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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung von optisch-aktiven 2-Aryloxy- oder
2-Alkylthioalkansäuren der allgemeinen Formel:
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mittels enantioselektiver Hydrolyse der entsprechenden
racemischen Amide.
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In der Formel (I) bedeutet
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. Ar einen aromatischen Rest, der gegebenenfalls durch
mindestens eine Alkyl- oder Alkoxygruppe, ein Halogenatom oder
eine Hydroxygruppe substituiert ist, wobei die Alkyl- oder
Alkoxygruppen vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatome
enthalten;
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. A ein Sauerstoff- oder Schwefelatom;
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. R eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.
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Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die
Herstellung der R(+) Enantiomeren der 2-Aryloxy- oder
2-Arylthioalkansäuren der allgemeinen Formel (I).
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Noch spezieller betrifft die vorliegende Erfindung die
Herstellung der R(+) Enantiomeren der 2-Phenoxy- oder
2-Phenylthiopropionsäuren der allgemeinen Formel (II):
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in der Ar die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) hat.
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Die vorliegende Erfindung betrifft noch weiter im Speziellen
die Herstellung der R(+) 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure.
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Es wurde nun gefunden, und dies ist Gegenstand der
vorliegenden Erfindung, daß die 2-Aryloxy- oder 2-Arylthioalkansäuren
der allgemeinen Formel (I) in der Form R durch
enantioselektive Hydrolyse der entsprechenden racemischen Amide,
gegebenenfalls in situ hergestellt, mit Hilfe eines Mikroorganismus
oder eines aus diesem Mikroorganismus hervorgegangenen Enzyms
erhalten werden können, wobei der Mikroorganismus
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- unter den Stämmen der Gattungen Brevibacterium und
Corynebacterium ausgewählt wird, und
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- eine Nitrilase-Aktivität besitzt, die mit der Fähigkeit
assoziiert ist, enantioselektiv das racemische
α-Phenylpropionamid zu S(+) α-Phenylpropionsäure mit einem
enantiomeren Überschuß von mehr als 65% zu hydrolysieren.
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Die Auswahl der erfindungsgemäßen Mittel, die die
enantioselektive Hydrolyse der racemischen 2-Aryloxy- oder
2-Arylthioalkansäuren der allgemeinen Formel (I) ermöglichen, wird
ausgeführt, indem das Mittel bzw. Agens mit racemischem
α-Phenylpropionamid in geeignetem Medium zusammengebracht wird, bis
20% des Produktes umgewandelt sind, worauf dann der
enantiomere Überschuß gemessen wird.
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Die besonders geeigneten Mikroorganismen werden ausgewählt
unter Brevibacterium R312 (CBS 717.73) und Corynebacterium N711
(FERM P 4445) oder Corybacterium N774 (FERM P 4446), mit deren
Hilfe die S 2-Arylalkansäuren mit einem enantiomeren überschuß
an Isomeren S von allgemein mehr als 90%, ausgehend von dem
entsprechenden Amid, erhalten werden können.
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Es ist überraschend festzustellen, daß unter diesen
Mikroorganismen Brevibacterium R312, von dem in der FR-PS 7 901 803/2
447 359 und in "Advances in Biochemical Engineering ", Bd. 14,
S. 1-32 (1980) gesagt wird, daß es eine allgemein nicht
stereospezifische Amidase besitzt, die Amide der racemischen 2-
Arylalkansäuren spezifisch hydrolysiert, während seine mutante
A4, die eine L stereospezifische Amidase besitzt, die Amide
der racemischen 2-Arylalkansäuren nicht hydrolysiert.
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Es muß festgestellt werden, daß Corynebacterium N771 und
Corybacterium N774, die in der EP 0 187 680 beschrieben werden,
beispielsweise Lactonitril zu D, L Milchsäure und
α-Aminophenylpropionitril zu D, L-Phenylalanin hydrolysieren, ohne
daß Stereoselektivität beobachtet wird.
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Erfindungsgemäß wird das Verfahren allgemein in einem
homogenen oder heterogenen wässrigen oder wässrig-organischen Medium
unter Bedingungen der Temperaturen und des pH-Wertes
ausgeführt, die in Abhängigkeit von der Beschaffenheit des
Mikroorganismus und des Enzyms gewählt werden, indem eine Suspension
von Zellen oder Zellextrakten des Mikroorganismus und das Amid
der racemischen 2-Aryloxy- oder 2-Arylthioalkansäure in
Bewegung gehalten wird.
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Das Verfahren führt zu einem Gemisch der R 2-Aryloxy- oder 2-
Arylthioalkansäure und des Amids der S 2-Aryloxy- oder
2-Arylthioalkansäure. Abschließend wird bei dem Verfahren die Säure
in der R-Form von dem Amid in der S-Form abgetrennt.
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Der verwendete Mikroorganismus besitzt die Eigenschaft,
Nitrile zu hydrolysieren, assoziiert mit der Eigenschaft,
enantioselektiv α-Phenylpropionamid zu hydrolysieren. Unter diesen
Bedingungen ist es möglich, eine R 2-Phenoxy- oder
2-Phenylthioalkansäure, ausgehend von dem Nitril der racemischen 2-
Phenoxy- oder 2-Phenylthioalkansäure oder ausgehend von dem
Amid der racemischen 2-Phenoxy- oder 2-Phenylthioalkansäure zu
erhalten.
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Die folgenden Beispiele, die keine Einschränkung darstellen,
zeigen, wie die Erfindung in der Praxis ausgeführt werden
kann.
BEISPIEL 1
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a) Der Stamm Brevibacterium R312 (CBS 717.73) wurde im
Schüttelkolben bei 28ºC während 14 Stunden in einem Medium
gezüchtet, dessen Zusammensetzung wie folgt lautet:
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- Glucose 10 g
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- (NH&sub4;)&sub2;S0&sub4; 5 g
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- KH&sub2;PO&sub4; 1,01 g
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- Na&sub2;HPO&sub4;, 12H&sub2;0 1,64 g
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- K&sub2;HPO&sub4; 0,82 g
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- CaCl&sub2;, 2H&sub2;0 0,012 g
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- ZnCl&sub2; 0,0012 g
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- FeSO&sub4;, 7H&sub2;0 0,0012 g
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- MnSO&sub4;, H&sub2;O 0,0012 g
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- MgSO&sub4;, 7H&sub2;0 0,5 g
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- Thiamin-chlorhydrat 0,002 g
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- Wasser ad 1000 ml
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Diese Vorkultur wurde verwendet, um ein Kulturmedium gleicher
Zusammensetzung, das aber N-methylacetamid in einer
Konzentration von 20 mM enthielt, zu beimpfen. Die Kultur bzw. Züchtung
erfolgte im Schüttelkolben während 24 Stunden bei 28ºC. Die
erhaltene Biomasse wurde abzentrifugiert und dann zweimal mit
einer Lösung gewaschen, die 9 g Natriumchlorid pro Liter
enthielt.
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b) Ein Zentrifugenrückstand, der 13 mg Zellen von
Brevibacterium R312, ausgedrückt als Trockensubstanz, enthielt, wurde
in 2 ml Phosphatpuffer (50 mM) bei pH = 7 suspendiert. Es
wurden 25 mg racemisches 2-Phenylpropionnitril zugesetzt
(190 umol). Nach 24-stündigem Rühren bei 25ºC wurde das
Reaktionsgemisch durch Zugabe von 23 ml eines Gemisches aus
Acetonitril und n-Chlorwasserstoffsäure (90:10
Volumenteile) verdünnt. Die Bakterien wurden abzentrifugiert. Die
Zusammensetzung des überstands wurde durch Hochleistungs-
Flüssigchromatographie (HCLP) bestimmt.
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Der Überstand enthielt:
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119 umol 2-Phenylpropionamid und
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62 umol 2-Phenylpropionsäure
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Es wurde Natriumchlorid zugesetzt, um die Trennung der
wässrigen und der organischen Phasen zu begünstigen. Nach
dem Eindampfen der organischen Phase wurde der Rückstand
mit 20 ml eines Gemisches aus Chloroform und 0,1 M
Natriumlauge (1:1 Volumenteile) aufgenommen.
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Die basische Phase wurde angesäuert und dann mit Chloroform
extrahiert.
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Die Messung des Drehungsvermögens zeigte, daß der
enantiomere Überschuß an Isomerem S(+) 100% betrug.
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Nach dem Überführen der 2-Phenylpropionsäure in ein Derivat
mit R(+) α-Methylbenzylamid zeigte die HCLP-Analyse, daß
der enantiomere Überschuß 96,4% betrug.
BEISPIEL 2
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Ein Zentrifugierrückstand, der 1,33 mg Zellen von
Brevibacterium R312, ausgedrückt als Trockensubstanz, enthielt, wurde in
2 ml Phosphatpuffer (50 mM) bei pH = 7,0 suspendiert.
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Es wurden 32,6 mg racemisches 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionamid
(0,180 mmol) zugesetzt. Nach 24-stündigem Schütteln bei 25ºC
wurde das Reaktionsgemisch durch Zugabe von 23 ml eines
Gemisches aus Acetonitril und n Chlorwasserstoffsäure (90:10
Volumenteile) verdünnt. Die Bakterien wurden abzentrifugiert. Die
Zusammensetzung des Überstands wurde mit
Flüssigkeit-Hochleistungschromatographie (HCLP) bestimmt:
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0,0884 mmol 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionamid
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0,0864 mmol 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure
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Es wurde Natriumchlorid zugesetzt, um die Trennung der
organischen und der wässrigen Phasen voneinander zu begünstigen.
Nach dem Eindampfen der organischen Phase zur Trockne wurde
der Rückstand mit 10 ml Ethylacetat und 6 ml einer wässrigen
Lösung von Natriumhydrogencarbonat, 10% Gewicht/Volumen,
aufgenommen. Die wässrige Lösung wurde nach dem Dekantieren mit
zweimal 10ml Ethylacetat extrahiert. Dann wurde die wässrige
Lösung mit einer n Salzsäurelösung auf pH = 1,0 angesäuert und
dann mit dreimal 10 ml Ethylacetat extrahiert. Die organischen
Phasen, die die Säure enthielten, wurden über Natriumsulfat
getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in
Aceton aufgenommen. Die Messung des Drehungsvermögens dieser
acetonischen Lösung zeigte, daß der enantiomere Überschuß 99%
Isomer R(+) entsprach.
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Nach der Überführung der 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure in
ein Derivat mit R(+) c -Methylbenzylamid zeigte die
HCLP-Analyse, daß der enantiomere Überschuß 94% Isomer R(+) ergab bzw.
entsprach.
BEISPIEL 3
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a) Im Schüttelkolben wurde bei 28ºC während 24 Stunden der
Stamm Corynebacterium N771 (FERM P 4445) in einem Medium
der folgenden Zusammensetzung kultiviert:
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- Hefeextrakt 3g
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- Malzextrakt 3g
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- Lactopepton 5g
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- Glucose 10 g
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- FeSO&sub4;, 7H&sub2;0 0,1 g
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- Wasser ad 1 Liter
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dessen pH-Wert durch Zugabe von Natronlauge vor der
Sterilisation auf 7,5 eingestellt worden war.
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Diese Vorkultur wurde verwendet, um ein Medium gleicher
Zusammensetzung zu 1/40 zu beimpfen.
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Nach 24-stündigem Inkubieren bei 28ºC im Schüttelkolben
wurde die Biomasse abzentrifugiert und dann zweimal mit
einer wässrigen Natriumchloridlösung, 9 g je Liter,
gewaschen.
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b) Ein Zentrifugierrückstand, der 11,3 mg Zellen von
Corynebacterium N 771, ausgedrückt als Trockensubstanz, enthielt,
wurde in 2 ml Phosphatpuffer (50 mM) vom pH = 7
suspendiert. Darauf wurden 34 mg racemisches
2-(4-Hydroxyphenoxy)propionamid (0,187 mmol) zugesetzt und dann während 24
Stunden bei 25ºC geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde
unter den Bedingungen des Beispiels 2 behandelt bzw.
aufgearbeitet.
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Der Überstand enthielt:
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0, 083 mmol 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionamid
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0,079 mmol 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure.
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Die enantiomeren Überschüsse der
2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure, gemessen durch das Drehungsvermögen und
nach Derivatisieren mit R(+) α-Methylbenzylamin, betrugen
95% bzw. 91% an Isomerern R(+).
BEISPIEL 4
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Die Zellen von Corybacterium N774 wurden unter den in Beispiel
3a) für die Herstellung eines Rückstandes aus Zellen von
Corynebacterium N771 beschriebenen Bedingungen hergestellt.
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Ein Zentrifugierrückstand, der 10,8 mg Zellen von
Corynebacterium N774, ausgedrückt als Trockensubstanz, enthielt, wurde in
2 ml Phosphatpuffer (50 mM) vom pH = 7 suspendiert.
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Es wurden 34,5 mg racemisches 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionamid
(0,190 umol) zugesetzt und dann 24 Stunden bei 32ºC
geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde unter den Bedingungen des
Beispiels 1 aufgearbeitet.
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Der Überstand enthielt:
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0,078 mmol 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionamid
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0,080 mmol 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure.
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Die enantiomeren Überschüsse der
2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure, gemessen durch das Drehungsvermögen und nach
Derivatisierung mit R(+) c -Methylbenzylamin, betrugen 95% bzw. 92% an
Isomeren R(+).