DE68916729T2

DE68916729T2 - Lipoprotein-Analyse in Blut mittels magnetischer Kernresonanz.

Info

Publication number: DE68916729T2
Application number: DE68916729T
Authority: DE
Inventors: James D Otvos
Original assignee: Individual
Current assignee: Siemens Medical Solutions USA Inc
Priority date: 1988-09-26
Filing date: 1989-09-13
Publication date: 1994-12-08
Anticipated expiration: 2009-09-14
Also published as: JP3059181B2; JPH02116743A; DE68916729D1; EP0361214A1; EP0361214B1; US4933844A; CA1327993C; ES2056173T3

Description

Allgemeiner Stand der Technik

Das Gebiet der Erfindung betrifft die Messung von Lipoproteinspiegeln im Blutplasma oder Blutserum und insbesondere der Spiegel von Lipoproteinen geringer Dichte ("low-density lipoproteins", LDL), von Lipoproteinen hoher Dichte ("high-density lipoproteins", HDL) und von Lipoproteinen sehr geringer Dichte ("very low- density lipoproteins", VLDL). Diese Lipoproteine machen bei weitem den größten Anteil des im Blut vorliegenden Cholesterins aus.
Wie wichtig es ist, Cholesterinspiegel im Blut genau zu messen, ist wohlbekannt. Die Bundesregierung, in Zusammenarbeit mit über zwanzig Gesundheitsorganisationen, hat mittels des nationalen Cholesterinaufklärungsprogramms eine energische Kampagne lanciert, um Ärzte und die allgemeine Bevölkerung von den Gefahren hoher Cholesterinspiegel im Blut zu überzeugen. Es wird allen dringend geraten, ihre Cholesterinspiegel überprüfen zu lassen, und aufgrund der jeweils gemessenen genauen Cholesterinspiegel werden gezielte Behandlungen empfohlen. Überdies stützen sich diese Behandlungen nicht ausschließlich auf den Gesamtcholesterinspiegel, sondern auf den LDL-Cholesterinspiegel. LDL-Cholesterin stellt anscheinend die wichtigste Ursache verstopfter Arterien dar, wohingegen HDL-Cholesterin zur Entfernung von Cholesterinablagerungen beiträgt. Die Bestimmung des LDL- Cholesterinspiegels erfordert einen gesonderten und teureren Test, der üblicherweise nicht durchgeführt wird, es sei denn, der gemessene Gesamtcholesterinspiegel läge an oder jenseits der Grenze zu den mit hohem Risiko verbundenen Spiegeln.
Die gängigen Verfahren zur Messung von Cholesterinspiegeln sind als ungenau bekannt, und man geht üblicherweise so vor, daß die Messung bei der Entdeckung hoher Spiegel bei der ersten Messung mehrmals wiederholt wird. In fast der Hälfte der von Prüfungsanstalten durchgeführten Messungen wurden Fehler von 5% oder mehr beobachtet, und bei 15% der Messungen lag der Fehler bei über 10%. Diese Fehler wohnen den gängigen Meßverfahren inne, bei denen das Blut umständlicheren Prozeduren unterworfen werden muß und gewisse Annahmen über die Verhältnisse seiner Bestandteile erforderlich sind.
Die direkte quantitative Bestimmung von Lipoproteincholesterin erfolgt im allgemeinen durch enzymatische Bestimmung der einzelnen Lipoproteine, die durch Ultrazentrifugieren, Elektrophorese oder selektive Ausfällung getrennt werden. Die zur Verfügung stehenden Trennverfahren unterscheiden sich stark bezüglich ihrer Genauigkeit, praktischen Durchführbarkeit und Kosten. Im allgemeinen sind die genauesten Verfahren jene, bei denen ultrazentrifugiert wird, doch sind diese sehr zeitraubend und teuer und daher für großangelegte statistische Untersuchungen nicht geeignet. Als am weitesten verbreitete Alternative wird ein von W.T. Friedewald, R.I. Levy und D.S. Fredrickson in ihrer Veröffentlichung "Estimation of the Concentration of Low-Density Lipoprotein Cholesterol in Plasma, Without Use of the Preparative Ultracentrifuge" (Schätzung der Konzentration an Lipoprotein-Cholesterin geringer Dichte im Plasma ohne Verwendung der präparativen Ultrazentrifuge), Clin. Chem., 18, 499-502 (1972) eingeführtes indirektes Verfahren angewendet. Bei dieser Arbeitsweise werden Plasma- Triglyzerid (TG) und Gesamtcholesterin (TC) mittels enzymatischer Bestimmung gemessen. Eine gesonderte Teilmenge an Plasma wird mit einem aus einer Reihe von Reagenzien versetzt, das VLDL und LDL selektiv ausfällt. Nach Abtrennung des Niederschlags durch Zentrifugieren wird der Cholesteringehalt des Überstands bestimmt, um ein Maß für HDL-Cholesterin (HDL-C) zu gewinnen. Nun wird das VLDL-Cholesterin (VLDL-C) abgeschätzt indem der Plasma-Triglyzeridspiegel durch fünf dividiert wird. Die LDL-Cholesterin (LDL-C)-Konzentration wird dann aus dem Unterschied berechnet: LDL-C = TC - (HDL-C + VLDL-C). Zwar ist dieses Verfahren verhältnismäßig schnell und billig, doch können bei einigen Schritten experimentelle Fehler eingeschleppt werden, insbesondere bei der Ausfällung. Überdies hängt die Genauigkeit der Analyse von der Annahme ab, daß VLDL-C zuverlässig als ein Fünftel der Konzentration an Plasma-Triglyzerid abgeschätzt werden kann. Bei Verwendung von Nüchtern-Proben trifft dies meist zu, doch sind auch andere Formeln vorgeschlagen worden, die genauere Werte ergeben sollen, wie von D.M. DeLong, E.R. DeLong, P.D. Wood, K. Lippel und B.M. Rifkind in ihrer Veröffentlichung "A Comparison of Methods for the Estimation of Plasma Low- and Very Low- Density Lipoprotein Cholesterol" (Ein Vergleich von Verfahren zur Abschätzung von an Lipoprotein geringer und sehr geringer Dichte gebundenem Cholesterin im Plasma), J. Am. Med. Assoc., 256, 2372-2377 (1986), beschrieben.
Eine NMR-Lipoproteinanalyse von Blut wird von J. D. Bell et al., "HNMR studies of human blood plasma" (H-NMR-Studien an menschlichem Blutplasma) in FEBS Letters, Band 219, Nr. 1, Juli 1987, S. 239-243, beschrieben. Es werden nicht unter NMR fallende Verfahren, d.h. Zentrifugen usw., eingesetzt, um die Bestandteile des Blutplasmas zu trennen. Für jeden Bestandteil und für das Vollblutplasma werden NMR-Spektren erstellt. Laut den Verfassern können die Spektren von Blutplasma durch Addition der sich aus den einzelnen Lipoproteinen ergebenden Spektren simuliert werden. Es liegt jedoch kein Hinweis darauf vor, daß der Spiegel der einzelnen Lipoproteine durch Analyse der Spektren von Blutplasma gemessen werden kann, wie es die vorliegende Erfindung lehrt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Messung der Lipoprotein-Bestandteile des Blutes unter Verwendung eines magnetischen Kernresonanz- (NMR)-Verfahrens. Insbesondere werden bei dem Verfahren Protonen-NMR-Daten aus einer Blutplasma- oder Serumprobe gewonnen, werden die gewonnenen NMR-Daten verarbeitet, um so ein Spektrum der chemischen Verschiebung zu erhalten, und wird das Spektrum einer Dekonvolution, bezogen auf vier Normalspektren von Lipoproteinbestandteilen, unterzogen, um so die Konzentration jedes der vier Lipoprotein-Bestandteile zu erhalten. Es wurde gefunden, daß das Spektrum durch eine lineare Kombination der Spektren von vier Bestandteilen, in die das Blut fraktioniert werden kann, exakt wiedergegeben wird. Diese vier Bestandteile sind VLDL, LDL, HDL und Protein, und es hat sich gezeigt, daß ihre NMR-spektroskopischen Eigenschaften von Person zu Person praktisch invariant sind. Daher sind Unterschiede bei den NMR-Spektren ausschließlich auf Unterschiede der Amplituden der Spektren der Bestandteile zurückzuführen, was wiederum auf die Konzentrationen jener Bestandteile im Blut zurückgeht.
Eine allgemeine Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer exakten und zuverlässigen Messung der Lipoprotein-Bestandteile des Blutes. Da das beobachtete Spektrum einer Vollplasma-Probe durch entsprechend gewichtete Summen der NMR-Spektren ihrer vier Lipoprotein-Bestandteile getreu simuliert wird, können die Konzentrationen jener Bestandteile in einer Probe gewonnen werden, indem man jene Wichtungsfaktoren berechnet, die die beste Übereinstimmung zwischen dem Probenspektrum und dem berechneten Spektrum ergeben. Im Vergleich zu früheren Verfahren ist der Umgang mit der Probe und deren Verarbeitung verhältnismäßig einfach, und es tritt daher weniger Gelegenheit zu Fehlern auf. Die Probe wird lediglich für die NMR-Messung vorbereitet, und die Messung erfolgt bei einer geregelten Temperatur und einer geregelten magnetischen Feldstärke.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Messung der Lipoprotein-Bestandteile des Blutes, das rationell ist und in großem Umfang eingesetzt werden kann. Die Vorbereitung der Probe ist eine triviale Angelegenheit, und die eigentliche NMR-Messung erfolgt automatisch mittels eines NMR-Spektrometers in höchstens sieben Minuten. Die Dekonvolutionsberechnungen werden durch einen Computer ebenfalls automatisch durchgeführt, der dann ein Protokoll ausdruckt, das die Konzentrationen der Lipoprotein- Bestandteile angibt.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Verbesserung der Genauigkeit des Dekonvolutionsprozesses, indem auch andere Bestandteile als Lipoproteine in die Berechnung einbezogen werden. Es werden normierte NMR- Bezugsspektren für Metaboliten wie Laktat, Valin und Hydroxybutyrat erstellt, die dann zusammen mit den NMR- Bezugsspektren der Lipoprotein-Bestandteile zur Dekonvolution des NMR-Spektrums der Probe eingeeetzt werden.
Die oben genannten wie auch andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung. In der Beschreibung wird auf die zur Beschreibung gehörenden Zeichnungen Bezug genommen, in denen zur Erläuterung eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung abgebildet ist. Eine derartige Ausführungsform stellt jedoch nicht unbedingt den gesamten Rahmen der vorliegenden Erfindung dar; zur Auslegung des Rahmens der Erfindung sei daher auf die vorliegenden Ansprüche verwiesen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine die Spektren der chemischen Verschiebung einer ersten Plasmaprobe und deren Lipoprotein- Bestandteile darstellende Kurve;
Fig. 2 ist eine die Spektren der chemischen Verschiebung einer anderen Plasmaprobe und deren entsprechenden Lipoprotein-Bestandteile darstellende Kurve;
Fig. 3 ist eine die Spektren der chemischen Verschiebung einer dritten Plasmaprobe und deren entsprechenden Lipoprotein- und Nichtlipoprotein-Bestandteile darstellende Kurve;
Fig. 4 ist eine Blockzeichnung des zur Anwendung der vorliegenden Erfindung eingesetzten Geräts.

Allgemeine Beschreibung der Erfindung

¹H-NMR-Spektren menschlichen Blutplasmas enthalten zwei herausragende Peaks, deren Schwerpunkt bei etwa 1,2 und 0,8 ppm liegt (bezogen auf den chemischen Verschiebungsstandard, TSP). Diese Peaks ergeben sich aus Methylen-(CH&sub2;) bzw. Methyl-(CH&sub3;)-Protonen der Plasmalipide. Diese Peaks sind jeweils von sehr heterogener Art, bestehen sie doch aus einander überlagernden Resonanzen von Protonen aus den mehreren chemisch verschiedenen Klassen von in Plasma vorliegenden Lipiden: Triglyzeride; Cholesterin; Cholesterinester; sowie Phospholipide. Diese Lipide sind in drei Haupttypen von Lipoproteinteilchen zusammengepackt, die sich in den Verhältnissen der Lipide, welche sie enthalten, unterscheiden. Außerdem unterscheiden sich diese Lipoproteinteilchen auch in ihrer Dichte, woraus sich ihre Namen ableiten: Lipoprotein sehr geringer Dichte ("very low density lipoprotein," (VLDL), Lipoprotein geringer Dichte ("low density lipoprotein", LDL) und Lipoprotein hoher Dichte ("high density lipoprotein", HDL). Nur jener Anteil der Lipide in diesen Lipoproteinteilchen, der in einem flüssigen, beweglichen Zustand vorliegt (im Gegensatz zu einem geordneten flüssig-kristallinen Zustand), liefert NMR-Plasma-Resonanzen. Die Heterogenität dieser Signale zeigt sich in ihren komplexen Linienkonturen, die sich aufgrund von unterschiedlichen Plasmakonzentrationen der verschiedenen Lipoproteinteilchen, von denen jedes seine eigenen charakteristisch verschiedenen NMR-spektroskopischen Eigenschaften aufweist, von Person zu Person unterscheiden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Ermittlung der Konzentrationen aller drei Lipoproteinteilchen (VLDL, LDL, HDL) einer Plasmaprobe aus deren ¹H- NMR-Spektrum durch Computerauswertung der Linienkonturen der Methyl- und Methylensignale. Das Verfahren macht sich die Tatsache zunutze, daß dieses Gebiet des beobachteten Plasmaspektrums durch eine einfache lineare Kombination der Spektren von vier Bestandteilen, in die das Plasma durch differenzielle Flotationsultrazentrifugierung fraktioniert werden kann, exakt wiedergegeben wird. Die vier Bestandteile werden aufgrund ihrer Dichte differenziert; zu ihnen zählen: VLDL (Dichte < 1,006); LDL (Dichte = 1,006 bis 1,063); HDL (Dichte = 1,063 bis 1,21); und "Protein" (Dichte > 1,21). Der letztgenannte Bestandteil ist die hauptsächlich proteinhaltige, nach der Flotation der Lipoproteine zurückbleibende Rückstandsfraktion.
Es hat sich gezeigt, daß die NMR-spektroskopischen Eigenschaften dieser Bestandteile von Person zu Person praktisch invariant sind. Dies veranschaulicht die Tabelle 1, die aus einer von der Universität von Wisconsin-Milwaukee und der Medizinischen Hochschule von Wisconsin durchgeführten Untersuchung hervorgeht. TABELLE 1 NMR-Parameter (500 MHz) der isolierten Lipoprotein- Bestandteile des Plasmas Parameter Mittel + DA Chemische Verschiebung CH&sub2; (ppm) Chemische Verschiebung CH&sub3; (ppm) Linienbreite CH&sub2; (Hz) Linienbreite CH&sub3; (Hz) Intensitätsverhältnis CH&sub2;/CH&sub3; PROTEIN
Es gehen also Unterschiede zwischen den NMR- Signale aus dem Plasma von Einzelpersonen auf Unterschiede in den Amplituden der Lipid-Resonanzen aus den vier Bestandteilen zurück, die wiederum proportional zu deren Konzentrationen im Plasma sind.
Dies ist in den Figuren 1 und 2 dargestellt, wo die NMR-Spektren als chemische Verschiebungen zweier erheblich verschiedener Blutplasmaproben dargestellt sind. Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung benötigt man die durch Methylen-(CH&sub2;)- und Methyl-(CH&sub3;)-Protonen gebildeten Spektralpeaks, die im Spektralgebiet der chemischen Verschiebung zwischen 1,33 und 0,70 ppm auftreten, das entlang der horizontalen Achse dargestellt ist. Die Spektralpeaks werden jeweils durch die arithmetische Summe von vier durch die Blutplasmabestandteile VLDL, LDL, HDL und Proteine hervorgerufenen NMR-Signale gebildet. Man erkennt, daß die Linienkontur des Vollplasmaspektrums durch die Änderung der relativen Mengen seiner vier Lipoprotein- Bestandteile wesentlich verändert wird. Dabei bleiben die Linienkonturen der vier Lipoprotein-Bestandteile aber im wesentlichen gleich, obwohl sich ihre Amplituden mit ihren relativen Konzentrationen in der Plasmaprobe dramatisch ändern. Die invariante Linienkontur der NMR- Spektren der vier Plasmalipoprotein-Bestandteile über die Gesamtbevölkerung und die Tatsache, daß diese Linienkonturen arithmetisch summiert werden können und so die Linienkontur der Blutplasmaprobe ergeben, bilden eben die Grundlage für die vorliegende Erfindung.
Da die beobachteten CH&sub2;- und CH&sub3;-Linienkonturen von VollplasmaProben durch die entsprechend gewichtete Summe der Lipidsignale ihrer vier Lipoprotein-Bestandteile getreu simmuliert werden, können die Konzentrationen dieser in jeder beliebigen Probe vorliegenden Bestandteile ermittelt werden. Dies wird durch Berechnen jener Wichtungsfaktoren erreicht, die die beste Übereinstimmung zwischen gemessenen Blutplasma-NMR-Spektren und den beobachteten Blutplasma-Spektren ergeben. Das Verfahren der NMR-Lipoproteinanalyse umfaßt daher die folgenden Schritte: 1) Erfassung eines NMR-"Bezugs"- Spektrums für jeden der vier reinen Plasmabestandteile (VLDL, LDL, HDL, Protein), 2) Erfassung von Vollplasma- NMR-Spektren unter Einsatz von mit den bei der Ermittlung der Bezugsspektren verwendeten identischen Meßbedingungen, und 3) auf die vier Bestandteile bezogene Dekonvolution mittels Computer der Plasma-NMR-Spektren, woraus sich die Konzentration jedes der Lipoprotein-Bestandteile als Vielfaches der Konzentration der entsprechenden Lipoprotein-Bezugsprobe ergibt. Die Auswertung der Plasma-Linienkontur erfolgt durch Berechnung von Wichtungskoeffizienten für jedes der vier NMR-Bezugsspektren, durch die die Summe der zum quadratischen Abweichungen zwischen dem gemessenen Plasma-NMR-Spektrum und dem durch Summierung der vier gewichteten Bezugsspektren berechneten minimiert wird.
Zwar wird laut der vorliegenden Beschreibung die Erfindung zur Analyse von Blutplasma verwendet, doch kann sie ebenso wirksam auch zur Analyse vom Blutserum eingesetzt werden. Auch kann die Genauigkeit der Analyse gesteigert werden, wenn man außer Lipoprotein auch andere Bestandteile berücksichtigt. Zwar ist es denkbar, daß bei späterer Entwicklung die Liste derartiger Bestandteile erweitert wird, doch sind die durch Metaboliten wie Laktat, Valin und Hydroxybutyrat hervorgerufenen NMR- Signale wesentlich und sind in die Analyse aufzunehmen. Der Beitrag dieser Bestandteile zum NMR-Signal von Blutplasma wird in Fig. 3 gezeigt; wenn sie auch im Vergleich zu den Lipoprotein-Bestandteilen sehr klein sind, wirken sie sich doch auf die Genauigkeit des Dekonvolutionsverfahrens aus.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Blut wird Spendern nach einer nüchternen Periode von 12-16 Stunden abgenommen. Dadurch verringert sich die Menge an Chylomikronen, deren NMR-Spektren jenen von VLDL ähneln, und die in nicht nüchternen Spendern in unterschiedlicher Menge vorliegen. Das Blut wird in ein Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) enthaltendes, oben purpurnes Vacutainer-Rohr aufgezogen und dann sofort auf Eis gelegt. Die Blutprobe wird bei 4ºC zehn Minuten lang bei 1000 g innerhalb von vier Stunden nach der Probennahme zentrifugiert. Das abgetrennte Blutplasma wird in ein Plastikröhrchen pipettiert, und davon 0,5 ml in ein NMR-Röhrchen mit einem äußeren Durchmesser von 5 min überführt. Danach wird die Plasmaprobe bei 4ºC gekühlt bis die NMR-Analyse erfolgt, die innerhalb von 48 Stunden nach ihrer Abnahme geschehen sollte.
Mittels dieser Arbeitsweise gewinnt man Probenplasma sowohl zur Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung als auch zur Analyse zwecks Erstellung von NMR- Bezugsspektren der vier Bestandteile. Wie oben angedeutet benötigt man die NMR-Bezugsspektren zur Anwendung der vorliegenden Erfindung. Solange die NMR-Meßbedingungen jedoch konstant bleiben, können dieselben NMR-Bezugsspektren auch weiterhin zur Analyse weiterer Blutplasmaproben verwendet werden.
Zuerst müssen die NMR-Bezugsspektren für jedes der vier Bestandteile von Blutplasma (VLDL, LDL, HDL und Proteine) ermittelt werden. Plasma wird wie oben beschrieben gewonnen, und eine Probe von 30 ml wird mit soviel Natriumazid (NaN&sub3;) versetzt, daß sich eine Konzentration von 0,05 Gewichtsprozent ergibt. Das Probenplasma wird dann durch sequentielles Flotationsultrazentrifugieren bei 10ºC in vier Bestandteile verschiedener Dichte fraktioniert, wie von V.N. Schumaker und D.L. Puppione in "Sequential Flotation Ultracentrifugation" (Sequentielles Flotationsultrazentrifugieren), Methods in Enzymology, Band 128, s. 155-170, Academic Press, New York, 1986, beschrieben. Die vier Bestandteile sind wie folgt definiert: VLDL (d < 1,006 g/ml), LDL (d = 1,006 bis 1,063), HDL (d = 1,063 bis 1,21) und Protein (d > 1,21). Insbesondere geht man so vor, daß das Plasma in zwei Gruppen, #1 und #2, geteilt wird. Die Dichte von #1 (d = 1,006) wird nicht verändert, und die Dichte von #2 wird auf 1,063 g/ml eingestellt, indem man das entsprechende Volumen einer konzentrierten Lösung von Natriumbromid (NaBr) hinzufügt. Die zwei Plasmagruppen werden in Plastikröhrchen (2 ml) bei 50.000 U/min 18 Stunden lang in einem Ultrazentrifugenläufer, Typ Beckman 50.3 Ti, zentrifugiert. Die reines VLDL erhaltende obere Fraktion von #1 wird abgetrennt und bei 4ºC aufbewahrt. Die Dichte der unteren Fraktion von #1 (mit LDL, HDL und Protein) wird auf d = 1,063 (#3) eingestellt und die untere Fraktion von #2 (mit HDL und Protein) wird auf d = 1,21 (#4) eingestellt. Diese zwei Probengruppen werden abermals bei 50,000 U/min 24 Stunden lang zentrifugiert. Die obere Fraktion von #3 enthält reines LDL, die obere Fraktion von #4 enthält HDL, und die untere Fraktion von #4 enthält Protein.
Zu diesem Zeitpunkt enthalten die Lösungen der vier getrennten Plasmabestandteile noch gewisse niedermolekulare Metaboliten, deren Methylprotonen-NMR-Signale im selben Spektralbereich auftreten wie die gewunschten Lipid-Methyl- und Methylenresonanzen. Diese Verbindungen, welche die Linienkonturauswertung stören würden, werden durch wiederholte Ultrafiltration der vier Lipoprotein- Bestandteillösungen bei 4ºC in einem von der Firma Amicon Corp. hergestellten Mikrokonzentrator des Typs Centricon 10 entfernt. Nach jedem fünffachen Konzentrationsschritt werden die Lipoproteinlösungen mit einer "Schein"-Plasmalösung aus 0,08M NaBr, 0,05M Natriumphosphat, 0,005M EDTA, 0,001M CaCl&sub2;, pH 7,4 auf ihre ursprüngliche Konzentration verdünnt. Teilmengen (0,5 ml) jedes Probenbestandteils werden in 5mm-NMR-Röhrchen gegeben und bei 4ºC bis zur Analyse aufbewahrt.
Nun werden die NMR-Spektren der vier Bezugs- Lipoprotein-Bestandteile erfaßt. Sie werden im Speicher eines Rechners gespeichert, und die Linienkonturen und Amplituden ihrer Methyl- und Methylenlipidresonanzen dienen als bei dem zur Dekonvolution von Blutplasmaproben eingesetzten Linienkonturen-Angleichungsverfahren verwendete Bezugsgrößen. Da die Linienkonturen und Amplituden der NMR-Spektren recht empfindlich von den NMR- Meßparametern, besonders der magnetischen Feldstärke und Temperatur abhängen, ist es unbedingt notwendig, die Lipoprotein-Bezugsspektren unter den gleichen Meßbedingungen zu erfassen, die auch bei der Messung der Vollplasmaproben angewendet werden.
In der bevorzugten Ausführungsform werden die NMR-Messungen bei 250 MHz unter Verwendung eines nicht modifizierten handelsüblichen Spektrometers, des von Bruker Instruments, Inc. hergestellten Modells WM250, durchgeführt. Es wird eine Festfrequenz 5-mm-¹H-Sonde eingebaut und der Temperaturregler auf 23ºC (± 0,5ºC) eingestellt. Die Homogenität des Feldes wird durch Shimming bei einer Probe von 99,8% D&sub2;O optimiert, bis die Spektrallinienbreite des HDO-NMR-Signals weniger als 0,6 Hz beträgt. Zur D&sub2;O-Messung wird die 90º HF-Anregungspulsbreite auf einen Wert von 5,5 ± 0,2 Mikrosekunden eingestellt.
Was insbesondere Fig. 4 angeht, so wird das durch die gestrichelte Linie 10 angedeutete Spektrometer durch einen Digitalrechner 11 gesteuert. Der Rechner 11 ist unter der Handelsbezeichnung "ASPECT 2000" erhältlich und weist eine Wortlänge von 24 Bits und Speicherkapazität für 80 K Worte auf. Er eignet sich besonders zur Durchführung schneller Fourier-Transformationen und weist zu diesem Zweck eine fest verdrahtete Sinustabelle und fest verdrahtete Multiplikations- und Divisionsschaltung auf. Außerdem ist er mit einer Datenleitung 12 zu einem externen Personal Computer 13 und einem direkten Speicherzugriffskanal 14 ausgestattet, der mit einer Festplatteneinheit 15 verbunden werden kann.
Außerdem ist der Digitalrechner 11 mit einem Satz von Analog-Digitalumsetzern, Digital-Analogumsetzern und langsamen E/A-Geräteanschlüssen ausgestattet, die über eine Pulssteuerungs- und Schnittstellenschaltung 16 mit dem Betriebssystem des Spektrometers in Verbindung stehen. Zu diesem System gehört ein HF-Sender 17, der einen HF-Anregungspuls mit durch den Digitalrechner 11 bestimmter Dauer, Frequenz und Größe erzeugt, und ein HF- Leistungsverstärker 18, der den Puls verstärkt und ihn mit der HF-Sendespule 19 koppelt, die das Probenrohr 20 umgibt. Das durch die angeregte Probe in Gegenwart eines durch den supraleitenden Magneten 21 erzeugten polarisierenden Magnetfelds von 5,875 Tesla erzeugte NMR- Signal wird von einer Spule 22 empfangen und an einen HF- Empfänger 23 angelegt. Das verstärkte und gefilterte NMR- Signal wird bei 24 demoduliert und die so erzeugten, um 90º phasenverschobenen Signale werden der Schnittstellenschaltung 16 zugeführt, wo sie digitalisiert und durch den Digitalrechner 11 einer Datei im Datenspeicher 15 eingegeben werden.
Nach Erfassung der NMR-Daten aus der Probe im Röhrchen 20 werden sie durch den Rechner 11 verarbeitet und ergeben so eine weitere Datei, die im Datenspeicher 15 gespeichert wird. Bei dieser zweiten Datei handelt es sich um eine digitale Darstellung des Spektrums der chemischen Verschiebung; sie wird danach in den Personal Computer 13 ausgelesen, um dort in dessen Datenspeicher 25 gespeichert zu werden. Gesteuert von einem in seinem Speicher gespeicherten Programm, verarbeitet der Personal Computer 13 das Spektrum der chemischen Verschiebung gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung zwecks Ausdrucken eines Protokolls, das an einen Drucker 26 ausgegeben wird.
Dem Durchschnittsfachmann wird einleuchten, daß die von dem Personal Computer 13 und dessen gesondertem Datenspeicher 25 ausgeübten Funktionen auch in die vom dem Digitalrechner 11 des Spektrometers ausgeübten Funktionen aufgenommen werden können. In diesem Fall ist der Drucker 26 direkt mit dem Digitalrechner 11 verbunden.
Bevor sie gemessen werden, nimmt man die Bezugsproben von 0,5 ml aus dem Kühlschrank und läßt sie über einen Zeitraum von zehn Minuten bis zwei Stunden auf eine Temperatur von 23ºC erwärmen. Ein verschlossener koaxialer Einsatz (Wilmad, Cat. #WGS-8BL) mit einem externen Standard, welcher dem Feld-Frequenz-Lock und der Normierung der Plasmasignalamplituden dient, wird vor der Aufnahme des Spektrums in jedes Plasma-NMR-Probenröhrchen eingebracht. Dieser Standardeinsatz weist die folgende Zusammensetzung auf: 0,008M TSP (Natrium-3-trimethyl- [2,2,3,3-²H&sub4;)-propionat), 0,6mM MnSO&sub4;, 99,8% D&sub2;O. Das D&sub2;O liefert das Feld-Frequenz-Lock und mit Hilfe der integrierten Fläche der TSP-Resonanz normiert man die Amplituden der Plasmalipidresonanzen, um Schwankungen der Nachweisempfindlichkeit des Spektrometers auszugleichen. Man dotiert die Lösung mit Mn²&spplus;, um die normalerweise scharfe TSP-Resonanz paramagnetisch zu verbreitern, damit deren integrierte Fläche unempfindlich gegenüber geringen Schwankungen der Feldhomogenität wird, und um deren T&sub1;- Relaxationszeit auf einen mit jenen der Plasmalipidresonanzen vergleichbaren Wert zu senken (200 bis 500 Millisekunden). Die Vergleichsprobe mit dem koaxialen Einsatz wird auf eine bestimmte Tiefe in das Probenröhrchen eingebracht und in das Spektrometer eingeführt. Die Probe wird mit einer Geschwindigkeit von 20 Hz gedreht. Nach Einlocken auf das D&sub2;O-Signal aus dem koaxialen Einsatz erfolgt kurzes Shimming der z- und z²- gradientensteuerung mit Hilfe des NMR-Signals des Plasmawassers.
Nun ermittelt man das Bezugsspektrum mit Hilfe einer normalen Einpulssequenz nach einem eine Sekunde langen selektiven Entkopplungsvorsättigungspuls der starken H&sub2;O-Resonanz. Es wird ein räumlich selektiver, zusammengesetzter 90º-Beobachtungspuls (90x-90y-90-x-90-y) angewendet um sich aus der Wassersignalunterdrückung ergebende Artefakte so klein wie möglich zu halten, wie von A. Bax, "A Spatially Selective Composite 90º Radiofrequency Pulse" (Ein räumlich selektiver, zusammengesetzter 90º-Hochfrequenzpuls) in J. Magn. Reson., 65 142-145 (1985), beschrieben, wenngleich ein normaler 90º- Puls ebenfalls zu befriedigenden Ergebnissen führt. Man wendet die folgenden Erfassungsparameter an: 240 Transienten (4 Blindläufe), Datenumfang 4K, Quadraturphasen detektion, Spektralbreite 2800 Hz (9,9 bis -1,2 ppm), Meßzeit 0,73 Sek., Entkopplungsvorsättigungspuls (0,2 Watt) mit einer Dauer von 1,0 Sek. bei der H&sub2;O-Frequenz, zusammengesetzter 90º-Puls von 22 Mikrosekunden und konstante Empfängerverstärkung für alle Spektren. Die Zeit-Spektren (FIDs) der vier Lipoprotein-Bezugsproben werden digitalisiert und auf Speicherplatten gespeichert.
Die Bezugsproben-FIDs werden ebenso verarbeitet und ergeben so die bei der Fit-Analyse der Plasma-Linienkonturen eingesetzten Frequenz-Spektren. Für die dabei erfolgenden Arbeitsschritte (Fourier-Transformation, Einstellung der Signal phase und Grundlinienkorrektur) wird die normale handelsübliche Software des NMR-Spektrometers eingesetzt ("DISNMR"-Programm von Bruker). Die FIDs werden nach Anwendung einer 1,0 Hz linienverbreiternden exponentiellen Multiplikationsfunktion einer Fourier-Transformation unterzogen, wobei 16K Meßpunkte verwendet werden. Alle Spektren werden auf den gleichen Maßstab umgerechnet. Dann erfolgt eine Phasenkorrektur der Spektren, um so reine Absorptionssignale zu erhalten.
Die Skalen der chemischen Verschiebung der vier Lipoprotein-Bezugsspektren können nicht auf die Ca-EDTA- Resonanz bezogen werden, weil die ionische Zusammensetzung dieser Bezugsproben sich von jener des Plasmas unterscheidet (als Folge des Ultrazentrifugierungsverfahrens). Es wurde gefunden, daß die Verschiebungen der Methyl- und Methylenresonanzen der Lipoproteine und jene von Ca-EDTA von der Ionenstärke unterschiedlich stark beeinflußt werden, und durch gezielte Messungen der Größe dieses Effektes war es möglich, die "wahren" chemischen Verschiebungen der Methyl- und Methylenresonanzen der Lipoprotein-Bestandteile in Vollplasma zu ermitteln. Diese chemischen Verschiebungen sind in der folgenden Tabelle aufgeführt; sie werden als Bezugspunkte für die Verschiebungsskalen der vier Lipoprotein-Bezugsspektren verwendet. Protein CH&sub2;-Verschiebung (ppm)
Dann wird eine lineare Grundlinienkorrektur angewendet, um die Grundlinie zwischen 1,8 und -0,2 ppm einzuebnen, und die einer Fourier-Transformation unterzogenen, in Phase gebrachten und grundlinienkorrigierten Spektren werden an einen von IBM hergestellten Personal Computer, Modell PC-AT, übermittelt und auf dessen Platte gespeichert.
Die Einrichtung ist nun zur Messung von Plasmaproben bereit. Dabei geht man praktisch genauso vor wie bei der oben beschriebenen Messung der Bezugsproben. Man verwendet das gleiche NMR-Spektrometer, das auch auf die gleiche Betriebsweise wie die bei der Erfassung der Lipoprotein-Bezugsspektren verwendete eingestellt wird. Das Zeit-Spektrum (FID) der Plasmaprobe wird auf gleiche Weise ermittelt wie die Bezugsspektren, und es wird auch fast genauso verarbeitet, um eine digitalisierte Darstellung des Blutplasmaprobenspektrums auf der Platte des Personal Computers zu ergeben. Der einzige Unterschied bei dieser Verarbeitung liegt darin, daß die Vollplasmaspektren exakt auf den durch den in der Probe vorliegenden Kalziumkomplex von EDTA erzeugten scharfen NMR-Resonanzpeak bezogen werden können. Das gesamte Spektrum wird je nachdem verschoben, um diesen Peak auf 1,519 ppm auf der horizontalen Skala einzustellen.
Der Personal Computer speichert ein Programm, welches die Linienkontur des Plasmaprobenspektrums mittels einer gewichteten lineare Kombination der vier Lipoprotein-Bezugsspektren angleicht. Bei der Angleichung werden sowohl die reellen wie auch die imaginären Teile der Spektren verwendet, um unvermeidliche kleine relative Phasenunterschiede zwischen dem Plasmaprobenspektrum und den Lipoprotein-Bezugsspektren aüfzugleichen. Die exakte Linienkonturanalyse hängt auch von der korrekten Ausrichtung des Methyl- und Methylenbereichs des Plasmaprobenspektrums zu demselben spektralen Bereich der vier Bezugsspektren ab (deren gegenseitige relative Ausrichtung festliegt). Kleine Unterschiede der chemischen Verschiebung zwischen den Plasmaproben leicht unterschiedlicher ionischer Zusammensetzung werden im Programm kompensiert, indem die Plasmaproben- und Bezugsspektren systematisch gegeneinender um jeweils einen Meßpunkt verschoben werden, um so die geringste mittlere quadratische Abweichung zwischen dem reellen gemessenen Spektrum und dem berechneten Plasmaspektrum zu ermitteln.
Die bei dem Linienkontur-Angleichungsverfahren verwendete Mathematik (d.h. Angleichung nach der Methode der kleinsten Quadrate einer unbekannten Funktion als gewichtete Summe bekannter Funktionen) ist wohlbekannt und in vielen Lehrbüchern der Numerischen Analyse beschrieben worden, wie etwa F.B. Hildebrand, Introduction to Numerical Analysis (Einführung in die Numerische Analyse), 2. Auflage, S. 314-326, 539-567, McGraw-Hill, 1975. Ein Programm zur Durchführung dieser Funktion auf einem PC-AT-Rechner wird im Anhang offenbart. Die Meßpunkte des reellen Teils des Plasmaprobenspektrums, die den anzugleichenden Spektralbereich (üblicherweise 1,33- 0,70 ppm) umfassen, werden in ein Feld eingegeben. Dieses Plasmafeld besteht aus m diskreten Meßpunkten, die mit Pio, i = 1,2,...m, bezeichnet werden. Die Meßpunkte sowohl der reellen wie auch der imaginären Teile der vier Lipoprotein-Bezugsspektren für denselben Spektralbereich werden in gesonderte Felder eingegeben. Die Meßpunkte dieser Felder werden mit VjiR bzw. VjiI für die reellen und imaginären Teile bezeichnet, wobei i = 1,2,...m Meßpunkte und j = 1,2...n Bestandteile (n = 4 wenn nur die vier Lipoprotein-Bestandteile bei der Angleichung verwendet werden, und n=7 wenn auch die drei Nicht- Lipoprotein-Bestandteile der Fig. 3 in die Analyse eingehen). Das Verfahren zur Angleichung des gemessenen Plasmaprobenspektrums Pio, mit Hilfe einer linearen Kombination von n Bestandteilsspektren, geht von der Annahme aus, daß ein solcher Satz von Koeffizienten (Wichtungsfaktoren), cjR und cjI, entsprechend den reellen und imaginären Beiträgen der Komponente j zum beobachteten Spektrum existiert, so daß für jeden Meßpunkt gilt: (berechnetes Plasmaspektrum)
Die bestmögliche Angleichung ergibt sich bei Minimierung des mittleren Fehlers
wobei &epsi;i = Pio - Pic.
Man erreicht dies durch Ermittlung jener Koeffizienten, die Σ&epsi;i² minimieren, also wenn
j = 1,2,...2n (n reelle plus n imaginäre Beiträge). Die Differenzierung ergibt ein System von 2n linearen Gleichungen:
Setzt man
so erhält man ein System von 2n linearen Gleichungen der Form:
Durch Bildung der 2n x 2n- Matrix, [A] = [akj], j = 1,2...2n; k = 1,2...2n, ergibt sich [A] = , wobei und die Spaltenvektoren
darstellen. Die die beste Angleichung ergebenden Koeffizienten werden durch Matrixinversion berechnet:
= [A] &supmin;¹
Die Wurzel der mittleren quadratischen Abweichung ("root mean square deviation, RMSD") berechnet sich als
Um eine inkorrekte Ausrichtung des Plasmaprobendatenfelds bezüglich der Bezugsdatenfelder zu kompensieren, wird die Plasmaprobendatei um jeweils einen Meßpunkt in beiden Richtungen bezüglich der Bezugsdaten verschoben. Für jede Ausrichtung werden die Koeffizienten und mittlere quadratische Abweichungen neu berechnet, um so die beste Angleichung (geringste mittlere quadratische Abweichung) zu ermitteln.
Für jeden Bestandteil j ist so ein reeller und imaginärer Koeffizient cjR und cjI berechnet worden. Als Wichtungskoeffizienten für jeden Bestandteil ergibt sich daher:
cj = [(cjR)² + (cjI)²]
und als seine Phase
θj = tan&supmin;¹ (cjI/cjR).
Die gesamte Phasenverschiebung des berechneten Plasmaspektrums gegenüber jener des gemessenen Plasmaspektrums ergibt sich aus:
Aus den aus dieser Linienkonturanalyse hervorgehenden Komponentenkoeffizienten ergeben sich die Konzentrationen der vier Lipoprotein-Bestandteile in jeder Plasmaprobe. Die Konzentrationen werden jeweils bezogen auf die Konzentration des Lipoproteins ausgedrückt, dessen Spektrum als Bezugsspektrum dient. Die Endkonzentrationen werden auf die integrierte Fläche der Resonanz aus dem externen TSP-Standard normiert, um Schwankungen der Nachweisempfindlichkeit des NMR-Spektrometers auszugleichen.
Die aus der oben beschriebenen, sehr raschen (Minuten) und fast keine Probenbearbeitung erfordernden Vorgangsweise erhaltenen Angaben sind jenen äquivalent, die durch Ermittlung gesonderter Spektren der durch Ultrazentrifugierung (Tage) hergestellten vier Komponenten und Vergleich der Integrale ihrer Lipid-NMR- Signale mit jenen von Bezugs-Lipoproteinproben erhalten werden. Es sei besonders darauf hingewiesen, daß die mit dieser Vorgangsweise gemessenen Daten (durch die "mobilen" Lipidmoleküle in jeder Lipoproteinklasse erzeugte NMR-Signalamplitude) zwar in Beziehung zu mit derzeit in klinischer Verwendung stehenden diversen chemischen und immunochemischen Bestimmungsmethoden erhaltenen Lipoprotein-Lipid- und -Proteinkonzentrationen stehen, sich davon aber fundamental unterscheiden. Es besteht daher kein Grund, eine vollkommene Korrelation zwischen diesen aus NMR-Messungen hergeleiteten Lipoproteinspiegeln und jenen aus üblichen Serumcholesterin- und Triglyzeridanalysen hergeleiteten zu erwarten. Trotz der gut dokumentierten, beschränkten Genauigkeit letzterer Messungen ist ihre klinische Verwendung weit verbreitet, weil sie sich bei der Einschätzung des Herzkranzgefäßerkrankungsrisikos und anderen mit Lipiden in Zusammenhang stehenden Krankheitszuständen gut bewährt haben.
Möglicherweise werden sich aus dem NMR-Linienkontur- Dekonvolutionsverfahren hergeleitete Lipoproteinspiegel sogar als noch nützlicher bei der Diagnose erweisen, doch wird sich dies erst nach Durchführung ausgedehnter klinischer Korrelationsuntersuchungen zeigen.
Was nun die Frage angeht, ob das Linienkontur- Dekonvolutionsverfahren eine genaue Anzeige der Konzentrationen der Plasmabestandteile ergibt, habe ich eine Reihe von künstlichen Plasmaproben analysiert, die durch Vermischung definierter Mengen der vier Lipoprotein- Bestandteile hergestellt worden waren. Wie die folgende Tabelle 2 zeigt, erhält man gute Übereinstimmung zwischen den bekannten Konzentrationen der vier Bestandteile in jeder Probe und den mit Hilfe des rechnergestützten Linienkontur-Dekonvolutionsverfahrens berechneten. Tabelle 2 Dekonvolution bekannter Plasmaspektren bei 250 MHz PROTEIN Probe
Plasmaproben wurden durch Vermischung definierter Volumina gepufferter Kochsalzlösung und konzentrierter Stammlösungen und VLDL, LDL, HDL und Protein (untere Fraktion) hergestellt, die durch Ultrazentrifugierung gesammelten Plasmas mehrerer Spender isoliert worden waren. 250 MHz-Spektren (240 Läufe, Vorsättigung 1 sek.) wurden sowohl von den bekannten Plasmaproben als auch von den Lipoprotein-Stammlösungen bei 23º aufgenommen und mit einer linienverbreiternden Fensterfunktion (1 Hz) und Grundlinieneinebnung zwischen 1,8 und -0,2 ppm. verarbeitet. Nach Übermittlung der Spektren an einen PC-AT-Rechner erfolgte die Linienkonturanalyse für den die Methyl- und Methylen-Lipidsignale der bekannten Plasmaspektren enthaltenden Spektralbereich, indem das Signal, wie oben beschrieben, einer Dekonvolution unterzogen wurden, bezogen auf die Amplituden der Signale der in jeder Plasmaprobe vorliegenden vier Lipoprotein- Bestandteile, ausgedrückt Verhältnis zu den Konzentrationen der Lipoprotein-Stammlösungen, deren Spektralamplituden als Bezugsdaten dienen. Tabelle 2 zeigt die durch Linienkonturanalyse berechneten Konzentrationen der Lipoprotein-Komponenten (Ber.) im Vergleich zu den wahren, bekannten Konzentrationen (Wahr) in den verschiedenen Plasmaproben. Der Gehalt an Triglyzerid (TG) bzw. Gesamtcholesterin (Chol.) der vier Lipoprotein- Bezugsproben wurde direkt bestimmt, und der Lipidgehalt der Plasmaproben wurde aus deren bekannten Lipoprotein- Zusammensetzungen berechnet.
Wie oben angeführt, kann die Genauigkeit der Methode verbessert werden, indem man auch andere Blutplasma-Bestandteile in die Analyse einbezieht. Insbesondere ergeben die Metabolite Laktat, Valin und Hydroxybutyrat kleine, aber merkliche Protonen-NMR-Signale, wie Fig. 3 zeigt. Wie bei den vier Lipoprotein-Bestandteilen können diese Metabolit-Bestandteile getrennt, und für jeden von ihnen Bezugs-NMR-Spektren erstellt werden. Diese zusätzlichen Bestandteile gehen dann ebenfalls in das oben beschriebene Dekonvolutionsverfahren ein, wodurch die Konzentrationen der Lipoprotein-Bestandteile in der Blutplasmaprobe genauer bestimmt werden können.
Dem Durchschnittsfachmann wird einleuchten, daß gegenüber der oben dargestellten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung noch viele Abwandlungen möglich sind. Zum Beispiel kann die polarisierende Feldstärke erhöht werden, um das NMR-Spektrum noch weiter zu dehnen und um so die Auflösung des Dekonvolutionsverfahrens zu verbessern. Auch können die Messungen bei anderen Temperaturen durchgeführt werden. Unabhängig von der gewählten magnetischen Feldstärke oder Meßtemperatur ist es wesentlich, daß die gewählten Werte während des gesamten Verfahrens der Erstellung der Bezugsspektren und der Probenspektren konstant bleiben. APPENDIX

Claims

1. Verfahren zur Messung der Lipoprotein-Bestandteile des Blutes, wobei die folgenden Schritte durchgeführt werden:

Speicherung des NMR-Spektrums jedes Lipoprotein- Bestandteils als Bezugsspektrum für jenen Bestandteil;

Erfassung des NMR-Spektrums einer Plasma- oder Serumprobe des zu analysierenden Blutes;

Erstellung einer berechneten Linienkontur durch Summierung des Bezugsspektrums für jeden Bestandteil in durch entsprechende Bestandteilkoeffizienten bestimmten Mengen;

Anpassung der Bestandteilkoeffizienten zur Angleichung der berechneten Linienkontur an das NMR- Spektrum der Probe; und

Berechnung der Konzentration wenigstens eines Lipoprotein-Bestandteils in Abhängigkeit von der Größe dessen Bestandteilkoeffizienten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei den Lipoprotein-Bestandteilen um VLDL, LDL, HDL und Proteine handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das NMR- Spektrum wenigstens einen der durch Methylen- und Methylprotonen erzeugten Peaks enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die NMR- Spektren Spektren der chemischen Verschiebung sind und das NMR-Probenspektrum erfaßt wird, indem

a) das von der Probe in einem NMR-Spektrometer erzeugte NMR Signal im Zeitbereich erfaßt wird; und

b) eine Fourier-Transformation an dem erfaßten NMR-Signal durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das NMR- Spektrum jedes Lipoprotein-Bestandteils durch

a) Abtrennung des Lipoprotein-Bestandteils aus einer Blutprobe;

b) Erfassung des durch den abgetrennten Lipoprotein-Bestandteil in einem NMR-Spektrometer erzeugten NMR-Signals; und

c) Durchführung einer Fourier-Transformation am erfaßten NMR-Signal zur Erstellung des NNR-Spektrums des Lipoprotein-Bestandteils

erstellt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei:

d) das Probenspektrum so verschoben wird, daß ein bekannter Peak darin zu seinem bekannten chemischen Verschiebungswert ausgerichtet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die berechnete Linienkontur an die NMR-Spektren der Probe durch Minimierung der Wurzeln aus den mittleren Fehlerquadraten angeglichen wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das NMR-Spektrum eines Nicht-Lipoprotein-Bestandteils als Bezugsspektrum für jenen Bestandteil gespeichert wird und das Bezugsspektrum für den Nicht-Lipoprotein-Bestandteil in die berechnete Linienkontur eingeht.

9. Verfahren nach Anspruch 1, das den Schritt der Erstellung eines die Konzentration jedes berechneten Lipoprotein-Bestandteils angebenden gedruckten Protokolls einbezieht.

10. Vorrichtung zur Messung mehrerer Lipoprotein- Bestandteile des Blutes, die

eine Einrichtung (25) zur Speichung des NMR- Spektrums eines jeden jener mehrerer Lipoprotein-Bestandteile als Bezugsspektrum für jenen Bestandteil;

eine Einrichtung (10) zur Erfassung des NMR-Spektrums einer Plasma- oder Serumprobe des zu analysierenden Blutes;

eine Einrichtung (13) zur Erstellung einer berechneten Linienkontur durch Summierung des Bezugsspektrums für jeden Bestandteil in durch entsprechende Bestandteilkoeffizienten bestimmten Mengen;

eine Einrichtung (13) zur Anpassung der Bestandteilkoeffizienten zur Angleichung der berechneten Linienkontur an das NMR-Spektrum der Probe; und

eine Einrichtung (13) zur Berechnung der Konzentration wenigstens eines jener mehrerer Lipoprotein- Bestandteile in Abhängigkeit von der Größe dessen Bestandteilkoeffizienten

umfaßt.

11. Vorrichtung gemäß Anspruch 10, bei dem die NMR- Spektren Spektren der chemischen Verschiebung sind und das NMR-Probenspektrum erfaßt wird durch

a) eine Einrichtung (10) zur Erfassung des NMR- Signals der Probe in einem NMR-Spektrometer; und

b) eine Einrichtung (11) zur Durchführung einer Fourier-Transformation an dem erfaßten NMR-Signal.

12. Vorrichtung gemäß Anspruch 10, mit einer Druckereinrichtung (26) zur Erstellung eines Protokolls, das die Konzentration jedes berechneten Lipoprotein-Bestandteils angibt.