DE68905097T2 - Peptid-molekuele, wirksam gegen gram-positive keime. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereiche der Human- und Veterinärmedizin, des Pflanzenschutzes und der Lebensmittelindustrie, und ihr Gegenstand sind Peptidmoleküle, die bei Gram-positiven Keimen wirksam sind.
• Es ist seit langem bekannt, daß Insekten zu äußerst wirksamen Immunreaktionen imstande sind. Zum Beispiel können bei Insekten alle Arten von chirurgischen Eingriffen ohne die geringsten aseptischen Vorsichtsmaßnahmen durchgeführt werden, und diese Operationen führen niemals zu Sepsis. Dies beruht auf der Tatsache, daß die Immunantwort der Insekten mit einer kurzen Verzögerung, das heißt, in der Größenordnung von vier bis sechs Stunden, eintritt, wobei im allgemeinen die Erzeugung verschiedener antibakterieller Peptide ein großes Wirkungsspektrum bietet.
• So wurde bei den Lepidopteren zwei während der Immunantwort auftretende, antibakterielle Peptidfamilien isoliert und charakterisiert, nämlich die Cecropine und die Attacine.
• Eine Arbeit über eine andere Insektengruppe, die Diptere, ermöglichte die Isolierung und Charakterisierung dreier Moleküle, die einander sehr ähnlich sind, sich aber stark von den Cecropinen unterscheiden, wobei diese Moleküle vollkommen neuartige Antibiotika sind und von diesen Insekten in den Stunden nach einer Verletzung synthetisiert werden. Diese drei Moleküle sind unter der Bezeichnung Diptericin A, B und C bekannt und sind basische, antibakterielle Peptide mit 9K, deren Wirkungsspektrum innerhalb der Gram-negativen Bakterien groß ist (zum Beispiel beträgt die molekulare Masse von Diptericin A 8621 Da). Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden im besonderen im European Journal of Biochemistry, Band 171, S. 17 bis 22, (1988), veröffentlicht. Diese Veröffentlichung behandelt vor allem die Synthese von Molekülen aus Larven des Dipters Phormia terranovae. Diese Studien sind auch Gegenstand von Veröffentlichungen in den COMPTES RENDUS DE L'ACADEMIE DES SCIENCES PARIS, Band 303, Nr. 5, 15. Juli 1986, "Série III SCIENCES DE LA VIE", S. 155-160, Académie des Sciences; E. KEPPI et al.: "IMMUNOLOGIE - Recherches sur les mécanismes de défense antibactérienne chez les insectes; isolement de peptides antibactériens dans l'hémolymphe du Diptère Phormia terranovae" - und der Schrift BIOLOGICAL ABSTRACTS, Band 81, Nr. 11, 1986, S. AB-554, Nr. 102712 Phildelphia, PA., US; E. KEPPI et al.: "Induced antibacterial proteins in the hemolymph of Phormia terranovae (Diptera): Purification and possible origin of the one protein " & INSECT BIOCHEM 16(2); 395-402 (1986).
• Diese neuartigen Moleküle sind jedoch im gereinigten Zustand gegenüber Gram-positiven Keimen nicht oder nur schwach wirksam. Die Diptericine töten die Bakterien in der exponentiellen Wachstumsphase und das Ergebnis ihrer Wirkung ist eine zelluläre Lysis.
• Diesen Schriften zufolge ist tatsächlich eine Aminosäurenanalyse bekannt, die sich auf Peptidsequenzen ohne Cystein bezieht, und die erhaltenen Moleküle weisen eine molekulare Masse in der Größenordnung von 9000 Da auf. Diese Peptidmoleküle sind nur gegen die Gram-negativen Bakterien wirksam.
• Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung sind Peptidmoleküle mit einer Wirkung auf die Gram-positiven Keime.
• Erfindungsgemäß weisen die Moleküle folgende Beschreibung auf: basische Peptide von 40 Aminosäuren, beinhaltend 6 in drei Disulfidbrücken gebundene Cysteine, die aus Larven des Insekts Phormia terranovae nach Immunisierung gewonnen werden können, wobei diese Moleküle gegen Gram-positive Keime wirksam sind.
• Dem besseren Verständnis der Erfindung dient die folgende Beschreibung, die sich auf eine bevorzugte Ausführungsform bezieht, nur als Beispiel und nicht als Einschränkung angeführt ist und mit Bezugnahme auf die beigefügten schematischen Zeichnungen erklärt wird, von welchen:
• Fig. 1 ein Diagramm ist, das die Abtrennung von Proteinen mit Wirksamkeit gegen Micrococcus luteus durch Kationenaustauschchromatographie darstellt, die von immunisierten Larven von Phormia terranovae synthetisiert wurden;
• Fig. 2 und 3 Diagramme sind, welche die Reinigung von zwei Peptidmolekülen durch Umkehrphasen- Hochdruckflüssigchromatographie darstellen, und
• Fig. 4 ein antibakterielles Spektrum eines erfindungsgemäßen Moleküls ist.
• Die Isolierung und Charakterisierung der neuartigen erfindungsgemäßen peptidmoleküle ist wie folgt:
• Larven im dritten Stadium des Dipters Phormia terranovae werden zur Einleitung des Immunisierungsprozesses durch einen Stich mit einer zuvor in einer Bakterienkultur, z.B. Enterobacter cloacae in der exponentiellen Wachstumsphase, kontaminierten Nadel verletzt. Nach 24 Stunden wird durch einen Cuticulaschnitt Blut entnommen und die Blutkörperchen werden durch Zentrifugation mit 36000 g 20 Minuten bei 4ºC abgetrennt. Dann wird der erhaltene Überstand nach Zugabe von Essigsäure 4 Minuten bei 100ºC erwärmt. Nach Zentrifugation der ausgefällten thermolabilen Proteine wird der Überstand auf eine Kationenaustauschsäule aufgebracht, die mit einem Ammoniumacetatpuffer mit 40 mM und pH 6,8 äquilibriert ist. Nachdem die Säule mit demselben Puffer gewaschen wurde, werden die anhaftenden Proteine mit einem linearen Gradienten einer Ammoniumacetatlösung, deren Molarität zwischen 40 mM und 500 mM beträgt, eluiert. Durch diese bekannte Technik können peptide, die gegen Micrococcus luteus wirksam sind, durch einen Verteilungstest auf mit Bakterienkeimen beimpftem Agar oder Gelose isoliert werden. Figur 1 der beigefügten Zeichnungen zeigt das Diagramm der entsprechenden Abtrennung, wobei die antibakterielle Wirksamkeit in Millimeter des Verteilungsdurchmessers auf der linken Ordinate und die Pufferkonzentration in mm. 10&supmin;² auf der rechten Ordinate und das Puffervolumen in ml.10&supmin;² auf der Abszisse eingetragen ist.
• Danach werden die erhaltenen Moleküle auf einem Filter, bekannt unter dem Handelsnamen Sop Pack C18 Waters, gefiltert und durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigchromatographie, üblicherweise als Umkehrphasen-HPLC bezeichnet, auf einer Säule, bekannt als Baker-Bond C18 WP, durch Elution mit einem linearen Acetonitrilgradienten gereinigt. Die Figuren 2 und 3 der beigefügten Zeichnungen zeigen die Entwicklung der Diagramme bei der Reinigung von zwei erfindungsgemäßen Molekülen in bezug auf die Retentionszeit, die in der Abszisse eingetragen ist, und Acetonitrilmenge.
• Das zuvor beschriebene Verfahren ermöglicht die Gewinnung von Anti-Micrococcus luteus Proteinen in reiner Form, die durch die Spitzen A und B in den Figuren 1 bis 3 dargestellt sind. Gemäß einem Merkmal der Erfindung weist das Molekül die folgende Peptidsequenz auf:
• Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung weist das Molekül die folgende Peptidsequenz auf:
• Die oben angeführten Peptidsequenzen sind durch das Vorhandensein von sechs Cysteinen in homologer Position gekennzeichnet, wobei alle Reste mit Ausnahme des Restes 32 identisch sind, der in dem ersten Molekül Glycin und in dem zweiten Molekül Arginin ist. Dieser Austausch erklärt das unterschiedliche Verhalten der genannten Moleküle (A) und (B) in der Kationenaustauschchromatographie, wobei das letztgenannte Molekül (B) einen Rest, das Arginin, aufweist, der mehr positive Ladungen besitzt. Die Spitzen A und B von Figur 1 der beigefügten Zeichnungen entsprechen dem ersten beziehungsweise zweiten genannten Molekül.
• Eine Messung der chemischen Masse der genannten Moleküle (A) und (B) wurde durch Massenspektrometrie in Form von raschem positiven Atombeschuß vorgenommen, wobei eine ausreichend geringe Auflösung mit R gleich 1000 verwendet wurde, so daß die pseudomolekuläre protonierte Masse als homogene Spitze erscheint. Unter diesen Bedingungen betrug die für das Molekül (A) gemessene Molekularmasse 4060,22 Da bei einer erwarteten (berechneten) Masse von 4060,21 Da, und die für Molekül (B) gemessene betrug 4159,16 Da bei einer erwarteten Masse von 4159,35 Da. Diese Messung entspricht der oxydierten Form von sechs Cysteinen, das heißt, umfaßt in bezug auf die Molekularstruktur, die aus der erhaltenen Primärstruktur berechnet wurde, sechs Masseneinheiten weniger, wodurch die Bildung von drei Cysteinbrücken bewiesen ist. Bei einer Messung der monoisotopen Masse konnte bei Molekül (A) eine Masse von 4057,90 Da bei einer erwarteten Masse von 4057,81 Da festgestellt werden.
• Die Aktivität der erfindungsgemäßen Peptidmoleküle wurde bei verschiedenen Bakterienstämmen durch einen Beimpfungstest auf Agar oder Gelose getestet. Zu diesem Zweck wurde ein antibakterielles Spektrum von Molekül (A) mit je 800 ng pro Versuch bei den folgenden Gram-positiven Keimen erstellt:
• 1. Micrococcus luteus, und
• 2. Bacillus megaterium
• 3. bis 7. Bacillus subtilis, entsprechend den Stämmen S3, Mo201, 6633, QB122 und QB935,
• 8. bis 10. Bacillus thuringiensis, entsprechend den Stämmen Smr, Rifr und 53137, und
• 11. Staphylococcus aureus, sowie bei
• 12. bis 14. Escherichia coli, entsprechend den Stämmen D31, BZB1011 und 7624,
• 15. Enterobacter cloacae (Stamm β 12) und
• 16. Pseudomonas aeruginosa.
• Mit dem erhaltenen antibakteriellen Spektrum, das in Figur 4 der beigefügten Zeichnungen dargestellt ist, konnte festgestellt werden, daß die erfindungsgemäßen Moleküle gegen Gram-positive Keime wirksam sind: besonders wirksam gegen Micrococcus luteus und Bacillus megaterium, etwas weniger wirksam gegen die anderen Gram-positiven Keime, nämlich Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis und Staphylococcus aureus, während sie gegen die Gram-negativen Keime, Escherichia coli, Enterobacter cloacae und Pseudomonas aeruginosa, nicht wirksam sind.
• Die neuartigen erfindungsgemäßen Peptidmoleküle können vorteilhaft zur Herstellung eines Medikaments verwendet werden. Ein derartiges Medikament kann vorteilhaft als antibakterielles Mittel dienen.
• Gemäß einem anderen Merkmal der Erfindung weisen die neuartigen Peptidmoleküle bei Gram-positiven Bakterien eine keimtötende Wirkung auf. Diese Eigenschaft wurde durch eine Versuchsreihe in vitro bewiesen. Das Hauptziel der erfindungsgemäßen Moleküle ist die cytoplasmatische Membran der Bakterien. Diese Moleküle sind bakterizid aber nicht bakteriolytisch.
• Die erfindungsgemäßen Moleküle, die vorteilhaft Phormicine (nach dem Namen des Insekts Phormia terranovae) genannt werden könnten, sind neue Antibiotika von verhältnismäßig geringer Größe mit spezifischem Wirkungsspektrum für Gram-positive Keime. Diese Moleküle sind besonders in den Bereichen der Lebensmittelindustrie, des Pflanzenschutzes und der Human- und Veterinärmedizin anwendbar. Ihre Nutzung im Nahrungsmittelbereich, besonders als von Insekten ableitbare antibakterielle Peptide, ist besonders interessant.
• Die Gene der erfindungsgemäßen Moleküle können auch geklont werden und die Gene (oder die komplementäre DNA) können in mehrere Expressionssysteme eingeführt werden, wie zum Beispiel Hefe oder Baculovirus, oder in Fermentern in Masse hergestellt werden. Diese Moleküle können zur Isolierung von Mutanten mit den neuen antibakteriellen Eigenschaften auch in Mutageneseverfahren verwendet werden. Ebenso können die Gene, die für diese Moleküle kodieren, in Pflanzen eingeführt werden, so daß deren Widerstandsfähigkeit gegenüber Krankheitserregern erhöht wird.
• Die erfindungsgemäßen Peptidmoleküle stellen außerdem eine unentbehrliche Ergänzung zu der biotechnologischen Strategie dar, die auf der Verwendung von Cecropinen und Diptericinen beruht, die bei Gram-negativen Bakterien wirksam sind. Überdies stellen ihre geringe Größe und ihre Widerstandsfähigkeit gegenüber Wärmebehandlung und sauren Bedingungen gleichfalls eine äußerst günstige Eigenschaft für eine biotechnologische Nutzung dar. Ferner können diese neuen Moleküle im Bereich der Lebensmittelindustrie während der Herstellung als Mittel dienen, das die Kontamination durch Gram-positive Keime verhindert, und nach der Herstellung als Konservierungsmittel. Im Bereich des Pflanzenschutzes können diese Moleküle anstelle von üblichen chemischen Produkten verwendet werden.
• Bei einer, den spezifischen Anforderungen der Nahrungsmittel- und Pharmaindustrie entsprechenden Wahl von Analogen nach der Mutagenese des Gens, können diese Analoge in Hefe- oder Milchsäurebakterienstämme, die gegenwärtig in der Produktion verwendet werden, eingesetzt werden, so daß schädliche bakterielle Kontaminationen vermieden werden, die manchmal in den Produkten auftreten.
• Im Bereich des Pflanzenschutzes können die Gene, die den Mutanten entsprechen, die wirksame Peptide ergeben, auch in das Genom der gewählten Pflanzen integriert werden, um diesen eine größere Widerstandsfähigkeit gegenüber Krankheiten bakteriellen Ursprungs zu verleihen.
• Die vorliegende Erfindung ist natürlich nicht auf die beschriebenen Angaben und Ausführungsformen beschränkt. Es sind auch andere Angaben und Ausführungsformen möglich, sowie Veränderungen der beschriebenen Angaben und Ausführungsformen, ohne vom geschützten Umfang der Erfindung Abstand zu nehmen.

Claims (9)

1. Peptidmoleküle, gekennzeichnet durch folgende Beschreibung: basische Peptide von 40 Aminosäuren, beinhaltend 6 in drei Disulfidbrücken gebundene Cysteine, die aus Larven des Insekts Phormia terranovae nach Immunisierung gewonnen werden können, wobei diese Moleküle gegen Gram-positive Keime wirksam sind.

2. Moleküle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Peptidreihe aufweist:

3. Moleküle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Peptidreihe aufweist:

4. Verwendung der Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Gewinnung eines Medikaments.

5. Verwendung der Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Gewinnung eines pflanzlichen Heilmittels.

6. Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung als antibakterielles Mittel.

7. Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung als antibakterielles Mittel gegen Gram-positive Keime.

8. Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung als keimtötendes Mittel.

9. Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung als antibakterielles Mittel gegen die Gram-positiven Keime im Bereich der Lebensmittelindustrie.