DE68912403T2 - Monoklonaler Antikörper, spezifisch für eine in transformierten Zellen exprimierte Fibronectin-Sequenz, Hybridoma, das diesen Antikörper erzeugt und Verwendung dieses monoklonalen Antikörpers zur Diagnose von Tumoren. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft einen spezifischen monoclonalen Antikörper gegen eine Proteinsequenz, die vom Exon ED-B von menschlichem Fibronectin codiert wird, ein Hybridom, das diesen Antikörper absondert, und die Verwendung dieses Antikörpers zur Diagnose von Tumoren.
• Fibronectine sind eine Klasse von Glycoproteinen mit hohem Molekulargewicht, die in löslicher Form im Plasma und anderen Körperflüssigkeiten und in nichtlöslicher Form in extrazellulären Matrices vorhanden sind. Fibronectin-Moleküle sind an verschiedenen biologischen Phänomenen beteiligt, beispielsweise an der Aufrechterhaltung einer normalen Zellmorphologie, Zellwanderung, Hämostasis und Throm-bose, Wundheilung und onkogenen Transformation. Es ist be-kannt, daß Fibronectin (FN) aus einem Gemisch von Molekülen von unterschiedlichen Strukturen (Isoformen) besteht, deren Eigenschaften sich je nach Ursprungsgewebe ändern. FN aus transformierten menschlichen Zellkulturen weist eine Isoform-Zusammensetzung auf, die sich vom normalen Gegenstück sehr unterscheidet. Tatsächlich erzeugen transformierte Zellen beachtliche Mengen einer FN-Isoform (β-FN), die in normalen Zellen kaum vorhanden ist. Es ist kürzlich gezeigt worden, daß diese FN-Form aus einem differentiellen Spleißmuster des FN-mRNA-Vorläufers hervorgeht, das in transformierten Zellen zu einem hohen Expressionsniveau des ED-B- Exons führt, das im Gegensatz dazu in normalen Zellen nur gering exprimiert wird (EMBO J. 6 (1987), 2337-2342.
• Der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper ermöglicht die Analyse der Isoform-Zusammensetzung von FN in durch Biopsien erhaltenen menschlichen Geweben und ist daher für viele diagnostische und/oder therapeutische Verwendungen geeignet.
• Der erfindungsgemäße Antikörper liefert aufgrund seiner hohen Affinität und Spezifität ein ideales Reagens zum Nachweis der onkofötalen FN-Isoform in Biopsien von menschlichen Geweben.
• Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Gesichtspunkt wird ein Hybridom bereitgestellt, das durch Fusion von Milzzellen von immunisierten Mäusen mit Myelomzellen von P3U1- Mäusen erhalten wird, wobei die Immunisierung unter Verwendung von FN, das von einem Kulturmedium von SV40-transformierten Embryonalzellen stammt, durchgeführt wird.
• Es wurde ein FN zur Immunisierung der Tiere verwendet, das aus dem Kulturmedium von mit SV40 transformierten menschlichen Wi-38-Embryonalzellen der junge isoliert und als Wi-38Va13 definiert worden ist. Die verwendeten Immunisierungs- und Fusionverfahren sind die üblichen und werden im nachstehend beschriebenen Beispiel genauer erläutert. Das erfindungsgemäße Antikörper-absondernde Hybridom wurde am 21. April 1988 unter der Nr. 88042101 bei der European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, Großbritannien, hinterlegt.
• Es wurde festgestellt, daß der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper für ein Epitop sehr spezifisch und selektiv ist, das in der FN-ED-B-Sequenz von Wi-38Va13-Zellen vorhanden ist, wie es unter Verwendung des Western-Blot- Verfahrens mit Plasma-FN oder Thermolysin-gespaltenem FN von Wi-38- oder Wi-38Va13-Zellen gezeigt werden konnte. Der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper reagiert weder mit Plasma-FN noch mit FN von normalen menschlichen Wi-38- Fibroblasten.
• Zur Bewertung der Anwendungsmöglichkeiten des erfindungsgemäßen Antikörpers wurde die Verteilung des vom Antikörper erkannten Epitops in mehreren fötalen und erwachsenen Tumorgeweben und normalen Geweben untersucht.
• Die Ergebnisse der immunhistochemischen Analyse von mehreren fötalen und erwachsenen normalen Geweben von unterschiedlichen embryonalen Ursprüngen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Mak sind in Tabelle I zusammengefaßt. Tabelle I Reaktivität des erfindungsgemäßen Mak mit erwachsenen und fötalen normalen Geweben (8 bis 10 Wochen) NeQativ: Dickdarm, Haut, Niere Fötale Gewebe Erwachsene Gewebe Positiv: Gehirn, Magen, Thymus, Lunge, Leerdarm, Leber Negativ: Gehirn (2), Lunge (3), Brust (3) Magen (4), Zwölffingerdarm (3), Dickdarm (3), Leber (2) Pancreas (1), Niere (4), Harnblase (2), Prostata (2), Hoden (2), Endometrium (2), Milz (2), Lymphknoten (2), Haut (6), Thymus (2), Schilddrüse (2), Meningen (2), Skelettmuskel (1), Aderhaut (2), Netzhaut (2) Positiv: Gelenkhaut (3), Eierstock (1) Eileiter (1/4)
• ( ) zwischen den Klammern ist die Zahl der Individuen, aus denen Gewebe erhalten wurde, angegeben.
• Die durchgeführten Untersuchungen zeigen, daß das erkannte Epitop eine sehr spezifische Verteilung im Gewebe aufwies. Unter den 10 bis 12 Wochen alten fötalen Geweben färbt der erfindungsgemäße Mak die innere Schicht der Blutgefäße des Magens, Leerdarms, Thymus und der Submukosa der junge sowie die Basalmembran des Epithels der Bronchien (Pseudo-glanduläres Stadium ["pseudo glandular stage"]). Es stellte sich heraus, daß mit Ausnahme des basalen Teils der Magendrüsen die älteren fötalen Gewebe (bis zu 26 Wochen) vollständig negativ beim erfindungsgemäßen Mak waren, was darauf hinweist, daß das von diesem Reagens identifizierte FN-Epitop einer programmierten Expression während der Ontogenese unterworfen ist. In den erwachsenen Proben ist die Verteilung dieses Epitops im Gewebe, obgleich anders als im fötalen Zustand, viel stärker begrenzt. Es stellte sich heraus, daß der erfindungsgemäße Mak Oberflächenzellen der Gelenkhäute, die innere Schicht einiger ovarialer Gefäße, isolierte Bereiche der Basalmembran des Zölomepithels und mit einer unterschiedlichen Intensität Myometrium-Bereiche färbte. Während normale Gewebe sehr selten mit dem erfindungsgemäßen Mak reagierten, wie es aus der Tabelle II hervorgeht, enthielt der Hauptteil der analysierten Tumore beachtliche Mengen des vom getesteten Antikörper erkannten Epitops. Tabelle II Tumorart positiv/getestet Adenokarzinom des Magens Adenokarzinom des Pancreas Adenokarzinom der Leber Adenokarzinom des Dickdarms Adenokarzinom der Niere Karzinom der Harnblase Adenokarzinom der Prostata Adenokarzinom der Eierstöcke Adenokarzinom des Endomethriums Haut - gemischter Typ Adenokarzinom der Schilddrüse Adenokarzinom der Lunge Melanome der Haut und Augen Adenokarzinom der Brust Gehirn - gemischter Typ Meningiome Sarkome des gemischten Typs
• Das Auftreten der positiven Färbung variierte innerhalb einer bestimmten Tumorart, und es wurden keine Zusammenhänge mit dem Differenzierungsgrad (Adenokarzinome des Dickdarms) und dem Histotyp des Tumors (Brusttumore) nachgewiesen. Die einzige Ausnahme stellen fibromatöse und endotheliale Meningiome dar, bei denen festgestellt wurde, daß sie bei Krebspatienten durchgehend positiv sind, wobei sowohl das normale Gewebe als auch das Tumorgewebe des gleichen Patienten untersucht werden konnte. Die positive Reaktion mit dem erfindungsgemäßen Mak wurde nur im neoplastischen Gewebe festgestellt. In beinahe sämtlichen Proben, die beim erfindungsgemäßen Mak positiv waren, wurde die Färbung in Bereichen von unterschiedlicher Ausdehnung des Zwischenraums des Tumors lokalisiert, der Nester von Tumorzellen unterschiedlicher Größe umgab oder teilte, in denen die Färbung selten einzelne Zellen abgrenzte.
• Es war ein häufiges Erscheinungsbild bei den Tumoren, die beim erfindungsgemäßen Mak positiv waren, daß die innere Schicht der Gefäße positiv war, während mit der Ausnahme einiger Blutgefäße der Eierstöcke die von untersuchten normalen erwachsenen Geweben niemals positiv war.
• Eine bestimmte Zahl von gutartigen krankhaften Veränderungen (Brustfibroadenome (4), Mastopathien (2), Gynäkomastien (4), Hypertrophie der Prostata (5), Polypen der Harnblase und des Rectums (4), intradermale Muttermale (14), Angiome (2), ovariale Zystadenome (2), Neurofibrome der Schilddrüse (1), chronische, endzündliche, krankhafte Veränderungen, Leberzirrhose (2), Echinoccccus-Zysten (2), Hautnarben (3) (10 bis 30 Tage)) wurde mit dem erfindungsgemäßen Mak getestet, und es wurde festgestellt, daß alle mit Ausnahme eines Brustadenofibroms, das eine Färbung des interstitiellen Gewebes in einigen Bereichs zeigte, negativ waren.
• Aus der vorstehenden Beschreibung geht hervor, daß der erfindungsgemäße Mak zu Diagnosezwecken für eine frühe und empfindliche Diagnose von Tumoren nützlich sein kann. Zu diesem Zweck kann der Mak in bekannten Immunenzym-, Immunfluoreszenz- und ähnlichen Verfahren verwendet werden, in denen der monoclonale Antikörper mit Enzymen, fluoreszierenden Verbindungen, lumineszierenden Verbindungen, radioaktiven Verbindungen, ferromagnetischen Sonden und ähnlichen markiert ist. Besonders bevorzugt ist die Enzym-Markierung, in der alkalische Phosphatase, Glucose-Oxidase, Galactosidase, Peroxidase und Urease üblicherweise verwendet werden. Die Enzymmarkierung kann gemäß jedes beliebigen, üblichen Verfahrens unter Verwendung von beispielsweise Glutaraldehyd, Benzochinon, Periodat, Protein A etc. durchgeführt werden.
• Nach Erhalt des markierten monoclonalen Antikörpers wird eine Analyse unter Verwendung eines der zahlreichen üblichen Immuntest-Verfahren, beispielsweise von den als EIA oder ELISA bekannten, durchgeführt. Wenn der erfindungsgemäße Mak verfügbar ist, können Fachleute leicht ein Diagnose-Kit oder ein geeignetes Verfahren zum Nachweis von transformiertem FN in Proben von Biopsien entwickeln. Eine positive Antwort (aufgrund der erkannten Gegenwart von die ED-B-Sequenz enthaltendem FN) zeigt eine in den Zellen des untersuchten Gewebes aufgetretene Krebs- oder Virus-Transformation an.
• Aufgrund der Spezifität des erfindungsgemäßen Mak für Tumor-transformierte Zellen kann der Antikörper selber, der zweckmäßigerweise an cytotoxische oder beliebige Anti-Tumor- Medikamente gebunden ist, zu therapeutischen Zwecken in Form von geeigneten Arzneimitteln, die ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt sind, verwendet werden.
• Das nachstehend beschriebene Beispiel, das nicht-einschränkend sein soll, erläutert die Erfindung genauer.
Beispiel Herstellung des Antigens
• Das Kulturmedium wird aus Platten mit konfluenten Kulturen von Wi38Va13-Zellen (mit SV40-transformierte Fibroblasten) gewonnen, die in Gegenwart von FCS, aus dem das Rinder-FN entfernt worden ist, gezüchtet worden sind. Das Medium wird durch Millipore-Filter filtriert, dann wird NaN&sub3; und Trasylol (Endkonzentration 0,2 % bzw. 10 E/ml) zugesetzt und das Medium anschließend durch eine Chromato-graphiesäule aus an Sepharose 4B-konjugierte Gelatine geleitet. Mit bis zu 20 Liter Medium wird eine 150 cc-Säule beladen.
• Anschließend wird die Säule mit 0,1 % NaN&sub3; enthaltendem PBS (20 mM Na-Phosphat, pH-Wert 7; 0,15 M Nacl) gewaschen, danach mit 4 M NaCl in 50 mM Tris, pH-Wert 7, um die spezifisch gebundenen Proteine zu entfernen. Schließlich wird FN mit 3 M Harnstoff in 0,1 % NaN&sub3; enthaltendem PBS eluiert.
• Das ganze Verfahren wird bei Raumtemperatur mit einer Fließrate von 200 ml/Std. durchgeführt, wobei 10 ml Fraktionen gewonnen werden.
• Die erhaltenen Fraktionen, die mit 3 M Harnstoff aus der Säule gewaschen werden und eine Absorption bei 200 nm von mehr als 0,5 aufweisen, werden in einem Pool kombiniert und gegen 20 Volumina 0,1 % NaN&sub3; und 2 mM PMSF entha1tendem PBS dialysiert.
• Üblicherweise wurden 5 mg FN aus 1 Liter Medium erhalten. Es stellte sich heraus, daß das in diesem Verfahren erhaltene FN bei Elektrophorese auf Polyacrylamid-Gelen homogen ist.
Immunisierung von Mäusen und Zellhybridisierungsverfahren
• Balb/c-Mäuse werden mit zwei intraperitonealen Injektionen von 50 ug gereinigtem FN in etwa 100 ul PBS, das in einem gleichen Volumen von komplettem Freundschem-Adjuvans (DIFCO) emulgiert ist, und mit drei intraperitonealen Injektionen, die 400 ug Antigen ohne Adjuvans enthalten, immunisiert. Die beiden ersten Injektionen werden in Abständen von 1 Woche verabreicht, wobei die nachfolgenden täglich während der 3 letzten Tage vor der Fusion verabreicht werden.
• Milzen werden steril entfernt und unter Verwendung eines Netzes aus rostfreiem Stahl mit engen Maschen in eine Suspension aus einzelnen Zellen aufgebrochen. Die Fusion wird durchgeführt, indem 10 Maus-Splenocyten mit 1/5 P3UI- Plasmozytomzellen in 0,5 ml Polyethylenglycol (PEG 4000) mit 50 % DMEM-FCS, das in einer Minute tröpfchenweise zugesetzt wird, inkubiert werden. Anschließend wird das Gemisch 90 Sekunden bei 37ºC geschüttelt. Danach werden 20 ml serumfreies DMEM unter Rühren tröpfchenweise zugesetzt. Das Gemisch wird 5 Minuten stehengelassen. Anschließend werden 20 ml DMEM, das 10 % fötales Kälberserum (FCS) enthält, zugesetzt und die Zellen 5 Min. mit 1000 x g zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Zellen in 48 ml DMEM-HAT (20 % FCS, 1 % Hypoxanthin, 1 % Aminopterin, 0,2 % Thymidin, 0,2 % Glycin) resuspendiert. Die Suspension der Zellen wird anschließend in zwei Platten mit je 24 Vertiefungen verteilt (1 ml pro Vertiefung), die einen Monolayer aus Makrophagen enthalten. Nach 3 Tagen wird jeder Vertiefung 1 ml HAT- Medium zugesetzt.
• Dieses Verfahren wird 2 Wochen durchgeführt, wobei am Ende das Wachstum von Hybriden auf dem Boden der 48 Vertiefungen beobachtet wird.
Clonierung
• Die Gegenwart von Anti-FN-Antikörpern in jeder Vertiefung wird durch einen Radioimmuntest überprüft, anschließend werden die in den "positiven" Vertiefungen enthaltenen Zellen geclont.
• Die Zellen werden aus jeder Vertiefung entfernt und in 10 ml HAT-Medium resuspendiert, gezählt und verdünnt, um eine etwa 3 Zellen/ml enthaltende Suspension zu erhalten.
• Etwa 200 ul dieser Verdünnung pro Vertiefung werden auf 96 Vertiefungen verteilt, die bereits peritoneale Makrophagen der Maus enthalten.
• Nach 2 Wochen wird das Medium aus solchen Vertiefungen, bei denen mindestens 1/3 der Oberfläche mit Zellen bedeckt ist, durch Radioimmuntest auf Anti-FN-Antikörper getestet.
Radioimmuntest
• Der Radioimmuntest wird gemäß dem in geeigneter Weise modifizierten Verfahren von Accolla und Celada [Accolla, R. S. und Celada, F., Eur. J. Immunol. 8 (1978), 688] durchgeführt.
• Polyvinyl-Platten mit 96 Vertiefungen ("Microvil" 24 A m. cat. 968 Pbi) werden verwendet. Polyvinyl ist ein Material, das durch Bindungsstellen für Proteine charakterisiert ist. Das gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren gereinigte FN wird bei Raumtemperatur in den Vertiefungen inkubiert (bei einer Konzentration von 100 ug/ml). Nach 2 Stunden wird das Protein aus den Vertiefungen entfernt, die mit 1 % Rinderserumalbumin enthaltendem PBS gefüllt werden (200 ul pro Vertiefung), um freie Bindungsstellen zu binden. Nach zwei weiteren Stunden wird die Albuminlösung entfernt, und die Vertiefungen werden mit PBS gewaschen. Anschließend werden die Kulturmedien der Hybride, deren Fähigkeit zur Freisetzung von Anti-FN-Antikörpern untersucht werden soll, zugesetzt (100 ul pro Vertiefung). Nach weiteren 2 Stunden werden diese Medien entfernt und die Vertiefungen erneut mit PBS gewaschen. In Kaninchen induzierte und mit I markierte Maus-anti-Fab-Antikörper werden nun zugesetzt, 100 ul pro Vertiefung, und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen der ungebundenen radioaktiven Antikörper mit PBS wird jede Vertiefung in ein nummeriertes Teströhrchen gegeben. Der Radioimmuntest wird unter Verwendung eines Gamma- Zählers (Packard) über einen Zeitraum von 10 Minuten für jedes Röhrchen durchgeführt.
Bestimmung der Antikörper-Spezifität
• Es wurde von den durch das beschriebene Verfahren hergestellten Hybridomen ein Clon erhalten, der Antikörper freisetzte, die zwar mit Wi38Va13-FN, jedoch nicht mit FN von Plasma oder normalen Zellen reagierten. Diese Spezifität wurde durch zwei verschiedene Verfahren getestet: A) Radioimmuntest Fibronectine, die von Wi38Va13-Zellen, von normalen Fibroblasten oder von Plasma-Kulturmedien gereinigt worden waren, wurden gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren für den Radioimmuntest verwendet.
• Der getestete Antikörper lieferte nur beim FN von Wi38Va13-Zellen Zerfälle mit positiven Werten. B) Western-Blot Fibronectine, die von Wi38Va13-Zellen, von normalen Fibroblasten oder von menschlichen Plasma-Kulturmedien gereinigt worden waren, ließ man gemäß dem Verfahren von Lämmli [Laemmli, U. K., Nature 227 (1970), 680-685] auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel wandern.
• Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf einen Nitrozellulose-Filter gemäß dem Verfahren von Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 4350-4354, transferriert (Western-Blot)
• Anschließend wurden die Filter zur Entfernung von SDS 10 Minuten mit 6 M Harnstoff in destilliertem Wasser gewaschen. Nach sorgfältigem Waschen mit destilliertem Wasser und anschließend mit TBS (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4; 0,15 M NaCl) wurden die Filter 2 Stunden mit 0,05 % Tween 20 (Merck) enthaltenden, monoklonalen Anti-FN-Antikörpern inkubiert. Die überschüssigen Anti-FN-Antikörper wurden durch Waschen mit TBS (5 Wechsel, 30 Minuten insgesamt) entfernt. Anschließend wurden die Filter 2 Stunden mit einem zweiten Antikörper, der an 1/1000 in TBS, 3 % BSA und 0,05 % Tween 20 verdünnte Maus-anti-Ig-Peroxidase (Dako, Kopenhagen, Dänemark) konjugiert war, inkubiert.
• Nach wiederholtem Waschen mit TBS (5 Wechsel, 30 Minuten insgesamt) und zweimaligem Waschen mit TB (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 6,8) wurden die Filter mit einer Substratlösung inkubiert, um die Antigenbanden sichtbar zu machen. Das Substrat wurde unmittelbar vor der Verwendung, wie nachstehend beschrieben, hergestellt:
• 20 ml TB, 6,63 ul 30 % H&sub2;O&sub2;, 5 ml 0,3 % (Gew./Vol.) 4-Chlor-1-naphthol-Lösung (Merck; Darmstadt, Deutschland) in Methanol.
• Die 4-Chlor-1-naphthol-Lösung kann einen Monat bei 4ºC aufbewahrt werden. Die Umsetzung wird durch Waschen der Filter mit destilliertem Wasser nach 10 bis 120 Minuten (die Zeit hängt von den Antigenmengen und der Aktivität des ersten Antikörpers ab) beendet. Die Filter werden zwischen zwei Papierfiltern getrocknet und photographiert. In diesem Verfahren ist das einzige Protein, das mit dem getesteten Antikörper reagieren kann, das FN von Wi38Va13-Zellen.
Lokalisierung der vom Mak erkannten Antigen-Determinanten
• Das Western-Blot-Verfahren wurde zur Lokalisierung des von diesem Antikörper erkannten Epitops verwendet.
• Fibronectine von Wi38Va13-Zellen, normalen Fibroblasten und Plasma wurden mit Thermolysin gespalten. Jede Art von FN wurde gereinigt, in 25 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,6, gegen 0,5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 2,5 mM CaCl&sub2; dialysiert und 4 Stunden bei 22ºC mit Thermolysin (5 um/mg FN) inkubiert. EDTA wurde zur Beendigung der Umsetzung zu einer Endkonzentration von 5 mM zugesetzt. Mit den erhaltenen Spaltprodukten wurde gemäß dem Verfahren von Laemmli, U. K., Nature 227 (1970), 680-685, eine SDS-Polyacrylamid-Gelchromatographie durchgeführt, um die Proteinfragmente nach ihrem Molekulargewicht zu trennen. Anschließend wurden die Peptide nach dem Western-Blot-Verfahren auf ein Nitrozellulose- Blatt transferriert. Verschiedene Filter wurden mit der gleichen Probenserie, deren antigene Determinanten eine bekannte Lage auf dem FN-Molekül aufweisen, hergestellt, um mehrere von ihnen mit Maks zu testen, während auf einem dieser Filter der erfindungsgemäße Mak getestet wurde, der hier nachstehend als BC-1 definiert ist. [Fig. 1 - Modell der Domänenstruktur einer Untereinheit von menschlichem FN. Große weiße Pfeile zeigen die aufgrund des alternativen Spleißvorgangs variablen Regionen des FN-mRNA-Vorläufers. Lange weiße Pfeile zeigen die Stellen an, in denen die von verschiedenen Maks erkannten Epitope liegen. Die Figur stellt auch die drei Arten von internen Homologien dar, die Makromoleküle, die mit den verschiedenen FN-Domänen interagieren, und die möglichen Isoformen, die durch unterschiedliche Spleiß-Modelle erzeugt werden. Fig. 2 -Elektrophorese auf 4 bis 18 % SDS-Polyacrylamid-Gel von Plasma-FN (P), FN von normalen menschlichen Wi38- (N) und Wi38Va13-Zellen und SV40-transformierten, menschlichen Fibroblasten (T), die mit Thermolysin (5 ug/mg FN 2 Stunden bei 22ºC) gespalten worden sind. Die links angegebenen Werte sind die Molekulargewichte von Standards in kd. Die rechts angegebenen Werte sind die Molekulargewichte der vier Hauptfragmente in kd, die nur in den Thermolysin-Spaltprodukten von FN aus transformierten Zellen vorhanden sind und des die Domäne 4 darstellenden 110 kd-Fragments. Immunblots von ähnlichen Gelen, die mit BC-1, IST-4, 3E3 bzw. IST-9 gefärbt sind, sind ebenfalls dargestellt. Es werden die beiden Formen der Domäne 4 mit oder ohne die ED-B-Sequenz nachgewiesen].
• Dieser Antikörper reagiert stark mit einem 120 kd- Fragment, das die an die Zelle bindende, die ED-B-Sequenz enthaltende Form darstellt [Zardi, L. et al., EMBO J. 6 (1987), 2337-2342), jedoch nicht mit dem 110 kd-Fragment, das die an die Zelle bindende, die ED-B-Sequenz nicht-enthaltende Domäne darstellt (Figur 1). Dieses Ergebnis zeigt, daß das durch den BC-1-Antikörper erkannte Epitop in der ED- B-Sequenz enthalten ist.
• Um dieses Ergebnis weiter zu bestätigen, wurden die beiden 120 und 110 kd-Fragmente gereinigt und weiter gespalten.
• 120 und 110 kd-Fragmente von FN (Figur 1) wurden durch eine Hydroxylapatit (DNA-Grade, BioRad Laboratories, Richmond, Ca)-Chromatographiesäule, wie vorstehend beschrieben [Borsi, L. et al., Anal. Biochem. 155 (1986), 335-345], aus einer FN-Thermolysin-Spaltung (6 ug/mg FN, 2 Stunden bei 22ºC) isoliert. Eine vollständige Trennung des 120 kd- vom 110 kd-Fragment wurde unter Verwendung einer DEAE-Zellulose (DE+52, Whatman, Maidstone, UK)-Chromatographiesäule erreicht. Sowohl das 120 als auch das 110 kd-Fragment wurde mit Thermolysin gespalten.
• Das 110 kd-Fragment ist gegen Thermolysin resistent, während die Gegenwart der ED-B-Sequenz im 120 kd-Fragment eine Thermolysin-empfindliche Stelle in dieses Molekül einführt [Zardi, L. et al., EMBO J. 6 (1987), 2337-2342]. [Figur 3 - Schematische Darstellung der Thermolysin-Spaltung des 110 kd-Fragments (Domäne 4 ohne ED-B) und des 120 kd- Fragments (Domäne 4 mit der ED-B-Sequenz). Die Spaltung mit Hilfe einer S-Cyanilierung des in der Domäne 4 (120 kd) erhaltenen 85 kd-Fragments ist schematisch dargestellt. Die Epitope, die durch die Maks 3E3, IST-4 und BC-1 erkannt werden, sind ebenfalls angegeben. Die Zahlen auf der linken Seite geben die entsprechenden Bahnen in den Gelen und Immunblots an, die in Figur 4 dargestellt sind. Figur 4 -Auf der linken Seite ist die in den nachstehenden Beispielen beschriebene Elektrophorese auf einem 4 bis 18 % SDS-Polyacrylamid-Gel dargestellt: gereinigtes 110 kd-Fragment (Spur 1), gereinigtes, die ED-B-Sequenz enthaltendes 120 kd- Fragment (Spur 2), gereinigtes, mit Thermolysin gespaltenes 110 kd-Fragment (Spur 3), mit Thermolysin gespaltenes 120 kd-Fragment (Spur 4), gereinigtes 85 kd-Fragment der Thermolysin-Spaltung des 120 kd-Fragments (Spur 5) und des 85 kd- Fragments, das durch S-Cyanilierung (Spur 6) gespalten wurde. Auf der rechten Seite sind die Immunblots von ähnlichen Gelen, die unter Verwendung der Maks BC-1, IST-4 bzw. 3E3 gefärbt wurden, dargestellt. Somit liefert die Thermolysin-Spaltung der Domäne 4 von 120 kd zwei Fragmente: ein 35 kd- und ein 85 kd-Fragment.
• Diese Fragmente wurden nach der Elektrophorese und dem Blot mit dem Mak BC-1 getestet, und die erhaltenen Ergebnisse bewiesen, daß das bloße 85 kd-Fragment mit dem Mak BC-1 reagierte.
• Die Bestimmung der Aminosäuresequenz ergab, daß das 35 kd-Fragment 7 Aminosäuren der ED-B-Sequenz in seinem Amino-terminalen Teil enthält. Das 85 kd-Fragment enthält in seinem Carboxy-terminalen Teil die ED-B-Sequenz beinahe vollständig.
• Das 85 kd-Fragment wurde gereinigt und sein Carboxyterminaler Teil wurde durch S-Cyanilierung gespalten [K. Sekiguchi und S. Hakomori, Biochemistry 22 (1983), 1415- 1422], wobei ein 65 kd-Fragment produziert wurde, das nicht mehr mit dem Mak BC-1 reagieren konnte (vgl. die Figuren 3 und 4).

Claims (5)

1. Monoclonaler Antikörper, der für die ED-B-Sequenz von Fibronectin von transformierten Zellen spezifisch ist, erhalten von dem bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) am 21. April 1988 unter der Nummer 88042101 hinterlegten Hybridom

2. Hybridom ECACC 88042101.

3. Verfahren zur Diagnose von Tumoren in Biopsieproben, dadurch gekennzeichnet, daß diese Proben init dem monoclonalen Antikörper nach Anspruch 1 oder mit den gleichen, in geeigneter Weise markierten Antikörper auf die Gegenwart von transformiertem Fibronectin getestet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der monoclonale Antikörper markiert mit Enzymen, fluoreszierenden Verbindungen, lumineszierenden Verbindungen, ferromagnetischen Sonden oder radioaktiven Verbindungen verwendet wird.

5. Kit für die Diagnose von Tumoren, umfassend den monoclonalen Antikörper nach Anspruch 1 oder den gleichen markierten Antikörper und andere mögliche Reagenzien, die üblicherweise in immunodiagnostischen Methoden verwendet werden.