DE68916843T2

DE68916843T2 - Mikropartikel, Verfahren und Gerät zur Sammlung von Proben zur Verwendung bei der Markierung von Immunreaktionen und Verfahren und Gerät zur Bereitung von Proben.

Info

Publication number: DE68916843T2
Application number: DE68916843T
Authority: DE
Inventors: Koichi Fujiwara; Hiroko Mizutani; Hiromichi Mizutani
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: NTT Inc
Priority date: 1988-04-26
Filing date: 1989-04-26
Publication date: 1995-02-02
Anticipated expiration: 2009-04-27
Also published as: EP0339980B1; DE68916843D1; US5340749A; US5498550A; EP0339980A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft magnetische Mikroteilchen, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Sammeln von Proben unter Einsatz von Antigen-Antikörper-Reaktion, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung van Proben, die zur Verwendung in der immunologischen Diagnose, Biotechnologie die Zellengineering 5-wie Virologie und Immunologie geeignet sind.

Stand der Technik

Die Entwicklung von Immunoassayverfahren, bei denen eine Antigen-Antikörper-Reaktion eingesetzt wird, erfolgt nun global als ein Frühbestimmungsverfahren für neue virale Erkrankungen, wie erworbenes Immundefekt-Syndrom (AIDS) und Erwachsenen-T-Zellen-Leukämie sowie verschiedene Krebsarten. Die nun durchgefuhrten Tests sind Antikörpertests, die dazu bestimmt sind, nach der Infektion mit Immunogenen durch Immunreaktion bei Menschen erzeugte Antikörper festzustellen, und sind daher insofern von Nachteil, daß, auch wenn eine Infektion stattgefunden hat, das Vorliegen einer Infektion wahrend der latenten Periode, bevor ein Antikörper erzeugt wird, nicht festgestellt wird. Aus diesem Grund besteht der dringende Bedarf zur Entwicklung eines Testverfahrens, das den direkten Nachweis von Viren ermöglicht und fruhe Diagnose zuläßt.
Was direkte Nachweisverfahren zum Nachweis von Viren betrifft, ist ein Blutagglutinationsverfahren bekannt. Dieses Verfahren hat jedoch eine geringe Nachweisempfindlichkeit, und es war notwendig, Viren bis zu einer Population von zumindest 10.000.000 Individuen/ml zu kultivieren und zu vermehren, ein Vorgang, der miihevoll und zeitaufwendig ist. Weiters war es bei diesem Verfahren notwendig, zum Kultivieren von Viren geeignete empfindliche Wirtszellen zu finden, da die Wirtszellen für verschiedene Viren verschiedenartig sind. Außerdem war die Suche nach oder das Screenen empfindlicher Zellen schwierig, da die Kultivierung von für Menschen infektiösen Viren einen technologischen Flaschenhals darstellt.
Im Fall viraler Hepatitis beispielsweise kommt es sehr oft dadurch zu Unfällen, daß medizinisches Personal mit Viren von Patienten infiziert wird, da die Krankheit hochgradig ansteckend ist, was ein soziales Problem darstellt. Was virale Hepatitis betrifft, sind das Hepatitisvirus Typ und das Hepatitisvirus Typ B als Pathogene bekannt, und es sind Impfstoffe hergestellt worden. Jedoch ist trotz der Tatsache, daß das Vorhandensein eines solches Virus schon lange vorher angenommen wurde, noch kein pathogenes Virus fiir virale nicht-A- und nicht-B-Hepatitis gefunden worden, und daher ist noch keine richtige Therapie festgelegt worden.
Die morphologische Virusbetrachtung, um sein Vorhandensein zu bestätigen, kann nur mittels Betrachtung durch das Elektronenmikroskop erfolgen. Die morphologische Betrachtung macht es möglich, zu beurteilen, zu welcher Gruppe das fragliche Virus gehört, und wenn ein neues virus gefunden wird, ist es unabdingbar, das Virus schließlich unter dem Elektronenmikroskop zu bestätigen. In diesem Fall ist die Betrachtung jedoch schwierig, es sei denn, das Virus ist hoher Konzentration vorhanden, da das Virus eine Größe im Bereich von 20 bis 200 nm aufweist und da ein enger Bereich in um-Größenordnung zu betrachten ist. Demgemäß war es bisher praktisch unmöglich, eine solche winzige Virusmenge nachzuweisen, wenn nur etwa 10 Individuen/ml in einer Lisung vorhanden sind. Das gleiche gilt für die Diagnose auf der Ebene von Zellen wie Krebszellen.
Im Fall von Krebs wird zunachst nur eine einzelne Zelle von Krebs befallen und der Patient erkrankt nach einem langen Zeitraum. Daher erfolgt die gegenwärtig eingesetzte Diagnose unter Verwendung eines Endoskops, CT-Scanners, pathologischer Tests und ahnlichem meist visuell durch einen Doktor oder Arzt, was dazu führt, daß, wenn bei einem Patienten ein Krebsleiden diagnostiziert wird, der mit dem Auge schwer zu diagnostizierende Zustand bereits zu Metabasen- oder Metastasenbildung geführt hat und ein chirurgischer Eingriff selten Palindromie verhindert. Wenn eine Diagnose auf der Ebene der Zellen gestellt werden kann, bevor Palindromie stattfindet, kann Palindromie verhindert werden, und es wird möglich, Krebs durch immunologische Therapie ohne Operationen zu heilen. In Hinblick darauf wird nun die immunologische Diagnose von Krebs, wie unter Verwendung von Tumormarkern, erforscht, und jede noch so geringe Entwicklung wird als Frühdiagnoseverfahren in die Praxis umgesetzt.
Biotechnologie, wie genetischem Engineering, Zellengineering oder ähnlichem wird als ein Ansatz Aufmerksamkeit gewidmet, um einen Durchbruch bei auf medizinischem Gebiet anzutreffenden schwierigen Situationen zu erzielen und technologische Innovationen herbeizuführen. Es besteht die Möglichkeit, daß der Einsatz biotechnologischer Techniken immunologische Diagnosetechniken auf Ebene der Zelle unter Einsatz von Antigen-Antikörper-Reaktion und immunologische Diagnosetechniken auf Ebene der Gene unter Einsatz von DNA-Hybridisierung (Bildung von Doppelsträngen) in die Praxis umsetzt, sodaß mit diesen Techniken die frühe Diagnose verschiedener Erkrankungen durchgeführt wird. Aus diesem Grund wird die Entwicklung früher Diagnose global gefördert.
Bei der Durchführung von Forschung auf der Ebene von Viren, Krebszellen oder Genen unter freiem Einsatz solcher biotechnologischen Techniken sind Techniken unabdingbar, welche die Bestimmung und Sammlung von Proben wie Viren, Krebszellen usw. ermöglichen, die Gegenstand der Forschung sind.
Um Proben mit einer hohen- Bestimmungsempfindlichkeit zu bestimmen, haben die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes zuvor Laser-Magnet-Immunoassayverfahren studiert, wie in WO/88/02118 (PCT/JP87/006941 entspricht der EP-A-287655, Japanische Patentanmeldungen Nr. 61-224567, 61-252427, 61-254164, 62-22062, 62-22063, 62-152791, 62-152792 und 62-184902), Japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 1-107151, die der japanischen Patentanmeldung Nr. 62-264319 entspricht, und Japanische Patentanmeldung Nr. 62-267481. Die Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß Laserstrahlen zum Bestimmen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von Antigen-Antikörper-Reaktion verwendet werden, magnetische Mikroteilchen als Markierungsmaterial verwendet werden und konzentrierte Probe mit Laserstrahl bestrahlt wird und reflektiertes Licht oder ein ähnliches von der Probe abgegebenes Licht festgestellt wird, und sie ermöglichen Ultramikrobestimmung von Proben im Pikogrammbereich. Insbesondere legt die in der japanischen Patentanmeldung Nr. 62-184902 beschriebene Technik ein Magnetfeld an eine Lösung an, die eine magnetisch markierte Probe enthält, um die Probe unter Verwendung eines Magneten zu einem Laserstrahlbestrahlungsbereich an der Oberfläche der Lösung zu führen und dort zu konzentrieren. Das Führen mit einem Magneten verursacht winzige Vorsprünge an der Oberfläche der Lösung und es werden im reflektierten Licht erzeugte Interferenzstreifen festgestellt, deren Auftreten vom Grad oder der Höhe des Virsprungs abhängt. So kann die Probe bestimmt werden. Dieses Verfahren ermöglicht den Nachweis eines Virus in einer Population in der Größenordnung von 10 Individuen/ml im Gegensatz zum herkömmlichen EIA, bei dem das Bestimmen nur möglich ist, wenn ein Virus in einer Population in der Größenordnung von 10.000.000 Individuen/ml vorhanden ist.
Ausgehend vom oben beschriebenen Assayverfahren haben die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes Antigene oder Antikörper mit magnetischen Mikroteilchen markiert und erstmals den direkten Nachweis von Viren durchgeführt. Nun ist bestätigt worden, daß das magnetische Laser-Immunoassayverfahren eine höhere Bestimmungsempfindlichkeit aufweist als das RIA, auf das nachstehend bezuggenommen wird, das als das empfindlichste gilt. Beispielsweise war bei der Durchführung von Virusnachweisversuchen unter Verwendung inaktivierter Influenzaviren Typ A und Typ B als Virusmodell der Nachweis von Viren in einer Population in der Größenordnung von 1 Individuum/ml erfolgreich, wie die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes bei der 5. Generalversammlung der Japanischen Virologenvereinigung (November 1987, Vortrag Nr. 4011, "Virus Detection Experiment Using a Newly Developed Immunoassay Apparatus") berichtet haben.
Die US-A-4,710,472, die US-A-3,970,518 und die EP-A-0,206,077 beschreiben verschiedene Vorrichtungen, die auf der Fähigkeit von Elektromagneten basieren, magnetische Mikroteilchen festzuhalten. Antikörper-beladene Mikroteilchen werden verwendet, um konzentrierte Lösungen aus Leukämiezellen oder Zellen im allgemeinen, Bakterien, Viren, Antigenen usw. zu erhalten.
Jedoch befinden sich Techniken zur effizienten Sammlung von Proben wie Viren, Krebszellen oder Lymphozyten noch immer im Entwicklungsstadium und sind noch nicht in die Praxis umgesetzt worden.
Andererseits sind Beispiele für herkömmliche Mikroimmunoassayverfahren, die in die Praxis umgesetzt worden sind, Radioimmunoassay (RIA), Enzymimmunoassay (EIA), Fluoreszenimmunoassy (FIA) usw. Bei diesen Verfahren werden Antigene oder Antikörper verwendet, die mit einem Isotop, einem Enzym oder einer fluoreszierenden Substanz markiert sind, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von entsprechenden Antikörpern bzw. Antigenen festzustellen, die spezifisch damit reagieren.
RIA ist jedoch ein Verfahren, bei dem die Radioaktivität eines als eine Markierung verwendeten Isotops gemessen wird, um die Menge der Probe quantitativ zu bestimmen, die zur Antigen-Antikörper-Reaktion beigetragen hat, und zur Zeit ermöglicht nur das RIA Ultramikromessung mit einer Bestimmungsempfindlichkeit im Pikogrammbereich Jedoch unterliegt es in der Praxis vielen Einschränkungen, weil radioaktive Substanzen als Markierungssubstanz eingesetzt werden und spezielle Anlagen erforderlich sind und weil eine Abnahme der Markierungswirkung aufgrund der Halbwertszeit und anderer Faktoren berücksichtigt werden muß. Außerdem ist in Anbetracht der gegenwärtigen gesellschaftlichen Gegebenheiten, wonach die Entsorgung von radioaktiven Abfällen ein großes gesellschaftliches Problem darstellt, die Praktizierung des RIA natürlich eingeschränkt.
Andererseits handelt es sich bei Verfahren, bei denen Enzyme oder fluoreszierende Substanzen als Marker verwendet werden, um Verfahren, bei denen die Menge der Probe, die zur Antigen-Antikörper-Reaktion beigetragen hat, durch Bestimmen der Färbung oder Lumineszenz gemessen wird, und daher unterliegen sie nicht den Einschränkungen, die für RCA gelten. Jedoch liegt die Bestimmungsgrenze dieser Verfahen im Nanogrammbereich.
Wie oben beschrieben unterliegt von den herkömmlichen Immunoassayverfahren RIA, das eine hohe Bestimmungsempfindlichkeit aufweist, aufgrund der Verwendung radioaktiver Substanzen vielen Einschränkungen, und andererseits weisen EIA, FIA und ähnliche Verfahren, die leicht durchzuführen sind, eine geringe Bestimmungsempfindlichkejt auf und werden hauptsächlich für Tests in Bezug auf Antikörper eingesetzt. Da Tests auf Antikörper dazu bestimmt sind, durch Immunreaktionen bei Menschen gebildete Antikörper nachzuweisen, ist es im Prinzip unmöglich, Viren im Blut direkt nachzuweisen.
Die oben beschriebenen Markierungsverfahren wie RIA, EIA und FIA werden durchgeführt, indem einer Probe eine Überschußmenge eines Markerreagens, wie ein radioaktives Isotop, ein Enzym bzw. ein fluoreszierender Farbstoff, zugegeben wird und Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen der Probe und dem Markerreagens zugelassen wird, gefolgt vom Entfernen von nicht umgesetztem Markerreagens durch Waschen. Daher ist der Überschuß der Menge an Markerreagens gegenüber der Probe umso größer, je mehr die Menge der Probe abnimmt, was ein ernsthaftes Problem bewirkt, das darin besteht, daß das nach dem Waschen nicht entfernte Markerreagens unspezifische Reaktionen verursacht.
Weiters ist bei der Anwendung von magnetischem Laserimmunoassay zur Betrachtung von Viren, Krebszellen, Lymphozyten und ähnlichen Proben durch das Elektronenmikroskop eine Verbesserung der Technik zur Herstellung von Proben mit hoher Effizienz erforderlich.
Ausgehend von den Ergebnissen des Nachweises von Viren unter Einsatz des magnetischen Laserimmunoassays haben die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes bei einem am 20. Juni 1989 an der Universität Helsinki in Finnland abgehaltenen internationalen Symposium über die Chemotherapie von Viren und ihre klinische Anwendung Vorträge mit dem Titel "Detection of EB Virus Infected Cells by Magnetic Immunoassay", Vortrag Nr. M-26, und "A New Method for Detection of Virus Antigens", Vortrag Nr. M-31, gehalten.
Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben vorgeschlagen, das neue Verfahren "MIA-Verfahren" zu nennen. Um das MIA-Verfahren einsetzen zu können, ist es wichtig, ein Verfahren zur Herstellung von Proben zu entwickeln, mit dem eine sehr kleine Menge einer Probe mit Gewißheit magnetisch markiert werden kann.
Wolfang Muelier Ruffoltz et al., japanische Patentanmeldung (Kokai) Nr. 61-293562, "Trenner zum magnetischen Entfernen magnetisierbarer Teilchen", offenbart einen Trenner, für den ein Elektromagnet verwendet wird. Der Trenner, der dazu bestimmt ist, biologische Materialien zu fraktionieren, wobei auf magnetische Mikrosphären zurückgegriffen wird, um Zellen, Antigene, Antikörper, Enzyme usw. zu entfernen, ist so konstruiert, daß eine als Trenneinheit bezeichnete Teflonrohrleitung mit einer Länge von 1 bis 200 cm und einem Durchmesser von 0,1 bis 5 mm so verwunden ist, daß sie einen Kreis bildet, der in einen Elektromagneten eingepaßt ist, und eignet sich nicht zur Anwendung für die Herstellung von Proben, die nach dem magnetischen Laserimmunoassayverfahren zu messen sind, weil eine sehr große Menge an magnetisch markiertem Antikörper zu verwenden ist, sodaß es nicht gelingt, an den magnetisch markierten Antikörper gebundene Proben wiederzugewinnen.
Ein weiteres Problem des Trenners besteht darin, daß, wenn die Lange der Teflonrohrleitung verringert wurde, ein Großteil der Probe durch die Rohrleitung gelangt, ohne mit dem magnetisch markierten Antikörper zu reagieren, da der magnetisch narkierte Antikörper nur an der Wand der Teflonrohrleitung gehalten wird, obwohl die einzusetzende Menge des magnetisch markierten Antikörpers verringert würde.
Ein Nachteil, den die herkömmlichen Verfahren gemeinsam haben, besteht darin, daß es umso schwieriger ist, den magnetisch markierten Antikörper sicher in einem Elektromagneten zu halten, je kleiner die Ultramikroteilchen einer magnetischen Substanz sind. Das heißt, wenn eine Ultramikroprobe wie ein Virus magnetisch markiert wird, wird es vorgezogen, daß der magnetisch markierte Antikörper kleiner als das Virus ist. Es ist jedoch bekannt, daß die aus einer ferromagnetischen Substanz bestehenden magnetischen Mikroteilchen nichtferromagnetisch werden und in eine superparamagnetische Substanz umgewandelt werden, die nicht auf einen Magneten anspricht, wenn ihre Teilchengröße geringer wird. Beispielsweise wird Magnetit in eine superparamagnetische Substanz umgewandelt, wenn die Teilchengröße nicht mehr als 10 nm beträgt, und wenn magnetisch markierter Antikörper unter Verwendung von Magnetit mit einer Teilchengröße von nicht mehr als etwa 10 nm hergestellt wird, dauert es nach herkömmlichen Verfahren 1 Stunde oder länger, um den magnetisch markierten Antikörper unter Verwendung eines Magneten zu sammeln.
Daher ist eine weitere Verbesserung wünschenswert.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Allgemein gesagt schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Sammeln einer Probe oder zur Herstellung einer Probe, gekennzeichnet durch das magnetische Markieren einer Probe mit einem magnetisch-markierten Körper, der aus einem Mikroteilchen einer magnetischen Substanz und einem daran gebundenen Antikörper oder Antigen besteht und das Anlegen des Gradientenmagnetfeldes an die magnetisch markierte Probe, um die markierte Probe lokal in einer vorherbestimmten Position zu konzentrieren. Dem kann das Wiedergewinnen des Immunkomplexes folgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ermöglicht die vorliegende Erfindung die Beschleunigung der Antigen-Antikorper-Reaktion durch magnetische Kraft, um das magnetische Markieren der Probe wirksam durchzuführen.
Iin der Folge wird die vorliegende Erfindung im Detail unter Bezugnahme auf Ausführungsformen beschrieben, die Verbesserungen in Bezug auf das Sammeln von Proben, die Herstellung von Proben zur Betrachtung durch das Elektronenmikroskop und die Herstellung von Proben zur Verwendung bei magnetischen Laserimmunoassayverfahren, wie zuvor von der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen, betreffen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung einer Probensammelvorrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
Fig. 2 ist ein schematischer Ablaufplan eines Verfahrens zur Herstellung einer mit einem Elektronenmikroskop zu untersuchenden Probe nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
Fig. 3 ist eine schematische Querschnittansicht einer Vorrichtung zum Leiten und Fixieren einer magnetisch markierten Probe auf einem Gitter zur Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop;
Fig. 4 ist ein Elektronenmikrobild, das ein Bild des Influenzavirus, erhalten nach einem Verfahren zur Herstellung einer Probe wie in Beispiel 1 beschrieben, zeigt;
Fig. 5 ist ein Elektronenmikrobild, das ein Bild des Influenzavirus, erhalten nach einem Verfahren zur Herstellung einer Probe wie in Beispiel 2 beschrieben, zeigt;
Fig. 6 ist eine schematische perspektivische Ansicht einer Gitterhalterung;
Fig. 7 ist eine schematische Darstellung eines Schritts zum Konzentrieren und Reinigen einer Probe und eines Schritts zur Wiedergewinnung der Probe, worin (a) den Schritt der Konzentration und Reinigung darstellt und (b) den Schritt der Wiedergewinnung der Probe darstellt;
die Fig. 3 und 9 sind jeweils eine schematische perspektivische Ansicht einer Vorrichtung zur Herstellung einer Probe zur Untersuchung mit einem Elektronenmikroskop nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
die Fig. 10(a), 10(b), 10(c), 10(d) und 10(e) veranschaulichen Verfahren zur Herstellung einer Probe nach einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin 10(a) einen Schritt des Injizierens eines magnetisch markierten Antikörpers darstellt, 10(b) einen Schritt des Haltens des magnetisch markierten Antikörpers, 10(c) einen Schritt des Injizierens und Inkubieren einer Probe, 10(d) einen Schritt des Waschens und 10(e) einen Schritt der Wiedergewinnung der Probe;
Fig. 11 ist eine schematische perspektivische Ansicht einer Vorrichtung zur Herstellung einer Probe gemäß wieder einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
Fig 12 ist ein schematischer Ablaufplan, der ein Verfahren zur Herstellung einer Probe zur Untersuchung mit einem Elektronenmikroksop gemäß wieder einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;
Fig. 13 ist eine schematische perspektivische Ansicht, welche die Konstruktion einer Vorrichtung zur Herstellung einer Probe zur Untersuchung mit einem Elektronenmikroskop gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt; und
Fig. 14 ist eine schematische perspektivische Teilansicht eines Abschnitts zum Montieren eines Gitters zur Verwendung bei der Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop in einer Vorrichtung zur Herstellung einer Probe, die mit einem Elektronenmikroskop zu untersuchen ist.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß einer ersten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Sammeln einer Probe geschaffen, das folgende Schritte umfaßt:
das Unterziehen einer Probe und eines magnetisch markierten Antikörpers, der aus einem magnetischen Mikroteilchen und einem am Mikroteilchen fixierten Antikörper besteht, einer Antigen-Antikörper-Reaktion, um einen Immunkomplex zu bilden, der ein Komplex aus der Probe und dem magnetischen Mikroteilchen ist,
die Durchführung lokaler Konzentration des Immunkomplexes an einer vorherbestimmten - Position durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes, vorzugsweise Gradientenmagnetfeldes, das durch einen Elektromagneten und ein Magnetpolstück erzeugt wird, um den Magnetfluß an der genannten vorherbestimmten Position zu konzentrieren,
das Sammeln des Immunkomplexes durch direkte magnetische Adsorption zum Magnetpolstück hin an der Position der lokalen Konzentration.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wird ein Verfahren zum Sammeln einer Probe geschaffen, worin die Probe im ersten Schritt der obengenannten ersten Ausführungsform an einem nichtmagnetischen Teilchen fixiert wird, das eine größere Masse als der magnetisch markierte Antikörper aufweist, bevor die Probe und der magnetisch markierte Antikörper der Antigen-Antikörper-Reaktion unterzogen werden, und worin der nicht umgesetzte magnetisch markierte Antikörper durch Zentrifugieren abgetrennt und entfernt wird.
Bei diesen Verfahren können Proben wie Viren, Krebszellen und Lymphozyten gesmmelt werden. Beim Verfahren gemäß der zweiten Ausführungsform kann die Probe beispielswiese an den nichtmagnetischen Teilchen fixiert werden, indem die Oberfläche des nichtmagnetischen Teilchens nach einem bekannten Verfahren aktiviert wird und zugelassen wird, daß die Probe nichtspezifisch an der aktivierten Oberfläche adsorbiert wird, oder indem ein bekannter Antikörper an der Oberfläche des nichtmagnetischen Teilchens fixiert wird und die Probe und der bekannte Antikörper der Antigen-Antikörper-Reaktion unterzogen werden. Außerdern wird es bei diesen Verfahren vorgezogen, ein Magnetelement oder -stück an der Position der lokalen Konzentration einzusetzen, um darauf den Immunkomplex anzuziehen, gefolgt vom Abziehen des Magnetelements, um den an der Position der lokalen Konzentration konzentrierten Immunkomplex effizient zu sammeln.
Gemäß einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wird eine Vorrichtung zum Sammeln einer Probe geschaffen, umfassend
ein Testgefäß zur Aufnahme einer Lösung, die einen Immunkomplex enthält, der als Ergebnis der Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen einer Probe und einem magnetisch markierten Antikörper gebildet wird, der aus einem magnetischen Mikroteilchen und einem am Mikroteilchen fixierten Antikörper besteht,
eine Vorrichtung zur Erzeugung eines äußeren Magnetfeldes, um ein Magnetfeld, vorzugsweise Gradientenmagnetfeld zu erzeugen und es an die Losung im Testgefäß anzulegen, um lokale Konzentration des Immunkomplexes an eine vorherbestimmte Position zu bewirken,
ein Magnetpolstück zum Sammeln des Immunkomplexes an der Position der lokalen Konzentration durch direkte magnetische Absorption zum Magnetpol hin, und
einen Bewegungsmechanismus zur Erzielung relativer Bewegung zwischen dem Magnetpolstück und dem Testgefäß.
Bei der Vorrichtung zum Sammeln einer Probe gemäß vorliegender Erfindung ist das Testgefäß vorzugsweise ein Gefäß mit einer nach oben gerichteten Öffnung, um die lokale Konzentration und Sammlung des Immunkomplexes effizient durchführen zu können. Die Vorrichtung zur Erzeugung eines Gradientmagnetfeldes kann wünschenswert einen unter dem Testgefäß angeordneten Magneten und ein unmittelbar über der Oberfläche der im Gefäß enthaltenen Flüssigkeit angeordnetes und dem Magneten gegenüberstehendes Polstück umfassen.
Gemäß vorliegender Erfindung kann die Probe durch äußere magnetische Kraft sicher festgehalten oder gesammelt werden, da sie durch Antigen-Antikörper-Reaktion an den magnetisch markierten Antikörper gebunden ist. Wenn ein Gradientenmagnetfeld, das so beschaffen ist, daß das magnetische Potential der Sammelposition am höchsten ist, als äußere magnetische Kraft an den magnetiscn markierten Antikörper angelegt wird, wird der magnetisch markierte Antikörper an der Sammelposition lokal angeordnet und konzentriert, und die an den magnetisch markierten Antikörper gebundene Zielprobe kann gesammelt werden, indem die Sammelvorrichtung an der Position der Konzentration eingesetzt wird, um den magnetisch markierten Antikörper zu sammeln. In diesem Fall wird die Probe gemeinsam mit nicht umgesetztern magnetisch markiertem Antikörper gesammelt.
Wenn beabsichtigt wird, nur die Probe zu sammeln, kann ein Verfahren eingesetzt werden, bei dem ein nichtmagnetisches Teilchen eine Masse aufweist, die in ausreichendem Maße größer als die des magnetisch markierten Antikörpers ist. Das heißt, nachdem die Probe am nichtmagnetischen Teilchen fixiert wurde, wird der magnetisch markierte Antikörper daran gebunden, und dann wird die Reaktionsmischung zentrifugiert, um nur den Immunkomplex auszufallen, sodaß die Trennung und das Entfernen van nicht umgesetztem magnetisch markiertem Antikörper ermöglicht wird. Außerdem bewirkt die Aktivierung der Oberfläche des nichtmagnetisclien Teilchens, daß es die Probe nichtspezifisch bindet, sodaß ein unbekanntes Virus und ähnliches gefunden werden kann oder daß eine sehr kleine Probenmenge gesammelt wird. Anderseits eignet sich das spezifische Binden der Probe mit einem antikörperbeschichteten nichtmagnetischen Teilchen dafur, um nur die Probe zu sammeln.
Die Vorrichtung zum Sammeln einer Probe gemäß vorliegender Erfindung eignet sich zur Durchführung der oben beschriebenen Verfahren. Die Verwendung des nach oben hin offenen Testgefäßes und der Vorrichtung zur Erzeungung eines Gradientenmagnetfeldes, die den Magneten und das Polstück umfaßt, ermöglicht die Wahl eines beliebigen gewünschten Punktes an der Oberfläche der in Testgefäß enthaltenen Flüssigkeit als Position der lokalen Konzentration, an der das höchste Magnetfeld angelegt wird, wodurch die Sammlung des unter Verwendung des magnetisierten Magnetelements zur Position der lokalen Konzentration geleiteten und dort konzentrierten Immunkomplexes durch magnetische Anziehung an deren Oberfläche ermöglicht wird.
Unter Ausnutzung der obigen Merkmale der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine Probe zu einer an der Vorrichtung gewahlten Position der Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop zu leiten und dort zu konzentrieren, um eine Probe zu sammeln, sodaß jedes unbekannte Virus, das schwer zu kultivieren ist, auch in sehr kleinen Mengen direkt nachgewiesen werden kann, was einen wesentlichen Beitrag zur Entwicklung der Virologie leistet. Beispielsweise trägt die vorliegende Erfindung dazu bei, Hepatitisviren vom Nicht-A- und Nich-B-Typ zu finden. Sie ist auch nützlich zur Frühdiagnose von Krebszellen und ähnlichem auf zellularer Ebene und es kann damit eine sehr kleine Menge an Krebszellen gesammelt werden, die das von Krebs befallene Gewebe verlassen und in Körperfluid wie Blut Metastasen bilden. Darüber ist es gemäß vorliegender Erfindung auch möglich, nur in winziger Menge vorkommende physiologisch aktive Substanzen wie Enzyme und Hormone zu sammeln, die durch Antigen-Antikörper-Reaktion spezifisch gebunden werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht nur auf die Betrachtung von Proben durch ein Elektronenmikroskop anwendbar, sondern auch auf die Extraktion nur von Proben durch Einstellen des pH-Werts der Flüssigkeit auf 3,o bis 3,5 nach dem Sammeln der gewünschten Probe, um den magnetisch markierten Antikörper aus der Probe freizusetzen und den magnetisch markierten Antikörper durch einen Magnet zu entfernen. Die extrahierte Probe kann als ein Material zur Verwendung bei biochemischer Analyse, genetischer Analyse und genetischer Rekombination verwendet werden.
Wie oben angeführt, ist die vorliegende Erfindung sehr nützlich auf medizinischen und therapeutischen Gebieten, auf wissenschaftlichem Gebiet, wie in der Molekularbiologie, auf biotechnologischem Gebiet, wie bei Zellengineering, genetischem Engineering usw.
Gemäß einer vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein verfahren zur Herstellung einer Probe geschaffen, umfassend einen ersten Schritt, bei dem eine Probe magnetisch markiert wird, um eine magnetisch markierte Probe zu bilden,
einen zweiten Schritt, bei dem an die magnetisch markierte Probe ein Gradientenmagnetfeld angelegt wird, um die Probe auf die Oberfläche eines Gitters zur Verwendung bei Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop zu leiten, und die Probe auf dem Gitter zu fixiert wird, sowie
einen dritten Schritt, bei dem die magnetisch markierte Probe auf dem Gitter der Negativeinfärbung im Gradientenmagnetfeld unterzogen wird.
Gemäß einer fünften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann, um das Screenen von Proben zu erleichtern, ein für die Probe spezifischer Antikörper einer Probensuspension zugegeben werden, um die Probe vor dem magnetischen Markieren der Probe zum Koagulieren zu bringen.
Gemäß einer sechsten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann, wenn insbesondere die Konzentration und Reinigung von Proben gewünscht wird, ein Konzentrations- und Reinigungsschritt der Probe hinzugefügt werden, bei dem an die die magnetisch markierte Probe enthaltende Probensuspension ein Gradientenmagnetfeld angelegt wird, um nur die magnetisch markierte Probe lokal an der Oberfläche der Suspension oder Wasseroberfläche zu konzentrieren, und daraufhin wird ein dünnes Rohr an der Position der lokalen Konzentration eingesetzt, um die magnetisch markierte Probe zurückzugewinnen. Nach dem Konzentrations- und Reinigungsschritt wird der Schritt des Leitens und Fixierens auf die gleiche Art wie oben beschrieben durchgeführt.
Gemäß einer siebenten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Gitter auf einem abnehmbaren Film gehalten werden, durch den ein Gradientenmagnetfeld von der Rückseite des Films angelegt wird, sodaß das magnetische Potential am Sitterabschnitt am höchsten ist, wodurch die magnetisch markierte Probe zur Oberfläche des gitters geleitet und darauf fixiert wird.
Gemäß einer achten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung zur Herstellung einer Probe geschaffen, welche
ein Gefäß, enthaltend eine Flüssigkeit, die einen magnetisch markierten Immunkomplex enthält, der aus einer Probe und einem daran gebundenen magnetischen Mikroteilchen besteht,
eine Einrichtung zum magnetischen Konzentrieren des Immunkomplexes an einer vorherbestimmten Position,
eine Einrichtung zur Rückgewinnung des Immunkomplexes,
eine Einrichtung zum Tragen eines entfernbaren Gitters zur Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop in der Flüssigkeit, und
eine Einrichtung zum Heranführen des Immunkomplexes an die Oberfläche des Gitters und Fixieren des Immunkomplexes daran umfaßt.
Mit einem solchen Verfahren und einer solchen Vorrichtung kann die Probe durch das Anlegen eines äußeren Magnetfeldes verläßlich auf das Gitter zur Verwendung bei der Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop geführt und fixiert werden, da die Probe magnetisch markiert ist. Das magnetische Markieren der Probe kann auf zwei Arten durchgeführt werden. Ein Verfahren ist ein direktes Verfahren, bei dem ein magnetisch markierter Antikorper, der an einen Antikörper wie einen monoklonalen Antikörper gebunden ist, der spezifisch mit der Probe reagiert, direkt der Antigen-Antikörper-Reaktion mit der Probe unterzogen wird. Beim anderen Verfahren handelt es sich um ein indirektes Verfahren, bei dem IgG-Antikörper, der spezifisch mit der Probe reagiert, der Probe zugegeben wird, um die Probe zum Koagulieren zu bringen, und die Probe dann der Antigen-Antikörper-Reaktion mit einem magnetisch markierten Antikörper unterzogen wird, der an Protein A gebunden ist, das mit IgG-Antikörper reagiert. Das erstere Verfhahen, bei dem die Zielsubstanz wie ein Virus oder eine Zelle selektiv durch Antigen-Antikörper-Reaktion mit dem magnetisch markierten Antikörper gesammelt wird, ist die Verunreinigung durch andere Materialien als die Zielsubstanz minimal, und die Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop kann mit hoher Verläßlichkeit durchgeführt werden, indem der magnetisch markierte Antikörper als Marker gescreent wird. Andererseits weist das letztere Verfahren eine schlechtere Selektivität auf, da bei der Herstellung des magnetisch markierten Antikörpers verwendetes Protein A alle IgG-Antikörper umsetzt. Wenn die Zielsubstanz jedoch ein Ultramikrokörper die ein Virus ist, ist es insofern vorteilhaft, als die Zielsubstanz vor dem Screenen mit IgG-Antikörper zum Koagulieren gebrach- wird und es ausreicht, nur bezüglich des Vorhandenseins von magnetisch markierten Koagulaten zu screenen, was effiziente Betrachtung durch das Elektronenmikroskop ermöglicht.
Die bei der Herstellung von magnetisch markiertem Antikörper verwendeten magnetischen Mikroteilchen sind vorzugsweise eine ferromagnetische Substanz aus Oxiden auf Eisennbasis die Magnetit, Übergangsmetallen oder Seltenerdelementen. Sie haben eine höhere Dichte als lebende Organismen und sehen unter dem Elektronenmikroskop schwarz aus, was es einfach macht, ihr Vorhandensein zu bestätigen.
Üblicherweise enthalten die Proben eine Vielzahl fremder Substanzen in größeren Mengen als die Zielsubstanz. Die fremden Substanzen stören natürlich die Betrachtung durch das Elektronenmikroskop, und eines der wichtigen Ziele bei der Herstellung von Proben, die unter einem Elektronenmikroskop zu betrachten sind, besteht darin, die Zielsubstanz zu reinigen. Da ein lebender Organismus selbst nicht auf eine äußere magnetische Kraft anspricht, ist das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung, bei dem Proben magnetisch markiert werden und nur die Zielsubstanz abgetrennt wird, zur Reinigung der Zielsubstanz vorteilhaft. Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Gradientenmagnetfeld als äußeres Magnetfeld angelegt, das so beschaffen ist, daß lokale Konzentration von in einer Probensuspension enthaltenen magnetisch markierten Proben bewirkt wird, um die Zielsubstanz an einer Position lokaler Konzentration zu konzentrieren. Dann kann Reinigung und Konzentration der Proben gleichzeitig erreicht werden, indem ein dünnes Rohr an der Position der lokalen Konzentration eingesetzt wird, um die Zielsubstanz zu gewinnen. Die Proben werden auf der Oberfläche der Suspension oder Wasseroberfläche konzentriert oder lokal angeordnet, um Verunreinigung durch andere fremde Substanzen als die Zielsubstanz so weit wie möglich zu verhindern. Wenn beispielsweise der Boden des Gefäßes als eine Position lokaler Konzentration gewählt wird, ist die Verunreinigung durch fremde Substanzen, sedimentierte Zellen usw. unvermeidlich.
Die gereinigten und konzentrierten Proben werden dann auf ein Gitter zur Verwendung bei der Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop mit einem Durchmesser von üblicherweise etwa 3 mm aufgebracht und gefärbt, um die Betrachtung zu erleichtern. Bei den herkömmlichen Verfahren werden die Proben in allgemeinen fallen auf ein Kupfergitter aufgebracht und haften daran, auf dem eine Trägermembran aus Formbar usw. befestig ist, und dann werden überschüssige droben unter Verwendung von Filterpapier entfernt, gefolgt von Einfarben mit Phosphorwolframsäure oder einer ähnlichen Färbungsflüssigkeit, Entfernen der Färbungsflüssigkeit mit Filterpapier und natürlichem Trocknen. Die so gefärbten Proben werden dann der Betrachtung mit einem Elektronenmikroskop unterzogen. Das Entfernen von Proben und Färbungsflüssigkeit mit Filterpapier oder ähnlichem führt zur Absorption eines Großteils der auf das Kupfergitter aufgebrachten Probe durch Filterpapier, und nur eine kleine Teilmenge der Probe verbleibt auf dein Gitter. Das ist ein Grund, weshalb die Konzentration oder Population von Viren, die unter einem Elektronenmikroskop zu betrachten sind, in der Praxis nicht geringer als 100.000.000 Individuen/ml sein darf. Im Gegensatz dazu können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Proben in die Mitte der Oberfläche des Gitters für Elektronenmikroskope geleitet und dort fixiert werden, indem von der Rückseite einer Filmhalterung zum abnehmbaren Halten eines Gitters ein Gradientenmagnetfeld angelegt wird, sodaß das Magnetfeld im mittleren Abschnitt des Gitters am höchsten ist. Daher wird die magnetisch markierte Probe, wenn überschüssige Probe und Färbungsflüssigkeit mit Filterpapier entfernt werden, magnetisch am Gitter und nicht am Filterpapier usw. adsorbiert. Bei der Betrachtung von Virusteilchen ermöglicht das die problemlose Betrachtung einer stark verdünnten virushältigen Probe, beispielsweise in der Grbßenordnung von einigen -zig Inidividuen/ml, mit einem Elektronenmikroskop.
So kann unter Verwendung der Vorrichtung zur Herstellung einer Probe gemäß vorliegender Erfindung das Verfanren zur Herstellung einer Probe gemäß vorliegender Erfindung auf leichte Art durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Probe gewährleistet das präzise Leiten und Fixieren von Proben durch ein äußeres Magnetfeld auf das Gitter für das Elektronenmikroskop, da die Proben durch Antigen-Antikörper-Reaktion mit dem magnetisch markierten Körper magnetisch markiert sind, was die Bestimmungsempfindlichkeit für Proben deutlich verbessert. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Herstellung einer Probe können auch eine Reihe von Schritten zur Herstellung von Proben effizient und leicht durchgeführt werden. Die Erklärung konzentriert sich zwar auf den Fall der Verwendung von Influenzaviren, die erfindungsgemäßen Verfahren sind jedoch nicht auf die Präparierung von Viren beschränkt, sondern können auch auf die Betrachtung verschiedener Zellen, wie Krebszellen und Lymphozyten, durch ein Elektronenmikroskop angewandt werden.
Außerdem können die erfindungsgemäßen Verfahren nicht nur auf ein Verfahren angewandt werden, bei dem Proben auf einem Gitter negativ eingefärbt werden, sonden auch auf Verfahren, bei dem Proben in ein Harz eingebettet werden, gefolgt von Mikrotomie und Betrachtung unter dem Elektronenmikroskop. Herkömmlicherweise werden, wenn ein dünner Abschnitt hergestellt wird, Fixierungs-, Entwässerungs- und Einbettungsverfahren durchgeführt, während zur Sedimentation der Probe wiederholt zentrifugiert wird. Im Gegensatz dazu kann gemäß vorliegender Erfindung die Fixierung der Probe und ihre Entwässerung mit einem Alkohol leicht durchgeführt werden, da es möglich ist, die Probe zu einer gewünschten Position zu leiten und lokal anzuordnen und sie dort in einem Gradientenmagnetfeld zu halten anstatt sie zu zentrifugieren. Die Proben können auch nach dem Einbetten lokal angeordnet werden, und daher wird das Zerschneiden oder in Scheiben schneiden der Probe mit einem Mikrotom erleichtert.
Wie bei der oben beschriebenen achten Ausführungsform ermöglicht die vorliegende Erfindung den direkten Nachweis von unbekannten unkultivierbaren Viren auch in einer sehr kleinen Menge, was einen wesentlichen Beitrag zur Entwicklung der Virologie leistet. Beispielsweise trägt die vorliegende Erfindung zum Finden oder Screenen von Nicht-A- und Nicht-B-Hepatitisviren bei. Sie ist auch nuutzlich zur Fruhdiagnose auf zellularer Ebene, wie zur Diagnose von Krebszeilen usw., und ermöglicht die Beobachtung van Krebszellen im Metastasenstadium.
Gemäß einer neunten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein verfahren zur Herstellung einer Probe geschaffen, welches
einen Schritt des Injizierens einer Probe an einer Stelle innerhalb eines Reakturs, die eine Halteposition des magnetisch markierten Körpers darstellt, an der ein aus einem magnetischen Mikroteilchen und einem daran gebundenen Antikörper oder Antigen zusammengesetzter magnetisch markierter Antiköper gehalten wird, und die auf dar Oberfläche eines magnetischen Elements, das im Reaktor angeordnet ist, durch äußere magnetische Kräfte bestimmt wird, umfaßt, um die Probe und den magnetisch markierten Körper der Antigen-Antikörper-Reaktion zu unterwerfen.
und welches einen Schritt umfaßt, bei dem der magnetisch markierte Antikörper rückgewonnen wird, indem das Anlegen der äußeren Magnetkraft aufgehoben wird, worin das Halten des magnetisch markierten Körpers durchgeführt wird, indem ein Magnetelement innerhalb des Reaktors magnetisiert wird, und die Rückgewinnung des magnetisch markierten Elements durchgeführt wird, indem das magnetische Element entmagnetisiert wird.
Gemäß einer zehnten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Magnetisieren des Magnetelements im Gradientenmagnetfeld durchgeführt, um präzises Halten des magnetisch markierten Körpers auf dem Halteabschnitt für magnetiscn markierten Körper zu bewirken, und die Rückgewinnung des magnetisch markierten Körpers wird durch die Entmagnetisierung des Magnetelements in Verbindung mit Vibration des Magnetelements durchgeführt, um den Komplex, der aus der Probe und dem magnetisch an der Oberfläche des Magnetelements adsorbierten magnetisch markierten Körper besteht, zwangsweise freizusetzen, um die Rückgewinnung des magnetisch markierten Körpers zu gewährleisten.
Gemäß einer elften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen der Probe und dem magnetisch markierten Körper durchgeführt, während die Probe durch die Halteposition für magnetisch markierten Körper zirkuliert wird, um Umsetzung einer kleinen Menge der Probe mit dem magnetisch markierten Körper zu gewährleisten.
Gemäß einer zwölften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen der Probe und dem magnetisch markierten Körper durchgeführt, während das Magnetelement in Schwingung gehalten wird.
Bei dieser Ausführungsform handelt es sich um ein Verfahren zur Herstellung einer Probe gemäß vorliegender Erfindung, bei dem magnetische Mikroteilchen, die Mikroteilchen einer magnetischen Substanz sind, zum markieren einer Immunreaktion verwendet werden, und der magnetisch markierte Körper durch den ein Gradientenmagnetfeld erzeugenden Mechanismus zum Halteabschnitt für magnetisch markierten Körper weitergeleitet wird und magnetisch am Magnetelement adsorbiert wird, das innerhalb des Halteabschnitts für magnetisch markierten Körper eingesetzt ist.
Um eine winzige Menge der Probe effizient magnetisch mit dem magnetisch markierten Körper zu markieren, ist es vorteilhaft, den Bereich, wo Antigen-Antikörper-Reaktion stattfindet, so weit wie möglich auszudehnen. Daher kann das Magnetelement vorzugsweise aus einem dünnen Draht aus einem weichen magnetischen Material bestehen, der beispielsweise in Form einer Spule aufgewickelt ist, sodaß die Oberfläche des Magnetelements so groß wie möglich sein kann. Was das weiche magnetische Drahtmaterial betrifft, sind Materialien mit großer Permeabilität geeignet, die geringe Restmagnetisierung aufweisen. Beispiele für das Material mit hoher Permeabilität, das verwendet werden kann, sind Nickel, reines Eisen, Permaloy, amorphe Legierungen usw. Der Durchmesser des dünnen Drahtes liegt vorzugsweise im Bereich von 20 um bis 1 mm, und mehr bevorzugt 50 um bis 0,2 mm. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt. Wenn das Magnetelement von außerhalb durch einen Magneten magnetisiert wird, wird ein Magnetfeld mit einem steilen Gradienten um jeden Draht erzeugt, was dazu führt, daß der magnetisch markierte Körper magnetisch an der Oberfläche eines jeden Drahtes adsorbiert wird. Daher kann der magnetisch markierte Körper umso besser im Halteabschnit für magnetisch markierten Körper gehalten werden, je höher die Dichte des Drahtes ist.
Wünschenswerterweise ist das vom Magneten erzeugte Magnetfeld groß. Andererseits verursacht das eine Vergrößerung der Vorrichtung. Es ist daher angemessen, Magneten mit einem Magnetfeld in der Größenordnung einigerkG bis einiger -zig kG zu verwenden. Der Magnet kann ein Elektromagnet oder ein Permanentmagnet sein.
Das Vorsehen des Halteabschnitts für magnetisch markierten Köprer in einem Teil des Reaktors, welcher Teil eine beschränkte Form hat, führt zu einer Reduktion der Breite des Magnetspaltes, was eine sehr kleine Ausführung des Magneten zuläßt. Dieses Verfahren ist auch vorteilhaft, um die Probe zum Magnetelement zu leiten und die Möglichkeit zum Kontakt zwischen der Probe und dem magnetisch markierten Körper zu erhöhen. Das vorteilhaftaste Verfahren zum Erhöhen der Möglichkeit zum Kontakt zwischen der Probe und dem magnetisch markierten Körper besteht darin, die Probe beispielsweise durch eine Pumpe zirkulieren zu lassen. Die Zirkulationsrate der Probe kann je nach der Menge der Probe, der Stärke des Magnetfeldes, der Dichte, mit der das Magnetelement geladen ist usw. variieren, aber es wird vorgezogen, die Probe mit einer Rate von 1 ml bis 100 ml pro Stunde zu zirkulieren.
-Ein weiteres wirksames Verfahren zum Erhöhen der Moglichkeit des Kontakts zwischen der Probe und dem magnetisch markieren Körper besteht darin, die Antigen-Antikörper-Reaktion durchzuführen, während eine Gruppe von Drähten aus einer magnetischen Substanz leicht in Schwingung gehalten wird. Durch leichtes Rühren der die Probe enthaltenden Suspension kann die zum magnetischen Markieren erforderliche Zeitspanne verringert werden.
Gemäß vorliegender Erfindung kann eine winzige Probenmenge effizient und präzise magnetisch markiert werden, sodaß die Menge an magnetisch markiertem Körper, die bei herkömmlichen Verfahren in einem großen Überschuß vorliegt, beträchtlich, beispielsweise auf ein Ausmaß von einem Zehntel oder weniger, verringert werden kann. Außerdem ist es gemäß vorliegender Erfindung möglich, das Screenen oder Sammeln von Virus in einer verdünnten Lösung durchzuführen, in der nur einige wenige Individuen pro ml vorliegen.
Nach dem obigen Schritt ist es wichtig, die an den magnetisch markierten Körper gebundene Probe vollständig zurückzugewinnen. Zu diesem Zweck muß das Magnetelement entmagnetisiert werden. Das vollständigste Entmagnetisierungsverfahren besteht darin, als Magnetelement ein Material mit hoher Permeabilität zu verwenden, das keine Restmagnetisierung aufweist, und das Magnetfeld des Magneten aufzuheben. Wenn ein Elektromagnet als Magnet verwendet wird, muß auf die Entmagnetisierung des Kerns des Elektromagneten geachtet werden. Da es oft der Fall ist, daß der magnetisch markierte Körper an der Oberfläche des Magnetelements haften bleibt, auch nachden das Magnetfeld aufgehoben werden ist, wäre oft eine große Menge an Waschflüssigkeit oder Rückgewinnungsflüssigkeit erforderlich. Gemäß vorliegender Erfindung wird die effiziente Rückgewinnung des magnetisch markierten Körpers erreicht, indem das Magnetelement in einer kleinen Menge Rückgewinnungsflüssigkeit mechanisch bewegt wird.
Durch heftige Schwingungen des Magnetelements kann der am Magnetelement haftende magnetisch markierte Körper abgelöst werden. Die Schwingungsfrequenz ist um eine Zehnerpotentz kürzer als jene der Schwingung zur Zeit der Beschleunigung der Antigen-Antikörper-Reaktion. Es wird vorgezogen, die Schwingungen beispielsweise mit einer Frequenz von 10 bis 60 Hz durchzuführen.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Probe gemäß vorliegender Erfindung kann wie oben angeführt durchgeführt werden.
Nach der Herstellung von Proben gemäß vorliegender Erfindung kann die erhaltene Probe zum Nachweis einer sehr kleinen Menge an Antigenen oder Antikörpern unter Einsatz der/des oben beschriebenen magnetischen Laserimmunoassayverfahrens und -vorrichtung verwendet werden.
Gemäß einer dreizehnten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung zur Herstellung einer Probe geschaffen, die umfaßt:
einen Reaktor,
einen Halteabschnitt für magnetisch markierten Körper innerhalb des Reaktors zum Halten eines magnetisch markierten Körpers, der aus einer Probe und einem an die Probe gebundenen magnetischen Mikroteilchen besteht,
einen Magneten, der dem Halteabschnitt für magnetisch markierten Körper zugeordnet und außerhalb des Reaktors angeordnet ist,
einen Erzeugungsmechanismus für ein Gradientenmagnetfeld, der dem Magneten zur Erzeugung eines Gradientenmagnetfeldes zugeordnet ist,
ein innerhalb des Reaktors angeordnetes Magnetelement,
einen Probenzirkuliermechanismus zum Zirkulieren der Probe
und einen Rückgewinnungsmechanismus zum Rückgewinnen der magnetisch markierten Probe,
wobei der Rückgewinnungsmechanismus einen Mechanismus umfaßt, um den Magneten und den Halteabschnitt für magnetisch markierten Körper in Relativbewegung zu versetzen, um die an die magnetisch markierte Probe angelegte magnetische Kraft aufzuheben.
Um die Rückgewinnung der Probe zu gewährleisten, wird es vorgezogen, daß das Magnetelement beweglich ist und der Probenrückgewinnungsmechanismus mit einem Mechanismus zum zwangsweisen Freisetzen eines Komplexes zwischen dem am Magnetelement magnetisch adsorbierten magnetisch markierten Körper und der Probe nach dem Aufheben der Magnetischen Kraft versehen ist.
Bei der Verfahren nach der neunten bis zwölften Ausführungsform gemäß vorliegender Erfindung ist vorgesehen, daß die Probe um das Magnetelement geschickt wird, auf dem der magnetisch markierte Körper gehalten wird, sodaß die Chance für Kontakt oder Aufeinandertreffen zwischen der Probe und dem magnetisch markieren Körper im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Proben für RIA usw. zunimmt, bei denen eine große Überschußmenge eines Standardreagens der Probenlösung zugegeben wird, um die Möglichkeit zum Kontakt zwischen der Probe und dem Reagens zu erhöhen. Da die Verringerung der zuzugebenden Menge der Markierungssubstanz (magnetisch markierter Körper) um etwa eine Zehnerpotenz möglich ist, ist die vorliegende Erfindung vorteilhaft für die Verringerung des Auftretens nichtspezifischer Reaktion aufgrund von nicht umgesetztem magnetisch markiertem Körper. Als Ergebnis wird das S/N-Verhältnis bei der Messung verbessert, was sehr wirskam die Bestimmungsempfindlichkeit verbessert. Da teure Antikörper wie monoklonale Antikörper effizient eingesetzt werden können, ist eine Einsparung bei der praktischen Durchführung der Erfindung möglich.
Weiters ist die vorliegende Erfindung auch vorteilhaft beim Nachweis eines Virus, das in sehr begrenzter Menge in einer großen Probenmenge wie Gurgelwasser von einem Patienten vorhanden ist, da die Probe kontinuierlich oder sequentiell umgesetzt werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Automatisierung. Außerdem verursachen nichtmagnetische Teilchen und Magnetische Mikroteilchen, die als Marker verwendet werden, kein Problem hinsichtlich Radioaktivität und Toxizität für Menschen, und daher können die gegenüber Proben stabilen leicht und sicher erhalten werden, was einen zusätzlichen Vorteil der vorliegenden Erfindung darstellt.
Die neunte bis zwolfte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann nicht nur für den Nachweis von Viren sondern auch für die Frühdiagnose von Krebs, Allergie-, Bakterientests usw., Bestimmungen verschiedener Hormone die Peptidhormone oder verschiedener Enzyme, Vitamine, Arzneimittel eingesetzt werden, welche Bestimmungen bisher nach dem RIA-Verfahren durchgeführt worden sind. Daher können präzise Bestimmungen, die bisher außer unter Einsatz des RIA-Verfahrens in einer eingeschränkten Anlage nicht durchgeführt werden konnten, in einer allgemeineren Umgebung in weitem Umfang durchgeführt werden, was es möglich macht, wirksame Therapie in frühen Stadien zu praktizieren.
Des weiteren kann die vorliegende Erfindung gemäß der neunten bis zwölften Ausführungsform für die Abtrennung und das Entfernen von Viren aus gespendetem Blut sowie verschiedene immunologische Diagnosen eingesetzt werden. Das heißt, die Verwendung der magnetischen Mikroteilchen als eine Markierungssubstanz macht es möglich, Virus, das durch Antigen- Antikorper-Reaktion an den magnetisch markierten Körper gebunden ist, in gespendetem Blut durch äußere magnetische Kraft spezifisch einzufangen und zu entfernen. Die Erklärung erfolgte zwar unter Bezugnahme auf das Influenzavirus als Modell, aber wenn je nach der Art des Virus der magnetisch markierte Körper auf geeignete Art gewählt wird, kann gemäß vorliegender Erfindung jedes Virus abgetrennt und entfernt werden. Unter Verwendung einer Mischung aus einer Vielzahl magnetisch markierter Körper können das AIDS-Virus, ATL-Virus, Nicht-A- und Nicht-B-Hepatitisvirus gleichzeitig aus gespendeten Blut entfernt werden. Außerdem können Nicht-A- und Nicht-B-Hepatitisviren, deren Vorhandensein noch nicht bestätigt worden ist, entfernt werden, wenn IgG aus dem Serum eines Patienten, der an Nicht-A- und/oder Nicht-B-Hepatits leidet, oder eines immunisierten Schimpansen isoliert wird, und magnetisch markierter Antikörper daraus hergestellt wird.
Außerdem ist die dreizehnte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nicht nur zur Abtrennung und das Entfernen der oben beschriebenen Viren, sondern auch für die Reinigung von Viren wirksam. Wenn beispielsweise beabsichtigt wird, ein unbekanntes Virus zu finden, ist es oft der Fall, daß Verunreinigungen wie verschiedene Proteine und ähnliche Substanzen die Betrachtung durch das Elektronenmikroskop stören. Andere Verunreinigungen als das Virus verursachen im Fall der Herstellung von Impfstoffen Probleme, weil sie der Grund für die Nebenwirkungen von Impfstoffen sind. Andererseits wird, wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung verwendet wird, das Zielvirus mit dem magnetisch markierten Körper eingefangen und an der Oberfläche des Magnetelements magnetisch adsorbiert, und daher kann Virus durch das Aufheben der magnetischen kraft und die Rückgewinnung von Virus nach dem Abwaschen des adsorbierten Virus gereinigt werden. Der an das Virus gebundene magnetisch markierte Körper kann leicht freigesetzt werden, indem die Flüssigkeit oder das Medium in der Größenordnung von pH 3 bis 4 angesäuert wird.
Die vorliegende Erfindung kann eingesetzt werden, um ebenso wie Viren auch eine Krebsmarkierung und eine sehr geringe Menge an Krebszellen einzufangen, die vom Krebsgewebe freigesetzt wurden und sich in einem Stadium der Metastasenbildung im Körperfluid wie Blut befinden. Daher ist die vorliegende Erfindung auch wirksam bei der Frühdiagnose von Krebszellen auf Zellebene. Weiters kann gemäß vorliegender Erfindung eine winzige Menge an physiologisch aktiven Substanzen, wie Enzymen, Hormonen usw. eingefangen werden, die durch Antigen-Antikörper-Reaktion spezifisch gebunden werden.
Gemäß einer vierzehnten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Probe geschaffen, welches umfaßt:
einen ersten Schritt, bei dem eine Probe in einer die Probe enthaltenden Suspension magnetisch markiert wird,
einen zweiten Schritt, bei dem lokale Konzentration der Probe durchgeführt wird, indem ein Gradientenmagnetfeld an die Lösung angelegt wird,
worin die Probe auf eine vorherbestimmte Position an oder in Hähe der Oberfläche der Suspension konzentriert wird und ein Gitter zur Verwendung bei der Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop an der Position der lokalen Konzentration eingesetzt wird, um die Probe auf dem Gitter rückzugewinnen.
Der erste Schritt dieser Ausführungsform kann beispielsweise durchgeführt werden, indem der magnetisch markierte Körper durch Antigen-Antikörper-Reaktion an die Probe gebunden wird. Die im magnetisch markierten Körper verwendeten magnetischen Mikroteilchen können vorzugsweise ferromagnetische Substanzen wie Oxid auf Eisenbasis wie Magnetit, Übergangsmetall oder Seltenerdelemente sein.
Gemäß einer fünfzehnten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Gradientenmagnetfeld von der Seite des Gitters an die Suspension angelegt, die der Seite gegenüberliegt, an der die magnetisch markierte Probe wiedergewonnen wird, sodaß das Magnetfeld an der Position des Gitters am höchsten ist, um die magnetisch markierte Probe zum Gitter zu leiten und dort zu fixieren.
Nach der Rückgewinnung der Probe auf dem Gitter kann entweder das die Probensuspension enthaltende Gefäß oder das Gitter bewegt werden. Wenn es gewünscht wird, die direkt am Gitter fixierte Probe durch magnetische Adsorption oder Anziehung weiter zu reinigen, sind gute Ergebnisse zu erzielen, indem Vorgänge des Eintauchens des Gitters in das Gefäß, in das unter dem Anlegen eines Magnetfeldes Waschflüssigkeit eingespritzt wird, und des anschließenden Herausnehmens daraus wiederholt werden. Mit dem so durchgeführten Waschen können Verunreinigungen, die nicht magnetisch adsorbiert sind, entfernt werden, während magnetisch markierte Probe am Gitter fixiert bleibt.
Die so konzentrierte und gereinigte Probe kann, wenn gewünscht, eingefärbt werden, sodaß Betrachtung durch das Elektronenmikroskop leicht durchgeführt werden kann. Es wird vorgezogen, den Einfärbungsvorgang durchzuführen, indem das Gitter, auf dem die Probe fixiert ist, in ein Gefäß getaucht wird, in dem sich Einfärbungsflüssigkeit wie Phosphorwolframsäure usw. befindet, und nach einem vorherbestimmten Zeitraum unter dem Anlegen eines Magnetfeldes herausgezogen wird.
Nach der Herstellung der Probe auf diese Weise wird sie der Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop unterzogen.
Bei der praktischen Durchfuhrung des Verfahrens zur Herstellung einer Probe zur Betrachtung mit einem Elektronenmikroskop ist es vorteilhaft, eine Vorrichtung zur Herstellung einer Probe zur Elektronenmikroskopie zu verwenden, die einen Erzeugungsmechanismus für ein Gradientenmagnetfeld zur Erzeugung eines Gradientenmagnetfeldes, eine Gitterhalterung zum Halten eines Gitters zur Verwendung bei der Betrachtung mit einem Elektronenmikroskop (Gitterhalterung) in einer Position, in der das Gradientenmagnetfeld konzentriert ist, und einen Führungsmechanismus, um die Gitterhalterung zur Wasseroberfläche im Gefäß zu führen, umfaßt.
Was die Vorrichtung zur Erzeugung eines Gradientenmagnetfeldes betrifft, kann eine verwendet werden, wie in der achten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben. Das heißt, es kann eine Vorrichtung verwendet werden, die einen über einem Elektromagneten angeordneten Probenbehälter und ein Polstück in Form eines Bleistifts mit einem Spitzendurchmesser so groß wie der Durchmesser eines Gitters umfaßt, wobei das Polstück unmittelbar über der Wasseroberfläche im Probenbehälter angeordnet ist und das Polstück dem Elektromagneten gegenüberliegt. Da der vom Elektromagneten ausgestrahlte Magnetfluß sich zum bleistiftförmigen Polstück hin konzentriert, ist das Magnetfeld unmittelbar unter dem Polstück am höchsten.
Was die Gitterhalterung betrifft, kann vorteilhaft ein Gittergestell aus einer nichtmagnetischen Substanz verwendet werden, das so konstruiert ist, daß es an der Spitze des bleistiftförmigen Polstücks angebracht ist. das Gitter kann beispielsweise unter Verwendung eines doppelseitigen Klebefilms am Gittergestell montiert sein, der an eine Seite des Gittergestells gepreßt ist, um daran zu kleben, und an dessen anderer Seite das Gitter fixiert ist.
Bei der oben beschriebenen vierzehnten Ausführungsform ist die Probe an oder in der Nähe der Oberfläche der Probensuspension konzentriert, und das Gitter ist an der Position der lokalen Konzentration eingesetzt, um eine Probe aus der Probensuspension rückzugewinnen, die nur eine winzige Menge der Probe, die Zielsubstanz, aber dafür viele fremde Substanzen enthält, was es möglich macht, die Probe im gleichen Zustand wie eine gereinigte zurückzugewinnen. Daher ermöglicht es das Verfahren zur Herstellung einer Probe gemäß vorliegender Erfindung, die Bestimmungsempfindlichkeit bei der Betrachtung durch das Elektronenmikroskop drastisch zu erhöhen. Außerdem ist die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sehr einfach, was eine Reihe von Schritten zur Herstellung einer Probe effizienter macht.
Bei der fünfzehnten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Herstellungsvorgang problemlos durchgeführt werden, indem an die Probensuspension von der Rückseite des Gitters ein Gradientenmagnetfeld angelegt wird, sodaß das Magnetfeld an der Position des Gitters am stärksten ist, um die magnetisch markierte Probe zum Gitter zu leiten und dort zu fixieren.
Gemäß einer sechzehnten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren zur Herstellung einer Probe effizient unter Verwendung einer Vorrichtung zur Herstellung einer Probe durchgeführt wird, die
einen Mechanismus zum Erzeugen eines Gradientenmagnetfeldes,
eine Gitterhalterung zum Halten eines Gitters zur Verwendung bei der Betrachtung mit einem Elektronenmikroskop an einer Position, wo das Gradientenmagnetfeld konzentriert ist, und
einen Führungsmechanismus umfaßt, um die Gitterhalterung zu einer vorherbestimmten Position an der Oberfläche der in einem Gefäß enthaltenen Suspension zu führen.
Wie oben beschrieben ist es gemäß der vierzehnten bis sechzehnten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung möglich, unbekannte, unkultivierbare Viren auch in einer winzigen Menge direkt nachzuweisen, was einen Beitrag zur Entwicklung der Virologie darstellt. Beispielsweise kann die vorliegende Erfindung dazu beitragen, Nicht-A- und Nicht-B-Hepatitisviren zu finden. Weiters ist die vorliegende Erfindung für die Frühdiagnose von Krebszellen usw. auf zellularer Ebene wirksam und macht es möglich, eine winzige Menge an Krebszellen zu betrachten, die aus Krebsgewebe freigesetzt werden und in Körperfluid wie Blut Metastasen bilden.
Gemäß der vierzehnten bis sechzehnten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird nur die magnetisch markierte Probe zu dem Punkt geleitet, wo das Magnetfeld am stärksten ist, wenn ein Gradientenmagnetfeld an die die magnetisch markierte Probe enthaltende Probensuspension angelegt wird, um sammelt sich dort.
Obwohl die Probensuspension neben der Zielsubstanz lebende Organismen als fremde Substanzen in größeren Mengen enthält, sprechen die lebenden Organismen nicht auf äußere magnetische Kraft an, was dazu führt, daß nur die magnetisch markierte Probe zur Position der lokalen Konzentration geleitet wird.
Da sich die Position der lokalen Konzentration auf oder in der Nähe der Oberfläche der Probensuspension befindet, kann die Verunreinigung mit frendem Substanzen und Zellen, die sich am Boden des Gefäßes abgesetzt haben, verhindert werden. Das verringert die Verunreinigung mit anderen Substanzen als der Zielsubstanz weiter. Als Ergebnis befindet sich die Probe im gleichen Zustand, als wäre sie gereinigt.
Wenn das Gitter zur Verwendung bei der Betrachtung mit einem Elektronenmikroskop an der Position eingesetzt wird, wo der magnetisch markierte Körper lokal konzentriert ist, haftet die magnetisch markierte Probe an der Oberfläche des Gitters, was dazu führt, daß eine große Menge an gereinigter Probe auf dem Gitter wiedergewonnen werden kann.
Da die magnetischen Mikroteilchen im so wiedergewonnenen magnetisch markierten Körper eine größere Dichte als lebende Organismen aufweisen, sind die magnetischen Mikroteilchen unter dem Elektronenmikroskop als schwarz zu erkennen, sodaß ihr Vorhandensein sehr leicht bestätigt werden kann.
Außerdem wird beim Verfahren zur Herstellung einer Probe zur Verwendung bei der Betrachtung mit einem Elektronenmikroskop die Probe auf dem Gitter rückgewonnen, indem das Gitter an der Position der lokalen Konzentration des durch das Anlegen eines Gradientenmagnetfeldes lokal angeordneten magnetisch markierten Körpers eingesetzt wird, und wenn nach dem Vorgang der Rückgewinnung weitere Reinigung oder Einfärbung der Probe gewünscht wird, können die nachfolgenden Arbeitsgänge leicht in dem Zustand durchgeführt werden, daß an das Gitter immer noch ein Gradientenmagnetfeld angelegt wird. Durch das Anlegen des Gradientenmagnetfeldes an das Gitter kann der Verlust von so rückgewonnener Probe während der Reinigung oder Einfärbung verhindert werden, was zu einer weiteren Verbesserung der Bestimmungsempfindlichkeit führt. Beispielsweise kann eine verdünnte Probe wie eine solche nachgewiesen werden, die Viren in einer Population in der Größenordnung einiger -zig Individuen pro ml enthält.

BEISPIELE

Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen und Beispiele detaillierter beschrieben, diese sollten jedoch nicht als Einschränkung der Erfindung betrachtet werden.

BEISPIEL 1

Fig. 1 zeigt ein Beispiel für eine Vorrichtung zum Sammeln einer Probe gemäß der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin Bezugszahl 1 ein Testgefäß, 2 einen Antigen-Antikörper-Reaktion-Komplex (oder Immunkomplex), der eine nachzuweisende oder zu bestimmende Probe enthält, 3 ein Magnetstück, 4 eine Haspelwinde oder Montagewinde, 5 einen Elektromagneten, 6 ein Polstück und 7 ein Joch bezeichnet. Der vom Elektromagneten 5 ausgehende Magnetfluß geht durch das Testgefäß oder den Probenbehälter 1 und wird vom Polstück 6 aufgenommen und geht über das Joch 7 zum Elektromagneten zurück, sodaß ein magnetischer Kreis geschaffen wird. Das Polstück 6 mit einem spitzen Ende mit einem Querschnitt, der ausreichend kleiner als jener des Elektromagneten 5 ist, ist unmittelbar über dem Testgefäß 1 angeordnet, um ein Gradientenmagnetfeld zu bilden, sodaß der Magnetfluß am Polstück 6 konzentriert wird. Für diesen Zweck ist der Durchmesser des Elektromagneten 5 bei diesem Beispiel mit 100 mm festgelegt, und der Durchmesser des Polstücks 6 ist mit 8 mm festgelegt, wobei die Spitze des Polstücks eine konische Form hat, und das Polstück 6 ist unmittelbar über der Oberfläche oder dem Spiegel der im Testgefäß enthaltenen Flüssigkeit angeordnet, wobei die Höhe von der Oberfläche der Flüssigkeit 10 mm beträgt. Das Polstück 6 ist mit einem Durchgangsloch mit einem Durchmesser von 0,2 mm im Mittelabschnitt im Querschnitt entlang seiner Länge versehen. In das Durchgangsloch ist ein dünner Nickeldraht 3 mit einem Durchmesser von 50um (der aus einer ferromagnetischen Substanz besteht) eingeschoben, der durch die Haspelwinde 4 vertikal beweglich ist. Der unmittelbar unter dem Polstück 6 auf der Flüssigkeitsoberfläche konzentrierte Immunkomplex wird auf dem magnetisierten, dünnen Nickeldraht 3 magnetisch adsorbiert, indem der Draht 3 in die Lösung im Testgefäß eingebracht wird und der Draht 3 daraufhin über die Flüssigkeitsoberfläche gehoben wird, um die Probe zu sammeln. Nach dem Sammeln wird die Spitze des Drahtes abgeschnitten, und die Spitze wird in die Probenkammer eines Elektronenmikroskops eingebracht, um die Oberfläche des Nickeldrahtes 3 zu betrachten. Als Ergebnis wurde die Zielprobe beobachtet.
Als die Vorrichtung zum Sammeln von Probe verwendet wurde, um Influenzaviren zu sammeln, war die Betrachtung einer verdünnten Probe, die Virus in einer Population in der Größenordnung von 10 Individuen/ml enthielt, zum erstenmal erfolgreich. Wie allgemein bekannt ist, ist es notwendig, Virus in einem Ei bis zu einer Population in der Größenordnung von 1.000.000 Individuen/ml zu kultivieren.
Das Magnetstück 3 ist nicht auf dünnen Nickeldraht beschränkt, sondern es kann auch ein dünner Draht oder Film aus irgendeiner ferromagnetischen Substanz als Sammler verwendet werden. Anstatt das Magnetstück 3 hochzuheben, kann das Magnetstück 3 am Polstück 6 fixiert werden, und das Polstück 6 kann gemeinsam mit dem Magnetstück 3 auf- und abbewegt werden. Alternativ dazu kann das Magnetstück 3 fixiert werden und das Testgefäß 1 kann auf- und abbewegt werden.

Beispiel 2

Anti-Ishikawa-Kaninchenimmunserum (Influenzavirus Typ A), das an der Oberfläche nichtmagnetischer Teilchen aus Acrylpolymer mit einem Durchmesser von 1 um fixiert war, und Gurgelwasser von einem Patienten wurden bei 35ºC 2,5 Stunden lang umgesetzt. Dann wurde die Reaktion nach der Zugabe von magnetisch markiertem Antikörper, der aus Anti-Ishikawa-Ferrat-IgG bestand, weitere 2,5 Stunden lang bei 25ºC fortgesetzt, gefolgt von 5minütigem Zentrifugieren mit einer Geschwindigkeit von 1.500 UpM. Das Präzipitat wurde in das in Fig. 1 gezeigte Testgefäß 1 gegeben, und nach Verdünnung mit 1 ml PBS-Lösung (Phosphatpuffersalzlösung) wurde die Probe auf die gleiche Weise gesammelt wie in Beispiel 1, gefolgt von Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop. Als Ergebnis wurde Influenzavirus Typ A erfolgreich nachgewiesen.

Beispiel 3

Nach dem Aktivieren der Oberfläche nichtmagnetischer Teilchen aus Acrylpolymer mit einem Durchmesser von 1 um, um die Adsorption von Virus zu erleichtern, wurde Gurgelwasser von einem Patienten zugegeben, und die Mischung wurde eine Nacht lang bei 35ºC umgesetzt. Daraufhin wurde Anti-Singapur-Ferrat-IgG (Influenzavirus Typ B) zugegeben, und die Mischung wurde bei 35ºC 2,5 Stunden lang umgesetzt, gefolgt von 5minütigem Zentrifugieren mit 1500 UpM, um nur die nichtmagnetischen Teilchen vollständig auszufällen. Das erhaltene Präzipitat wurde in das Testgefäß 1 in der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung eingebracht. Nach Verdünnung mit 1 ml PBS-Lösung (Phosphatpuffersalzlösung) wurde die Probe auf die gleiche Art wie in Beispiel 1 gesammelt und Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop unterworfen. Als Ergebnis wurde Influenzavirus Typ B erfolgreich nachgewiesen.

Beispiel 4

Fig. 2 ist ein schematischer Ablaufplan, der ein Beispiel für das Verfahren zur Herstellung einer Probe gemäß der vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, bei der der erste Schritt ein Schritt ist, bei dem die Probe magnetisch markiert wird, der zweite Schritt ein Schritt ist, bei dem die magnetisch markierte Probe zu einem Gitter zur Verwendung bei der Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop im Gradientenmagnetfeld geleitet und dort fixiert wird, und der dritte Schritt ein Schritt ist, bei dem Negativeinfärbung im Gradientenmagnetfeld durchgeführt wird. Bei der in diesem Beispiel verwendeten Probe handelt es sich um Influenzavirus Typ A (A/Ishikawa/7/82(H3N2)). Als Ergebnis von Blutgerinnungsreaktion und Blutzellenzählplatte wurde bestätigt, daß die Probe Virus in einer Population von 1.000.000 Individuen/ml enthielt. Das Influenzavirus in dieser Konzentration wurde mit PBS-Lösung in einem Verdünnungsverhältnis von 1/10 des ursprünglichen seriell verdünnt, und eine Grenze für die Betrachtung durch das Elektronenmikroskop wurde bestimmt. Zuerst wurde die Probe auf herkömmliche Art ohne magnetisches Markieren der Probe unter dem Elektronenmikroskop betrachtet, wobei das Vorhandensein von Virus nicht bestätigt werden konnte.
Auf den ersten Schritt dieses Beispiels bezugnehmend wird als Antikörper zum magnetischen Markieren IgG, das durch das Reinigen von Kaninchen-Hyperimmunantiserum gegen Virus erhalten wird, verwendet. Dieses wird durch kovalente Bindung an dextranbeschichtete magnetische Magnetitmikroteilchen mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 10 nm gebunden, um magnetisch markierten Antikörper zu erhalten. Das Markieren der Probe wurde durchgeführt, indem 1 ml der Probe und 10 ul der magnetisch markierten Antikörper bei 35ºC 2,5 Stunden lang inkubiert wurden.
Nun wird auf den zweiten Schritt dieses Beispiels bezuggenommen. Fig. 3 ist eine Querschnittansicht einer Vorrichtung, um die magnetisch markierte Probe auf ein Gitter zur Verwendung bei der Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop im Gradientenmagnetfeld zu führen und dort zu fixieren, worin Bezugszahl 11 ein Elektromagnet, 11a ein Eisenkern für den Elektromagneten, 12 ein Polstück, 13 ein Gestell zum Montieren eines Gitters, 14 ein Klebefilm, 15 eine Gitterhalterung, 16 ein Gitter, 17 ein dünnes Rohr und 18 ein Aufsatz ist.
Das Polstück (A) 12, das aus reinem Eisen besteht und eine konische Gestalt aufweist, ist auf dem Eisenkern 11a des Elektromagneten montiert und mit dem Gittergestell 13 aus Aluminium zum Anbringen des Gitters bedeckt. Die Spitze des Polstücks (A) 12 ist abgeschnitten, um übermäßige Konzentration des Magnetfelds zu vermeiden, und der Durchmesser des Spitzenendes beträgt 2 mm. Bei diesem Beispiel wurde der Elektromagnet mit Energie beaufschlagt, sodaß ein Magnetfeld von etwa 3 kG an der Endfläche des Polstücks entstand. Das Gittergestell 13 ist mit einem Durchgangsloch mit einem Durchmesser von 4 mm in seiner Mitte ausgebildet, wobei die Endfläche des Polstücks (A) 12 in der Mitte des Durchgangslochs und 0,5 mm unter der Oberfläche des Gittergestells angeordnet ist. Das Durchgangsloch ist nicht obligatorisch. Jedoch wurde es in diesem Beispiel vorgesehen, weil leicht ein starkes Magnetfeld erhalten wurde und die Ausrichtung zwischen dem Gitter 16 und dem Polstück (A) 12 einfach war.
Das Kupfergitter mit einem Durchmesser von 3 mm, an dem ein Stützelement aus Formvar befestigt war, war leicht mit einem klebrigen Parafilm (Klebefilm) verbunden, sodaß es abnehmbar war, und wurde von der Gitterhalterung 15 getragen. Die Gitterhalterung 15 bestand aus einem Acrylharz und hatte einen Außendurchmesser von 20 mm, einen Innendurchmesser von 8 mm und eine Dicke von 1 mm, wie in Fig. 3 gezeigt. Auf der Unterseite haftete der oben beschriebene Klebefilm 14. Da das Gitter klein ist, muß bei der Handhabung des Gitters große Sorgfalt aufgebracht werden. Jedoch wird die Herstellung von Proben einfach, wenn es in der Gitterhalterung 15 enthalten gehandhabt wird, wie in diesem Beispiel, und außerdem sind auch der Transport und die Lagerung des Gitters 16 nach dem Abschluß der Herstellung der Proben einfach. Wenn das Gitter 16 herausgenommen werden muß, kann der Klebefilm 14 an der Rückseite leicht mit den Fingern manipuliert werden, das Gitter 16 kann leicht vom Klebefilm 14 abgezogen werden und das Gitter 16 kann mit einer Pinzette gehandhabt werden.
Wenn die Gitterhalterung 15 auf dem Gittergestell 13 in dessen Mitte montiert ist und eine magnetisch markierte Probe im Kapillarröhrchen 17 in einer Menge von einigen ul von oben auf das Gitter 16 aufgebracht wird, indem der Aufsatz 18 gedrückt wird, wobei der Elektromagnet 11 mit Energie beaufschlagt wird, wird ein Gradientenmagnetfeld durch das Polstück (A) 12 erzeugt, sodaß sich der mittlere Abschnitt des Gitters im höchsten Feld befindet, mit dem Ergebnis, daß die magnetisch markierte Probe zum mittleren Abschnitt des Gitters 16 geleitet und darauf richtig magnetisch adsorbiert wird. Etwa 1 Minute nach dem Fallenlassen der Probe wird überschüssige Probe mit Filterpapier entfernt, während der Elektromagnet weiterhin mit Energie beaufschlagt bleibt. Mit diesen Verfahren wird nur die magnetisch markierte Probe auf dem Gitter 16 fixiert.
Im dritten Schritt dieses Beispiels werden, während der Elektromagnet 11 mit Energie beaufschlagt wird, mehrere ul Negativeinfärbungsflüssigkeit, die aus 1 % Phosphorwolframsäure (pH 7) besteht, auf das Gitter 16 aufgebracht. Nach 30 Sekunden wird überschüssige Färbungsflüssigkeit mit Filterpapier entfernt, und die eingefärbte Probe wird auf natürliche Art trocknen gelassen.
Das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung einer Probe zur Betrachtung durch ein Elektronenmikrotrockner wurde auf die Bestimmung von Influenzavirus angewandt, um die Nachweisgrenze zu untersuchen, und als Ergebnis war das Screenen von Virus beim Sichtbereich des Elektronenmikroskops mit einer 50.000-fachen Vergrößerung problemlos erfolgreich, wenn die Konzentration des Virus 10.000/ml betrug. Fig. 4 ist ein Elektronenmikrobild von magnetisch markiertem Influenzavirus. Der Durchmesser des Virus betrug 100 nm, und aus Fig. 4 ist ersichtlich, daß der in schwarz aufscheinende magnetisch markierte Antikörper an das Virus gebunden war.

Beispiel 5

Vor dem in Beispiel 4 beschriebenen Schritt des magnetischen Markierens der Probe wurde ein Schritt des Koagulierens des Virus durchgeführt. Das heißt, 1 ml der in Beispiel 4 verwendeten Probe wurden mit 20 ul des IgG-Antikörpers gemischt, und die Mischung wurde bei 35ºC 2,5 Stunden lang und in der Folge bei 4ºC eine Nacht lang inkubiert, um Virus zu koagulieren. Weiters wurde der aus dem Virus und IgG-Antikörper bestehende Immunkomplex durch 30minütiges Zentrifugieren mit 3000 UpM ausgefällt, und das Präzipitat wurde wieder in PBS-Lösung dispergiert. Nach diesem Schritt wurde der gleiche Schritt zur Herstellung einer Probe wie in Beispiel 4 wiederholt, mit der Ausnahme, daß ein anderer magnetisch markierter Antikörper verwendet wurde. Das heißt, in diesem Beispiel war das dextranbeschichtete magnetische Mikroteilchen an Protein A gebunden. Da Protein A sich spezifisch mit IgG-Antikörper verbindet, wurde das mit dem IgG-Antikörper zum Gerinnen gebrachte Virus magnetisch markiert. Somit erleichterte die Anwendung von Vorbehandlung, um Virusteilchen miteinander zu koagulieren, die Betrachtung durch das Elektronenmikroskop weiter, und das Screenen war bei einer Viruskonzentration in der Größenordnung einiger tausend Individuen/ml problemlos erfolgreich. Fig. 5 ist ein Elektronenmikrobild von magnetisch markiertem Virus. Es ist offensichtlich, daß 10 und mehr Virusteilchen koagulierten und der schwarz erscheinende magnetisch markierte Antikörper an die Peripherie der Viren gebunden war.
Ein Verfahren, bei dem Proben vor der Betrachtung durch das Elektronenmikroskop zum Gerinnen gebracht werden, um die Betrachtung zu erleichtern, ist als Immunelektronenmikroskopie bekannt. Die vorliegende Erfindung, bei der, soweit den Erfindern bekannt ist, erstmals das magnetische Markieren von Proben eingesetzt wird, hat die Bestimmungsempfindlichkeit im Vergleich zur herkömmlichen Immunelektronenmikroskopie um 5 Zehnerpotenzen oder mehr verbessert.

Beispiel 6

Nach dem in Beispiel 5 beschriebenen ersten Schritt des Koagulierens von Virus und magnetischen Markierens von Proben wurde ein Schritt durchgeführt, bei dem die Probe konzentriert und gereinigt wurde, gefolgt von der Durchführung des zweiten und des dritten Schritts, wie in Beispiel 5. Der Schritt des Konzentrierens und Reinigens wird nachstehend im Detail beschrieben.
Fig. 7(a) und 7(b) stellen den Schritt des Konzentrierens und Reinigens der Probe dar. Fig. 7(a) veranschaulicht den Schritt des Konzentrierens und Reinigens, und Fig. 7(b) den Schritt der Rückgewinnung der Probe.
In Fig. 7 bezeichnet Bezugszahl 20 ein Gefäß, 21 eine magnetisch markierte Probe, 21-1 eine wiedergewonnene Probe, und 22 ist ein Polstück (B). Da der magnetische Kreis 50 gestaltet ist, daß der vom Elektromagnet 11 ausgehende Magnetfluß zum Magnetstück (B) konzentriert wird, wird ein Gradientenmagnetfeld erzeugt, sodaß das Magnetfeld an der Oberfläche der im Gefäß enthaltenen Flüssigkeit unmittelbar unter dem Polstück (B) 22 am größten ist. In diesem Beispiel hatte das höchste Magnetfeld 8 kG. Die Mitte des Polstücks (B) 22 war hohl, sodaß das Kapillarröhrchen 17 darin eingeschoben werden konnte. Im Gefäß 20 war 1 ml der Probensuspension enthalten, die die nach dem ersten Schritt magnetisch markierte Probe 21 enthielt.
Beim Schritt des Konzentrierens und Reinigens (a) wurde das Gefäß 20 zwischen dem Elektromagneten 11 und dem Polstück (B) 22 eingesetzt. Wenn der Elektromagnet mit Energie beaufschlagt wurde, wurde die magnetisch markierte Probe 21 zur Wasseroberfläche unmittelbar unter dem Polstück (B) 22 geleitet und dort konzentriert. In diesem Fall war, da verschiedene Verunreinigungen, die in der Probensuspension vorhanden sind, nicht auf magnetische Kraft ansprechen, nur die magnetisch markierte Probe 21 an der Position der Konzentration vorhanden, und daher wurden die Konzentration und Rückgewinnung der Probe 21 gleichzeitig durchgeführt.
Beim Rückgewinnungsschritt (b) wurde das Kapillarröhrchen in das Durchgangsloch des Polstücks (B) 22 eingesetzt, während der Elektromagnet weiterhin mit Energie beaufschlagt wurde. Wenn das Kapillarröhrchen 17 mit der Probe in Berührung gebracht wurde, wurde die Probensuspension aufgrund der Kapillarwirkung im Kapillarröhrchen rückgewonnen, und die magnetisch markierte Probe wurde aufgrund magnetischer Anziehung ebenfalls im Kapillarröhrchen rückgewonnen. Bei diesem Beispiel wurde ein Kapillarröhrchen 17 mit einem Außendurchmesser von 1,1 mm und einem Innendurchmesser von 0,5 mm verwendet. Etwa 5 ul der Lösung wurden natürlich absorbiert. Der Aufsatz 18 wurde verwendet, um die wiedergewonnene Probe im nächsten Schritt auf das Gitter fallen zu lassen.
Beim herkömmlichen Verfahren zur Herstellung einer Probe zur Elektronenmikroskopie wird die Betrachtung durch das Elektronenmikroskop stark beeinträchtigt, wenn die Reinigung der Probe unzureichend ist. Jedoch erleichtert die Reinigungswirkung dieses Beispiels die Betrachtung durch das Elektronenmikroskop und erhöht als Ergebnis der Konzentrationswirkung die Bestimmungsempfindlichkeit, sodaß das Screenen von Virus in einer Viruskonzentration in der Größenordnung einiger hundert Individuen/ml in kurzer Zeit ermöglicht wird.
Das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung einer Probe kann unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Vorrichtung einfach und effizient durchgeführt werden.
Die Fig. 8 und 9 veranschaulichen jeweils die Konstruktion der Vorrichtung zur Herstellung einer Probe zur Verwendung bei der Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop, wobei Bezugszahl 23 ein Joch (A) zum Halten des Polstücks (B) 22 und 24 ein Joch (B) bezeichnet. Das Joch (A) 23 ist durch eine Jochklemmschraube 25 zum Festklemmen eines Jochs mit dem Joch (B) 24 verbunden, und diese kann das Joch 23 in jeder Richtung fixieren, wie in Fig. 8 gezeigt. Der vom Elektromagneten 11 ausgehende Magnetfluß wird vom Polstück (B) 22 konvergiert, nachdem er durch ein Gefäß 20 gegangen ist, und geht durch das Joch (A) 23 und das Joch (B) 24 zum Elektromagneten 11 zurück, sodaß ein magnetischer Kreis gebildet wird. Wenn der Abstand zwischen dem Elektromagneten 11 und dem Polstück (B) 22 11 mm beträgt, hat das beim Anlegen eins Stroms von 1A an den Elektromagneten 11 an einer Position 0,5 mm unter dem Polstück (B) erzeugte Magnetfeld 8 kG. Das Gefäß 20 wird auf einem Gefäßträger 26 getragen, der eine Gefäßführungsoberfläche 27 umfaßt, und ist mit einer Klemmschraube zum Festklemmen des Gestells auf einem höhenregulierbaren Gestell 29 befestigt. Die Höhe der Plattform 26, die das Gefäß 20 trägt, ist durch das höhenregulierbare Gestell 29 regulierbar, und wie in Fig. 8 gezeigt kann das Gestell 26 so fixiert werden, daß es sich in jeder gewünschten Richtung erstreckt.
Der oben beschriebene Reinigungs- und Konzentrationsschritt wird durchgeführt, nachdem die Vorrichtung gemäß vorliegender Erfindung wie in Fig. 7 gezeigt angeordnet worden ist. Zuerst wurde das eine Probe enthaltende Gefäß 20 in dem Zustand, daß das Kapillarröhrchen 22 vom Polstück (B) 22 abgezogen war, auf der Gefäßführungsfläche 27 angeordnet, und die Höhe des Gefäßes wurde mit dem höhenregulierbaren Gestell 29 eingestellt, sodaß der Abstand des Polstücks (B) 22 und des Gefäßes 20 von der Wasseroberfläche 5 mm betrug. Dann wurde ein Strom von 1A an den Elektromagneten angelegt, un die magnetisch markierte Probe wurde zur Wasseroberfläche unmittelbar unter dem Polstück (B) 22 geleitet und dort konzentriert. Nach etwa 1 Minute wurde das Kapillarröhrchen 17 in das Durchgangsloch des Polstücks (B) 22 eingeschoben, und das Gefäß wurde durch das höhenregulierbare Gestell 29 nach oben gehoben, bis das Kapillarröhrchen 17 mit der Wasseroberfläche im Gefäß 20 in Berührung kam, die magnetisch markierte Probe wurde gemeinsam mit der Probensuspension durch magnetische Anziehung sofort in das Kapillarröhrchen 17 absorbiert. Um die Rückgewinnung der Probe zu gewährleisten, wird es vorgezogen, den Vorgang des In-Berührung-Bringens des Kapillarröhrchens 17 mit der Wasseroberfläche zu wiederholen, da die Probe auf der Wasseroberfläche konzentriert ist, und die Probe kann zu dem Zeitpunkt am effizientesten wiedergewonnen werden, wenn das Kapillarröhrchen 17 mit der Wasseroberfläche in Berührung kommt. Wenn das Kapillarröhrchen 17 zu weit ins Wasser getaucht ist, wird es unmöglich, sie rückzugewinnen.
Nach 5 Stunden wurde das Anlegen von Strom an den Elektromagneten 11 unterbrochen, das Kapillarröhrchen 18 wurde aus dem Polstück (B) 22 genommen, und die Probe wurde im Kapillarröhrchn 17 wiedergewonnen.
Als nächstes wird das Verfahren zur Durchführung des zweiten und des dritten Schritts unter Verwendung der Vorrichtung zur Herstellung einer Probe gemäß vorliegendem Beispiel erklärt. Für den zweiten und den dritten Schritt wird die Vorrichtung angeordnet, wie in Fig. 8 gezeigt. Das Polstück (B) 22 auf dem Joch 23 und das Gefäßtragegestell 26 werden vom Elektromagneten 11 wegbewegt, indem die Jochklemmschraube 25 bzw. die Gefäßtragegestellklemmschraube 28 gelockert und gedreht werden. Ein weiteres Polstück (A) 12 wird auf dem Eisenkern 10a des Elektromagneten 11 montiert, und das Gittergestell 13 wird auf dem Polstück (A) 12 montiert, wie in Fig. 3 gezeigt. In der Mitte des Gestells 13 ist das in den Fig. 3 und 5 gezeigte Gitter 16 montiert. Dann wird ein Strom von 0,5A an den Elektromagneten 11 angelegt, um den Elektromagneten mit Energie zu beaufschlagen, und in diesem Zustand wird die im Kapillarröhrchen 17 wiedergewonnene Probe aufgebracht. Von der Rückseite der Gitterhalterung 15 wird ein Gradientenmagnetfeld angelegt, sodaß in der Mitte des Polstücks (A) 12 am höchsten ist, und so wird die magnetisch markierte Probe magnetisch in der Mitte der Oberfläche des Gitters 16 adsorbiert und daran fixiert. In diesem Fall wird die Formvar-Stützmembran des Gitters von Zeit zu Zeit zerstört, wenn das Magnetfeld zu stark ist. Daher ist es vorzuziehen, die Stärke des Magnetfeldes auf ein Niveau abzuschwächen, das geringer ist als beim Konzentrations- und Reinigungsschritt. Bei der Vorrichtung nach vorliegendem Beispiel hatte das Magnetfeld über dem Gitter etwa 2,5 kG, wenn der Elektromagnet mit einem Strom von 0,5A beaufschlagt wurde.

Beispiel 7

Die Fig. 10(a) bis 10(e) veranschaulichen Vorrichtungen zur Herstellung von Proben nach Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung; Fig. 10(a) zeigt einen Schritt des Einspritzens eines magnetisch markierten Antikörpers, Fig. 10(b) einen Schritt des Haltens eines magnetisch markierten Antikörpers, Fig. 10(c) einen Schritt des Einspritzens und Inkubierens einer Probe und Fig. 10(d) einen Schritt des Waschens und Fig. 10(e) einen Schritt der Rückgewinnung einer Probe. In den Fig. 10(a) bis 10(e) bezeichnet Bezugszahl 31 eine Gruppe von dünnen Drähten (magnetische Substanz), 32 eine nichtmagnetische Stütze, 33 einen Reaktor, 34 ein Ventil, 35 einen magnetisch markierten Antikörper, 36 einen Seltenerdpermanentmagneten, 37 ein Joch zum Erzeugen eines Gradientenmagnetfelds, 38 eine Probe, 39 eine Waschlösung, 40 ein Behältnis und 41 einen Schwingungserzeuger.
Der Reaktor 33 ist ein Glasgefäß mit uneinheitlichem Querschnitt, wobei die untere Seite enger ist als die obere Seite, das in seinem mittleren Abschnitt eine eingeschnürte Form aufweist. Vom eingeschnürten Abschnitt zum unteren Abschnitt des Reaktors 33 hängt eine Gruppe dünner magnetischer Drähte hinunter. An beiden Seiten des Reaktors 33 sind abnehmbar ein Magnet 36 und ein Joch 37 aus reinem Eisen angeordnet. Die Gruppe der dünnen magnetischen Drähte ist aus Nickeldraht mit einer Reinheit von 99,9% oder darüber und mit einem Außendurchmesser von 0,15 mm in Form einer Spule ausgebildet, und sie sind an einem nichtmagnetischen Stützstab 32 aus Glas befestigt, der zwischen den Magneten 36,36 am Reaktor 33 hängt. Das vom Magneten 36 gebildete Magnetfeld betrug etwa 65 kG bei einer Magnetspaltbreite von 3 mm. Das Jochpaar 37 wird in Kombination mit den Magneten 36 verwendet, und der Abstand dazwischen nimmt zu, je weiter sie sich von den Magneten 36 entfernen. Daher wird im Gefäß 33 ein Gradientenmagnetfeld erzeugt, das mit der Nähe zu den Magneten 36 zunimmt.
Der magnetisch markierte Antikörper 35 besteht aus superparamagnetischen Ultramikroteilchen aus Magnetit mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 5 nm. Seine Oberfläche ist mit Dextran beschichtet, und ein Antikörper, der spezifisch mit nachzuweisenden Viren oder Zellen reagieren kann, ist durch kovalente Bindung an das Dextran gebunden.
Als nächstes wird ein Verfahren zur Herstellung einer Probe gemäß vorliegender Erfindung beschrieben.
Beim in Fig. 10(a) gezeigten Schritt des Einspritzens eines magnetisch markierten Antikörpers wird eine Pufferlösung, die 1 x 10&supmin;&sup8; g des magnetisch markierten Antikörpers 35 enthält, mit einer Mikronadel in den Reaktor 33 injiziert, der magnetisch markierte Antikörper 35 wird in einem Zustand, in dem sich der Magnet 36 nicht in Position befindet, gleichmäßig in der Pufferlösung dispergiert.
Dann werden beim in Fig. 10(b) gezeigten Schritt des Haltens des magnetisch markierten Antikörpers der Magnet 36 und das Joch 37 in den Zustand versetzt, daß sie den dünnen magnetischen Drähten 31 nahe sind, der magnetisch markierte Antikörper 35 im Reaktor 33 durch Gradientenmagnetfeld zu den dünnen magnetischen Drähten 31 geführt und durch die magnetisierten dünnen magnetischen Drähte 31 magnetisch adsorbiert. Wenn das Joch 37 nicht vorhanden ist, dauert es einen halben Tag oder länger, um den magnetisch markierten Antikörper 35, der vom Magneten 36 entfernt treibt, vollständig auf den dünnen magnetischen Drähten 31 einzufangen. Bei dem Beispiel, bei dem das Joch 37 eingestellt ist, kann er jedoch in etwa 5 Minuten eingefangen werden. Die oben beschriebenen Schritte des Einspritzens und Haltens wurden getrennt, um die Erklärung zu vereinfachen, aber in der Praxis ist ein gleichzeitiger Einsatz effizienter. Das heißt, die den magnetisch markierten Antikörper 35 enthaltende Pufferlösung kann in dem Zustand, daß der Magnet 36 eingeschaltet ist, in den Reaktor 33 eingespritzt werden.
Fig. 10(c) zeigt einen Schritt des Einspritzens und Inkubierens der Probe, bei dem ein Ventil 34 für den Reaktor 33 bis zu einem gewissen Grad geöffnet wird und Probe 38 mit einer Mikronadel in den Reaktor 33 injiziert wird, sodaß die Probe 38 langsam nach und nach in kleinen Mengen hinuntertropft. Bei diesem Schritt fließt die Probe 38 um die dünnen magnetischen Drähte 31, auf denen der magnetisch markierte Antikörper 35 gehalten wird, und wenn sie zu diesen gelangt, reagiert die Probe mit dem magnetisch markierten Antikörper durch Antigen-Antikörper-Reaktion. Um die Antigen-Antikörper-Reaktion zu fördern, wird der Reaktor 33 vorzugsweise auf eine Temperatur von 35 bis 37ºC erwärmt. Die Strömungsgeschwindigkeit wird durch das Ventil 34 beispielsweise so gesteuert, daß sie 1 bis 10 ml/h beträgt.
Weiters können die dünnen magnetischen Drähte 31 durch einen Schwingungserzeuger 41 mit einer Frequenz von 10 Hz in Auf- und Abschwingungen mit einer Amplitude von 0,5 bis 3 mm versetzt werden, was mäßige Schwingung ergibt, um die Antigen-Antikörper-Reaktion zu beschleunigen.
Beim in Fig. 10(d) gezeigten Waschschritt ist das Ventil 34 offen, und Waschlösung, die aus TWEEN-Pufferlösung besteht, wird in den Reaktor 33 gegossen, um andere Substanzen als jene, die magnetisch an den dünnen magnetischen Drähten 31 adsorbiert sind, in eine Auffangschale oder Platte 40 auszuwaschen.
Beim in Fig. 10(e) gezeigten Rückgewinnungsschritt wird das Ventil 34 geschlossen, um den Reaktor in einem solchen Ausmaß mit der Waschlösung zu füllen, daß die dünnen magnetischen Drähte 31 vollkommen in die Waschlösung 39 getaucht sind, und nach dem Entfernen der Magneten 36,36 wird der magnetische Stützstab 32 durch den Schwingungsgenerator 41 zum Schwingen gebracht, um den Komplex zwischen dem magnetisch markierten Antikörper 35 und der Probe vollständig von den dünnen magnetischen Drähten 31 abzulösen, dann wird das Ventil geöffnet, um die Probe im Testgefäß rückzugewinnen.
Auf die so hergestellte Probe ist das magnetische Laserimmunoassayverfahren und die Vorrichtung unter Verwendung des superparamagnetisch markierten Körpers anwendbar. Bei dem Verfahren wird eine Vorrichtung zur Erzeugung eines Gradientenmagnetfeldes verwendet, die einen Elektromagneten und ein gegenüber dem Elektromagneten angeordnetes Polstück umfaßt, worin das Testgefäß in die Vorrichtung zur Erzeugung eines Gradientenmagnetfeldes eingebracht wird und austretendes Licht wie Streulicht und ähnliches von der unmittelbar unter dem Polstück an der Wasseroberfläche konzentrierten Probe bestimmt wird. Bei diesem Verfahren ist keine B/F-Trennung erforderlich. Das heißt, der als Ergebnis der Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen der Probe und dem magnetisch markierten Körper erhaltene magnetisch markierte Körper hat ein größeres Volumen als der nicht umgesetzte magnetisch markierte Körper, und daher wird die Molekularbewegung inert. Daher kann der an die Probe gebundene magnetisch markierte Körper leichter als der nicht umgesetzte magnetisch markierte Körper im Gradientenmagnetfeld geführt und konzentriert werden. Beim oben beschriebenen Verfahren wird dieses Merkmal ausgenutzt. Beispielsweise kann zwischen dem Umgesetzten und dem nicht Umgesetzten durch chronologische Änderung im Streulichtmuster unterschieden werden.
Wenn das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung einer Probe auf einen Modellversuch angewandt wird, bei dem Influenzavirus in Gurgelwasser von einem Patienten bestimmt wird, kann in einer wässerigen Lösung in einer Population von mehreren hunderten Individuen pro 10 ml vorhandenes Virus in etwa 3 Stunden, gezählt von der Herstellung der Probe bis zur Messung, bestimmt werden. Beim herkömmlichen Verfahren, bei dem Eier verwendet wurden, um Influenzavirus in Gurgelwasser von einem Patienten zu kultivieren, bis die Blutgerinnungsreaktion mit freiem Auge sichtbar wird, dauerte es mehrere Wochen, bevor Ergebnisse erzielt wurden.

Beispiel 8

Fig. 11 veranschaulicht ein Beispiel für die Vorrichtung zur Herstellung einer Probe gemäß vorliegender Erfindung. An einer Endfläche eines Seltenerdmagneten 36, der zylindrisch mit einem Durchmesser von 20 min und einer Länge von 20 mm ist, ist das Joch 37 mit einer Breite von 10 mm und einer Dicke von 2 mm aus reinem Eisen, gebogen wie in Fig. 11 gezeigt, magnetisch adsorbiert, und zwei Magneten und Joche sind einander gegenüber angeordnet und sind an einer Magnetpaarhalterung 38 in Form einer offenen Schachtel (Querschnitt) mit einer Magnetspaltbreite von 2,5 mm befestigt, sodaß sie eine Vorrichtung zur Erzeugung eines Gradientenmagnetfeldes darstellen. In diesem Fall hat das Magnetfeld des Magnetspaltabschnitts 7 kG. Der Abschnitt mit kleinerem Querschnitt an der Seite des Reaktors 33, die eine Pasteurpipette umfaßt, ist mit einer Spule (Magnetelement) 100 aus Nickeldraht mit 99,9%iger Reinheit und einem Drahtdurchmesser von 0,2 mm versehen. In diesem Beispiel entspricht die Spule 100 den dünnen magnetischen Drähten 31 im vorhergehenden Beispiel und hat einen Außendurchmesser von 1 mm und eine Länge von etwa 10 mm. Die Spule 100 ist vertikal von einem Kunststoffstab mit einem Durchmesser von 1,5 mm abgestützt.
Der Reaktor 33 wird von einem Rotationsgestell 42' getragen und ist in einer horizontalen Ebene um die Stützsäule 43 drehbar, und der Erzeuger für das Gradientenmagnetfeld ist auf einem Gestell 44 montiert, sodaß die Spule 100 in der Mitte des Erzeugers für das Gradientenmagnetfeld angeordnet werden kann.
Wie in diesem Beispiel kann, wenn der Magnetspalt unter Verwendung des Reaktors mit uneinheitlichen Querschnitt verringert wird, mit dem Permanentmagneten 36 und dem Erzeuger für das Gradientenmagnetfeld ein ausreichendes Magnetfeld erzeugt werden, und die Größe des Erzeugers für das Gradientenmagnetfeld kann vorteilhaft verringert werden. Der Reaktor 33 ist mit der Pumpe 45 zur Zirkulation über die Rohrleitungen 161 und 162 aus Silikonrohr mit einem Außendurchmesser von 2 mm und einem Innendurchmesser von 1 mm verbunden. Die Pumpe 45 ist vorzugsweise eine Pumpe, deren Strömungsrate im Bereich von 1 bis 100 ml/h variiert werden kann, beispielsweise ist eine peristaltische Pumpe (Pharmacia, P-1) geeignet. Der Schwingungsgenerator 41 kann jede beliebige Konstruktion haben, solange er den nichtmagnetischen Stützstab 32 in winzige Schwingung nach oben und unten oder nach links und rechts versetzt. Es können ein Ultraschalloszillator, eine mechanische exzentrische Nocke usw. verwendet werden.
Der Betrieb der Vorrichtung im vorliegenden Beispiel ist jenem in Beispiel 7 ähnlich, und es wird auch im nachstehenden Beispiel 9 darauf bezuggenommen, und es erfolgt hier keine detaillierte Erklärung.

Beispiel 9

Für das vorliegende Beispiel wurde die Vorrichtung von Beispiel 8 verwendet, und die vorliegende Erfindung wurde unter Verwendung von inaktiviertem Influenzavirus durchgeführt, das bei der Durchführung von Versuchen hohe Sicherheit bietet.
Als Vorbehandlung wurden nichtmagnetische Acrylpolymerteilchen mit einer Teilchengröße von 1 um verwendet, die so aktiviert waren, daß sie nichtspezifisch an Virus hafteten, und nachdem eine Probe durch Inkubieren bei 35ºC für 2,5 Stunden auf den nichtmagnetischen Teilchen festgesetzt worden war, wurde die Oberfläche der nichtmagnetischen Teilchen, auf denen kein Viren gebunden war, mit BSA beschichtet, um die nichtmagnetischen Teilchen zu inaktivieren. Das Ziel des Einfangens von Viren mit den nichtmagnetischen Teilchen im vorhinein bestand darin, nicht umgesetzten magnetisch markierten Antikörper wie nachstehend beschrieben zu entfernen.
Die nichtmagnetischen Teilchen, auf denen Viren festgenalten wurden, wurden in 2 ml HEPES-Puffer dispergiert, und dieser Suspension wurde eine Lösung zugegeben, die mit 1 x 10&supmin;&sup8; g magnetisch markiertem Antikörper mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 30 nm beaufschlagt war, und die Mischung wurde in den Reaktor 33 in der in Fig. 11 gezeigten Vorrichtung eingespritzt, wobei die Mischung durch die Pumpe 45 zirkuliert wurde, und die Probe wurde durch den Magneten 36 magnetisch an der Spule 100 adsorbiert.
In Beispiel 7 wird ein Beispiel erklärt, bei dem der Reaktor 33 zuerst mit dem magnetisch markierten Antikörper beaufschlagt wurde. Jedoch ist bei einem Verfahren, bei dem die Probe zirkuliert wird, wie im vorliegenden Beispiel, die Reihenfolge der Zugabe des magnetisch markierten Antikörpers und der Probe nicht wichtig, weil, während der magnetisch markierte Antikörper und die Probe zirkulieren, Probe nach der Antigen-Antikörper-Reaktion gemeinsam mit dem magnetisch markierten Antikörper an der Spule 100 adsorbiert wird.
Nach dem Inkubieren der Probe durch Zirkulieren bei 35ºC für 2,5 Stunden lang wurde der HEPES-Puffer bis zu einer Menge von 0,5 ml entfernt, und der Reaktor 33 wurde gemeinsam mit dem Drehgestell 42 gedreht, um den Reaktor vom Magneten 36 zu entfernen. Daraufhin wurde der nichtmagnetische Stützstab 32 zum Schwingen gebracht, um die Probe von der Spule 100 loszulösen, und dann wurde die Probe im Testgefäß wiedergewonnen.
Die wiedergewonnene HEPES-Pufferlösung enthielt nicht umgesetzten magnetisch markierten Antikörper sowie die an den magnetisch markierten Antikörper gebundene Probe. Daher wurde die Reaktionsmischung zur B/F-Trennung, d.h. um nicht umgesetzten magnetisch markierten Antikörper von magnetisch markierter Probe zu trennen, mit 1500 UpM 5 Minuten lang zentrifugiert, das erhaltene Präzipitat wurde im Testgefäß aufgenommen, gefolgt von Messung durch das magnetische Laserimmunoassay unter Verwendung des in WO/88/d2118 beschriebenen Interferenzverfahrens, um Viren nachzuweisen.
Als Ergebnis wurden Viren in Gurgelwasser in einer Konzentration in der Größenordnung von 10 Individuen erfolgreich nachgewiesen.
In den vorangehenden Beispielen wurde zwar ein Magnetelement 31 in Form einer Spule verwendet, die Gestalt des Magnetelements ist jedoch nicht auf Spulen beschränkt, sondern es kann jede Gestalt gewählt werden, solange dadurch die Wahrscheinlichkeit des Aufeinandertreffens von magnetisch markiertem Antikörper und Probe erhöht werden kann. Daher kann das Magnetelement baumförmig, leiterförmig oder torusförmig sein.

Beispiel 10

Fig. 12 stellt ein Ablaufschema des Verfahrens zur Herstellung einer Probe gemäß einem Beispiel der vorliegenden Erfindung dar. Dieses Verfahren umfaßt einen ersten Schritt 51, bei dem eine Probe magnetisch markiert wird, einen zweiten Schritt 52, bei dem die Probe in einem Gradientenmagnetfeld zu einem Gitter geleitet und dort fixiert wird, und einen dritten schritt 53 zur Durchführung von Negativeinfärbung im Gradientenmagnetfeld. Bei der in diesem Beispiel verwendeten Probe handelt es sich um Influenzavirus Typ A (A/Ishikawa/7/82(H3N2)). Aufgrund einer Blutgerinnungsreaktion und Blutzellenzählplatte wurde bestätigt, daß die Probe Virus in einer Population von 1.000.000 Individuen/ml enthielt.
Auf den ersten Schritt dieses Beispiels bezugnehmend, ist der zum magnetischen Markieren verwendete Antikörper IgG, der durch das Reinigen von Kaninchenhyperimmunantiserum gegen Virus erhalten wurde. Dieser wurde durch kovalente Bindung an dextranbeschichtete magnetische Mikroteilchen aus Magnetit mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 10 nm gebunden, um magnetisch markierten Antikörper zu erhalten. Das Markieren der Probe wurde durchgeführt, indem 1 ml der Probe und 10 um des magnetisch markierten Antikörpers bei 35ºC 2,5 Stunden lang inkubiert wurden.
Nun sei auf den zweiten Schritt 52 des vorliegenden Beispiels bezuggenommen, der in drei Unterschritte 52a, 52b und 52c geteilt ist. Beim ersten Unterschritt 52a wird die Probe in Gradientenmagnetfeld lokal konzentriert, und im zweiten Unterschritt 52b wird ein Gitter mit der Position der lokalen Konzentration in Berührung gebracht, und im dritten Unterschritt 52c wird ein Gitter von der Wasseroberfläche entfernt, während ein Magnetfeld angelegt wird.
Fig. 13 ist eine schematische Ansicht, welche die Konstruktion der Vorrichtung zur Herstellung einer Probe zur Verwendung bei der Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop darstellt. In Fig. 13 bezeichnet Bezugszahl 76 einen Elektromagneten, 60 ein Gefäß, 61 ein Gefäßtragegestell und 62 eine Führungsfläche zum Führen des Gefäßes. Das Gefäß 60 ist auf der Führungsfläche 62 angeordnet und an einem höhenregulierbaren Gestell 66 befestigt. Das Gefäßtragegestell 61 kann durch das höhenregulierbare Gestell 66 auf jede gewünschte Höhe eingestellt werden.
In Fig. 13 bezeichnet Bezugszahl 63 ein Joch (A) zum Halten des Polstücks 75 und 64 ein Joch (B). Das Joch (A) 63 ist durch eine Jochklemmschraube 65 zum Festklemmen eines Jochs mit dem Joch (B) 64 verbunden und kann das Joch 63 in jeder Richtung fixieren, wie in Fig. 13 gezeigt. Der vom Elektromagneten 76 ausgehende Magnetfluß wird vom Polstück (B) 75 konvergiert, nachdem er das Gefäß 60 passiert hat und durch das Joch (A) 63 und das Joch 64 (B) zum Elektromagneten 76 zurückgeht, sodaß ein magnetischer Kreis gebildet wird. Wenn der Abstand zwischen dem Elektromagneten 76 und dem Polstück (B) 62 11 mm beträgt, hat das beim Anlegen eines Stroms von 1 A an den Elektromagneten 76 an der Position 0,5 mm unmittelbar unter dem Polstück (B) 62 erzeugte Magnetfeld 8 kG.
Wie in Fig. 14 gezeigt, ist an der Spitze des Polstücks 75 ein Gittermontagegestell 73 befestigt. Das Gittermontagegestell 73 besteht aus einem Kunststoff und ist mit einer Schlagschraube 74 an das Polstück 75 geklemmt. Am Gittermontagegestell 73 ist mit einem Klebefilm (Parafilm) 72 ein Kupfergitter 71 mit einem Durchmesser von etwa 3 mm befestigt. Die Distanz zwischen der Spitze des Polstücks 75 und dem Gitter 71 ist vorzugsweise so gering wie möglich, um ein starkes Magnetfeld zu erzeugen, und die Distanz ist in diesem Beispiel mit 1 mm festgelegt.
Nach dem Befestigen des Gitters 71 am Gittermontagegestell 73 und nach dem Anbringen des Gittermontagegestells 73 am Polstück 75 wird der zweite Schritt 52 in Angriff genommen. Der erste Unterschritt 52a wird wie folgt durchgeführt. Zunächst wird eine aus PBS-Tween bestehende Waschlösung im vorhinein in einer Menge von 1 ml in den Reaktor 60 eingebracht, und 25 ul einer Lösung, die die im ersten Schritt 51 erhaltene magnetisch markierte Probe enthält, wird dazu eingespritzt, um eine Probensuspension zu erhalten. Dann wird der Elektromagnet 76 mit Energie beaufschlagt, um ein Gradientenmagnetfeld zu erzeugen, und die magnetisch markierte Probe wird unmittelbar unter dem Polstück 75 lokal konzentriert. Im zweiten Unterschritt 52b wird das höhenregulierbare Gestell 66 betätigt, um das Gefäß 60 nach oben zu bewegen, um das Gitter 71 mit der Flüssigkeitsoberfläche in Berührung zu bringen. Dieser Vorgang bewirkt, daß die magnetisch markierte Probe magnetisch an der Rückfläche des Polstücks 75 adsorbiert wird und natürlich zum Gitter 71 geleitet und dort fixiert wird. Dann wird im dritten Unterschritt 52c, während der Elektromagnet 76 mit Energie beaufschlagt wird, das Gittermontagegestell 73 von der Flüssigkeitsoberfläche entfernt, indem das höhenregulierbar Gestell 66 gesenkt wird. Durch die obigen Verfahren wird die magnetisch markierte Probe auf dem Gitter 71 rückgewonnen.
Der dritte Schritt 53 umfaßt die folgenden drei Unterschritte 53a, 53b und 53c. Beim Ingangsetzen des dritten Schritts 53 wird zunächst eine Einfärbungsflssigkeit aus 1% Phosphorwolframsäure in einen anderen Napf im Gefäß 60 eingebracht, und die Einfärbungsflüssigkeit wird entlang der Gefäßführungsfläche 62 zu einer Position unmittelbar unter dem Gittermontagegestell 73 bewegt. Dann wird das Gefäß 60 im Unterschritt 53a durch die Betätigung des höhenregulierbaren Gestells 66 nach oben bewegt, während der Elektromagnet 76 mit Energie beaufschlagt bleibt, um das Gitter mit der Flüssigkeitsoberfläche in Kontakt zu bringen. Nach einem vorherbestimmten Zeitraum, im vorliegenden Beispiel nach 30 Sekunden, wird das höhenregulierbare Gestell 66 gesenkt, um das höhenkontrollierbare Gestell 66 zu entfernen, um das Gittermontagegestell 73 dadurch von der Flüssigkeitsoberfläche zu entfernen, sodaß der zweite Unterschritt 53b durchgeführt wird. Daraufhin wird im dritten Unterschritt 53c überschüssige Einfärbungsflüssigkeit mit Filterpapier entfernt, gefolgt von natürlichem Trocknen (Lufttrocknen), wodurch das Einfärben der Probe abgeschlossen wird.
Die Nachweisgrenze wurde untersucht, indem das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung einer Probe für Influenzavirus eingesetzt wurde. Durch serielles Verdünnen in einem Verdünnungsverhältnis von 1/10 des Ursprünglichen mit PBS-Lösung wurde die Nachweisgrenze mit Betrachtung des Virus durch ein Elektronenmikroskop untersucht. Als Ergenis war das Screenen des Virus unter dem Elektronenmikroskop bei einem Sichtbereich bei einer 50.000-fachen Vergrößerung auch bei einer Viruskonzentration in der Größenordnung von 1.000 Individuen/ml problemlos erfolgreich.
Zum Vergleich wurde eine Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop nach dem herkömmlichen Verfahren durchgeführt, bei dem kein magnetisches Markieren erfolgte, wobei das Vorhandensein von Virus auch bei nichtverdünnter Probe nicht bestätigt wurde.
Nach obiger Beschreibung wird zwar das Probengefäß 60 auf und ab bewegt, aber es können ähnliche Ergebnisse erzielt werden, wenn das am Gittermontagegestell 73 befestigte Polstück 75 auf und ab bewegt wird.

Beispiel 11

Vor dem ersten Schritt des magnetischen Markierens von Proben, wie in Beispiel 10 erklärt, wurde ein Schritt zum Ansammeln von Viren durchgeführt. Im speziellen wurden 20 ul des in Beispiel 10 verwendeten IgG-Antikörpers zu 1 ml in Beispiel 10 verwendeter Probe zugegeben. Die resultierende Mischung wurde dem Inkubieren in zwei Schritten unterzogen, wobei ein erster Schritt bei einer Temperatur von 35ºC für einen ersten Inkubationszeitraum von 2,4 Stunden durchgeführt wurde und ein zweiter Schritt bei einer Temperatur für einen zweiten Inkubationszeitraum von einer Nacht durchgeführt wurde, um dadurch Virusteilchen anzusammeln. Nach diesem Schritt wurde das Verfahren zur Herstellung von Probe auf die gleiche Weise durchgeführt, wie in Beispiel 10. In weiteren Schritten wurden die Proben Ultrazentrifugieren unterzogen. Die Ultrazentrifugation wurde mit einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 3000 UpM 30 Minuten lang durchgeführt, um einen Immunkomplex auszufällen, der Virus und IgG-Antikörper enthält. Die resultierenden Präzipitate wurden in PBS-Lösung redispergiert. Der Unterschied zwischen Beispiel 10 und Beispiel 11 besteht lediglich darin, daß Teilchen, die durch das Binden von mit Dextran beschichteten Ultramikroteilchen mit Protein A erhalten wurden, als der mit dem Polstück markierte Antikörper verwendet wurden. Demgemäß verbindet sich Protein A spezifisch mit IgG-Antikörper, und die durch IgG-Antikörper angesammelten Viren werden mit magnetischen Mikroteilchen magnetisch markiert. Demgemäß wird Vorbehandlung zum Ansammeln von Viren im vorhinein vor der Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop durchgeführt, sodaß die Betrachtung durch das Elektronenmikroskop problemlos durchzuführen ist. Wenn die Viruskonzentration etwa 100 Individuen/ml beträgt, kann die Betrachtung leicht durchgeführt werden. Das Verfahren zur einfachen Durchführung der Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop durch vorheriges Ansammeln ist als ein Verfahren zur Herstellung von Proben zur Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop bekannt. Das herkömmliche Verfahren umfaßt jedoch keinen Schritt zum Markieren magnetischer Proben nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Die Nachweisempfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ist um 5 Zehnerpotenzen höher als jene des herkömmlichen Verfahrens.
Es ist anzumerken, daß, obwohl die vorliegende Erfindung zur Betrachtung von Viren eingesetzt wird, verschiedene Arten von Zellen, wie Krebszellen, Lymphozyten und ähnliches als die Objeckte der oben beschriebenen Betrachtung verwendet werden können.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren können die folgenden Verfahren eingesetzt werden. Beispielsweise kann für die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Einfärben von auf einem Gitter angeordneten negativen Proben und anschließendem Beobachten der eingefärbten Proben, ein Verfahren zum Einbetten von Proben in Harze, wobei die Harze geschnitten werden, um eine Scheibe zu erhalten, und die Scheibe betrachtet wird, und ähnliches eingesetzt werden. Im spezielleren müssen die Proben nach den herkömmlichen Verfahren, wenn die Scheibe aus den Proben gebildet wird, der Fixierungsentwässerung und Einbetten unterzogen werden, während die Proben oft zentrifugiert werden. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Proben muß der Schritt des Zentrifugierens von Proben nicht durchgeführt werden. Im speziellen können die Proben gemäß vorliegender Erfindung in ein Gradientenmagnetfeld eingebracht und in einer vorherbestimmten Position gehalten werden. Demgemäß kann die Fixierung der Proben und die Entwässerung unter Verwendung von Alkoholen leicht durchgeführt werden. Auch können die Proben, wenn sie eingebettet sind, unter Verwendung eines Mikrotoms leicht geschnitten werden, weil sie an einer vorherbestimmten Position angesammelt sind.

Claims

1. Verfahren zum Sammeln einer Probe, folgende Schritte umfassend:

das Unterziehen einer Probe und eines magnetisch markierten Antikörpers, der aus einem magnetischen Mikroteilchen und einem am Mikroteilchen fixierten Antikörper besteht, einer Antigen-Antikörper-Reaktion, um einen Immunkomplex zu bilden, der ein Komplex aus der Probe und dem magnetischen Mikroteilchen ist,

die Durchführung lokaler Konzentration des Immunkomplexes an einer vorherbestimmten Position durch Anlegen eines äußeren Magnetfeldes, vorzugsweise Gradientmagnetfeldes, das durch einen Elektromagneten und ein Magnetpolstück erzeugt wird, um den Magnetfluß an der genannten vorherbestimmten Position zu konzentrieren,

das Sammeln des Immunkomplexes durch direkte magnetische Adsorption zum Magnetpol hin an der Position der lokalen Konzentration.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probe an einem nichtmagnetischen Teilchen fixiert wird, das einen größere Masse als der magnetisch markierte Antikörper aufweist, bevor die Probe und der magnetisch markierte Antikörper der Antigen-Antikörper-Reaktion unterzogen werden, und worin der nicht umgesetzte magnetisch markierte Antikörper durch Zentrifugieren abgetrennt und entfernt wird.

3. Vorrichtung zum Sammeln einer Probe, umfassend ein Testgefäß zur Aufnahme einer Lösung, die einen Immunkomplex enthält, der als Ergebnis der Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen einer Probe und einem magnetisch markierten Antikörper gebildet wird, der aus einem magnetischen Mikroteilchen und einem am Mikroteilchen fixierten Antikörper besteht,

eine Vorrichtung zur Erzeugung eines äußeren Magnetfeldes, um ein Magnetfeld, vorzugsweise Gradientmagnetfeld zu erzeugen und es an die Lösung im Testgefäß anzulegen,

ein Magnetpolstück zum Konzentrieren des Magnetflusses an einer vorherbestimmten Position, um lokale Konzentration des Immunkomplexes zu bewirken, und zum Sammeln des Immunkomplexes an der Position der lokalen Konzentration durch direkte magnetische Adsorption zum Magnetpol hin, und

einen Bewegungsmechanismus zur Erzielung relativer Bewegung zwischen dem Magnetpolstück und dem Testgefäß.

4. Verfahren zur Herstellung einer Probe, umfassend einen ersten Schritt, bei dem eine Probe magnetisch markiert wird, um eine magnetisch markierte Probe zu bilden,

einen zweiten Schritt, bei dem an die magnetisch markierte Probe ein Gradientmagnetfeld angelegt wird, um die Probe auf die Oberfläche eines Gitters zur Verwendung bei Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop zu leiten, und die Probe auf dem Gitter fixiert wird, sowie

einen dritten Schritt, bei dem die magnetisch markierte Probe auf dem Gitter der Negativeinfärbung im Gradientmagnetfeld unterzogen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, das weiters vor dem magnetischen Markieren das Hinzufügen eines zur spezifischen Reaktion mit der Probe fähigen Antikörpers zu einer Suspension umfaßt, welche die Probe enthält, um die Probe zum Gerinnen zu bringen.

6. Verfahren nach Anspruch 4, weiters umfassend das Anlegen eines Gradientmagnetfeldes an eine Suspension, welche die magnetisch markierte Probe enthält, um die magnetisch markierte Probe lokal in einer Position der lokalen Konzentration an der Oberfläche der Suspension zu konzentrieren,

das Einsetzen eines dünnen Rohres an der Position der lokalen Konzentration und das Gewinnen der magnetisch markierten Probe.

7. Verfahren nach Anspruch 4, weiters umfassend das Halten des Gitters auf einem abnehmbaren Film, und

das Anlegen eines Gradientmagnetfeldes durch den Film von der Seite, die jener gegenüberliegt, an welche das Gitter gehalten wird, sodaß das Gitter sich an der Position des höchsten Magnetfeldes befindet.

8. Vorrichtung zur Herstellung einer Probe zur Elektronenmikroskopuntersuchung, umfassend

ein Gefäß, enthaltend eine Flüssigkeit, die einen magnetisch markierten Immunkomplex enthält, der aus einer Probe und einem daran gebundenen magnetischen Mikroteilchen besteht,

eine Einrichtung zum magnetischen Konzentrieren des Immunkomplexes an einer vorherbestimmten Position,

eine Einrichtung zur Rückgewinnung des Immunkomplexes,

eine Einrichtung zum Tragen eines entfernbaren Gitters zur Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop in der Flüssigkeit, und

eine Einrichtung zum Heranführen des Immunkomplexes an die Oberfläche des Gitters und Fixieren des Immunkomplexes daran.

9. Verfahren zur Herstellung einer Probe, umfassend

einen Schritt, bei dem eine Probe in eine Halteposition für magnetisch markierten Körper innerhalb eines Reaktors injiziert wird, in der ein magnetisch markierter Antikörper gehalten wird, der aus einem magnetischen Mikroteilchen und einem Antikörper oder Antigen besteht, der/das an das magnetische Mikroteilchen gebunden ist und die sich an der Oberfläche eines innerhalb des Reaktors angeordneten Magnetelements befindet, durch äußere magnetische Kraft, um die Probe und den magnetisch markierten Körper der Antigen-Antikörper-Reaktion zu unterziehen,

einen Schritt, bei dem der magnetisch markierte Antikörper rückgewonnen wird, indem das Anlegen der äußeren Magnetkraft aufgehoben wird, worin das Halten des magnetisch markierten Körpers durchgeführt wird, indem ein Magnetelement innerhalb des Reaktors magnetisiert wird, und die Rückgewinnung der magnetisch markierten Probe durch Entmagnetisierung des magnetischen Elements durchgeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Magnetisierung des Magnetelements im Gradientmagnetfeld durchgeführt wird und worin die Rückgewinnung des magnetisch markierten Körpers durch Entmagnetisierung des Magnetelements in Kombination mit Schwingungen des Magnetelements durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin die Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen der Probe und dem magnetisch markierten Körper durchgeführt wird, während die Probe durch die Halteposition für magnetisch markierten Körper zirkuliert wird oder das Magnetelement in Schwingung gehalten wird.

12. Vorrichtung zur Herstellung einer Probe, umfassend einen Reaktor,

einen Halteabschnitt für magnetisch markierten Körper innerhalb des Reaktors zum Halten eines magnetisch markierten Körpers, der aus einer Probe und einem an die Probe gebundenen magnetischen Mikroteilchen besteht,

einen Magneten, der dem Halteabschnitt für magnetisch markierten Körper zugeordnet und außerhalb des Reaktors angeordnet ist,

einen Erzeugungsmechanismus für ein Gradientmagnetfeld, der dem Magneten zur Erzeugung eines Gradientmagnetfelds zugeordnet ist,

ein innerhalb des Reaktors angeordnetes Magnetelement,

einen Probenzirkuliermechanismus zum Zirkulieren der Probe

und einen Rückgewinnungsmechanismus zum Rückgewinnen der magnetisch markierten Probe,

wobei der Rückgewinnungsmechanismus einen Mechanismus umfaßt, um den Magneten und den Halteabschnitt für magnetisch markierten Körper in Relativbewegung zu versetzen, beispielsweise indem der Magnet bewegt wird, um die an die magnetisch markierte Probe angelegte magnetische Kraft aufzuheben, und einen Mechanismus, mit dem das Magnetelement in Schwingung versetzt wird, um die Probe vom Magnetelement zu lösen.

13. Verfahren zur Herstellung einer Probe, umfassend

einen ersten Schritt, bei dem eine Probe in einer die Probe enthaltenden Suspension magnetisch markiert wird,

einen zweiten Schritt, bei dem lokale Konzentration der Probe durchgeführt wird, indem ein Gradientmagnetfeld an die Lösung angelegt wird,

worin ein Gitter zur Verwendung bei Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop an der Position der lokalen Konzentration eingesetzt wird, um die Probe auf dem Gitter zu gewinnen, und die Probe durch das Verfahren der magnetischen Adsorption an der Oberfläche des magnetisierten Gitters konzentriert und gesammelt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das Gradientmagnetfeld an die Suspension von der Seite des Gitters angelegt wird, die jener Seite gegenüberliegt, an der die magnetisch markierte Probe gewonnen wird, sodaß das Magnetfeld an der Position des Gitters am höchsten ist, um die magnetisch markierte Probe zum Gitter zu leiten und sie daran zu fixieren.

15. Vorrichtung zur Herstellung einer Probe, umfassend einen Mechanismus zur Erzeugung eines Gradientmagnetfelds,

einen Gitterhalter zum Halten eines Gitters zur Verwendung bei der Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop in einer Position, an der das Gradientmagnetfeld konzentriert ist, und

einen Führungsmechanismus, um den Gitterhalter zu einer vorherbestimmten Position an der Oberfläche der in einem Gefäß enthaltenen Suspension zu führen.

16. Verfahren nach Anspruch 13, folgende Schritte umfassend:

das magnetische Markieren einer Probe, um eine magnetisch markierte Probe zu bilden;

das Anlegen eines Gradientmagnetfeldes an die magnetisch markierte Probe, um die Probe an die Oberfläche eines Gitters zur Verwendung bei Betrachtung durch ein Elektronenmikroskop zu leiten, und das Fixieren der Probe auf dem Gitter, und

das Unterziehen der magnetisch markierten Probe auf dem Gitter der Negativeinfärbung im Gradientmagnetfeld.

17. Verfahren nach Anspruch 16, weiters umfassend das Hinzufügen eines probenspezifischen Antikörpers zu einer die Probe enthaltenden Suspension, um die Probe vor dem magnetischen Markieren zu koagulieren.

18. Verfahren nach Anspruch 14, weiters folgende Schritte umfassend: das Befestigen des Gitters auf einem abnehmbaren Film und das Anlegen eines Gradientmagnetfeldes durch den Film von der Seite, die jener gegenüberliegt, auf welcher das Gitter gehalten wird, sodaß die Position des Gitters sich beim höchsten magnetischen Fluß befindet.