DE69403961T3

DE69403961T3 - Verfahren zur bestimmung der von blutplättchen abstammenden mikrovesikel

Info

Publication number: DE69403961T3
Application number: DE69403961T
Authority: DE
Inventors: Frank Brosstad; Geir Gogstad; Pal Holme; Nils Solum
Original assignee: Individual
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Priority date: 1993-03-24
Filing date: 1994-03-23
Publication date: 2003-01-16
Anticipated expiration: 2014-03-24
Also published as: DE69403961T2; EP0694168B2; FI954499A0; FI954499L; EP0694168A1; ES2103582T3; WO1994022018A1; NO953770L; DK0694168T4; JPH08509806A; AU691489B2; JP3422491B2; US5811250A; DK0694168T3; GB9306053D0; CA2158363A1; ES2103582T5; FI113206B; DE69403961D1; ATE154847T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis und/oder die Messung von Mikrovesikeln, die von Blutplättchen abgeleitet sind, in einer flüssigen Probe, wie Plasma, und die Verwendung dieser Messung zur Diagnose hämostattscher Störungen.
Blutplättchen sind eine normale Komponente des Bluts und nehmen bekanntlich aktiv an hämostatischen Prozessen teil. Durch ihre Wechselwirkung mit dem Subendothel von beschädigten Blutgefäßen beispielsweise können sich die Plättchen aggregieren, wodurch sich ein primäres hämostatisches Gerinnsel bildet. Diesas Verfahren ist üblicherweise von der Bildung verschiedener Faktoren, die an der Hämostase durch die Blutplättchen beteiligt sind, begleitet.
Die Aktivierung der Blutplättchen verstärkt stark ihre Katalyse von hämostatischen Reaktionen, und aktivierte Blutplättchen zeigen insbesondere eine erhöhte Konzentration und Aktivität an Faktor Va. (Der Faktor Va ist eine Komponente des sog. Prothrombinasekomplexes, der Thrombin aus seinem Vorläufer Prothrombin bildet.) Zusätzlich wurde gefunden, daß die Blutplättchen Mikrovesikel (auch Mikroteilchen genannt) aus ihrer Plasmamembran nach Aktivierung abschnüren. Dieses Phänomen wurde zuerst von Sandberg et al. (Biochem. J. 203 : 303-311 (1982)) beschrieben.
Nach weiterer Forschung wird nun angenommen, daß die Plättchenmikrovesikel durch Abschnüren oder knospenförmiges Abgeben der Plasmamembran gebildet werden. Die Mikrovesikel enthalten die Plättchenglycoproteine Ib, lib und lila und die Cytoskelettproteine Filamin, Talin und Myosin. Die gebildeten Mikrovesikel besitzen einen Durchmesser von 50 bis 800 nm.
Sowohl die Mikrovesikel als auch die Plättchen können hämostatische Reaktionen katalysieren und zeigen jeweils sowohl prokoagulierende als auch antikoagulierende Aktivitäten. Während postuliert wurde, daß die Bildung von Mikrovesikeln mit der Produktion des Prothrombinasekomplexes verbunden ist (vgl. Sims et al., J. Biol. Chem. 264 : 17049- 17057 (1989)), wurde jedoch nicht gezeigt, daß irgendeine spezifische Aktivität entweder auf die von dem Plättchen abgeleiteten Mikrovesikel oder auf die Plättchen selbst beschränkt ist.
Die Aktivierung der Plättchen und die Bildung der Mikrovesikel kann durch eine Reihe verschiedener Faktoren induziert werden, beispielsweise durch Thrombin, Collagen, Ionophore, Calpain und Komplementproteinkomplexe, z. B. C5b- 9. Schwache Aktivatoren der Plättchen, beispielsweise ADP, Epinephrin und der plättchenaktivierende Faktor verursachen nur eine geringgeradige Mikrovesikelbildung. Eine erhöhte Konzentration an Mikrovesikeln wurde nach Lagerung von Plättchenkonzentraten (Bode et al., Blood 77 : 887-895 (1991); Solberg et al., Throm. Res. 48 : 559-565 (1987)) nachgewiesen. Zusätzlich wurde auch gezeigt, daß das Rühren von Proben, die durch Collagen und/oder Thrombin aktivierte Plättchen umfassen, die Mikrovesikelbildung verstärkt.
Die Bildung einer Hämostase als Ursache oder Folge der Entwicklung einer vaskulären Erkrankung oder vaskulärer Störungen ist weithin anerkannt, und mehrere hämostatische Faktoren wurden auf ihre Eignung als Marker für solche Erkrankungen und Störungen untersucht. So können Prothrombinzeittests, umfassend Thromboplastin- oder partielle aktiviertes Thrombinzeittests, umfassend Aktivatoren für die intrinsische Plasmagerinnung, verwendet werden, um die Erkrankung zu überwachen oder nachzuweisen. Ebenfalls verwendet werden Tests auf Fibrinogen, Antithrombin III, Protein C, Protein S. Faktor VIII,
Gewebsplasminogenaktivator, Fibrinmonomere und Fibrinogenabbauprodukte.
Als eine Alternative zur Messung der hämostatischen Plasmafaktoren wurden auch Versuche unternommen, den Grad der zellulären Aktivierung, die während der Hämostase stattfindet, zu überwachen. Die Aktivierung der Plättchen wurde in dieser Hinsicht untersucht, da (wie vorstehend diskutiert) Plättchen wichtige Teilnehmer der Hämostase sind und vermutlich auch eine Hauptrolle bei der Entwicklung der arteriellen Thrombose und bei atherosklerotischenProzessen spielen.
Frühere Studien sind auf die Überwachung der Plättchenaktivierung durch Messen der Mengen der ausgeschiedenen Proteine fokussiert. So wurden Assays zur Messung des Plättchenfaktors 4 (PF-4), β-Thromboglobulin (β-TG) und Thrombospondin untersucht (vgl. Lane et al., Thromb. Haemostas. (Stuttgart) 52 2 S. 183-187 (1984). Jedoch erwies sich keines dieser Proteine als für eine Routinemessung geeignet. Es wurde gefunden, daß Thrombospondin für die Plättchen nicht spezifisch ist, und Untersuchungen über β-TG und PF-4 zeigten, daß ihre Halbwertszeiten im Blut zu kurz waren, was Probleme bei der Unterscheidung der Probenkonzentration gegenüber dem Untergrundwert verursachte. Ferner wurden erhöhte β-TG-Spiegel bei Patienten mit Nierenversagen gefunden, und die PF-4-Spiegel wurden durch die Anwesenheit von Heparin beeinflußt (was ausgiebig verwendet wird, um Patienten mit thrombotischen Störungen zu behandeln).
Es wurde nun erkannt, daß die durch die Plättchen gebildeten Mikrovesikel eine genaue Indikation der Plättchenaktivierung sind und so die Aktivität des hämostatischen Systems als ganzes widerspiegeln. George et al., (J. Clin.Invest. 78 : 340-348 (1986) überwachten die Veränderung von Glycoproteinen, die auf der Oberfläche von Plättchen und auf den plättchenabgeleiteten Mikrovesikeln nach einer kardiopulmonären Bypassoperation erschienen. Es wurde festgestellt, daß die Anzahl der Mikrovesikel erhöht war, und es wurde postuliert, daß dies eine Folge des Stresses des Schneidens, dem man während einer solchen Operation ausgesetzt ist, war. Jedoch wurde nicht vorgeschlagen, daß die Überwachung der Konzentration der Mikrovesikel ein guter Indikator für hämostatische Störungen sei und die Basis für ein Verfahren zur Diagnose solcher Zustände sein könnte.
Es wurde nun gefunden, daß die Bewertung der Anwesenheit oder der Konzentration der plättchenabgeleiteten Mikrovesikel als Verfahren zur Diagnose hämostatischer Störungen verwendet werden kann.
Der Ausdruck "hämostatische Störungen" umfaßt jede Abweichung oder Abnormalität in den Mechanismen der Blutgerinnungskaskade, insbesondere Störungen, die zu einer erhöhten Wahrscheinlichkeit einer Thrombusbildung oder zu einer erniedrigten Fähigkeit für Blutgerinnung nach Verletzung, beispielsweise kongenitale Blutgerinnungsstörungen, alle Formen von DIC (disseminierte intravasale Koagulation), und nach atherosklerotischen Erkrankungen führen. Die Diagnose hämostatischer Störungen ermöglicht so den Nachweis und/oder die Überwachung thromboembolischer und/oder kardiovaskulärer Erkrankungen. Dieser Ausdruck umfaßt auch hämostatische Störungen, die ein Sekundärphänomen sind, wie beispielsweise das Ergebnis von Krebs.
Die vorliegende Erfindung betrifft so ein Verfahren zur Diagnose einer kongenitalen Blutungsstörung, einer Form von disseminierter intravaskulärer Koagulation, atherosklerotischer Erkrankung, thromboembolischer Erkrankung und/oder kardiovaskulärer Erkrankung in einem menschlichen oder nichtmenschlichen Patienten, wobei die Anwesenheit und/oder Konzentration der plättchenabgeleiteten Mikrovesikel in einer Körperflüssigkeitsprobe des Patienten bestimmt wird.
Das erfindungsgemäße diagnostische Verfahren wird in vitro durchgeführt, wobei eine Körperflüssigkeitsprobe, z. B. Blut, verwendet wird, die von dem Patienten durch herkömmliche Mittel erhalten wurde.
Es besteht auch eine Notwendigkeit, nach einem einfachen Assay, um die Anwesenheit oder die Konzentration von plättchenabgeleiteten Mikrovesikeln zu bewerten. - Es wurde nun als besonders vorteilhaft befunden, die Mikrovesikel auf einem Filter einzuschließen, wodurch eine leichte zweckdienliche Messung ermöglicht wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft so einen Assay zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von Plättchenmikrovesikeln in einer flüssigen Probe, wobei man
(a) i. zuerst die Probe filtriert, wobei die Mikrovesikel als Retentat zurückgehalten werden und dann einen für die Mikrovesikel spezifischen Marker dem Retentat zusetzt; oder
ii. ggf. zuerst einen für die Mikrovesikel spezifischen Marker zusetzt und dann die Probe filtriert, wobei die markierten Mikrovesikel als Retentat zurückgehalten werden;
(b) ggf. den Filter wäscht; und
(c) die Anwesenheit oder die Menge des zurückgehaltenen Markers bestimmt.
Die flüssige Probe sollte von Plättchen und bevorzugt von anderen Zellen, die hämostatische Proteine produzieren können, z. B. Epithelzellen oder Monocyten, frei sein. Es wird daher in Betracht gezogen, daß vor Stufe (a) die flüssige Probe filtriert oder zentrifugiert wird, um eine im wesentlichen zellfreie Probe zu ergeben. Ein Filter mit einer Porengröße von größer als oder gleich 100 nm, beispielsweise größer oder gleich 1 > tm, eignet sich zur Entfernung des Hauptteils der Zellen in einer flüssigen Probe, während die viel kleineren Mikrovesikel suspendiert bleiben können. Wenn die Zellen in einer Probe durch Zentrifugation entfernt werden sollen, eignet sich eine g-Kraft von 2.000 bis 20.000 xg für 10 bis 30 min. beispielsweise 11.000 xg für 15 min. und kann verwendet werden, um eine im wesentlichen zellfreie Probe wie für die Stufe (a) des vorstehend dargelegten Assayverfahrens benötigt wird, zu ergeben. Andere äquivalente Techniken können verwendet werden, um die Zellen zu entfernen und um eine im wesentlichen zellfreie flüssige Probe, wie erforderlich, zu erhalten.
In Stufe (a) sollte der verwendete Filter eine Porengröße besitzen, die klein genug ist, um die Plättchenmikrovesikel zurückzuhalten, und eine Porengröße von weniger als oder gleich 800 nm, bevorzugt weniger als oder gleich 200 nm, ist geeignet. Durch die Filtration werden die Mikrovesikel auf dem Filter immobilisiert, der dann mit dem Marker in Kontakt gebracht werden kann oder direkt ausgewertet werden kann, wenn die Mikrovesikel bereits markiert wurden.
Ein geeigneter Marker umfaßt jeden Antikörper, der für die Oberflächenepitope, die auf den plättchenabgeleiteten Mikrovesikeln vorhanden sind, spezifisch ist. Ein bevorzugter erfindungsgemäßer Antikörpermarker erkennt Glycoproteine einschließlich des Komplexes GPIIb-IIIa und oder der getrennten Proteine GPIIb und GPIIIa. Andere plättchenspezifische Glycoproteine, die auf Mikrovesikeln vorkommen, umfassen GPIb-GPIX, GPIa-IIa und GPIIIb. Der an den Mikrovesikel bindende Antikörper kann selbst markiert sein, oder alternativ kann ein zweiter Antikörper verwendet werden, beispielsweise ein Anti-Maus-Immunglobulin, das markiert ist und das spezifisch an den angewendeten ersten Antikörper, z. B. einen monoclonalen Maus-Antikörper, bindet. Monoclonale Antikörper sind bevorzugt. Die Zugabe des Markers zu der flüssigen Probe wie in Stufe (a)(ii) ist bevorzugt. Der Marker kann mit den auf dem Filter immobilisierten Mikrovesikeln gemäß Stufe (a)(i) entweder durch direktes Aufbringen des Markers auf den Filter oder durch Eintauchen des Filters in eine Markerlösung in Kontakt gebracht werden. Der verwendete Marker kann jede beliebige Komponente sein, die ein Signal erzeugen kann, beispielsweise Enzyme, Chromophore, Fluorphore, radioaktive Isotope, gefärbte Teilchen, Farbstoffe, kolloidale Metalle etc.
Bevorzugt wird überschüssiger Marker durch Waschen des Filters entfernt, bevor jede: Messung der Anwesenheit oder Menge des Markers durchgeführt wird. Zusätzlich kann in Stufe (a)(i) der Filter nach Aufbringen der Probe und vor der Zugabe des Markers gewaschen werden. Wasser oder Puffer eignen sich für die Waschstufen.
Wenn der verwendete Marker ein Enzym ist, dann kann mit der Stufe (c) die Zugabe des Substrats zu der zu katalysierenden Reaktion verbunden sein. Bevorzugt ist jedoch der verwendete Marker sofort sichtbar, was die Durchführung einer sofortigen Bewertung erlaubt.
Die Konzentration der Mikrovesikel in einer Probe kann anschließend aus der auf dem Filter zurückgehaltenen Menge des Markers berechnet werden.. Dieser Wert kann dann vom Arzt verwendet werden, um eine hämostatische Störung des Patienten zu diagnostizieren. Ein Assay, der eine quantitative Messung erlaubt, ist bevorzugt.
Plättchenfreies Plasma, das mit einem Antikoagulans, wie Citrat, EDTA oder Heparin, behandelt ist, ist zur Verwendung in der Assayprobe gemäß der Erfindung geeignet.
Das mit Citrat versetzte Plasma kann natürlich ggf. vor Gebrauch verdünnt werden.
Zusätzlich kann der die Mikrovesikel enthaltende Filter auf den Proteingehalt oder bevorzugter den Phospholipidgehalt analysiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Nitrocellulosemembran oder eine Nylonmembran, beispielsweise Hybond N® (verkauft von Amersham International) oder Magna Nylon® (verkauft von MSI) als Filter verwendet. Eine Porengröße von 100 nm ist zweckdienlich. Ein adsorbierendes Pad, wie Celluloseblotting-Papier wird vorteilhafterweise auf eine Seite der Membran aufgebracht, um die Passage der flüssigen Probe durch den Film zu verstärken, und eine flüssigkeitsundurchlässige Schicht oder ein flüssigkeitsundurchlässiger Rahmen wird auf die andere Seite der Membran gegeben. Kreisförmige Löcher, z. B. mit einem Durchmesser von 5 mm, werden in der undurchlässigen Schicht oder dem Rahmen angebracht, um eine genaue Aufbringung der flüssigen Probe und Assayflüssigkeiten auf die Membran zu erlauben. Ein bekanntes Volumen der zellfreien wäßrigen Lösung, die Mikrovesikel enthält (die ggf. mit einem Puffer vorverdünnt wurde), z. B. 10 bis 500 ul, wird auf die Membran aufgebracht und in das darunterliegende adsorbierte Pad passieren gelassen. Eine wäßrige Lösung, z. B. 10 bis 500 ul, Anti-GPIIb-IIIa- Antikörper, konjugiert an ein Goldsolkolloid als Marker, wird aufgebracht und durch die Membran passieren gelassen. Die Membran wird dann mit 2 · 200 ul Aliguoten einer geeigneten Waschlösung, beispielsweise Tris-HCl-Puffer (pH 7,0), gewaschen, bevor die Menge des auf der Membran immobilisierten Goldsols üblicherweise durch das unbewaffnete Auge durch Vergleich mit einer Farbskala oder durch ein Reflektometer bewertet wird.
Indem man eine ggf. verdünnte im wesentlichen zellfreie Plasmaprobe, die einem menschlichen oder nichtmenschlichen Tierkörper, bevorzugt einem Säuger, entnommen wurde, dem vorstehend beschriebenen Assay unterwirft, wird zur Diagnose einer kongenitalen Blutungsstörung, einer Form von disseminierter intravaskulärer Koagulation, atherosklerotischer Erkrankung, thromboembolischer Erkrankung und/oder kardiovaskulärer Erkrankung ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Konzentration von plättchenabgeleiteten Mikrovesikeln, die im Blut kreisen, bereitgestellt.
Die folgende Beispiele dienen nur der Erläuterung:
Alle Mengenangaben beziehen sich auf das Volumen, sofern nicht anderweitig angegeben. Die folgenden Abkürzungen werden in den Beispielen verwendet, um auf die verschiedenen Pufferlösungen Bezug zu nehmen:
TS-Puffer: 0,01 mol/l Tris-HCl-Puffer (pH 7,4)/0,154 mol/l NaCl
TTG-Puffer: TS-Puffer versetzt mit 1% Triton X-100®
TBS-Puffer: 0,02 mol/l Tris-HCl-Puffer (pH 7,5)/0,5 mol/l NaCl
TTBS-Puffer: TBS-Puffer versetzt mit 0,05% Tween 20®.

Beispiel 1

Herstellung und Gewinnung von Plättchenmikrovesikeln

Blut wurde in einer gepufferten wäßrigen Natrumcitratlösung (1 : 9) gew Verfahren zur Diagnose einer kongenitalen Blutungsstörung, einer Form von disseminierter intravaskulärer Koagulation, atherosklerotischer Erkrankung, thromboembolischer Erkrankung und/oder kardiovaskulärer Erkrankung in einem menschlichen oder nichtmenschlichen Patienten, wobei die Anwesenheit und/oder Konzentration der plättchenabgeleiteten Mikrovesikel in einer Körperflüssigkeitsprobe des Patienten bewertet wird onnen und 15 min bei 320 xg zentrifugiert. Der das plättchenreiche Plasma enthaltende Überstand (PRP) wurde in Plastikröhrchen überführt und weitere 10 min bei 11.000 xg zentrifugiert. Der so erhaltene Überstand ist frei von Plättchen und enthält die Mikrovesikel. Um die Mikrovesikel zu gewinnen, wurden 2,8 ml des Überstands durch ein Millex- VV® -0,10 jim-Filter (Millipore Products Division Bedford, MA, USA), das in einer Spritze angebracht war, filtriert. Der Filter wurde ausgiebig in TS-Puffer gewaschen. Die auf dem Filter verbleibenden Mikrovesikel konnten entweder weiter analysiert werden, indem man den ganzen Filter der Reaktionsstufen unterwarf, oder sie wurden 150 ul-TTG-Puffer solubilisiert.

Beispiel 2

Proben des Materials aus in TTG-Puffer solubilisierten Mikrovesikeln wurden mit einem "Phospholipidenzym"-Kit (BioMerieux, Frankreich) zur quantitativen Bestimmung der Phospholipide gemessen. Das Verfahren beruht auf Takayama et al., Clin. Chim. Acta., 1977, 79, S. 93-98.

Beispiel 3

Bestimmung des Gesamtproteins

Materialproben aus den, wie in Beispiel 1 beschrieben, filtrierten und in TTG-Puffer solubilisierten Mikrovesikeln wurden mit dem BioRad-Farbstoffbindungsassay (BioRad, Richmond, USA), basierend auf dem Verfahren von Bradford, Anal. Biochem. 1976, 72,248-54, ausgemessen.

Beispiel 4

Schnelltest zur immunchemischen Bestimmung von Mikrovesikeln

Mit Citrat versetzte Blutproben wurden bei 320 xg 15 min lang zentrifugiert, gefolgt von der Zentrifugation der Überstände bei 11.000 xg für 10 min. Die die Plättchenmikrovesikel enthaltenden Überstände wurden mit dem monoclonalen Antikörper SC22, der gegen ein Epitop auf Cd41b (GPIIb) des GPIIb-IIIa-Komplexes der Plättchenoberflächenmembranen gerichtet ist, versetzt. Der Antikörper wurde von Immunotech S. A., Luminy, Marseille, Frankreich, erhalten. Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1 : 1500 zugesetzt. Nach 1minütiger Inkubation bei 20ºG wurden 2,8 ml der Gemische, wie in Beispiel 1 beschrieben, filtriert. Die Mikrovesikel mit dem monoclonalen Maus-Antikörper wurden nun auf den Filtern eingefangen. Die Filter wurden ausgiebig in TTBS- Puffer und dann in TBS-Puffer gewaschen. Ziege-Anti-Maus- IgG-F(ab), konjugiert an alkalische Phosphatase (Jackson Immuno Research Laboratories, USA), verdünnt 1 : 3000 in TBS- Puffer, wurde durch jeden der Filter geleitet. Das Konjugat wurde nun an den an die GPIIb-IIIa-Komplexe in den Mikrovesikeln gebundenen Antikörper gebunden. Die Filter wurden in eine Lösung, die 0,5 mg/ml Nitroblue-Tetrazolium, 0,25 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-p-toluidin und 0,1 mol/l NaHC&sub0;&sub3;-Puffer (pH 9,8) enthielt, für eine Zeit, die ausreicht, um zu einer meßbaren Farbbildung auf den Filteroberflächen zu führen, eingetaucht.
Patienten mit positivem D-Dimer und/oder positivem löslichem Fibrintest (Ethanolgelbildungstest) wurden unter Verwendung des vorstehend genannten Verfahrens untersucht. Als Kontrolle wurde ein offensichtlich gesunder Patient ohne klinisches Anzeichen einer Erkrankung und mit einem negativen D-Dimeren und löslichen Fibrintests ausgewählt.
Die so erhaltene Farbe auf den Filtern wurde mit einem Reflektometer (NycoCard® Reader, wie beispielsweise in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO94/00749 und WO94/0072 offenbart), gemessen. Die Reflexionswerte waren: Reflexionserqebnisse
Es ist zu erkennen, daß die Patientenproben im wesentlichen höhere Werte als die normale Plasmaprobe und der Kontrollpuffer ergeben.

Beispiel 5

Untersuchung von Material aus Patienten mit einer thromboembolischen Erkrankung

Patienten mit einer thromboembolischen Erkrankung, die durch die Anwesenheit des D-Dimeren und/oder löslichen Fibrins in routinemäßigen analytischen Labortests festgestellt wurde, und offensichtlich gesunde Individuen wurden in Gruppen entsprechend ihres Alters eingeteilt. Das Blut wurde gewonnen und zentrifugiert, und die Plättchenmikrovesikel wurden auf Filtern, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen. Die Analysen von Gesamtphospholipid, Gesamtprotein und GPIIb-IIIa unter Verwendung des raschen Immunoassays mit spezifischen Antikörpern (beschrieben jeweils in den Beispielen 2 bis 4) wurden durchgeführt. In dem immunchemischen Assay wurde die nur mit Puffer als Ersatz für die Probe erhaltene Farbe als Kontrolle verwendet und von den Werten abgezogen. Ein innerer Standard der Mikrovesikel wurde mit einem willkürlichen Wert von 1,0 gleichgesetzt, und alle Ergebnisse, die mit dem immunchemischen Verfahren erhalten wurden, wurden auf die mit diesem Standard erhaltenen Ergebnisse, wenn Einzelversuche durchgeführt wurden, bezogen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt und zeigen, daß das Gesamtprotein beträchtlich zwischen den Patienten und den gesunden Individuen überlappte. Jedoch zeigte die Menge an GPIIb-IITa einen klaren Unterschied zwischen Patienten und gesunden Individuen. So eignet sich dieses analytische Verfahren am besten zur Konstruktion eines diagnostischen Mittels zur Detektion der Plättchenmikrovesikel in Blutproben.
Die Variabilität der Menge des Gesamtproteins kann eine Folge des variablen Gehalts an Protein in den Mikrovesikeln sein. Es kann schwierig sein zu kontrollieren, in welchem Ausmaß die Vesikel durch das Herstellungsverfahren aufgebrochen werden und folglich kann ein variables Austreten löslicher Proteine aus den Vesikeln die beobachtete Variabilität in den Ergebnissen erklären. Tabelle 1 Ergebnisse aus der Messung der Menge der Plättchenmikrovesikel in Proben aus Patienten und normalen Individuen unter Verwendung von Gesamtphospholipid, Gesamtprotein und der Menge an GPIIb-IIIa

Beispiel 6

Untersuchung von Material aus Patienten mit DIC

Patienten mit disseminierter intravasaler Koagulation (DIC), wie aus positiven Tests über Fibrinabbauprodukte (FDP) und löslichem Fibrin (positiver Ethanolgelbildungstest) beurteilt wurde, wurden unter Verwendung der in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren untersucht. Das Alter der Patienten lag zwischen 24 und 72 Jahren. Von den Patienten mit DIC hatten sich 10 eines größeren chirurgischen Eingriffs unterzogen, sechs hatten Präeklampsie, drei Sepsis und drei hatten promyelocytäre Leukämie. Die Kontrollen (n = 30) bestanden aus gesunden Blutspendern, die in Alter und Geschlecht paßten. Die DIC-Patienten hatten bei Abnahme des Bluts keine Antikoagulanztherapie erhalten. Der Test auf PGIIb-IIIa (z. B. GPIIb-Antigen), Phospholipid und Gesamtprotein mit den in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren zeigte die folgenden Ergebnisse: DIC- Kontrollen Probabili-
Die Ergebnisse zeigen, daß die Messung von GPIIb-IIIa und Phospholipid zwischen Patienten und Kontrollen mit hoher Signifikanz unterscheidet, wohingegen die Signifikanz bezüglich Gesamtprotein beträchtlich niedriger ist.

Claims

1) Verfahren zur Diagnose einer kongenitalen Blutungsstörung, einer Form von disseminierter intravaskulärer Koagulation, atherosklerotischer Erkrankung, thromboembolischer Erkrankung und/oder kardiovaskulärer Erkrankung in einem menschlichen oder nichtmenschlichen Patienten, wobei die Anwesenheit und/oder Konzentration der plättchenabgeleiteten Mikrovesikel in einer Körperflüssigkeitsprobe des Patienten bestimmt wird.

2) Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Stufen der Abtrennung der Mikrovesikel von intakten Zellen, Immobilisieren der Mikrovesikel auf einem festen Träger und der Bestimmung der Anwesenheit oder der Konzentration der immobilisierten Mikrovesikel.

3) Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Mikrovesikel von den intakten Zellen durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt werden.

4) Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Mikrovesikel von den intakten Zellen durch Filtration durch ein Filter mit einer Porengröße 100 nm abgetrennt werden.

5) Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Filter eine Porengröße ≥ 1 um besitzt.

6) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Mikrovesikel auf einem Filter mit einer Porengröße S 800 nm immobilisiert werden.

7) Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Filter eine Porengröße ≤ 200 nm besitzt.

8) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Anwesenheit und/oder die Konzentration der Mikrovesikel durch Binden von Antikörpern an spezifische Oberflächenepitope der Mikrovesikel und Bestimmen der Mengen der so gebundenen Antikörper bestimmt wird.

9) Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Oberflächenepitope von Glykoproteinen getragen sind.

10) Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Oberflächenglykoprotein GPIIb-IIIa ist.

11) Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei der Antikörper einen Marker trägt, der direkt oder indirekt nachgewiesen werden kann.

12) Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Marker indirekt durch Binden einer weiteren markierten Komponente an den Antikörper, der direkt oder indirekt nachgewiesen werden kann, oder durch die Zugabe eines Substrates zu einem ein Enzym tragenden Antikörper nachgewiesen wird.

13) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Antikörper gegen spezifische Oberflächenepitope der Mikrovesikel vor der Immobilisierung gebunden werden.

14) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Bestimmung der Anwesenheit und/oder Konzentration der Mikrovesikel durch Phospholipidanalyse durchgeführt wird.

15) Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 14, wobei der feste Träger zwischen den Stufen gegebenenfalls gewaschen wird.