DE60317303T2

DE60317303T2 - Hämoglobin-Konjugate

Info

Publication number: DE60317303T2
Application number: DE60317303T
Authority: DE
Inventors: Ezio Panzeri
Original assignee: Individual
Current assignee: Panzeri Ezio Dublin Ie
Priority date: 2003-04-17
Filing date: 2003-04-17
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2023-04-18
Also published as: ATE377608T1; EP1469011A1; DE60317303D1; EP1469011B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hämoglobinkonjugaten bei der Behandlung menschlicher oder nicht-menschlicher Säuger zur Bekämpfung bakterieller oder viraler, insbesondere retroviraler Infektionen.
Es ist bekannt, die Sauerstoffträger-Kapazität von Blut durch Verabreichung eines Konjugats aus Hämoglobin und einem Polyalkylenoxid in einem Blut-Substitut an Säuger zu verstärken. Das Hämoglobin-Polyalkylenoxidkonjugat ist besonders wirksam, da es eine längere Verweilzeit im Blut aufweist als Hämoglobin selbst.
Die Reaktion von Polyalkylenoxid mit Hämoglobin ist jedoch ineffizient, da ein Teil des Hämoglobins bei der Reaktion denaturiert wird. Darüber hinaus ist die Affinität des Hämoglobin-Polyalkylenoxidkonjugates für Sauerstoff höher als diejenige von Hämoglobin, was bedeutet, dass die Freisetzung von Sauerstoff durch das Konjugat erschwert wird.
Psoralene und andere kondensierte trizyklische heterozyklische Verbindungen wurden für die Ex-vivo-Dekontamination von Blut und anderen Materialien zur parenteralen Verabreichung vorgeschlagen. Die Verbindungen interkalieren zwischen Rasenpaaren von Nukleinsäuren in dem zu dekontaminierenden Material und bei Ex-vivo-Exposition mit ultraviolettem Licht wird die Nukleinsäure vernetzt und somit nicht-transkribierbar.
Während dieser Ansatz brauchbar ist, um das Risiko einer HIV-Infektion für einen Patienten zu vermindern, der eine Bluttransfusion erhält, so bewirkt dieser keinerlei therapeutischen Effekt auf einen infizierten Patienten, noch wird dadurch das Risiko eines Patienten verringert, auf anderen Wegen infiziert zu werden.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass ein Konjugat aus Hämoglobin und Psoralen oder einer vergleichbaren Nukleinsäure vernetzenden Verbindung einem Individuum verabreicht werden kann, um sowohl die Sauerstoffträger-Kapazität von Blut zu erhöhen als auch bakterielle oder virale Infektionen, wie z. B. retrovirale Infektionen, Krebs usw., zu bekämpfen.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft somit ein Konjugat aus Hämoglobin und einem Nukleinsäure-Vernetzungsmittel, ausgewählt unter Psoralen, Isopsoralen, Acridin, Haloethylaminen und Haloethylsulfiden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Mittel, umfassend ein Konjugat aus Hämoglobin und einem Nukleinsäure-Vernetzungsmittel, ausgewählt unter Psoralen, Isopsoralen, Acridin, Haloethylaminen und Haloethylsulfiden, zusammen mit einem physiologisch verträglichen Träger oder Exzipienten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines Konjugats aus Hämoglobin und einem Nukleinsäure-Vernetzungsmittel zur Herstellung eines Medikaments zur parenteralen Verabreichung an einen menschlichen oder nicht-menschlichen Säuger zur Bekämpfung von bakterieller oder viraler Infektion.
Das Individuum wird vorzugsweise außerdem einer Bestrahlung ausgesetzt, um das Nukleinsäure-Vernetzungsmittel zu aktivieren, wie z. B. bei Verabreichung des Hämoglobin konjugates oder zu irgendeinem Zeitpunkt oder irgendwelchen Zeitpunkten danach, wie z. B. bis zu drei Wochen, vorzugsweise 2 Stunden bis zu einer Woche, nach Verabreichung. Eine derartige Bestrahlung kann extern oder intern appliziert werden und bei interner Applikation kann diese mithilfe einer strahlungsemittierenden Verbindung erfolgen, die ebenfalls parenteral dem Patienten verabreicht wird, wie z. B. eine fluoreszierende, lumineszierende oder biolumineszierende Verbindung. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist eine derartige Emitter-Verbindung in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthalten. Beispiele derartiger Emitter-Verbindungen umfassen Luziferin. Alternativ dazu kann Patientenblut aus dem Körper entnommen und einer Strahlungsbehandlung unterzogen werden, wie z. B. einer UV-Bestrahlung, bevor es dem Körper wieder zugeführt wird. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bestrahlung eine Röntgenbestrahlung, welche extern appliziert wird. Dies ist besonders geeignet für die Behandlung von AIDS-Patienten, insbesondere solcher, die sich im Endstadium ihrer Erkrankung befinden.
Das Nukleinsäure-Vernetzungsmittel ist vorzugsweise eine Psoralen-, Isopsoralen-, Acridin-, Haloethylamin-, Haloethylsulfid-, Epoxid- oder Aziridinverbindung. Beispiele derartiger Agenzien sind z. B. offenbart in US-B-6194139 , US-B-6177441 und US-A-6093725 . Weitere Beispiele sind beschrieben in WO 97/21346 , WO 96/40857 , WO 94/20090 , WO 94/03054 , WO 94/27433 , WO 95/19705 , WO 98/30545 , WO 99/26476 , WO 96/14739 , WO 95/00141 , US-A-6133460 und US-A-6017691 .
Besonders bevorzugt ist jedoch das Nukleinsäure-Vernetzungsmittel ein Psoralen, insbesondere ein 8-Methoxypsoralen oder ein Derivat davon, insbesondere ein Carboxy(C_1-10-alkyl)oxy-, Carboxy(C_1-10-alkyl)-, Carboxy(C_1-10-alkyl)carbonyloxy- oder C_1-10-Alkylcarboxypsoralen, und ganz besonders bevorzugt sind solche Carboxypsoralene, worin die Alkylengruppe 1 bis 6, insbesondere 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthält und vor allem solche Carboxypsoralene, worin die Alkylengruppe linear ist.
Die Konjugationsreaktion kann durch direkte Reaktion des Vernetzungsmittels mit Hämoglobin oder durch Reaktion von Vernetzungsmitteln, Hämoglobin und einem bifunktionalen verbrückenden Agens erfolgen. Wünschenswerterweise ist in dem Konjugat das Vernetzungsmittel mit dem Hämoglobin über eine Ester-, Amid-, Ether- oder doppelte Etherbindung, besonders bevorzugt über eine Amidbindung, verbrückt. Dies kann durch übliche chemische Synthesetechniken, durch Auswahl in geeigneter Weise substituierter Vernetzungsmittel und/oder durch Verwendung in geeigneter Weise funktionalisierter bifunktionaler vernetzender Agenzien erfolgen. Die Carboxypsoralene sind besonders bevorzugt, da kein verbrückendens Agens erforderlich ist. Derartige Verbindungen können beispielsweise durch Michael-Additionen, durch Oxidation von 8-Methoxypsoralenen oder durch Kondensation von 8-Methoxypsoralenen oder Derivaten davon mit C_1-12-Carbonsäuren, terminal substituiert mit einer reaktiven oder Abgangsgruppe, wie z. B. einem Halogenatom, einer Diazoniumgruppe oder einer Carboxy- oder aktivierten Carboxygruppe, hergestellt werden.
8-Methoxypsoralene können 8-carboxyliert werden, um die Vernetzungsmittel, beispielsweise durch die Methylierung, gefolgt von einer Reaktion mit einer aktivierten Carboxyverbindung (z. B. einem Acylhalogenid, wie z. B. Aylchlorid) oder einem Ester, herzustellen. Die Methylierung kann, wie beispielsweise in Barton et al., J.C.S. Chem. 640 (1975) oder J.C.S. 499 (1970) beschrieben, durchgeführt werden und kann die Reaktion mit Lithiumjodid in siedendem Methylisobutylketon oder Aluminiumcarbid in Nitrobenzol umfassen.
Wenn das Vernetzungsmittel eine Carboxylgruppe trägt, die zur Reaktion mit einer freien Amin- oder Hydroxygruppe am Hämoglobin geeignet ist, ist es besonders bevorzugt, dass die Carboxylgruppe vor der Konjugationsreaktion aktiviert wird. Für diesen Zweck können übliche Carboxyl-Aktivierungstechniken verwendet werden, wie z. B. unter Verwendung eines Aktivierungsreagens, wie solchen, die üblicherweise in der Peptidsynthese verwendet werden (wie z. B. N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid, p-Nitrophenol, Pentachlorphenol usw.) oder durch Umwandlung in eine Säurehalogenidgruppe (wie z. B. durch Reaktion mit Thionylchlorid).
Das zur Produktion der erfindungsgemäßen Konjugate verwendete Hämoglobin kann aus jeglicher tierischer Spezies stammen, die Hämoglobin in ihrem Blut aufweist, insbesondere einem Säuger oder einem Vogel, wie z. B. Menschen, Rindern, Schweinen, Schafen, Pferden, Hunden, Affen, Mäusen, Ratten und besonders bevorzugt stammt das Hämoglobin aus der gleichen Spezies, die als Empfänger des Konjugates dienen soll. Bei dem Hämoglobin kann es sich um normales oder abnormales Hämoglobin oder um ein Derivat davon handeln, wie z. B. ein Phosphatderivat (z. B. ein Pyridoxal-5'-phosphat- oder 2-Nor-2-formylpyridoxal-5'-phosphatderivat), ein Sulfatderivat (z. B. ein Pyridoxalsulfat, wie z. B. ein Pyridoxal-5'-sulfatderivat), ein Glyceratderivat (z. B. ein 2,5-Diphosphoglycerinsäurederivat), ein Zuckerdderivat (z. B. ein Derivat eines Zuckers mit einer Carboxyl- oder Phosphatgruppe, wie z. B. Glucose-6-phosphat) oder ein Adenosinderivat (z. B. ein Adenosin-5'-phosphatderivat) handeln. "Abnormale" Hämoglobine werden von Imai et al. in "Allosteric effected in hemoglobin", Cambridge University Press, 1980 diskutiert.
Die Konjugationsreaktion wird vorzugsweise in einer Flüssigphase, insbesondere einer wässrigen Phase durchgeführt, welche bis zu 25% w/v, insbesondere 0,5 bis 20% w/v und vor allem 1 bis 10% w/v, des Hämoglobins enthält. Die Reaktion wird vorzugsweise in Gegenwart von freien Aminen, wie z. B. Aminosäuren, durchgeführt, insbesondere wenn der Hämoglobingehalt des Reaktionsgemisches oberhalb von 4% w/v liegt, da dies ein Auftreten von Gelbildung verhindert. Wünschenswerterweise wird das Vernetzungsmittel in stöchiometrischen oder überstöchiometrischen Mengen eingesetzt. Beispielsweise können das Vernetzungsmittel und das Hämoglobin in einem Molverhältnis von 1:1 bis 1:50, vorzugsweise 1:10 bis 2:10, umgesetzt werden.
Im Falle einer Reaktion zwischen dem Vernetzungsmittel und dem Hämoglobin in Gegenwart einer Aminosäure oder eines Amins kann das Molekulargewicht des Hämoglobinkonjugates in einfacher Weise kontrolliert werden. Es wird angenommen, dass sich die Aminosäure oder das Amin an einen Teil der aktivierten Carboxylgruppen des Vernetzungsmittels anlagert und dass die auf diese Weise produzierte Substanz verhindert, dass überschüssige Carboxylgruppen mit dem Hämoglobin reagieren. Mithilfe dieses Verfahrens kann das erfindungsgemäße Hämoglobinkonjugat in einfacher Weise ohne Verdünnung der Hämoglobinlösung erhalten werden.
Als Aminosäure für die Verwendung bei dieser Reaktion werden vorzugsweise natürliche Aminosäuren verwendet, d. h. solche, die bei der Proteinbildung verwendet werden. Beispiele dafür umfassen basische Aminosäuren, wie Lysin, Argenin und Histidin, neutrale Aminosäuren, wie Glycin und Phenylalanin, und saure Aminosäuren, wie Glutaminsäure und Asparaginsäure. Beispiele für Amine, welche verwendet werden können, umfassen Ammoniak, aliphatische Amine und aromatische Amine. Da das Hämoglobinkonjugat in den Blutkreislauf eingebracht werden soll, sollte die Substanz vorzugsweise physiologisch verträglich sein. Ein einzelnes Amin oder eine einzelne Aminosäure oder eine Kombination aus zwei oder mehr Aminen oder Aminosäuren ist verwendbar.
Durch geeignete Wahl des Amins oder der Aminosäure kann das Maß der Oberflächenladung auf dem Hämoglobinkonjugat oder dessen hydrophober oder hydrophiler Charakter nach Bedarf eingestellt werden. Wenn also das Hämoglobinkonjugat als Blut-Substitut verwendet werden soll, kann die Interaktion zwischen dem Hämoglobinkonjugat und roten Blutkörperchen, Leukozyten und Blutplasmaproteinen, welche mit dem Hämoglobinkonjugat in dem lebenden Körper in Kontakt gebracht werden, beispielsweise im Hinblick auf die Erythrozytensedimentationsrate und die immunologische Erkennung reguliert werden.
Es ist bevorzugt, dass 1 bis 100 mol, insbesondere 5 bis 20 mol, der Aminosäure oder des Amins je Mol Hämoglobin bei der Reaktion eingesetzt werden.
Das Reaktionsgemisch aus Hämoglobin und dem Vernetzungsmittel enthält vorzugsweise einen möglichst geringen Anteil an Sauerstoff. Beispielsweise ist ein Sauerstoffpartialdruck von 0 bis 30 mmHg bevorzugt. Zu diesem Zweck wird das Reaktionsmedium vorzugsweise entgast oder mit einem Inertgas gespült und die Reaktion wird vorzugsweise unter Inertgas (z. B. Stickstoff, Helium oder Argon) durchgeführt. Ausgenommen der Sauerstoffkonzentration sind sämtliche anderen Reaktionsbedingungen gemäß Stand der Technik durchführbar, mit der Maßgabe, dass Hämoglobin nicht denaturiert wird.
Das auf diese Weise erhaltene Hämoglobinkonjugat kann gefriergetrocknet werden, um eine Präparation zur Verwendung als Wirkstoff zu erhalten. Ein Stabilisierungsmittel wird vorzugsweise zugesetzt, um die Produktion von Methämoglobin und unlöslichem Material zu inhibieren. Beispiele für geeignete Stabilisierungsmittel umfassen Monosaccharide (wie D-Galaktose und D-Glukose) und Disaccharide wie Sucrose und Laktose. Es wurde jedoch festgestellt, dass Glukose und Mannitol besonders wirksam sind.
Beispielsweise wird in einem Verfahren zur Herstellung eines gefriergetrockneten Präparates zur Verwendung als Wirkstoff, enthaltend das Hämoglobinkonjugat, eine wässrige Maltoselösung oder ein Maltosepulver in eine wässrige Lösung des Hämoglobinkonjugats gegeben und die auf diese Weise erhaltene wässrige Lösung wird mithilfe herkömmlicher Verfahren gefriergetrocknet. Die mit dem Hämoglobinkonjugat zu vermischende Menge an Maltose beträgt 0,1 bis 2,0 Gewichtsteile, vorzugsweise 0,5 bis 1,2 Gewichtsteile, Maltose, die vorzugsweise je Gewichtsteil Hämoglobin eingesetzt wird. Die Maltose oder die Maltoselösung kann beispielsweise zu einer Hämoglobinkonjugatlösung mit einem Gehalt von 2 bis 20 w/v% zugesetzt werden und das auf diese Weise erhaltene Gemisch wird bei –35 bis –50°C für 20 bis 60 Minuten eingefroren und anschließend bei vermindertem Druck bei 10° bis 50°C auf einer Ablage 5 bis 70 Stunden getrocknet, um ein gefriergetrocknetes Präparat für einen Wirkstoff zu erhalten. Es ist bevorzugt, dass eine Aminosäure, wie Histidin, Glutamin oder Tryptophan, mit der Maltose und/oder Glukose zur Herstellung des Wirkstoffes zugesetzt wird.
Vor dem Einfrieren einer wässrigen Hämoglobinkonjugatlösung, enthaltend Maltose und/oder Glukose, können bekannte Stabilisierungsmittel und/oder Salze zur Einstellung des osmotischen Druckes zugesetzt werden.
Das Hämoglobinkonjugat gemäß vorliegender Erfindung besitzt ausgezeichnete Eigenschaften, wie z. B. Affinität des Hämoglobins für Sauerstoff und ebenfalls hohe Stabilität.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann nicht nur in gefriergetrockneter Form hergestellt werden, sondern kann auch in anderen Formen vorliegen, wie z. B. als Pulver, Tabletten, Lösungen und dergleichen. Wenn sie nicht in gelöster Form vorliegt, so wird die Zusammensetzung vorzugsweise in einer physiologisch verträglichen Flüssigkeit (z. B. Wasser zur Injektion) vor Verabreichung gelöst. Die Verabreichung erfolgt typischerweise durch Injektion oder Infusion.

Claims

Verwendung eines Konjugates aus Hämoglobin und einem Nukleinsäure-Vernetzungsmittel zur Herstellung eines Medikaments für die parenterale Verabreichung an einen menschlichen oder nicht-menschlichen Säuger zur Bekämpfung von bakterieller oder viraler Infektion.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Nukleinsäure-Vernetzungsmittel ausgewählt ist unter Psoralen, Isopsoralen, Acridin, Haloethylaminen, Haloethylsulfiden, Epoxiden und Aziridinen.
Verwendung nach Anspruch 2 eines Konjugates, worin das Psoralen 8-Methoxypsoralen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Konjugat Meloxin und Hämoglobin umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüchen 1 bis 4, worin das Medikament für Verabreichung an das Subjekt in einer Behandlungsmethode bestimmt ist, welche die Bestrahlung des Subjekts umfasst.
Konjugat aus Hämoglobin und einem Nukleinsäure-Vernetzungsmittel, das ausgewählt ist unter Psoralen, Isopsoralen, Acridin, Haloethylaminen und Haloethylsulfiden.
Konjugat nach Anspruch 6, worin das Psoralen 8-Methoxypsoralen ist.
Konjugat nach Anspruch 6, worin das Konjugat Meloxin und Hämoglobin umfasst.
Pharmazeutisches Mittel, umfassend ein Konjugat aus Hämoglobin und einem Nukleinsäure-Vernetzungsmittel, das ausgewählt ist unter Psoralen, Isopsoralen, Acridin, Haloethylaminen und Haloethylsulfiden, zusammen mit einem physiologisch verträglichen Träger oder Exzipienten.
Mittel nach Anspruch 9, worin das Konjugat wie in einem der Ansprüche 7 und 8 definiert ist.