DE68910704T2

DE68910704T2 - Immunmodulierende Bryostatine.

Info

Publication number: DE68910704T2
Application number: DE89300174T
Authority: DE
Inventors: George Robert Pettit; Michail Sitkovsky
Original assignee: University of Arizona; Arizona State University ASU
Current assignee: University of Arizona; Arizona State University ASU
Priority date: 1988-01-13
Filing date: 1989-01-10
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2009-01-11
Also published as: EP0324574B1; ES2061963T3; JP2973322B2; ATE97321T1; EP0324574A2; EP0324574A3; JPH01308228A; DE68910704D1

Description

Die Erfindung betrifft neue immunmodulierende Mittel und insbesondere eine neue Reihe von Aktivatoren der Proteinkinase C, die keine Tumor-Promotoren sind.
Jüngste Arbeiten auf dem Gebiet der Zellaktivierung (s. M.J. Berridge, 1984, "Inositol Triphosphate and diacyclglycerol as second messengers", Biochem. J. 220:345; U. Kikkawa et al., 1983, "Protein kinase C as a possible receptor protein of tumor-promotiong phorbol esters", J. Biol. Chem. 258:11442; Y. Nishizuka, 1984, "The role of protein kinase C in cell surface signal transduction and tumor promotion", Nature 308:693) und die biochemischen Reaktionswege, die an der durch T-Zell-Antigenrezeptor (TcR) vermittelten T- Lymphozytenstimulierung beteiligt sind (s. Weiss et al. 1984, "Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3- dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4169; J.B. Imboden et al., 1985 "Transmembrane signalling by the T-cell antigen receptor. Perturbation of the T-3 antigen receptor complex generates inositol phosphates and releases calcium ions from intracellular stores", J. Exp. Med. 161:446; A. Trunch et al., 1985, "Early steps of lymphocyte activation bypassed by synergy between calcium ionophores and phorbol ester", Nature 313:318; N. Utsunomiya et al., 1986, "Early transmembrane events in alloimmune cytotoxic T-lymphocyte activation as revealed by stopped-flow fluorometry", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:1877; G. Berrebi et al., 1987, "The antigen-receptor requirement for conjugate formation and lethal hit triggering by cytotoxic T-lymphocytes can be bypassed by protein kinase C activators and Ca&spplus;&spplus;-ionophores", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1364) haben eine neue gedankliche Basis für die Konstruktion und Entwicklung immunmodulierender Mittel geschaffen.
Von besonderem Interesse ist die Bewertung immunmodulierender Eigenschaften gut definierter Mittel, die den Ag-Rezeptor-mediierten "transmembrane signalling pathway" bei der T-Lymphozyten-Aktivierung beeinflussen. Zahlreiche Studien haben gezeigt, daß die Proteinkinase C (s. Nishizuka, oben) an der Aktivierung von Helfer- (siehe: Imboden et al. und Trunch et al., oben) und cytotoxischen (siehe: Utsunomiya et al. und Berrebi et al., oben) T-Lymphozyten beteiligt ist. Die Entdeckung der Verknüpfung zwischen dem Inositol- Phospholipid-Metabolismus und der Aktivierung der Proteinkinase C (eines wesentlichen zellulären Rezeptors für Phorbolester) helfen bei der Erklärung der Wirkung von Phorbolestern bei der Lymphozytenaktivierung. Phorbolester könnten deshalb als ausgezeichnete Anwärter für die Auswertung als immunomodulierende Mittel betrachtet werden, wären sie keine potenten Tumor-Promotoren (siehe: A.M. Jeffery, 1986, "Computer-assisted molecular modelling of tumor promotors: Rationale for the activity of phorbol esters, teleocidin B, and aplysiatoxin", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:241).
Demzufolge besteht ein Bedarf an den Identifizierung von nicht als Tumor-Promotoren wirkenden Aktivatoren der Proteinkinase C, die auf ihrer Fähigkeit zur Beschleunigung oder Supprimierung der Immunantwort untersucht werden können. Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Identifizierung und Verwendung eines Aktivators der Proteinkinase C, der nicht nur kein Tumor-Promotor ist, der vielmehr, wie gefunden wurde, starke anti-neoplastische Eigenschaften in verschiedenen in vitro- und in vivo-Systemen besitzt. Die spezifischen Verbindungen, die - wie herausgefunden wurde - die voranstehend aufgeführten Anforderungen erfüllen, wurden in einer neu entdeckten Familie biosynthetischer Produkte gefunden, die in Meereslebewesen der Ordnung Ectoprocta (Familienname Bryozoa) gefunden und als "Bryostatine" bezeichnet werden. In von der Maus stammenden P388 Lymphozytenleukämie-(PS)-System zeigte Bryostatin 1 (NSC 339555) eine Lebensverlängerung von 52 - 96% bei Injektionsdosen in der Größe von 10 - 70 ug/kg und eine ED&sub5;&sub0; von 0,89 ug/ml gegen die P388 in vitro Zellinie (siehe: G.R. Pettit et al., 1982, "Isolation and structure of bryostatin 1", J. Amer. Chem. Soc. 104:6846). Darüber hinaus wurde festgestellt, daß Bryostatin 1 zu einer Lebensverlängerung von 31 - 68% bei 5 - 40 g/kg im M531 Mäuseovariumsarkom-System führt (siehe: G.R. Pettit, 1984, "Structure of Bryostatin 4. An important antineoplastic constituent of geographically diverse bugula neritina (Bryosoa)", J. Amer. Chem. Soc. 106:6768). In ähnlicher Weise wurde gefunden, daß die Bryostatine 1 und 2 Antagonisten von Tumor-Promotoren sind.
Die vorliegende Erfindung basiert auf unserem Auffinden des stimulatorischen Effektes der Bryostatine 1 und 2 auf die Entwicklung und Effektor-Funktionen von cytotoxischen Mäuse-T- Lymphozyten ("CTL") in Systemen. Im einzelnen wurde gefunden, daß die Bryostatine 1 und 2 mit rekombinantem B-Zell- Stimulierungsfaktor ("BSF-1") dabei synergistisch zusammenwirken, ruhende T-Zellen zur Proliferierung und Differenzierung in cytotoxische T-Lymphozyten zu stimulieren. Studien von in vivo angeregten Milzzellen zeigen, daß Bryostatine die Konzentration von Interleukin-2 ("IL-2"), die für die Entwicklung von CTL notwendig ist, dramatisch absenken und die IL-2-induzierte Entwicklung der Cytotoxizität steigern. Bei der Verwendung von kloniertem CTL zeigt sich, daß beide Bryostatine 1 und 2 wie 4-β-Phorbol-12-myristat-13- acetat ("PMA") die Ag-spezifische Cytotoxizität inhibieren, das Anfordernis der TcR-Verknüpfung (cross linking") jedoch umgehen können und die Exocytose von cytolytischen Granula und die Cytotoxizität gegen keine Ag-tragenden Zielzellen auslösen können. In der vorliegenden Bedeutung bezeichnet "TCR" den Antigenrezeptor von T-Lymphozyten. Wie gezeigt werden wird, beruht die vorliegende Erfindung auf der Verwendung von Bryostatin 1 und Bryostatin 2, entweder allein oder in Kombination mit Interleukin-2 plus B-Zell-Stimulationsfaktor für die Immunmodulierung in vivo.
Demzufolge ist es eine wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, nicht aus Protein bestehende Immunstimulatoren zur Beschleunigung der endogenen Erzeugung von Interleukin-2 und gamma-Interferon innerhalb des Autoimmunsystems eines Patienten zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen nicht aus Protein bestehenden Immunstimulator zur Verfügung zu stellen, der, wenn er intravenös zusammen mit klonierten Proteinsubstanzen (Interleukin-2 und/oder gamma- Interferon) an einen Wirt verabreicht wird, der an neoplastischem Wachstum leidet, die Menge einer solchen klonierten fremden Proteinsubstanz, die zum Erzielen eines gewünschten therapeutischen Effekts benötigt wird, verringert, wobei das Risiko einer hierdurch verursachten anaphylaktischen Reaktion signifikant gesenkt wird.
Eine weitere Aufgage der vorliegenden Erfindung ist es, neue und verbesserte Verfahren zum Aktivieren der Proteinkinase C zur Verfügung zu stellen, wodurch die endogene Produktion von Interleukin-2 und gamma-Interferon innerhalb des Autoimmunsystems des Wirtes, an den es verabreicht wird, stimuliert wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Mittel für die Verwendung in einem neuen und geeignetem Verfahren zum Verabreichen von klonierten Proteinsubstanzen, beispielsweise Interleukin-2 und/oder gamma-Interferon, in im Vergleich zu den bisher zur Erzielung eines gegebenen therapeutischen Effekts erforderlichen wesentlich verringerten Mengen, wodurch das Risiko einer hierdurch verursachten anaphylaktischen Reaktion minimalisiert wird, durch gleichzeitige Verabreichung eines wirksamen Anti-Tumor- Promotor-Proteinkinase C-Aktivators damit zur Verfügung zu stellen, um deren Wirkung zu verstärken.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einzelne immunverstärkende Substanzen für die Verwendung in einem Verfahren zum Behandeln neoplastischer Krankheiten zur Verfügung zu stellen, wobei das Autoimmunsystem eines Wirtes angeregt wird, endogenes Interleukin-2 und gamma-Interferon zu erzeugen und dadurch die Spezifität der T-Zellen (Lymphozyten) beim Angriff auf neoplastische Zellen zu erweitern und das Ausbreiten des Neoplasmus zu verhindern, ohne den Wirt durch die Zuführung von fremdem Protein (beispielsweise kloniertem Interleukin-2 und kloniertem gamma-Interferon, die z.B. von Cetus Corporation, California, zu beziehen sind) in den Wirt aus dem biologischen Gleichgewicht zu bringen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, einzelne immunsteigernde Substanzen für die Verwendung in einem Verfahren zum Behandeln neoplastischer Krankheiten zur Verfügung zu stellen, wobei das Autoimmunsystem des Wirtes durch den Zusatz einer geregelten Menge von kloniertem Interleukin-2 und gamma-Interferon (fremdem Protein) hierzu im wesentlichen gleichzeitig mit der Injektion einer kleinen, jedoch wirksamen Menge von Bryostatin 1 oder Bryostatin 2 unterstützt wird, wobei die geregelte Menge des fremden Proteins ungefähr 1/10 bis ungefähr 1/20 derjenigen beträgt, die ohne die gleichzeitige Injektion von Bryostatin erforderlich wäre, um im wesentlichen die gleiche therapeutische Wirkung zu erzielen, während das Risiko der Anaphylaxe oder anderer bekannter Nebeneffekte des Einführens von fremdem Protein in das menschliche System um das etwa 10- bis 20fache verringert wird.
Diese und weitere Gegenstände, die hier im folgenden erkennbar werden, werden durch die vorliegende Erfindung auf bemerkenswert unerwartete Weise bereitgestellt, wie sich leicht aus der nachfolgenden, genauen Beschreibung beispielhafter Ausführungsformen davon erkennen läßt, insbesondere wenn sie in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird.
In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 die chemischen Strukturen von Bryostatin 1 und 2;
Fig. 2 die Wirkung von PK-C-Aktivatoren auf die Bildung von Cytotoxizität in angeregten Milzzellen;
Fig. 3 die Antigen-Spezifität von mit Bryostatin/IL-2 induzierten cytotoxischen Zellen;
Fig. 4 die Wirkung von Bryostatin 2 auf die Cytotoxizität eines CTL-Klons gegen keine Ag tragende Zielzellen;
Fig. 5 das synergistische Zusammenwirkung von Bryostatin mit Ca&spplus;&spplus;-Ionophoren zur Induktion von spezifischer BLT-E- Freisetzung aus dem CTL-Klon;
Fig. 6 die Inhibition der Ag-spezifischen Cytotoxizität des CTL-Klons durch Bryostatin 1 und 2; und
Fig. 7 die Wirkung von Bryostatin 1 und 2 und von Wachstumsfaktoren (IL-2, IL-4) auf die Expression von BLT- Esterase und die Entwicklung der Cytotoxizität in ruhenden T- Zellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft neuaufgefundene immunmodulierende Mittel, die hier im folgenden als "Bryostatin 1 und Bryostatin 2" bezeichnet werden, und Verfahren zu deren Verwendung bei der Behandlung eines unter neoplastischem Wachstum leidenden Wirtes, um entweder
(a) die Erzeugung von endogenem Interleukin-2 und gamma- Interferon innerhalb des Autoimmunsystems des Wirtes anzuregen, wobei diese selbst erzeugten Proteine mit der Biochemie des Wirtes verträglich sind; oder
(b) die Aktivität von geklontem Interleukin-2 und gamma- Interferon zu steigern, die beide unverträgliche Proteinformen sind und deshalb mit hoher Wahrscheinlichkeit eine antigen Reaktion hervorrufen, die zu einer Anaphylaxe führen könnte, wobei dadurch die Menge an Fremdprotein, die zur Erzielung eines gewünschten therapeutischen Effekts erforderlich ist, wesentlich verringert wird, mit dem damit verbundenen Vorteil, daß das Risiko von nachteiligen Nebeneffekten durch die Verwendung eines Proteinmaterials, das mit der Biochemie des Wirtes nicht verträglich ist, signifikant herabgesetzt wird.
Wie bekannt ist, resultiert Krebs aus der Unfähigkeit von T-Zellen (im Autoimmunsystem des Wirtes), Krebszellen zu erkennen, was ihnen ermöglicht, sich ungehindert innerhalb des Wirtes auszubreiten. Es wird angenommen, daß die Verwendung der Bryostatine wie vorliegend dargestellt den Bereich der T- Zellerkennung erweitert und dadurch ein Ergebnis erzielt, das durch T-Zellaktivität erreicht sein muß und das ansonsten nicht auftreten würde. Darüber hinaus erreichen die vorliegenden Verfahren das Ergebnis ohne den Einsatz hochriskanter Mengen toxischer Materialien wie beispielsweise fremder Proteine und minimieren das Risiko der typischen Protein-Anaphylaxe, das sich normalerweise durch Schwierigkeiten bei der Atmung, Schwitzen, Fieber und möglicherweise sogar Tod manifestiert, ganz wesentlich.
Die Aufmerksamkeit sei nun in den folgenden Absätzen auf die Herstellung der Bryostatine und die Arbeitsanleitungen gerichtet, die die hierdurch erzielten, völlig unerwarteten Vorteile zeigen.

Isolierung und Reinigung der Bryostatine 1 und 2.

Ein Methylenchloridextrakt, hergestellt aus 500 kg (feuchte Tiere) Bugula neritina aus dem östlichen pazifischen Ozean, wurde durch die Solvens-Verteilungsabfolge 9:1 4:1 Methanol-Wasser mit Ligroin-Tetrachlorkohlenstoff und anschließend durch ausführliche Säulenchromatographie- Techniken unter Verwendung von sowohl Sephadex LH-20 als auch Silikagel, wie in G.R. Pettit et al., oben, 1982, und G.R. Pettit et al., 1983, berichtet, weiter fraktioniert. Die Struktur von Bryostatin 2 aus dem Meerestier Bryozoan Bugula neritina, J. Natural Products 46:528. Beide Bryostatine sind makrozyklische Lactone mit 20-gliedrigen Ringen einer sehr ungewöhnlichen Struktur, wie in Fig. 1 und 2 dargestellt. Bryostatin 2 ist das 7-Desacetyl-Derivat von Bryostatin 1.

Tiere.

Acht Wochen alte männliche DBA-2, B10 und BALB/c-Mäuse, die durchweg bei der Studie verwendet wurden, wurden von Charles River, Frederick, MD, bezogen.

Zellen.

Die folgenden cytolytischen T-Zell-Klone und Zielzellen wurden verwendet: Cytotoxische T-Lymphozyten ("CTL") OE4 (H- 2b, spezifisch für H-2d) (s. U.D. Staerz et al, 1985, "Hybrid antibodies can target sites for attack by T-cells", Nature 314:628), CTL 2C (H-2b, spezifisch für H-2d) (s. G. Berrebi, oben); CTL BM10-37 (H-2d, spezifisch für H-2b) (s. J.A. Bluestone, 1987, "Characterization of cytotoxic T-cell (CTL) clones derived from mutant H-2Kbm10 anti-H-2Kb mixed lymphocyte culture populations" in: Proceedings of the 15th International Leucocyte Culture Conference, Sussex, J. Wiley & Sons, Ltd., Seite 149); P815 (Mäuse-Mastocytom-Zellinie, H- 2d), EL-4 (T-Zell-Lymphom, H-2b). Tumorzielzellen wurden in RPMI 1640 Medium gehalten, das mit 10% FCS (Biofluids, Bethesda, MD) ergänzt war. Die CTL-Klone wurden wie in A.L. Glasebrook und F.W. Fitch, 1980, "Alloreactive cloned T-cell lines. I. Interactions between cloned amplifier and cytolytic T-cell lines", J. Exp. Med., 151:876, gehalten, wobei bestrahlte Stimulatorzellen und ein IL-2-haltiger Überstand von mit Concanavalin A aktivierten Rattenmilzzellen verwendet wurde.

Cytotoxizitätsbestimmung

Effektorzellen und mit 51Cr-markierte Zielzellen wurden vermischt und in dreifacher Ausführung in einer 96 Vertiefungen aufweisenden Schale bei verschiedenen E/T- Verhältnissen inkubiert, wie in K. Grabstein, 1980, "Cellmediated cytolytic responses", in: Selected Methods in Cellular Immunology, B.B. Mishel und S.M. Shiigi, Hrsg., San Francisco, Freeman), Seite 124 ff. beschrieben. Die Anzahl der Zielzellen betrug 10&sup4; Zellen pro Vertiefung, wenn mit den cytolytischen Zellklonen der 51cr-Freisetzungstest durchgeführt wurde. 5 x 10³ Zielzellen pro Vertiefung wurden verwendet, wenn Milzzellen und T-Zellen aus Lymphknoten als Effektoren untersucht wurden. PMA, Bryostatin 1 und Bryostatin 2 wurden mit Endkonzentrationen im Bereich von 0,5 ng/ml bis 100 ng/ml zugesetzt. Die Bestimmung der lectinabhängigen Cytotoxizität wurde durch Zugabe von 10 g/ml Con A zur Mischung aus CTL und mit 51Cr-markieren Zielzellen durchgeführt. Nach der Inkubation wurde die 96 Vertiefungen aufweisende Schale zentrifugiert (1 min, 800 Upm, 4ºC), alle Überstände wurden geerntet, die Radioaktivität in den Proben wurde gezählt und die Mittelwerte für jeden Dreifachsatz wurden bestimmt. Der Prozentsatz der spezifischen Freisetzung von 51Cr wurde als 100 x (a-b)/(t-b) bestimmt, wobei a die Freisetzung von 51Cr in Gegenwart von CTL ist, b die spontane Freisetzung aus markierten Zielzellen in Abwesenheit von CTL ist und t die Gesamtzahl der cpm (Treffer pro Minute) in den Zielzellen ist. Die spontane Freisetzung von 51cr aus den Zielzellen überstieg 15% der gesamten cpm nicht.
Abschätzung der Menge an zellassoziierter BLT-Esterase- Aktivität und Bestimmung der BLT-Esterase-Sekretion.
Diese Bestimmung wurde wie in H. Takayama et al., 1987, "Antigen receptor triggered secretion of a trypsin-type esterase from cytotoxic T-lymphocytes", J. Immunol., 138:566 beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt wurden die Effektorzellen in den Inkubationsmedien resuspendiert und in dreifacher Ausführung in einem 96 Vertiefungen aufweisenden Teller (Immulon) mit einer Konzentration von 10&sup5; Zellen pro 100 ul inkubiert. Phorbolmyristatacetat ("PMA"), Bryostatin 1 und Bryostatin 2 wurden mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml zugesetzt, das Ca&spplus;&spplus;-Ionophor A23187 (freie Säure, Sigma C7522) wurde mit einer Endkonzentration von 0,5 ug/ml zugesetzt. Das Gesamtvolumen pro Vertiefung wurde auf 200 ul eingestellt. Nach 4-stündiger Inkubation (37ºC, 5% CO&sub2;) wurden die Teller rotiert (1 min, 200 x g), und 50 ul des Überstandes wurden geerntet. Der gesamte BLT-E-Gehalt wurde bestimmt, indem 10&sup5; Effektorzellen mit 0,1% Triton X-100 in PBS löslich gemacht wurden.
Antikörper für die Verwendung zur Reinigung von kleinen ruhenden T-Zellen aus Mäuselymphknoten oder -milzen.
Der monoklonale Antikörper M5/114.15.2 (Ratten-IgG2b), der gegen die Mäuseantigene Ia I-Ab,d,q und I-Ed,k gerichtet ist (s. A. Bhattacharya et al., 1981, "A shared alloantigenic determinant on Ia-antigen encoded by the I-A and I-E subregions: evidence for I region gene duplication", J. Immunol., 127:2488) wurde mit einer Endverdünnung von 1/100 Ascites-Flüssigkeit zusammen mit einem nicht-toxischen Kaninchen-Komplement (Cedar Line, Low- Tox-M Kaninchen- Komplement, Ontario, Canada) verwendet. Der 7D4-Ratten-IgM- Antikörper gegen den IL-2-Rezeptor der Maus (s. T. Malek et al., 1983, "Identification and initial characterization of a rat monoclonal antibody reactive with the murine interleukin-2 receptor-ligand complex", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:5694) und der gegen die Kappakette der Ratte gerichtete Mäuse- Antikörper MAR 18.5 (s. L. Lanier, et al., 1982, "Monoclonal antibodies against rat immunoglobulin chains", Hybridoma 1:125) sind bereits zuvor beschrieben worden.

Reagentien:

rIL-2 wurde von "Biogen" (Cambridge, MA) bezogen. Der rekombinante B-Zell-Stimulationsfaktor (BSF-1IL-4) wurde von der Immunex Corporation zur Verfügung gestellt.

Reinigung von in vivo angeregten Milzzellen.

B10-Mäuse wurden in vivo mit 5 - 7,5 x 10&sup6; bestrahlten P815 (H-2d)-Zellen immunisiert. Nach 2 - 3 Wochen wurden die Tiere getötet, und die Milzzellen wurden entnommen. Rote Blutzellen wurden mit hypotonischer Salzlösung lysiert. Die Zellen wurden mit 100 ul 1/10 verdünnte M5/114.15.2 mAb enthaltender Ascitesflüssigkeit pro 50 x 10&sup6; Zellen inkubiert. Nach 30 min nach Raumtemperatur wurden die Zellen gewaschen, und 100 ul des MAR 18.5 enthaltenden Zellüberstands und 100 ul Kaninchen-Komplement pro 50 x 10&sup6; Zellen wurden zugesetzt. Man ließ die Inkubation bei 37ºC 45 min lang andauern, tote Zellen wurden durch Hypaque-Ficoll-Zentrifugation entfernt, man wusch und inkubierte dann 3 Tage lang in RPMI-Medium/10% FCS mit oder ohne Zusatz von IL-2, PMA oder Bryostatin wie in den Legenden der Zeichnungen angegeben. Die Cytotoxizität gegen Ag-tragende Zielzellen wurde in einer 51Cr- Freisetzungsbestimmung unter Verwendung von P815 Mastocytom- Zellen als Zielzellen gemessen.

Reinigung von in vitro angeregten Milzzellen.

Man gewann Milzzellen aus B10-Mäusen und mischte sie mit bestrahlten DBA-2-Milzzellen im Verhältnis 1:1. Die Zellen wurden in 5% FCS mit RPMI-1640 Medium bei einer Konzentration von 2 x 10&sup6;/ml kultiviert. Nach 14 Tagen in Kultur wurden die Zellen wie oben beschrieben gereinigt.

Reinigung kleiner ruhender T-Zellen aus Mäuselymphknoten.

Mesenteriale Lymphknoten wurden aus virusfreien BALB/c- Mäusen im Alter von 8 - 12 Wochen gewonnen. Nach zwei Passagen über eine Nylonwollsäule wurden Ia-positive Zellen nachfolgend mit dem gegen Ia gerichteten monoklonalen Antikörper MS/114 plus Low-Tox-M Kaninchenkomplement wie oben beschrieben lysiert. Kleine, dichte, ruhende T-Zellen wurden dann durch ein modifiziertes, diskontinuierliches Percoll- Gradientenverfahren (s. Defranco et al., 1982, "Frequency of B-lymphocytes responsive to antiimmunoglobulin", J. Exp. Med. 155:1523) abgetrennt. Gereinigte T-Zellen, die in der Bande mit 66 - 70% Dichte isoliert worden waren, wurden für kleine, ruhende T-Zellen angesehen. Anfärben mit mAb und anschließende Fluoreszenz-Sortieranalyse ergab, daß praktisch alle davon Thy 1&spplus; waren; 80% der Zellen waren L3T4&spplus; und 20% der Zellen waren Lyt 2&spplus;.

Die Wirkung der Bryostatine 1 und 2 auf die in vitro erfolgende Entwicklung von cytotoxischen T-Zellen aus Milzen von in vivo angeregten Mäusen.

Wenn gereinigte T-Lymphozyten von Milzen von in vivo angeregten Mäusen in vitro in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren inkubiert wurden, wurde die maximale cytotoxische Aktivität nach 24 h aufgefunden; die Cytotoxizität nahm ab, wenn die Zellen weiter in Kultur gehalten wurden (Daten nicht gezeigt). Der Zusatz von steigenden Konzentrationen von IL-2 in das Inkubationsmedium führte zu einer ansteigenden Zahl von lytischen Einheiten in der Population der cytotoxischen Lymphozyten aus Mäusemilz, wie in Fig. 2A und Tabelle 1 unten dargestellt. Zwei E/ml rIL- 2/ml hatten einen nur geringen Effekt. Die maximale Induktion der Cytotoxizität (51 lytische Einheiten pro 10&sup7; Milz-T- Zellen) wurde nach 72 h der Inkubation angeregter Zellen mit 20 E/ml rIL-2 erzielt, wie in Fig. 2A dargestellt. Wenn jedoch 0,78 nM Bryostatin 2 oder PMA während des Inkubationszeitraums vorhanden waren, induzierten 2 E/ml rIL-2 die Entwicklung von CTL (s. Tabelle 1, unten) in der gleichen Größenordnung wie diejenige, die durch 20 E/ml IL-2 induziert wurde, wie in Fig. 2 dargestellt. Darüber hinaus erhöhten PMA und die Bryostatine 1 und 2 auch den Grad der mit hohen Konzentrationen von rIL-2 erhaltene Cytotoxizität.
Die cytolytischen Zellen, die durch Bryostatin und IL-2 stimuliert waren, waren für die H-2d-tragenden Zielzellen (s. Fig. 3) spezifisch, was ihre Entwicklung aus mit der H-2d- tragenden Zellinie P815 angeregter Maus widerspiegelt. Es wurde keine Cytotoxizität gegen EL-4-Zielzellen gefunden. Mit Bryostatin plus IL-2 induzierte cytotoxische Zellen waren jedoch in der Lage, EL-4-Zellen in Gegenwart von Con A zu Iysieren, wie in Fig. 3 dargestellt ist.
Die Steigerung der Entwicklung cytotoxischer Zellen durch Bryostatin + IL-2 ist stark von der Konzentration von Bryostatin während der 3 Tage dauernden Inkubation in vitro von in vivo angeregten Milzzellen abhängig. Bryostatin- Konzentrationen von 0,5 ng/ml oder weniger beschleunigten die durch IL-2 induzierte Cytotoxizität; höhere Konzentrationen von Bryostatin hatten entweder keinen Effekt (1 ng/ml) oder inhibierten die IL-2-induzierte Cytotoxizität (2 ng/ml oder darüber) (Daten nicht gezeigt).

Auslösen nicht-Ag-spezifischer Cytotoxizität von CTL-Klonen in vitro durch die Bryostatine 1 und 2.

Beim Vermischen von &sup5;¹Cr-markierten EL-4-Zellen (H-2d) mit dem cytotoxischen T-Zell-Klon 2C (Anti-H-2Ld) in verschiedenen E/T-Verhältnissen wurde keine &sup5;¹Cr-Freisetzung beobachtet. Wie in Fig. 4 gezeigt, verursachte jedoch der Zusatz von Bryostatin 1 oder 2 zur Zellmischung die Lyse von EL-4-Zellen in einer dosisabhängigen Weise, wobei die maximale Aktivität von 10 ng/ml Bryostatin 2 hervorgerufen wurde. Es wird angenommen, daß dies ein gleichbleibend hohes Niveau einer Abhängigkeit der Dosisreaktion darstellt, da ein 10facher Anstieg der Konzentration von Bryostatin 2 zu keiner höheren Cytotoxizität von CTL führte. Bei 10 ng/ml Bryostatin 2 war die Menge der &sup5;¹Cr-Freisetzung im Vergleich zu den gleichen Konzentrationen an PMA oder Bryostatin 1 bei allen getesteten E/T-Verhältnissen übereinstimmend geringer (Daten nicht gezeigt).

Auslösen der BLTE-Freisetzung aus einem cytotoxischen T-Zell- Klon.

Da die cytolytische Aktivität von CTL mit der Exocytose von Granula verbunden ist (s. S.N. Bykovskaja et al., 1978, "Ultrastructural alteration of cytolytic T-lymphocytes following their interaction with target cells. II. Morphogenesis of secretory granules and intracellular vacuoles", Cell. Immunol., 40:175; D. Zagury, 1982, "Direct analysis of individual killer T-cells: Susceptibility of target cells to lysis and secretion of hydrolytic enzymes by CTL", Adv. Exp. Med. Biol., 146:149; P.A. Henkart, 1985, "Mechanism of lymphocyte-mediated cyto-toxicity", Ann. Rev. Immunol. 3:31; J.H. Russel, 1986, "Phorbol-ester stimulated lysis of weak and nonspecific target cells by cytotoxic T- lymphocytes", J. Immunol. 136:23; H. Takayama et al., s. oben) wurde die Fähigkeit der Bryostatine 1 und 2, die Sekretion von granula-assoziierter trypsinartiger Esterase (BLT-E) in Reaktion auf die CTL-Interaktion mit spezifischen Zielzellen oder im Anschluß an die Verknüpfung ("cross-linking") von TcR durch immobilisierte, gegen TcR gerichtete mAb zu beeinflussen, getestet.
Unter Verwendung eines neuerdings entwickelten BLT- Esterase-Sekretionstestes (s. H. Takayama et al., oben) wurde die Fähigkeit der Bryostatine 1 und 2, cytolytische T-Zellen zu aktivieren und die Exocytose von Granula aus CTL auszulösen, getestet. Wie in Fig. 5 dargestellt, induziert der Zusatz von Bryostatin 1 oder 2 allein nur einen geringfügigen Anstieg der BLT-E-Sekretion in den cytolytischen T-Zellen. Die Kombination von Bryostatin und einem Ca&spplus;&spplus;-Ionophoren steigert jedoch die Aktivierung von CTL in großem Maß und induziert eine signifikante Sekretion von in den Granula befindlichem Enzym. PMA allein induziert ebenfalls eine geringe BLT- Esterase-Sekretion, die durch den Zusatz von 0,5 ug/ml A23187 in großem Maße gesteigert wird. Der Effekt von Bryostatin 1/Ca²&spplus;-Ionophoren ist geringfügig kleiner als der von PMA/Ca²&spplus;-Ionophoren (wie in Fig. 5 gezeigt). Wenn jedoch äquimolare Konzentrationen an PMA und Bryostatin verwendet wurden, war die Menge an sezernierter BLT-Esterase in beiden Kombinationen vergleichbar. Bryostatin 2 oder die Kombination von Bryostatin 2/Ca²&spplus;-Ionophoren war bei der Aktivierung von cytotoxischen T-Zellen jeweils weniger wirksam als PMA und Bryostatin 1, auch bei äquimolaren Konzentrationen.

Inhibition spezifischer Cytotoxizität von CTL-Klonen in vitro durch die Bryostatine 1 und 2.

Die Wirkung der Bryostatine 1 oder 2 und die von PMA auf die Ag-spezifische Cytotoxizität von CTL wurde in einem &sup5;¹Cr- Freisetzungstest bestimmt, wobei P815-Zellen bei verschiedenen E/T-Verhältnissen mit CTL OE4-Zellen vermischt wurden. Wie in Fig. 6 dargestellt, nahm die spezifische &sup5;¹Cr-Freisetzung ab, wenn 10 ng/ml Bryostatin 2 zu den Proben gegeben wurden. Eine vergleichbare Inhibition erreichte man durch den Zusatz von 10 ng/ml PMA. Die selbe Konzentration an Bryostatin 1 führte jedoch zu einer leichten, jedoch gleichbleibenden höheren Inhibition der Ag-spezifischen &sup5;¹Cr-Freisetzung im Vergleich zu PMA. Eine Vorbehandlung von CTL mit PMA und Bryostatin anstelle von deren Zusatz direkt in die Inkubationsvertiefungen einer Mikrotiterschale änderte die beschriebenen Effekte nicht in signifikanter Weise.

Wirkung der Bryostatine 1 und 2 auf die Entwicklung von cytolytischen Granula und von Cytotoxizität in kleinen ruhenden T-Lymphozyten.

Wirkungsvolle verstärkende Eigenschaften von Bryostatin wurden gefunden, wenn die Wirkungen von PMA, Bryostatin 1 und Bryostatin 2 auf kleine ruhende, nicht angeregte cytotoxische T-Zellen gemessen wurden. Vorangegangene Studien von G. Trenn et al. zeigten, daß kleine, ruhende cytotoxische T-Zellen durch die gleichzeitige Zugabe von BSF-1 und PMA zum Kulturmedium wirksam zu reifen cytotoxischen T-Zellen differenziert werden, wobei dieser Effekt durch die Zugabe von IL-2 vergrößert wird. Die Ansammlung von CTL-Granula-Marker, BLT-E (s. M.S. Pasternack et al., 1985, "A Novel serine esterase expressed by cytotoxic T-lymphocytes", Nature (Lond) 314:743) während der Inkubation unbeeinflußter ("naiver") ruhender T-Zellen mit Wachstumsfaktoren und Proteinkinase C- Aktivatoren wurde gemessen und die Ergebnisse sind in Fig. 7, Abbildung A, dargestellt. Weder die Wachstumsfaktoren (IL-2, IL-4) noch Bryostatin 1 und 2 allein induzierten die Expression von BLT-E-Aktivität in ruhenden T-Zellen. Die Bryostatine 1 und 2 steigerten jedoch in Kombination mit IL-4, jedoch nicht mit IL-2, die Menge dieses Granula-assoziierten Enzyms, berechnet pro Zelle, in dramatischer Weise, was die Differenzierung ruhender T-Zellen in CTL widerspiegelt. Die Fähigkeit von Bryostatin, die Entwicklung von CTL zu steigern, wird durch die Studien über die Wirkung der Bryostatine 1 und 2 auf die Entwicklung der Cytotoxizität in ruhenden T-Zellen bestätigt, die sich in einen in Fig. 7, Abbildung B, dargestellten &sup5;¹Cr-Freisetzungstest zeigt. Die Bryostatine 1 und 2 allein, wie auch BSF-1 und IL-4 allein waren nicht in der Lage, die CTL-Entwicklung zu induzieren, während sie bei gemeinsamer Zugabe synergistisch zusammenwirkten. Interessanterweise steigerte beim &sup5;¹Cr-Freisetzungstest (Fig. 7, Abbildung B) der Zusatz von IL-2 die Wirkung von BSF- 1/Bryostatin, während dies nicht der Fall war, wenn die BLT-E- Menge pro Zelle nach der Inkubation von Zellen unter denselben Bedingungen gemessen wurde (Fig. 7, Abbildung A).
Aus dem Voranstehenden läßt sich erkennen, daß starke immunsteigernde Eigenschaften einer neuen Reihe von Proteinkinase C-Aktivatoren, ausgewählt aus der Bryostatin- Familie, gezeigt werden. Im Gegensatz zu den PK-C- aktivierenden Phorbolestern, die eine starke tumorfördernde Aktivität besitzen, fehlt den Bryostatinen die tumorfördernde Aktivität, und es wurde gezeigt, daß sie antineoplastische Eigenschaften besitzen (s. G.R. Pettit et al., 1982, oben; G.R. Pettit et al., 1983, oben; und G.R. Pettit et al., 1984, oben). Wichtige zellbiologische Unterschiede zwischen PMA und Bryostatin sind beobachtet worden, einschließlich von Unterschieden in ihren Wirkungen auf unreife Zellinien. Es wurde gezeigt, daß die Differenzierung der HL-60-Zellinie durch PMA, jedoch nicht durch die Bryostatine induziert werden kann (s. A.S. Kraft et al., 1986, "Bryostatin, an activator of the calcium phospholipid-dependent protein kinase, blocks phorbol ester-induced differentiation of human promyelocytic leukemia cells HL-60", Proc. Natl. Acad. Sci. 83:1334). Obwohl die Aktivierung von Proteinkinase C ausreicht, um viele phorbolesterartigen Wirkungen zu induzieren, könnte also die Modulation der Differenzierung komplizierter sein. Es scheint, daß Bryostatin, ein makrocyclisches Lacton, andere Wirkungen auf die intrazellulären biochemischen Reaktionswege auslöst als diejenigen, die durch PMA ausgelöst werden, und daß die Dauer seiner Wirkungen unterschiedlich sein kann. Über Verschiedenheiten der durch PMA und die Bryostatine induzierten Proteinphosphorylierungs-Muster ist berichtet worden (s. R.L. Berkow et al., 1985 "Bryostatin, a non-phorbol macrocyclic lactone, activates intact human polymorphonuclear leukocytes and binds to the phorbol ester receptor", Biochem. Biophys. Res. Commun. 131:1109).
Wie oben beschrieben und in den Fig. 2 bis 7 gezeigt, ähneln die Bryostatine 1 und 2 PMA darin, daß sie potente Modulatoren der Antwort von sowohl ruhenden als auch in vivo angeregten T-Zellen und von klonierten T-Lymphozyten sind. Darüber hinaus steigern diese Bryostatine die Entwicklung von cytotoxischen Zellen aus unbeeinflußten (naiven) ruhenden T- Zellen (s. Fig. 7) und aus in vivo angeregten Milzzellen (s. Fig. 2 und Tabelle 1). Die Bryostatine fördern auch die Con A- abhängige Cytotoxizität gegen Zielzellen, denen Determinanten, für die die CTL spezifisch sind, fehlen, wie in Fig. 4 dargestellt. Quantitative Untersuchungen der Exocytose von Cytolysin enthaltenden Granula aus CTL zeigen (s. Fig. 5), daß entweder der Phorbolester oder die Bryostatine die Exocytose von Granula aus mit Ca&spplus;&spplus;-Ionophoren stimuliertem CTL in synergistischer Weise steigern können.
Bryostatine wirken bei der Stimulierung von unbeeinflußten (naiven) T-Lymphozyten synergistisch mit Lymphokinen zusammen, was durch die Verwendung gereinigter kleiner ruhender T-Zellen aus mesenterialen Lymphknoten von Mäusen gezeigt wurde. Bryostatin und IL-4 bewirken, daß CTL- Vorläufer in diesen ruhenden T-Zell-Populationen zu cytotoxischen T-Zellen differenzieren (Fig. 7). Dieser Reifungsprozeß wird durch die Zugabe von IL-2 gesteigert, und er wird von der Entwicklung der granula-assoziierten Serinesterase vom Trypsintyp BLT-E begleitet (Fig. 7A). Obwohl in einigen Experimenten Bryostatin 1 bei der Induktion von Cytotoxizität in kleinen, ruhenden T-Zellen weniger wirksam ist als PMA, induzierte Bryostatin 2 gleichbleibend vergleichbare Mengen an Cytotoxizität, wie in Fig. 7B gezeigt ist.
Die Untersuchungen der Wirkung von Bryostatinen auf in vivo angeregte cytotoxische T-Zellen, die in den Fig. 2 und 3 und in Tabelle 1 gezeigt ist, zeigen, daß niedrige Dosen IL-2 (2 Einheiten/ml) plus Bryostatin genauso viele oder mehr CTL Lysiseinheiten induzieren können wie hohe Dosen von rIL-2 (10 oder 20 Einheiten/ml). Dieser Effekt ist keine Folge der zusätzlichen Freisetzung von endogenem IL-2 aus stimulierten T-Helferzellen, da eine IL-2 induzierte Proliferation in der Zellkultur nicht beobachtet wurde, wenn Zellen mit IL-2 plus Bryostatin inkubiert wurden. Deshalb senkt Bryostatin in signifikanter Weise die Menge an rIL-2, die für die Entwicklung von CTL notwendig ist, wobei das Risiko von nachteiligen Nebenwirkungen verringert wird. Es wird deshalb angenommen, daß die Verwendung von Bryostatin zusammen mit rIL-2 wie vorliegend Tumorabstoßung (s. S.A. Rosenberg et al., 1987, "A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interleukin-2 or high-dose interleukin-2 alone", New Engl. J. Med. 316:889) mit IL-2-Dosen ermöglichen wird, die ausreichend gering sind, um die unerwünschten Nebenwirkungen (s. C.G. Moertel, 1986, "On lymphokines, cytokines, and breakthroughs", JAMA 256:3141) der derzeit bei der übernommenen Immuntherapie verwendeten hohen Dosen an rIL-2 zu mildern oder zu vermeiden. Bryostatin ist daher als immunmodulierendes Mittel reizvoll, da es nicht nur antineoplastische Eigenschaften aufweist, sondern auch antitumorfördernde Eigenschaften besitzt.
Genaue Untersuchungen der Wirkung von Bryostatinen auf das Wachstum, die Differenzierung und die Effektorfunktionen von Lymphozyten zeigen, daß sie nicht lymphotoxisch sind. In Übereinstimmung damit wurde gefunden, daß der Prozentsatz an toten Zellen in Bryostatin enthaltenden Kulturen von CTL sich sogar nach 3 Inkubationstagen nicht von dem der Kontrollkulturen unterschied (Schätzung durch Anfärbung mit Trypanblau). Kein lymphotoxischer Effekt von Bryostatin wurde bei der Verwendung der LDH-Sekretionsbestimmung oder dem Trypanblau-Ausschließungstest in CTL-Kulturen gefunden, die sogar noch höhere Konzentrationen an Bryostatin enthalten. Während jedoch die Bryostatine die IL-2-induzierte Entwicklung von CTL-Zellen von Mäusen nach 24 oder 72 h in Kultur steigerten (Daten nicht gezeigt), steigerten sie die gesamte Zellgewinnung nach 72 h der in vitro Inkubation von in vivo angeregten Milzzellen nicht und inhibierten die IL-2- induzierten Steigerungen beim Vergleich der Zellgewinnung, wie in Tabelle 1 unten gezeigt.
Eine der interessierenden Eigenschaften von Proteinkinase C-Aktivatoren einschließlich von Bryostatinen, wie in Fig. 6 dargestellt ist, ist ihre Fähigkeit, die Ag-spezifische Cytotoxizität von CTL-Klonen zu inhibieren. Es wird deshalb gezeigt, daß die Bryostatine 1 und 2 PK-C-Aktivatoren mit vorteilhaften Eigenschaften für die Verwendung als immunmodulierende Mittel sind. TABELLE 1 Wirkung von Bryostatin auf die Erzeugung von Cytotoxizität in angeregten Milzzellen Kulturbedingungen Lytische Einheiten pro 10&sup7; Zellena Index der Zellgewinnung nach der Inkubationb Medium Medium = rIL-2 (2 E/ml) + PMAc
aEine lytische Einheit ist definiert als die Anzahl von Effektorzellen, die für die 50%ige spezifische &sup5;¹Cr- Freisetzung von 10&sup4; Zielzellen notwendig ist.
bDer Index der Zellgewinnung wurde als Verhältnis der Zellzahl bei Kultivierungsbeginn zur Zellzahl nach 3-tägiger Inkubation berechnet. Angeregte Milzzellen wurden wie in Beispiel I beschrieben erhalten. c0,5 ng/ml PMA oder 0,5 ng/ml Bryostatin 1 wurden während der Inkubation von Zellen dort verwendet, wo es angegeben ist.
Um weiterhin das Verständnis der vorliegenden Erfindung zu fördern, ohne diese einzuschränken, sind die nun folgenden Beispiele angegeben.

BEISPIEL I

In vivo angeregte B10-Milzzellen wurden wie oben beschrieben hergestellt. Nach 3-tägiger Kultur in Gegenwart von entweder rIL-2 oder rIL-2 plus Proteinkinase C-Aktivator wurde die Cytotoxizität in einem &sup5;¹Cr-Freisetzungstest mit den in Fig. 2 gezeigten E/T-Verhältnissen unter Verwendung von 10&sup4; P815-Zielzellen/Vertiefung gemessen. Die Ergebnisse der Cytotoxizitätsbestimmung sind dargestellt für
(A) mit rIL-2 kultivierten Zellen allein (0 E/ml, 2 E/ml, 10 E/ml, 20 E/ml);
(B) mit rIL-2 plus 0,5 ng/ml Bryostatin 1 kultivierte Zellen;
(C) mit rIL-2 plus 0,5 ng/ml Bryostatin 2 kultivierte Zellen, und
(D) mit rIL-2 plus 0,5 ng/ml PMA kultivierte Zellen.
Alle Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.

BEISPIEL II

B10-Mäuse wurden wie oben beschrieben mit P815-Zellen immunisiert. Von Ia-Zellen befreite Milzzellen wurden in Gegenwart von 0,5 ng/ml Bryostatin 2 und 10 E/ml rIL-2 inkubiert. Nach 3 Tagen wurde die Cytotoxizität in einem &sup5;¹Cr- Freisetzungstest bestimmt, wobei 10&sup4; P815 (H-2d) oder EL-4 (H- 2b) Zielzellen verwendet wurden. Con A wurde auf eine Endkonzentration von 10 ug/ml zugesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt.

BEISPIEL III

CTL 2C-Klone wurden 4 h lang mit &sup5;¹Cr-markierten syngeneischen EL4-Zielzellen bei verschiedenen E/T- Verhältnissen in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen an PMA oder Bryostatin 2 inkubiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt.

BEISPIEL IV

10&sup5; CTL (Klon BM10-37) wurden in einer 96 Vertiefungen aufweisenden Schale inkubiert und durch Zugabe von PMA (10 ng/ml) und A23187 (0,5 ug/ml) stimuliert. Die spezifische BLT- E-Sekretion wurde wie oben beschrieben gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt, wobei die folgenden Bezeichnungen verwendet wurden:
A ist Medium plus Solvens DMSO;
B ist A23187 (0,5 ug/ml) allein;
C ist PMA (10 ng/ml) plus A23187 (0,5 ug/ml);
D ist Bryostatin 1 (10 ng/ml) plus A23187 (0,5 ug/ml);
E ist Bryostatin 2 (10 ng/ml) plus A23187 (0,5 ug/ml).

BEISPIEL V

OE4 CXTL-Zellen wurden mit 10&sup4; mit Cr markierten P815- Zellen mit verschiedenen E/T-Verhältnissen inkubiert, und die Freisetzung von &sup5;¹Cr wurde nach 4-stündiger Inkubation gemessen. PMA oder Bryostatin wurden mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml zugegeben. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt.

BEISPIEL VI

Kleine, ruhende T-Zellen wurden wie oben beschrieben aus Balb/c mesenterialen Lymphknoten isoliert. Die gereinigten Zellen wurden 3 Tage lang bei einer Zellkonzentration von 10&sup6; Zellen/ml entweder in Medium allein oder in Medium plus verschiedene Zusätze (rIL-2, 100 E/ml; BSF-1, 2000 E/ml; Bryostatin 1 oder 2, 015 ng/ml) kultiviert. Die Cytotoxizität wurde in einem 6-stündigen, lectinmediierten (Con A, 10 ug/ml) &sup5;¹Cr-Freisetzungstest gemessen. Die Ergebnisse sind für das Verhältnis E/T von 100/1 gezeigt. Für die Bestimmung des BLT- E-Gehaltes wurden 10&sup6; Zellen einer jeden, unter bestimmten Bedingungen getesteten Kultur in 100 ul Medium resuspendiert und mit 1% Triton X-100 löslich gemacht. 50 l Zellsuspension wurden für die Messung des BLT-Esterasegehaltes wie oben beschrieben verwendet. Die untersuchten Reagentien steigerten bei ihrem alleinigen Zusatz zu den Zellkulturen weder den zellulären BLT-Esterase-Gehalt noch die induzierte Cytotoxizität, wie in Fig. 7 dargestellt.

Claims

1. Zusammensetzung, enthaltend (i) eine Verbindung der Struktur:

worin R -H oder -COCH&sub3; ist,

und (ii) kloniertes Interleukin-2 oder gamma- Interferon.

2. Verwendung einer Verbindung der Struktur:

worin R -H oder -COCH&sub3; ist,

bei der Herstellung eines Medikamentes zum Behandeln eines Wirtes, der unter neoplastischem Wachstum leidet, wobei der Wirt außerdem mit kloniertem Protein Interleukin-2 und/oder gamma-Interferon behandelt wird.

3. Verwendung nach Anspruch 2, worin das Medikament für die Verabreichung durch intravenöse Injektion geeignet ist.

4. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, worin R H ist.

5. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, worin R COCH&sub3; ist.