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Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekular-
und Immundiagnostik. Im Speziellen betrifft die vorliegende Erfindung
Spezies-spezifische immunreaktive Proteinorthologen (∼200 kDa) von
Ehrlichia canis und Ehrlichia chaffeensis, die verwendbar sind für die Spezien-spezifische
Diagnose von Hunde-Ehrlichiosis und menschlicher monozytrophischer
Ehrlichiosis.
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Monozytische
Hunde-Ehrlichiosis ist eine potenziell fatale Zeckenbisskrankheit
bei Hunden mit weltweiter Verbreitung hauptsächlich verursacht durch den
Rickettsienerreger Ehrlichia canis (Huxsoll et al., 1970). E. canis
ist ein notwendiges intrazelluläres
Bakterium, das Tropismus für
Monozyten und Makrophagen aufweist (Nyindo et al., 1971) und persistente
Infektionen in dem Wirbeltierwirt hervorruft (Harrus et al., 1998).
Die Krankheit ist charakterisiert durch drei Stadien: Das akute
Stadium, das 2 bis 4 Wochen dauert; das subklinische Stadium, in
dem Hunde persistent infiziert für
Jahre verbleiben können,
aber keine klinischen Anzeichen aufweisen, gefolgt von der chronischen
Phase, in der sich bei vielen Hunden die Krankheit stufenweise auf Grund
von Knochenmarkshypoplasie verschlechtert und die Prognose weniger
positiv wird (Troy et al., 1990).
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Ehrlichia
canis infiziert und verursacht Ehrlichiosis in Tieren, die zur Canidae-Familie
gehören.
Hunde-Ehrlichiosis besteht aus einer akuten und einer chronischen
Phase. Die akute Phase ist charakterisiert durch Fieber, serös nasalen
und okularen Ausfluss, Appetitlosigkeit, Depression und Gewichtsverlust.
Die chronische Phase ist charakterisiert durch schwerwiegende Panzytopenie,
Epistaxis, Hämaturie,
Blut im Stuhl in Verbindung mit mehr schwerwiegenden klinischen
Anzeichen der akuten Krankheit. Hunde sprechen gut auf Doxycyclin
an, wenn sie frühzeitig
während
des Verlaufs der Krankheit behandelt werden. Chronisch infizierte Hunde
dagegen sprechen nicht gut auf das Antibiotikum an. Deshalb ist
die frühzeitige
Diagnose für
die Behandlung von Hunde-Ehrlichiosis sehr bedeutend.
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Die
Behandlung der Krankheit in der akuten Phase ist für die beste
Prognose wichtig. Hämatologische Unregelmäßigkeiten
wie Leukopenie und Thrombozytopenie liefern oft nützliche
Anzeichen von Hunde-Ehrlichiosis und sind wichtige Faktoren bei
der anfänglichen
Diagnose (Troy et al., 1990). Dennoch ist die Diagnose schwierig,
da die klinische Darstellung von Hunde-Ehrlichiosis nicht spezifisch
ist.
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Die
Diagnose von Hunde-Ehrlichiosis über
serologische Verfahren wie dem indirekten Fluoreszenz-Antikörpertest
(IFA) ist aufgrund seiner Einfachheit, Zuverlässigkeit und Kosteneffizienz
zum Standardverfahren geworden (Troy et al., 1990). Dennoch schließen Defizite
des indirekten Fluoreszenz-Antikörpertests
die Unfähigkeit
ein, eine Spezienspezifische Diagnose zu machen, aufgrund von antigener
Kreuzreaktivität
mit anderen sehr ähnlichen
Ehrlichia-Arten, die Hunde infizieren (E. chaffeensis, E. ewingii,
Anaplasma phagocytophilum und A. platys). Subjektive Interpretationen
können
ebenfalls zu falschnegativen Ergebnissen führen, oder zu falsch-positiven,
verursacht durch kreuzreaktive Antigene. Andere diagnostische Verfahren
wie die Polymerasekettenreaktion (PCR) sind für den spezifischen Nachweis
von E. canis entwickelt worden und wären nach Dokumentationen sensitiver
als Zellkulturisolation, dieses Verfahren benötigt jedoch spezialisierte Schulung
und teures Equipment (McBride et al., 1996). Die Isolation des Organismus
ist zeitintensiv, und nur wenige Laboratorien sind konsistent erfolgreich
mit diesem Verfahren. Außerdem
werden zusätzliche
Tests bei der Benutzung dieses Verfahrens benötigt, um das Isolierte für die Bestimmung
einer spezifischen Ätiologie
zu charakterisieren.
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Gemeinsame
serologische kreuzreaktive Antigene für E. canis und E. chaffeensis
sind dokumentiert worden. Einige von den hauptserologischen kreuzreaktiven
Proteinen weisen eine Molekularmasse von 28 bis 30 kDa auf (Chen
et al., 1997; Rikihisa et al., 1994), und es ist inzwischen bekannt,
dass diese Proteine von homologen Multigenfamilien kodiert werden
(Ohashi et al, 1998 a, b). Es gibt 22 bzw. 25 Homologe aber nicht identische
p28-Gene, die in E. chaffeensis und E. canis identifiziert und sequenziert
wurden. Ähnliche
Intraspezien und Interspezifische Stammhomologie wurde zwischen
den p28-Proteinen von E. canis und E. chaffeensis beobachtet, was
die serologische Kreuzreaktivität
von diesen Proteinen erklärt
(McBride et al., 1999).
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Ein
kürzlicher
Bericht stellte dar, dass das rP28-Protein von E. chaffeensis ein
unsensitives Mittel in der Diagnose von menschlicher monozytrophischer
Ehrlichiosis (HME) war (Yu et al., 1999a). Der eigentliche Grund
hierfür
scheint die Variabilität
des P28-Proteins bei verschiedenen Stämmen von E. chaffeensis zu
sein (Yu et al., 1999b). Umgekehrt sind die p28-Gene, die in E. canis identifiziert
wurden, erhalten bei geographisch verstreuten Stämmen, und das E. canis rP28
ist bewiesenermaßen
nützlich
für die
Diagnose von Hunde-Ehrlichiosis (McBride et al., 1999; Ohashi 1998a).
Andere homologe immunreaktive Proteine einschließlich der Glycoproteine in
E. canis (gp140) und E. chaffeensis (gp120) sind kloniert worden
(Yu et al., 1997, 2000). Die Reaktivität des rgp120 von E. chaffeensis
hat dem indirekten Fluoreszenz-Antikörper für die Serumdiagnose von
menschlicher monozytotropischen Ehrlichiosis gut entsprochen und
vorausgehende Studien mit dem rgp140 von E. canis deuten daraufhin,
dass es ein sensitives und zuverlässiges immundiagnostisches
Antigen sein könnte
(Yu et al., 1999a, 2000).
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Der
Stand der Technik ist unzureichend in Bezug auf spezifische Antigene
für serologische
und molekulare Diagnostik von E. canis und E. chaffeensis genauso
wie Verfahren für
solche Verwendung. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese lange Notwendigkeit
und das Bedürfnis
auf diesem Gebiet.
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Ein
höchst
immunreaktives 43 kD Protein (p43) von Ehrlichia canis wurde identifiziert
(U.S. Pat. Nr. 6,355,777). Als ein immundiagnostisches Antigen,
wies das p43 eine 96 %-ige Genauigkeit im Vergleich mit dem indirekten
Fluoreszenz-Antikörpertest
auf und stellte eine Spezien-spezifische Diagnose von E. canis-Infektionen
zur Verfügung.
Weitere Untersuchungen offenbarten, dass das E. canis p43 den N-terminalen
Teil eines Proteins mit einer prognostizierten molekularen Masse
von 153 kD, dem größten immunreaktiven
Protein beschrieben in Ehrlichia spp., repräsentiert. Analysen von rekombinant
expremierten Fragmenten des p153 durch Proteingelelektrophorese
zeigten eine größer als
prognostizierte molekulare Masse (∼10 bis 30 %) und die Präsenz von
Kohlenhydratglykanen in N- und C-terminalen
Fragmenten, die andeuten, dass das p153 ein Glykoprotein ist.
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Eine
BLAST-Suche wurde für
die verfügbare
E. chaffeensis-Genomsequenz (95 %) durchgeführt, und das Gen, das den p153
Orthologen kodiert, wurde in E. chaffeensis identifiziert. Die E.
canis p153 (4263-bp)- und E. chaffeensis p156 (4389-bp)-Gene hatten ähnliche
chromosomale Positionen, stromabwärts von den homologen (∼87 %) Desoxyguanosintriphosphat-Triphosphohydrolase-Genen
und homologen (∼90
%) intergenen Sequenzen vorangehend den offenen Leserastern. Nukleinsäuresequenzhomologie
(50 %) wurde zwischen den Glykoprotein-Genen, die durch vorherige
Funde in Bezug auf genetische Divergenz des p43-Genfragments bestätigt wurden,
und den p153- und p156-Proteinen, die Aminosäureähnlichkeiten von 32 % aufwiesen,
beobachtet. Ein natives E. canis-Protein mit einer Molekularmasse
von 200 kD reagierte mit Antiserum, das gegen die N-terminale Region
(p43) des p153 produziert wurde, so dass nahe liegend ist, dass
das native Protein nachtranslational modifiziert wurde. Ebenso umfasst
ein rekombinantes Protein die N-terminale Region des E. chaffeensis
p156, größer migriert
als prognostiziert (200 kD), und Kohlenhydrat wurde auf dem rekombinanten
Protein nachgewiesen. Ein hauptimmunreaktives Epitop wurde in diesem
N-terminalen Fragment identifiziert. Die chromosomale Position,
Aminosäurehomologie
und biophysikalische Eigenschaften bestätigen die Schlussfolgerung,
dass die p153- und p156-Glykoproteine
(bezeichnet als gp200s) Spezien-spezifische immunreaktive Orthologen
sind.
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In
den N-(P43)- und C-terminalen Regionen des E. canis p153 und der
N-terminalen Region des E. chaffeensis p156 Orthologen sind wichtige
immunreaktive Epitope identifiziert worden, die wichtig sein werden für serologische
Diagnostiken und Impfstoffe. Darüber
hinaus sind Gene, die diese Proteine kodieren, Spezien-spezifisch
und werden für
die Entwicklung von molekularbasierten Diagnostiken nützlich sein.
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Andere
und weitere Aspekte, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden
Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der derzeitig bevorzugten
Ausführungsformen
der Erfindung offensichtlich werden. Diese Ausführungsformen werden für den Zweck
der Offenbarung gemacht.
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Es
sei auf die genauere Beschreibung der oben kurz zusammengefassten
Erfindung in Bezug auf die bestimmten Ausführungsformen in den beigefügten Abbildungen
hingewiesen, so dass die oben genannten Eigenschaften, Vorteile
und Gegenstände
der Erfindung, genau wie Anderes, was deutlich werden wird, erreicht
und im Detail verstanden werden kann. Diese Abbildungen bilden einen
Teil der Beschreibung. Dennoch muss beachtet werden, dass die beigefügten Abbildungen
bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung darstellen und deshalb nicht als Limitierung in ihrem
Umfang betrachtet werden dürfen.
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1A und 1B zeigen,
das Lipman-Pearson-Aminosäurealignment
von E. chaffeensis p156 (obere Linie) und den E. canis p153 (untere
Linie) Proteinorthologen. Aminosäureidentitäten, konservierte
(:) und halb-konservierte (.) Substituenten werden in der Mitte
gezeigt.
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2A und 2B zeigen
die Expression von rekombinanten Proteinfragmenten von E. canis
p153 (A) und E. chaffeensis (B) und die Detektion mit dem Anti-V5-Antikörper. E.
canis p153, Reihe 1, N-terminales Fragment (1107-bp, nt-1-1107),
Reihe 2, inneres Fragment (910-bp, nt-1080-1990), Reihe 3, inneres Fragment (1000-bp,
nt-1950-2950) und Reihe 4, C-terminales Fragment (1280-bp, nt-2940-4220).
E. chaffeensis p156, Reihe 1, N-terminales Fragment (1545-bp, nt-125-1675),
Reihe 2, inneres Fragment (1365-bp, nt-1685-3050) und Reihe 3, C-terminal
(1365-bp, nt-2950-4315).
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3A zeigt
den Western-Immuno-Blot des E. canis p153 rekombinanten Fragmentes.
Reihe 1, N-terminales Fragment (1107-bp, nt-1-1107), Reihe 2, inneres
Fragment (910-bp, nt-1080-1990),
Reihe 3, inneres Fragment (1000-bp, nt-1950-2950) und Reihe 4, C-terminales
Fragment (1280-bp, nt-2940-4220).
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3B zeigt
den Kohlenhydratnachweis des entsprechend aufgereinigten rekombinanten
Fragmentes des E. canis p153, das unter Verwendung des pRSET-Expressionsvektors
in E. coli expremiert wurde. Glykane, angehängt an die rekombinanten Proteine,
wurden oxidiert, mit Biotin markiert und mit Streptavidin-Alkalinphosphatase
detektiert.
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4A zeigt
einen Western-Blot der E. chaffeensis p156 rekombinanten Fragmente
(Reihe 1–3)
mit menschlichem (linke Tafel) und Hundeserum (rechte Tafel). Reihe
1, E. chaffeensis p156 N-terminales Fragment (1545-bp, nt-125-1675),
Reihe 2, inneres Fragment (1365-bp, nt-1685-3050) und Reihe 3, C-terminal (1365-bp,
nt-2950-4315). Die rekombinant expremierten Proteine stellen ∼95 % des
E. chaffeensis p156 dar.
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4B zeigt
den Kohlenhydratnachweis der drei entsprechenden rekombinanten E.
chaffeensis p156 Proteine (Reihe 1–3).
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5 zeigt
einen Western-Blot, der die Proteine des vollständigen E.canis Zelllysats mit
polyklonalen Antiserum von einem mit E. canis infizierten Hund (Reihe
1) und antirekombinantes p43 (gp200) (Reihe 2) und antirekombinantes
gp140 (Reihe 3) polyklonales Kaninchenserum.
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Die
E. canis p43-Gensequenz wurde bereits als 1173-bp beschrieben (U.S.
Pat. Nr. 6,355,777), aber weitere Analyse offenbarte einen DNA-Sequenzierungsfehler,
der zu einem künstlichen
Stopkodon und einer gekürzten
Gensequenz führte.
Unter Verwendung des Primer-Adaptor-Gen-Wanderungs-Verfahrens (primer-Adaptor
gene walking method), wurde eine zusätzliche 4.5-kbp Sequenz stromabwärts von
der 2.4-kbp in dem Original p43-Klon bestimmt. Die nicht komplette
p43-Gensequenz wurde durch die Offenbarung eines offenen Leserasters
von 4263-bp vervollständigt,
das ein Protein mit einer vorhergesagten Molekularmasse von 153
kD kodiert (bezeichnet als p153). Stromaufwärts von dem p153-Gen befindet
sich ein offenes Leseraster, das eine Desoxyguanosintriphosphat-Triphosphohydrolase
kodiert und eine intergene nicht kodierende Region, die dem p153-Gen,
das eine hohe Nukleinsäurehomologie
(87 % bzw. 90 %) zwischen E. canis und E. chaffeensis aufweist,
vorangeht.
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Eine
BLAST-Suche der E. chaffeensis-Genomsequenz mit dem 2.4-kbp p43-Klon
identifizierte eine höchst
homologe Nukleinsäuresequenz.
Ein großes
offenes Leseraster (4389 bp) ungefähr identisch in der Größe zu dem
E. canis p153 wurde in demselben chromosomalen Bereich gefunden,
in Bezug auf die stromaufwärts
homologe Kodierung und intergene Nukleinsäuresequenz und kodierend ein
Protein mit einer prognostizierten Molekularmasse von 156 kD (p156).
Es wurde zwischen den E. canis p153- und dem E. chaffeensis p156-Genen
eine Nukleinsäuresequenzhomologie
von (∼50
%) beobachtet; dennoch weisen die Proteine eine gesamte Aminosäuresequenzähnlichkeit
von 32 % auf (1).
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Genkonstrukte,
expremiert in E. coli, die das E. chaffeensis p156-Protein (nt-125-1670;
nt-1685-3050) und
vier rekombinante Fragmente von E. canis p153 (nt-1-1107 (p43);
nt-1080-1990; nt-1950-2950; nt-2940-4220)
darstellen, wurden in E. coli expremiert (2).
Die E. canis N-terminalen
(nt-1-1107) und C-terminalen (nt-2940-4220) rekombinant expremierten
Proteine wiesen eine hohe Immunreaktivität auf (3A). Dennoch
war nur das N-terminale Fragment (nt-125-1670) von E. chaffeensis
p156 immunreaktiv (4A).
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Die
E. canis (nt-1-1107 und nt-2940-4420) und E. chaffeensis p156 rekombinanten
Proteinfragmente (nt-125-1607) wanderten weiter als erwartet in
der SDS-PAGE, was darauf hindeutet, dass nachtranslationale Modifikation
dieser Fragmente stattgefunden hatte. Anschließend wurden Kohlenhydrate in
den E. canis p153- und E. chaffeensis p156-Peptidfragmenten nachgewiesen (3A und 4B).
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Anti-p43-Antikörper reagierten
mit einem nativen Protein von ungefähr 200 kD aus dem vollständigen E.
canis Zelllysat. Darüber
hinaus wurde dieses 200 kD Protein auch von Sera eines mit E. canis
infizierten Hundes erkannt (5). Eine
Teilgensequenz, zuvor identifiziert als p43 (N-terminaler Teil von
p153), wurde der GenBank Zugangsnummer AF252298 zugeordnet. Die
geänderte
Sequenzierung, kodierend p153, wurde der GenBank Zugangsnummer AY156950
zugeordnet.
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Die
chromosomale Position, Aminosäurehomologie
und biophysikalische Eigenschaften unterstützen die Schlussfolgerung,
dass die p153- und p156-Glykoproteine (bezeichnet als gp200s) Spezien-spezifische immunreaktive
Orthologen sind. Diese Proteine finden potenzielle Verwendung in
der Impfstoffentwicklung und können
als sensitive und zuverlässige
serumdiagnostische Wirkstoffe für
die Diagnose von Ehrlichia-Infektionen verwendet werden. Dieses
wird durch vorherige Funde bestätigt,
die die Immunreaktivität
und die potenzielle Verwendung von dem E. canis p43 als serodiagnostisches
Antigen zeigten (U.S. Pat. Nr. 6,355,777). Die Reaktion mit Antikörpern gegen
p43 hatte eine 100 %-ige Übereinstimmung
mit Proben, die einen indirekten Fluoreszenzantikörper (IFA)-Titer
von >40 hatten und
mit verschiedenen Proben mit einem indirekten Fluoreszenzantikörper-Titer
von <40 reagierten.
Die schwache Reaktivität
von verschiedenen indirekten Fluoreszenzantikörper-negativ-Proben mit den
p43-Antikörpern
deutet darauf hin, dass das p43-Protein ein sensitiveres serodiagnostisches
Antigen sein könnte.
Die in der vorliegenden Erfindung präsentierten Ergebnisse zeigen,
dass p43 ein Teil eines größeren p156-Proteins
in E. canis ist.
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Die
aktuelle Erfindung ist auf isolierte Polynukleotide, die das Ehrlichia
canis immunreaktive Oberflächenprotein
p153 und das Ehrlichia chaffeensis p156-Protein kodieren, gerichtet.
Vorzugsweise kodieren die isolierten Polynukleotide die Proteine
mit den Aminosäurensequenzen
gezeigt in SEQ ID NO:1 und 2. Andernfalls kann die DNA in der Nukleotidsequenz
in Bezug auf die Degeneration des genetischen Kodes abweichen.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Vektoren, die diese isolierten
Polynukleotide und notwendige regulatorische Elemente für die Expression
von der DNA in einer Zelle umfassen; isolierte und aufgereinigte
p153- und p156-Proteine; und Antikörper, die gegen diese Proteine
gerichtet sind.
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Die
vorliegende Erfindung ist darüber
hinaus gerichtet auf die Verwendung der p153- und p156-Proteine bei der
Herstellung von Impfstoffen gegen Hunde- und menschliche Ehrlichiosis.
Zusätzlich
sind Verfahren zur Bestimmung, ob ein Hund oder Mensch mit einem
Ehrlichia-Spezien
infiziert ist, bereitgestellt, durch die Bestimmung, ob Hundeserum
mit dem p153- oder p156-Protein reagiert. Die verwendeten Proteine
können aus
rekombinanten Quellen stammen, und Western-Blot-Analyse könnte verwendet
werden, um die Reaktion des Serums auf die Proteine zu detektieren.
Da auch die Reaktion mit vorherigen isoliertem E. canis p28-Protein
ein zuverlässiger
Marker einer E. canis-Infektion ist, könnte die Diagnose aus der Bestimmung
der Immunreaktivität
auf das p153-Protein, gp140, und das p28-Antigen von Ehrlichia canis
bestehen.
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Die
vorliegende Erfindung richtet sich auch auf ein serodiagnostisches
Kit zur Untersuchung, ob ein Hund oder Mensch mit einer Ehrlichia-Spezies
infiziert ist. Das Kit umfasst immobilisierte Proteine (p153 oder p156)
wie hier offenbart, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:2
bzw. die Aminosäuresequenz
der SEQ ID NO:1 haben, geeignete Verdünnungspuffer für Hundeserum,
zweite Anti-Hundserumantikörper,
gebunden an ein Reportermolekül,
und geeignete Reagenzien zum Nachweis des Reportermoleküls. Mögliche Verfahren zur
Immobilisierung der Antigene schließen die Bindung an Membrane
oder Mikrotiterplatten ein. Das Reportermolekül könnte Luziferase, Meerrettichperoxidase,
Beta-Galaktosidase oder ein Fluoreszentmarker sein.
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Entsprechend
der vorliegenden Erfindung können
konventionelle molekularbiologische, mikrobiologische und rekombinante
DNA-Techniken innerhalb der Fähigkeiten
auf diesem Gebiet verwendet werden. Solche Techniken sind vollständig in
der Literatur erklärt.
Siehe zum Beispiel, Maniatis, Fritsch & Sambrook, „Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (1982); „DNA
Cloning; A Practical Approach, „Volumes I and II (D.N. Glover
ed. 1985); "Oligonucleotdie
Synthesis" (M.J.
Gait ed. 1984); "Nucleic
Acid Hybridization" [B.D.
Hames & S.J.
Higgins eds. (1985)]; "Transcription
and Translation" [B.D.
Hames & S.J.
Higgins eds. (1984)]; "Animal
Cell Culture" [R.I.
Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized
Cells And Enzymes" [IRL
Press, (1986)]; B. Perbal, "A
Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
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Der
Begriff "Wirt" wie hier verwendet,
schließt
nicht nur Prokaryoten, sondern auch Eurkaryoten wie zum Beispiel
Hefe-, Pflanzen- und Tierzellen ein. Ein rekombinantes DNA-Molekül oder Gen,
das ein Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, kann verwendet
werden, um einen Wirt zu transformieren unter Verwendung von irgendeiner
der gebräuchlichen
Techniken, die dem normalen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind.
Prokaryotische Wirte können
E. coli, S tymphimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis
einschließen.
Eukaryotische Wirte schließen
Hefen wie zum Beispiel Pichia pastoris, Säugetierzellen und Insektenzellen
ein.
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Im
Allgemeinen werden Expressionsvektoren, die Promotorsequenzen enthalten,
die die effiziente Transkription der eingefügten DNA-Fragmente fördern, in
Verbindung mit dem Wirt verwendet. Der Expressionsvektor enthält typischerweise
einen Anfangspunkt der Replikation, Promotor(en), Terminator(en),
sowie spezifische Gene, die in der Lage sind, eine phänotypische
Selektion in transformierten Zellen bereitzustellen. Die transformierten
Wirte können
entsprechend bekannter Mittel auf diesem Gebiet fermentiert und
kultiviert werden, um ein optimales Zellwachstum zu erreichen. Verfahren,
die einem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt sind, können verwendet
werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die geeignete transkriptionale
und translationale Kontrollsignale enthalten. Siehe zum Beispiel
die Techniken beschrieben in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual (2. Auflage), Cold Spring Harbor Press, N.Y.
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Der
Begriff „Primer" wie hier verwendet,
bezieht sich auf Oligonukleotide, auch wenn diese natürlicherweise
in einem isolierten Restriktionsverdau oder synthetisch-produziert
vorkommen, die in der Lage sind, als Startpunkt der Synthese zu
fungieren, wenn sie unter Bedingungen eingesetzt werden, in denen
die Synthese von einem Primerextensionsprodukt komplementär zu einem
Nukleinsäurestrang
eingeleitet wird. Die Bedingungen schließen die Anwesenheit von Nukleotiden
und einem induzierendem Wirkstoff wie einer DNA-Polymerase und einer
geeigneten Temperatur und pH-Wert ein. Die Primer können entweder
einzelsträngig
oder doppelsträngig
sein und müssen
ausreichend lang sein, um als Primer für die Synthese des gewünschten
Extensionsproduktes in der Anwesenheit des induzierenden Wirkstoffs
zu fungieren. Die genaue Länge
der Primer wird abhängig
sein von vielen Faktoren einschließlich Temperatur, Quelle der
Primer und dem verwendeten Verfahren. Für diagnostische Anwendungen
zum Beispiel umfasst ein Oligonukleotidprimer typischerweise 15
bis 25 oder mehr Nukleotide abhängig
von der Komplexität
der Zielsequenz. Primer mit einer geringeren Nukleotidzahl können ebenfalls
verwendet werden.
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Die
Primer hierin wurden ausgewählt,
um „im
Wesentlichen" komplementär zu verschiedenen
Strängen
einer bestimmten Ziel-DNA-Sequenz zu sein. Das bedeutet, dass die
Primer ausreichend komplementär sein
müssen,
um mit ihren entsprechenden Strängen
zu hybridisieren. Deshalb braucht die Primer-Sequenz nicht die exakte
Sequenz des Templates wiederzugeben. Beispielsweise könnte ein
nicht-komplementäres
Nukleotidfragment an das 5'-Ende
des Primers angehängt
sein, mit dem Rest der Primer-Sequenz, die komplementär zu dem
Strang ist. Alternativ können
nicht-komplementäre
Basen oder längere
Sequenzen in den Primer eingelagert sein, vorausgesetzt, dass die
Primer-Sequenz eine ausreichende Komplementarität mit der Sequenz hat oder
daran hybridisiert und somit das Template für die Synthese des Extensionsprodukts
bildet.
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Die
folgenden Beispiele werden für
den Zweck der Illustration verschiedener Ausführungsformen der Erfindung
gegeben und sollen die vorliegende Erfindung in keiner Weise limitieren.
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BEISPIEL 1
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Charakterisierung der E. canis p153- und
E. chaffeensis p156-Proteine
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Wie
zuvor beschrieben wurde das E. canis p43-Protein von einer Lambda
Zap II-Expressionsbibliothek
identifiziert (McBride et al., 2001; U.S. Pat. Nr. 6,355,777). Der
Original 2.4-kb-Klon bestand aus einem offenen Leseraster (ORF),
das ein Desoxyguanisintriophosphat-Triphosphohydrolase-Gen und einen stromabwärts 229-bp
intergenen Bereich kodiert, vorangehend an das verkürzte p43-Genfragment.
Ein Primer-Adapter PCR-Verfahren wurde verwendet um die komplette
Sequenz des p43 offenen Leserasters zu untersuchen, wobei die E.
canis genomische DNA als Template verwendet wurde (Jake, North Carolina-Strang).
Die Amplifikate wurden direkt mit den Primern sequenziert, die für die Amplifikation
verwendet wurden oder in TOPO/TA für Sequenzanalyse kloniert.
Der E. chaffeensis Orthologe (p156-Gen) wurde durch die Durchführung einer BLAST-Suche
der E. chaffeensis-Genomsequenz mit dem gesamten E. canis p43-Klon
(2.4-kb) identifiziert.
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Die
E. canis p156- und E. chaffeensis p156-Gene wurden in große Fragmente
(1 bis 1,5-kbp) geteilt, in einen pUni/V5-His-TOPO Echo Donor-Vektor
kloniert und mit pBAD Thio-E oder pRSET Echo Akzeptorexpressions-Vektoren
rekombiniert. Die rekombinanten Proteine wurden für 4 Stunden
nach Induktion mit Arabinose oder IRTG expremiert. Der Glykannachweis
der expremierten rekombinanten Proteine wurde unter Verwendung eines
Immuno-Blot-Kits für
den Glykoproteinnachweis (Bio-Rad) nach dem Membran-Markierungsprotokoll
durchgeführt.
Das E. chaffeensis rekombinante Dsb-Protein, wie vorher beschrieben
(McBride et al., 2002), wurde in E. coli expremiert und als ein
Ehrlichiales-negativ-Kontrollprotein für die Glykoproteinnachweisstudien
verwendet. Das vollständige
E. canis Zelllysat wurde durch Gelelektrophorese unter Verwendung von
Gradientengelen (4–12
% Bis-Tris, Novagen) getrennt und unter Verwendung einer halbtrockenen
Transfereinheit (Bio-Rad) auf reine Nitrozellulose gegeben. Immuno-Blots,
wie vorher beschrieben, wurden durchgeführt (McBride et al., 2001).
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Diskussion
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Die
starke Immunreaktivität
des Klons, der den N-terminalen (p43) Teil des E. canis p153 enthält, führte zu
seiner anfänglichen
Identifikation und Charakterisierung (McBride et al., 2001). Beim
Vergleich mit den Ergebnissen des indirekten Fluoreszenzantikörper-Tests
zum Nachweis von Antikörpern
gegen E. canis in Hunden, wies das p43 eine exzellente Sensitivität und Spezifität auf. Zusätzlich schien
das p43 einen Spezien-spezifischen Nachweis bereitzustellen, da
antirekombinante p43 polyklonale Antikörper nicht mit E. chaffeensis
infizierten DH82-Zellen reagierten. Die Identifikation des p153
Orthologen in E. chaffeensis (p156), der genetisch divergent ist
und einen niedrigen Grad von Aminosäurehomologie aufweist, bestätigt vorherige
Funde, dass das p43-Protein ein Spezien-spezifisches Antigen ist
und deshalb ein exzellentes Spezien-spezifisches immundiagnostisches
Antigen sein würde.
Hauptsächlich
sind lineare B-Zell-Epitope in den N-(p43) und C-terminalen Regionen
des p153-Proteins
anwesend.
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Das
p43 rekombinante Protein weist eine größere Molekularmasse als prognostiziert
auf (∼30
% oder ∼10
kDa), was anfänglich
nicht bemerkt wurde. Die zuvor berichteten ehrlichialen Glykoproteine
gp120 und gp140 waren 60 bis 100 % größer als erwartet. Obwohl der
Grad der Molekularmassenabweichung deutlich kleiner war, wurde durch
Kohlenhydratnachweis der angelagerten Glykane bestätigt, dass
das p43-Protein ein Glykoprotein ist. Konsistent mit den p43-Funden
weisen die expremierten E. chaffeensis p156-rekombinanten Genfragemente
eine größere als
erwartete Molekularmasse auf, und Kohlenhydrat wurde in diesen Fragmenten
detektiert. Zusätzlich
wies das C-tenninale Fragment des E. canis p153 ebenfalls eine größere Molekularmasse
auf als erwartet (∼10
% oder 6 kDa).
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Als
das p43-Gen identifiziert wurde, reagierte ein entsprechendes natives.
E. canis-Protein aus vollständigen
Zelllysaten nicht mit den Anti-p43-Antisera. Basierend auf den hier
präsentierten
Funden, kann dieser Widerspruch der Tatsache zugeschrieben werden,
dass das p43-Gen einen unvollständigen
offenen Leseraster darstellt und es kein 43 kD-Protein kodiert.
Zusätzlich
benötigt
die große
Molekularmasse dieses Proteins (>150
kD) besondere Aufmerksamkeit bei Gelelektrophoresebedingungen, um
eine konsistente Identifikation dieses Proteins durch einen Immuno-Blot
zu erhalten. Das 200 kD-Protein in vollständigen Zelllysaten von E. canis
war stark immunreaktiv mit dem Anti-p43 polyklonalen Antikörper. Die
Molekularmasse von diesem Protein stimmt mit der prognostizierten
Masse des p153, gekoppelt mit einigen Glykanen, die zu einer Erhöhung der
Molekularmasse beitragen, überein.
Dieser Fund ist außerdem
mit der Molekularmasse der E. chaffeensis p156-rekombinanten Fragmente
konsistent, die fast das gesamte offenen Leseraster darstellen.
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Glykoproteine
von Ehrlichia spp. sind einige der ersten solcher Proteine, die
in pathogenen Bakterien charakterisiert werden. Die bisher entdeckten
ehrlichialen Glykoproteine werden konsistent und stark von Antikörpern in
infizierten Patienten und Tieren erkannt. Diese einmaligen Oberflächen-exponierten
immunreaktiven Proteine haben ein Potential in der Impfstoffentwicklung,
und diese Proteine können
wichtige Komponenten der Untereinheit Impfstoffe sein.
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Die
folgenden Referenzen wurden hierin zitiert:
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of patients with human monocytotropic ehrlichiosis to different
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Alle
Patente und Publikationen, die in dieser Beschreibung genannt wurden,
sind hinweisend auf das Level eines Fachmanns auf diesem Gebiet,
die diese Erfindung betrifft. Diese Patente und Publikationen werden
hierin durch Referenzen im selben Ausmaß berücksichtigt als ob jede einzelne
Publikation spezifisch und individuell angegeben ist, um durch Referenz
eingebunden zu sein.
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Ein
Fachmann aus diesem Bereich wird bereitwillig einsehen, dass die
vorliegende Erfindung gut geeignet ist, die Gegenstände nachzuvollziehen
und die genannten Ziele und Vorteile zu erreichen, genauso wie das
Innewohnende darin. Die gegenwärtigen
Beispiele zusammen mit den Verfahren, Handlungsweisen, Behandlungen,
Molekülen
und spezifische Verbindungen wie hierin beschrieben, sind derzeitig
exemplarisch repräsentativ
für bevorzugte
Ausführungsformen
und beabsichtigen nicht die Limitierung des Umfangs der Erfindung. Änderungen
darin und andere Verwendungen werden solchen Fachleuten auf dem
Gebiet einfallen, die den Umfang der Erfindung wie durch den Umfang
der Ansprüche
erfassen.
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