent sind und es ist häufig beobachtet worden, dass der Austausch solcher äquivalenter Peptide keine Verringerung der Proteinfunktion verursacht. Außerdem kann auch eine Substitution bestimmter unkritischer Aminosäuren vorgenommen werden ohne jeglichen oder ohne bedeutenden Funktionsverlust, sogar dann wenn jene Aminosäuren durch chemisch unähnliche Aminosäuren ersetzt wurden. Ferner sind chemische Varianten der natürlich auftretenden Aminosäuren bekannt, und die Substitution durch solche Moleküle wird ebenfalls durch den Begriff "Analoga", wie hier verwendet, abgedeckt.
In der Sequenz der oben genannten Formel I kann jedes "C", das für die Aminosäure Cystein steht, durch Alanin (gekennzeichnet durch "A") ersetzt werden. Deshalb umfassen die Peptide, die von besonderem Interesse sind -ENGGA-, -GGAEQ- und AEQYV-.
Zusätzlich umfassen die von Sequenzen der Formel IA, IB und/oder IC abgeleiteten Peptide chimere Derivate, wobei sich zwei normalerweise nichtbenachbarte Teile (zwei oder mehr Aminosäuren umfassend) der Sequenz der Formel I nebeneinander befinden. Ein Beispiel für eine solche chimere Sequenz ist -EQYVNE-.
Gegebenenfalls können die erfindungsgemäßen Peptide cyclisch sein, mit der Maßgabe, dass deren Konformation die an TF bindende Sequenz für die Bindung zur Verfügung stellt. Cyclisierung kann durch jedes geeignete chemische Mittel erreicht werden und umfasst beispielsweise die Bildung von Disulfidbrücken zwischen zwei Cystein- Aminosäuren. Ein Beispiel für ein von Formel I abgeleitetes cyclisches Peptid ist
CVNENGGCEQYC.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein oder mehrere Peptide oder Analoga oder Salze davon umfasst, wobei die Aminosäuresequenz des besagten Peptids die Sequenz der obigen Formel IA, IB und/oder IC umfasst oder davon abgeleitet ist. Die Peptide können gemeinsam mit jedem dem Fachmann bekannten physiologisch verträglichen Exzipienten verabreicht werden. Beispiele für geeignete Exzipienten sind Wasser und Öl.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können beispielsweise in einer für orale, nasale, parenterale oder rektale Verabreichung geeigneten Form vorgelegt werden.
Der hier verwendete Begriff "pharmazeutisch" umfasst auch tiermedizinische Anwendungen der Erfindung.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in den herkömmlichen pharmakologischen Verabreichungsformen, wie Tabletten, Manteltabletten, Nasensprays, Lösungen, Emulsionen, Pulver, Kapseln oder Depotpräparaten, vorgelegt werden. Zur Herstellung dieser Formen können herkömmliche pharmazeutische Exzipienten wie auch die üblichen Herstellungsverfahren verwendet werden. Beispielsweise können Tabletten hergestellt werden, indem man den oder die aktiven Bestandteile mit bekannten Exzipienten, wie beispielsweise mit Verdünnungsmitteln, wie Calciumcarbonat, Calciumphosphat oder Lactose, zerfallsbeschleunigenden Mitteln, wie Stärkemehl oder Alginsäure, Bindemitteln, wie Stärke oder Gelatine, Gleitmittel, wie Magnesiumstearat oder Talkum, und/oder Mitteln zum Erreichen anhaltender Freisetzung, wie Carboxypolymethylen, Carboxymethylcellulose, Celluloseacetatphthalat oder Polyvinylacetat, mischt.
Die Tabletten können gewünschtenfalls aus mehreren Schichten bestehen. Manteltabletten können durch Beschichten von Kernen, die in ähnlicher Weise wie die Tabletten erhalten werden, mit üblicherweise für Tablettenbeschichtungen verwendeten Mitteln, wie Polyvinylpyrrolidon oder Schellack, Gummi Arabicum, Talkum, Titandioxid oder Zucker, hergestellt werden. Um eine Depotwirkung zu erreichen oder Unverträglichkeiten zu vermeiden, kann auch der Kern aus mehreren Schichten bestehen. Auch die Tablettenbeschichtung kann aus mehreren Schichten bestehen, um eine Depotwirkung zu erreichen, wobei in diesem Fall die obengenannten Exzipienten verwendet werden können.
Es können auch organspezifische Trägersysteme verwendet werden.
Injektionsmittel können beispielsweise auf herkömmliche Weise hergestellt werden, beispielsweise durch Zugabe von Konservierungsmitteln, wie p-Hydroxybenzoesäureester, oder Stabilisatoren, wie EDTA. Dann werden die Lösungen in Injektionsfläschchen oder Ampullen gefüllt.
In ähnlicher Weise können Nasensprays in wässriger Lösung formuliert werden und entweder mit einem Aerosol-Treibmittel in Spraybehälter gepackt werden oder mit Mitteln für manuelle Kompression versehen werden. Kapseln mit einem oder mehreren aktiven Bestandteilen können beispielsweise hergestellt werden, indem man die aktiven Bestandteile mit inerten Trägern, wie Lactose oder Sorbitol, mischt und das Gemisch in Gelatinekapseln füllt.
Geeignete Zäpfchen können beispielsweise hergestellt werden, indem man den aktiven Bestandteil oder Kombinationen aktiver Bestandteile mit den herkömmlichen für diesen Zweck vorgesehenen Trägern, wie natürliche Fette oder Polyethylenglycol oder Derivate davon, mischt.
Die Dosierungseinheiten, die die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten, enthalten bevorzugt 0,1 bis 10 mg, beispielsweise 1 bis 5 mg des Peptids der Formel (I) oder eines Salzes davon.
Wie oben angedeutet betrifft ein Aspekt der Erfindung erfindungsgemäße Peptide (einschließlich der Analoga oder Salze davon) zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Blutgerinnungsstörungen oder -problemen. Zu den Blutgerinnungsstörungen gehören Thrombose (insbesondere vaskuläre Thrombose oder Tiefvenenthrombose, akuter Mycardialinfarkt, Restenose, Wiederverschluss, Angina, cerebrovaskuläre Erkrankung, Peripherarterienverschlusserkrankung, Hyperkoagulabilität und Lungenembolie. Die erfindungsgemäßen Peptide können auch verwendet werden, um dem Auftreten von Blutgerinnungsproblemen vorzubeugen, die beispielsweise durch Verletzung der Blutgefäße während der thrombolytischen Therapie, Transplantationschirurgie, Wiederherstellung der Gefäßdurchgängigkeit etc., verursacht werden. Blutgerinnungsstörungen können durch Sepsis aufgrund der Produktion von TNF-α oder IL-1 ausgelöst werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Behandlungsverfahren für Bluterkrankungen von Säugern, bevorzugt des menschlichen oder tierischen Körpers, wobei das Verfahren umfasst, dass man dem Körper ein oder mehrere oben definierte Peptide der Formel IA, IB und/oder IC, einschließlich Verbindungen der Formeln IIA, IIB und/oder IIC, oder Analoga oder Salzen davon, verabreicht. Es werden auch prophylaktische Behandlungsverfahren bereitgestellt, wobei man einem Patienten ein erfindungsgemäßes Peptid verabreicht, um das Auftreten möglicher Blutgerinnungsprobleme, beispielsweise bei chirurgischen oder anderen invasiven Eingriffen, zu verhindern oder zu verringern. Das Peptid wird natürlich normalerweise in Form einer pharmazeutisch verträglichen Zubereitung verabreicht.
Unter einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von Peptiden, welche die Sequenz der Formel I enthalten oder davon abgeleitet sind oder Analoga oder Salze davon.
Die erfindungsgemäßen Peptide können auf jede zweckmäßige Weise synthetisiert werden. Im Allgemeinen werden die vorhandenen reaktiven Gruppen (z.B. Amino, Thiol und/oder Carboxyl) während der gesamten Synthese geschützt. Die letzte Stufe der Synthese wird daher die Deprotektion eines geschützten Derivats des erfindungsgemäßen Peptids sein.
Beim Aufbau der Peptidketten kann man prinzipiell entweder am C- Terminus oder dem N-Terminus beginnen, obwohl nur das am C-Terminus beginnende Verfahren gebräuchlich ist.
Man kann daher am C-Terminus beginnen, indem man ein geeignetes geschütztes Derivat, beispielsweise von Lysin, mit einem geeigneten geschützten Derivat von Cystein oder Cystin reagieren lässt. Das Lysinderivat weist eine freie α-Aminogruppe auf, während der andere Reaktionspartner entweder eine freie oder aktivierte Carboxylgruppe und eine geschützte Aminogruppe aufweist. Nach dem Verknüpfen kann das Zwischenprodukt zum Beispiel durch Chromatographie gereinigt und danach selektiv N-deprotektioniert werden, um die Addition eines weiteren Aminosäurerestes zu ermöglichen. Man führt diese Vorgehensweise fort, bis die erforderliche Aminosäuresequenz vollständig vorliegt.
Carbonsäure aktivierende Substituenten, welche man beispielsweise verwenden kann, umfassen symmetrische oder gemischte Anhydride oder aktivierte Ester, wie z.B. p-Nitrophenylester, 2,4,5- Trichlorphenylester, N-Hydroxybenzotriazolester (OBt) oder N- Hydroxysuccinimidylester (OSu).
Man kann die Koppelung der freien Amino- und der Carboxylgruppen beispielsweise bewirken, indem man Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) verwendet. Ein anderes Koppelungsungsmittel das beispielsweise verwendet werden kann, ist N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin.
Im Allgemeinen ist es zweckmäßig, die Verknüpfungsreaktion bei niedrigen Temperaturen durchzuführen, z.B. bei -20ºC bis Umgebungstemperatur, und zweckmäßigerweise in einem geeigneten Lösungssystem, wie Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylformamid, Methylenchlorid oder einem Gemisch dieser Lösungsmittel.
Es kann noch zweckmäßiger sein, die Synthese in einem Festphasen- Harzträger durchzuführen. Chlormethyliertes Polystyrol (vernetzt mit 1% Divinylbenzol) ist ein brauchbarer Trägertyp; in diesem Fall beginnt die Synthese am C-Terminus, beispielsweise indem man das Ngeschützte Lysin an den Träger knüpft.
Einige geeignete Festphasenverfahren werden von Eric Atherton, Christopher J. Logan und Robert C. Sheppard, J. Chem. Soc. Perkin I, 538-46 (1981); James P. Tam, Foe S. Tjoeng und R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 102, 6117-27 (1980); James P. Tam, Richard D. Dimarchi und R. B. Merifield, Int. J. Peptide Protein Res. 16. 412-25 (1980); Manfred Mutter und Dieter Bellof, Helvetica Chimica Acta 67, 2009-16 (1984) beschrieben.
Eine breite Auswahl von Aminosäureschutzgruppen ist bekannt und wird erläutert in Schröder, E. und Lübke, K., The Peptides, Bde. 1 und 2, Academic Press, New York und London, 1965 und 1966; Pettit, G. R., Synthetic Peptides, Bde. 1-4, Van Nostrand, Reinhold, New York, 1970, 1971, 1975 und 1976; Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Synthese von Peptiden, Band 15, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974; Amino Acids, Peptides and Proteins, Bde. 4-8, The Chemical Society, London 1972, 1974, 1975 und 1976; Peptides, Synthesis-physical data 1- 6, Wolfgang Voelter, Eric Schmidt-Siegman, Georg Thieme Verlag Stuttgart, NY, 1983; The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology 1-7, Hrsg. Erhard Gross, Johannes Meienhofer, Academic Press, NY, San Francisco, London; solid Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl., John M. Stewart, Janis D. Young, Pierce Chemical Company.
Deshalb umfassen zum Beispiel die verwendbaren Aminschutzgruppen Schutzgruppen wie Carbobenzoxy (im Folgenden auch mit Z bezeichnet), t-Butoxycarbonyl (im folgenden auch mit Boc bezeichnet), 4-Methoxy- 2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl (Mtr) und 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (im folgenden auch als Fmoc bezeichnet). Es wird bekannt sein, dass sofern das Peptid vom C-terminalen Ende aufgebaut wird, eine Aminschutzgruppe an der α-Aminogruppe jedes neu angefügten Restes vorliegt, die vor dem nächsten Koppelungsschritt selektiv entfernt werden muss. Eine besonders brauchbare Gruppe für solchen temporären Aminschutz ist die Fmoc- Gruppe, die selektiv durch Behandlung mit Piperidin in einem organischen Lösungsmittel entfernt werden kann.
Verwendbare Carboxylschutzgruppen umfassen beispielsweise leicht abspaltbare Estergruppen, wie Benzyl- (Bzl), p-Nitrobenzyl- (ONb), Pentachlorphenyl- (OPClP), Pentafluorphenyl- (OPFP) oder t-Butyl- (OtBu) Gruppen sowie die Verknüpfungsgruppen auf festen Trägern, z.B. an Polystyrol gebundene Methylgruppen.
Thiolschutzgruppen umfassen p-Methoxybenzyl (Mob), Trityl (Trt) und Acetamidomethyl (Acm).
Es ist bekannt, dass zahlreiche andere solche Gruppen existieren, wie beispielsweise in den obengenannten Literaturstellen dargestellt ist, und die Verwendung aller dieser Gruppen in den zuvor beschriebenen Verfahren fällt in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung.
Es gibt eine Vielzahl von Verfahren zur Entfernung der Amin- und Carboxylschutzgruppen. Diese müssen jedoch in Einklang mit der verwendeten Synthesestrategie sein. Die Seitenkettenschutzgruppen müssen unter den Bedingungen, die zum Entfernen der temporären α- Aminoschutzgruppen vor dem nächsten Verknüpfungsschritt verwendet werden, stabil sein.
Aminschutzgruppen, wie Boc, und Carboxylschutzgruppen, wie tBu, können gleichzeitig mittels Säurebehandlung entfernt werden, z.B. mit Trifluoressigsäure. Thiolschutzgruppen wie Trt können selektiv entfernt werden, indem man ein Oxidationsmittel, wie Iod, verwendet.
Die folgenden Beispiele dienen nur der Veranschaulichung.
Fig. 1 zeigt die Inhibierung von Blutgerinnung durch verschiedene FVII-Peptide und FVII-Peptidanaloga.
Fig. 2 zeigt die Dosis-Response-Beziehung zwischen FVII/TF- Aktivität und dem Peptid FVII-5.
Fig. 3 zeigt die Dosis-Response-Beziehung zwischen FVII/TFaktivität und dem Peptid FVII-5d.
Fig. 4 zeigt die Inhibierung der Factor X-Aktivierung bei unterschiedlichen Konzentrationen von FVII-5.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden nichteinschränkenden Beispiele weiter veranschaulicht.
In den Beispielen werden folgende Abkürzungen verwendet:
TFA: Trifluoressigsäure
BocAA: t-Butoxycarbonyl-geschützte Aminosäure
BOP: Benzotriazol-1-yloxy-tris-(dimethylamino)-phosphonhexafluorphosphat
HOBT: N-Hydroxybenzotriazol
DIEA: Diisopropylethylamin
DCM: Dichlormethan
NEM: N-Ethylmaleimid
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
DMF: Dimethylformamid

BEISPIEL 1

Allgemeine Peptidsynthese

Die verwendeten Peptide wurden mittels Standardverfahren der Festphasenchemie synthetisiert und mittels präparativer HPLC gereinigt. Die Reinheit der Peptide wurde mittels analytischer HPLC, Aminosäureanalyse und Massenspektrometrie überprüft. Es handelte sich bei allen um Produkte der Neosystems Laboratoire (Strasbourg, France).
Die Peptide wurden unter Verwendung des folgenden allgemeinen Verfahrens zusammengebaut und gespalten. Beim verwendeten Harz handelte es sich um 4-Methylbenzhydrylamin (Charge R2161) mit einer Anfangsladung von 0,9 meq/g. Für jedes Peptid verwendete man 450 mg des Ausgangsharzes (0,4 mmol)

1. Zusammenbau

Nach der Neutralisierung verwendete man das unten beschriebene Koppelungs-/Deprotektionierungs-Protokoll (Volumen: 10 ml für jedes Lösungsmittel).
a) reine TFA 1 Min.
b) reine TFA 3 Min.
c) Methylenchlorid-Spülung
d) Isopropanol 0,5 Min.
e) Dimethylformamid (DMF) 0,5 Min. (dreimal)
f) Dimethylformamid-Spülung

Koppelung

Man löste 5 Äquvalente BocAA, BOP und HOBT in 5 ml DMF und gab sie zu dem Harz. Nachdem eine Bläschenbildung einsetzte, gab man 0,5 ml Diisopropylethylamin zu und bewegte weitere 13 Minuten. Nach 2 DMF- Waschungen führte man eine Doppelkoppelung unter denselben Bedingungen durch.

Acetylierung

Nach dem letzten Deprotektionierungsschritt führte man die Acetylierung durch, indem man 10 Äquivalente Essigsäureanhydrid und 10 Äquivalente DIEA in 10 ml DMF verwendete.
Umsetzungsdauer: 10 Minuten.
Nach dem Zusammenbau wusch man das Peptidharz mit DMF und DCM- Ether und trocknete danach unter Stickstoffstrom.

2. Spaltung

Man trennte das Peptid 45 Minuten bei 0ºC vom Harz und deprotektionierte durch Behandlung mit HF/Anisol (Volumenverhältnis 9/1. 10 ml pro Gramm Peptidharz).
Nach dem Verdampfen von HF und nach Fällung mit Abscheiden wurde das Rohpeptid in reiner TFA solubilisiert und filtriert.
Danach verdampfte man die TFA unter vermindertem Druck und fällte das Peptid erneut mit Ether aus. Nach diesem Schritt konnte man das Peptid reinigen.

3. Reinigung und Analyse

Man reinigte jedes Peptid mittels HPLC an einer Umkehrphasen-C&sub1;&sub8;- Säule (15-25 um) unter Verwendung eines linearen Gradienten von Acetonitril/Wasser (0,1% TFA). Fraktionen mit einer Reinheit von > 95% wurden gesammelt und gefriergetrocknet. Dann analysierte man das gereinigte Peptid mittels HPLC und hydrolysierte eine Probe für die Aminosäureanalyse. Die Ergebnisse wurden auf dem Analysendatenblatt notiert, welches für jedes Peptid ausgestellt wurde.
Die grundsätzliche Vorgehensweise bei der Reinigung war immer dieselbe. Nur der für die präparative Reinigung verwendete Gradient unterschied sich abhängig von der anfänglichen Retentionszeit jedes einzelnen Peptids.
Das nach der oben beschriebenen Prozedur erhältliche Peptid trägt eine Acetylgruppe am N-Terminus und eine CONH&sub2;-Gruppe am C-Terminus.

Beispiel 2

Peptid FVII-5

Bei dem verwendeten Harz handelte es sich um Boc-Cys(4-MeBzl)- PAM-Harz (Charge 52172) mit einer Anfangsladung von 0,63 meq/g. Man verwendete 0,96 g des Ausgangsharzes (0,6 mmol).
Bei Zusammenbau, Koppelung und Abtrennung ging man wie oben beschrieben vor, mit den folgenden Modifikationen:

1. Zusammenbau

a) TFA 55% in DCM 5 Minuten
b) TFA 55% in DCM 25 Minuten

2. Spaltung

Nach dem Abscheiden mit Ether wusch man das Peptidharz mit 30 ml 10%iger Essigsäure in Wasser und lyophilisierte es. Das aus dieser Abtrennung erhältliche Peptid weist eine C-terminale COOH-Gruppe und eine N-terminale NH&sub2;-Gruppe auf.

3. Reinigung- Cyclisierung

Lösungsmittelzusammensetzung:
A: Wasser und 0,1% TFA
B: Acetonitril/Lösungsmittel A (Volumenverhältnis 60/40).
Das Rohprodukt wurde mittels Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines linearen Gradienten von Acetonitril/Wasser (0,1% TFA), 10 bis 80% von B, 30 Minuten vorgereinigt.
Man sammelte alle Fraktionen, die das unverzweigte Peptid in einer Reinheit > 80 enthielten, und stellte das Volumen mit Wasser auf 0,5 Liter ein. Man stellte den pH-Wert der Lösung mit DIEA auf 8,5 ein und ließ sie über Nacht bei Umgebungstemperatur unter Magnetrühren stehen. Man beobachtete die Entwicklung der Cyclisierungsreaktion durch Koinjektion einer Probe des Reaktionsgemisches mit N- Ethylmaleimid (NEM)
Nach 24 Stunden war die Cyclisierung abgeschlossen. Man setzte danach den pH-Wert mit Essigsäure auf 2,5 herab und engte die Lösung vor dem Gefriertrocknen unter verringertem Druck ein.
Man reinigte danach das cyclische Peptid mittels RP-HFLC auf 95% (linearer Gradient von 5 bis 30% von B in 30 Minuten).
Danach kontrollierte man Reinheit und Identität des Endprodukts durch analytische HPLC, Aminosäureanalyse und Massenspektrometrie.

Beispiel 3

Peptid FVII-1

Man synthetisierte dieses Peptid, indem man die Fmoc/t-But- Strategie verwendete und von 90 mg Fmoc-Ala-Wang-Harz (0,67 meq/g) ausging.

1. Zusammenbau

Man verwendete das folgende Protokoll für Deprotektion/Koppelung:
a) Piperidin 25% in DMF 2 Minuten
b) DMF-Spülung
c) Piperidin 25% in DMF 4 Minuten
d) DMF-Spülung
e) Piperidin 25% in DMF 6 Minuten
f) DMF-Spülung fünffache Wiederholung

2. Koppelung

Man löste 5 Äquivalenten Fmoc-AA, BOP und HOBT in 3 ml DMF und gab dies zum Harz. Nach Beginn der Bläschenbildung gab man 0,13 ml DIEA zu und setzte die Koppelung 13 Minuten fort. Nach 2 DMF- Waschungen führte man eine Doppelkoppelung wie oben beschrieben durch.

3. Spaltung

Man erreichte die Spaltung des Peptids und die Deprotektion durch 2,5-stündiges Umsetzen mit 5 ml eines Gemisches aus TFA (83,3%), Wasser (4,2%), Thioanisol (4,2%), Ethandithiol (2,1%) und Phenol (6,25 %). Nach dem Filtrieren goß man das Gemisch in 25 ml kalten Ether. Man zentrifugierte das abgeschiedene Peptid und wusch zweimal mit Ether. Dann löste man das Produkt in Wasser, lyophilisierte und verwendete es ohne weitere Reinigung weiter.

Beispiel 4

Sofern nicht anders angegeben stellte man andere synthetische Peptide analog zu dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren her. Man stellte cyclische Verbindungen nach dem Verfahren gemäß Beispiel 2 her.
In Tabelle 1 sind alle synthetisierten Peptide aufgelistet. Tabelle 1 - Faktor-VII-Petide

Beispiel 5

Test der FVIIa/TF-Aktivität

Man präinkubierte Peptide 30 Minuten bei 22ºC (0-1 mM) in 0,1 M Tris. HCl (pH 7,2) mit Gewebefaktor (Thromborel®, Behringwerke, Marburg, Deutschland; 0,2% Endkonzentration), gab danach Faktor X (American Diagnostica Inc., Greenwich, CT, USA; 70 nM) zu und danach FVIIa (Diagnostica Stago, Asnieres, Frankreich; 8 pM) und CaCl&sub2; (5 mM). Man setzte die Inkubationen 30 Minuten fort und quenchte mit EDTA (50 mM), wodurch essentielle Ca²&spplus;-Ionen entfernt werden. Man quantifizierte das hergestellte FXa, indem man die Hydrolyse des chromogenen FX-Substrats S-2222 (Chromogenix, Mölndal, Schweden) beobachtete.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel 6

Man untersuchte die Wirkung unterschiedlicher Konzentrationen des Peptids FVII-5, indem man das in Beispiel 5 beschriebene Testverfahren verwendete. Man wiederholte das Experiment unter Verwendung des Peptids FVII-5D.
Die Ergebnisse sind in den Fig. 2 bzw. 3 dargestellt.

Beispiel 7

Man untersuchte die Kinetik der Inhibition der FX-Aktivierung durch FVII-5. Man inkubierte verschiedene Konzentrationen von FVII-5 mit verschiedenen Konzentrationen von Faktor X in Anwesenheit oder Abwesenheit von TF und FVIIa.
Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Beide Darstellungen basieren auf denselben Werten und beide deuten auf eine nichtkompetitive Inhibition der Faktor X-Aktivierung durch FVII-5 hin und dadurch darauf, dass die Inhibition in einer früheren Stufe als der Faktor X- Bindung stattfindet, d.h. die Inhibition findet bei der FVIIa/TF- Komplexbildung statt.

Beispiel 8

Test der katalytischen Aktivität von apoTF/FVIIa

Man verwendete diesen colorimetrischen Test, um direkt die amidolytische (katalytische) Aktivität von gereinigtem humanem FVIIa zu messen, wenn FVIIa an rekombinanten humanen TF in Abwesenheit von Phospholipid gebunden wird.

Protokoll

Man führte die Umsetzungen in Mikrotiterplattenvertiefungen durch, indem man ein Endinkubationsvolumen von 200 ul verwendete. Man präinkubierte 30 Minuten bei Umgebungstemperatur in Wasser gelöste Testverbindungen (Endkonzentration, 0-1 mM) mit rekombinantem menschlichen Gewebefaktor (American Diagnostica, Katalog-Nr. 4500; 5 nM) und CaCl&sub2; (5 mM) in Tris-Puffer (100 mM), pH 7,2, die NaCl (150 mM) und BSA (1 mg/ml) enthielt. Man gab Faktor VIIa (Enzyme Research Laboratories, Katalog-Nr. HFVIIa; 5 nM) zu und setzte die Inkubationen 60 Minuten fort. Dann gab man chromogenes Substrat, S2288 (Chromogenix, Katalog- Nr. 820852; 0,5 mM) zu und maß die enzymatische Aktivität des Gewebefaktor-Apoproteins/Faktor VII-Komplexes (apoTF/FVIIa) bei 405 nm.

Beispiel 9

Test der durch HT1080-Zelloberflächen-TF/FVIIa vermittelten Aktivierung von FX

Man verwendete dieses Testsystem, um die katalytische Aktivität des nativen TF/FVIIa-Komplexes an der Oberfläche lebender in ihrer Zellmembran TF exprimierender Zellen zu messen. Man maß die Aktivität als amidolytische (katalystische) Aktivität von FXa, produziert durch die Einwirkung von Zelloberflächen-TF/FVIIa auf zugesetzten FX. Bei der für diesen Test ausgewählten Zelllinie handelte es sich um Fibrosarkom HT-1080 des Menschen (American Type Culture Collection CCL 121).

Protokoll

Man suspendierte HT-1080-Zellen in einem kleinen Volumen Serum enthaltenden Mediums und vermischte mit Mikroträgern (Cytodex-3, Pharmacia) in einem Verhältnis von etwa 50 bis 100 Zellen/Mikroträger. Die Zellen hafteten gewöhnlich innerhalb von 2 Stunden an den Mikroträgern und konnten danach in gewöhnliche Zylinderflaschen mit einem größeren Volumen an Kulturmedium transferiert werden. Danach wusch man die Mikroträger-Zellzubereitungen zweimal in calciumfreiem Puffer, um gebundene Serumfaktoren zu entfernen. Von neun verschiedenen getesteten Wasch-Puffern erwies sich Hanks gepufferte Kochsalzlösung als am besten geeignet unter Berücksichtigung von i) geringem Übertrag von Serumfaktoren, ii) geringer Auswirkung auf die Zellhaftung an Mikroträgerkugeln, iii) geringem Schaden an Zellmembranen und iv) hoher Zelloberflächen-TF-Aktivität. Man suspendierte die Mikroträgerkugeln erneut in Hanks Puffer und zählte die Kugeln.
Danach gab man FVII (Enzyme Research Laboratories, Katalog-Nr. HVII 1007; 5 pM) (und Inhibitor in Inhibitionstests) zu, ließ dem Gemisch 30 Minuten vor der Zugabe von FX (Enzyme Research Laboratories, Katalog-Nr. HFX 1010; 50 nM) und CaCl&sub2; (5 mM) zur Gleichgewichtseinstellung. Man bestimmte die Rate der FX-Bildung durch einen amidolytischen Test, indem man chromogenes Substrat S2765 für FXa (Chromogenix Katalog-Nr. 821413) verwendete und die Extinktionszunahme bei 405 nm maß. Man stellte die TF-Aktivität einfach durch Verdünnung der Mikroträger-Suspension ein. Die Schwankung konnte bei Entnahme der Aliquots durch Rühren der Suspension auf einem Minimum gehalten werden. Die Schwankung wurde mit 14±7% bestimmt.
Dass die FX-Aktivierung durch die Zellen wirklich vom Zelloberflächen-TF abhing, konnte unter Verwendung eines neutralisierenden monoklonalen Antikörpers gegen humanen TF, wie in Fig. 5 dargestellt, gezeigt werden. Titrieren des zellgebundenen TF mit FVII zeigte etwa 11000 TF-Moleküle pro Zelle oder 0,8 ng/106 Zellen. Die FX-Aktivierung war auch abhängig von der Inkubationsdauer und der Zugabe von FVII (Fig. 6 & 7). Dass die gemessene Aktivität für FXa stand, verifizierte man durch Inhibition der Aktivität mit TAP (Zecken- Antikoagulanspolypeptid; G. Vlasuk, Corvas Int.) (Fig. 8).

Legende zu den Figuren

Fig. 5 Inhibierung der zellvermittelten Aktivierung von Faktor X durch einen neutralisierenden monoklonalen Gewebefaktor- Antikörper (American Diagnostica #4504). HT-1080-Zellen und Antikörper wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur vor der Zugabe von Faktor VII (5 pM) und Faktor X (56 nM) inkubiert. Die Umsetzungen wurden 2 Stunden fortgesetzt und durch Zugabe von EDTA abgestoppt. Faktor Xa-Bildung wurde durch einen amidolytischen Test unter Verwendung eines chromogenen Faktor Xa-Substrats (Chromogenix, 52765) kontrolliert. Die Inhibition erreichte > 95%, was auf eine vollständige Abhängigkeit vom Gewebefaktor hindeutete.
Fig. 6 Zeitverlauf für Faktor X-Aktivierung unter Verwendung von 0 ( ) und 1 nM ( ) Faktor VII.
Fig. 7 Abhängigkeit von zellvermittelter Faktor X-Aktivierung bei Zugabe von Faktor VII. Mittelwert aus dreifacher Bestimmung. Die testinterne Abweichung betrug 12±14%.
Fig. 8 Inhibierung von durch HT-1080-Zelloberflächen-TF/FVIIa erzeugte amidolytische Fxa-Aktivität durch TAP (Zecken- Antikoagulans-Polypeptid).

Beispiel 10

Test der Zelloberflächen-TF-initiierten Koagulation von Plasma

Es wurde ein neuartiges Testsystem entworfen, um die durch Gewebefaktor (TF) an der Oberfläche lebender Zellen exprimierte induzierte Koagulation des Blutplasmas (d.h. die Gerinnungszeit) zu messen. Bei diesem Test werden menschliche oder tierische Zellen verwendet, die an der Oberfläche von Mikroträgern haften (siehe Fig. 9), wodurch eine reproduzierbare Darstellung bekannter Mengen TF-Aktivität in den gerührten Messvertiefungen eines elektromagnetischen Koagulometers möglich wird. Bei den verwendeten Zellen kann es sich um normale oder transformierte handeln und sie können Phänotypen, wie Monozyten, Endothelzellen, Fibroblasten etc., darstellen (siehe Fig. 10).
Dieser neuartige Test ist insbesondere entwickelt und beschrieben worden, um vor allem bei der Bestimmung der Wirkung synthetischer Pep tide und peptidomimetischer Verbindungen auf dem extrinsischen Koagulationspfad verwendbar zu sein, indem man lebende Zellen in einem Plasmamilieu verwendet. Ergebnisse für die inhibitorische Wirkung synthetischer Peptide, die auf der Aminosäuresequenz von menschlichem FVII basieren, sind offenbart.

Protokoll

Man stellt das Mikroträger-Zellpräparat folgendermaßen her: Man suspendiert aus Primärisolaten oder Subkulturen transformierter Linien erhältliche Zellen (siehe Fig. 10) in einem geringen Volumen Serum enthaltenden Mediums und mischt sie mit Mikroträgern (Cytodex-3, Pharmacia) in einem Verhältnis von etwa 50 bis 100 Zellen/Mikroträger. Die Zellen haften gewöhnlich innerhalb 2 Stunden an den Mikroträgern und können anschließend in gewöhnliche Zylinderflaschen mit einem größeren Volumen Kulturmedium transferiert werden. Eine gleichmäßige Belegung der Mikroträger mit etwa 20 bis 60 Zellen kann direkt mit transformierten Zellen erreicht werden, wenn eine große Zellzahl zur Verfügung steht, oder nach 2 Tagen Wachstum, wenn Primärkulturen (z.B. Nabelvenen-Endothelzellen) verwendet werden. Primärzellkulturen, die TF nicht exprimieren (z.B. Monozyten oder Endothelzellen) können angeregt werden, so dass sie TF exprimieren, indem man anhaftende Zellen mit Agenzien, wie bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS) oder Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α), inkubiert (siehe Fig. 10)
Um die extrinsische Koagulationsaktivität zu bestimmen, wäscht man die Mikroträger-Zellpräparate zunächst mit einem calciumfreien Puffer, um die gebundenen Serumfaktoren zu entfernen. Danach gibt man einen Calcium enthaltenden Puffer und Plasma zu und bestimmt automatisch die Gerinnungszeit in einem elektromagnetischen Koagulometer. Die Gerinnungszeit kann sehr zweckmäßig eingestellt werden (z.B. 35 Sekunden), indem man die Mikroträgersuspension einfach verdünnt, und Reproduzierbarkeit erreicht man leicht unter der Voraussetzung dass die Suspension gerührt wird, wenn die Aliquots entnommen werden. Die Gerinnungszeit kann durch eine log-log-Eichkurve, die mit Kaninchenhirn-Thromboplastin erzeugt wird, in arbiträre TF-Einheiten umgewandelt werden.
Durch Verwendung eines Panels immunreduzierter menschlicher Plasmen, die bezüglich aller Koagulationsfaktoren Defizite aufweisen, zeigt sich, dass das so erhaltene System genau den extrinischen Pfad der Koagulation wiedergibt. Beispielsweise ist die durch ECV304- Endothelzellen des Menschen (American Culture Collection CRL-1998) vermittelte Koagulation deutlich abhängig von FVII und FX (Fig. 11). Daher gibt es keine direkte FX-Aktivierung; die Koagulation ist durch Zelloberflächen-TF/FVII vermittelt. Es wurde gezeigt, dass die Prokoagulans-Aktivität wirklich TF-vermittelte Koagulation wiedergibt, indem man einen für menschlichen TF neutralisierenden monoklonalen Antikörper verwendete, der jegliche Koagulationsaktivität unterband (Fig. 12).

Legende zu den Figuren

Fig. 9 Prinzip der Mikroträgertests von zelloberflächenvermittelter Koagulation von Blutplasma. Lebende Zellen (z.B. menschliche HT-1080-Fibrosarcomzellen; ATCC CRL 121), die an der Oberfläche eines Mikroträgers haften, werden in der Inkubationsvertiefung eines elektromagnetischen ThrombotrackTM-Koagulators (Nycomed) mit einem Calcium enthaltenden Puffer und Plasma gemischt. Die Gerinnungszeit wird über die Zunahme des durch die Bildung von Fibrinfasern entstehenden Widerstands gegenüber der Bewegung einer magnetischen Kugel bestimmt. Im unteren Nebenbild sind die an Cytodex-3-Mikroträger haftenden HT-1080-zellen als Beispiel für verwendbare TF exprimierende Zelltypen dargestellt.
Fig. 10 Koagulans-Aktivität einer Auswahl an Mikroträgern haftender Zelltypen. Die Aktivität ist ausgedrückt als TF-Einheiten pro 10&sup5; Zellen und berechnet nach einer Eichkurve, die mit Kaninchenhirn-Thromboplastin (Nycomed) erzeugt wurde. Bei den dargestellten Zelltypen handelt es sich um RD, menschliche Rhabdomyosarkom-Zellen (ATCC CCL 136); HT-1080, menschliche Fibrosarkom-Zellen (ATCC CRL 121); HE US, unangeregte Primärkultur menschlicher Nabelvenen-Endothelzellen; HE ST, menschliche Nabelvenen-Endotheliumzellen nach der Anregung mit bakteriellem Lipopolysaccharid (1 ug/ml; 5 Stunden); ECV-304, menschliche Endothelzellen (ATCC CRL 1998); HM US, unangeregte menschliche periphere Monozyten; und HM ST, menschliche periphere Monozyten nach der Anregung mit bakteriellem Lipopolysaccharid (0,5 ug/ml; 2 Stunden).
Fig. 11 Abhängigkeit der ECV-304-vermittelten Koagulation bei spezifischen Koagulationsfaktoren, gezeigt anhand der Verwendung immunoreduzierter menschlicher Plasmen (American Diagnostica) im Mikroträger-Test. Zu beachten ist die vollständige Abhängigkeit von Faktoren VII und X.
Fig. 12 Charakterisierung der Koagulans-Aktivität an ECV-304-Zellen im Mikroträger-Test unter Verwendung eines für menschlichen TF neutralisierenden monoklonalen Antikörpers (American Diagnostica Katalog-Nr. 4504). Durch den neutralisierenden Antikörper kann fast jegliche Gerinnungsaktivität unterbunden werden, was zeigt, dass diese äußerst abhängig von der TF-Funktion ist.

Beispiel 11

Test der TF/FVII-Inhibition durch FVII-Peptide

ELISA-Test

Die in Fig. 13 dargestellten Inhibitionsergebnisse deuten darauf hin, dass es zusätzlich zu den Sequenzen aus der "Hinge"-Region (d.h. den Resten 41-48 zwischen der GLA-Domäne und der ersten EGF-Domäne University of Texas) und aus der ersten EGF-Domäne selbst (d.h. den Resten 50-61; Clarke et al.) weitere Sequenzen in der zweiten EGF- Domäne gibt, die Inhibitoren sind, wenn sie als Peptide in diesem Bindungstest eingeführt werden.

Legende zur Figur

Fig. 13 ELISA-Test der Inhibition der FVII-Bindung an immobilisierten rTF, der durch synthetische FVII-Peptide (alle bei 0,5 mM) hergestellt wurde. Bezüglich der Peptidsequenzen wird auf die obige Peptid-Tabelle (Seite 17) verwiesen. C und L bezeichnen die cyclischen bzw. geradkettigen Peptidformen mit terminalen Cysteinen.
Die Ergebnisse der oben genannten Peptid-Inhibitionsexperimente sind unten tabellarisch zusammengefasst: Zusammenfassung der Peptid-Inhibierungsergebnisse FVII-Peptid IC&sub5;&sub0; (mM) oder % Inhibierung bei 0,5 mMa
a) Die prozentuale Inhibition bei 0,5 mM ist für die Peptide angegeben, die nicht quantitative oder nähernd-quantitative Inhibition bei der höchsten Testkonzentration (1 mM) erreichten.
b) Die angegebenen Sequenznummern beziehen sich auf die natürliche Sequenz von menschlichem FVII. C und L beziehen sich auf die Disulfid-cyclisierten bzw. geradkettigen Formen.
C) 91-102 (anal) weist in Position 100 einen Argininrest anstelle von Glutamin auf.

Beispiel 12

Nachweis der Spezifität von Peptid-Inhibitoren

Die Wirkung der in den Koagulationstests untersuchten Peptide könnte scheinbar auch aufgrund von Wirkungen einer oder mehrerer anderer der verschiedenen an der Koagulationskaskade beteiligten Komponenten verursacht sein. Deshalb testete man diese Möglichkeit, indem man die Peptide zu Koagulationstests gab, die man durch Kontaktaktivierung (CephotestTM, Nycomed) initiierte, und damit Koagulationsfaktoren des intrinsischen und des allgemeinen Pfades der Koagulation, d.h. alle Koagulationsfaktoren außer TF/FVII, mit einbezog. Die Peptide 91-102 und 103-111 waren in diesem System inaktiv, während die Kontrollinhibitoren von FX (TAP) und Thrombin (Hirudin; HIR) stark inhibitorisch wirkten (siehe Fig. 21, unten). Daher erhielt man Beweise dafür, dass die im obigen TF/FVII-initiierten Koagulationstest beobachteten Wirkungen tatsächlich auf einer direkten Wirkung auf den TF/FVII-Komplex beruhten.

Claims

1. Peptidverbindungen, nämlich

- CVNENGGCEQYCSD- IA

- FCLPAFEGRNCE- und IB

- RCHEGYSLLADGVSCT- IC

sowie Peptidfragmente, Ester, Amide, Salze, cyclische Derivate und funktionelle Analoga davon zur Verwendung bei der Prävention und Inhibierung der Bildung eines funktionellen TF/FVIIa- Komplexes.

2. Peptidverbindungen, nämlich

- CVNENGGCEQYCSD- IA

- FCLPAFEGRNCE- und IB

- RCHEGYSLLADGVSCT- IC

sowie Peptidfragmente, Ester, Amide, Salze, cyclische Derivate und funktionelle Analoga davon, mit Ausnahme der Peptide

CVNENGGCEQYC IIA

CLPAFEGRNC und IIB

CHEGYSLLADGVSC IIC.

3. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, umfassend 5 oder mehr Aminosäuren.

4. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich um - VNENG-, -ENGGC-, -GGCEQ-, -CEQYV-, NGGCEQYCSD- oder -GGCEQYCSD- handelt.

5. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich um - ENGGA-, -GGAEQ- oder -AEQYV- handelt.

6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich um -EQYVNE- handelt.

7. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich um cyclische Derivate davon handelt.

8. Verwendung der Verbindungen der Formeln IA und/oder IB gemäß Anspruch 1, gegebenenfalls zusammen mit Verbindungen der Formel IC oder Analoga oder Salzen dieser Verbindungen, zur Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen zur Prävention oder Inhibierung der Bildung eines funktionellen TF/FVIIa-Komplexes.

9. Verbindungen der Formeln. IA und/oder IB, gegebenenfalls zusammen mit Verbindungen der Formel IC oder Analoga oder Salzen dieser Verbindungen, zur Verwendung bei der Prävention oder Inhibierung der Bildung eines funktionellen TF/FVIIa-Komplexes.

10. Verbindungen nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Verbindungen der Formeln IA, IB und IC oder Analoga davon 5 oder mehr Aminosäuren umfassen.

11. Pharmazeutische Zubereitungen, umfassend ein oder mehrere Peptide der Formel IA, IB und/oder IC gemäß Anspruch 1 oder Analoga oder Salze davon, zusammen mit einem physiologisch verträglichen Exzipienten.

12. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel IA, IB und/oder IC gemäß Anspruch 1, umfassend die Deprotektion eines geschützten Derivates einer Verbindung der Formel IA, IB und/oder IC.