DE69400427T2

DE69400427T2 - Nährstoff für Mikroorganismenkultur

Info

Publication number: DE69400427T2
Application number: DE69400427T
Authority: DE
Inventors: Corrine Jay
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1993-12-02
Filing date: 1994-12-02
Publication date: 1997-01-16
Anticipated expiration: 2014-12-03
Also published as: US5536645A; FR2713240B1; CA2137170C; ATE141954T1; DE69400427D1; CA2137170A1; EP0656421A1; ES2092388T3; FR2713240A1; EP0656421B1

Description

Die Erfindung betrifft ein im wesentlichen synthetisches Nährmedium für Mikroorganismen. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Nährmedium zum Kultivieren von Mikroorganismen und dessen Verwendung zur Bestimmung der Aktivität eines Wirkstoffes, der gegen diese Mikroorganismen aktiv ist.
Unter im wesentlichen synthetischem Medium entsprechend der Erfindung wird ein Medium verstanden, bei dem zumindest diejenigen Bestandteile, die zwingend notwendig sind, um dieses Medium mit den später beschriebenen Eigenschaften zu erhalten, synthetisch sind.
Die Beschaffenheiten, die für Nährmedien für Mikroorganismen notwendig sind, sind diejenigen, wie sie durch H.M. Ericsson et al. (J.C. 1977, Antibiotic Sensitivity Testing, Report of an international collaborative study, Munksgaard, Kopenhagen) beschrieben wurden, nämlich:
- Es muß das Wachstum eines überwiegenden Anteils von klinisch bedeutsamen Bakterien ermöglichen, ohne daß eine zusätzliche Anreicherung notwendig ist,
- es muß Basiselemente (Peptone) zufriedenstellender Qualität enthalten,
- es muß die Reproduzierbarkeit von Sensibilitätstests ermöglichen, und zwar unabhängig von der jeweiligen Charge und/oder dem Lieferanten,
- es darf keinen Antagonismus gegegenüber Antibiotika aufweisen,
- es darf nicht ausgeprägten pH-Schwankungen ausgesetzt sein,
- es muß isotonisch für Bakterien sein und es muß das Hinzufügen von Blut ertragen, ohne daß eine Hämolyse hervorgerufen wird.
Ein Medium, das gegenwärtig von allen Fachleuten als Referenzmedium betrachtet wird, ist das gelosierte Mueller- Hinton-Medium, das all diese Erfordernisse relativ gut erfüllt. Dennoch wurden unterschiedliche Probleme festgestellt, die die Folge dessen komplexen Charakters sind: das Mueller-Hinton-Medium besteht nämlich aus einem Auszug von Rindfleisch, einem Caseinhydrolysat und Stärke. Insbesondere was Antibiotika-Studien betrifft, ermöglicht das komplexe Medium nicht die Konzentration von deren bekannten Bestandteilen, wie die der bivalenten Ionen, des Thymidins, der PBA (Paraaminobenzoesäure), der Folsäure genau zu kennen, um deren Aktivität zu optimieren, wodurch es mühselig oder sogar unmöglich ist Versuche durchzuführen, die zum Ziel haben, unterschiedliche Aktivitäten eines Antibiotikums mit unterschiedlichen Zusammensetzungen zu korrelieren. So kann die Zusammensetzung eines Mueller-Hinton-Mediums nicht nur von einer Charge zur anderen eines und desselben Lieferanten variieren, sondern es haben sich auch beachtliche Unterschiede beim Wechseln des Lieferanten herausgestellt. Diese Unterschiedlichkeit der Zusammensetzung zieht einen Mangel an Reproduzierbarkeit des Wachstums von Bakterien und der Aktivitäten von Antibiotika nach sich. Diese Probleme treten verstärkt bei der flüssigen Form des Mediums auf, das überhaupt nicht für die Verwendung bei einem Automaten geeignet ist, und zwar aufgrund dessen schlechter optischer Eigenschaften, und zwar aufgrund der Tatsache, daß es schlecht lösliche Bestandteile, wie beispielsweise Stärke enthält.
Um die Probleme bezüglich der Reproduzierbarkeit zu lösen, wurden sogenannten synthetische Medien vorgeschlagen, d.h. Medien, die im wesentlichen frei von natürlichen Bestandteilen sind. Diese Medien, sofern sie in flüssiger Form vorliegen, weisen eine ausreichende optische Qualität auf, um zuverlässige und auf Automaten reproduzierbare Messungen durchzuführen.
Dennoch sind die für Antibiogramme beschriebenen synthetischen Medien im allgemeinen nur für einige spezien vorhanden, die oftmals die geringsten Nähranforderungen haben, und deren Nährgualität liegt unterhalb des Referenzmediums Mueller-Hinton (siehe beispielsweise die Artikel von P.D. Heoprich et al., Synthetic medium for susceptibility testing, anti-microbial. agents and chemotherapy (1970); P.F. Dougherty et al., Chemically defined medium for susceptibility testing of antimicrobial agents, Antimicrobial. agents and chemotherapy, 10 (6) 2. 923-925 (1976), R.M. Lawrence et al., Totally synthetic medium for susceptibility testing, Antimicrobial agents and chemotherapy, Vol 13, 3, 394-3998 (1978)). Das europäische Patent EP 0 019 054 beschreibt ein synthetisches Medium für das Wachstum von Mikroorganismen und dessen Verwendung zur Bestimmung der Aktivität einer therapeutisch wirksamen Substanz gegen einen Mikroorganismus. Die Zusammensetzung dieses Mediums bewirkt, daß es nur für das Wachsen und für die Bestimmung der Sensibilität gegenüber Antibiotika von den gängigsten Keimen und von anaeroben Bakterien einsetzbar ist. Darüber hinaus kann die Bestimmung der Sensibilität gegenüber Antibiotika nur nach 12 bis 24 Stunden Inkubation durchgeführt werden.
Es besteht demzufolge die Notwendigkeit, ein synthetisches Medium zu schaffen, das die Nährqualitäten des Referenzmediums Mueller-Hinton aufweist, und das darüber hinaus für das Wachstum und die Bestimmung der Sensibilität gegenüber Antibiotika von den am häufigsten, in der klinischen Praxis isolierten Bakterien geeignet ist.
Die Anmelderin hat daher ein Medium geschaffen, das den vorgenannten Anforderungen entspricht und das darüber hinaus, falls es in flüssiger Form vorliegt, ein sehr rasches Erfassen von Antibiogrammen ermöglichst, d.h. nach 3 bis 5 Stunden Inkubation für Enterobakterien und nach weniger als 10 Stunden für Pseudomonas, und zwar durch kinetische Wachstumsanalyse.
Das erfindungsgemäße Medium weist ein Nährmedium zur Kultivierung von Mikroorganismen auf, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es folgendes enthält, nämlich 7-70 mg/l L-Alanin, 8-80 mg/l L-Arginin, 5-50 mg/l L-Asparagin, 6-60 mg/l L-Asparaginsäure, 2-20 mg/l L-Cystein, 4-40 mg/l L-Glutamin, 8-80 mg/l L-Glutaminsäure, 7-70 mg/l Glycin, 2,5-25 mg/l L-Histidin, 6-60 mg/l L-Isoleucin, 9-90 mg/l L-Leucin, 9-90 mg/l L-Lysin, 4-40 mg/l L-Methionin, 5-50 mg/l L-Phenylalanin, 4-40 mg/l L- Prolin, 4-400 mg/l L-Serin, 5-50 mg/l L-Threonin, 2-20 mg/l L-Tryptophan, 4-40 mg/l L-Tyrosin, 8-80 mg/l L-Valin, 0,01-02 mg/l Biotin, 0,01-0,3 mg/l Calciumpantothenat, 0,0010,01 mg/l Folsäure, 0,01-0,Smg/l Inositol, 0,04-0,2mg/l Vitamin PP, 0,02-0,3 mg/l Vitamin B&sub6;, 0,01-0,1 mg/l Thiaminchlorid, 0,005-0,05 mg/l Liponsäure, 0,1-5 mg/l Cholin, 1-10 mg/l Ethyloxalacetat, 0,1-1 mg/l Spermidin, 5-50 mg/l Tween 80 [Polyoxyethylen-80-Sorbitanoleat, bezeichnet mit der Nummer 7455 im THE MERCK INDEX (10. Auflage)], 11-110 mg/l Purin- Nudeoside bestehend aus Adenosin und Guanosin, in einem Verhältnis vom ersten zum zweiten zwischen 0,8 und 1,2, und 4-40 mg/l Pyrimidin-Nudeoside bestehend aus Cytidin und Uridin, in einem Verhältnis vom ersten zum zweiten zwischen 1 und 3, wobei die Purin-Nucleoside und die Pyrimidin-Nucleoside in einem Verhältnis von den ersten zu den zweiten zwischen 1,5 und 2,2 vorhanden sind, 100-10000 mg/l Glucose, 100-10000 mg/l Maleinsäure, 0,020-0,583 mg/l Eisen, 49,3-493 mg/l Kalium, 1,2-12 mg/l Magnesium, 2,7-27,2 mg/l Calcium, 1,18-3,15 g/l Natrium, 1820-5000 mg/l Chlor, 17,8-178,3 mg/l Phosphationen, 33,6-336, mg/l Ammoniumionen, 2000-20000 mg/l eines sauren Puffers und 1000-10000 mg/l eines basischen Puffers.
Insbesondere weist das erfindungsgemäße Medium 5-50 mg/l Adenosin, 3-30 mg/l Cytidin, 6-60 mg/l Guanosin, 1- 10 mg/l Uridin, 0,2-5 mg/l Eisenpyrophosphat, 100-1000 mg/l zweibasisches Kaliumphosphat, 10-110 mg/l Magnesiumchlorid, 10-100 mg/l Calciumchlorid, 100-1000 mg/l Ammoniumchlorid, 3000-8000 mg/l Natriumchlorid auf.
Vorteilhafterweise weist das erfindungsgemäße Medium darüber hinaus bis zu 0,022 mg/l Molybdän, vorzugsweise in Form von Ammoniummolybdat in einer Konzentration von höchstens 0,04 mg/l, bis zu 0,010 mg/l Cobalt, vorzugsweise in Form von Colbaltchlorid bis zu einer Konzentration von höchstens 0,04 mg/l, bis zu 0,027 mg/l Mangan, vorzugsweise in Form von Manganchlorid, in einer Konzentration von höchstens 0,1 mg/l, bis zu 0,007 mg/l Zink, vorzugsweise in Form von Zinksulfat, in einer Konzentration von höchstens 0,03 mg/l, bis zu 0,128 mg/l Kupfer, vorzugsweise in Form von Kupfersulfat, in einer Konzentration von höchstens 0,5 mg/l, bis zu 0,088 mg/l Bor, vorzugsweise in Form von Borsäure, in einer Konzentration von höchstens 0,5 mg/l, bis zu 18,4 mg/l Sulfationen, vorzugsweise in Form von Kahumsulfat, in einer Konzentration bis zu höchstens 100 mg/l, bis zu 0,1 mg/l Riboflavin, bis zu 0,005 mg/l Cyanocobalamin, bis zu 0,1 mg/l Menadion, bis zu 0,5 mg/l Borsäure und/oder bis zu 5 mg/l Glycerin auf.
Bei der vorliegenden Erfindung bedeutet "bis zu" eine Konzentration bis einschließlich auf diesen Wert.
Noch vorteilhafterweise weist das erfindungsgemäße Medium folgendes auf, nämlich 0,0005-0,005 mg/l Cyanocobalamin, 0,01-01 mg/l Menadion, 0,01-01 mg/l Riboflavin, 0,1-5 mg/l Glycerin, 0,0004-0,04 mg/l Ammoniummolybdat, 0,0004-0,04 mg/l Cobaltchlorid, 0,001-01 mg/l Manganchlorid, 0,0003-0,03 mg/l Zinksulfat, 2000-20000 mg/l MOPS-Puffer [3-(N-Morpholino) propansulfonsäure, vertrieben durch die Firma SIGMA unter der Bezeichnung M(254)], 1000-10000 mg/l Tris-Puffer (tris[Hydroxymethyl]aminomethan), vertrieben durch die Firma SIGMA unter der Bezeichnung T-1503.
Vorteilhafterweise weist das erfindungsgemäße Medium jumindest 65 mg/l L-Alanin, 73 mg/l L-Arginin, 43 mg/l L-Asparagin, 53 mg/l Asparaginsäure, 16 mg/l L-Cystein, 37 mg/l L-Glutamin, 73 mg/l L-Glutaminsäure, 66 mg/l Glycin, 22 mg/l L-Histidin, 54 mg/l L-Isoleucin, 84 mg/l L-Leucin, 89 mg/l L-Lysin, 33 mg/l L-Methionin, 44 mg/l L-Phenylalanin, 36 mg/l L-Prolin, 320 mg/l L-Serin, 43 mg/l L-Threonin, 17 mg/l L-Tryptophan, 36 mg/l L-Tyrosin, 70 mg/l L-Valin, 0,03 mg/l Biotin, 0,03 mg/l Calciumpantothenat, 0,0008 mg/l Cyanocobalamin, 0,005 mg/l Folsäure, 0,04 mg/l Menadion, 0,15 mg/l Inositol, 0,15 mg/l Vitamin PP, 0,15 mg/l Vitamin B&sub6;, 0,03 mg/l Riboflavin, 0,03 mg/l Thiaminchlorid, 0,01 mg/l Liponsäure, 1,5 mg/l Cholin, 2,5 mg/l Glycerin, 5 mg/l Ethyloxalacetat, 0,75 mg/l Spermidin, 10 mg/l Tween 80, 15 mg/l Adenosin, 10 mg/l Cytidin, 20 mg/l Guanosin, 6 mg/l Uridin, 750 mg/l Glucose, 500 mg/l Maleinsäure, 0,004 mg/l Ammoniummolybdat, 0,004 mg/l Cobaltchlorid, 0,016 mg/l Manganchlorid, 0,003 mg/l Zinksulfat, 1,8 mg/l Eisenpyrophosphat, 0,25 mg/l Kupfersulfat, 0,025 mg/l Borsäure, 50 mg/l Kaliumsulfat, 230 mg/l zweibasisches Kaliumphosphat, 100 mg/l Magnesiumchlorid, 90 mg/l Calciumchlorid, 500 mg/l Ammoniumchlorid, 7500 mg/l Natriumchlorid, 15000 mg/l MOPS-Puffer, 7000 mg/l Tris-Puffer auf.
In einer Ausfüurungsform der Erfindung weist das Medium darüber hinaus zumindest ein Peptid in einer Konzentration zwischen 50 und 100 mg/l oder eine Mischung von Peptiden in einer Konzentration zwischen 50 und 1000 mg/l auf, wobei die Peptide eine Länge zwischen 4 und 15 Animosäuren aufweisen.
Insbesondere ist das Peptid ausgewählt aus den Peptiden, die die folgenden Aminosäuresequenzen aufweisen:
Ala-Gly-Ser-Glu (SEQ ID NO: 1)
Glu-Asp-Arg-Pro-Pro-Leu-Phe-Gly-Gln-Gly-Thr-Val (SEQ ID NO: 2)
und
Ala-Ser-Asp-Ala-Lys-Ala-Tyr-Asp-Thr-Glu-Val (SEQ ID NO: 3).
Bei einer vorteilhaften Formulierung des erfindungsgemäßen Mediums weist letzteres darüber hinaus einen Rinderextrakt auf, dessen Konzentration vorzugsweise zwischen 2 und 10 g/l liegt. Das Hinzufügen eines Rinderextrakts ermöglicht insbesondere, das Wachstum von Spezies wie Staphylococcus saprophyticus, Xanthomonas maltophilia und Acinetobacter iwoffi zu fördern.
Das erfindungsgemäße Medium kann gleichermaßen in flüssiger oder gelosierter Form hergestellt werden. Wird es in gelosierter Form hergestellt, wird ein gelifizierendes Agens dem Medium hinzugefügt. Das gelifizierende Agens kann irgend ein bekanntes gebräuchliches gelifizierendes Agens sein, wie beispielsweise Gelatine, Agar, Agarose, etc. Um die im wesentlichen synthetische Natur des Mediums zu konservieren, wird jedoch vorzugsweise Agarose in einer Konzentration von etwa 10000 mg/l als gelifizierendes Agens ausgewählt.
Es ist selbstverständlich, daß die zuvor beschriebenen Bestandteile des Mediums durch Äquivalente ersetzt werden können, ohne die Art und Eigenschaften des erfindungsgemäßen Mediums zu modifizieren. So können die zuvor erwähnten Säure- oder Basensalze durch eine äquivalente Menge der freien Base oder der freien Säure oder durch eine äquivalente Menge eines Salzes mit einer anderen Säure oder einer anderen Base ersetzt werden. Gleichermaßen kann eine freie Base oder eine freie Säure in Form eines geeigneten Salzes vorhanden sein. Gleichermaßen kann ein Bestandteil, der als Hydrat definiert ist, in Anhydridform vorliegen, oder kann durch ein anderes Hydrat ersetzt werden, das dieselben Eigenschaften aufweist, und zwar unter den an sich bekannten Bedingungen. Gleichermaßen kann ein emulgierendes oder dispergierendes Agens, mit an sich bekannten Eigenschaften, das dieselben Eigenschaften oder ähnliche Eigenschaften wie Tween 80 hat, dieses ersetzen.
Die Erfindung wird beim Studium der nachfolgenden detaillierten Beschreibung in Zusammenhang mit den beiliegenden Figuren besser verstanden, in denen auf den Abszissen die Zeit in Minuten und auf den Ordinaten eine optische Dichte bei 650 nm, die von einer Vorrichtung M52 der Firma ABBOTT erhalten werden, aufgetragen sind.
Fig. 1 zeigt den Effekt der Erhöhung der Konzentration von Serin im erfindungsgemäßen Medium, das als IST-Medium bezeichnet wird, im Vergleich mit dem Wachstum, der mit einem Mueller-Hinton-Medium erhalten wird, das von der Firma DIFCO LABORATORIES unter der Bezeichnung 0757-01-4 in den Handel gebracht wird. Die Kurve a stellt das Wachstum, das mit dem IST-Medium erhalten wurde, dar, wobei dies eine Ausgangskonzentration an Serin von 32 mg/l aufgewiesen hat. Die Kurve b zeigt das Wachstum mit einem IST-Medium bei einer um den Faktor 10 erhöhten Serin-Konzentration. Die Kurve c zeigt das Wachstum, das mit einem Mueller- Hinton-Medium erhalten wurde.
Fig. 2 zeigt die Wirkung der Konzentration an Aminosäuren des IST-Mediums auf das Wachstum von Pseudomonas aeruginosa; Kurve a zeigt das Wachstum, das mit einer Ausgangskonzentration der unterschiedlichen Aminosäuren von 108 mg/l erhalten wurde, und Kurve b zeigt die Wirkung einer Erhöhung der Konzentration der Aminosäuren um einen Faktor 3.
Fig. 3 zeigt den Einfluß der Konzentration von Natriumchlorid des IST-Milieus auf das Wachstum von Proteus mirabilis; die Kurven a, b, c und d zeigen diesen Einfluß bei Konzentrationen an NaCl von 0,3 %, 0,5 %, 1 % und 0,75 %.
Fig. 4 zeigt den Einfluß der Natriumchloridkonzentration des IST-Milieus auf das Wachstum von Vibrio parahaemolyticus; die Kurven a, b, c und d entsprechen Natriumchloridkonzentrationen von 0,3 %, 0,5 %, 0,75 % und 1 %.
Fig. 5 zeigt die Wirkung von Folsäure auf das Wachstum von Enterococcus faecium. Die Kurve a zeigt die Ergebnisse ohne Folsäure, und die Kurve b zeigt das Wachstum, das erhalten wird, wenn dem IST-Medium 0,005 mg/l Folsäure hinzugefügt worden ist.
Fig. 6 zeigt die Wirkung von Folsäure auf das Wachstum von Enterococcus faecalis, die Kurve a zeigt die Ergebnisse, die mit einem IST-Medium erhalten wurden, das keine Liponsäure enthält und die Kurve b zeigt das Wachstum dieses Stammes nach Hinzufügen von Liponsäure in einer Konzentration von 0,01 mg/l zum IST-Milieu.
Fig. 7 zeigt die Wirkung von Spermidin auf das Wachstum von Proteus mirabilis. Kurve a zeigt die Ergebnisse, die mit einem IST-Medium ohne Spermidin erhalten wurden, und Kurve b zeigt das Wachstum, nachdem 0,25 mg/l Spermidin hinzugefügt wurde.
Fig. 8 zeigt die Wirkung von Ethyloxalacetat auf das Wachstum von Staphylococcus saprophyticus. Kurve a zeigt das Wachstum, das bei einem IST-Medium ohne Ethyloxalacetat erhalten wird, Kurve b zeigt die Ergebnisse mit 5 mg/l Ethyloxalacetat.
Fig. 9 zeigt die Wirkung des Weglassens von Tween 80 auf das Wachstum von Enterococcus faecalis. Die Kurve a zeigt das Wachstum, das mit einem IST-Medium erhalten wurde, in dem kein Tween 80 enthalten ist und die Kurve b zeigt die Ergebnisse nach einem Hinzufügen von 10 mg/l Tween 80.
Fig. 10 zeigt die Wirkung von L-Maleinsäure auf das Wachstum von Alcaligenes faecalis. Die Kurve a zeigt das Wachstum, das mit dem IST-Medium ohne L-Maleinsäure erhalten wurde, und die Kurve b zeigt die Ergebnisse nach einem Hinzufügen von L-Maleinsäure in einer Konzentration von 500 mg/l.
Die Figuren 12 und 13 zeigen die Kompatibilität einer bestimmten Konzentration von Folsäure mit der Aktivität gewisser Antibiotika. Sie zeigen das Wachstum von Enterococcus faecalis auf einem erfindungsgemäßen IST-Medium bzw. auf einem Mueller-Hinton-Medium, jeweils ohne Antibiotikum (Kurven b) und in Gegenwart eines Antibiotikums, nämlich Trimethoprim in einer Konzentration von 0,25 mg/l (Kurven a). Diese Figuren bestätigen die Inhibierung des Wachstums dieses Stammes, und zwar unabhängig vom Medium, bei einer Konzentration von 0,25 mg/l Trimethoprim.
Fig. 14 zeigt den Einfluß des Hinzufügens des Peptides Ala-Gly-Ser-Glu (SEQ ID NO: 1) in das erfindungsgemäße IST-Medium und den Vergleich mit den Ergebnissen, die erhalten werden, wenn man die freien Aminosäuren, die dieses Peptid aufbauen, hinzufügt. Die Kurve a entspricht den Ergebnissen, die mit dem erfindungsgemäßen Medium ohne Hinzufügen des vorgenannten Peptides und ohne Hinzufügen der freien Aminosäuren, dieses Peptid aufbauen, erhalten wurden. Die Kurve b zeigt die Ergebnisse, die bei einer Hinzufügung der Aminosäuren Ala, Gly, Ser, Glu jeweils in Konzentrationen von 11, 9, 12,5 und 17,5 mg/l erhalten wurden. Die Kurve c zeigt die Ergebnisse, die bei Hinzufügen der Aminosäuren Ala, Gly, Ser, Glu jeweils in Konzentrationen von 22, 18, 25 und 35 mg/l erhalten wurden. Die Kurve d entspricht dem bakteriellen Wachstum, das erhalten wurde, nachdem dem Medium 50 mg/l des Peptides hinzugefügt wurden. Die Kurve e zeigt die Ergebnisse nach der Hinzufügung von 100 mg/l desselben Peptides.
Fig. 15 zeigt den Vergleich zwischen dem Wachstum eines Stammes S. agalactiae in einem erfindungsgemäßen IST- Medium (Kurve a) und einem Medium nach dem Stand der Technik (Mueller-Hinton) (Kurve b).
Fig. 16 zeigt einen Vergleich zwischen dem Wachstum eines Stammes E.faecium, einmal im erfindungsgemäßen Medium (Kurve a) und zum anderen in einem Medium nach dem Stand der Technik (Kurve b).
Fig. 17 zeigt den Einfluß des Einbringens eines Rinderextraktes in das IST-Medium auf das Wachstum von Staphylococcus saprophyticus. Kurve a zeigt das Wachstum, das in einem IST-Medium erhalten wurde, ohne Rinderextrakt, und Kurve b zeigt die Ergebnisse mit 5 g/l Rinderextrakt.

Beispiel 1: Zusammensetzung des Mediums

Das erfindungsgemäße Medium enthält Aminosäuren, eine mineralische Basis, Vitamine und Wachstumsfaktoren, Kohlenstoffquellen, Nudeoside und einen Puffer.
Die 20 Aminosäuren, die die Proteine aufbauen, alle mit Ausnahme von Glycin in der L-Konfiguration, sind in der Zusammensetzung des Mediums enthalten.
Die Konzentration jeder Aminosäure wurde unter Bezugnahme auf die relativen Anteile an Aminosäuren des E. coli bestimmt, der der am meisten bekannte und am häufigsten in der klinischen Praxis isolierte Bakterienstamm darstellt. Die Anteile der Aminosäuren wurden einerseits durch chemische Analyse eines Hydrolysats des Proteins bestimmt (F.C. Neidhart (1988) Chemical composition of Escherichia coli in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society of Microbiology, Washington D.C., Vol. 1: 3-6) und andererseits durch statistische Analyse der Codons der ausgeprägt exprimierten Proteine (G. Manob (1987) Origine et fonction du code génétique ches E. Coli: structuration en banque de données et analyse statistique des sequences Nudeotidiques, thèse de Doctorat ès-Sciences, Lyon).
Die Ergebnisse, die durch diese beiden Annäherungen erhalten wurden, sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt. Die Anteile wurden von den molaren Konzentrationen genommen und sind als prozentualer Anteil der Aminosäuren angegeben. TABELLE 1
(1) bezieht sich auf die chemische Analyse eines Hydrolysat des Proteins.
(2) entspricht der statistischen Analyse von Codons von ausgeprägt exprimierten Proteinen.
Asx und Glx beziehen sich auf eine Mischung an Glutaminsäure/Glutamin und Asparaginsäure/Asparagin.
Die Unterscheidung zwischen den Säureformen und den Aminformen dieser Aminosäuren wurde mittels der Methode von Manob durchgeführt. Die relativen Anteile, angegeben in Prozentanteil sind die folgenden: Glu 7,0%, Gln 3,5 %, Asp 5,5%, Asn 4,1 %. Die Anteile zwischen den molaren Konzentrationen der unterschiedlich zurückbehaltenen Aminosäuren sind diejenigen, wie sie nach der Methode von Neidhart bestimmt wurden, mit der Ausnahme der Verhältnisse Glu/Gln und Asp/Asn, die 2 bzw. 1,3 sind, und die nach der Methode von Manolo bestimmt worden sind.
Die prozentualen Anteile der Aminosäuren des Mediums auf Basis der molaren Konzentrationen sind in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengestellt. TABELLE 2
Die qualitative und quantitative Zusammensetzung an Aminosäuren wird anschließend für unterschiedliche Gattungen optimiert, um ein Wachstum zu erhalten, das einem solchen entspricht, wie es mit dem Referenzmedium Mueller-Hinton erhalten wird. So wird insbesondere die Konzentration an Serin erhöht, um eine Endkonzentration im Bereich von 400 mg/l, vorteilhafterweise 320 mg/l zu erreichen, da diese Aminosäure sehr rasch durch Serratia assimiliert wird, insbesondere der Stämme marcescens, liquefaciens und fonticola und durch die Stämme Marganella morganii, Proteus mirabilis und Yersinia enterocolitica. Die Verbesserung des Wachstums wurde durch Erhöhen der Endkonzentration des Serins erzielt, insbesondere für Serratia marcescens, wie dies in Fig. 1 dargestellt ist. Wie dies aus dieser Figur hervorgeht, ermöglicht eine Erhöhung der Konzentration an Serin um den Faktor 10, ein bakterielles Wachstum zu erhalten, das in der Nähe dessen liegt, wie es mit dem Mueller-Hinton-Medium erhalten wird. Die Endkonzentrationen der Aminosäuren wurden, nachdem man deren Einfluß auf die Endbiomasse festgestellt hat, unter Bezug auf die Biomasse, die im Mueller-Hinton-Medium erhalten wird, definiert. Diese Untersuchung ist besonders gut bei Pseudomonas aeruginosa erläutert, deren Wachstum und deren Endbiomasse besonders stark von der Konzentration der Aminosäuren abhängt, wie dies in der Fig. 2 dargestellt ist.
Die mineralische Basis enthält Metallionen und Salze, deren Rolle von G. Gottschalk (Bacteriol. Metabolism, 2. Auflage, Seite 3, Springer Verlag, Berlin (1988)) beschrieben wurden. Die Metallionen sind Bor, Cobalt, Kupfer, Eisen, Mangan, Molybdn, Zink, die die Rolle von enzymatischen Cofaktoren spielen. Die ausgewählten Konzentrationen für die Ionen sind diejenigen, wie sie durch Neidhart definiert wurden (C. Neidhart et al., Culture Medium for Enterobacteria, Journal of Bacteriology, Sept., Seiten 736-747 (1974)). Mit Ausnahme von Eisen zieht das Weglassen der anderen Oligoelemente keine signifikante Wirkung auf das Wachstum der getesteten Bakterien nach sich, da die realisierten Dosierungen gezeigt haben, daß diese Elemente indirekt und in ausreichender Menge durch die anderen Bestandteile des kommerziell zur Verfügung stehenden Mediums beigebracht werden. Unter der Hypothese, daß immer reinere kommerzielle Produkte erhalten werden sollen, ist es selbstverständlich, daß man es bevorzugt, ein gesteuertes Hinzufügen der Mineralionen zu erhalten, um Minimalkonzentrationen sicherzustellen, die mit dem Wachstum der Bakterien kompatibel sind. Im Gegensatz dazu zeigt sich das Eisen als ein unumgänglicher hinzuzufügender Bestandteil, insbesondere für das Wachstum bestimmter Gattungen. Die Konzentration des Eisens im Medium, die relativ hoch ist, wurde dahingehend optimiert, um die Anfordernisse von P. aeruginosa und von Staphylokokken zu erfüllen, ohne das Wachstum der anderen Gattungen zu inhibieren. So können beispielsweise unterschiedliche Eisensalze im Medium enthalten sein, wie Eisenpyrophosphat, Eisenchlorid, Eisencitrat und Eisensulfat, und zwar unabhängig voneinander, oder in Kombination miteinander. Vorzugsweise ist erfindungsgemäßer Bestandteil das Pyrophosphatsalz.
Der Schwefel wird im wesentlichen durch das Sulfation beigebracht, das 45 % des im Medium vorhandenen Schwefels darstellt, manche Bakterien jedoch, die ihre Fähigkeit verloren haben, das Sulfation zu reduzieren, können andere reduzierte Bestandteile, die im Medium enthalten sind, verwenden, insbesondere Cystein und Methionin. Vorzugsweise ist das Sulfation des erfindungsgemäßen Mediums Kaliumsulfat. Die Konzentration an Sulfat wird so ausgewählt, wie sie durch Neidhart definiert wird.
Die Hauptquelle an Kalium (70 %) und an Phosphor (100 %) wird durch das zweibasische Kaliumphosphat beigebracht. Die Konzentration an Phosphat ist so ausgewählt, daß die Ausbildung von Niederschlägen mit Calcium- und Magnesiumionen vermieden wird, welche die optische Qualität des Mediums beeinflussen würden, und die Konzentration dieser beiden Ionen verändern würden. Die Konzentration wird so ausgewählt, wie sie durch Neidhart definiert wird.
Das Ammoniumion stellt eine Stickstoffquelle dar, wie sie von dem überwiegenden Anteil der Bakterien genutzt wird. Die Konzentration an Ammoniumionen wird unter Berücksichtigung der Konzentrationen der Aminosäuren definiert, die gleichermaßen als Stickstoffquelle von den Bakterien verwendet werden. Die chloridische Form ist bevorzugt, insbesondere im Hinblick auf phosphatische Formen, und zwar um ein zusätzliches Hinzufügen von Phosphationen zu verhindern.
Calcium- und Magnesiumionen sind die Cofaktoren von zahlreichen Enzymen und sind dafür bekannt, die Sensibilität gegenüber gewissen Antibiotika zu modifizieren, insbesondere der Aminoside gegenüber Pseudomonas (M. Christe et al. (1082) Susceptibilité du Pseudomonas aeruginosa aux aminosides: influence du calcium et du magnésium, Schweizerische Medizinische Wochenschrift, 112, 4, 241). Die Gehalte an Calcium- und Magnesiumionen des erfindungsgemäßen Mediums entsprechen den Normen, wie sie vom NCCLS für Antibiogramme befürwortet werden (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1990, Methods for dilution antimicrobial. susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard publication M7-A2: 10-11 Villanova Pa USA). Die gewichtsanteiligen Konzentrationen der Calcium- und Magnesiumionen sind 25 bzw. 12,5 mg/l. Die chloridischen Formen des Calciums und die chloridischen Formen des Magnesiums sind vorteilhafterweise bei den Bestandteilen des erfindungsgemäßen Mediums ausgewählt.
Das Natriumchlorid stellt die Hauptquelle an Natrium und Chlorionen dar. Die Konzentration an Natriumchlorid wurde dahingehend optimiert, daß die starken Anforderungen an Natrium von Proteus mirabilis und Vibrio parahaemolyticus, wie dies in Figuren 3 und 4 dargestellt ist, berücksichtigt wurden.
Die Vitamine und die Wachstumsfaktoren sind bedeutende Bestandteile für den Metabolismus der Bakterien. Die Rolle der Vitamine B&sub1;, B&sub2;, B&sub5;, B&sub6;, B&sub1;&sub2;, H und PP im Metabolismus von Bakterien sind in zahlreichen Arbeiten im "Manual of Methods for General Bacteriology" von Guirard und Snell (Biochemistry Factors in Growth, Teil 7 (1981)) beschrieben. Inositol, Cholin und Glycerin sind Precursoren von Zell-Lipiden in den Membran-Phospholipiden (siehe L.S. Klig et al. (1990) Phospholipid biosynthesis in Candida albicans: regulation by the precursors inosital and choline, Journal Bact. 178(8): 4407-4414). Die Konzentration an Folsäure, Liponsäure, Spermidin, Ethyloxalacetat und Tween 80 wurden besonders ausführlich für das erfindungsgemäße Medium untersucht.
Folsäure ist ein Coenzym, deren Bedeutung für das Wachstum von Enterokokken, insbesondere für die unterschiedlichen Stämme E. faecalis, E. faecium und E. hirae, wie dies nachfolgend beschrieben wird, bekannt ist. Dies ist beispielsweise bekannt, um die Aktivität der Antibiotika der Familien der Sulfamide und des Trimethoprims zu beeinflussen (R. Then et al., Mecanisme moleculaire de la bactéricidie; sulfamides et trimethoprime. Bactéricidie 1990, Editions Maloine, Paris). Die Konzentration an Folsäure wurde so ausgewählt, daß die Anforderungen der untersuchten Stämme erfüllt werden, und für deren Kompatibilität mit den Aktivitäten der Antibiotika, wie dies in den Figuren 12 und 13 dargestellt ist.
Die Konzentration der Liponsäure wurde so ausgewählt, daß dies die minimale Konzentration ist, um das Wachstum der Enterokokken und der Streptokokken der Gruppe B maximal zu verbessern. Fig. 6 zeigt die Wirkung von Liponsäure auf das Wachstum von Enterococcus faecalis.
Die Polyamine sind in den eukaryotischen und in den prokaryotischen Zellen enthalten und nehmen an zahlreichen biologischen Reaktionen teil, wie die Synthese von Nukleinsäuren und Proteinen (siehe C.W. Tabor und H. Tabor (1985) Polyamines in Microorganisms, Microbiol. Rev. 49: 81-99). Es wurden das Putrescin, das Spermin und das Spermidin untersucht. Aufgrund der Ergebnisse wurde Spermidin ausgewählt, insbesondere für das Wachstum von Proteus, Morganella, Providencia und Serratia, und zwar vorzugsweise in einer Konzentration von 0,7 mg/l. Fig. 7 zeigt die Wirkung von Spermidin auf das Wachstum von Proteus mirabilis.
Das Ethyloxalacetat wird bezüglich seiner stimulierenden Wirkung auf das Wachstum von zahlreichen Gattungen beschrieben (M.J. Pelczar und J.H. Brown (1951) Synthetic culture media for reference use in dairy bacteriology, Journal Milk Food Technol., 14: 90-91 und 97). Dessen Einfluß auf das Wachstum von Staphylococcus-Stämmen wurde unter Beweis gestellt, wie das in Fig. 8 gezeigt ist, und die Konzentration ist derart ausgewählt, daß man eine Verbesserung des Wachstums von Staphylokokken erzielt, ohne das Wachstum von anderen Gattungen zu inhibieren.
Das Tween 80 ist ein emulgierendes und dispergierendes Agens. Es kann das Biotin ersetzen, wie das durch A.C. Gretler et al. gezeigt wurde (Vitamine nutrition of the staphylococci with special reference to their biotin requirements (1954) Journal Bact. 70: 44-49). Es spielt gleichermaßen eine entgiftende und schützende Rolle, indem es mögliche toxische metabolitische Elemente des Mediums absorbiert (siehe RD. Klein et al. (Simplified media for growth of haemophilus influenzae for clinical and normal flora sources. Journal of General Microbiology. 113: 409-411 (1979)). Wie in Fig. 9 gezeigt, zieht ein Weglassen von Tween 80 im Medium eine Verringerung des Wachstums der unterschiedlichen Bakterienstämme nach sich.
Die Kohlenstoffquellen des erfindungsgemäßen Mediums werden im wesentlichen durch einen Zucker, vorzugsweise D- Glucose, und eine organische Säure, insbesondere Maleinsäure dargestellt. D-Glucose wurde aufgrund deren Verwendung oder Nichtverwendung durch eine große Anzahl von Bakterienstämmen beim fermentativen Metabolismus herangezogen (R.Y. Stanier et al. (1966) The aerobic Pseudomonas: a taxonomic study. Journal Gen. Microbiol. 43: 159-271). Dessen Konzentration im erfindungsgemäßen Medium wurde so ausgewählt, daß eine Biomasse erzielt wird, die in der Nähe derjenigen liegt, wie sie mit dem Mueller- Hinton-Referenzmedium erhalten wird. Die Maleinsäure ist für das Wachstum von nicht-glucidolytischen Gattungen notwendig, wie Alcaligenes faecalis, wie dies in Fig. 10 dargestellt ist, und Pseudomonas acidovorans. Sie erhöht gleichermaßen das Wachstum von Pseudomonas aeruginosa, das vorzugsweise Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet, wie das in Fig. 11 gezeigt ist. Die Konzentrationen an D-Glucose und an L-Maleinsäure sind so ausgewählt, daß sie den Qualitäten von Mueller-Hinton entsprechen.
Die purinischen und pyrimidinischen Basen können in verschiedenen Formen beigebracht werden, d.h. in Form von Precursoren, den freien Basen, als Nudeoside oder Nudeotiden. Die Untersuchungen an Hand des erfindungsgemäßen Mediums haben gezeigt, daß ein Hinzufügen der beiden Precursoren Hypoxanthin und Uracil nicht die Basisanforderungen der Enterokokken erfüllen. Die Nukleotiden ziehen eine Verminderung des Wachstums von zahlreichen Bakterienstämmen nach sich. Signifikante Verbesserungen konnten mit den Nukleosiden erzielt werden, und zwar in Abwesenheit von Thymidin unter Berücksichtigung dessen Inkompatibilität mit der Aktivität der Sulfamide und von Trimethoprim. Die Verhältnisse zwischen Purinen und Pyrimidinen wurden hinsichtlich derjenigen ausgewählt, wie sie von Neidhart für die Synthese von RNS beschrieben wurden (Neidhart et al. (1990) Physiology of the bacterial cell. A molecular approach. Sinauer associates inc. USA), und zwar unter Berücksichtigung der Abwesenheit von Thymidin, d.h. die Purine/Pyrimidine sind in einem Verhältnis zwischen 1,5 und 2,2 vorzugsweise in einem Verhältnis von 1,8 vorhanden. Die Endkonzentrationen wurden anschließend so optimiert, damit sie im wesentlichen das Wachstum von Staphylokokken und Enterokokken zufriedenstellend machen.
Der Puffer wurde so ausgewählt, daß er den Anforderungen der optischen Qualität des Mediums und dem pH entsprechen, der pH 7,4 ist einem Antibiogramm und dem Wachstum der Bakterien angepaßt. Die saure Form wird durch den MOPS-Puffer beigebracht, der insbesondere aufgrund seines pKa-Wertes von 7,2 (bei 20ºC) ausgewählt wurde, der nahe dem pH des Mediums liegt. Die Konzentration des MOPS-Puffers ist so ausgewählt, daß eine Pufferkapazität sichergestellt ist, die dem des Mueller-Hinton- Mediums aquivalent ist, ohne daß die Konzentration von 80 mM überstiegen wird, über die hinaus Inhibitionen des Bakterienwachstums von Neidhart beschrieben worden sind. Die basische Form wird insbesondere durch den Tris-Puffer beigebracht, der vorzugsweise eine Basenkraft wie Natriumhydoxyd aufweist, um das Hinzufügen von zusätzlichen Ionen auszuschließen. Die Konzentration im erfindungsgemäßen Medium bestimmt sich in Abhängigkeit des MOPS-Puffers und vom gewünschten endgültigen pH-Wert.
Die Anmelderin hat außerdem gezeigt, daß das Hinzufügen von Peptiden im erfindungsgemäßen Medium einen stimulierenden Effekt zeigt, insbesondere für das Wachstum von Enterokokken. Unter den untersuchten Peptiden haben solche, die eine Größe von geringer oder bis zu 15 Aminosäure haben, eine starke Erhöhung des Wachstums nach sich ziehen. Außerdem hat die Anmelderin gezeigt, daß das Hinzufügen von freien Aminosäuren, die diese Peptide bilden, und zwar in äquivalenten Konzentrationen, es nicht möglich machen, diesen stimulierenden Effekt zu erzeugen, wie das in Fig. 14 dargestellt ist. So ergibt insbesondere das Tetrapeptid Ala-Gly-Ser-Glu (SEQ ID NO: 1) eine beachtliche Verbesserung des Wachstums der unterschiedlichen Stämme von Enterococcus hirae und Enterococcus faecium, andere Peptide wie Glu-Asp-Arg-Pro-Pro-Leu-Phe-Gly-Gln-Gly-Thr-Val (SEQ ID NO: 2) und Ala-Ser-Asp-Ala-Lys-Ala-Tyr-Asp-Thr-Glu-Val (SEQ ID NO: 3) und zeigen interessante Ergebnisse bei anderen Enterokokken-Stämmen.

Beispiel 2: Herstellen des erfindungsgemäßen Mediums

Das erfindungsgemäße Medium kann beispielsweise ausgehend von sechs konzentrierten Mutterlösungen erhalten werden, die direkt aus den in Pulverform im Handel befindlichen Bestandteilen erhalten werden, wie sie im Katalog der Firma SIGMA aufgeführt sind und mit einer benötigten Menge an destilliertem Wasserverdünnt werden. Die Lösungen werden anschließend durch Filtration sterilisiert und in flüssiger oder fester Form bei -20ºC eingefroren. Die Mutterlösungen, nämlich Lösungen auf mineralischer Basis (5-fach konzentriert), Oligoelemente (10000-fach konzentriert), Aminosäuren (3-fach konzentriert), Nudeoside (8-fach konzentriert), wasserlösliche Vitamine (700- fach konzentriert), fettlösliche Vitamine (2000-fach konzentriert) werden dann miteinander vermischt, anschließend mit einer benötigten Menge destilliertem Wasser verdünnt und der Glucose, Maleinsäure und dem zweibasischem Kaliumphosphat hinzugefügt (Bestandteile, die durch die Firma SIGMA vertrieben werden). Falls es notwendig ist, wird der pH durch Hinzufügen von Soda oder Salzsäure eingestellt, um einen Wert in der Nähe von 7,4 zu erhalten. Die Reihenfolge, in der die unterschiedlichen Bestandteile zusammengemischt werden, ist nicht kritisch.

Beispiel 3: Vergleich der Ergebnisse, die mit dem erfindungsgemäßen Medium und mit dem Mueller-Hinton- Referenzmedium erhalten vurden

Zur Bestimmung der Sensibilität gegenüber Antibiotika wird eine Suspension von 0,5 MF (Mac Farland) in physiologischem Wasser aus Bakterienkolonien hergestellt, die von Petrischalen entnommen werden: die Erfassung wird auf einem Densitometer ATB 1550 durchgeführt, wie er von der Firma BIOMERIEUX (ATB ist eine Handelsmarke) angeboten wird. Die erhaltene Suspension wird in einem erfindungsgemäßen Medium und in einem Mueller- Hinton-Medium jeweils auf 1/100 verdünnt. VITEK-Karten (VITEK ist eine Handelsbezeichnung), die unterschiedliche Antibiotika mit 10 Konzentrationen enthalten, werden unter Vakuum in einer VITEK-Vorrichtung gefüllt, wie sie durch die Firma BIOMERIEUX- VITEK im Handel angeboten werden. Die Karten werden für 12 Stunden in einem Inkubator/Leser VITEK inkubiert, wie er durch die Firma BIOMERIEUX-VITEK in den Handel gebracht wird. Die Wachstumskinetika werden sichtbar gemacht, interpretiert und ein CMI-Äquivalent wird bestimmt (CMI-Äquivalent: Äquivalentkonzentration der minimalen Inhibierung, d.h. die kleinste Konzentration bei der kein bakterielles Wachstum mehr durch die Vorrichtung detektiert wird).
Die Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen 3 und 4 dargestellt.
IST bezeichnet das erfindungsgemäße Medium, MH bezeichnet das Mueller-Hinton-Medium. TABELLE 3 Ergebnisse an Gram-negativen Bakterien TABELLE 4 Ergebnisse an Gram-positiven Bakterien
*Für jedes Antibiotikum wurden in jedem der vorgenannten Bereiche eine Reihe an Konzentrationen, nämlich zwei untersucht.
S, I und R bezeichnen "sensibel", "zwischenliegend" und "resistent" bezüglich der kritischen Konzentrationen, wie sie durch das NCCLS definiert sind (National Committee for Clinical Laboratory Standards).
CDC: Center Disease Control (Atlanta, U.S.A).
UA und AP: Sammlung an Stämmen, wie sie durch J.P. Flandrois et al. beschrieben wurden: Antibiogramme automatisé" (1988) 1. Auflage, Walter Coussement - Brüssel.
ATCC: American Type Culture Collection (USA).
API: Gattungsbezeichnung BIOMERIEUX.
Aus den vorangegangenen Tabellen ergibt sich, daß eine Konkordanz der Ergebnisse bei einer mehr oder weniger naheliegenden Verdünnung existiert, was die Gleichwertigkeit der beiden Medien demonstriert, soweit es Antibiotika-Studien betrifft. Die Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Medium es ermöglicht, Stämme zu detektieren, die gegenüber Antibiotika eine Resistenzeigenschaft aufweisen.

Beispiel 4: Vergleich zwischen dem erfindungsgemäßen Medium und dem im EP-Patent 0 019 054 beschriebenen Medium

Das Medium des Standes der Technik wurde ausgänglich nach dem von Hall beschriebenen Verfahren hergestellt (M.J. Hall et al., Roche susceptibility test (RST) medium, a defined formulation for susceptibility testing II, Manufacture stability and use, Journal of Microbiological Method 2: 215-220 (1984)). Das Verfahren mußte leicht modifiziert werden, um den Niederschlägen, die Aminosäuren, Magnesiumglycerophosphat und Calciumgluconat enthalten, Rechnung zu tragen.
Vergleich des bakteriellen Wachstums:
Die jeweils untersuchten Stämme waren Enterobakterien, Pseudomonas aeruginosa, Staphylokokken, Enterokokken und Streptokokken der Gruppe B.
Ausgehend von aus Gelose isolierten Kolonien wurde eine Suspension hergestellt, auf 0,5 MF in physiologischem Wasser eingestellt (Densitometer ATB 1550). Die Suspension wird in physiologischem Wasser auf 1/10 verdünnt, anschließend im RST- Medium und im erfindungsgemäßen Medium auf ein weiteres 1/10 verdünnt, anschließend in 1 ml-Portionen in Kuvetten in den Kassetten der Vorrichtung M52 (durch die Firma ABBOTT in den Handel gebracht) verteilt. Die Kassetten wurden für 10 Stunden inkubiert und es wurde alle 5 Minuten eine Erfassung durchgeführt.
Wie das in Fig. 15 dargestellt ist, beobachtet man ein viel rascheres Wachstum von Streptokokken der Gruppe B mit einem erfindungsgemäßen Medium im Vergleich mit einem RST-Medium, wodurch es möglich ist, ein Antibiogramm nach fünfstündiger Inkubation zu erfassen, und zwar durch kinetische Wachstumsanalyse im Gegensatz zu den dazu benötigten neun Stunden bei einem Medium nach dem Stand der Technik.
Gleichermaßen ermöglicht die Wachstumskinetik von Enterokokken mit einem erfindungsgemäßen Medium es, ein Ergebnis eines Antibiogramms in fünf Stunden zu erhalten, wobei dieselben Bakterien mit einem Medium nach dem Stand der Technik nur schwierig ergriffen werden können. Dies ist deutlich aus Fig. 16 ersichtlich, die einen Vergleich des Wachstums eines Stammes E.faecium in dem IST- und in dem RST-Medium zeigt.

SEQUENZLISTE

1 ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
1i ANMELDER:
1iA NAME: BIO MERIEUX
1iB STRASSE:
1iC STADT: MARCY L'ETOILE
1iD STAAT ODER PROVINZ:
1iE LAND: FRANKREICH
1iF POSTLEITZAHL: 69280
1ii TITEL DER ERFINDUNG: Nährmedium für die Kultivierung von Mikroorganismen
1iii ZAHL DER SEQUENZEN: 3
1iv KORRESPONDENZANSCHRIFT:
1ivA NAME: Cabinet GERMAIN & MAUREAU
1ivB STRASSE: 20 Bd Eugene Deruelle
1ivC STADT: LYON
1ivD LAND: FRANKREICH
1ivE POSTLEITZAHL: 69003
1ivF TELEFON: 72 60 28 90
1ivG TELEFAX: 78 60 92 85
1v COMPUTERKENNDATEN:
1vA TRÄGER: 3,5 Zoll-Disketten DS, HD
1vB COMPUTER: EPSON (IBM-kompatibel)
1vC BETRIEBSSYSTEM: DOS
1vD SOFTWARE: MICROSOFT WORD FOR WINDOWS
1vi AKTUELLE ANMELDUNG:
1viA ANMELDETAG: 02/12/1994
1viB ANMELDENUMMER: EP 94 420 339.7
1vii FRÜHERE ANMELDUNG: 02/12/1993
1viiA ANMELDENUMMER: 93 14687
1viiB KLASSIFIZIERUNG:
1viii VERTRETER:
1viiiA NAME: CABINET GERMAIN & MAUREAU, Dominique GUERRE
1viiiB AKTENZEICHEN: MD/B 05 B 1878 EP
2 INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 1
2i CHARAKTERISTIKA DER SEQUENZ:
2iA LÄNGE: 4 Aminosäuren
2iB ART: Amonisäurensequenz
2ii MOLEKÜLART: Peptid
2vi URSPRUNG:
2viA ORGANISMUS:
2viB STAMM:
2vii DIREKTE QUELLE: bioMérieux S.A.
2viiA BIBLIOTHEK:
2xi BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 1
Ala Gly Ser Glu
1
2 INFORMATIONEN ZUR SEQUENZ ID NO: 2
2i CHARAKTERISTIKA DER SEQUENZ:
2iA LÄNGE: 12 Aminosäuren
2iB ART: Amonisäurensequenz
2ii MOLEKÜLART: Peptid
2vi URSPRUNG:
2viA ORGANISMUS:
2viB STAMM.
2vii DIREKTE QUELLE: biomerieux S.A.
2viiA BIBLIOTHEK:
2xi BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 2
Glu Asp Arg Pro Pro Leu Phe Gly Gln Gly Thr Val
1 5 10
2 INFORMATIONEN ZUR SEQUENZ ID NO: 3
2i CHARAKTERISTIKA DER SEQUENZ:
2iA LÄNGE: 11 Aminosäuren
2iB ART: Amonisäurensequenz
2ii MOLEKÜLART: Peptid
2vi URSPRUNG:
2viA ORGANISMUS:
2viB STAMM:
2vii DIREKTE QUELLE: bioMérieux S.A.
2viiA BIBLIOTHEK:
2xi BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ ID NO: 3
Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu Val
1 5 10

Claims

1. Nährmedium für die Kultivierung von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß es folgendes enthält, nämlich 7-70 mg/l L-Alanin, 8-80 mg/l L-Arginin, 5-50 mg/l L-Asparagin, 6-60 mg/l L-Asparaginsäure, 2-20 mg/l L-Cystein, 4-40 mg/l L-Glutamin, 8-80 mg/l L-Glutaminsäure, 7-70 mg/l Glycin&sub1; 2,5-25 mg/l L-Histidin, 6-60 mg/l L-Isoleucin, 9-90 mg/l L-Leucin, 9-90 mg/l L-Lysin, 4-40 mg/l L-Methionin, 5-50 mg/l L-Phenylalanin, 4-40 mg/l L-Prolin, 4-400 mg/l L-Serin, 5-50 mg/l L-Threonin, 2-20 mg/l L-Tryptophan, 4-40 mg/l L-Tyrosin, 8-80 mg/l L-Valin, 0,01-02 mg/l Biotin, 0,01-0,3 mg/l Calciumpantothenat, 0,001-0,01 mg/l Folsäure, 0,01-0,5 mg/l Inositol, 0,04-0,2mg/lvitaminpp, 0,02-0,3mg/lvitaminb&sub6;, 0,01-0,1 mg/l Thiaminchlorid, 0,005-0,05 mg/l Liponsäure, 0,1-5 mg/l Cholin, 1-10 mg/l Ethyloxalacetat, 0,1-1 mg/l Spermidin, 5-50 mg/l Tween 80, 11-110 mg/l Purin-Nudeoside bestehend aus Adenosin und Guanosin, die in einem Verhältnis vom ersten zum zweiten zwischen 0,8 und 1,2 enthalten sind, und 4-40 mg/l Pyrimidin- Nucleoside bestehend aus Cytidin und Uridin, in einem Verhältnis vom ersten zum zweiten zwischen 1 und 3 enthalten sind, wobei die Purin-Nucleoside und die Pyrimidin-Nucleoside in einem Verhältnis von den ersten zu den zweiten zwischen 1,5 und 2,2 vorhanden sind, 100-10000 mg/l Glucose, 100-10000 mg/l Malein säure, 0,020-0,583 mg/l Eisen, 49,3-493 mg/l Kalium, 1,2-12 mg/l Magnesium, 2,7-27,2 mg/l Calcium, 1,18-3,15 gil Natrium, 1820-5000 mg/l Chlor, 17,8-178,3 mg/l Phosphationen, 33,6-336, mg/l Ammoniumionen, 2000-20000 mg/l eines sauren Puffers und 1000-10000 mg/l eines basischen Puffers.

2. Medium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es folgendes enthält, nämlich 5-50 mg/l Adenosin, 3-30 mg/l Cytidin, 6-60 mg/l Guanosin, 1-10 mg/l Uridin, 0,2-5 mg/l Eisenpyrophosphat, 100-1000 mg/l zweibasiges Kaliumphosphat, 10-110 mg/l Magnesiumchlorid, 10-100 mg/l Calciumchlorid, 100-1000 mg/l Ammoniumchlorid, 3000-8000 mg/l Natriumchlorid.

3. Medium nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es darüber hinaus folgendes enthält, nämlich bis zu 0,022 mg/l Molybdän, bis zu 0,010 mg/l Cobalt, bis zu 0,027 mg/l Mangan, bis zu 0,007 mg/l Zink, bis zu 0,128 mg/l Kupfer, bis zu 0,088 mg/l Bor, bis zu 18,4 mg/l Sulfationen, bis zu 0,1 mg/l Riboflavin, bis zu 0,005 mg/l Cyanocobalamin, bis zu 0,1 mg/l Menadion, bis zu 0,5 mg/l Borsäure und/oder bis zu 5 mg/l Glycerin.

4. Medium nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es bis zu 0,04 mg/l Ammoniummolybdat, bis zu 0,04 mg/l Cobaltchlorid, bis zu 0,1 mg/l Manganchlorid, bis zu 0,03 mg/l Zinksulfat, bis zu 0,5 mg/l Kupfersulfat und/oder bis zu 100 mg/l Kaliumsulfat enthält.

5. Medium nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß (a) der saure Puffer der Puffer MOPS ist, und (b) der basische Puffer der Puffer Tris ist, und (c) daß es darüber hinaus 0,0005-0,005 mg/l Cyanocobalamin, 0,01-0,1 mg/l Menadion, 0,01-0,1 mg/l Riboflavin, 0,1-5 mg/l Glycerin, 0,0004-0,04 mg/l Ammoniummolybdat, 0,0004-0,04 mg/l Cobaltchlorid, 0,001-0,1 mg/l Manganchlorid und 0,0003-0,03 mg/l Zinksulfat enthält.

6. Medium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zumindest 65 mg/l Alanin, 73 mg/l L-Arginin, 43 mg/l L-Aspargin, 53 mg/l L-Asparaginsäure, 16 mg/l L-Cystein, 37 mg/l L-Glutamin, 73 mg/l L-Glutaminsäure, 66 mg/l Glycin, 22 mg/l L-Histidin, 54 mg/l L-Isoleucin, 84 mg/l L-Leucin, 89 mg/l L-Lysin, 33 mg/l L-Methionin, 44 mg/l L-Phenylalanin, 36 mg/l L-Prolin, 320 mg/l L-Serin, 43 mg/l L-Threonin, 17 mg/l L-Tryptophan, 36 mg/l L-Tyrosin, 70 mg/l L-Valin, 0,03 mg/l Biotin, 0,03 mg/l Calciumpantothenat, 0,005 mg/l Folsäure, 0,15 mg/l Inositol, 0,15 mg/l Vitamin PP, 0,15 mg/l Vitamin B&sub6;&sub1; 0,03 mg/l Riboflavin, 0,03 mg/l Thiaminchlorid, 0, Ol mg/l Liponsäure, 1,5 mg/l Cholin, 2,5 mg/l Glycerin, 5 mg/l Ethyloxalacetat, 0,75m9/lspermidin, lomg/ltween 80, lsmg/ladenosin, 10 mg/l Cytidin, 20 mg/l Guanosin, 6 mg/l Uridin, 750 mg/l Glucose, 500 mg/l Maleinsäure&sub1; 0,004 mg/l Ammoniummolybdat, 0,004 mg/l Cobaltchlorid, 0,016 mg/l Manganchlorid, 0,003 mg/l Zinksulfat, 1,8 mg/l Eisenpyrophosphat, 0,25 mg/l Kupfersulfat, 0,025 mg/l Borsäure, 50 mg/l Kahumsulfat, 230 mg/l zweibasisches Kaliumphosphat, 100 mg/l Magnesiumchlorid, 90 mg/l Calciumchlorid, 500 mg/l Ammoniumchlorid, 7500 mg/l Natriumchlorid, 15000 mg/l MOPS-Puffer, 7000 mg/l Tris-Puffer enthält, und daß es darüber hinaus 0,0008 mg/l Cyanocobalamin und 0,05 mg/l Menadion enthält.

7. Medium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zumindest ein Peptid in einer Konzentration zwischen 50 und 100 mg/l oder eine Mischung von Peptiden in einer Konzentration zwischen 50 und 1000 mg/l enthält, wobei die genannten Peptide eine Länge zwischen 4 und 15 Aminosäuren aufweisen.

8. Medium nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid ausgewählt ist aus den Peptiden, die die folgenden Aminosäuresequenzen aufweisen:

Ala-Gly-Ser-Glu (SEQ ID NO: 1)

Glu-Asp-Arg-Pro-Pro-Leu-Phe-Gly-Gln-Gly-Thr-Val

(SEQ ID NO: 2)

und

Ala-Ser-Asp-Ala-Lys-Ala-Tyr-Asp-Thr-Glu-Val

(SEQ ID NO: 3).

9. Medium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es darüber hinaus einen Rinderextrakt in einer Konzentration von vorzugsweise zwischen 2 und 10 g/l enthält.

10. Medium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ein gelbildendes Agens, insbesondere Agarose enthält, und zwar in einer Konzentration von etwa 10000 mg/l.

11. Verwendung des Mediums nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Bestimmung der Aktivität eines therapeutischen Wirkstoffes, der gegen einen infektiösen Mikroorganismus aktiv ist.