DE68909797T2 - Cucumber-mosaikvirus-hüllproteingen. - Google Patents
Cucumber-mosaikvirus-hüllproteingen.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft ein Hülleproteingen des Gurkenmosaikvirusstamms WL (CMV-WL). Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieses Gens sowie seinen Einbau in einen Transfervektor sowie seine Verwendung zur Herstellung transformierter Pflanzenzellen und transformierter Pflanzen, die gegenüber CMV-Virusinfektionen resistent sind.
- Gurkenmosaikvirus (CMV) ist ein einzelsträngiges (+) RNS-Pflanzenvirus mit funktionell unterteiltem Genom. Das Virusgenom enthält vier als RNsen1-4 bezeichnete RNS-Arten; 3389 Nukleotide (nt), 3035 nt, 2193 nt bzw. 1027 nt (Peden 26 und Symons, 1973; Gould und Symons, 1982; Rezaian und Mitarbeiter, 1984; Rezaian und Mitarbeiter, 1985). Lediglich die RNSen1-3 sind für eine Infektion (Peden und Symons, 1973) erforderlich, da das Hüllenprotein, das durch RNS 4 codiert wird, auch durch RNS 3 codiert wird. Translationen von CMV RNSen liefern ein 95KDal Polypeptid aus RNS 1, ein 94 kDal Polypeptid aus RNS 2 (Gordon und Mitarbeiter, 1983) und zwei Polypeptide aus RNS 3: sein 5'-Ende codiert ein 35 KDal Polypeptid, sein 3'-Ende codiert ein 24,5kDal Polypeptid (Gould und Symons, 1982). Das 24,5kDal Polypeptid ist mit dem durch RNS 4 codierten identisch und stellt das Hüllenprotein dar.
- Mit Hilfe der Serologie (Devergne und Cardin, 1973, 1975), des Wirtbereichs (Marrow und Mitarbeiter, 1975), der Peptidkartierung (Edwards und Gonsalves, 1983) und der Nukleinsäurehybridisierung (Piazzola und Mitarbeiter, 1979; Gonda und Symons, 1978) wurden einige Gurkenmosaikvirusstämme klassifiziert. Diese CMV-Stämme lassen sich in zwei mit S und WT bezeichnete Gruppen unterteilen. Das Genom des CMV-Q-Stammes wurde vollständig sequenziert (Rezaian und Mitarbeiter, 1984, 1985; Gould und Symons, 1982; Davies und Symons, 1988). Der Q-Stamm ist ein Mitglied der aus drei Mitgliedern bestehenden S-Gruppe. Von der WT-Gruppe ist bekannt, daß sie mindestens 17 Mitglieder aufweist. Aus einer Nukleotidsequenzanalyse und Vergleichen der Hülleproteingene aus CMV-C und CMV-WL (Quemada und Mitarbeiter, Manuskript in Vorbereitung, vgl. Schema 1) haben wir ermittelt, daß der C- Stamm zur WT-Gruppe und der WL-Stamm zur S-Gruppe gehören. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der Hülleproteingene der Stämme C und WL unterscheiden sich um 22,7% bzw. 16% (vgl. Schemata 2 und 3).
- Wie bereits für einige Viren [Tabakmosaikvirus (Powell- Abel und Mitarbeiter, 1986), Alfalfamosaikvirus (Loesch- Fries und Mitarbeiter, 1987; Tumer und Mitarbeiter, 1987), Gurkenmosaikvirus (Cuozzo und Mitarbeiter, 1988; Quemada und Slightom, in Vorbereitung) und Kartoffelvirus X (Hemenway und Mitarbeiter, 1988)] gezeigt, führt eine Expression des Hülleproteins in transgenen Pflanzen zu einer Pflanze mit Resistenz gegen eine Infektion durch das betreffende Virus. Ob sich jedoch dieser (künstlich) herbeigefuhrte Kreuzschutz auf sämtliche Stämme eines speziellen Virus erstreckt, wurde noch nicht bestimmt. Die beiden CMV-Gruppen scheinen sich in ihrem Hülleproteingen um etwa 16% zu unterscheiden. Somit dürfte die Expression beider Virushülleproteine erforderlich sein, um einen (künstlich) herbeigeführten Kreuzschutz gegen unter Feldbedingungen zu erwartende CMV-Infektionen sicherzustellen.
- Das CMV-Hülleproteingen enthält nicht die zu seiner Expression nach erfolgter Übertragung und Integration in ein Pflanzengenom erforderlichen Signale. Es muß derart konstruiert werden, daß es einen konstitutiven Promotor 5' zu seinem Translationsinitiationscodon (ATG) und ein Poly(A)- Additionssignal (AATAAA) 3' zu seinem Translationsterminationscodon enthält. Es stehen einige in Pflanzen funktionierende Promotoren zur Verfügung, wir glauben jedoch, daß die besten Promotoren die 355 konstitutiven Promotoren aus Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) darstellen. Das Poly(A)-Signal läßt sich aus dem CaMV 35S Gen oder aus einer beliebigen Zahl gut charakterisierter Pflanzengene, d.h. Nopaline-Synthase (Bevan und Mitarbeiter, 1983), Octopine-Synthase (Depicker und Mitarbeiter, 1982) und dem Bohnenlagerungsproteingen Phaseolin (Slightom und Mitarbeiter, 1983), erhalten. Die Bauweisen sind ähnlich derjenigen, wie sie gemäß der PCT-Patentanmeldung PCT/US88/04321, veröffentlicht am 29. Juni 1989 als WO 89/05858 mit der Priorität der U.S.-Patentanmeldung Ser.No. 135 591 vom 21. Dezember 1987 und dem Titel "Gurkenmosaikvirus-Hülleproteingen", auf deren wesentliche Teile hierin bezug genommen wird, zur Expression des CMV-C Hülleproteins benutzt wird.
- Gegen Viruserkrankungen resistente Pflanzen und Verfahren zur Herstellung derselben sind in dem EP 223 452 beschrieben.
- Die in den folgenden Literaturstellen enthaltenen Informationen erläutern ebenfalls Materialien, Maßnahmen und interessierende Ergebnisse für bzw. bei der Konstruktion von Virushülleproteingenen zur Expression in transgenen Pflanzen.
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- Diese Erfindung liefert: Das Hülleproteingen aus dem WL-Stamm von Gurkenmosaikvirus (CMV-WL).
- Einen Pflanzentransformationsvektor mit dem Hülleproteingen aus CMV-WL, dem Promotor des 355-Gens von Blumenkohlmosaikvirus und das Polyadenylierungssignal des Blumenkohlmosaikvirus 355-Gens.
- Eine Bakterienzelle mit einem Pflanzentransformationsvektor mit dem Hülleproteingen aus CMV-WL, dem 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus und dem Polyadenylierungssignal des Blumenkohlmosaikvirus 35S-Gens.
- Eine transformierte Pflanzenzelle mit dem Hülleproteingen aus CMV-Wl, dem Blumenkohlmosaikvirus 35S-Promotor und dem Polyadenylierungssignal des Blumenkohlmosaikvirusgens.
- Eine Pflanze mit transformierten Zellen mit dem Hülleproteingen von CMV-WL, dem Blumenkohlmosaikvirus 35S-Promotor und dem Polyadenylierungssignal des Blumenkohlmosaikvirusgens.
- Erfindungsgemäße transformierte Pflanzen sind Bete, Zitrusfrüchte, Mais, Gurken, Pfeffer, Kartoffel, Sojabohnen, Kürbis und Tomaten. Besonders bevorzugt sind Mitglieder der Cucurbitaceae (d.h. Kürbis und Gurken)- und Solanaceae (d.h. Pfeffer und Tomaten)-Familien.
- Weiterhin wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung virusresistenter Pflanzen durch Fortpflanzen einer das Hülleproteingen aus dem WL-Stamm von Gurkenvirus exprimierenden Pflanze. Das Verfahren eignet sich besonders gut zur Produktion von Mitgliedern der Cucurbitacaea- und Solanacaea-Familien.
- Die Schemata 1 bis 5 dienen zur Veranschaulichung der erfindungsgemäßen Bauweisen bzw. Konstrukte. Zur Veranschaulichung von Plasmiden und DNS-Fragmenten werden - wie folgt - bestimmte Übereinkünfte getroffen:
- (1) Die Gebilde als einer einzelnen Linie representieren sowohl ringförmige als auch lineare doppelsträngige DNS.
- (2) Sternchen (*) bedeuten, daß das dargestellte Molekül kreisförmig ist. Das Fehlen eines Sternchens zeigt, daß das Molekül linear ist.
- (3) Verbindungen zwischen natürlichen Grenzen funktioneller Komponenten sind durch vertikale Linien längs der horizontalen Linien angezeigt.
- (4) Es werden Gene oder funktionelle Komponenten angezeigt.
- (5) Abstände zwischen Genen und Restriktionsstellen sind nicht maßstabsgerecht. Die Figuren zeigen die relativen Lagen lediglich dann, wenn nicht anders angegeben.
- Bei den meisten im Rahmen der Ausführung der vorliegenden Erfindung angewandten rekombinanten DNS-Maßnahmen handelt es sich um dem Fachmann bekannte und detailliert beispielsweise in dem EP-223452 (auf das im folgenden Bezug genommen wird) beschriebene Standardverfahren. Bei den Enzymen handelt es sich um handelsübliche Enzyme. Deren Einsatz erfolgt entsprechend den Empfehlungen des Verkäufers oder nach bekannten (sonstigen) Variationen. Auch die Reagentien, Puffer und Kulturbedingungen sind auf dem einschlägigen Fachgebiet bekannt. Allgemeine Veröffentlichungen solcher Standardtechniken, auf die hierin bezug genommen wird, sind beispielsweise folgende: R. Wu, Herausgeber (1979) Methods in Enzymology, Band 68; J.H. Miller (1972) Experiments in Molecular Genetics; T. Maniatis und Mitarbeiter (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual; und D.M. Glover, Herausgeber (1985) DNA Cloning, Band II; S.B. Gelvin und R.A. Schilperoort, Herausgeber "Introduction, Expression, and Analysis of Gene Products in Plants.
- Die Fortpflanzung von Gurkenmosaikvirus Stamm WL (CMV- WL) erfolgte in Tabakpflanzen (cv. Havana 423). Die RNS wurde nach Standardverfahren, beispielsweise nach dem Verfahren von Lot und Mitarbeitern (Annals of Phytopathology 4:25, 1972) isoliert. Die RNS 3 wurde von den sonstigen CMV- WL RNSen durch Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation abgetrennt.
- Gereinigte CMV-WL RNS3 wurde polyadenyliert, um eine Stelle für das Anschmelzen eines Oligo-dT-Primers zu schaffen. Der Reaktionspuffer war folgender: 5 ul, 1 M Tris pH 7,9; 1 ul, 1 M MgCl&sub2;; 2,5 ul, 0,1 M MnCl&sub2;; 5 ul, 5 u NaCl; 0,5 ul, 100 mM ATP; 18 ul, 2,8 mg/ml Rinderserumalbumin. 3,2 ul dieses Puffers wurden mit 2 ug CMV-WL RNS3 gemischt. Nach Zugabe von 3,8 ul H&sub2;O und 1 ul Poly-A-Polymerase wurden die Reaktionsgemische 10 min bei 37ºC inkubiert.
- Die erhaltene polyadenylierte RNS wurde im Rahmen des cDNS-Syntheseprotokolls von Polites und Marotti (Biotechniques 4:514, 1986) mit Ausnahme der Verwendung von 0,75 mM KCl anstelle von 50 mM NaCl und von 130 uCi/100 ul 32p-dCTP anstelle von 10 - 50 uCi/100 ul eingesetzt.
- Nach der Synthese von ds-cDNS wurde sie durch G-100 Säulenchromatographie gereinigt, mit Ethanol gefällt und in 20 ul 1X Eco R1 Methylasepuffer (100 nM Nacl, 100 mM Tris- HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 80 uM S-Adenosylmethionin, 100 ug/ml Rinderserumalbumin) suspendiert. Nach Entfernung eines aliquoten Teils von 2 ul zur anschließenden Gelanalyse wurde das Reaktionsgemisch mit einem weiteren ul 32 mM S-Adenosylmethionin und 1 ul (20 Einheiten) Eco RI Methylase versetzt. Die Reaktion wurde 30 min lang bei 37ºC inkubiert und durch 10-minütiges Inkubieren bei 70ºC abgebrochen.
- Aus dem Reaktionsgemisch wurden 2 ul entnommen. 1 ul (5 Einheiten) E. coli DNS-Polymerase I Klenow-Fragment wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 min lang bei 37ºC inkubiert und vor dem Fällen mit Ethanol mit Phenol/Chloroform extrahiert. Das Pellet wurde in 70%igem Ethanol und danach in 70% Ethanol/0,3 M Natriumacetat gewaschen.
- Das Pellet wurde getrocknet und in 8 ul 0,5 ug/ul phosphorylierten Eco RI-Linkern (von Collaborative Research, Inc. 128 Spring Street, Lexington, MA 02173) resuspendiert. Nach Zugabe von 1 ul 10X Ligasepuffer (800 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM MgCl&sub2;, 150 mM DTT, 10 mM ATP) und 1 ul T4 DNS- Ligase (4 Einheiten/ul) wurde die Reaktion über Nacht bei 15ºC inkubiert.
- Die Ligationsreaktion wurde danach durch 10-minütiges Inkubieren bei 65ºC gestoppt. Nach Zugabe von 60 ul Wasser, 10 ul 10X Eco RI-Salzen (900 mM Tris pH 8,0, 100 mM MgCl2, 100 mM NaCl) und 10 ul EcoRI (10 Einheiten/ul) wurde das Reaktionsgemisch 1 h lang bei 37ºC inkubiert (zu Beginn wurde ein aliquoter Teil von 5 ul zur anschließenden Gelanalyse entfernt). Die Reaktion wurde durch Phenol/Chloroform und Chloroformextraktion gestoppt. Nach Entfernung eines aliquoten Teils von 5 ul zur Gelanalyse wurde die Hälfte des Rests zum zukünftigen Gebrauch eingefroren. Die andere Hälfte wurde durch G-100 Säulenchromatographie gereinigt. Die cDNS enthaltenden G-100 Fraktionen wurden durch Butanolextraktion konzentriert, mit Ethanol gefällt und in 10 ul H&sub2;O resuspendiert. Nach Entfernen von 3 ul für eine anschließende Analyse wurden 1 ul Lambda gt11 oder Lambda Zap Arme (von Stratagene Co., 3770 Tandy St, San Diego, Ca. 92121), 1 ul 10X Ligasepuffer und 1 ul T4 DNS-Ligase zugegeben. Danach wurde das Reaktionsgemisch über Nacht bei 15ºC inkubiert.
- Die erhaltenen ligierten Lambda gt11 oder Zap/cDNS-Moleküle wurden nach vom Hersteller des Packungsextrakts (Gigapack plus, auch von Stratagene) empfohlenen Maßnahmen gepackt. Dies führte zu rekombinanten Lambda-Phagen, die nach dem Fachmann bekannten Verfahren plattiert wurden.
- Lambda-Klone mit dem Hülleproteingen wurden durch Hybridisieren mit radioaktiv markierter einsträngiger cDNS aus gereinigter RNS4 von CMV-WL identifiziert. Diese RNS4 einsträngige cDNS wurde wie folgt synthetisiert: RNS 4 Moleküle wurden - wie zuvor für CMV-WL RNS3 beschrieben - jedoch mit 5,8 ug RNS4 polyadenyliert. Die erste Strangsynthese erfolgte gemäß Polites und Marotti (Biotechniques 4:514, 1986) mit der Ausnahme, daß kein nicht-radioaktives dCTP mitverwendet wurde. Stattdessen wurden 260 uCi/100 ul radioaktives dCTP verwendet.
- Die markierte einsträngige cDNS wurde durch P6 Säulenchromatographie gereinigt und zur Sondierung von von den oben genannten Lambda-Phagenplatten abgehobenen Replikatfiltern verwendet. Die einsträngige cDNS hybridisierte mit DNS aus mehreren Phagen-Klonen, was darauf hindeutet, daß sie zumindest einen Teil des CMV-WL Hülleproteingens enthielten. Einige diese Lambda-Klone wurden wachsengelassen. DNS aus diesen wurde nach dem Fachmann bekannten Verfahren isoliert. Es wurde insbesondere das Lambda-Klon WL3Z8 isoliert. Sein Insert von etwa 2,0kb enthält sämtliche CMV-WL RNS3 mit Ausnahme des 5'-193 bp.
- Die EcoRI-Fragmente aus dem Lambda-Klon WL3Z8 wurden nach üblichen Verfahren auf den Plasmidvektor pUC19 (von Bethesda Research, P.O.Box 6009, Gaithersburg, Md 20877) übertragen, wobei das Klon pWL3Z8.1 erhalten wurde. Danach wurden die EcoRI-geklonten Fragmente in pUC19 nach der von Maxam und Gilbert (Methods in Enzymology 65:499, 1980) beschriebenen Technik sequenziert. Basierend auf dieser Information wurde die komplette Sequenz des CMV-WL-Hülleproteingens bestimmt. Dieses ist in Schema A dargestellt. Eine weitere Sequenzierung zeigte, daß das Klon pWL3Z8.1 das gesamte (mit Ausnahme des 5'193 bp) CMV-WL RNS3-Molekül, bestimmt durch Vergleich mit der vollständigen Sequenz von CMV-Q RNS3 (Davis and Symons, 1988, Virology 164: im Druck) enthält. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von CMV-WL und CMV-C unterscheiden sich um 22,7% (Schema 2) bzw. 16% (Schema 3).
- Um den CaMV 355 Promotor und das Polyadenylierungssignal anzubringen, wurde ein sich von einer ApaI-Stelle (die sich im intergenen Bereich von RNS3 befindet) bis zu einer EcoRI-Stelle (während des Klonungsversuchs angebracht) erstreckendes Fragment aus dem Lambda-Klon WL3Z8 entfernt und in die Mehrfachklonierstelle des Vektors pDH51 (Pietrzak und Mitarbeiter, 1986) (von Thomas Hohn, Friedrich Miescher Institute, P.O. Box 2543, CH-4002 Basel, Schweiz) ligiert. Dies wurde durch vollständige Verdauung mit ApaI und eine Teilverdauung mit EcoRI von WL3Z8, Schaffung eines stumpfendigen Moleküls außerhalb des geeigneten ApaI bis EcoRI 1090 bp-Fragments (unter Verwendung von Mungobohnennuklease) und anschließendes Ligieren desselben in die Smal-Stelle von pDH51 (vgl. Schema 4) bewerkstelligt. Dieses mit pDH51/CPWL bezeichnete Klon wurde nach der Maxam-Gilbert-Technik sequenziert, um seine Eignung zur Expression in Pflanzen sicherzustellen.
- Das pflanzenexprimierbare Hülleproteingen wurde dann in einen für die durch Agrobacterium vermittelte Genübertragung geeigneten Vektor eingeschleust. Nach teilweiser Verdauung mit EcoRI wurde das EcoRI-bis-EcoRI-Fragment von etwa 1,9kb aus pDH51/CPWL entfernt und in die EcoRI-Stelle des Plasmids pUC1813 (von Robert Kay, Dept. of Chemistry, Washington State University, Pullman, Washington) eingefügt, wobei das Plasmid pUC1813/CPWL entstand. Ein 1,9 kb langes Fragment mit diesem pflanzenexprimierbarem CMV-WL-Hülleproteingen wurde durch teilweise HindIII-Verdauung entfernt und in die HindIII-Stelle des Vektors pGA482 (An, 1986) (erhältlich von Gynehung An, Institute of Biological Chemistry, Washington State University) ligiert. Das Plasmid pGA482 wurde zuvor modifiziert, damit es das pflanzenexprimierbare β-Glucuronidgen entsprechend der WO 89/05858 (auf die Bezug genommen wird) enthält. Das modifizierte Plasmid wird als pGA482/G bezeichnet. Nach Klonung der Expressionskassette wurde das Plasmid als pGA482/CPWL/G (vgl. Schema 5) bezeichnet.
- Dieses Plasmid (oder seine Derivate) kann in dem Fachmann bekannter Weise in Agrobacterium Stämme A208, C58, LBA4404, C58Z707, A4RS, A4RS(pRiB-278b) und andere übertragen werden. Die Stämme A208, C58, LBA4404 und A4RS sind bei ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD. erhältlich. A4R(pRiB278b) ist von Dr. F. Casse-Delbart, C.N.R.A., Routede Saint Cyr, F-78000 Versailles, Frankreich, erhältlich. C58Z707 ist von Dr. A.G. Hepburn, University of Illinois, Urbana, IL. erhältlich. Eine durch Agrobacterium vermittelte Übertragung des pflanzenexprimierbaren CMV-WL- Hülleproteingens erfolgt in dem Fachmann bekannter Weise oder nach in einer US-Patentanmeldung mit der Ser.No. 135 655 vom 21. Dezember 1987 mit dem Titel "Agrobacterium Mediated Transformation of Germinating Plant Seeds", die erneut als PCT-Anmeldung PCT/US88/04464 angemeldet und am 29. Juni 1989 als WO 89/05859 veröffentlicht wurde und auf deren wesentliche Teile hierin Bezug genommen wird, beschriebenen Verfahren. Die Übertragung dieses Gens in eine Pflanzenzelle kann auch nach anderen Verfahren, z.B. durch direkte DNS-Aufnahme (Paszkowski und Mitarbeiter, EMBO J., 1984, 3:2717), Mikroinjektion (Crossway und Mitarbeiter, Mol. Gen. Genet. 202:179), Elektroporation (Fromm und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:5824) oder mittels Hochgeschwindigkeitsmikroprojektilen (Klein und Mitarbeiter, Nature 327:70) bewerkstelligt werden. Schema 1 Nukleotid- und Aminosäuresequenz von CMV-WL Hülleproteingen Schema 2 Vergleich von CMV-WL und CMV-C Hülleproteingenen Schema 3 Vergleich von CMV-WL und CMV-C Hülleproteinen Schema 4 Konstruktion von RDH 51/cpWL Hülleproteingen A-Reste CaMv 35S Poly-A Signal CaMV 35S-Promotor Schema 5 Konstruktion von pGA482/CPWL/G CaMV 35S Poly-A-Signal CaMV 35S-Promotor Hülleproteingen A-Reste gus Gen A-Reste
Claims (8)
1. Hülleproteingen aus dem WL-Stamm von Gurkenmosaikvirus
mit der in Schema 1 dargestellten Sequenz.
2. Pflanzentransformationsvektor mit dem Hülleproteingen
gemäß Anspruch 1, dem 35S-Promotor von
Blumenkohlmosaikvirus und dem Polyadenylierungssignal des
Blumenkohlmosaik 35S-Gens.
3. Bakterienzelle mit dem Pflanzentransformationsvektor
gemäß Anspruch 2.
4. Transformierte Pflanzenzelle mit dem
Pflanzentransformationsvektor nach Anspruch 2.
5. Cucurbitaceae-Pflanze mit transformierten Zellen nach
Anspruch 4.
6. Solanaceae-Pflanze mit transformierten Zellen nach
Anspruch 4.
7. Verfahren zur Produktion einer virusresistenten
Cucurbitaceae-Pflanze durch Fortpflanzung einer das
Hülleproteingen nach Anspruch 1 exprimierenden
Cucurbitaceae-Pflanze.
8. Verfahren zur Produktion einer virusresistenten
Solanaceae-Pflanze durch Fortpflanzung einer das
Hülleproteingen nach Anspruch 1 exprimierenden
Solanaceae-Pflanze.
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