DE68901781T2 - Enzymsubstrate auf der basis neuer fettsaeureanaloge. - Google Patents
Enzymsubstrate auf der basis neuer fettsaeureanaloge.Info
- Publication number
- DE68901781T2 DE68901781T2 DE8989870019T DE68901781T DE68901781T2 DE 68901781 T2 DE68901781 T2 DE 68901781T2 DE 8989870019 T DE8989870019 T DE 8989870019T DE 68901781 T DE68901781 T DE 68901781T DE 68901781 T2 DE68901781 T2 DE 68901781T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- acid
- fatty acid
- peptide
- analogue
- undecanoic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 title claims description 61
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 title claims description 57
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 title claims description 57
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 title claims description 57
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 29
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 28
- YDNFLXXNJDMLOT-UHFFFAOYSA-N 11-ethylsulfanylundecanoic acid Chemical compound CCSCCCCCCCCCCC(O)=O YDNFLXXNJDMLOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 11
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 9
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000010933 acylation Effects 0.000 claims description 7
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 7
- OGLQEYICTWWJQB-UHFFFAOYSA-N 12-methoxydodecanoic acid Chemical compound COCCCCCCCCCCCC(O)=O OGLQEYICTWWJQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- LETKNKUAHDGLPM-UHFFFAOYSA-N 5-octoxypentanoic acid Chemical compound CCCCCCCCOCCCCC(O)=O LETKNKUAHDGLPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- CKUBYIJWWHKACM-UHFFFAOYSA-N 10-prop-2-ynoxydecanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCOCC#C CKUBYIJWWHKACM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HSRAJJQTYQHRSA-UHFFFAOYSA-N 10-propoxydecanoic acid Chemical compound CCCOCCCCCCCCCC(O)=O HSRAJJQTYQHRSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FKMQVTJQDBCYAK-UHFFFAOYSA-N 10-propylsulfanyldecanoic acid Chemical compound CCCSCCCCCCCCCC(O)=O FKMQVTJQDBCYAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- GGLNIBSAZPKDDR-UHFFFAOYSA-N 11-butoxyundecanoic acid Chemical compound CCCCOCCCCCCCCCCC(O)=O GGLNIBSAZPKDDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RHTZJZZCRZAWHA-UHFFFAOYSA-N 11-ethoxyundecanoic acid Chemical compound CCOCCCCCCCCCCC(O)=O RHTZJZZCRZAWHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WIRNCMWAXLBKCD-UHFFFAOYSA-N 11-methoxyundecanoic acid Chemical compound COCCCCCCCCCCC(O)=O WIRNCMWAXLBKCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 4
- PUCWEEYLJDJFDB-UHFFFAOYSA-N 5-octylsulfanylpentanoic acid Chemical compound CCCCCCCCSCCCCC(O)=O PUCWEEYLJDJFDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 claims description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 2
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 claims 3
- 108010016306 Glycylpeptide N-tetradecanoyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- BMNNCSRHLSXAIT-UHFFFAOYSA-N nonyl 4-nonoxybutanoate Chemical compound CCCCCCCCCOCCCC(=O)OCCCCCCCCC BMNNCSRHLSXAIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 36
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 229940105132 myristate Drugs 0.000 description 25
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 23
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 18
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 16
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 16
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 13
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 12
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 10
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 10
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 10
- TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 2-cyanobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=CC=C1C#N TWJNQYPJQDRXPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 description 9
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 9
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 9
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 8
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 8
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 8
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 8
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 7
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 7
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M hexadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 1-Octanol Chemical compound CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 6
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- -1 C14:0 fatty acid Chemical class 0.000 description 5
- IUDGNRWYNOEIKF-UHFFFAOYSA-N 11-bromo-undecanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCBr IUDGNRWYNOEIKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229950007919 egtazic acid Drugs 0.000 description 4
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 150000002190 fatty acyls Chemical group 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- PGVRSPIEZYGOAD-UHFFFAOYSA-N 10-bromodecanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCBr PGVRSPIEZYGOAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 150000002185 fatty acyl-CoAs Chemical class 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- DUAFKXOFBZQTQE-QSGBVPJFSA-N myristoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCCCCCCCCCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 DUAFKXOFBZQTQE-QSGBVPJFSA-N 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[14C](O)=O TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 2
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- MZRVEZGGRBJDDB-UHFFFAOYSA-N N-Butyllithium Chemical compound [Li]CCCC MZRVEZGGRBJDDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001356 alkyl thiols Chemical class 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethanethiol Chemical compound CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N methyloxidanyl Chemical compound [O]C GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- SJWFXCIHNDVPSH-UHFFFAOYSA-N octan-2-ol Chemical compound CCCCCCC(C)O SJWFXCIHNDVPSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SUVIGLJNEAMWEG-UHFFFAOYSA-N propane-1-thiol Chemical compound CCCS SUVIGLJNEAMWEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 2
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YTBOJQMLLCXWDT-NTMALXAHSA-N (z)-11-ethylsulfanylundec-9-enoic acid Chemical compound CCSC\C=C/CCCCCCCC(O)=O YTBOJQMLLCXWDT-NTMALXAHSA-N 0.000 description 1
- GYSCBCSGKXNZRH-UHFFFAOYSA-N 1-benzothiophene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2SC(C(=O)N)=CC2=C1 GYSCBCSGKXNZRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YYKBWYBUCFHYPR-UHFFFAOYSA-N 12-bromododecanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCCBr YYKBWYBUCFHYPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVEZIHKRYBHEFX-MNOVXSKESA-N 13C-Cerulenin Natural products CC=CCC=CCCC(=O)[C@H]1O[C@@H]1C(N)=O GVEZIHKRYBHEFX-MNOVXSKESA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710186512 3-ketoacyl-CoA thiolase Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-FOEKBKJKSA-N 3654-96-4 Chemical compound C[35S]CC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-FOEKBKJKSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical class [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N Decanoic acid Natural products CCCCCCCCCC(O)=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N Pentane Chemical compound CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- WTXQBCCKXIKKHB-JYJNAYRXSA-N Tyr-Arg-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O WTXQBCCKXIKKHB-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000006959 Williamson synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- YNQLUTRBYVCPMQ-UHFFFAOYSA-N alpha-methyl toluene Natural products CCC1=CC=CC=C1 YNQLUTRBYVCPMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N anhydrous n-heptane Natural products CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- GVEZIHKRYBHEFX-UHFFFAOYSA-N caerulein A Natural products CC=CCC=CCCC(=O)C1OC1C(N)=O GVEZIHKRYBHEFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- GVEZIHKRYBHEFX-NQQPLRFYSA-N cerulenin Chemical compound C\C=C\C\C=C\CCC(=O)[C@H]1O[C@H]1C(N)=O GVEZIHKRYBHEFX-NQQPLRFYSA-N 0.000 description 1
- 229950005984 cerulenin Drugs 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- JNGZXGGOCLZBFB-IVCQMTBJSA-N compound E Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@@H]1C(N(C)C2=CC=CC=C2C(C=2C=CC=CC=2)=N1)=O)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 JNGZXGGOCLZBFB-IVCQMTBJSA-N 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical group SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Natural products C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- RAVVJKCSZXAIQP-UHFFFAOYSA-N methyl 5-bromopentanoate Chemical compound COC(=O)CCCCBr RAVVJKCSZXAIQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZCOBXFFBQJQHH-UHFFFAOYSA-N octane-1-thiol Chemical compound CCCCCCCCS KZCOBXFFBQJQHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- TVDSBUOJIPERQY-UHFFFAOYSA-N prop-2-yn-1-ol Chemical compound OCC#C TVDSBUOJIPERQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 1
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003463 sulfur Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000000101 thioether group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
- C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
- C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
- C07C323/51—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
- C07C323/52—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C59/00—Compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
- C07C59/125—Saturated compounds having only one carboxyl group and containing ether groups, groups, groups, or groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C59/00—Compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
- C07C59/40—Unsaturated compounds
- C07C59/58—Unsaturated compounds containing ether groups, groups, groups, or groups
- C07C59/60—Unsaturated compounds containing ether groups, groups, groups, or groups the non-carboxylic part of the ether being unsaturated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/006—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length of peptides containing derivatised side chain amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
- Diese Erfindung bezieht sich auf neue Fettsäureanalogonsubstrate von myristylierenden Enzymen und insbesondere auf oxy- und thiosubstituierte Fettsäureanaloga, die bei der Fettsäureacylierung von Peptiden und Proteinen verwendbar sind.
- Fettsäureacylierung von spezifischen eukaryotischen Proteinen ist ein gut etabliertes Verfahren, das zweckdienlich in zwei Kategorien unterteilt werden kann. Einerseits wird Palmitat (C&sub1;&sub6;) durch Ester- oder Thioesterbindung posttranslational, wahrscheinlich in der Golgi-Apparatur, an Membranproteine gebunden.
- Andererseits ist es bekannt, daß Myristat (C&sub1;&sub4;) durch Amidbindung früh im Proteinbiosyntheseweg kovalent an lösliche und Membranproteine gebunden wird. Es ist bekannt, daß in den N- myristylierten Proteinen aminoterminale Glycinreste die Acylierungsstelle sind.
- Es hat sich gezeigt, daß eine Reihe von viralen und zellulären Proteinen durch die kovalente Haftung von Myristat durch ein Amid gebunden an Glycin an ihren Aminotermini so modifiziert wird. Ein Beispiel eines am gründlichsten untersuchten myristylierten Proteins ist das transformierende Protein von Rous-Sarkom-Virus, p60v-src.
- Die Myristylierungsreaktion kann wie folgt dargestellt werden: Myristylierungs/enzym
- Weitere Hintergrundinformation über die obige Fettsäureacylierung von Protein kann durch Hinweis auf die folgende Reihe von Artikeln von Wissenschaftlern, die Mitglieder der Washington University School of Medicine sind, erhalten werden:
- Towler und Glaser, Biochemistry 25, 878-84 (1986);
- Towler und Glaser, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83, 2812-2816 (1986);
- Towler et al., Glaser, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84, 2708-2712 (1987);
- Towler et al., J.Biol.Chem. 262, 1030-1036 (1987), und
- Towler et al., Ann.Rev.Biochem., im Druck (1988).
- Außergewöhnliche synthetische Peptide mit relativ kurzen Aminosäuresequenzen, die als Substrate von myristylierenden Enzymen verwendbar sind, sind im US-Patent 4 740 588 beschrieben. Beispiele derartiger Peptide sind:
- Gly-Asn-Ala-Ala-Ala-Ala-Arg-Arg und
- Gly-Asn-Ala-Ala-Ser-Tyr-Arg-Arg.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung sind neue Fettsäureanalogonsubstrate für myristylierende Enzyme vorgesehen. Diese neuen Verbindungen sind oxy- und thiosubstituierte Fettsäureanaloga, die bei der Fettsäureacylierung von Proteinen verwendbar sind. Sie enthalten ein Sauerstoff- oder Schwefelatom anstelle einer Methylen-(CH&sub2;)-gruppe in einer Kohlenstoffstellung von 4 bis 13 in der Fettsäurekette einer C&sub1;&sub3;-C&sub1;&sub4;-Fettsäure oder eines Alkylesters hievon. Das Carboxylkohlenstoffatom wird hier auf Basis herkömmlicher Nomenklatur als Nr. 1 definiert. Bevorzugte Alkylester der Fettsäureanaloga weisen 1 bis 6 Kohlenstoffatome in der Alkylgruppe auf.
- Diese neuen Substratverbindungen sind zum Untersuchen der Regulierung der Enzymwirkung bei der Fettsäureacylierung und der Rolle der N-Myristylierung in der Proteinfunktion verwendbar. Sie können als synthetische Substrate für die N-myristylierenden Enzyme in Quellen, wie Hefen, Weizenkeimlysaten und Säugerzellen, dienen. Diese neuen Verbindungen unterscheiden sich in der Hydrophobizität von Myristinsäure, obwohl sie ungefähr die gleiche Kettenlänge beibehalten. So sollten sie, wenn sie in Myristylproteine eingebaut werden, die anschließenden Wechselwirkungen des Acylproteins mit Membranen oder mit hydrophoben Proteinen ändern. Sie weisen auch potentielle Verwendung als antivirale oder antineoplastische Mittel auf.
- Illustrative Beispiele der neuen oxy- und thiosubstituierten Fettsäureanalogonsubstratverbindungen dieser Erfindung sind:
- A. 11-(Ethylthio)-undecansäure - CH&sub3;CH&sub2;S(CH&sub2;)&sub1;&sub0;COOH
- B. 11-(Ethoxy)-undecansäure - CH&sub3;CH&sub2;O(CH&sub2;)&sub1;&sub0;COOH
- C. 5-(Octylthio)-pentansäure - CH&sub3;(CH&sub2;)&sub7;S(CH&sub2;)&sub4;COOH
- D. 11-(Methoxy)-undecansäure - CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub0;COOH
- E. 12-(Methoxy)-dodecansäure - CH&sub3;O(CH&sub2;)&sub1;&sub1;COOH
- F. 5-(Octyloxy)-pentansäure - CH&sub3;(CH&sub2;)&sub7;O(CH&sub2;)&sub4;COOH
- G. 10-(Propylthio)-decansäure - CH&sub3;(CH)&sub2;S(CH&sub2;)&sub9;COOH
- H. 10-(Propoxy)-decansäure - CH&sub3;(CH&sub2;)&sub2;O(CH&sub2;)&sub9;COOH
- I. 11-(1-Butoxy)-undecansäure - CH&sub3;(CH&sub2;)&sub3;O(CH&sub2;)&sub1;&sub0;COOH
- J. 10-(2-Propinoxy)-decansäure - HC CCH&sub2;O(CH&sub2;)&sub9;COOH.
- Für die obigen oxy- und thiosubstituierten Fettsäureanalogonsubstratverbindungen kann eine andere Nomenklatur verwendet werden. Beispielsweise kann die Verbindung A 12-Thiamyristinsäure, die Verbindung B 12-Oxymyristinsäure und die Verbindung J 13-in- 11-Oxymyristinsäure bezeichnet werden.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung basieren die oxy- und thiosubstituierten Fettsäureanalogonsubstratverbindungen auf gesättigten C&sub1;&sub3;-C&sub1;&sub4;-Fettsäuren, wie durch die obigen Verbindungen A bis H exemplifiziert.
- Die Verbindung I, die ein Fettsäureanalogon auf Basis einer gesättigten C&sub1;&sub6;-Fettsäure ist, ist weniger wirksam als die Analoga auf Basis von C&sub1;&sub3;-C&sub1;&sub4;-Fettsäuren.
- In einer durch die obige Verbindung J illustrierten weiteren Ausführungsform basiert das Fettsäureanalogon auf einer ω-ungesättigten C&sub1;&sub4;-Fettsäure. Es wird angenommen, daß Ergebnisse, wie die mit der letzteren Verbindung erhaltenen, auch mit Fettsäureanaloga basierend auf Δ9,10 cis- und Δ9,10-trans-ungesättigten Fettsäuren, z.B. 12-Thiamyristoleinsäure und 12-Oxymyristelaidinsäure, erzielt werden können.
- Die Herstellung der oxy- und thiosubstituierten Fettsäureanalogonsubstratverbindungen kann durch Verfahren analog der Herstellung von gemischten Ethern durch die Williamson-Synthese durchgeführt werden. So kann eine geeignete ω-Bromcarbonsäure mit einem Alkoholat oder einem Alkylthiol umgesetzt werden, um den oxysubstituierten Fettsäureether bzw. den thiosubstituierten Fettsäureether zu bilden.
- Insbesondere können die Verbindungen der Erfindung durch Verfahren analog der Synthese von heteroatomsubstituierten Analoga von Stearinsäure, wie von Pascal und Ziering, J.Lipid Res. 27, 221-224 (1986), beschrieben, gebildet werden. Unter Anwendung dieser Methoden können die schwefelhaltigen Analoga durch die Kondensation geeigneter Alkylthiole und ω-Bromcarbonsäuren in Anwesenheit einer alkoholischen Base hergestellt werden. Dies kann durch die Herstellung der obigen Verbindung A wie folgt illustriert werden:
- Ähnlich können die sauerstoffhaltigen Analoga durch Umsetzen der ω-Bromsäuren mit alkoholischer Base hergestellt werden. Dies kann durch die Herstellung der obigen Verbindung E wie folgt illustriert werden:
- Br(CH&sub2;)&sub1;&sub1;COOH + CH&sub3;OH + KOH T CH&sub3;O(CH&sub2;)&sub1;&sub1;COOH + KBr + H&sub2;O
- Andere oxy- und thiosubstituierte Fettsäureanalogonsubstratverbindungen der Erfindung können durch ähnliche derartige Methoden durch Selektieren geeigneter Alkyl- und Fettsäurekettenlängen in den Reaktantenverbindungen zum Bilden der gewünschten Produkte hergestellt werden. Beide Reaktionen des obigen Typs werden in organischem Lösungsmittelmedium bei Rückflußtemperaturen durchgeführt, bis die gewünschte Reaktion im wesentlichen beendet ist.
- Obwohl spezifische Verfahren zur Herstellung der neuen Fettsäureanaloga hier beschrieben sind, ist es klar, daß die neuen Verbindungen dieser Erfindung nicht auf irgendein spezifisches Herstellungsverfahren beschränkt sind.
- In einer typischen Verbindung dieser Erfindung, nämlich 11- (Ethylthio)-undecansäure, wurde gefunden, daß das Einführen der Thioethergruppe in die Fettsäurekette unerwartet und überraschenderweise deren Hydrophobizität und die Hydrophobizität der betreffenden Acylpeptide und Fettacylproteine senkt, aber dennoch die Fähigkeit intakt läßt, als Substrat für das Enzym Myristyl- CoA: Protein-N-myristyltransferase (NMT) zu wirken. Die Reinigung und Verwendung dieses Enzyms sind beispielsweise von Towler et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84, 2708-2712 (1987); J.Biol.Chem. 262, 1030-1036 (1987), beschrieben.
- Obwohl die Beschreibung mit Ansprüchen endet, die den Gegenstand, der als die vorliegende Erfindung bildend angesehen wird, besonders herausstreichen und deutlich beanspruchen, wird angenommen, daß die Erfindung aus der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen besser zu verstehen ist, in welchen
- Fig. 1 eine graphische Darstellung ist, die einen Vergleich der kinetischen Merkmale von Myristinsäure und 11-(Ethylthio)- undecansäure mit Weizenkeim-NMT zeigt. Myristyl-CoA und Fettsäureanalogon-CoA wurden durch Inkubieren der Fettsäure oder des Analogons mit CoA-, ATP- und CoA-Ligase erzeugt. Diese Reaktionsmischung wurde zu Weizenkeim-NMT und Gly-Asn-Ala-Ala-Ser- [¹²&sup5;J]Tyr-Arg-Arg in Anwesenheit von 0,03 % Triton X-100 zugesetzt. Die Reaktionsprodukte wurden durch Umkehrphasen-HPLC und γ-Zählung charakterisiert.
- Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, die die C-18 Umkehrphasen-HPLC-Elutionsprofile von Myristyl-GNAASYRR[¹²&sup5;J] und 11- (Ethylthio)-undecanoyl-GNAASYRR[¹²&sup5;J] zeigt. Das Fettsäureanalogon-Acylpeptid eluierte 7 Minuten früher als das entsprechende Myristylpeptid. Das freie Peptid eluierte im Leervolumen (3 bis 5 Minuten).
- Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen 1 bis 15 durch die Synthese und das Testen repräsentativer Verbindungen der Erfindung als Myristylierungsenzymsubstrate detaillierter erläutert. Demgemäß wird die Erfindung zunächst in den Beispielen 1 bis 5 durch die chemische Synthese eines schwefelhaltigen Analogons von Myristinsäure, nämlich 11-(Ethylthio)-undecansäure, CH&sub3;CH&sub2;-S- (CH&sub2;)&sub1;&sub0;COOH, illustriert, das dann in vitro als Weizenkeim-NMT- Substrat getestet wird. Weizenkeim-NMT ist ein Protein ähnlich Hefe-NMT. Die Reinheit und chemische Identität der synthetisierten Verbindung wurden unter Anwendung von ¹H- und ¹³C-NMR sowie Massespektroskopie geprüft. Die Untersuchung, die zum Charakterisieren der Substratspezifität von Weizenkeim-NMT verwendet wurde, mißt die Haftungsrate einer radiomarkierten Fettsäure an einem unmarkierten Peptid. Das synthetisierte Fettsäureanalogon war nichtradioaktiv. Das Peptid Gly-Asn-Ala-Ala-Tyr-Arg-Arg wurde mit Na[¹²&sup5;J] in Anwesenheit von Jodogen markiert. Die Reaktion wurde mit kaltem NaJ durchgeführt, um eine Peptidpopulation zu bilden, die am Tyr&sup6; gleichförmig jodiert war. Erste Versuche zeigten, daß das Fettsäureanalogon die kinetischen Merkmale des Peptidsubstrates nicht signifikant änderte: Km = 3 uM mit Myristinsäure, während Km = 7 uM mit 11-(Ethylthio)-undecansäure. Die scheinbare Höchstgeschwindigkeit ist 2,3-mal höher mit 11- (Ethylthio)-undecansäure als mit Myristinsäure. Das jodierte Peptid wurde bei Sättigungskonzentrationen für alle weiteren Versuche verwendet (40 uM).
- Der CoA (Coenzym A)-Ester des schwefelhaltigen Analogons schien zumindest so gut als Substrat für Weizenkeim-NMT zu sein wie Myristyl-CoA selbst. Fig. 1 zeigt repräsentative Daten eines von drei Versuchen, wobei die kinetischen Merkmale von Myristat und des schwefelhaltigen Analogons mit Weizenkeim-NMT verglichen werden. Der Km-Wert für das Analogon ist 1,5-mal höher als für Myristat, während die Vmax für das Analogon 3,5-mal höher ist. Dieser Unterschied in Km und Vmax zwischen Analogon und Myristat wurde in jedem Versuch festgestellt. Die in vitro- Untersuchung auf NMT-Aktivität erfordert die enzymatische Erzeugung von Fettacyl-CoA. Da die Pseudomonas-Acyl-CoA-Ligase recht nicht- spezifisch ist [Shimizo et al., Anal.Biochem. 107, 193-198 (1980)] und im Überschuß verwendet wird, sollte sie Myristinsäure und 11- (Ethylthio)-undecansäure gleich gut in die entsprechenden CoA- Ester überführen. Es wird daher angenommen, daß die Daten die relative katalytische Effizienz von Fettacyl-CoA und Analogon-CoA für Weizenkeim-NMT darstellen.
- Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung eines 11 000-fach gereinigten Präparats von Hefe-NMT erhalten [Towler et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84, 2708-2712 (1987)]. Km und Vmax für das Analogon waren von jenen der C14:0 Fettsäure nicht zu unterscheiden.
- 11-(Ethylthio)-undecansäure weist ein weiteres interessantes Merkmal auf, von dem angenommen wird, daß es zur Untersuchung der biologischen Rolle von Protein-N-Myristylierung nützlich ist - ihre Hydrophobizität ist nämlich von jener von Myristinsäure signifikant verschieden. Dieser Unterschied war evident, als die HPLC-Elutionsmerkmale von Fettacylpeptiden geprüft wurden. Die Elutionszeit eines besonderen Acylpeptids hängt stark von der Peptidsequenz sowie der an diesem Peptid haftenden Acylkette ab. Beispielsweise sind die Elutionszeiten von Fettacylderivaten von GNAAAARR (in Minuten) Decansäure 9, Dodecansäure 18, Myristinsäure 24 und Palmitinsäure 30. Die Elutionszeiten für Fettacylderivate von GNAAS[¹²&sup5;J]YRR sind 23 bzw. 28 Minuten für C&sub1;&sub2;- bzw. C&sub1;&sub4;- Fettsäure (Fig. 2). 11-(Ethylthio)-undecanoyl-GNAAS[¹²&sup5;J]YRR eluierte 7 Minuten früher als das entsprechende Myristylpeptid (Fig. 2). Dies läßt vermuten, daß die Substitution eines Kohlenstoffatoms durch ein Schwefelatom im Gerüst der Fettsäurekette (zumindest in Stellung 12) eine Wirkung ähnlich der Verkürzung der Kettenlänge der Fettsäure um zwei Kohlenstoffatome hat. Eine derartige Änderung könnte die biologische Wirksamkeit von Myristylproteinen ändern.
- 1 g (3,77 mMol) 11-Bromundecansäure (Aldrich) wurden einer Lösung von 0,279 ml (3,77 mMol) Ethanthiol (Aldrich) und 0,486 g (8,66 Mol) Kaliumhydroxid in 40 ml absolutem Ethanol zugesetzt und 5 h unter einer Stickstoffatmosphäre am Rückfluß gehalten. Nach Abkühlen und Ansäuern mit HCl wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, wobei ein weißer Feststoff erhalten wurde. Der Feststoff wurde in Ethylacetat gelöst und mit Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wurde durch Kieselerdesäulenchromatographie unter Anwendung steigender Konzentrationen von Ethylacetat in Hexan für Elution gereinigt. Das Produkte eluierte bei 25 % Ethylacetat/Hexan. Das Lösungsmitel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wobei 76 mg (8 %) 11-(Ethylthio)-undecansäure erhalten wurden, Fp. 58-61ºC.
- ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 1,24 (t, 3H, J=7,4, CH&sub3;), 1,20-1,40 (bm, 12H, Methylenhülle), 1,48-1,67 (bm, 4H, S-CH&sub2;- COO-CH&sub2;- ), 2,33 (t, 2H, J=7,5 -COOH), 2,49 (t, 2H, J=7,4, S- -CH&sub3;), 2,51 (q, 2H, J=7,4, S- -CH&sub3;), 10,5 (br, 1H, COOH); ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) δ 14,88, 24,70, 25,98, 28,97, 29,08, 29,24*, 29,38, 29,48, 29,69, 31,73, 34,11, 180,05; MS, m/z 246 (M&spplus; 50), 217 [COOH(CH&sub2;)&sub1;&sub0;S&spplus;, 7], 199 (100), 181 (7), 167 (7), 149 (6), 117 (7), 101 (9), 97 (9), 87 (14), 83 (18), 75 (54), 69 (29), 62 (18), 55 (37).
- In einem typischen Versuch wurden 100 ul eines 2 mg/ml Vorrates (ungefähr 2 mM) des Peptids Gly-Asn-Ala-Ala-Ser-Tyr-Arg-Arg mit NaoH auf pH 7,4 eingestellt und mit PSB (30mM Natriumphosphat, pH 7,5, 150 mM NaCl) auf 0,5 ml verdünnt. Diese Lösung wurde einem jodogen (Pierce)-beschichteten Polypropylenrohr zugesetzt und mit trägerfreiem Na¹²&sup5;J (400 uCi) 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Kaltes NaJ wurde dann auf eine Endkonzentration von 2 mM zugesetzt und die Inkubation weitere 15 min fortschreiten gelassen. Die Reaktionsmischung wurde auf eine Einweg-Octadecyl (C&sub1;&sub8;)-Säule (Baker) aufgebracht, die mit 0,05 % Trifluoressigsäure in Wasser voräquilibriert worden war. Na¹²&sup5;J wurde durch Waschen der Säule mit 10 Volumina 0,05 % Trifluoressigsäure/Wasser entfernt. Das Peptid wurde dann mit 25 % Acetonitril/0,05 % Trifluoressigsäure/Wasser eluiert und das Lösungsmittel unter einem Stickstoffstrom entfernt. Das jodierte Peptid wurde in Wasser bei einer Endkonzentration von 2 mg/ml erneut suspendiert. Die spezifische Aktivität des Peptids betrug 100 000 cpm/nMol.
- Verfahren, früher von Towler et al., J.Biol.Chem. 262, 1030- 1036 (1987), für Hefe-NMT entwickelt, wurden für Weizenkeim-NMT- Reinigung mit leichten Modifizierungen angewandt. Alle Schritte wurden, wenn nichts anderes angegeben, bei 4ºC durchgeführt. Protein wurde durch die Methode von Bradford, Anal.Biochem. 72, 248-254 (1986), gemessen. Die NMT-Aktivität wurde, wie von Towler und Glaser, Biochemistry 25, 878-884 (1976), unter Verwendung eines synthetischen Peptids Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Lys-Pro-Lys, das von der N-terminalen Sequenz von p60v-src stammt, untersucht. Dieses Peptid wurde auf Grund seiner höheren Stabilität in rohen Enzymfraktionen im Vergleich mit anderen Peptidsubstraten verwendet. 750 ml Puffer A (20 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2- ethansulfonsäure, pH 7,6, 100 mM Kaliumacetat, 1 mM Magnesiumacetat, 2 mM Calciumchlorid, 1 mM DTT), auf 4ºC vorgekühlt, wurden zu 300 g ungerösteten Weizenkeimen zugesetzt. Die Aufschlämmung wurde 15 s in einem Waring-Mischer homogenisiert. Die Probe wurde dann 20 min bei 27 500 x g zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde durch Gaze filtriert und über Nacht in einem Amicon-Konzentrator mit einer YM30-Membran konzentriert. N-2- Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (pH 7,6) wurde auf eine Endkonzentration von 0,1 M zugesetzt. Folgende Ammoniumsulfatfraktionierung wurde durchgeführt, wie von Towler et al., J.Biol.Chem. 262, 1030-1036 (1987), beschrieben. Nach erneutem Suspendieren der 25 bis 50 % Fraktion in Puffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM DTT, 0,1 mM EGTA, 1 ug/ml jedes der Peptidproteaseinhibitoren Aprotinin, Sojabohnentrypsininhibitor, Leupeptin und Pepstatin) wurde die Probe gegen drei Wechsel von Puffer B (4 l pro Austausch) dialysiert. Die Probe wurde dann vierfach verdünnt und 10 min bei 11 750 x g zentrifugiert. Eine aliquote Menge des Überstandes (90 ml von 420 ml) wurde (bei 200 ml/h) auf eine 5 x 23 cm DEAE-Sepharose CL-6B-Säule (Pharmacia P-L Biochemicals), voräquilibriert mit Puffer C (20 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM DTT) aufgebracht. Die Säule wurde nacheinander mit einem Säulenvolumen Puffer C plus 0, 50, 100 oder 200 mM NaCl gewaschen. Material mit der höchsten spezifischen Aktivität eluierte in der 100 mM NaCl- Wäsche (Fraktionen 59 bis 72) und wurde für weitere Reinigung verwendet. Nach Einengen auf etwa 40 ml mit einer YM30-Membran wurde diese Fraktion gegen Puffer D (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM DTT, 0,1 mM EGTA) plus den oben angegebenen Peptidproteaseinhibitoren dialysiert (2 x 2 l). Danach wurde sie einer 5 ml Aufschlämmung vom Typ V AG-CoA (CoA-Agaroseaffinitätsmatrix; Pharmacia P-L Biochemicals), voräquilibriert mit Puffer D plus Proteaseinhibitoren, zugesetzt. Nach 5 h kontinuierlichem Mischen wurde die Suspension in eine 2,5 cm hohe Säule mit einem Durchmesser von 1,5 cm gegossen und mit drei Säulenvolumina Puffer D gewaschen. Danach folgten aufeinanderfolgende schrittweise Elutionen mit 100, 200 oder 500 mM KCl in Puffer D (jeweils 3 Säulenvolumina). NMT- Aktivität eluierte in den 200 und 500 mM KCl-Wäschen. Diese Fraktionen wurden vereinigt, gegen Puffer E (10 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 1 mM DTT) dialysiert und auf eine Bio-Gel HTP-Säule (5 g Hydroxylapatit; Bio-Rad), wie von Towler et al., J.Biol.Chem. 262, 1030-1060 (1987), beschrieben, aufgebracht. NMT-Aktivität wurde mit 200 mM Kaliumphosphat eluiert. Diese Fraktion wurde konzentriert und mit Puffer D unter Verwendung von Centricon-30- Mikrokonzentratoren (Amicon) dialysiert. Partiell gereinigte NMT wurde bei 4ºC als eine 77 mg/ml Proteinlösung gelagert und nach geeigneter Verdünnung für sämtliche weitere Charakterisierung verwendet. (DTT = DL-Dithiothreitol; EGTA = Ethylenglykol-bis-(β- aminoethylether)-N,N,N' ,N'-tetraessigsäure).
- Die Reinigungsergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben. Tabelle I Partielle Reinigung von Weizenkeim-NMT Fraktion Volumen* (ml) Proteinkonzentration (mg/ml) spezifische Aktivität (Einh.**/mg) fache Reinigung % Ausbeute Anfangsextrakt 25-50 % Ammoniumsulfatfraktion DEAE-Säule CoA-Säule Hydroxyapatitsäule * Volumina des Anfangsextraktes und der in dieser Tabelle angegebenen Ammoniumsulfatfraktion sind 20 % der bei diesen Reinigungsstufen tatsächlich verwendeten Volumina, da nur 20 % der Probe für nachfolgende Reinigungsschritte verwendet wurden. ** Eine Aktivitätseinheit wird als 1 pMol gebildetes Acylpeptid/min definiert.
- Tests auf NMT-Aktivität wurden unter Anwendung eines von Towler und Glaser, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83, 2812-2816 (1986), früher detailliert angegebenen Verfahrens durchgeführt. Kurz gesagt, mißt die in vitro-Untersuchung den Transfer von radiomarkierter Fettsäure von Acyl-CoA zu einem synthetischen Peptidsubstrat. Das Acylpeptidprodukt wird durch Umkehrphasen-HPLC identifiziert. Zeit- und Enzymabhängigkeit wurden durch Variieren der Reaktionszeit oder der Enzymkonzentration bewertet. Es wurde gefunden, daß eine Reaktionszeit von 10 min im linearen Bereich für Produktbildung war (Daten nicht gezeigt). Fettsäurespezifität wurde geprüft, im wesentlichen wie von Towler et al., J.Biol.Chem. 262, 1030-1036 (1987), beschrieben, ausgenommen daß das Peptid Gly-Ser-Ser-Lys-Ser-Lys-Pro-Lys anstelle von Gly-Asn-Ala-Ala-Ala- Ala-Arg-Arg verwendet wurde, um Palmitat- und Myristatverwertung durch Weizenkeim-NMT zu vergleichen. Dies war auf Grund der Anwesenheit eines großen, peptidunabhängigen Peaks notwendig, das mit einem Palmitoyl-Gly-Asn-Ala-Ala-Ala-Ala-Arg-Arg-Standard coeluierte. [³H]Palmitat und [³H]Myristat wurden in diesem Vergleich verwendet. [¹&sup4;C]Fettsäuren wurden zum Vergleichen von C&sub1;&sub0;-, C&sub1;&sub2;-und C&sub1;&sub4;-Kettenlängen verwendet. Fettacyl-CoA-Konzentrationen in diesen Untersuchungen wurden durch eine Modifizierung der Methode von Hosaka et al., Methods Enzymol. 71, 325-333 (1981), bestimmt.
- Gly-Asn-Ala-Ala-Ser-[¹²&sup5;J]-Tyr-Arg-Arg, wie im obigen Beispiel 2 hergestellt, wurde in einem in vitro-Myristylierungssystem getestet, das gegenüber dem mit radiomarkierten Fettsäuren verwendeten modifiziert wurde. Um den Km-Wert des Peptids mit Myristinsäure und dem Thioetheranalogon als Substrate zu bestimmen, wurden kaltes Myristat und 11-(Ethylthio)-undecansäure im Acyl- CoA-Erzeugungssystem [Towler et al., J.Biol.Chem. 262, 1030-1036 (1987); Towler und Glaser, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83, 2812-2816 (1986)] bei einer Endkonzentration von 5 uM verwendet. 20-mal mehr Weizenkeim-NMT (480-fach gereinigt wie im obigen Beispiel 3) wurde für diese Untersuchungen verwendet wie für Untersuchungen, die [³H]Myristat verwendeten. Es wurde gefunden, daß diese Menge von NMT im linearen Bereich von Enzymkonzentration ist (Daten nicht gezeigt). Doppelte reziproke graphische Darstellungen wurden für das jodierte Peptid sowohl mit Myristinsäure als auch dem Schwefelanalogon durch Ändern der Peptidkonzentration in Anwesenheit einer konstanten Menge von Fettsäure oder Analogon erzeugt. Zur Bestimmung des Km-Wertes von 11-(Ethylthio)- undecansäure und kalter Myristinsäure als deren CoA-Ester wurden Sättigungskonzentrationen von jodiertem Peptid (40 uM) verwendet und die Höhe der Fettsäure oder des Analogons variiert. Die Untersuchungen enthielten 0,03 % Triton X-100, um die Löslichkeit der Fettsäuren aufrechtzuerhalten. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt.
- Andere illustrative Beispiele der oxy- und thiosubstituierten Fettsäureanalogonsubstratverbindungen der Erfindung wurden in den Beispielen 6 bis 14 synthetisiert und in Beispiel 15 als Substrate für die Hefe-NMT getestet. Ein Vergleich der kinetischen Merkmale dieser Analogonsubstrate unter Verwendung von Myristinsäure als Standard ist in Tabelle II angegeben.
- Für diese Beispiele ist jedes synthetisierte Analogon durch ¹H- und ¹³C-NMR sowie Massespektroskopie charakterisiert. Die Analoga sind dann als NMT-Substrate kinetisch charakterisiert. Kurz gesagt, werden Fettsäureanaloga mit Pseudomonas CoA-Ligase in ihre CoA-Ester überführt und mit dem jodierten Peptid GNAAS[¹²&sup5;J]YRR und einer Quelle von NMT inkubiert. Km und Vm des Peptids werden zuerst durch variierende Peptidkonzentration mit Fettsäureanalogon bei 15 uM (im allgemeinen eine Sättigungskonzentration) bestimmt. Das radiomarkierte Peptid wird dann bei Konzentrationen, die zu 50 % Enzymsättigung (d.h. bei seinem Km) führen, zur Bestimmung der kinetischen Merkmale des Fettsäureanalogons verwendet. Repräsentative Analoga mit Schwefel oder Sauerstoff im Gerüst der Fettsäurekette dienen als gute Substrate für NMT in vitro und konkurrieren um den Einbau von ³H-markiertem Myristat in Hefeproteine in vivo. Außerdem unterscheiden sich diese Analoga markant in der Hydrophobizität von Myristat, wie sowohl durch C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-HPLC-Elutionsprofile als auch durch 2-Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten gemessen. Das Analogon CH&sub3;O(CH&sub2;)&sub1;&sub1;COOH beispielsweise verteilt sich in Wasser 20-mal besser als Myristat. Es wird angenommen, daß diese Analoga in Säugeracylproteine in vivo eingebaut werden und daß ihr Einbau in diese Proteine Proteinbehandlung oder -zielsetzung drastisch ändert. Es wird weiters angenommen, daß der Einbau von Fettsäureanaloga sowohl von Myristat als auch Palmitat in esterverknüpfte und phosphatidiylinositglycanverknüpfte Acylproteine deren Eigenschaften ebenfalls dramatisch ändert. Da viele Virusproteine und Onkogene acyliert sind, stellen diese Verbindungen eine neue Klasse von potentiellen antiviralen und antineoplastischen Mitteln dar.
- 2,25 g (8,47 mMol) 11-Bromundecansäure wurden einer Lösung von 2,15 g (38,3 mMol) Kaliumhydroxid in 20 ml absolutem Ethanol zugesetzt und 7 h am Rückfluß gehalten. Nach Abkühlen und Ansäuern mit HCl wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, wobei ein weißer Feststoff erhalten wurde. Die Probe wurde in Äthylacetat gelöst und mit Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wurde durch Kieselerdesäulenchromatographie in 1 % Diethylether/0,3 % Ameisensäure/Methylenchlorid gereinigt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wobei 680 mg (35 %) 11-(Ethoxy)-undecansäure erhalten wurden, Fp. 44-45,5ºC.
- ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 1,20 (t, 3H, J=7,0, CH&sub3;), 1,24-1,40 (bm, 12H, Methylenhülle), 1,52-1,68 (bm, 4H, O-CH&sub2;- ; -CH&sub2;-COOH), 2,34 (t, 2H, J=7,5, -COOH), 3,41 (t, 2H, J=6,8, O- -CH&sub2;), 3,48 (q, 2H, J=7,0, O- -CH&sub3;), 10,25 (br, 1H, COOH); ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) δ 15,27, 24,75, 26,23, 29,11, 29,26, 29,40, 29,55*, 29,80, 34,12, 66,06, 70,76, 179,71; m/z 231 (M+H&spplus;).
- 8,3 ml (22,1 mMol) n-Butyllithium wurden tropfenweise einer Lösung von 2,9 g (19,8 mMol) Octanthiol (1) in 198 ml trockenem THD bei 0ºC zugesetzt. Nach Rühren während 30 min bei 0ºC wurde eine Lösung von 4,2 g (21,6 mMol) Methyl-5-brompentanoat (2) in 43 ml trockenem THF tropfenweise zugesetzt und die erhaltene heterogene Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde konzentriert und der Rückstand zwischen Ether und gesättigtem NH&sub4;Cl aufgeteilt. Nach nochmaligem Extrahieren der wässerigen Schicht mit Ether wurden die vereinigten organischen Extrakte mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und konzentriert. Reinigung durch Destillation bei vermindertem Druck (140 bis 145ºC bei 2 mMol) ergab 4,4 g (86 %) des Titelproduktes.
- ¹H-NMR-Daten, δ 3,63 (s, 3H, OCH&sub3;), 2,48 (q, 4H, j=6,8 Hz, CH&sub2;-S- CH&sub2;), 2,30 (t, J=7,0 Hz, CH&sub2;CO&sub2;CH&sub3;), 1,78-1,48 (bm, 6H, CH&sub2;'s β zu Thio- und Estergruppen), 1,43-1,15 (bs, 1=, CH&sub2;'s), 0,85 (t, J=6,6 Hz, CH&sub2;); ¹³C-NMR-Daten: δ 173,7, 51,4, 33,5, 32,1, 31,7, 31,6, 29,6, 29,1 (2), 29,0, 28,8, 24,1, 22,5, 14,0.
- 1,24 g (31,0 mMol) NaOH wurden einer Lösung von 4,25 g (16,3 mMol) Methyl-6-thiotetradecanoat in 55 ml trockenem Methanol zugesetzt und die erhaltene Mischung auf Rückfluß gebracht. Nach 5 h wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt, mit 100 ml Wasser verdünnt und mit 1 M HCl auf einen pH von 3 angesäuert. Diese angesäuerte Lösung wurde zweimal mit Äther extrahiert und die vereinigten organischen Extrakte wurden zweimal in Wasser und zweimal in Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und konzentriert. Säulenchromatographie (Ethylacetat/Pentan, 1:9) des Rückstandes ergab 1,4 g (35 %) Produkt. ¹H-NMR-Daten, δ 2,46 (q, 4H, J=7,6 Hz, CH&sub2;SCH&sub2;), 2,33 (t, 2H, J=7,2 Hz, CH&sub2;CO&sub2;H), 1,75- 1,45 (bm, 6H, CH&sub2;'s β zu Thio- und Estergruppen), 1,38-1,15 (bs, 10H, CH&sub2;'s), 0,83 (t, 3H, J=6,6 Hz, CH&sub3;); ¹³C-NMR-Daten: 179,4, 33,5, 32,1, 31,8, 31,6, 29,7, 29,1 (2), 28,9 (2), 23,8, 22,6, 14,0; m/z (E1): 246, 145 (100 %), 115, 101, 88, 69.
- 10,0 g (37,7 mMol) 11-Bromundecansäure wurden einer Lösung von 24,3 g (433 Mol) Kaliumhydroxid in 280 ml Methanol zugesetzt und 5 h am Rückfluß gehalten. Nach Abkühlen und Ansäuern mit HCl wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Die Probe wurde in Ethylacetat gelöst und mit Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wurde durch Kieselerdesäulenchromatographie unter Verwendung steigender Konzentrationen von Ethylacetat in Hexanen für Elution gereinigt. Das Produkt eluierte in 25 % Ethylacetat in Hexanen. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wobei 200 mg (2,5 %) 11-(Methoxy)-undecansäure erhalten wurden, Fp. 31-32ºC. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 1,1-1,3 (bm, 12H, Methylenhülle), 1,45- 1,63 (bm, 4H, O- -CH&sub2;; -CH&sub2;-COOH), 2,34 (t, 2H, J=7,3 - COOH), 3,45 (s, 3H ), 3,50 (t, 2H, J=6,8, O- ), 10,70 (br, COOH); ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) δ 24,64, 26,00, 29,00, 29,16, 29,29, 29,40, 34,00, 58,23, 72,81, 179,17; m/z 216 (M&spplus;).
- 2,0 g (7,16 mMol) 12-Bromdodecansäure wurden einer Lösung von 1,61 g (28,65 Mol) Kaliumhydroxid in 30 ml Methanol zugesetzt und 20 h am Rückfluß gehalten. Nach Abkühlen und Ansäuern mit HCl wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Die Probe wurde in Ethylacetat gelöst und mit Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wurde durch Kieselerdesäulenchromatographie in 1 % Diethylether/0,3 % Ameisensäure/Methylenchlorid gereinigt, wobei 640 mg (39 %) 12-(Methoxy)- dodecansäure erhalten wurden, Fp. 45-47ºC.
- ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 1,20-1,45 (bm, 15H, Methylenhülle), 1,51-1,69 (bm, 4H, O-CH&sub2;- ; -CH&sub2;-COOH), 2,34 (t, 2H, J=7,4, -COOH), 3,34 (s, 3H, O-CH&sub3;), 3,38 (t, 2H, J=6,7, O- ), 10,99 (br, 1H, ); ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) δ 24,75, 26,16, 29,10, 29,27, 29,38, 29,44, 29,53, 34,12, 58,50, 72,97, 179,70; m/z 231 (M+H&spplus;).
- 2 g (11,0 mMol) 12-Brompentansäure wurden einer Lösung von 2,48 g (44,2 Mol) Kaliumhydroxid in 20 ml 1-Octanol zugesetzt und 27 h bei 97ºC gerührt. Nach Abkühlen wurde das Produkt bei pH = 1 mit Ethylacetat und Wasser extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel entfernt. 1- Octanol wurde durch Kurzweg- (Kugelrohr)-destillation (50 bis 70ºC, 0,5 mm Hg) entfernt. Um vollständige Spaltung des Octylesters zu gewährleisten, wurde der Rückstand 3 h mit Methanol/Wasser/KOH (50 %/50 %/2,5 g, 40 ml) bei 25ºC gerührt. 1-Octanol wurde in Ethylacetat bei pH = 12 extrahiert. 5-(Octyloxy)-pentansäure wurde nach Einstellen des pH mit HCl auf 1,5 aus der wässerigen Phase in Ethylacetat extrahiert. Nach Trocknen über Natriumsulfat wurde das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt. Kieselerdesäulenchromatographie in 10 % Ethylacetat/Hexan/0,3 % Ameisensäure ergab 235 mg (9 %) 5-(Octyloxy)-pentansäure, Fp. < 30ºC.
- ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 0,88 (t, 3H, J=6,6), 1,18-1,39 (bm, 10H, Methylenhülle), 1,48-1,77 (bm, 6H, CH&sub2;OCH&sub2; , CH&sub2;COOH), 2,39 (t, 2H, J=7,1, COOH), 3,34-3,49 (bm, 4H, O ), 10,66 (br, 1H, COOH); ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) 14,18, 21,59, 22,73, 26,22, 29,03, 29,32, 29,51, 29,72, 31,89, 33,85, 70,22, 71,07, 179,55; m/z 231 (M+H).
- 1,0 g (3,98 mMol) 10-Bromdecansäure wurde einer Lösung von 0,893 g (15,9 mMol) Kaliumhydroxid in 30 ml 1-Propanthiol und 30 ml Methanol zugesetzt und 18 h bei 69ºC gerührt. Die Reaktionsmischung wurde nach Zusatz von 20 ml Wasser auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Nach Ansäuern auf pH = 1 und Extrahieren in Ethylacetat wurde die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt, wobei ein weißes kristallines Pulver erhalten wurde. Das Produkt wurde durch Kieselerdesäulenchromatographie in 8 % Ethylacetat/Hexan/0,3 % Ameisensäure und Umkristallisation aus Hexan gereinigt, wobei 210 mg (21 %) 10-(Propylthio)-decansäure erhalten wurden, Fp. 42-43,5ºC.
- ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 0,96 (t, 3H, J=7,3, ), 1,15-1,40 (bm, 10H, Methylenhülle), 1,49-1,64 (bm, 6H, CH&sub3; CH&sub2;SCH&sub2; , CH&sub2;COOH), 2,32 (t, 2H, J=7,6 COOH), 2,40-2,55 (bm, 4H, CH&sub3;CH&sub2; S ), 10,93 (br, 1H, COO ); ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) δ 13,64, 23,09, 24,71, 28,96, 29,07, 29,13, 29,24, 29,36, 29,77, 32,16, 34,10, 34,28, 179,98; m/z 247 (M+H).
- 1,0 g (3,98 mMol) 10-Bromdecansäure wurde einer Lösung von 0,893 g (15,9 mMol) Kaliumhydroxid in 30 ml n-Propanol zugesetzt und 18 h bei 102ºC gerührt. Die Reaktionsmischung wurde nach Zusatz von 20 ml Wasser auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Nach Ansäuern auf pH = 1 und Extrahieren in Ethylacetat wurde die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt, wobei ein gelbes Öl erhalten wurde. Das Produkt wurde durch Kieselerdesäulenchromatographie in 2 % Diethylether/Methylenchlorid/0,2 % Ameisensäure und dann in 7 % Ethylacetat/Hexan/0,3 % Ameisensäure gereinigt. Umkristallisation aus Hexan bei -20ºC ergab 74 mg (12 %) 10-(Propoxy)-decansäure, Fp. < 30ºC.
- ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 0,91 (t, 3H, J=7,5 ), 1,18-1,40 (br, 10H, Methylenhülle), 1,48-1,67 (bm, 6H, CH&sub3; CH&sub2;OCH&sub2; , CH&sub2;COOH), 2,33 (t, 2H, J=7 4 COOH), 3,31-3,45 (bm, 4H, O ), 10,37 (br, 1H, COOH); ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) δ 10,67, 22,94, 24,72, 26,19, 29,09, 29,22, 29,41, 29,74, 34,11, 70,88, 72,53, 179,69; m/z 231 (M+H).
- 2,0 g (17,5 mMol) 11-Bromdecansäure wurden einer Lösung von 1,7 g (30,2 mMol) Kaliumhydroxid in 20 ml 1-Butanol zugesetzt und die Lösung 5 h bei 40ºC gerührt. Nach Abkühlen wurde die mit Ethylacetat und Wasser bei pH = 2 extrahiert. Die organische Phase wurde dann mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über Natrium sulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wurde durch Kieselerdesäulenchromatographie in 2-10 % Ethylacetat/Hexan/0,2 % Ameisensäure gereinigt, wobei 336 mg (17 %) 11-(1-Butoxy)-undecansäure erhalten wurden, Fp. 29- 30,5ºC.
- ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 0,84-0,96 (t, 3H, J=7,3, ), 1,18-1,46 (bm, 14H, Methylenhülle), 1,47-1,68 (bm, 6H, CH&sub2;OCH&sub2; , CH&sub2;COOH), 2,31 (t, 2H COOH), 3,32-3,46 (bm, 4H, O ), 11,02 (br, 1H, COOH); ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) δ 14,02, 19,43, 24,74, 26,21, 29,11, 29,28, 29,35, 29,56, 29,64, 29,76, 31,85, 34,14, 70,63, 70,94, 179,82; m/z 259 (M+H).
- 420 mg (8,75 mMol) Natriumhydrid wurden zu 68 ml (1,17 Mol) Propargylalkohol bei 4ºC zugesetzt und 30 min bei 25ºC gerührt. 2 g (7,96 mMol) 10-Bromdecansäure wurden dieser Mischung zugesetzt und die Reaktionsmischung 48 h bei 98ºC gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser und Ethylacetat bei pH = 0 extrahiert. Nach Trocknen der organischen Phase über Natriumsulfat wurde das Lösungsmittel bei vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wurde durch Silikagelchromatographie in 7-10 % Ethylacetat/Hexan/0,3 % Ameisensäure und dann über einer zweiten Silikagelsäule in 1-2,5 % Ethylacetat/Benzol/0,3 % Ameisensäure gereinigt, wobei 245 mg (14 %) 10-(2-Propinoxy)-decansäure erhalten wurden, Fp. < 30ºC.
- ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;) δ 1,25-1,42 (br, 10H, Methylenhülle), 1,54-1,70 (bm, 4H, OCH&sub2; , CH&sub2;COOH), 2,35 (t, 2H, J=7,4, COOH), 2,43 (t, 1H, J=2,3, HC=C), 3,52 (t, 2H, J=6,8, O ), 4,14 (d, 2H, J=2,5, C=C O), 10,42 (br, 1H, COO ); ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl&sub3;) δ 24,68, 26,06, 29,04, 29,17, 29,35*, 29,46, 34,09, 57,95, 70,22, 74,09, 79,90, 180,02; m/z 227 (M+H).
- Saccharomyces cerevisiae Stamm BJ405 [MATα, trpl, prbl, prcl, pep4-3; Hemmings et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78, 435-439 (1981)] (früher als JR153 bezeichnet) wurde in YPD-Medium (1 % Hefeextrakt/2 % Bactopepton/2 % Dextrose) bei 30ºC in einem Wasserbad mit Rotationsschüttler auf mid-log-Phase gezüchtet. Zellen wurden mit Cerulenin bei 2 ug/ml 15 min vorbehandelt und dann 20 bis 45 min mit unmarkiertem Myristat, Palmitat oder Fettsäureanalogon bei 100 uM in Anwesenheit von entweder 5 uM [9,10-³H(N)]Myristat (22,4 Ci/mMol) oder L-[³&sup5;S]Methionin (1106 Ci/mMol) bei 30 uCi/ml Kultur inkubiert.
- Die Zellen wurden 5 min auf Eis gekühlt, bei 10 000 x g pelletisiert, dann gebrochen und durch die Methode von Towler et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83, 2812-2816 (1986), extrahiert. Gesamtproteinsynthese wurde durch Trichloressigsäure (TCA)-Ausfällung untersucht. Proteine wurden durch SDS-12 % Polyacrylamidgel-Elektrophorese getrennt und [³H]-Fettsäureeinbau in zelluläre Acylproteine wurde durch Autoradiographie gefolgt von Laserdensitometrie untersucht.
- Inkubation von Zellen mit dem 12-(Methoxy)-dodecansäureanalogon resultierte in einer 35 bis 60 %igen Reduktion des Einbaus von [³H]Myristat in ein bekanntes Hefemyristylprotein von Mr 20 kDa [Towler et al., PNAS 83, 2812-2816 (1986)] im Vergleich mit Kontrollzellen, die entweder mit [³H]Myristat allein (d.h. kein Analogon) oder 100 uM Palmitat inkubiert wurden. Im Gegensatz dazu führt der Zusatz von [³H]Myristat und 100 uM Myristat zu einer 75 bis 80 %igen Verminderung des Einbaus von [³H]Myristat in dieses zelluläre Acylprotein.
- Das Analogon scheint nicht für Zellen toxisch zu sein. Es wurde kein Unterschied in den Wachstumsraten zwischen mit 100 uM Myristat und 100 uM Analogon behandelten Zellen festgestellt. Weiterhin ergaben 100 uM Myristat und 100 uM Analogon eine ähnliche mäßige Verminderung (10 bis 15 %) in der Gesamtproteinsynthese (gemessen durch den Einbau von [³&sup5;S]Methionin in TCA- ausfällbares Protein) im Vergleich mit Kontrollzellen, die keiner exogenen Fettsäure ausgesetzt wurden.
- Miteinander zeigen diese Ergebnisse, daß das Analogon erfolgreich in Hefe eindringen und mit markiertem Myristat zum Einbau in ein bekanntes Myristylprotein konkurrieren kann. Tabelle II Kinetik von Fettsäureanaloga Analogon Elutionszeit (min) Peptid Acyl-CoA * Myristatkontrolle
- Es ist ersichtlich, daß der Km-Wert für jedes der Analoga höher ist als für Myristat, während die Vmax für die Analoga in den meisten Fällen höher ist.
- Standardaminosäureabkürzungen werden hier verwendet, um die Sequenz der Peptide hier wie folgt zu identifizieren: Aminosäure Abkürzung L-Alanin L-Arginin L-Asparagin L-Asparaginsäure L-Glutamin L-Glycin L-Leucin L-Lysin L-Prolin L-Serin L-Tyrosin L-Valin
- Verschiedene andere Beispiele sind für den Fachmann nach Lesen der vorliegenden Offenbarung offensichtlich, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Alle anderen derartigen Beispiele sind im Umfang der folgenden Ansprüche eingeschlossen.
Claims (15)
1. Oxy- oder thiosubstituierte Fettsäureanalogverbindung mit
Aktivität als Substrat von myristylisierenden Enzymen, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus C&sub1;&sub3;- oder C&sub1;&sub4;-Fettsäuren oder
Alkylestern hievon, worin eine normalerweise an einer
Kohlenstoffstellung von 4 bis 13 vorhandene Methylengruppe durch Sauerstoff oder
Schwefel ersetzt ist, jedoch mit Ausnahme der yerbindung
γ-Nonyloxybutansäurenonylester.
2. Verbindung nach Anspruch 1, worin eine Methylengruppe
durch Sauerstoff ersetzt ist.
3. Verbindung nach Anspruch 1, worin eine Methylengruppe
durch Schwefel ersetzt ist.
4. Verbindung nach Anspruch 1, worin die Fettsäure eine
gesättigte C&sub1;&sub3;- oder C&sub1;&sub4;-Fettsäure ist.
5. 11-(Ethylthio)-undecansäure.
6. 11-(Ethoxy)-undecansäure.
7. 5-(Octylthio)-pentansäure.
8. 11-(Methoxy)-undecansäure.
9. 12-(Methoxy)-dodecansäure.
10. 5-(Octyloxy)-pentansäure.
11. 10-(Propylthio)-decansäure.
12. 10-(Propoxy)-decansäure.
13. 11-(1-Butoxy)-undecansäure.
14. 10-(2-Propinoxy)-decansäure.
15. Verfahren zur Acylierung eines Peptids oder Proteins,
umfassend das Umsetzen des CoA-Esters einer oxy- oder
thiosubstituierten Fettsäureanalogverbindung nach Anspruch 1 mit dem
Peptid oder Protein in Gegenwart einer Quelle von
N-Myristoyltransferase.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US15177488A | 1988-02-03 | 1988-02-03 | |
| US20819288A | 1988-06-16 | 1988-06-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE68901781D1 DE68901781D1 (de) | 1992-07-23 |
| DE68901781T2 true DE68901781T2 (de) | 1993-01-07 |
Family
ID=26848957
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE8989870019T Expired - Fee Related DE68901781T2 (de) | 1988-02-03 | 1989-02-01 | Enzymsubstrate auf der basis neuer fettsaeureanaloge. |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5871954A (de) |
| EP (1) | EP0327523B1 (de) |
| JP (1) | JPH021425A (de) |
| CA (1) | CA1339220C (de) |
| DE (1) | DE68901781T2 (de) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5151445A (en) * | 1988-02-03 | 1992-09-29 | Washington University | Method of inhibiting parasitic activity |
| US5082967A (en) * | 1988-06-16 | 1992-01-21 | Washington University | Novel fatty acid analog enzyme substrates |
| DK0480901T3 (da) * | 1990-10-12 | 1996-08-05 | Univ Washington | Azidosubstituerede fedtsyreanalogenzymsubstrater |
| US5236955A (en) * | 1992-04-10 | 1993-08-17 | Washington University | Anti-fungal agent |
| US5599947A (en) * | 1993-01-14 | 1997-02-04 | G. D. Searle & Co. | Fatty acid analogs and prodrugs |
| US5859052A (en) * | 1993-01-14 | 1999-01-12 | G. D. Searle & Co. | Fatty acid analogs and prodrugs |
| JP2003514855A (ja) * | 1999-10-13 | 2003-04-22 | チャコン，マルコ，エー． | カロリー制限の効果を模倣した治療的介入 |
| JP2012526129A (ja) * | 2009-05-04 | 2012-10-25 | ワシントン・ユニバーシティ | 脂肪酸代謝および貯蔵を画像化するためのｐｅｔ放射性追跡子 |
| EP3441382B1 (de) | 2016-04-05 | 2023-08-30 | Moresco Corporation | Oxasäureverbindung |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE745312C (de) * | 1941-10-17 | 1944-03-31 | Ig Farbenindustrie Ag | Verfahren zur Herstellung von Estern veraetherter aliphatischer Oxycarbonsaeuren |
| US4740588A (en) * | 1986-08-07 | 1988-04-26 | Washington University | Novel substrate peptides |
| US4709012A (en) * | 1986-08-07 | 1987-11-24 | Washington University | Novel inhibitor peptides |
| US5093517A (en) * | 1987-03-09 | 1992-03-03 | The Goodyear Tire & Rubber Company | Method for the esterification of thiopropionates |
-
1989
- 1989-02-01 EP EP89870019A patent/EP0327523B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-01 DE DE8989870019T patent/DE68901781T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-02-02 CA CA000589919A patent/CA1339220C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-02-02 JP JP1024752A patent/JPH021425A/ja active Pending
-
1993
- 1993-07-15 US US08/091,550 patent/US5871954A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-07-15 US US08/091,549 patent/US5959145A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0327523B1 (de) | 1992-06-17 |
| CA1339220C (en) | 1997-08-05 |
| US5959145A (en) | 1999-09-28 |
| US5871954A (en) | 1999-02-16 |
| JPH021425A (ja) | 1990-01-05 |
| DE68901781D1 (de) | 1992-07-23 |
| EP0327523A1 (de) | 1989-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vogel et al. | Glutamic γ-semialdehyde and Δ1-pyrroline-5-carboxylic acid, intermediates in the biosynthesis of proline1, 2 | |
| DE69423915T2 (de) | Dichtgepackte polykationische ammonium, sulfonium und phosphonium lipide | |
| JP4638413B2 (ja) | セラミド型化合物の新規な合成方法 | |
| DE3785864T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von menschlichem Epidermalwachstumsfaktor und dessen Analogen. | |
| DE68901781T2 (de) | Enzymsubstrate auf der basis neuer fettsaeureanaloge. | |
| DE69700561T2 (de) | Verfahren zur Entfernung von N-Terminalem Methionin | |
| DE69510338T2 (de) | Azirdin-derivate, deren herstellung und verwendung | |
| DE69430321T2 (de) | Verbindung geeignet zur einführung von wenigstens einem molekül in eine zelle | |
| AU738857B2 (en) | Colchicine and thiocolchicine derivatives with antiflammatory and muscle relaxant activities | |
| US5679708A (en) | Epoxysuccinic acid derivatives, their production and use | |
| US5071585A (en) | Phosphoric acid ester, process for preparing the same, and detergent composition containing the same | |
| DE69101934T2 (de) | Neue Enzymsubstrate auf der Basis von Fettsäureanalogen. | |
| DE3885115T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Thiolen. | |
| DE69001107T2 (de) | Sauerstoff- oder schwefelsubstituierte Fettsäureanaloga zur Behandlung retroviraler Infektionen. | |
| DE69121435T2 (de) | Verfahren zur Protein-N-Myristoylation | |
| US5194592A (en) | Monoclonal antibodies to novel polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor | |
| DE69120368T2 (de) | Azido-substituierte Fettsäuren als Enzymsubstratanaloge | |
| DE3782880T2 (de) | Hemmende peptide. | |
| US4576757A (en) | Process for the preparation of monoacyl polyalkylene polyamines | |
| DE69408299T2 (de) | Phospholipase c inhibitierendes peptid | |
| JPH06145123A (ja) | アミド誘導体及びその製造中間体、並びに該アミド誘導体を含有する皮膚外用剤 | |
| AU2010311760B2 (en) | 2-amino-3-methyl-hex-5-enoic acid and its use in the production of peptides such as bacitracins | |
| US4493794A (en) | Peptide, process for preparation thereof and use thereof | |
| EP0273439A2 (de) | Verfahren zur Herstellung von lipophilen Aminosäurederivaten sowie lipophile Aminosäurederivate | |
| JPH08104684A (ja) | エポキシコハク酸関連化合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: RESEARCH CORPORATION TECHNOLOGIES, INC. (N.D.GES.D |
|
| 8328 | Change in the person/name/address of the agent |
Free format text: HOFFMANN * EITLE, 81925 MUENCHEN |
|
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |