DE68916087T2

DE68916087T2 - System der induzierbaren positiven Regulation zur Verwendung für die Herstellung von heterologen Proteinen.

Info

Publication number: DE68916087T2
Application number: DE68916087T
Authority: DE
Inventors: Roy Gross; Rino Rappuoli
Original assignee: Sclavo SpA
Current assignee: Sclavo SpA
Priority date: 1988-04-08
Filing date: 1989-04-06
Publication date: 1994-12-01
Anticipated expiration: 2009-04-07
Also published as: HK192795A; CA1338757C; IT1224254B; EP0336413A1; IT8820133A0; JPH0265784A; DE68916087D1; ATE107358T1; EP0336413B1

Description

Die Erfindung betrifft ein neues System einer induzierbaren positiven Regulation, das zur Kontrolle der großtechnischen Polypeptidherstellung durch mikrobielle Expression heterologer Gene fähig ist.
Die Erfindung bezieht sich auch auf rekombinante Vektoren, die das Regulationssystem oder Bestandteile davon umfassen, sowie auf Mikroorganismen, die durch die Vektoren transformiert sind.
Durch Fermentationsverfahren unter Nutzung von Mikroorganismen, die durch rekombinante DNA-Methoden transformiert wurden, ist es als Folge der jüngsten Entwicklungen in der Gentechnologie möglich geworden, bekannte oder neue Moleküle herzustellen, die sich zur Verwendung in der Heilbehandlung, bei Lebensmitteln oder in der Landwirtschaft eignen.
Diese Verfahren umfassen gewöhnlich:
(a) Isolierung des DNA-Gens oder des Fragments, weiches das Gen umfaßt, das das Protein von Interesse codiert;
(b) Insertion des Gens in einen Clonierungsvektor und Isolierung des rekombinanten Vektors mit der Fähigkeit zur Expression des clonierten Gens;
(c) Transformation eines Wirtsmikroorganismus mittels des rekombinanten Vektors, und schließlich
(d) Züchtung des transformierten Mikroorganismus in einer geeigneten Umgebung zur Herstellung des Polypeptides, das vom clonierten Gen codiert wird.
Ein wichtiger Faktor bei der Anwendung des vorstehenden Verfahrens ist der Clonierungsvektor, der unter Plasmiden, Phagen oder Cosmiden ausgewählt werden kann. Vorzugsweise wird das Plasmid verwendet, ein zirkuläres DNA- Molekül mit der Fähigkeit zur selbständigen und vorteilhaften Replikation, das die Gene für Antibiotikaresistenz enthält und die Identifizierung der Zellen erleichtert, die mit den vorstehenden Plasmiden transformiert sind. Diese Zellen wachsen auch in Antibiotika enthaltenden selektiven Medien.
Die Plasmide können auch in bestimmter Weise mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten werden, wobei jedes davon eine andere Stelle in der Plasmid-DNA erkennt.
Heterologe Gene oder diese Gene enthaltende DNA-Fragmente werden daher in den Plasmiden in die Spaltstelle eingesetzt.
Der Begriff "heterolog" bezieht sich auf ein Gen, das normalerweise im Plasmid nicht vorhanden ist, oder auf ein Polypeptid, das normalerweise nicht von einem Mikroorganismus produziert wird, der damit transformiert ist.
Die sich daraus ergebenden rekombinanten oder Hybridplasmide können dann durch die Verfahren der Transformation oder Conjugation in einen Wirtsmikroorganismus eingeführt werden.
Wenn das Gen in das Plasmid in korrekter Weise bezüglich des Bereiches eingesetzt ist, welcher seine Transkription und Translation kontrolliert, kann das resultierende Hybridplasmid zur Produktion oder Expression des vom Gen codierten Polypeptids verwendet werden.
"Transkription" wird als der Mechanismus definiert, über den die genetische Information aus DNA auf Boten-RNA (mRNA) übertragen wird, während "Translation" die Information bedeutet, wodurch gemäß den Gesetzen des genetischen Codes die genetische Information aus der mRNA an das Protein weitergegeben wird.
Demgemäß kennzeichnet der Begriff "Expression" das Verfahren, wodurch die in der DNA enthaltene genetische Information zur Produktion des Proteins verwendet wird.
Transkription wird durch das in den Zellen vorhandene Enzym der DNA- abhängigen RNA-Polymerase ermöglicht und beginnt in einem als Promotor bekannten Bereich, der eine Erkennungsstelle und eine Enzymanheftungsstelle enthält.
Die RNA-Polymerase, welche die Anheftungsstelle verläßt und die Doppelhelix fortschreitend öffnet, bewegt sich in 3'-> 5'-Richtung der Matrizenhelix, während die Polymerisierung der Ribonucleotide in 5'-> 3'-Richtung weitergeht. Während die Polymerase sich vorwärts bewegt, geht die transkribierte DNA in die Doppelhelix-Struktur zurück.
Das resultierende RNA-Molekül (mRNA), das die codierenden Nucleotide für die Ribosomenanheftungsstelle (RBS) und die Proteintranslations-Startsequenz ATG umfaßt, wird dann durch die Ribosomen gebunden.
Die Information in der mRNA wird auf diese Weise von der Zelle zur Synthese des Proteins verwendet.
Das exprimierte Protein wird dann aus den transformierten Zellen oder dem Kulturmedium gewonnen und hat die Form eines reifen Proteins oder eines Fusionsproteins, d.h. umfaßt die Aminosäuresequenz des Proteins von Interesse sowie eine Fremdsequenz an dessen Aminoende.
Mittels transformierter bakterieller Zellen kann die Gentechnik bei der industriellen Herstellung von Proteinen unterschiedlicher Abstammung eine wichtige Rolle spielen.
Das ist z.B. der Fall bei Human-Insulin, Interferon, dem Wachstumshormon und Produkten, die zur Entwicklung von Impfstoffen verwendet werden, wie z.B. das Pertussistoxin.
Verfahren, die durch rekombinante DNA-Methoden transformierte Mikroorganismen verwenden, weisen dennoch hauptsächlich wegen niedriger Produktionsraten Beschränkungen auf, weshalb solche Verfahren einen geringen industriellen Nutzen haben.
Das kann auf die Unwirksamkeit des Promotors zurückzuführen sein oder auf die vorzeitige Zerstörung der mikrobiellen Zellen in dem Fall, daß die exprimierten Polypeptide für den Mikroorganismus letal oder schädlich sind.
Auf dem Fachgebiet sind deshalb Regulationssysteme zur Verwendung bei der Konstruktion rekombinanter DNA-Moleküle vorgeschlagen worden, um die Expression der Gene zu verbessern, so daß die von den Genen codierten Polypeptide in hohen Ausbeuten produziert werden können.
Bekanntlich können genetische Regulationsmechanismen im negativen und im postiven Sinn wirken.
Gegenwärtig ist sehr wenig über den positiven Regulationsmechanismus und die von der Zelle verwendeten Kontrollsysteme bekannt, während es zahlreiche bekannte Systeme mit negativer Regulation gibt, von denen einige zur Expression heterologer Proteine durch Konstruktion rekombinanter Plasmide verwendet worden sind.
Dennoch besitzen die bekannten Systeme Nachteile wegen der Anwesenheit schwacher Promotoren oder der Notwendigkeit, große Induktormengen im Kulturmedium zu verwenden.
Jetzt ist ein neues System positiver Regulation gefunden worden, das durch geeignete Auswahl des Kulturmediums und der Wachstumsbedingungen leicht induziert werden kann und das für die Produktion von heterologen Proteinen in hohen Ausbeuten geeignet ist.
Ein erfindungsgemäßes Ziel ist deshalb ein neues System einer induzierbaren positiven Regulation, das sich zur Verwendung bei der Konstruktion eines Vektors eignet, welcher durch Expression repliziert und bei der Produktion heterologer Proteine über transformierte Mikroorganismen verwendet werden kann.
In den Vektoren, die durch Expression repliziert werden können, werden das Regulationssystem oder Bereiche davon in geeigneter Weise an ein heterologes Gen gebunden, welches das Protein von Interesse codiert.
Die Erfindung betrifft auch Vektoren, die durch Expression repliziert werden können und das Regulationssystem umfassen, sowie auf Mikroorganismen, die durch diese Vektoren transformiert sind.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur kontrollierbaren Produktion eines Polypeptids, das von Interesse ist, in hohen Ausbeuten unter Verwendung von Mikroorganismen und des vorstehenden Systems. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Regulationssystems und/oder dessen Bestandteilen für die Konstruktion van replizierbaren Vektoren zur Herstellung von heterologen Proteinen durch Expression.
Erfindungsgemäß enthält das induzierbare positive Regulationssystem den vir- Bereich, einen zwischen der EcoRI- und der XhoI-Stelle des Bordetella- Chromosoms liegenden Bereich von etwa 4,5 kb, enthaltend die die Regulationsfaktoren codierenden Gene BvgA, BvgB und BvgC sowie einen terminalen 5'-Bereich, der vor einem Gen liegt, das ein Bordetella-Protein codiert, das durch die vorstehenden Regulationsfaktoren in trans aktiviert oder reprimiert werden kann.
Im besonderen sind die durch den regulierenden Faktor und/oder die Faktoren in trans aktivierten terminalen 5'-Bereiche diejenigen, die vor einem Gen (i) liegen, das eines der von Bordetella produzierten virulenten Proteine codiert.
Im besonderen ist das genannte Bordetella Bordetella pertussis, wenn der terminale 5'-Bereich die Sequenz ist, die stromaufwärts vom Promotor des das Pertussistoxin (PT) codierenden Operons liegt.
Die terminalen Bereiche, die durch die regulierenden Faktoren inhibiert werden können, sind die Sequenzen, die stromaufwärts von einem Gen liegen, das ein nichtvirulentes Protein codiert.
Z.B. umfaßt der im chromosomalen DNA-Fragment von Bordetella enthaltene nichtcodierende terminale 5'-Bereich die codierende Nucleotidsequenz für den aminoterminalen Teil von FHA (vgl. Beispiel 7).
Durch Verwendung von Temperaturen von 35ºC oder ungefähr in diesem Bereich und/oder von einem Kulturmedium, das frei von modulierenden Stoffen ist, wie z.B. MgSO&sub4;, NaCl oder Nicotinsäure, wird erfindungsgemäß der nachstehend Regulationsbereich genannte vir-Bereich von Bordetella vollständig induziert.
Der Begriff "vollständige Induktion" bedeutet das Potential des vorstehenden Bereiches zur Produktion des regulierenden Faktors und/oder der Faktoren, welche die Produktion heterologer Proteine durch Aktivierung eines aktivierbaren terminalen 5'-Bereiches in trans induzieren.
Durch Verwendung eines auch die vorstehenden modulierenden Stoffe enthaltenden Kulturmediums und/oder bei Raumtemperaturen (20-25ºC) kann erfindungsgemäß der Regulationsbereich leicht reprimiert werden.
Unter diesen Bedingungen befindet sich das System im nichtaktivierten Zustand und produziert nicht den regulierenden Faktor und/oder die Faktoren und folgerichtig können nun die terminalen 5'-Bereiche, die durch diese Faktoren inhibiert wurden, dem unmittelbar stromabwärts gelegenen Promotor die Fähigkeit verleihen, die Expression des unter seiner Kontrolle stehenden Gens zu steuern.
Erfindungsgemäß hat der vir-Bereich die vorteilhafte Fähigkeit, daß er sich induzieren oder reprimieren läßt, wenn er entweder als einzelne Kopie im Genom eines Wirtsorganimus vorhanden ist oder in einer Anzahl von Kopien als ein extrachromosomales Element eingebaut ist.
Das erfindungsgemäße Regulationssystem ist deshalb besonders nützlich für die kontrollierte Polypeptidproduktion in hohen Ausbeuten unter Verwendung von Mikroorganismen, die durch rekombinante Vektoren unter Verwendung des vorliegenden Systems transformiert worden sind.
Im besonderen können rekombinante Vektoren konstruiert werden, indem ein terminaler 5'-Bereich oder Fragmente davon entweder allein oder in Verbindung mit einem den vir-Bereich umfassenden DNA-Fragment in geeigneter Weise in einen Clonierungsvektor eingebaut werden, der unter denjenigen gewählt wird, die auf dem Fachgebiet im allgemeinen verwendet werden.
Wenn aus der Bordetella-Gruppe ausgewählte Wirtsmikroorganismen verwendet werden, enthält der verwendete rekombinante Vektor vorzugsweise nur den terminalen 5'-Bereich.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform können deshalb rekombinante Vektoren durch geeignete Einführung eines terminalen 5'-Bereiches in einen Clonierungsvektor hergestellt werden, wobei sich der Bereich durch den regulierenden Faktor und/oder die Faktoren sowohl in Verbindung mit als auch nicht in Verbindung mit dem vir-Bereich in trans aktivieren läßt, sowie durch Positionierung des Bereiches stromabwärts von einem das Protein von Interesse codierenden Gen. In diesem Fall wird das heterologe Protein exprimiert werden, indem Mikroorganismen, die durch die Vektoren transformiert sind, bei Abwesenheit modulierender Stoffe im Kulturmedium und bei Temperaturen von 35ºC oder ungefähr in diesem Bereich gezüchtet werden.
Nach einer anderen Ausführungsform können rekombinante Vektoren konstruiert werden, indem ein durch den regulierenden Faktor und/oder die Faktoren inhibierbarer terminaler 5'-Bereich in Verbindung mit oder ohne die den vir-Bereich von Bordetella enthaltende Sequenz verwendet wird.
In diesem Fall wird das stromabwärts vom terminalen 5'-Bereich liegende heterologe Gen exprimiert, indem Mikroorganismen, die durch den Vektor transformiert sind, in Gegenwart der modulierenden Verbindungen und bei Raumtemperaturen (20-25ºC) gezüchtet werden.
Das zur Konstruktion von Expressionsvektoren verwendete Verfahren besteht in der Clonierung des Systems in einem Vektor und der Positionierung eines das gewünschte Protein codierenden Gens stromabwärts vom terminalen 5'- Bereich.
Erfindungsgemäß kann das heterologe Gen unter die Kontrolle homologer oder heterologer Promotoren gestellt werden, die keiner Regulation unterworfen sind und die durch den Einbau der erfindungsgemäßen regulierenden Sequenzen reguliert werden können.
Die sich daraus ergebenden rekombinanten Vektoren werden dann zur Transformation eines Wirtsmikroorganismus verwendet.
Die zur Expression heterologer Proteine durch das erfindungsgemäße System verwendeten Mikroorganismen werden aus E.coli, B.subtilis und Bordetella ausgewählt. Die bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform wird in bezug auf E.coli und Bordetella beschrieben.
Die Erfindung umfaßt auch den Nachweis und die Beschreibung des terminalen 5'-Bereiches des Promotorbereiches, der stromaufwärts vom Promotor des Pertussintoxin (PT)-Operons von B.pertussis liegt, welcher durch den vir- Regulationsbereich in trans aktiviert werden kann und fähig ist, die Transkription des stromabwärts vom letztgenannten Bereich eingebauten Strukturgens anzuregen.
Das Pertussintoxin (PT) ist ein aus fünf verschiedenen Untereinheiten zusammengesetztes Protein, das in der Virulenzphase oder Phase I nur von Bordetella pertussis produziert wird, einem beim Menschen Pertussis (Keuchhusten) verursachenden Bakterium.
Die anderen zwei Arten, B. parapertussis und B. bronchiseptica. enthalten die für ein funktionell wirksames PT codierenden Gene, sind aber nicht fähig, diese zu exprimieren ( B. Arico and R. Rappuoli, J. Bacteriol. 169, (1987) 2847- 2853).
Die gleichzeitig noch anhängige italienische Patentanmeldung A/86 Nr.19208 beschreibt und beansprucht die Clonierung und Sequenzierung des oder der für PT von B. pertussis codierenden Gene und zeigt, daß die für die einzelnen PT-Untereinheiten codierenden Gene in einem einzigen Operon vereinigt sind.
Im Ergebnis der Sequenzanalyse des vorstehenden Operons ist der Promotor als Bereich definiert worden, der sich von der Transkriptionsstartstelle etwa 40 bp entfernt befindet und die Consensus-Sequenzen -35 und -10 umfaßt, die den Promotorensequenzen von E.coli sehr ähneln.
Man hat jedoch gefunden, daß E.coli-Zellen, die mit dem das PT-Operon umfassenden Plasmid PT101 transformiert sind, das Pertussistoxin in extrem niedrigen Mengen produzieren. Das Plasmid PT101 wurde am 10.Oktober 1988 bei der "American Type Culture Collection" hinterlegt und es wurde ihm die Hinterlegungsnummer ATCC 67854 zugewiesen.
Das zeigt, daß der von uns definierte Promotor im Fall dieses Mikroorganismus unwirksam war, obwohl er die Sequenzen besaß, die von der DNA-abhängigen RNA-Polymerase erkannt werden.
Erfindungsgemäß und um den Bereich oder die Bereiche zu definieren, die zur PT-Expression notwendig sind, wurde das den PT-Promotor und dessen terminalen 5'-Bereich umfassende 539 bp große EcoRI-HindIII-DNA-Fragment aus dem Plasmid PT101 ATCC 67854 isoliert. Deletionsmutanten wurden dann durch partielle Spaltung des Fragments mit Ba131-Exonuclease hergestellt (R.J. Legerski et al. , Nucl. Acids Res. 5, (1978) 1445), um bestimmte Sequenzen aus dem Bereich stromaufwärts vom PT-Promotor zu entfernen.
In der Praxis wurde das gereinigte Fragment dann durch allgemein bekannte Verfahren in einen vorher mit geeigneten Restriktionsenzymen gespaltenen Clonierungsvektor eingeführt.
Vorzugsweise wurde der mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII gespaltene bluescript SK-Vektor verwendet (im Handel erhältlich, Stratagene, Californien, USA).
Das sich daraus ergebende Plasmid wurde dann an seiner EcoRI-Stelle in Pufferlösung linearisiert und Teile der Lösung wurden partiell mit Ba131 gespalten. Nachdem die Spaltgemische zum Glätten der Enden mit dem Kienow- Fragment der DNA-Polymerase behandelt worden waren, wurde die DNA mit HindIII gespalten.
Die sich daraus ergebenden Restriktionsfragmente wurden aus dem Gel durch bekannte Verfahren getrennt und diejenigen, die 50 bis 250 Basen enthieiten, wurden durch Anlegen von elektrischer Spannung eluiert und in einen Vektor zur Sequenzanalyse rückcloniert.
DNA-Fragmente, welche die folgenden Deletionen enthielten, wurden auf diese Weise identifiziert: Deletierte Fragmente Promotor PT Deletierter Bereich keiner
In dieser Tabelle zeigt +1 die Transkriptionserkennungsstelle an.
Dann wurden die BamHI-HindIII-Fragmente isoliert und in einen Clonierungsvektor eingeführt, der aus den auf dem Fachgebiet bekannten ausgewählt wurde, durch Einsetzen eines heterologen Gens stromabwärts von den Fragmenten, wobei das Gen keinen eigenen Promotor hatte.
Erfindungsgemäß wurden der Vektor pLAFR2 (A. M. Friedman et al., Gene 18, (1982) 289-296) und das Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) codierende Gen verwendet.
Die als-pBP (1, 2, 14, 20, 22, 24, 25, 28, 33, 46 und 72) bezeichneten resultierenden rekombinanten Plasmide, welche die vorstehenden Deletionen umfassen, wurden isoliert und zur Conjugation verschiedener Arten von Bordetella verwendet.
Im besonderen wurden die in jedem Forschungslabor erhältlichen B. pertussis BP 356 (ptx:Tn 5) vir&spplus; und B. Dertussis BP 347 (Vir: Tn 5) vir&supmin; (A.A. Weiss and S. Falkow, Infect. Immun. 42, (1983) 33-41) verwendet.
Die vorstehenden Stämme wurden durch Conjugation transformiert, wobei als Donorstamm (Spenderstamm) der mit den vorstehenden rekombinanten Plasmiden transformierte E.coli SM10 (in Laboren erhältlich) verwendet und nach dem von J. Bordet und O. Gengou beschriebenen Verfahren gearbeitet wurde (Amm. Inst. Pasteur (Paris) 23, (1909) 415-419).
Die sich daraus ergebenden Exconjugate wurden dann in einem geeigneten Medium gezüchtet, vorzugsweise Stainer-Scholte-Medium ( D. W. Stainer and M. J. Scholte, J. Gen. Microbiol. 63, (1971) 211-220), während einer Zeitspanne, die notwendig war, um die maximale Zellkonzentration zu erhalten.
Die Zellen wurden nach allgemein bekannten Verfahren lysiert, danach folgte eine qualitative und quantitative Bestimmung der von den vorstehenden transformierten Stämmen exprimierten CAT durch Analyse ihrer Aktivität (C. M. Gorman et al., Mol. Cell. Biol. 2, (1982) 1044-1051; A. Nicosia and R. Rappuoli, J. Bacteriol. 169, (1987) 2843-2846).
Die in den Fig. 2 und 4 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, daß CAT-Expression in großem Umfang nur bei BP 356 (vir&spplus;)-Stämmen beobachtet wurde, die Plasmide enthielten, bei denen der Bereich stromaufwärts vom PT-Promotor mindestens 170 bp enthielt.
Das Fehlen dieses Bereiches, wie im Fall des Hybridplasmids pBP1, oder eines aktiven vir-Bereiches, wie bei Bordetella BP 347, führte zu einer beträchtlichen Verminderung der CAT-Expression.
Das wies darauf hin, daß mindestens zwei Bedingungen für die wirksame Transkription der heterologen Gene erforderlich waren:
1. Das Vorhandensein eines terminalen 5'-Bereiches mit mindestens 170 bp stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle und
2. Ein vom vir-Bereich codierter, in trans aktivierender Faktor (i).
Eine 45%-ige Verminderung der CAT-Aktivität wurde tatsächlich beobachtet, wenn die Sequenz zwischen -70 und -158 deletiert wurde.
Eine weitere Verminderung der CAT-Aktivität, etwa 10 % der Ausgangsaktivität, wurde gefunden, wenn der Bereich zwischen -149 und -130 entfernt war.
Schließlich verminderte sich die Aktivität auf Werte unter 1%, wenn die Deletion die Sequenz -35 des Promotors zerstörte.
Die Analyse der resultierenden Sequenz des terminalen 5'-Bereiches zeigte auch, daß der Bereich Strukturen enthielt, die typisch für die Anheftungsstellen regulierender Proteine sind, welche im Falle anderer Gene beschrieben wurden (T.Mizuno and S. Mizushimo, J. Bacteriol. 168, (1986) 86-95; O.Raibaud and M. Schwartz, Arm. Rev. Genet. 18, (1984) 173-206).
Im besonderen wurde das folgende nachgewiesen:
- eine im Bereich von -182 bis -170 enthaltene Palindromsequenz (Fig.3) und
- eine 21 bp große Sequenz in der Position von -157 bis -137, die sich nach zwei Drehungen der DNA-Helix wiederholte (Fig. 3 und 6).
Diese Ergebnisse können zur Korrelation der CAT-Aktivitäten bei den verschiedenen Deletionsmutanten mit den strukturellen Eigenschaften der DNA-Sequenz verwendet werden und sie können vier verschiedenen Stufen zugeordnet werden (A, B, C und D) (Fig.4).
Stufe A: Wenn mindestens 170 bp des terminalen 5'-Bereiches des PT-Promotors vorhanden sind, erreicht die Aktivität ein Maximum (pBP2, pBP25, pBP14);
Stufe B: Die Entfernung eines Teils der ersten wiederholten Sequenz (pBP24) oder des Bereiches unmittelbar stromaufwärts davon (pBP20) reduziert die CAT- Aktivität um 45%.
Stufe C: Wenn die zweite wiederholte Sequenz teilweise oder vollständig entfernt wird (pBP46, pBP28, pBP72, pBP33 und pBP1), verliert der terminale 5'- Bereich das Potential, in trans aktiviert werden zu können.
Das zeigt, daß die wiederholte Sequenz (Fig. 6) sehr wahrscheinlich die Anheftungsstelle des in trans aktivierenden Faktors (i) ist.
Stufe D: Wenn die Sequenz -35 des Promotors entfernt wird (pBP22), vermindert sich sowohl bei vir&spplus;- als auch vir&supmin;-Stämmen die CAT-Aktivität auf Werte unter 1%. Es ist auch bemerkenswert, daß die Entfernung der die Palindromsequenz enthaltenden Sequenz von -182 bis -170 zu einem deutlichen Anstieg der CAT- Aktivität führte. Das weist darauf hin, daß diese Sequenz sehr wahrscheinlich eine kritische Rolle bei der Transkriptionsregulation der heterologen Gene spielt.
Erfindungsgemäß und zur Kontrolle der Ergebnisse wurden zwei Plasmide konstruiert. Ein Plasmid, pLAFR-CAT, besaß nicht den PT-Promotor und den terminalen 5'-Bereich davon und bei dem anderen, pBP25s, war der Bereich stromaufwärts der KpnI-Restriktionsstelle (-62) durch das 600 bp große BamHI- HindIII-Fragment ersetzt worden, das die SI-Untereinheit von PT, ohne Promotor, codiert.
In Bordetella vir&spplus; und vir&supmin;, transformiert durch Plasmid pLAFR-CAT, wurde keine CAT-Aktivität beobachtet, während Plasmid pBP255 enthaltende vir&spplus;- Zellen die gleiche Aktivität zeigten, wie sie im Fall der Deletionsmutante pBP1 beobachtet wurde.
Diese Ergebnisse bestätigten, daß die spezifischen Sequenzen stromaufwärts vom PT-Promotor für dessen Aktivierung in trans notwendig waren.
Erfmdungsgemäß ist gefunden worden, daß bei Einführung in die virulenten B. parapertussis und B. bronchiseptica die vorstehenden rekombinanten Plasmide den Mikroorganismen die Fähigkeit verliehen, das CAT-Gen in Mengen zu exprimieren, die identisch zu den waren, die im Fall von B. pertussis BP 357 (vir&spplus;) gemessen wurden.
Das wies darauf hin, daß wirksame vir-Bereiche in den vorstehenden Bakterien vorhanden waren und für erfindungsgemäße Zwecke verwendet werden konnten.
Erfindungsgemäß wurde eine Untersuchung über die Wirkung von im terminalen 5'-Bereich vorhandenen Mutationen auf die Aktivität des Promotors und auf die Transkriptionswirksamkeit durchgeführt.
Zu diesem Zweck wurde der Bereich zwischen der EcoRI-Stelle (-483) und der KpnI-Stelle (-62) des Plasmids pBP2 durch den entsprechenden Bereich von B. bronchiseptica ersetzt, der Mutationen in der Sequenz zwischen -170 und -62 enthält.
Das sich daraus ergebende, pBB2 genannte Plasmid wurde dann zur Transformation virulenter Zellen von B. parapertussis und B. bronchiseptica verwendet.
Durch Analyse wurde gezeigt, daß die CAT-Aktivität etwa 40% der für Plasmid pBP2 gemessenen Aktivität betrug.
Dieses Ergebnis stimmte mit denjenigen überein, die durch Deletionsanalyse des terminalen 5'-Bereiches erhalten wurden.
Wie in Beispiel 5 mitgeteilt, wurde unter Verwendung von virulenten B. bronchiseptica 7865-Zellen erfindungsgemäß die modulierende Wirkung von MgSO&sub4; und der Temperatur auf die Proteinexpression untersucht.
Um auch die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Induktionssystems in einem anderen Wirt als Bordetella zu überprüfen, wurde das Plasmid pLA-14-vir konstruiert, mit dem E.coli-Zellen transformiert werden können, wie in Beispiel 6 mitgeteilt.
Die Ergebnisse (Fig. 11) zeigen, daß das induzierbare System in E.coli ebenfalls wirkt.
Das Induktionssystem ist deshalb offensichtlich besonders zur Konstruktion von Vektoren geeignet, die für die Produktion heterologer Proteine in hohen Ausbeuten nützlich sind.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1: Clonierung verschiedener Fragmente des PT-Promotors vor dem CAT-Gen im Vektor pLAFR2.
Fig. 2: Dünnschicht-Chromatographie-Analyse von CAT aus Bordetella vir&spplus; (BP 356)- und vir&supmin; (BP 347)-Stämmen, enthaltend die rekombinanten Plasmide pBP1 bzw. pBP2.
Um die Ergebnisse deutlicher zu zeigen, wurde die Analyse an verdünnten Extrakten durchgeführt. Banden: A, Chloramphenicol; B, C, Chloramphenicol- Monoacetylat; D, Chloramphenicol-Diacetylat.
Fig. 3: Vergleich der Nucleotidsequenzen der PT-Promotorbereiche aus B. pertussis 165 (BP), B. parapertussis 9305 (BPP) und B. bronchiseptica 4617 (BB). Unter der BP-Sequenz werden die Basen gezeigt, die in BPP und BB unterschiedlich sind. Die Bereiche -35 und -10 der PT-Promotoren werden in Kästchen gezeigt. Die durch einen Pfeil angezeigte Translationsstartstelle ist mit +1 markiert und die anderen Nucleotide werden in bezug darauf nummeriert. Die Positionen der verschiedenen Deletionen werden im oberen Teil der Sequenz gezeigt und durch ein Δ angezeigt, dem die Nummer des Clons folgt.
Die Darstellung zeigt auch die bei den Clonierungsverfahren verwendeten Restriktionsstellen.
Die aus den Polylinkern des Vektors pEMBL18 stammenden Basen sind in Kleinbuchstaben geschrieben.
Die Pfeile vor der Sequenz zeigen die wiederholten Sequenzen.
Fig. 4: CAT-Aktivität verschiedener Deletionsmutanten (ausgedrückt in % Acetylierung) in Beziehung zur Länge des terminalen 5'-Bereiches von PT.
Die dunklen Säulen zeigen die CAT-Aktivität im Stamm BP 356 vir&spplus;, während die weißen Säulen die Aktivität im Stamm BP 347 vir&supmin; zeigen. Die unterbrochenen Linien kennzeichnen die vier Stufen der CAT-Aktivität, die zur Veranschaulichung der Diskussion ausgewählt wurden. Die Standardabweichungen liegen bei Stufe A zwischen 10 und 7%, bei Stufe B zwischen 7 und 5% sowie bei Stufe C unter 5%.
Fig. 5: Dünnschicht-Chromatographie-Analyse von CAT bei verschiedenen Mutanten des PT-Promotorbereichs in B. parapertussis P14 (A) und B. bronchiseptica 7865 (B).
Um die Ergebnisse deutlicher zu zeigen, wurde die Analyse an unverdünnten Extrakten durchgeführt. Die verschiedenen Formen von Chloramphenicol sind die gleichen wie in Fig. 2.
Fig. 6: Vergleich der wiederholten Sequenzen stromaufwärts des Promotorbereiches. Die Striche zeigen homologe Nucleotide an.
Fig. 7: Struktur des PT-Operons, welche die Verteilung der bei BPP und BB gemeinsam auftretenden Mutationen zeigt (vertikale Striche in der vorstehend wiedergegebenen Sequenz).
Fig. 8A und 8B: Modulation mittels MgSO&sub4; beim virulenten B. bronchiseptica, der durch pBP-Plasmide transformiert war, die im terminalen 5'-Bereich des PT- Operons die verschiedenen Deletionen enthielten:
+ und - kennzeichnen die Gegenwart oder die Abwesenheit von MgSO&sub4; im Kulturmedium.
Fig. 9: RNA-Identifizierung durch "primer extension"-Analyse (Verlängerung der Starter-RNA).
1) Bezugssequenz
2) pBP2, in Abwesenheit von MgSO&sub4; bei 35ºC gezüchtet
3) pBP2, in Gegenwart von MgSO&sub4; bei 35ºC gezüchtet
4) pBP2, in Abwesenheit von MgSO&sub4; bei 25ºC gezüchtet
5) pBP2, in Abwesenheit von MgSO&sub4; bei 35ºC gezüchtet
Fig. 10: Modulation mit Temperatur bei B. bronchiseptica, transformiert mit pBP2.
1) Wachstum in Abwesenheit von MgSO&sub4; bei 35ºC
2) Wachstum in Gegenwart von MgSO&sub4; bei 35ºC
3) Wachstum in Abwesenheit von MgSO&sub4; bei 25ºC
Fig. 11: Expression und Modulation des PT-Promotors in E.coli H1443, E.coli KY2562 ompR und E.coli FN 102 ompR, transformiert mit pBP14 und pLA-14-vir.
Fig. 12: Modulation mit MgSO&sub4; in virulenten und nichtvirulenten, durch Plasmid pFHA transformierten B. bronchiseptica.
1) pBB 7865 (vir&spplus;)-
2) +
3) pBB (vir&supmin;)-
4) +
+ und - zeigen die Gegenwart oder Abwesenheit von MgSO&sub4; im Kulturmedium an.

Beispiel 1

Konstruktion von rekombinanten Plasmiden, enthaltend Deletionen im 5'- Bereich des PT-Operons von B. Dertussis

A. Isolierung des CAT codierenden Strukturgens

20 ug des Plasmids pA10-CAT 2 (C. D'Onofrio et al., J. EMBO 4, (1985) 1981-1989) wurden mit jeweils 60 Einheiten (E) der Restriktionsenzyme HindIII und XbaI (Boehringer) in einem Puffer und unter den von der Lieferfirma vorgeschlagenen Bedingungen gespalten.
Nachdem die Enzyme 15 Minuten bei 65ºC inaktiviert worden waren, wurde das Spaltgemisch auf ein 0,8%-iges Agarosegel gegeben und 2 Stunden bei 100V laufen gelassen.
Das 1636 bp große HindIII-XbaI-Fragment, enthaltend das CAT-Gen ohne den Promotor, wurde dann durch das Verfahren von Maniatis mittels Anlegen einer elektrischen Spannung eluiert (Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, 1982).

B. Herstellung der DNA-Fragmente, enthaltend Deletionen im terminalen 5'- Bereich stromaufwärts vom PT-Promotor

Die Deletionen im terminalen 5'-Bereich des PT-Promotors wurden unter Verwendung der Ba131-Exonuclease (BRL) erhalten, wobei nach dem Verfahren von R. J. Legerski et al. (1978) gearbeitet wurde (Nucl. Acids Res. 5, 1445).
In der Praxis wurden 10 ug des Plasmids PT101 ATCC 67854 mit 30 E EcoRI und HindIII (Boehringer) gespalten.
Nachdem die Enzyme 15 Minuten bei 65ºC inaktiviert worden waren, wurde das Spaltgemisch auf ein 1,3%-iges Agarosegel gegeben und 2 Stunden bei 100V laufen gelassen.
Das den PT-Promotor mit dessen 5'-Bereich enthaltende, 539 bp große EcoRI- HindIII-Fragment wurde dann durch Anlegen einer elektrischen Spannung aus dem Gel eluiert. 200 ng des Fragments wurden dann an einen bluescript SK- Vektor gebunden (Stratagene, Californien), der vorher mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII nach dem von der Lieferfirma Boehringer vorgeschlagenen Verfahren gespalten worden war.
Die Ligierungsreaktion wurde in 30 ul Pufferlösung (66 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM ATP, 10 mM MgCl&sub2; und 20 mM Dithiothreitol (DTF)) in Gegenwart von 1 E T4-DNA-Ligase 18 Stunden bei 14ºC durchgeführt.
Zum Schluß wurde das ganze Gemisch zur Transformation von E.coli JM 101- Zellen (BRL) verwendet, der durch das von Messing beschriebene Verfahren mit CaCl&sub2; kompetent gemacht war (Methods in Enzymology Bd. 101, (1983) 20- 78).
Bei 37ºC wurden dann die Transformanten 18 Stunden auf Platten mit LB-Agar (DIFCO) selektiert, dem 100 ug/ml Ampicillin hinzugefügt worden war.
Das Plasmid wurde aus einem der resultierenden positiven Clone isoliert und wies die erwarteten Merkmale auf.
40 ug des Plasmids wurden 12 Stunden mit 200 E EcoRI bei 37ºC gespalten und dann mit 6 E Ba131 (Boehringer) partiell bei 37ºC verdaut, wobei alle 30 Sekunden 2,5 ul-Portionen als Probe entnommen wurden.
Um die Enden zu glätten, wurden dann jeder so gespaltenen Probe 2 E des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase (1) zugefügt und im Anschluß daran 5 E des Restriktionsenzyms HindIII. Die Gemische wurde 5 Stunden bei 37ºC gehalten und nach Enzyminaktivierung auf ein 4%-iges Polyacrylamidgel gegeben und 2 Stunden bei 250 V laufen gelassen. 50 bis 250 Basen enthaltende DNA-Fragmente wurden dann durch Anlegen einer elektrischen Spannung eluiert und in den bluescript SK-Vektor cloniert, der vorher mit den Enzymen SmaI und HindIII gespalten worden war, wobei das gleiche Verfahren wie vorher verwendet wurde, und sequenziert, wie von Sanger et al. (1977) beschrieben (PNAS USA 74, 5463).
Die BamHI-HindIII-Fragmente mit den Deletionen im terminalen 5'-Bereich (Fig. 3) wurden aus dem bluescript SK-Vektor isoliert und in Plasmid pLAFR 2 cloniert (A. M. Friedman et al., Gene 18, (1982) 289-296) (Fig. 1).

C. Konstruktion der Hybridplasmide mit Deletionen im terminalen 5'-Bereich des PT-Promotors

10 ug des Plasmids pLAFR2 wurden mit jeweils 50 E der Enzyme BamHI und XbaI gespalten (Boehringer).
Nach Inaktivierung der Enzyme wurde das Gemisch auf ein 0,5%-iges Agarosegel gegeben und 2 Stunden bei 100 V laufen gelassen. Das 260 bp große BamHI-XbaI-DNA-Fragment wurde durch Anlegen einer elektrischen Spannung eluiert.
Danach wurden 0,5 ug des BamHI-XbaI-Fragments und 0,3 ug des HindIII-XbaI- Fragments, erhalten wie in Abschnitt A beschrieben, zu jeweils 0,08 ug der die verschiedenen Deletionen enthaltenden BamHI-HindIII-Fragmente hinzugefügt und in 30 ul Legierungsgemisch in Gegenwart von 2 E T4-DNA- Ligase über Nacht bei 14ºC ligiert.
Die Legierungsgemische wurden zur Transformation kompetenter E.coli SM10- Zellen verwendet (R. Simon et al., Bio/Technology 1, (1983) 784-791) und die Transformanten wurden über Nacht bei 37ºC auf LB-Agar selektiert, dem 12,5 ug/ml Tetracyclin zugesetzt worden war.
Von den resultierenden Clonen wurden diejenigen isoliert, die rekombinante Plasmide mit den erwarteten Merkmalen aufwiesen.
Die Plasmide, enthaltend das CAT-Gen hinter dem PT-Promotor mit den verschiedenen Deletionen in dessen terminalen 5'-Bereich, wurden als pBP22, pBP1, pBP33, pBP72, pBP28, pBP46, pBP24, pBp20, pBP25, pBPl4 und pBP2 bezeichnet (Fig. 4).
Fig. 3 gibt die Lage der durch Δ angezeigten verschiedenen Deletionen für jedes rekombinante Plasmid wieder.

Beispiel 2

Beschriebung des Promotorbereiches des PT-Operons

Unter Verwendung des Conjugationsverfahrens wurden die Hybridplasmide, erhalten wie in Beispiel 1 beschrieben, in einen Stamm von B. pertussis BP 356 (ptx:Tn5) vir&spplus; und von B. pertussis BP 347(Vir: tn5) vir&supmin; eingeführt (A. A. Weiss et al., Infec.Immun. 42, (1983) 33-41).
Die Conjugationen wurden in der Praxis dadurch erreicht, daß frische Kulturen der Empfängerart (Bordetella) und der Spenderstämme mindestens sechs Stunden lang auf Bordet-Gengou-Platten verwendet wurden, wobei nach dem von J. Bordet und O. Gengou beschriebenen Verfahren gearbeitet wurde (Ann. Ins. Pasteur (Paris) 23, (1909) 415-419).
Die Exconjugate wurden dann 15 Stunden bei 35ºC auf Bordet-Gengou-Platten selektiert, denen 10 ug/ml Tetracyclin, 200 ug/ml Streptomycin und 20 ug/ml Nalidixinsäure zugesetzt worden waren.
Nach der in dieser Weise erfolgten Selektion wurden die Bordetella vir&spplus;-und vir&supmin;-Stämme bei 35ºC in 10 ml 10 ug/ml Tetracyclin enthaltendem Stainer- Scholte-Medium (D.W. Stainer and M. J. Scholte, J. Gen. Microbiol. 63, (1971) 211- 220) gezüchtet, bis die bei 580 nm gemessene optische Dichte 0,8 betrug.
1,5 ml jeder Kultur wurden dann 5 Minuten bei 5000 Upm unter Verwendung einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert.
Nachdem sie auf diese Weise gewonnen waren, wurden die Zellen in 300 ul 0,25 M Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 7,8, resuspendiert, durch Ultraschallbehandlung in einer Zellzerstörungs-Vorrichtung aufgebrochen (Bronson Sonie Parov Co) und erneut zentrifugiert.
Die Überstände wurden gewonnen (300 ul), 10 Minuten bei 65ºC inkubiert, zentrifugiert und dann verwendet, um das Vorhandensein und die Konzentration der resultierenden Chloramphenicol-Acetyltransferase durch Analyse ihrer Aktivität zu bestimmen (A. Nicosia and R. Rappuoli, J. Bacteriol. 169, (1987) 2843-2846; C.M. Gorman et al., Mol. Cell. Biol. 2, (1982) 1044-1051).
In der Praxis wurden 15 ul Überstand mit 0,25 M Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 7,8, auf 150 ul verdümit und 1 uCi [¹&sup4;C]-Chloramphenicol wurde zugesetzt.
Nach 5 Minuten Inkubation bei 37ºC wurden jeder Lösung 20 ul 4 mM Acetyl- Coenzym A zugesetzt und die sich daraus ergebenden Gemische 1 Stunde bei 37ºC inkubiert.
Am Ende dieses Zeitraums wurde die Enzymumsetzung durch Extraktion von Chloramphenicol und dessen Derivaten mit 2 ml kaltem Ethylacetat (0ºC) beendet.
Die organischen Phasen wurden durch Verdampfung entfernt und die verschiedenen Chloramphenicol-Formen wurden durch Dünnschicht- Chromatographie getrennt, wobei Kieselerde-Gelplatten und ein Chloroform/Methanol-Gemisch (95:5, Vol./Vol.) 1 Stunde verwendet wurden.
Bei Raumtemperatur wurden die Platten dann über Nacht auf einen Kodak X- Omat AR-Röntgenfilm aufgelegt, um die Ergebnisse sichtbar zu machen (Fig. 2).
Zur quantitativen Bestimmung der exprimierten CAT wurden die Proben von 1:10 auf 1:300 verdünnt und dann analysiert, wie vorstehend beschrieben.
Nach der Autoradiographie wurden die nichtacetylierten und die monoacetylierten Chloramphenicol-Formen ausgeschnitten und die Radioaktivität bestimmt. Die Schlußfolgerungen aus den in den Fig. 2 und 4 wiedergegebenen Ergebnissen sind wie folgt:
- Ein Bereich von mindestens -170 bp stromaufwärts von der in herkömmlicher Weise mit +1 markierten Transkriptionsstartstelle ist für die wirksame Promotoraktivität und folgerichtig für die Transkription des stromabwärts von dem vorstehenden Bereich liegenden heterologen Gens notwendig;
- Ein vir-Bereich ist für den zu aktivierenden Promotorbereich und das zu transkribierende Gen notwendig und
- die Entfernung des Bereiches zwischen den Positionen -182 und -171 führt zu einem deutlichen Anstieg der CAT-Expression. Das ist wahrscheinlich auf die Deletion der Palindromsequenz im vorstehenden Bereich zurückzuführen.
Um die vorstehenden Ergebnisse zu bestätigen, konstruierten wir zwei Plasmide, pLAFR-CAT und pBP255, die als Negativ- bzw. Positivkontrolle verwendet wurden.
Im besonderen wurde das Plasmid pLAFR-CAT durch Clonierung des CAT-Gens in dem mit den Restriktionsenzymen BamHI und Xbal gespaltenen Vektor pLAFR2 erhalten, wobei das Gen ohne seinen eigenen Promotor war und der BamHI- HindIII-Linker (-Verbindungsstück) von pEMBL18 verwendet wurde (L Dente et al., Nucl. Acids Res. 11, (1983) 1645-1655).
Andererseits wurde das Plasmid pBP255 dadurch konstruiert, daß stromaufwarts von der KpnI-Stelle (-62) das aus Plasmid pT101 ATCC 67854 erhaltene 600 bp große BamHI-HindIII-Fragment (A. Nicosia et al., Infect. Immun. 55, (1987) 963- 967) eingesetzt wurde, das die SI-Untereinheit von PT, ohne den Promotor, codiert.
Durch Conjugation wurden die vorstehenden Plasmide in BP 356 (vir&spplus;) und BP 347 (vir&supmin;) eingeführt und nach Züchtung und Lyse der Zellen wurde die CAT- Aktivität bestimmt, wie vorstehend beschrieben.
Die Ergebnisse zeigen, daß in keinem Bordetella-Stamm CAT-Aktivität vorhanden ist, wenn er mit Plasmid pLAFR-CAT transformiert ist, während der pBP255 enthaltende Stamm BP 356 (vir&spplus;) die gleiche Aktivität besaß wie die, welche für Plasmid pBP1 gemessen wurde.
Das weist darauf hin, daß die spezifischen Sequenzen stromaufwärts vom PT- Promotor notwendig für dessen Aktivierung in trans sind.

Beispiel 3

Zellen von B. parapertussis P14 (SCLAVO) und B. bronchiseptica 7865 (SCLAVO) wurden in der virulenten Phase mit den die verschiedenen Deletionen im 5'- Bereich enthaltenden Plasmiden und mit Plasmid pLAFR-CAT conjugiert.
Die Exconjugate wurden dann in Stainer-Scholte-Medium gezüchtet, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Schließlich wurden die Kulturen zur Bestimmung der Expression von CAT analysiert, indem dessen Aktivität bestimmt wurde.
Die in Fig. 5 wiedergegebenen Ergebnisse sind offensichtlich identisch zu denjenigen, die für B. pertussis BP 356 (vir&spplus;) erhalten wurden.

Beispiel 4

Gemäß dem vorstehenden, im Beispiel 3 wiedergegebenen Verfahren wurde B. bronchiseptica 7865 in der virulenten Phase mit dem Plasmid pBP2 conjugiert, das durch Ersetzen des pBP2-Bereiches zwischen der EcoRI- (-483) und KpnI- Stelle (-62) durch den entsprechenden Bereich von B. bronchiseptica erhalten wurde.
Der zuletzt genannte Bereich enthält Mutationen in der Sequenz zwischen -170 und -62, wobei diese Mutationen auch in B. pertussis vorhanden sind (Fig. 7).
Die CAT-Aktivität, bestimmt wie in Beispiel 2 beschrieben, betrug etwa 40% derjenigen, die für den gleichen Stamm ermittelt wurde, wenn er mit pBP2 transformiert war, und war identisch zu der, die für den mit pBP46 transformierten B. bronchiseptica erhalten wurde.

Beispiel 5

Modulation des vir-Bereiches

Zellen des virulenten B. bronchiseptica 7865 wurden mit pBP-Plasmiden conjugiert, welche die verschiedenen Deletionen im 5'-Bereich des PT-Operons enthielten.
Die sich daraus ergebenden Exconjugate wurden einzeln in 10 ml Stainer- Scholte-Medium enthaltenden 150 ml-Erlenmeyerkolben überimpft und über Nacht bei 35ºC gezüchtet.

A. Modulierende Wirkung von MgSO&sub4;

Von jeder Vorkultur wurden erneut zweimal 10 ul in Erlenmeyerkolben überimpft, wobei einige davon 30 ml Stainer-Scholte-Medium enthielten, dem 70 mM MgSO&sub4; zugesetzt worden war, während andere das Medium allein enthielten.
Die Kolben wurden dann bei sanftem Schütteln bei 35ºC gehalten, bis die optische Dichte bei 580 nm 0,8 betrug.
Schließlich wurden aus jedem Kolben entnommene 1,5 ml-Portionen untersucht, um die CAT-Expression durch Messung seiner Aktivität zu bestimmen. Gleichzeitig wurden 20 ml-Portionen jeder Kultur auf das Vorhandensein oder die Abwesenheit von RNA analysiert.
Die RNA wurde quantitativ durch das Verfahren von C. D'Onofrio et al. bestimmt (EMBO. J. 4, (1985) 1981-1984).
Die in Fig. 8 (A und B) wiedergegebenen Ergebnisse zeigen die Abwesenheit von CAT-Aktivität im Fall der Stämme, die in Gegenwart von MgSO&sub4; gezüchtet wurden. Das zeigt, daß dieses Salz den Regulationsbereich hemmt.
Die Ergebnisse in Fig. 9, die kein RNA-Vorhandensein zeigen, bestätigen unsere frühere Beobachtung, d.h. das Fehlen der Expression des CAT codierenden Gens.

B. Modulierende Wirkung der Temperatur

Zellen des virulenten B. bronchiseptica 7865 wurden mit dem Plasmid pBP2 conjugiert und bei 35ºC über Nacht gezüchtet.
10 ul-Portionen der Vorkultur wurden zur Beimpfung von 30 ml Stainer- Scholte-Medium enthaltenden Erlenmeyerkolben verwendet.
Danach wurden einige Kolben bei 35ºC gezüchtet, bis die optische Dichte bei 580 nm 0,8 betrug, während andere bei Raumtemperaturen gezüchtet wurden (20 - 25ºC).
Schließlich wurden die einzeInen Kulturen zur Bestimmung der CAT-Aktivität analysiert.
Die in Fig. 10 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen das Fehlen von CAT-Aktivität im Fall der bei Raumtemperaturen gezüchteten Stämme.

Beispiel 6

Konstruktion des Plasmids pLA-14-vir

A. Isolierung des vir-Bereiches aus der chromosomalen DNA von B. parapertussis

Der Stamm B. parapertussis 9305 (vir&spplus;) wurde in 500 ml Stainer-Scholte-Medium 2 Tage bei 37ºC gezüchtet.
Schließlich wurden die Zellen durch Zentrifugation (10 Minuten bei 5000 Upm) in einer Zentrifuge vom Typ Sorvall RC-SB bei 4ºC aus der Nährlösungskultur abgetrennt, mit einer lösung aus 25% Sucrose, 100 mM NaCl und 50 mM Tris- HCl, pH-Wert 7,5, gewaschen (2 x 120 ml) und erneut zentrifugiert, wie vorstehend beschrieben.
Die Zellen wurden in 10 ml Pufferlösung (100 mM EDTA und 50 mM NaCl, pH 6,9), enthaltend 1 mg/ml Lysozym (Sigma), resuspendiert.
Die sich daraus ergebende Suspension wurde bei sanftem Schütteln 30 Minuten bei 0ºC gehalten.
Danach wurde 1 ml SDS (Natriumdodecylsulfat) der Suspension zugesetzt, nach 10 Minuten bei 60ºC folgte die Zugabe von 1 mg/ml Pronase, die 30 Minuten bei 37ºC in 1 x SSC vorinkubiert war (SSC = 1,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat). Das resultierende Gemisch wurde 2 Stunden bei 37ºC gehalten.
Nachdem NaCl bis zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt worden war, wurde die DNA mit 2-3 Volumen kaltem Ethanol (-20ºC) gefällt, mit einem Glasstab aufgewickelt und in 10 ml 0,1 x SSC resuspendiert.
Die Lösung wurde unter sanftem Schütteln über Nacht bei Raumtemperatur (20-25ºC) gehalten und nach der Zugabe von RNAse (10 γ/ml) 30 Minuten bei 37ºC.
Die Salzkonzentration in der lösung wurde dann auf 1 x SSC gebracht und nach Phenolextraktion (1 Volumen) wurde die DNA durch die tropfenweise Zugabe von Isopropanol gefällt.
60 ug der sich daraus ergebenden chromosomalen DNA wurden 12 Stunden mit 150 E BamHI in 500 ul Umsetzungsgemisch gespalten.
Das Spaltgemisch wurde auf einen Saccharose-Gradienten (10 - 40%) in 35 mi Puffer geladen, der 1 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5 und 1mM EDTA enthielt, und 16 Stunden bei 20ºC in einem Beckman-Rotor vom Typ SW28 bei 26000 Upm zentrifugiert.
Schließlich wurde der Gradient in Fraktionen getrennt und ein Teil jeder Fraktion bei 20 V über Nacht auf einem 0,7%-igen Agarosegel analysiert, um die Fraktionen zu identifizieren, die Fragmente mit etwa 14000 bp enthielten.
Die Fraktionen wurden dann vereinigt und die DNA durch Fällung mit Ethanol (-20ºC) konzentriert.
Nach Abtrennung durch 15-minütige Zentrifugation bei 12000 Upm wurde die DNA in das Plasmid pLAFR2 cloniert, das in geeigneter Weise mit BamHI (Boehringer) gespalten war (Fig. 1).
Die sich daraus ergebenden hybriden Plasmide wurden in Bordetella pertussis vir&spplus; conjugiert und auf Bordet-Gengou-Medium ausgestrichen.
Nach einer Nacht bei 35ºC wurden die Kolonien selektiert, welche die für vir&spplus;- Stämme typischen Klarzonen zeigten.
Danach wurden die Plasmide aus den vorstehenden Stämmen isoliert und mit dem Restriktionsenzym BamHI (Boehringer) gespalten, wobei das gleiche Verfahren wie das der Lieferfirma verwendet wurde.
Die den vir-Bereich enthaltenden Fragmente mit etwa 4,7 Kb wurden isoliert und mit dem Plasmid pBp14 ligiert, das vorher mit Bglll (Boehringer) gespalten worden war.
Die Ligierungsumsetzung wurde 18 Stunden bei 14ºC durchgeführt, wie vorher beschrieben.
Das Gemisch wurde dann zur Transformation kompetenter E.coli JM109-Zellen verwendet, einem aus jedem Forschungszentrum erhältlichen Mikroorganismus.
Die Transformanten wurden über Nacht bei 37ºC auf LB-Agar-Medium (DIFCO) selektiert, dem 12,5 ug/ml Tetracyclin zugesetzt worden war. Das Plasmid mit den erwarteten Merkmalen wurde aus einem der positiven Clone isoliert und nachstehend als pLA-14-vir bezeichnet.

B. Expression und Modulation in E.coli. transformiert durch pLA-14-vir

E.coli H1443-, E.coli KY2562 ompR- und E.coli FN102 ompR-Zellen wurden mit dem Plasmid pLA-14-vir sowie pBP14 transformiert und bei 37ºC in 10 ml LB- Medium, dem 12,5 ug/ml Tetracyclin zugesetzt worden war, solange gezüchtet, bis die bei 580 nm gemessene optische Dichte 0,05 betrug.
Danach wurden erneut 5 ul jeder Kultur zweimal in 10 ml LB-Medium, dem Tetracyclin zugesetzt worden war (12,5 ug/ml), überimpft und bei 35ºC in Gegenwart oder Abwesenheit von MgSO&sub4; (70 mM) solange gezüchtet, bis die bei 580 um gemessene optische Dichte 0,8 betrug.
Schließlich wurden 1,5 ml jeder Kultur zur Bestimmung der CAT-Aktivität untersucht.
Die Ergebnisse (Fig. 11) sind offensichtlich identisch mit den, die für B. bronchiseptica erhalten wurden, der mit Plasmid pBP14 conjugiert war. In den verschiedenen E.coli-Stämmen wurde kein Unterschied beobachtet.

Beispiel 7

Konstruktion des Plasmids pFHA

Die chromsomale DNA von B. pertussis BP 165 (SCLAVO), extrahiert und gereinigt wie von Maniatis beschrieben, wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI gespalten (Boehringer). Das Spaltgemisch wurde auf ein 0,8%-iges Agarosegel aufgetragen und 3 Stunden bei 100 V laufen gelassen.
Schließlich wurden Fragmente, die zwischen 4000 und 2000 Basen enthielten, durch Anlegen elektrischer Spannung aus dem Gel eluiert.
Eines dieser Fragmente, zusammengesetzt aus etwa 3500 Nucleotiden, umfaßte anscheinend einen nichtcodierenden 5'-Bereich und einen Bereich mit einer Sequenz, die der aminoterminalen Sequenz von FHA entsprach.
Das Fragment wurde im Vektor pLAFR2 vor dem CAT-Strukturgen cloniert, wobei der pUC18-Polylinker verwendet wurde.
In der Praxis wurden das 3500 bp große EcoRI-BamHI-Fragment, der pUC18- Polylinker, das CAT-Gen enthaltende HindIII-XbaI-Fragment mit 1636 bp und das mit BamHI und XbaI gespaltene Plasmid pLAFR2 in Gegenwart von T4-DNA Ligase bei 14ºC über Nacht miteinander verbunden.
Das Ligierungsgemisch wurde dann zur Transformation kompetent gemachter E.coli SM10-Zellen verwendet und die Transformanten wurden selektiert, wie in Beipiel 1 beschrieben.
Die aus den positiven Clonen isolierten rekombinanten Plasmide wurden mittels einer Restriktionskarte genauer definiert.
Eines der Plasmide, genannt pFHA, wurde in B. bronchiseptica vir&spplus; und vir&supmin; conjugiert, wobei so verfahren wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Die Exconjugate wurden dann in Stainer-Scholte-Medium in Gegenwart und Abwesenheit von MgSO&sub4; sowie bei 35ºC und 25% gezüchtet.
Für die verschiedenen Kulturen wurde dann die CAT-Aktivität bestimmt.
Die in Fig. 12 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, daß die modulierende Wirkung von MgSO&sub4; sowie der Temperatur auf das Regulationssystem und auf die CAT-Expression in entgegengesetzter Richtung als diejenige verläuft, die bei Verwendung des 5'-Bereiches stromaufwärts vom PT-Promotor von B. pertussis beobachtet wird.

Claims

1. Neues System einer induzierbaren Regulation zur Verwendung in der Konstruktion eines Vektors, der durch Expression repliziert werden kann, zur Verwendung in der Produktion von heterologen Proteinen durch mikrobielle Expression, dadurch gekennzeichnet, daß es die vir-Region von Bordetella umfaßt, die einen oder mehrere regulierende Faktoren codiert, und auch einen terminalen 5'- Bereich umfaßt, der stromaufwärts von einem Gen liegt, das ein Bordetella-Protein codiert, welches durch die vorstehenden Faktoren in trans aktiviert oder inhibiert werden kann und dem stromabwärts liegenden Promotor die Fähigkeit zur Kontrolle der Expression des Proteins von Interesse verleihen kann.

2. Neues regulierendes System nach Anspruch 1, wobei der terminale 5'-Bereich, der in trans durch den regulierenden Faktor und/oder die Faktoren aktiviert wird, ausgewählt ist aus denen, die stromaufwärts vom Gen (i) liegen, das ein virulentes Bordetella-Protein codiert.

3. Neues regulierendes System nach Anspruch 2, wobei der terminale 5'-Bereich die 483 Basenpaare umfassende Sequenz ist, die stromaufwärts von der Erkennungsstelle des Transkriptionsstarts des Operons liegt, das das Pertussistoxin codiert, welches von Bordetella pertussis produziert wird.

4. Neues regulierendes System nach Anspruch 3, wobei die vorstehend erwähnte Sequenz mindestens 62 Basenpaare umfaßt.

5. Neues regulierendes Systern nach Anspruch 3, wobei die Sequenz 170 Basenpaare umfaßt.

6. Neues regulierendes System nach Anspruch 1, wobei der terminale 5'-Bereich, der in trans durch den regulierenden Faktor und/oder Faktoren inhibiert wird, ausgewählt ist aus denen, die vor dem Gen liegen, welches ein nicht-virulentes Bordetella-Protein codiert.

7. Neues regulierendes System nach Anspruch 6, wobei der terminale 5'-Bereich die nicht-codierende Sequenz ist, die im Fragment der chromosomalen DNA enthalten ist, die den aminoterminalen Teil des FHA-Proteins codiert.

8. Neues regulierendes System nach Anspruch 1, wobei die Induktion durch Verwendung von Temperaturen von etwa 35ºC und eines Kulturmediums erzielt wird, das frei ist von modulierenden Stoffen, wie MgSO&sub4;, NaCl oder Nicotinsäure.

9. Neues regulierendes System nach Anspruch 1, wobei die Hemmung durch Verwendung von Raumtemperaturen (20 bis 25ºC) und eines Kulturmediums erzielt wird, dem modulierende Substanzen, wie MgSO&sub4;, NaCl und Nicotinsäure, zugefügt wurden.

10. Vektor, der durch Expression repliziert werden kann und ein heterologes Gen umfaßt, dessen Expression unter der Kontrolle des positiven regulierenden Systems nach den Ansprüchen 1 bis 9 steht.

11. Vektor, der durch Expression nach Anspruch 10 repliziert werden kann, ausgewählt aus Plasmiden von E. coli und Bacillus.

12. Mikroorganismus, der durch einen Vektor transformiert ist, der durch Expression nach Anspruch 10 repliziert werden kann, der fähig ist zur Produktion eines heterologen Proteins durch Expression des für das vorstehend erwähnte Protein codierenden Gens, wobei die Expression unter der Kontrolle des regulierenden Systems nach den Ansprüche 1 bis 9 steht.

13. Mikroorganismus, der nach Anspruch 12 transformiert ist und ausgewählt ist aus Escherichia coli, Bordetella und Bacillus.

14. Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins in hohen Ausbeuten, umfassend die Züchtung eines gemäß den Ansprüchen 12 und 13 transformierten Mikroorganismus in einem geeigneten Kulturmedium.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der transformierte Mikroorganismus in einem Kulturmedium in Gegenwart oder Abwesenheit von modulierenden Stoffen und bei Umgebungstemperaturen (20 bis 25ºC) oder Temperaturen, die ungefähr oder genau bei 35ºC liegen, mit dem regulierenden System in inaktivierter Form für einen ausreichend langen Zeitraum gezüchtet wird, um die maximale Konzentration an Zellen zu erhalten, wobei die Temperatur und das Kulturmedium anschließend geändert werden, so daß das erhaltene regulierende System das Gen transkribieren kann, welches das Protein von Interesse codiert.

16. Verwendung des regulierenden Systems nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Vektors, der durch Expression nach Anspruch 10 repliziert werden kann.

17. Verwendung des Vektors, der durch Expression nach Anspruch 10 repliziert werden kann, zur Gewinnung eines Mikroorganismus, der gemäß Anspruch 12 transformiert wurde.