DE60316748T2

DE60316748T2 - Magnetischer Träger für biologische Substanzen, Verfahren zur seiner Produktion und seiner Verwendung zur Isolierung dieser biologischen Substanzen

Info

Publication number: DE60316748T2
Application number: DE60316748T
Authority: DE
Inventors: Yoshiaki Osaka-shi Nishiya; Satoko Otokuni-gun Tsuboi; Mikio Moriya-shi Kishimoto
Original assignee: Toyobo Co Ltd; Hitachi Maxell Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd; Maxell Ltd
Priority date: 2002-06-27
Filing date: 2003-06-27
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2023-06-28
Also published as: EP1376129A2; EP1376129B1; ATE375512T1; US20040126902A1; DE60316748D1; EP1376129A3

Description

Die Erfindung betrifft einen magnetischen Träger, ein Herstellungsverfahren dafür sowie ein Verfahren zum Isolieren biologischer Substanzen mit Hilfe des Trägers.
Verschiedene Verfahren zum Isolieren einer biologischen Zielsubstanz aus einer Probe, die eine biologische Substanz enthält, z. B. Nukleinsäure, Protein, Kohlenhydrat u. ä., wurden herkömmlich untersucht. Bekannt als derartige Verfahren sind Verfahren mit Extraktion und Trennung mit Hilfe organischer Lösungsmittel, Verfahren zum Isolieren der Zielsubstanz mit Hilfe eines Molekülfilters auf der Grundlage der Größe des Moleküls, Isolierverfahren, die einen Träger nutzen, der sich mit einer speziellen biologischen Substanz reversibel binden kann, u. ä. Von diesen Verfahren haben Isolierverfahren unter Nutzung eines Trägers viele Vorteile zum gleichzeitigen Verarbeiten einer Anzahl von Proben. Überaus zweckmäßig ist insbesondere die einen magnetischen Träger nutzende Isolierung. Grund dafür ist, daß ein Komplex aus biologischer Substanz/magnetischem Träger durch Anlegen eines Magnetfelds aufgefangen werden kann und keine Auffangvorrichtung, z. B. eine Zentrifuge u. ä., erforderlich ist.
Verfahren zum Isolieren biologischer Substanzen, die einen magnetischen Träger nutzen, wurden als Isolierverfahren für verschiedene Nukleinsäuren spezifisch entwickelt. Als magnetischer Träger zur Isolierung von Nukleinsäure sind magnetisch reaktionsfähige Teilchen bekannt, die Eisenoxid mit einer Beschichtung aus polymerisierbarem Silan enthalten, das sich mit Affinitätsmolekülen (z. B. Nukleinsäure u. ä.) kovalent binden kann ( JP-A-60-1564 ). Magnetisch reaktionsfähige Teilchen erfordern eine Silanbeschichtung, die sich mit Affinitätsmolekülen (z. B. Nukleinsäure) bindet. Als Verbesserung dessen sind kugelförmige magnetische Silikateilchen bekannt, die superparamagnetisches Metalloxid enthalten ( JP-A-9-19292 und JP-A-2001-78761 ). Solche magnetischen Silikateilchen sind Komplexe von superparamagnetischem Metalloxid mit anorganischer poröser Wandsubstanz, die aus feinen Silikateilchen besteht, und haben eine spezifische Oberfläche von 100 bis 800 m²/g. Der bevorzugte superparamagnetische Metalloxidgehalt beträgt 10 bis 60 Gew.-% und die bevorzugte Teilchengröße beträgt 0,5 bis 15 μm.
Vorgeschlagen wurden zudem magnetische Silikateilchen mit einer Struktur, bei der mehrere feine Kernteilchen, die Metall oder Metalloxid aufweisen, das aus mehreren magnetischen Domänen besteht, mit einem Film oder feinen Teilchen aus Silika beschichtet sind ( JP-A-2000-256388 ).
Bekannt sind außerdem ein Analyseverfahren und eine Vorrichtung unter Verwendung biologischer Substanzen, die mit einer Substanz mit magnetischer Reaktionsfähigkeit gebunden sind ( WO 86/05815 ). Gemäß diesem Verfahren wird ein magnetisiertes Teilchen oder ein magnetisierbares Teilchen, das mit einer Substanz beschichtet ist, die sich mit einer einsträngigen Nukleinsäure binden kann, zum Trennen und Detektieren einer einsträngigen Nukleinsäure verwendet. Speziell wird Nitrocellulose, die eine Art von Cellulosederivat ist, auf die Oberfläche eines magnetisierten Teilchens aufgetragen, und Nitrocellulose sowie einsträngige Nukleinsäure von DNA oder RNA binden sich spezifisch miteinander. Da gemäß diesem Verfahren einsträngige Nukleinsäure von DNA oder RNA mit dem magnetischen Träger spezifisch gebunden wird, muß die Oberfläche des magnetisierten Teilchens mit einem Cellulosederivat abgedeckt sein, z. B. Nitrocellulose u. ä.
Bekannt ist weiterhin der Gebrauch eines polykationischen Trägers zur Reinigung und Isolierung einer biologischen Substanz, insbesondere der Gebrauch eines polykationischen Trägers zur Reinigung, Isolierung und Hybridisierung von Nukleinsäure (Japanische Patentanmeldung unter PCT-Veröffentlichung unter Kohyo Nr. Hei-1-502319 ). Als Träger werden Metalloxid, Glas, Polyamid u. ä. beispielhaft aufgeführt. Als polykationisches magnetisch reaktionsfähiges Teilchen kann ein magnetisiertes Aminmikrokügelchen mit einer Teilchengröße von etwa 1 μm (magnetisches Mikrokügelchen) u. ä. verwendet werden. Angenommen wird, daß die Bindung von Nukleinsäure mit einem Träger auf der Innenbindung zwischen einem magnetisierten Aminmikrokügelchen mit einer positiven Ladung und einer Zuckerphosphat-Hauptkette von Nukleinsäure beruht, die eine negative Ladung hat.
Zusätzlich ist ein Isolierverfahren für ein biologisches Reinmaterial bekannt, das ein magnetisch reaktionsfähiges Teilchen verwendet, das ein Innenkern-Polymerteilchen und eine magnetisch reagierende Metalloxid/Polymer-Beschichtung aufweist, die das Teilchen gleichmäßig bedeckt (Japanische Patentanmeldung unter PCT-Veröffentlichung unter Kohyo Nr. Hei-2-501753 ).
Da aber eine funktionelle Gruppe oft der Oberfläche des magnetisierten Teilchens zugefügt ist, sind diese zur Isolierung von Nukleinsäure auf der Grundlage spezifischer Adsorption von Vorteil, aber zur unspezifischen Isolierung unzweckmäßig.
Allgemein sind bei Verwendung eines oberflächenbeschichteten magnetischen Teilchens als Festphasenträger zur Isolierung biologischer Substanzen große Teilchen (Durchmesser z. B. mindestens 20 μm) vorteilhaft, da sie in der Tendenz auch in einem schwachen Magnetfeld leicht reagieren. Andererseits erzeugen große Teilchen schnell Absetzungen, sind schlecht betriebsfähig, haben eine kleinere spezifische Ober fläche und zeigen geringes Bindungsvermögen mit biologischen Substanzen. Dagegen haben kleinere Teilchen (Durchmesser z. B. höchstens 0,1 μm) eine größere spezifische Oberfläche, was seinerseits das Bindungsvermögen mit Nukleinsäure u. ä. verbessert, und bessere Betriebsfähigkeit, da Absetzungen nicht so leicht auftreten. Da kleinere Teilchen andererseits eine geringere Reaktionsfähigkeit auf ein Magnetfeld zeigen, ist ein starkes Magnetfeld zum Auffangen des Trägers notwendig.
Wie zuvor beschrieben, enthalten bekannte Isolierverfahren für biologische Substanzen mit Hilfe magnetischer Träger noch viele verbesserungswürdige Aspekte. Unter anderen steht die Dispergierbarkeit des magnetischen Trägers in einer wäßrigen Lösung einer die biologische Zielsubstanz enthaltenden Probe in direkter Beziehung mit der Kontakthäufigkeit mit der biologischen Substanz, was ein wichtiger Faktor ist, der für das Bindungsvermögen des magnetischen Trägers und der biologischen Zielsubstanz und ferner für das Trennungsvermögen der biologischen Substanz verantwortlich ist. Zudem beeinflußt die Auffangbarkeit des magnetischen Trägers infolge des Magnetfelds direkt den Wirkungsgrad der Fest-Flüssig-Trennung und die Zeiteinsparung im Isolierverfahren biologischer Substanzen, die Techniken der Magnetfeldtrennung nutzen.
Die WO 00/32762 offenbart magnetische Teilchen zum Reinigen von Nukleinsäuren mit einer Glasoberfläche und einem magnetischen Kern. Der Kern kann eine Größe von 0,5 bis 1,5 μm haben.
Die Erfindung zielt auf die Lösung der o. g. Probleme ab. Hauptsächlich bezweckt die Erfindung die Bereitstellung eines magnetischen Trägers mit ausgezeichneter Dispergierbarkeit in wäßrigen Lösungen und ebensolcher Auffangbarkeit infolge des Magnetfelds, ausgezeichneter reversierbarer Bindungsfähigkeit mit einer biologischen Substanz und Elutionsfähigkeit der gebundenen biologischen Substanz verglichen mit herkömmlichen Trägern, sowie das Erreichen eines verbesserten Isolier- und Reinigungsvermögens biologischer Substanzen.
Außerdem zielt die Erfindung auf die Bereitstellung eines magnetischen Trägers ab, der für ein Mikro-TAS (Totalanalysensystem) geeignet ist, das ein zweckmäßiges Verfahren zur Analyse von Nukleinsäure mit Extraktion und Reinigung darstellt. Erwünscht ist, daß der auf das Mikro-TAS anzuwendende magnetische Träger eine kleinere Teilchengröße und eine ausgezeichnete Fließfähigkeit in einem Lösungsmittel hat. Er erleichtert den Durchgang im System durch das Magnetfeld. Dazu ist erwünscht, magnetische Teilchen mit einer Verbindung zur Nukleinsäurebindung zu beschichten, die hervorragende gleichmäßige Haftung hat.
Zur Lösung der o. g. Aufgabe wurde im Rahmen der Erfindung die Korrelation zwischen magnetischen Eigenschaften magnetischer Träger und dem Nukleinsäure-Isoliervermögen näher untersucht, was auf dem Gebiet biologischer Substanzen, besonders der Nukleinsäurereinigung, bisher nie Berücksichtigung fand. Als Ergebnis wurde folgendes festgestellt: Damit ein magnetischer Träger, der ein ferromagnetisches Eisenoxidteilchen enthält, Bindungsvermögen für biologische Substanzen, Auffangbarkeit infolge des Magnetfelds, Dispergierbarkeit in wäßriger Lösung und Elutionsvermögen biologischer Substanzen in Kombination hat, ist eine Steuerung der magnetischen Eigenschaften des magnetischen Trägers extrem wichtig. Genauer gesagt kann ein magnetischer Träger, der von den magnetischen Eigenschaften eine Koerzitivkraft und eine Sättigungsmagnetisierung in speziellen Bereichen sowie vorzugsweise eine mittlere Teilchengröße in einem speziellen Bereich hat, die o. g. Probleme lösen.
Zudem kann der magnetische Träger, der die o. g. Probleme zu lösen vermag, mit einer Verbindung beschichtet sein, die ein ferromagnetisches Eisenoxidteilchen und Silicium enthält. Von solchen magnetischen Trägern hat ein magnetischer Träger, bei dem eine spezifische Menge von Silika auf die Oberfläche eines kugel- oder körnchenförmigen ferromagnetischen Eisenoxidteilchens aufgetragen ist, Bindungsvermögen mit biologischen Substanzen (insbesondere Nukleinsäure), Auffangbarkeit infolge des Magnetfelds, Dispergierbarkeit in wäßriger Lösung und Elutionsvermögen biologischer Substanzen in gutem Ausgleich. Ferner zeigt ein magnetischer Träger, bei dem eine Silicium und Aluminium enthaltende Verbindung auf die Oberfläche eines ferromagnetischen Eisenoxidteilchens aufgetragen ist, gute Beschichtungsgleichmäßigkeit, was die o. g. Probleme löst, sowie ausgezeichnetes Fließvermögen.
Die Erfindung ist durch die Merkmale der Ansprüche festgelegt.
1 zeigt eine REM-Abbildung (30.000-fache Vergrößerung) des im Beispiel 1 erhaltenen erfindungsgemäßen magnetischen Trägers.
2 zeigt eine REM-Abbildung (30.000-fache Vergrößerung) des im Beispiel 3 erhaltenen erfindungsgemäßen magnetischen Trägers.
3 zeigt eine REM-Abbildung (30.000-fache Vergrößerung) des im Referenzbeispiel 13 erhaltenen erfindungsgemäßen magnetischen Trägers.
4 zeigt Elektrophoreseabbildungen der Nukleinsäuren, die mit Hilfe der in den Referenzbeispielen 13 bis 15 und im Vergleichsreferenzbeispiel 6 erhaltenen Träger zurückgewonnen wurden, wobei
M einen Molekulargewichtsmarker bezeichnet;
Spuren 1 und 2 die Ergebnisse der Nukleinsäure-Extraktionsreinigung durch den Gebrauch des Trägers des Referenzbeispiels 13 zeigen;
Spuren 3 und 4 die Ergebnisse der Nukleinsäure-Extraktionsreinigung mit Hilfe des Trägers des Referenzbeispiels 14 zeigen;
Spuren 5 und 6 die Ergebnisse der Nukleinsäure-Extraktionsreinigung mit Hilfe des Trägers des Referenzbeispiels 15 zeigen; und
Spuren 7 und 8 die Ergebnisse der Nukleinsäure-Extraktionsreinigung mit Hilfe des Trägers des Vergleichsreferenzbeispiels 6 zeigen.
Der in der Erfindung zu verwendende magnetische Träger hat [1] eine Sättigungsmagnetisierung von 30 bis 80 A·m²/kg, [2] eine Koerzitivkraft von 2,39 bis 11,94 kA/m und [3] eine mittlere Teilchengröße von 0,12 bis 0,45 μm. Ferner weist der magnetische Träger Magnetitteilchen und eine Silikabeschichtung auf der Oberfläche der Magnetitteilchen auf, wobei die Menge der Silikabeschichtung 3 bis 100 Gew.-% der Magnetitteilchen beträgt. Alle beanspruchten Verfahren und Verwendungsfälle beinhalten diesen Träger.
[1] Sättigungsmagnetisierung
Die Sättigungsmagnetisierung des magnetischen Trägers beträgt 30 bis 80 A·m²/kg (30 bis 80 emu/g), stärker bevorzugt 35 bis 75 A·m²/kg (35 bis 75 emu/g).
Die Sättigungsmagnetisierung hängt mit der Auffangbarkeit von magnetischem Träger zusammen. Allgemein geht eine größere Sättigungsmagnetisierung mit einer stärker verbesserten Reaktionsfähigkeit auf das Magnetfeld einher. Als Ergebnis läßt sich magnetischer Träger in einer Suspension in kurzer Zeit effizient auffangen. Solange die Sättigungsmagnetisierung im o. g. Bereich liegt, kann die Auffangleistung des magnetischen Trägers am stärksten verbessert sein, ohne die Bindungsfähigkeit mit einer biologischen Substanz zu beeinträchtigen, was später zu erwähnen ist. Liegt die Sättigungsmagnetisierung unter 10 A·m²/kg (10 emu/g), ist die Reaktionsfähigkeit des magnetischen Trägers auf das Magnetfeld beeinträchtigt, was das Ausflocken erschwert (schwieriges Auffangen). Damit man einen magnetischen Träger mit einer Sätti gungsmagnetisierung über 80 A·m²/kg (80 emu/g) erhält, muß die Menge einer biologisch bindenden Substanz (Silika usw.), die auf das magnetische Teilchen aufzutragen ist, verringert werden, was wiederum zu tendenziell verringerter Bindungsleistung mit einer biologischen Substanz und geringerer Dispergierbarkeit führt.
Bestimmen läßt sich die Sättigungsmagnetisierung des magnetischen Trägers z. B. durch Messen der Magnetisierung bei Anlegen eines Magnetfelds von 796,5 kA·m (10 Kilooersted) mit Hilfe eines Schwingprobenmagnetometers (TOEI INDUSTRY CO. LTD).
Ist der magnetische Träger ein mit Silika beschichtetes ferromagnetisches Eisenoxidteilchen, wird die Sättigungsmagnetisierung des magnetischen Trägers durch die Sättigungsmagnetisierung des ferromagnetischen Eisenoxidteilchens und die aufzutragende Menge des Silikas bestimmt. In diesem Fall liegt die Sättigungsmagnetisierung des magnetischen Trägers im Bereich von 30 bis 80 A·m²/kg (30 bis 80 emu/g).
Weist der magnetische Träger ein ferromagnetisches Eisenoxidteilchen auf, das mit einer Silicium und Aluminium aufweisenden Verbindung beschichtet ist, wird die Sättigungsmagnetisierung des magnetischen Trägers durch die Sättigungsmagnetisierung des ferromagnetischen Eisenoxidteilchens und die Menge der Silicium und Aluminium aufweisenden Verbindung bestimmt. In diesem Fall liegt die Sättigungsmagnetisierung des magnetischen Trägers am stärksten bevorzugt im Bereich von 10 bis 80 A·m²/kg (10 bis 80 emu/g). Ein solcher Träger wird aber nicht beansprucht.
[2] Koerzitivkraft
Die Koerzitivkraft des magnetischen Trägers beträgt 2,39 bis 11,94 kA/m (30 bis 150 Oersted), stärker bevorzugt 3,19 bis 10,35 kA/m (40 bis 130 Oersted).
Die Koerzitivkraft hängt eng mit dem Elutionsvermögen der biologischen Substanz aus dem magnetischen Träger zusammen. Der magnetische Träger wird durch das zum Auffangen angelegte Magnetfeld in gewissem Grad magnetisiert. In diesem Fall bewirkt eine größere Koerzitivkraft eine größere Ausflockungskraft zwischen magnetischen Trägern, was seinerseits die Dispergierbarkeit des magnetischen Trägers bei der Elution biologischer Substanz aus dem magnetischen Träger beeinträchtigt. Als Ergebnis wird die Flution der mit dem magnetischen Träger gebundenen biologischen Substanz in der Lösung schwierig, und das Isoliervermögen für die biologische Substanz sinkt in der Tendenz. Die Koerzitivkraft des magnetischen Trägers verursacht kein praktisches Problem, während sie klein ist, aber die Herstellung eines magnetischen Trägers mit kleiner Koerzitivkraft hängt mit Einschränkungen der Art zu verwendender Materialien (ferromagnetisches Eisenoxidteilchen usw.) und den Syntheseverfahren des magnetischen Trägers zusammen. Im Rahmen der Erfindung wurde der Optimalbereich der Koerzitivkraft untersucht, der die biologische Substanz und insbesondere die Reinigung von Nukleinsäure nicht beeinflußt, und es wurde festgestellt, daß kein praktisches Problem auftritt, wenn die Koerzitivkraft im o. g. Bereich liegt.
Bestimmen läßt sich die Koerzitivkraft des magnetischen Trägers mit Hilfe eines Schwingprobenmagnetometers (TOEI INDUSTRY CO. LTD) z. B. durch Anlegen eines Magnetfelds von 796,5 kA·m (10 Kilooersted) zur Sättigungsmagnetisierung, Verringern des Magnetfelds auf null, Anlegen des Magnetfelds auf solche Weise, daß das Magnetfeld in umgekehrter Richtung allmählich steigt und Ablesen der Stärke des angelegten Magnetfelds zu der Zeit, zu der der Magnetisierungswert null wird.
Ist der magnetische Träger ein mit Silika beschichtetes ferromagnetisches Eisenoxidteilchen, wird die Koerzitivkraft des magnetischen Trägers am stärksten durch die Koerzitivkraft des ferromagnetischen Eisenoxidteilchens bestimmt. In diesem Fall beträgt die Koerzitivkraft des magnetischen Trägers 2,39 bis 11,94 kA/m (30 bis 150 Oersted), und die Sättigungsmagnetisierung beträgt 30 bis 80 A·m²/kg (30 bis 80 emu/g).
[3] Mittlere Teilchengröße
Der magnetische Träger hat eine mittlere Teilchengröße von 0,12 bis 0,45 μm. Ist die mittlere Teilchengröße des magnetischen Trägers zu klein (z. B. unter 0,1 μm), wird das Auffangen von magnetischem Träger durch das Magnetfeld schwierig, und die erneute Dispersion nach Wegfall des Magnetfelds wird in der Tendenz erschwert. Ist die Teilchengröße des magnetischen Trägers zu groß (z. B. über 10 μm), bildet der magnetische Träger leicht Absetzungen, und die spezifische Oberfläche wird zu klein, was oft die Bindungsleistung mit einer biologischen Substanz verschlechtert.
Im Gebrauch hierin bezeichnet "Teilchengröße" des magnetischen Trägers die maximale Länge aller Längen in jeder Richtung des Teilchens. Berechnet wird die mittlere Teilchengröße des o. g. magnetischen Trägers zudem z. B. durch Messen der Teilchengröße von jeweils 300 Teilchen auf einer transmissionselektronenmikroskopischen Fotografie und Berechnen ihres Zahlenmittels.
Die Form des magnetischen Trägers ist vorzugsweise kugel- oder körnchenförmig.
Ist der magnetische Träger ein mit Silika beschichtetes ferromagnetisches Eisenoxidteilchen, hat ein kugel- oder körnchenförmiges Teilchen eine mittlere Teilchengröße von 0,12 bis 0,45 μm. In diesem Fall können Teilchen mit einer Struktur vorhanden sein, bei der mehrere ferromagnetische Bisenoxidteilchen mit Silika beschichtet sind, solange die mittlere Teilchengröße im o. g. Bereich liegt.
Ist der magnetische Träger ein ferromagnetisches Eisenoxidteilchen, das mit einer Silicium und Aluminium aufweisenden Verbindung beschichtet ist, beträgt eine mittlere Teilchengröße vorzugsweise 0,1 bis 10 μm, stärker bevorzugt 0,12 bis 8 μm. Allerdings wird ein solcher Träger nicht beansprucht.
Der für die Erfindung zu verwendende magnetische Träger hat ausgezeichnetes Isoliervermögen, indem er gleichzeitig die o. g. Punkte [1], [2] und [3] erfüllt. Genauer gesagt hat der magnetische Träger der Erfindung ein auffallend ausgezeichnetes Vermögen bei den nachfolgenden Punkten (a) bis (c) verglichen mit herkömmlichen magnetischen Trägern:

(a) Dispergieren in einer Menge von mindestens 20 mg in 1 ml einer wäßrigen Lösung einer Probe, die eine biologische Substanz enthält,
(b) Auffangen von mindestens 90 Gew.-% in 3 Sekunden in Gegenwart eines Magnetfelds von 2000 bis 3000 Gauß, und
(c) reversibles Binden mit mindestens 0,4 μg einer biologischen Substanz je 1 mg Träger.

Im folgenden werden die Punkte (a) bis (c) erläutert.
(a) Dispergieren in einer Menge von mindestens 20 mg in 1 ml einer wäßrigen Lösung einer Probe, die eine biologische Substanz enthält
Ein superparamagnetischer magnetischer Träger, der ein auf diesem Gebiet herkömmlich verwendeter typischer magnetischer Träger ist, unterscheidet sich grundsätzlich vom magnetischen Träger der Erfindung (der ein ferromagnetisches Eisenoxidteilchen u. ä. verwendet) dadurch, daß er eine Sättigungsmagnetisierung von höchstens 10 A·m²/kg und eine Koerzitivkraft von höchstens 0,80 kA/m hat. Für einen superparamagnetischen magnetischen Träger wird allgemein ein Stoff mit sehr kleiner Sättigungsmagnetisierung und Koerzitivkraft ver wendet, oder er sollte so hergestellt sein, daß er eine kleine Teilchengröße hat (z. B. höchstens 0,1 μm).
Allgemein gilt, daß eine kleinere Teilchengröße gute Dispergierbarkeit begünstigt. Im Gebrauch hierin bezeichnet "dispers" einen Zustand, in dem magnetischer Träger in einer wäßrigen Lösung einer Probe stabil schwebt, die eine biologische Substanz enthält, ohne bei Sichtbeobachtung eine Absetzung in der wäßrigen Lösung zu bilden. Bewerten läßt sich die Dispergierbarkeit eines solchen magnetischen Trägers z. B. durch Beobachtung der Position der Grenzfläche zwischen der Absetzflüssigkeit und dem Überstand nach Stehenlassen einer den magnetischen Träger enthaltenden wäßrigen Lösung für eine bestimmte Zeit. Trennt sich der Überstand nicht nach langem Stehenlassen, wird die Dispergierbarkeit als gut bewertet. Ein magnetischer Träger, der ein superparamagnetisches Teilchen mit einer kleinen Teilchengröße (höchstens 0,1 μm) verwendet, zeigt allgemein gute Dispergierbarkeit.
(b) Auffangen von mindestens 90 Gew.-% in 3 Sekunden in Gegenwart eines Magnetfelds von 2000 bis 3000 Gauß
Das Auffangen von 90 Gew.-% eines superparamagnetischen magnetischen Trägers, der ein auf diesem Gebiet herkömmlich verwendeter typischer magnetischer Trägers ist, in Gegenwart eines Magnetfelds von 2000 bis 3000 Gauß dauert über 10 Sekunden. Mit einem solchen herkömmlichen magnetischen Träger können nur etwa 1 bis 50 Gew.-% bei 3-sekündiger Gegenwart des o. g. Magnetfelds aufgefangen werden. Bewerten läßt sich die leichte Auffangbarkeit von magnetischem Träger z. B. durch 3-sekündiges Belassen einer den magnetischen Träger enthaltenden Lösung auf einem Magneten, der ein Magnetfeld von 2000 bis 3000 Gauß erzeugen kann, Entfernen der Lösung, die nicht durch das Magnetfeld aufgefangen wurde, und anschließendes Messen des Gewichts des durch das Magnetfeld aufgefangenen magnetischen Trägers. Bei Verwendung eines magnetischen Trägers mit einer Sättigungsmagnetisierung von höchstens 10 A·m²/kg und einer Koerzitivkraft von höchstens 0,80 kA/m ist das Auffangen von 90 Gew.-% in Gegenwart eines Magnetfelds von 2000 bis 3000 Gauß in 3 Sekunden schwierig, da die Empfindlichkeit gegenüber dem Magnetfeld niedrig ist. Außerdem ist das Auffangen von 90 Gew.-% eines magnetischen Trägers mit einer Teilchengröße von höchstens 0,1 μm in 3 Sekunden schwierig, da die Dispergierbarkeit in der Lösung hoch und die Trennung durch das Magnetfeld schwierig ist.
Das externe Magnetfeld von 2000 bis 3000 Gauß entspricht einem Bereich eines bevorzugten externen Magnetfelds zur Trennung eines Komplexes aus einem magnetischen Träger und einer biologischen Substanz, die miteinander gebunden sind, aus einer Probe auf dem Gebiet der Isolierung einer Probe, die eine biologische Substanz enthält, mit Hilfe eines magnetischen Trägers. Ist es kleiner als 2000 Gauß, wird die Empfindlichkeit des Komplexes gegenüber dem Magnetfeld in der Tendenz schwach, und übersteigt es 3000 Gauß, wird eine Vorrichtung zur Erzeugung des Magnetfelds groß und teuer.
(c) Reversibles Binden mit mindestens 0,4 μg einer biologischen Substanz je 1 mg Träger
Ein superparamagnetischer magnetischer Träger, der ein auf diesem Gebiet herkömmlich verwendeter typischer magnetischer Träger ist, kann sich nur mit etwa 0,3 μg einer biologischen Probe je 1 mg Träger reversibel binden. Im Gebrauch hierin bedeutet die Fähigkeit zur reversiblen Bindung, daß ein magnetischer Träger und eine biologische Substanz künstlich miteinander gebunden und durch ein reproduktives Verfahren voneinander getrennt werden können, ohne ihre Eigenschaften zu ändern. Nachweisen kann man die Fähigkeit zum reversiblen Binden durch das Verfahren zum Isolieren einer biologischen Substanz aus einer die biologische Substanz enthaltenden Probe gemäß der Beschreibung in den späteren Beispielen.
Erreichen lassen sich die o. g. Punkte (a) bis (c) durch gleichzeitiges Erfüllen der Bindungsfähigkeit mit einer biologischen Substanz, der Auffangbarkeit des magnetischen Trägers durch ein Magnetfeld, der Dispergierbarkeit des magnetischen Trägers und des Elutionsvermögens biologischer Substanzen. Durch den Einsatz von solchem magnetischen Träger verbessert sich das Isolier- und Reinigungsvermögen für biologische Substanzen.
Der magnetische Träger weist grundsätzlich ein ferromagnetisches Eisenoxidteilchen (Magnetitteilchen in der Erfindung) und Silika auf, das auf das ferromagnetische Eisenoxidteilchen aufzutragen ist. Im Gebrauch hierin bedeutet "Auftragen/Beschichten", daß eine Silikaschicht auf der äußersten Schicht des magnetischen Trägers gebildet wird, wobei sie die Außenseite des ferromagnetischen Eisenoxidteilchens abdeckt, und ist synonym mit Haftenlassen von Silika an der Oberflächenumgebung des ferromagnetischen Eisenoxidteilchens. Die Silikaschicht kann so gebildet sein, daß sie das ferromagnetische Eisenoxidteilchen vollständig bedeckt. Alternativ kann das ferromagnetische Eisenoxidteilchen teilweise freiliegen, solange das Bindungsvermögen mit Silika und einer zu isolierenden biologischen Substanz nicht behindert ist. Nur ein ferromagnetisches Eisenoxidteilchen kann mit Silika beschichtet sein, um einen magnetischen Träger zu ergeben, oder eine Gruppe von 2 bis 100 ferromagnetischen Eisenoxidteilchen kann mit Silika beschichtet sein, um einen magnetischen Träger zu ergeben. Zum Silika in der Erfindung gehören SiO₂-Kristall und andere Formen von Silikamolekülen, aus SiO₂ bestehendes Kieselalgenskelett und amorphes Silika.
Die ferromagnetischen Eisenoxidteilchen mit einer Kugel- oder Körnchenform finden Anwendung auf einen breiten Einsatzbereich, z. B. zur magnetischen Aufzeichnung, Toner für Kopiergeräte, schwarzfarbiger Zusatzstoff für verschiedene Harze u. ä. Diese ferromagnetischen Eisenoxidteilchen sollen un abhängig von einem Trocken- oder Naßverwendungsverfahren in einem Medium gleichmäßig dispergieren. Daher erfährt das ferromagnetische Eisenoxidteilchen eine Oberflächenbehandlung, um die Dispergierbarkeit zu verbessern. Für die Oberflächenbehandlung sind ein Verfahren mit Oberflächenbehandlung mit einem anorganischen Material und ein Verfahren mit Oberflächenbehandlung mit einem organischen Material bekannt. Als Verfahren zur Oberflächenbehandlung mit einem anorganischen Material wird allgemein eine Beschichtung aus Silika oder Aluminiumoxid gebildet.
Die Bildung einer Silikabeschichtung nahe der Oberfläche jedes ferromagnetischen Eisenoxidteilchens ist nicht sonderlich neu. Wird aber eine Silikabeschichtung mit dem Ziel der Verbesserung der Dispergierbarkeit zum Tonergebrauch u. ä. aufgetragen, ist die Bildung einer gleichmäßigen Beschichtung zum Abdecken der Oberfläche jedes Teilchens von Bedeutung, und die aufzutragende Silikamenge ist unwichtig. Ist verbesserte Dispergierbarkeit gewünscht, beträgt die auf das ferromagnetische Eisenoxidteilchen aufzutragende Silikamenge allgemein höchstens mehrere Gew.-%. Soll verbesserte Dispergierbarkeit erreicht werden, führt z. B. das Beschichten mit 2 Gew.-% Silika oder mehr zu keiner weiteren Dispergierbarkeitsverbesserung. Statt dessen nimmt die redundante Silikamenge ohne Magnetismus zu, was die Sättigungsmagnetisierung und Schwärze verringert.
Daher gab es keine Verwendung für ein ferromagnetisches Eisenoxidteilchen, das mit mehreren Gew.-% Silika oder mehr beschichtet war, wodurch die Beschichtung mit einer solchen großen Silikamenge nicht untersucht wurde.
Im Rahmen der Erfindung wurden verschiedene magnetische Träger mit variierender Silikamenge hergestellt, die an jedem ferromagnetischen Eisenoxidteilchen haftet, und man untersuchte die Bindungsfähigkeit mit Nukleinsäure, das Auffangen durch das Magnetfeld, die Dispergierbarkeit bei Wegfall des Magnetfelds und das Elutionsvermögen von Nukleinsäure, wobei unerwartet festgestellt wurde, daß ein magnetischer Träger, der zwecks Verleihen von Dispergierbarkeit mit einer weitaus größeren Silikamenge als die Silikamenge beschichtet ist, die zum Beschichten jedes ferromagnetischen Eisenoxidteilchens als notwendig gilt, ausgezeichnete Leistung nicht nur bei der Bindungsfähigkeit mit Nukleinsäure/ beim Auffangen durch das Magnetfeld, sondern auch bei der Dispergierbarkeit nach Wegfall des Magnetfelds/beim Elutionsvermögen von Nukleinsäure zeigt.
Das heißt, ein magnetischer Träger mit einer mittleren Teilchengröße von 0,1 bis 0,5 μm, der durch Beschichten eines kugel- oder körnchenförmigen ferromagnetischen Eisenoxidteilchens mit Silika in einer Menge von 3 bis 100 Gew.-% erhalten wird, die viel größer als die herkömmlich als optimal geltende Menge zum Verleihen von Dispergierbarkeit ist, hat ein überaus hohes Bindungsvermögen mit Nukleinsäure.
Infolge der Beschaffenheit von Nukleinsäure, die bevorzugte Bindung mit Silika zeigt, bedeutet eine größere Haftungsmenge von Silika allgemein eine größere Bindungsmenge von Nukleinsäure. Bei herkömmlichen magnetischen Trägern wird aber eine Gruppe, die aus mehreren magnetischen Teilchen mit kleinerer Teilchengröße vor dem Beschichten mit Silika besteht, mit Silika beschichtet. Daher wird die mittlere Teilchengröße des resultierenden magnetischen Trägers größer (0,5 bis 15 μm), und die zur Bindung mit Nukleinsäure effektive Oberfläche wird kleiner.
Bei solchem magnetischen Träger erhöht die Haftung einer großen Silikamenge nur die Filmdicke der Silikaschicht auf der Oberfläche, wodurch die Oberfläche der Silikaschicht, die zur Bindung mit Nukleinsäure wirksam ist, nicht wesentlich vergrößert wird.
Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, daß die Menge der Nukleinsäurebindung durch direktes Haftenlassen von Silika an ferromagnetischen Eisenoxidteilchen erhöht werden kann und daß zum Erreichen dessen der Silika aufweisende magnetische Träger verkleinert werden sollte (siehe den o. g. Punkt [3]).
In dieser Beschreibung ist das "ferromagnetische Eisenoxidteilchen" ein Teilchen mit magnetischer Reaktionsfähigkeit (Empfindlichkeit gegenüber dem Magnetfeld), die durch Oxidation von Metallteilchen erhalten werden kann. Die Ansprüche sind auf Magnetitteilchen beschränkt. Im Rahmen der Erfindung untersuchte man die Kompatibilität verschiedener ferromagnetischer Eisenoxidteilchen als magnetischer Träger zur Nukleinsäureextraktion über lange Jahre von Erfahrungen bei der Entwicklung von magnetischem Material zur magnetischen Aufzeichnung. Als ferromagnetische Eisenoxidteilchen sind Maghemitteilchen (γ-Fe₂O₃), Magnetitteilchen (Fe₃O₄ (die Erfindung)), Mangan-Zink-Ferrit-Teilchen (Mn_1-xZn_xFe₂O₄), Metalleisenteilchen (α-Fe), Eisen-Cobalt-Legierungsteilchen (FeCo) und Bariumferritteilchen (BaFe₁₂O₁₉) am besten geeignet. Von diesen ferromagnetischen Eisenoxidteilchen kann Eisenoxid mit einem zweiwertigen Eisenion, z. B. Magnetitteilchen u. ä., ein amphoteres Eisenoxid von Magnetit und Maghemit (amphoteres Magnetit-Maghemit-Eisenoxidteilchen) sein, das von der o. g. Stöchiometrie soweit abweicht, daß die Kristallstruktur gewahrt bleiben kann. Magnetische Metallteilchen, z. B. Metalleisen-, Eisen-Cobalt-Legierungsteilchen u. ä., sind gegenüber Feuchtigkeit instabil und zeigen in der Tendenz geringere Sättigungsmagnetisierung bei Eintauchen in Wasser. Mangan-Zink-Ferrit-Teilchen zeigen tendenziell geringere Sättigungsmagnetisierung verglichen mit ferromagnetischen Eisenoxidteilchen, die nur aus Eisen bestehen. Da zusätzlich Bariumferritteilchen eine übermäßig hohe Koerzitivkraft haben, flockt der magnetische Träger beim Eluieren der gebundenen Nukleinsäure nach Auffangen mit einem Magneten u. ä. leicht magnetisch aus, was die Elutionsfähigkeit der Nukleinsäure beeinträchtigt. Die zuvor erwähnte "magnetische Reaktionsfähigkeit" bedeutet, daß bei Vorhandensein eines externen Magnetfelds infolge eines Magneten u. ä. das Teilchen Empfindlichkeit gegenüber dem Magnetfeld zeigt, was durch Magnetisierung durch das Magnetfeld, Anziehung durch den Magneten u. ä. zutage tritt.
Im Rahmen der Erfindung wurden verschiedene magnetische Teilchen mit Silika beschichtet, es wurde die Kompatibilität als magnetischer Träger zur Isolierung biologischer Substanzen gemäß der späteren Darstellung untersucht, und man stellte fest, daß das o. g. Maghemitteilchen (γ-Fe₂O₃) und Magnetitteilchen (Fe₃O₄) sowie ein amphotere Eisenoxidteilchen davon zur Realisierung der o. g. Sättigungsmagnetisierung des magnetischen Trägers am besten geeignet sind und ein ausgezeichnetes Gleichgewicht der Eigenschaften haben. Da insbesondere Magnetitteilchen etwa 15 größere Sättigungsmagnetisierung als Maghemitteilchen und eine niedrigere Koerzitivkraft haben, sind sie als ferromagnetische Eisenoxidteilchen der Erfindung besonders bevorzugt.
Das ferromagnetische Eisenoxidteilchen der Erfindung unterliegt keiner speziellen Einschränkung in seiner Form und kann verschiedene Formen haben, z. B. Kugel, Ellipsoid, Körnchen, Plättchen, Nadel, Polyeder u. ä. Ist es nadel- oder plättchenförmig, kann eine anisotrope Koerzitivkraft auftreten. Somit ist eine Kugel-, Körnchen- oder Ellipsoidform bevorzugt, die frei von solcher Anisotropie ist, insbesondere vorzugsweise eine Kugelform. Das heißt, das bevorzugte Aspektverhältnis (Verhältnis der größten Länge und kleinsten Länge in der Messung in beliebiger Richtung) des Teilchens beträgt 0,5 bis 2,0. Im Gebrauch hierin versteht man unter "kugelförmig" eine Form mit einem Aspektverhältnis von 1,0 bis 1,2 (mindestens 1,0 und höchstens 1,2), und unter "ellipsoid" versteht man eine Form, bei der das Aspektverhältnis 1,2 übersteigt und höchstens 1,5 beträgt. Mit "körnchenför mig" ist eine Form bezeichnet, die die gleiche Teilchenlänge in allen Richtungen wie eine Kugel hat und insgesamt frei von spezieller Anisotropie, aber richtungsabhängigen Längenänderung unterworfen ist, z. B. ellipsoid mit einer größeren Länge nur in einer Richtung.
Während der ferromagnetische Eisenoxidteilchengehalt des magnetischen Trägers in der Erfindung durch die Ansprüche begrenzt ist, beträgt er vorzugsweise 50 bis 95 Gew.-%, stärker bevorzugt 60 bis 90 Gew.-% des magnetischen Trägers. Liegt der Gehalt unter 50 Gew.-%, wird die Sättigungsmagnetisierung des magnetischen Trägers klein, und die Empfindlichkeit gegenüber dem Magnetfeld ist in der Tendenz gering. Übersteigt der Gehalt 95 Gew.-%, wird die Menge von Silika u. ä. zur Beschichtung des ferromagnetischen Eisenoxidteilchens klein, was die Isolierung von Nukleinsäure erschwert.
Im folgenden wird ein bevorzugtes Verfahren anhand einer Ausführungsform unter Verwendung eines Magnetitteilchens als ferromagnetisches Eisenoxidteilchen näher beschrieben.
Synthese von Magnetitteilchen
Die Magnetitteilchen können durch das im folgenden dargestellte Verfahren mit Oxidation von Eisensalz in einer wäßrigen Lösung synthetisiert werden. Zunächst wird einer wäßrigen Lösung zweiwertiger Fe-Ionen, in der Eisensulfat (FeSO₄·6H₂O) gelöst wurde, eine wäßrige NaOH-Lösung tropfenweise zugegeben, damit Eisendihydroxid [Fe(OH)₂] ausscheiden kann. Diese Eisendihydroxidsuspension wird auf pH 9 bis 10 eingestellt und durch Einblasen von Luft oxidiert, um Magnetitteilchen wachsen zu lassen.
Liegt der pH-Wert unter dem o. g. Bereich, wird die Ausscheidung von Magnetit langsam. Liegt der pH-Wert über dem o. g. Bereich, wächst Goethit (α-FeOOH) in der Tendenz an. Der Luftdurchfluß und die Haltetemperatur der Suspension beeinflussen stark die Teilchengröße der Magnetitteilchen. Er wünscht ist, den Luftdurchfluß auf 100 bis 400 Liter/Stunde zu steuern, und erwünscht ist, die Haltetemperatur der Suspension auf 50 bis 90 °C zu steuern. Allgemein beschleunigt ein höherer Luftdurchfluß das Kristallwachstum des Magnetits, und die Teilchengröße wird kleiner. Ist der Luftdurchfluß zu klein oder zu groß, mischen sich andere Stoffe als Magnetit bei der Ausscheidung leicht ein. Eine höhere Haltetemperatur bewirkt leichtes Kristallwachstum des Magnetits, und die Teilchengröße steigt. Ist die Haltetemperatur zu niedrig, wachsen Goethit- (α-FeOOH) Teilchen leicht an.
Gemäß diesem Verfahren können Magnetitteilchen mit einer mittleren Teilchengröße von 0,05 bis 0,5 μm, vorzugsweise 0,1 bis 0,5 μm, synthetisiert werden. Unter "Teilchengröße" der Magnetitteilchen (ferromagnetischen Eisenoxidteilchen) versteht man die des o. g. magnetischen Trägers, und die mittlere Teilchengröße der Magnetitteilchen (ferromagnetischen Eisenoxidteilchen) kann auf die gleiche Weise wie die mittlere Teilchengröße der o. g. magnetischen Träger berechnet werden. Anders gesagt läßt sich die mittlere Teilchengröße durch Messen der Größe von 300 Teilchen auf einer rasterelektronenmikroskopischen (REM-) Abbildung und Berechnen des Mittelwerts bestimmen.
Haftenlassen von Silika
Als ferromagnetische Eisenoxidteilchen können getrennt erhaltene Trockenteilchen in Wasser dispergiert werden. Allerdings ist bevorzugt, wie zuvor erhaltene ferromagnetische Eisenoxidteilchen mit einer Silikabeschichtung zu versehen, ohne einen Trockenschritt zu durchlaufen grund dafür ist, daß die Verwendung in Form einer wasserhaltigen Suspension zu guter Dispergierbarkeit führt, gute Benetzbarkeit mit Silika zeigt und gleichmäßiges Beschichten ferromagnetischer Eisenoxidteilchen mit Silika ermöglicht.
Zum Auftragen von Silika lassen sich die beiden nachfolgend dargestellten Verfahren verwenden.
Erstes Verfahren zur Silikabeschichtung
Magnetitteilchen werden mit Reinwasser gründlich gewaschen, um eine wasserhaltige Suspension ohne Trocknen zu ergeben. Der Suspension wird eine vorbestimmte Menge Natriumsilicat (Wasserglas) zugegeben, die darin gelöst wird. Die zuzugebende Natriumsilicatmenge beträgt vorzugsweise 10 bis 300 Gew.-%, stärker bevorzugt 15 bis 250 Gew.-% der Magnetitteilchen bei Umwandlung in Silika (SiO₂). Liegt sie unter 10 Gew.-% bezogen auf die Magnetitteilchen, läßt sich höhere Sättigungsmagnetisierung leicht erhalten, aber gleichmäßiges Beschichten der Magnetitteilchen mit Silika ist in der Tendenz schwierig. Übersteigt sie 300 Gew.-% bezogen auf die Magnetitteilchen, wird die Sättigungsmagnetisierung zu klein und kann die Reaktionsfähigkeit auf das Magnetfeld bei Herstellung zu einem magnetischen Träger beeinträchtigen.
Eine Surfactant-Lösung, in der ein Surfactant in einem organischen Lösungsmittel gelöst ist, wird getrennt hergestellt. Diese Surfactant-Lösung wird mit einer Magnetitteilchensuspension gemischt, in der das o. g. Natriumsilicat gelöst wurde.
Während das Surfactant keiner speziellen Einschränkung unterliegt, ist ein Surfactant aus Sorbitanfettsäureester bevorzugt, da es sowohl Hydrophilie als auch Hydrophobie hat. Für ein Surfactant aus Sorbitanfettsäureester stehen exemplarisch Sorbitanmonostearat, Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonopalmitat, Sorbitanmonooleat, Sorbitantrioleat u. ä., von denen Sorbitanmonooleat besonders bevorzugt ist, da das Gleichgewicht von Hydrophilie und Hydrophobie zur Lösung der Aufgabe der Erfindung geeignet ist.
Vorzugsweise hat das organische Lösungsmittel geringe Lösbarkeit in Wasser, um einen Emulsionszustand zu erreichen, z. B. Benzol, Toluol, Xylol, n-Hexan, Isohexan, Cyclohexan, Ethylacetat, Butylacetat u. ä. Von diesen ist n-Hexan besonders bevorzugt, da es ausgezeichnete Betriebsfähigkeit nach Silikabeschichtung beim Extrahieren eines magnetischen Trägers aus der Reaktionsmischung, seinem Waschen u. ä. zeigt.
Eine Mischung der o. g. Surfactant-Lösung wird mit einem Mischer, z. B. Homomixer, Homogenisierer u. ä., gerührt, um eine W/O-Suspension herzustellen, die Emulsionsteilchen enthält. Die Emulsionsteilchen haben eine Struktur, bei der Magnetitteilchen und eine wäßrige Natriumsilicatlösung zu einem Surfactant in einem organischen Lösungsmittel gehören.
Während die Mischzeit je nach verwendetem Mischer variiert, beträgt sie vorzugsweise etwa 1 bis 30 min. Ist die Mischzeit zu kurz, sind gleichmäßig große Emulsionsteilchen schwierig zu erhalten. Ist die Mischzeit zu lang, reagieren Magnetitteilchen (ferromagnetische Eisenoxidteilchen) und Silika infolge von Mischungsenergie, was oft zur Erzeugung von Emulsionsteilchen ohne die o. g. Struktur führt.
Die so erhaltene, die Emulsionsteilchen enthaltende Suspension wird einer wäßrigen Ammoniumsalzlösung tropfenweise zugegeben. Durch die tropfenweise Zugabe wird Natriumsilicat durch Ammoniumsalz neutralisiert und scheidet als Silika aus. Natriumsilicat löst sich in alkalischem Wasser, aber ist in neutralem Wasser unlöslich. Dadurch werden mit Silika beschichtete kugelförmige Teilchen aus Magnetit hergestellt. Als o. g. Ammoniumsalz kommen Sulfat und Carbonat bevorzugt zum Einsatz, und Ammoniumcarbonat, Ammoniumbicarbonat, Ammoniumsulfat u. ä. sind bevorzugt.
Die tropfenweise Zugabe der Suspension in eine wäßrige Ammoniumsalzlösung wird vorzugsweise durchgeführt, damit Silika allmählich ausscheiden kann. Vorzugsweise beträgt die Zeit der tropfenweisen Zugabe 10 min bis 3 h. Liegt die Zeit der tropfenweisen Zugabe unter 10 min, hat die erhaltene Silikaschicht in der Tendenz Fehler (z. B. große Zwischenräume in der Silikaschicht) sowie Konkavitäten und Konvexitäten des magnetischen Trägers auf der Oberfläche. Auch wenn die Zeit der tropfenweisen Zugabe 3 h übersteigt, stellt dies kein spezielles Problem für die Eigenschaften dar, wobei aber eine lange Synthesezeit sinnlos ist.
Die so synthetisierten Teilchen werden mit Reinwasser gründlich gewaschen, gefiltert und luftgetrocknet. Vorzugsweise beträgt die Trockentemperatur 40 bis 120°C, stärker bevorzugt 60 bis 100 °C. Liegt die Trockentemperatur unter 40°C, kann in den magnetischen Träger aufgenommenes Wasser nicht ausreichend problemlos entfernt werden. Übersteigt die Trockentemperatur 120°C, sinkt die Sättigungsmagnetisierung in der Tendenz infolge von Oxidation der ferromagnetischen Eisenoxidteilchen. Zur ausreichenden Trocknung ohne Auswirkung auf die Eigenschaften des magnetischen Trägers beträgt die Trockenzeit vorzugsweise 1 bis 24 h, stärker bevorzugt 2 bis 20 h.
Auf diese Weise werden ferromagnetische Eisenoxidteilchen mit Silika beschichtet, und Teilchen mit einer mittleren Teilchengröße von vorzugsweise 0,1 bis 10 μm können erhalten werden. Die so erhaltenen Teilchen werden der später zu erwähnenden Wärmebehandlung unterzogen, um einen magnetischen Träger zu ergeben, der die o. g. Punkte [1] bis [3] erfüllen kann.
Zweites Verfahren zur Silikabeschichtung
Auch im zweiten Verfahren werden die wie zuvor hergestellten Magnetitteilchen (ferromagnetischen Eisenoxidteilchen) ausreichend mit Wasser gewaschen und ohne Trocknen in Wasser suspendiert, um eine Lösung zu ergeben. In diesem Fall wird das Mischungsverhältnis von Magnetitteilchen und Wasser so gesteuert, daß der Magnetitteilchengehalt 1 bis 10 Gew.-% von Wasser beträgt. Der Magnetitteilchengehalt bezogen auf Wasser beeinflußt die gleichmäßige Haftung von Silika an der Oberflächenumgebung der Magnetitteilchen, und Silika haftet am gleichmäßigsten, wenn der Magnetitteilchengehalt im o. g. Bereich liegt. Liegt der Magnetitteilchengehalt bezogen auf Wasser unter 1 Gew.-%, ist die Konzentration zu niedrig, und Silika scheidet leicht an einem anderen Teil als der Oberfläche der Magnetitteilchen aus. Übersteigt der Magnetitteilchengehalt bezogen auf Wasser 10 Gew.-%, wird die Konzentration zu hoch, und die Magnetitteilchen flocken leicht aus, was die gleichmäßige Haftung von Silika nahe der Oberfläche jedes Magnetitteilchens erschwert.
Danach wird Natriumsilicat (Wasserglas) der o. g. Suspension in einem Anteil von 3 bis 100 Gew.-%, vorzugsweise 3 bis 50 Gew.-%, bezogen auf die Magnetitteilchen bei Umwandlung in Silika (SiO₂) zugegeben. Liegt die zuzugebende Natriumsilicatmenge unter 3 Gew.-%, wird die an der Oberfläche der Magnetitteilchen haftende Silikamenge unzureichend, was die Bindung mit biologischen Substanzen erschwert. Übersteigt die zuzugebende Natriumsilicatmenge 100 Gew.-%, wird die gleichmäßige Haftung von Silika nahe der Oberfläche jedes Magnetitteilchens schwierig, was wiederum den Effekt einer erhöhten Bindungsmenge reduziert. Da zusätzlich die Menge der Sättigungsmagnetisierung als magnetischer Träger abnimmt, ist die Auffangbarkeit durch das Magnetfeld in der Tendenz schlechter.
Vorzugsweise beträgt die zuzugebende Menge des o. g. Natriumsilicats 0,3 bis 2 Gew.-%, stärker bevorzugt 0,5 bis 2 Gew.-%, bezogen auf Wasser bei Umwandlung in Silika (SiO₂). Vorzugsweise werden die Mengen der Magnetitteilchen, des Natriumsilicats und des Wassers so gesteuert, daß der Magnetitteilchengehalt bezogen auf Wasser 1 bis 10 Gew.-% beträgt. Wie im o. g. ersten Verfahren werden die ferromagnetischen Eisenoxidteilchen mit Silika mittels Ausscheidung von Silika durch Neutralisation im zweiten Verfahren beschichtet. Während der Silikaausscheidung wird die Flüssigkeitsviskosität hoch. Wird die Viskosität zu hoch, ist die gleichmäßige Haftung von Silika an der Oberflächenumgebung jedes Magnetit teilchens erschwert. Ist dagegen diese Viskosität zu niedrig, wird die Ausscheidung von Silika schwierig.
Die so synthetisierten Teilchen werden mit Reinwasser gründlich gewaschen, gefiltert und luftgetrocknet. Vorzugsweise beträgt die Trockentemperatur 40 bis 120 °C, stärker bevorzugt 60 bis 100 °C. Liegt die Trockentemperatur unter 40 °C, kann in den magnetischen Träger aufgenommenes Wasser nicht ausreichend problemlos entfernt werden. Übersteigt die Trockentemperatur 120 °C, sinkt die Sättigungsmagnetisierung in der Tendenz infolge von Oxidation der ferromagnetischen Eisenoxidteilchen. Zur ausreichenden Trocknung ohne Auswirkung auf die Eigenschaften des magnetischen Trägers beträgt die Trockenzeit vorzugsweise 1 bis 24 h, stärker bevorzugt 2 bis 20 h.
Im Vergleich zum o. g. ersten Verfahren ist dieses zweite Verfahren zur Herstellung eines magnetischen Trägers mit einer kleineren mittleren Teilchengröße geeignet, insbesondere mit einer mittleren Teilchengröße von höchstens 1 μm. Durch Anwenden der nachstehend erwähnten Wärmebehandlung auf die so erhaltenen Teilchen läßt sich ein magnetischer Träger erhalten, der die o. g. Punkte [1] bis [3] erfüllen kann.
Wärmebehandlung
Der so synthetisierte magnetische Träger zeigt ausgezeichnete Leistung als magnetischer Träger zur Extraktion und Reinigung von Nukleinsäure oder zur Reinigung von amplifizierten Nukleinsäureprodukten. Bei Wärmebehandlung dieses magnetischen Trägers werden die Eigenschaften weiter verbessert. Vorzugsweise beträgt die Temperatur der Wärmebehandlung 200 bis 800 °C, stärker bevorzugt 250 bis 500 °C. Liegt die Temperatur der Wärmebehandlung unter 200 °C, ist der nachstehend zu erwähnende Effekt der Wärmebehandlung schwierig zu erhalten. Übersteigt die Temperatur 800 °C, kommt es zum Sintern zwischen den Silikaschichten, die die ferromagnetischen Eisenoxidteilchen beschichten, und magnetischer Träger wird oft in Form einer Aggregation erhalten, was seinerseits die Dispergierbarkeit des magnetischen Trägers in einer Lösung beeinträchtigt und die Isolierung von Nukleinsäure erschwert. Die Behandlungszeit variiert je nach Behandlungstemperatur, beträgt aber vorzugsweise 1 bis 10 h. Ist die Behandlungszeit zu kurz, wird kein ausreichender Wärmebehandlungseffekt erhalten. Ist sie zu lang, aggregieren Magnetitteilchen leicht.
Obwohl der Grund für eine bevorzugte Wärmebehandlung im o. g. Temperaturbereich unklar ist, geht man im Rahmen der Erfindung von folgendem aus: Solche magnetische Eigenschaften der ferromagnetischen Eisenoxidteilchen wie Sättigungsmagnetisierung, Koerzitivkraft u. ä. variieren stark in Abhängigkeit von den Wärmebehandlungsbedingungen nach der Silikabeschichtungsbehandlung ferromagnetischer Eisenoxidteilchen. Angenommen wird, daß dies darauf zurückführbar ist, daß magnetische Träger, die durch Wärmebehandlungen ferromagnetischer Eisenoxidteilchen nach Beschichten mit Silika unter verschiedenen Bedingungen erhalten werden, variierende Kristallinität und Kristallitgröße ferromagnetischer Eisenoxidteilchen zeigen, wenngleich die scheinbare Teilchengröße identisch ist, und die magnetischen Eigenschaften der ferromagnetischen Eisenoxidteilchen stark von der Kristallinität und Kristallitgröße abhängen. Ist allgemein die Kristallinität ferromagnetischer Eisenoxidteilchen verbessert, nehmen sowohl die Sättigungsmagnetisierung als auch die Koerzitivkraft in der Tendenz zu. Wachsen die Kristalle ferromagnetischer Eisenoxidteilchen (größere Kristallitgröße), steigt die Sättigungsmagnetisierung, aber die Koerzitivkraft nimmt tendenziell ab.
Möglich ist auch, daß sich infolge dieser Wärmebehandlung Silika nahe der Oberfläche ferromagnetischer Eisenoxidteilchen fester bindet und die Kristallinität von Silika verbessert wird, was als Ergebnis die Bindungsfähigkeit mit Nukleinsäure verstärkt.
Im Gebrauch hierin bezeichnet die Kristallinität ferromagnetischer Eisenoxidteilchen im magnetischen Träger die Vollständigkeit der Kristallstruktur, die ein Teilchen hat, was quantitativ schwer zu messen ist. Bestimmen läßt sie sich z. B. aber qualitativ anhand der Breite des Beugungspeaks im Röntgenbeugungsverfahren. Wird die Kristallinität von Teilchen fein, so wird die Peakbreite schmal. Das ferromagnetische Eisenoxid eines magnetischen Teilchenträgers, der durch diese Wärmebehandlung erhalten wird, zeigt feine Kristallinität verglichen mit den ferromagnetischen Eisenoxidteilchen herkömmlicher magnetischer Träger, die ohne diese Wärmebehandlung erhalten werden. Dies kann anhand der o. g. Breite des Beugungspeaks untersucht werden. Das heißt, die ferromagnetischen Eisenoxidteilchen des magnetischen Trägers, der durch die o. g. Wärmebehandlung erhalten wird, haben eine schmalere Peakbreite und feinere Kristallinität als die der ferromagnetischen Eisenoxidteilchen, die ohne die Wärmebehandlung erhalten werden.
Die Kristallitgröße eines ferromagnetischen Eisenoxidteilchens eines magnetischen Trägers bezeichnet die Größe jedes Kristalls, der ein ferromagnetisches Eisenoxidteilchen bildet. Bestimmen läßt sich die Kristallitgröße durch die Scherrer-Gleichung unter Verwendung des Halbwerts des Beugungspeaks durch das Röntgenbeugungsverfahren. Das ferromagnetische Eisenoxidteilchen eines magnetischen Trägers, der durch die Wärmebehandlung unter den o. g. Bedingungen erhalten wird, hat eine Kristallitgröße in der Bestimmung durch das o. g. Röntgenbeugungsverfahren von etwa dem 1,1- bis 1,5-fachen der herkömmlicher magnetischer Träger, die ohne die o. g. Wärmebehandlung erhalten werden, und unterscheidet sich deutlich.
Die Zeit dieser Wärmebehandlung ist nicht speziell eingeschränkt und kann gemäß den Temperaturbedingungen dieser Wärmebehandlung geeignet ausgewählt sein (allgemein führen höhere Wärmebehandlungstemperatur und längere Wärmebehandlungszeit zu verbesserter Kristallinität und verbessertem Kristallwachstum), beträgt aber vorzugsweise 0,5 bis 10 h, stärker bevorzugt 1 bis 5 h. Eine Wärmebehandlung unter 0,5 h liefert möglicherweise keine ausreichende Wirkung dieser Wärmebehandlung. Eine Wärmebehandlung über 10 h verursacht leicht Sintern zwischen Silikaschichten, die die ferromagnetischen Eisenoxidteilchen bedecken, und der magnetische Träger wird oft zu einer Aggregation.
Vorzugsweise kommt diese Wärmebehandlung in einer Inertgas- oder Reduktionsgasatmosphäre zur Anwendung. Bei Anwendung dieser Wärmebehandlung in einer oxidierenden Gasatmosphäre, z. B. Luft oder Sauerstoffgas u. ä., kann die Wirkung in gewissem Grad auftreten. Sind aber z. B. die ferromagnetischen Eisenoxidteilchen Magnetitteilchen, kann der Magnetit durch Sauerstoff oxidiert werden, der durch feine Fehler u. ä. in Silika eindringt, das die ferromagnetischen Eisenoxidteilchen abdeckt, was zu Maghemit ((γ-Fe₂O₃) mit noch geringerer Sättigungsmagnetisierung oder übermäßig oxidiertem und unmagnetischem Hämatit (α-Fe₂O₃) führen kann. Durch Anwendung dieser Wärmebehandlung in einer Inertgas- oder Reduktionsgasatmosphäre lassen sich Probleme als Ergebnis einer Wärmebehandlung in einer oxidierenden Gasatmosphäre mit Sicherheit ausschließen.
Als o. g. Inertgas sind Stickstoffgas und Argongas bevorzugt. Insbesondere kommt Stickstoffgas vorzugsweise zum Einsatz, da es wirtschaftlich und bequem zu handhaben ist.
Als o. g. Reduktionsgas lassen sich Wasserstoffgas, Kohlenmonoxidgas, Stadtgas u. ä. erwähnen. Bei Anwendung der Wärmebehandlung in einer reduzierenden Atmosphäre ist eine Wärmebehandlung in Gegenwart von Wasserdampf bevorzugt, um übermäßige Reduktion bis zum metallischen Zustand zu verhindern.
Zur Verhinderung unerwünschter Oxidation von Eisenoxidteilchen kann diese Wärmebehandlung in einer Vakuumatmosphäre durchgeführt werden.
Bei einer weiteren bevorzugten Art (zweiten Art) wird ein magnetischer Träger vorgeschlagen, bei dem ein ferromagnetisches Eisenoxidteilchen als magnetisches Teilchen verwendet wird, und mit diesem als Kernsubstanz eine Silicium und Aluminium aufweisende Verbindung an dessen Oberfläche haftet. Der magnetische Träger der zweiten Art zeigt verbesserte Haftungsgleichmäßigkeit an einer Kernsubstanz, ausgezeichnete Isolierung und Reinigung von Nukleinsäure und bildet einen magnetischen Träger für Nukleinsäure, der ausgezeichnete Oberflächenglätte und Fließfähigkeit hat. Die zweite Art ist von den Ansprüchen erfaßt.
In einem Mikro-TAS muß der magnetische Träger zum Festhalten von Nukleinsäure eine möglichst kleine Teilchengröße und ausgezeichnete Fließfähigkeit haben, um im System gemäß dem Magnetfeld zu fließen. Die Fließfähigkeit wird durch die Oberflächenglätte des magnetischen Trägers beeinflußt. Da die Fließfähigkeit des magnetischen Trägers verbessert sein kann, wenn eine Verbindung zur Nukleinsäurebindung, z. B. Silika u. ä., gleichmäßiger an der Kernsubstanz haftet, ist es wichtig, daß eine Beschichtung aus dieser Verbindung, z. B. Silika u. ä., so gebildet sein sollte, daß sie die Oberfläche jedes Kernsubstanzteilchens gleichmäßig bedeckt.
Unter diesen Aspekten wurde im Rahmen der Erfindung ein ferromagnetisches Eisenoxidteilchen als Kernsubstanz verwendet, und unter verschiedenen Aspekten wurde die Verbindung zur Nukleinsäurebindung berücksichtigt, die an der Oberfläche des ferromagnetischen Eisenoxidteilchens haftet. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß eine Aluminium zusammen mit Silicium enthaltende Verbindung an der Oberfläche des Kernsubstanzteilchens gleichmäßig haften kann. Ist insbesondere diese Verbindung ein Mischoxid von Silicium und Aluminium, wird ih re Wirkung erheblich. Da eine Silicium und Aluminium aufweisende Verbindung in der Tendenz eine kompakte Struktur hat, geht man davon aus, daß die gleichmäßige Haftung an der Oberfläche des Kernsubstanzteilchens verbessert ist.
In einer Silicium und Aluminium aufweisenden Verbindung beträgt der Aluminiumgehalt vorzugsweise 0,1 bis 40 Gew.-%, stärker bevorzugt 0,2 bis 30 Gew.-%, der Gesamtmenge von Silicium und Aluminium. Liegt der Aluminiumgehalt unter 0,1 Gew.-%, ist die gleichmäßige Haftung an einem ferromagnetischen Eisenoxidteilchen beeinträchtigt, und übersteigt er 40 Gew.-%, ist das Nukleinsäure-Bindungsvermögen in der Tendenz verschlechtert. Gemessen wurde der Aluminiumgehalt mit einem Röntgenfluoreszenzspektrometer JSX-3220ZS, hergestellt von JEOL Ltd. Mischungen von Silika und Aluminiumoxid mit verschiedenen Mischungsverhältnissen wurden gemessen, um Kalibrierkurven vorab zu erstellen, auf deren Grundlage der Aluminiumgehalt bestimmt wurde.
Obgleich das Verfahren zum Zugeben von Aluminium nicht speziell eingeschränkt ist, ist ein aus Silicium und Aluminium bestehendes Mischoxid bevorzugt, z. B. ein Oxid, das durch eine SiO₂-Al₂O₃-Zusammensetzung dargestellt ist. Eine Silicium und Aluminium aufweisende Verbindung kann als Mischung mit magnetischen Teilchen vorhanden sein, bildet aber vorzugsweise eine Beschichtung auf der Oberfläche magnetischer Teilchen.
Zusätzlich beträgt der Gehalt einer Silicium und Aluminium aufweisenden Verbindung vorzugsweise 3 bis 100 Gew.-%, besonders bevorzugt 5 bis 80 Gew.-%, bezogen auf die ferromagnetischen Eisenoxidteilchen. Liegt der Gehalt dieser Verbindung unter 3 Gew.-%, wird die Nukleinsäurebindung unzureichend. Übersteigt der Gehalt 100 Gew.-%, scheidet die Verbindung leicht an einem anderen Teil als der Teilchenoberfläche aus. Besonders bei Bildung der o. g. Verbindung auf einer Oberfläche eines ferromagnetischen Eisenoxidteilchens neigt das Bindungsvermögen zu Beeinträchtigung infolge des Auftretens von Ausflockung u. ä. der Teilchen.
Das ferromagnetische Eisenoxidteilchen, auf das eine Silicium und Aluminium aufweisende Verbindung aufzutragen ist, kann dem der Ansprüche ähneln. Wenngleich die Teilchengröße des ferromagnetischen Eisenoxidteilchens nicht speziell eingeschränkt ist, ist der Bereich von 0,05 bis 0,5 μm angesichts der Dispergierbarkeit in einer wäßrigen Lösung am besten geeignet.
Bei der zweiten Art sind die Sättigungsmagnetisierung, Koerzitivkraft und mittlere Teilchengröße des magnetischen Trägers nach Bildung einer Silicium und Aluminium aufweisenden Verbindung nicht speziell eingeschränkt, wobei sie aber vorzugsweise in den o. g. Bereichen der Punkte [1] bis [3] liegen.
Der magnetische Träger, der mit einer Nukleinsäure über eine Silicium und Aluminium aufweisende Verbindung gebunden ist, kann durch einen Magneten u. ä. aufgefangen werden. Die Auffangbarkeit hängt von der Menge der Sättigungsmagnetisierung des magnetischen Trägers ab, wobei eine größere Sättigungsmagnetisierungsmenge zu stärkerer Verbesserung der Auffangbarkeit führt. Beträgt der Gehalt der o. g. Verbindung 3 bis 100 Gew.-% der ferromagnetischen Eisenoxidteilchen, beeinflußt eine Abnahme der Sättigungsmagnetisierungsmenge nicht wesentlich die Auffangbarkeit mit einem Magneten. Liegt der Gehalt der o. g. Verbindung unter 3 Gew.-%, wird die Bindungsfähigkeit mit Nukleinsäure unzureichend, und übersteigt er 100 Gew.-%, wird die Sättigungsmagnetisierung des magnetischen Trägers gering, was die Auffangbarkeit durch einen Magneten tendenziell verschlechtert.
Der so durch einen Magneten aufgefangene magnetische Träger wird in eine andere Lösung überführt und ermöglicht die Flution der mit der o. g. Verbindung gebundenen Nukleinsäure in diese Lösung. Festgestellt wurde, daß der magneti sche Träger der Erfindung ein ausgezeichnetes Elutionsvermögen zeigt.
Zudem hat der magnetische Träger der zweiten Art vorzugsweise eine Kugel- oder Körnchenteilchenform, um wie beim magnetischen Träger der Ansprüche für beste Dispergierbarkeit zu sorgen.
Die ferromagnetischen Eisenoxidteilchen, die für den magnetischen Träger der zweiten Art bevorzugt verwendet werden, ähneln denen, die für den magnetischen Träger der Ansprüche bevorzugt zum Einsatz kommen. Insbesondere jene, die mit Hilfe der Magnetitteilchen, Haftenlassen einer Silicium und Aluminium aufweisenden Komponente in der Oberflächenumgebung der Teilchen und Wärmebehandlung zum Umwandeln der Silicium und Aluminium aufweisenden Verbindung in ein Oxid erhalten werden, zeigen ausgezeichnete Fließfähigkeit und sind als magnetischer Träger besonders geeignet, der zur Mikro-TAS zu verwenden ist.
Im folgenden wird ein Herstellungsverfahren des magnetischen Trägers der zweiten Art anhand einer Ausführungsform erläutert, die Magnetitteilchen als ferromagnetische Eisenoxidteilchen verwendet. Die Synthese der Magnetitteilchen ist die gleiche wie in den Ansprüchen.
Haftung der Silicium und Aluminium aufweisenden Verbindung Erläutert wird ein die o. g. Magnetitteilchen als ferromagnetische Eisenoxidteilchen verwendendes Verfahren, zu dem das Haftenlassen einer Silicium und Aluminium aufweisenden Verbindung an deren Oberfläche gehört. Zunächst wird wie im "Zweiten Verfahren zur Silikabeschichtung" unter der o. g. Überschrift "Haftenlassen von Silika" eine Suspension von Magnetitteilchen hergestellt. Eine bevorzugte Magnetitteilchenmenge bezogen auf Wasser beträgt 1 bis 10 Gew.-%.
Getrennt von der Magnetitteilchensuspension wird ein Aluminiumsalz in einer wäßrigen alkalischen Lösung gelöst. Die Menge des bei Umwandlung zu Aluminium zuzugebenden Aluminium salzes beträgt vorzugsweise 0,1 bis 40 Gew.-% bezogen auf Silicium gemäß der späteren Darstellung angesichts gleichmäßiger Haftung. Während das Aluminiumsalz nicht speziell eingeschränkt ist, werden Aluminiumchlorid, Aluminiumacetat, Aluminiumnitrat, Aluminiumsulfat u. ä. vorzugsweise verwendet. Als wäßrige alkalische Lösung kommen wäßrige Natriumhydroxidlösung, wäßrige Kaliumhydroxidlösung, wäßrige Lithiumhydroxidlösung u. ä. zum Einsatz.
Vorzugsweise hat die wäßrige Aluminiumsalzlösung einen pH-Wert von 11 bis 14. Liegt der pH-Wert unter 11, kann anschließendes Mischen dieser Lösung mit Silicat zu Ausscheidung einer Silicium- und/oder Aluminiumverbindung führen.
Als Silicat wird allgemein Natriumsilicat verwendet. Die wäßrige Natriumsilicatlösung (Wasserglas) wird der o. g. wäßrigen Aluminiumsalzlösung zugegeben, um eine Mischlösung aus Silicat und Aluminiumsalz zu ergeben. Die Menge des Silicats ist eine solche Menge, daß die Menge einer Silicium und Aluminium aufweisenden Verbindung 3 bis 100 Gew.-% bezogen auf die Magnetitteilchen erreicht. Liegt sie unter 3 Gew.-%, wird die Menge der o. g. Verbindung, die nahe der Oberfläche der Magnetitteilchen haften soll, unzureichend, die Nukleinsäurebindungsmenge wird gering, und der Extraktionsgrad ist beeinträchtigt. Übersteigt sie 100 Gew.-%, kann die o. g. Verbindung nicht gleichmäßig nahe der Oberfläche jedes Magnetitteilchens haften. Außerdem sinkt die Sättigungsmagnetisierungsmenge des magnetischen Trägers, und die Auffangbarkeit durch das Magnetfeld ist beeinträchtigt.
Eine so alkalisch eingestellte Mischlösung aus Silicat und Aluminiumsalz und eine Suspension der o. g. Magnetitteilchen werden gemischt, die o. g. Teilchen werden in dieser Mischlösung suspendiert, und eine Säure (allgemein eine saure wäßrige Lösung von Salzsäure, Phosphorsäure u. ä.) wird zugegeben, um auf den pH-Bereich von 7 bis 8 zu neutralisieren, damit eine Silicium und Aluminium aufweisende Verbindung aus scheiden kann. Synthetisieren läßt sich so ein magnetischer Träger durch Haftenlassen der Silicium und Aluminium aufweisenden Verbindung nahe der Oberfläche der Magnetitteilchen, gründliches Waschen, Filtern und Lufttrocknen bei einer bestimmten Temperatur für eine bestimmte Zeit.
Wärmebehandlung
Der so synthetisierte magnetische Träger der zweiten Art kann als magnetischer Träger zur Extraktion und Reinigung von Nukleinsäure oder zur Reinigung von amplifizierten Nukleinsäureprodukten verwendet werden. Eine Anwendung von Wärmebehandlung auf diesen magnetischen Träger verbessert seine Eigenschaften weiter.
Vorzugsweise wird die Wärmebehandlung in einem Inertgas durchgeführt, z. B. Stickstoff, Argon u. ä. Die Wärmebehandlung kann im Vakuum durchgeführt werden. Während ein solches Oxidationsgas wie Luft verwendet werden kann, verursacht eine hohe Erwärmungstemperatur Oxidation von Magnetitteilchen, was die Sättigungsmagnetisierung leicht senkt. Somit ist der Gebrauch eines Inertgases bevorzugt.
Die Wärmebehandlungstemperatur beträgt vorzugsweise 100 bis 800 °C. Liegt sie unter 100 °C, ist die Wärmebehandlungswirkung gering. Übersteigt sie 800 °C, werden Magnetitteilchen durch Erwärmung leicht gesintert, was die Dispergierbarkeit beim Binden und Eluieren von Nukleinsäure beeinträchtigt. Wenngleich die Wärmebehandlungszeit je nach der Wärmebehandlungstemperatur variiert, beträgt sie allgemein vorzugsweise 1 bis 10 h. Bei kurzer Wärmebehandlungszeit kann keine ausreichende Wärmebehandlungswirkung erzielt werden, und ist sie zu lang, werden die Magnetitteilchen leicht gesintert.
Durch eine solche Wärmebehandlung bindet sich eine Silicium und Aluminium aufweisende Verbindung, insbesondere ein Mischoxid aus diesen beiden Elementen, fester nahe der Oberfläche der Magnetitteilchen, wodurch sich magnetischer Träger (zweite Art) mit ausgezeichneter Bindungsfähigkeit mit Nukleinsäure und zugleich Auffangbarkeit durch das Magnetfeld und Dispergierbarkeit bei Wegfall des Magnetfelds/Elutionsfähigkeit von Nukleinsäure erhalten läßt.
Der durch das o. g. Verfahren erhaltene magnetische Träger hat ausgezeichnete Haftungsgleichmäßigkeit einer Silicium und Aluminium aufweisenden Verbindung an einem Kernteilchen. Die Haftungsgleichmäßigkeit kann auch durch das Absetzvolumen bewertet werden, wenn ein magnetischer Träger in Wasser dispergiert ist.
Das heißt, je kleiner das Absetzvolumen ist, um so kleiner ist die Ausflockung von magnetischem Träger, was nachweist, daß die Silicium und Aluminium aufweisende Verbindung an einem magnetischen Teilchen gleichmäßig haftet. Dies beruht darauf, daß wenn magnetische Träger, bei denen die o. g. Verbindung an der Oberfläche der Magnetitteilchen gleichmäßig haftet, in Wasser dispergiert und stehen gelassen werden, sie praktisch am dichtesten gepackt werden. Dagegen bildet bei magnetischen Trägern, bei denen die o. g. Verbindung ungleichmäßig an der Oberfläche der magnetischen Teilchen haftet, eine Silicium und Aluminium aufweisende Verbindung eine sterische Hinderung, die problemloses dichtestes Packen verhindert. Dadurch wird das Absetzvolumen groß.
Eine Ausführungsform des magnetischen Trägers der Erfindung gliedert sich in die folgenden Punkte (1) bis (6).

(1) Magnetischer Träger, wobei Silika in einer Menge von 3 bis 100 Gew.-% ferromagnetischer Eisenoxidteilchen nahe der Oberfläche jedes ferromagnetischen Eisenoxidteilchens haftet,
(2) diese ferromagnetischen Eisenoxidteilchen Magnetitteilchen sind,
(3) dieser magnetische Träger eine Kugel- oder Körnchenform sowie eine mittlere Teilchengröße von 0,12 bis 0,45 μm hat,
(4) die Koerzitivkraft und Sättigungsmagnetisierung des magnetischen Trägers 2,39 bis 11,94 kA/m (30 bis 150 Oersted) bzw. 30 bis 80 A·m²/kg (30 bis 80 emu/g) betragen,
(5) in einem bevorzugten Herstellungsverfahren Silika in einer wäßrigen Suspension dieser ferromagnetischen Eisenoxidteilchen durch Einstellen der Menge von Natriumsilicat bei Umwandlung in SiO₂ auf 0,3 bis 2 Gew.-% Wasser und der Menge ferromagnetischer Eisenoxidteilchen auf 1 bis 10 Gew.-% bezogen auf Wasser haftet,
(6) nach Haftung von Silika der Träger mit Wasser gewaschen, getrocknet und vorzugsweise einer Wärmebehandlung in einem Inertgas unterzogen wird.

Eine weitere, wenngleich nicht beanspruchte Art von magnetischem Träger gliedert sich in die folgenden Punkte (1)' bis (5)'.

(1)' Magnetischer Träger mit ferromagnetischen Eisenoxidteilchen und Silika, mit dem die Teilchen beschichtet sind,
(2)' wobei die ferromagnetischen Eisenoxidteilchen Magnetit-, Maghemit- oder amphotere Eisenoxidteilchen, besonders bevorzugt Magnetitteilchen sind,
(3) diese ferromagnetischen Eisenoxidteilchen durch Oxidation in einer wäßrigen Eisensalzlösung synthetisiert und ohne Durchlaufen eines Trockenschritts einer Silikabeschichtungsbehandlung in einer wasserhaltigen Suspension unterzogen werden,
(4)' nach Silikabeschichtung der Träger mit Wasser gewaschen, getrocknet und einer Wärmebehandlung in einer Inertgas- oder Reduktionsgasatmosphäre bei 200 bis 800 °C unterzogen wird, und
(5)' eine Sättigungsmagnetisierung von 30 bis 80 A·m²/kg (30 bis 80 emu/g), eine Koerzitivkraft von 2,39 bis 11,94 kA/m (30 bis 150 Oersted) und eine mittlere Teilchengröße von 0,1 bis 10 μm hat.

Eine weitere, wenngleich nicht beanspruchte Art von magnetischem Träger gliedert sich in die folgenden Punkte (1)'' bis (8)''.

(1)'' Magnetischer Träger, wobei eine Silika und Aluminiumoxid aufweisende Verbindung in einer Menge von 3 bis 100 Gew.-% ferromagnetischer Eisenoxidteilchen nahe der Oberfläche jedes ferromagnetischen Eisenoxidteilchens haftet,
(2)'' diese ferromagnetischen Eisenoxidteilchen Magnetitteilchen sind,
(3)'' diese Verbindung ein Oxid ist,
(4)'' der Aluminiumgehalt dieser Verbindung vorzugsweise 0,1 bis 40 Gew.-% der Gesamtmenge von Silicium und Aluminium beträgt,
(5)'' dieser magnetische Träger eine Kugel- oder Körnchenform und eine mittlere Teilchengröße von 0,1 bis 10 μm hat,
(6)'' die Koerzitivkraft und Sättigungsmagnetisierung des magnetischen Trägers vorzugsweise 0,80 bis 15,92 kA/m (10 bis 200 Oersted) bzw. 10 bis 80 A·m²/kg (10 bis 80 emu/g) betragen,
(7)'' das Herstellungsverfahren vorzugsweise Dispergieren ferromagnetischer Eisenoxidteilchen in einer Mischlösung von Silicat und Aluminiumsalz und Zugeben einer Säure zur Neutralisation aufweist, um eine Silicium und Aluminium aufweisende Verbindung auszuscheiden,
(8)'' nach dieser Ausscheidung der Träger vorzugsweise mit Wasser gewaschen, gefiltert, getrocknet und einer Wärmebehandlung in einem Inertgas unterzogen wird.

In dieser Beschreibung versteht man unter "magnetischem Träger für biologische Substanzen" magnetische Teilchen (Pulver), die zum Binden einer biologischen Substanz verwendet werden, indem der Träger mit der biologischen Substanz in einer wäßrigen Lösung einer Probe in Kontakt gebracht wird, die die biologische Substanz enthält. Daher umfaßt die Erfindung den Gebrauch der o. g. magnetischen Teilchen (Pulver) zum Binden einer biologischen Substanz durch In-Kontakt-bringen des Trägers mit der biologischen Substanz in einer wäßrigen Lösung einer die biologische Substanz enthaltenden Probe. Spezifische Betriebsverfahren u. ä. im Zusammenhang mit dem Gebrauch werden im folgenden aufgeführt, wobei verständlich sein sollte, daß die Verfahren der Erfindung durch die Ansprüche festgelegt sind.
Das Isolierverfahren der Erfindung ist durch die folgenden Schritte gekennzeichnet: [i] In-Kontakt-bringen einer biologischen Substanz mit dem o. g. speziellen magnetischen Träger in einer wäßrigen Lösung einer Probe, die eine biologische Substanz enthält, um einen Komplex zu bilden, in dem die biologische Substanz und der magnetische Träger gebunden sind, [ii] Trennen des o. g. Komplexes von der Probe durch ein externes Magnetfeld, und [iii] Eluieren der biologischen Substanz aus einem von der Probe getrennten Komplex, wodurch die biologische Substanz aus der Probe isoliert wird.
Unter "biologischer Substanz" versteht man im Gebrauch in der Erfindung z. B. eine Substanz, die in einer Probe enthalten ist, die aus einem lebenden Organismus stammt, z. B. Bakterien, Hefe, Fungi, Insektenzellen, Zooblasten, tierisches Gewebe, pflanzliches Gewebe, Archaebakterien u. ä. Beispielsweise können Nukleinsäure wie DNA und RNA, verschiedene Proteine wie Enzyme, Antikörper u. ä. sowie verschiedene Polysaccharide verwendet werden. Von den o. g. Beispielen bindet sich Nukleinsäure mit Silika in Gegenwart hochkonzentrierter chaotroper Ionen. Daher ist Nukleinsäure als biologische Substanz besonders bevorzugt, die durch das Isolierverfahren der Erfindung aus der Probe zu isolieren ist.
Im folgenden wird das Verfahren der Erfindung anhand von Nukleinsäure als biologische Substanz näher beschrieben.
Im o. g. Schritt [i] wird eine wäßrige Lösung, die eine die Zielnukleinsäure enthaltende Probe enthält, mit dem o. g. speziellen magnetischen Träger gemischt, um die Nukleinsäure mit einem magnetischen Träger in Kontakt zu bringen. Im Gebrauch hierin gehört zu einer wäßrigen Lösung, die eine Nukleinsäure enthaltende Probe enthält, eine Flüssigkeit, bei der eine Probe nicht vollständig in Wasser gelöst ist. Das Verfahren zur Bindung der Nukleinsäure mit dem magnetischen Träger ist frei von speziellen Einschränkungen, solange sie in einem geeigneten Puffer gemischt werden, um sie miteinander in Kontakt zu bringen. Ausreichendes Mischen wird z. B. durch vorsichtiges Umdrehen des Röhrchens erreicht, um Rühren oder Schütteln des Röhrchens zu ermöglichen, was z. B. mit Hilfe eines handelsüblichen Vortexmischers u. ä. geschieht. Im Schritt [i] wird ein Komplex gebildet, der Nukleinsäure mit magnetischem Träger bindet.
Im o. g. Schritt [i] wird eine Lösung zur Nukleinsäureextraktion, in der ein magnetischer Träger in einem Puffer dispergiert ist, der eine chaotrope Substanz, EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), Tris-Salzsäure u. ä. enthält, vorzugsweise vorab hergestellt. Eine solche Lösung zur Nukleinsäureextraktion wird vorzugsweise so hergestellt, daß die Konzentration von 0,02 bis 0,5 g/ml, stärker bevorzugt 0,2 bis 0,45 g/ml für den magnetischen Träger erreicht wird. Liegt die Konzentration dieses magnetischen Trägers unter 0,02 g/ml, wird die Zurückhaltung vieler Nukleinsäuren schwierig, und das magnetische Auffangvermögen wird in der Tendenz schlecht. Übersteigt die Konzentration dieses magnetischen Trägers 0,5 g/ml, verschlechtern sich in der Tendenz auch die Dispergierbarkeit und die Konservierungsstabilität der Lösung zur Nukleinsäureextraktion. Als chaotrope Substanz, die in der Lösung zur Nukleinsäureextraktion enthalten sein muß, kommt Guanidinsalz, Natriumiodid, Kaliumiodid, Natrium(iso)thiocyanat und/oder Harnstoff u. ä. zum Einsatz. Die Konzentration der chaotropen Substanz in einer Lösung zur Nukleinsäureextraktion beträgt vorzugsweise 1 bis 10 mol/l.
Das Mischungsverhältnis des magnetischen Trägers in einer wäßrigen Lösung, die eine Probe enthält, ist vorzugsweise ein solches Verhältnis, daß das Volumenverhältnis des magnetischen Trägers und der eine Probe enthaltenden wäßrigen Lösung (magnetischer Träger/wäßrige Lösung) 1/100 bis 1/10 beträgt.
Im anschließenden Schritt [ii] wird die mit dem magnetischen Träger im o. g. Schritt [i] gebundene Nukleinsäure von der Probe als Komplex aus einem magnetischen Träger und einer Nukleinsäure getrennt. Zur Trennung wird ein externes Magnetfeld genutzt, optional zusammen mit einem externen elektrischen Feld. Erwähnen läßt sich insbesondere ein Verfahren mit Lösungstrennung, wobei ein Magnet nahe der Seitenwand eines Röhrchens plaziert wird, das eine wäßrige Lösung enthält, die einen mit einer biologischen Substanz gebundenen magnetischen Träger enthält, um den mit einer biologischen Substanz gebundenen magnetischen Träger an der Seitenwand aufzufangen.
Als Magnet, der für ein externes Magnetfeld zu verwenden ist, kommt vorzugsweise ein Magnet mit einer magnetischen Induktion von 2000 bis 3000 Gauß zum Einsatz. Beim Anlegen eines externen Magnetfelds mit einer magnetischen Induktion unter 2000 Gauß wird die Empfindlichkeit gegenüber dem Magnetfeld in der Tendenz schwach, was zu beeinträchtigter Auffangleistung von magnetischem Träger führt, und bei Anlegen eines externen Magnetfelds mit einer magnetischen Induktion über 3000 Gauß wird eine Vorrichtung zur Erzeugung des Magnetfelds groß und teuer.
Im Schritt [iii] wird die Nukleinsäure aus einem Komplex aus einem magnetischen Träger und einer Nukleinsäure eluiert, der von der o. g. Probe getrennt wurde. In diesem Schritt wird z. B. eine chaotrope Substanz mehrmals mit einer Waschlösung gewaschen, die die Substanz waschen kann, der magnetische Träger wird getrocknet, wonach eine Lösung zur Elution, die die Nukleinsäure lösen kann, injiziert wird, z. B. eine Lösung mit niedriger Innenkonzentration, z. B. TE-Puffer u. ä. oder steriles Wasser, um Elution der Nukleinsäure aus dem magnetischen Träger in eine Elutionslösung zu bewirken, wodurch eine Nukleinsäure abschließend zurückgewonnen werden kann.
Die o. g. Waschlösung ist nicht speziell eingeschränkt, solange eine chaotrope Substanz gelöst werden kann, und exemplarisch aufgeführte Beispiele sind Aceton, wasserverdünnter Alkohol u. ä., die herkömmlich verwendet werden. Unter Kosten- und Sicherheitsaspekten ist der Gebrauch von 70 %igem Alkohol bevorzugt. Als o. g. Lösung zur Elution ist die zum Lösen der Nukleinsäure fähige Flüssigkeit nicht speziell eingeschränkt und ist beispielsweise steriles Wasser, TE-Puffer, Tris-Salzsäurepuffer u. ä. Der Zweckmäßigkeit halber ist die Verwendung von sterilem Wasser und TE-Puffer (20 mM Tris-Salzsäure, 1 mM EDTA, pH 7,5) bevorzugt.
Wie zuvor erwähnt kann der in der Erfindung bevorzugt verwendete magnetische Träger (a) in einer Menge von mindestens 20 mg in 1 ml einer wäßrigen Lösung einer Probe dispergiert werden, die eine biologische Substanz enthält, (b) mit mindestens 90 Gew.-% in 3 Sekunden in Gegenwart eines Magnetfelds von 2000 bis 3000 Gauß aufgefangen werden und (c) sich mit mindestens 0,4 μg einer biologischen Substanz je 1 mg Träger binden, was eine überaus hervorragende Fähigkeit im Vergleich zu herkömmlichen Trägern darstellt.
Durch den Gebrauch eines solchen magnetischen Trägers kann infolge der Fähigkeit nach dem o. g. Punkt (a) der magnetische Träger mit einer biologischen Substanz in einer wäßrigen Lösung einer Probe im o. g. Schritt [i] rationell in Kontakt gebracht werden, wodurch sich ein Komplex effizient bilden läßt, in dem ein magnetischer Träger und eine biologische Substanz gebunden sind. Diese Wirkung kann durch die Fähigkeit nach dem o. g. Punkt (c) synergistisch verstärkt sein, wodurch die Effizienz der Komplexbildung erhöht sein kann. Infolge der Fähigkeit nach dem o. g. Punkt (b) kann der Komplex zudem durch das externe Magnetfeld im o. g. Schritt [ii] sicher und schnell aufgefangen werden. Weiterhin kann infolge der Fähigkeit nach dem o. g. Punkt (c) die biologische Substanz im o. g. Schritt [iii] aus dem von der Probe getrennten Komplex effizient eluiert werden.
Realisieren läßt sich auf diese Weise durch gleichzeitiges Erreichen der Fähigkeiten nach den o. g. Punkten (a) bis (c) des Magnetischen Trägers ein Isolierverfahren biologischer Substanzen, das ausgezeichnete Dispergierbarkeit in wäßrigen Lösungen sowie Auffangbarkeit infolge des Magnetfelds, ausgezeichnete reversible Bindungsfähigkeit mit einer biologischen Substanz und ausgezeichnetes Elutionsvermögen der gebundenen biologischen Substanz im Vergleich mit herkömmlichen Verfahren hat und für ein verbessertes Isolier- und Reinigungsvermögen für eine biologische Substanz im Vergleich mit herkömmlichen Verfahren sorgt.
Während dieses Isolierverfahren für den Fall erläutert wurde, daß die biologische Substanz eine Nukleinsäure ist, sind biologische Substanzen, die aus einer Probe durch das Isolierverfahren der Erfindung isoliert werden können, nicht auf eine Nukleinsäure beschränkt. Ist die biologische Zielsubstanz ein Protein oder Polysaccharid, kann sie z. B. mit einem magnetischen Träger gebunden werden, indem eine geeignete funktionelle Gruppe (Aminogruppe, Carboxylgruppe, Phosphorsäuregruppe u. ä.) auf der Oberfläche eines magnetischen Trägers (Außenfläche der Silikaschicht) mit Hilfe eines Silanhaftvermittlers gebildet wird, was herkömmlich bekannt ist. Ist die biologische Substanz ein Protein, wird im Schritt [iii] ein mit dem Protein gebundener magnetischer Träger mehrmals mit Phosphatpuffer, Tris-HCl-Puffer u. ä. gewaschen und durch Zugabe eines Puffers eluiert, der einen Proteinliganden enthält, und ist die biologische Substanz ein Polysaccharid, kann sie durch Senken der Innenstärke einer Elutionslösung oder Wärmebehandlung eluiert werden.
Beispiele
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert, die keine Einschränkung darstellen sollen.
Beispiel 1
Synthese von Magnetitteilchen
Eisensulfat (Fe₂O₄·7H₂O, 100 g) wurde in Reinwasser (1000 cm³) gelöst. Natriumhydroxid (28,8 g) wurde in 500 cm³ Reinwasser gelöst, um einen äquimolaren Zustand mit dem Eisensulfat zu erreichen. Danach wurde die wäßrige Natriumhydroxidlösung tropfenweise über 1 h unter Rühren der wäßrigen Eisensulfatlösung zugegeben, um Eisendihydroxid auszuscheiden. Nach Abschluß der tropfenweisen Zugabe wurde die das ausgeschiedene Eisendihydroxid enthaltende Suspension unter Rühren auf 85 °C erwärmt. Nachdem die Temperatur der Suspension 85 °C erreichte, wurde die Reaktionsmischung 8 h oxidiert, während Luft mit einem Durchfluß von 200 l/h mit einer Luftpumpe eingeblasen wurde, um Magnetitteilchen zu ergeben. Die Magnetitteilchen waren nahezu kugelförmig und hatten eine mittlere Teilchengröße von 0,28 μm.
Bestimmt wurde die mittlere Teilchengröße der Magnetitteilchen durch Messen der Größe von 300 Teilchen auf einer transmissionselektronenmikroskopischen Fotografie und Berechnen ihres Zahlenmittels.
Haftenlassen von Silika
Nach gründlichem Waschen einer Suspension der o. g. Magnetitteilchen mit Reinwasser wurde das Gewicht der Magnetitteilchen und des Wassers auf 10 g bzw. 200 g ohne Trocknen eingestellt. Die Menge des Magnetits in der Suspension nach Waschen mit Wasser wurde durch Beprobung und Trocknung eines Teils davon bestimmt. In dieser Suspension waren 3,6 g Natriumsilicat gelöst.
Während dieses Natriumsilicat in einem Lösungszustand alkalisch ist, scheidet es bei annähernd neutraler Einstellung durch einen Neutralisationsschritt als Silika aus. Daher wurde dieser Magnetitteilchensuspension, in der Natriumsilicat gelöst war, verdünnte Salzsäure unter Rühren über etwa 1 h tropfenweise zugegeben und dann auf annähernd neutral eingestellt. Nach Abschluß der tropfenweisen Zugabe wurde die Mischung 1 h gerührt. Durch diesen Schritt haftete Silika nahe der Oberfläche der Magnetitteilchen.
In dieser Reaktion sind die Menge von Natriumsilicat und die Menge von Magnetitteilchen bezogen auf Wasser von Bedeutung, und beträgt die Menge von Natriumsilicat bei Umwandlung in SiO₂ 0,5 bis 2 Gew.-% bezogen auf Wasser, hat die zur Ausscheidung von Silika aus einer wäßrigen Natriumsilicatlösung durch Neutralisation verwendete Flüssigkeit eine optimale Viskosität, wodurch Silika nahe der Oberfläche jedes Magnetitteilchens gleichmäßig haften kann. Beträgt die Menge von Magnetitteilchen bezogen auf Wasser 1 bis 10 Gew.-%, kann Silika vorzugsweise nahe der Oberfläche der Magnetitteilchen haften.
Danach wurde das Rühren eingestellt, um natürliches Absetzen zu ermöglichen. Der Überstand wurde entfernt, und nach Waschen mit Wasser wurde der resultierende Feststoff gefiltert und 4 h bei 60 °C getrocknet, um einen magnetischen Träger für Nukleinsäure zu ergeben.
Dieser magnetische Träger war kugel- oder körnchenförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 0,32 μm, eine Koerzitivkraft von 4,78 kA/m (60 Oersted) und eine Sättigungsmagnetisierung von 66,8 A·m²/kg (66,8 emu/g). Die Menge des aufgetragenen Silikas betrug 19,4 Gew.-% der Magnetitteilchen bei Umwandlung in SiO₂. 1 zeigt eine REM-Abbildung des magnetischen Trägers. Aus diesem Bild wird deutlich, daß Silika nahe der Oberfläche der Magnetitteilchen haftet.
Beispiel 2
Wie im Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß die Menge von Natriumsilicat von 3,6 auf 1,8 g im Auftragsschritt von Silika geändert wurde, wurde Silika auf Magnetitteilchen aufgetragen, um einen magnetischen Träger für Nukleinsäure zu ergeben.
Dieser magnetische Träger war kugel- oder körnchenförmig und zeigte eine mittlere Teilchengröße von 0,29 μm, eine Koerzitivkraft von 4,38 kA/m (55 Oersted) und eine Sättigungsmagnetisierung von 75,1 A·m²/kg (75,1 emu/g). Die Menge des aufgetragenen Silikas betrug 9,8 Gew.-% bezogen auf die Magnetitteilchen bei Umwandlung in SiO₂. Durch REM wurde die Haftung von Silika in der Umgebung der Oberfläche jedes Magnetitteilchens beobachtet.
Beispiel 3
Wie im Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß im Schritt des Auftragens von Silika das Gewicht der Magnetitteilchen und das von Wasser von 10 g bzw. 200 g auf 10 g bzw. 500 g geändert wurden und die Menge von Natriumsilicat von 3,6 g auf 14,9 g geändert wurde, wurde Silika auf Magnetitteilchen aufgetragen, um einen magnetischen Träger für Nukleinsäure zu ergeben.
Dieser magnetische Träger war kugel- oder körnchenförmig und zeigte eine mittlere Teilchengröße von 0,34 μm, eine Koerzitivkraft von 5,97 kA/m (75 Oersted) und eine Sättigungsmagnetisierung von 60,1 A·m²/kg (60,1 emu/g). Die Menge des aufgetragenen Silikas betrug 78,9 Gew.-% bezogen auf die Magnetitteilchen bei Umwandlung in SiO₂. Durch REM wurde die Haftung von Silika in der Oberflächenumgebung jedes Magnetitteilchens beobachtet.
Beispiel 4
Der im Beispiel 1 erhaltene magnetische Träger wurde einer 2-ständigen Wärmebehandlung in Stickstoffgas bei 500 °C unterzogen.
Dieser magnetische Träger war kugel- oder körnchenförmig und zeigte eine mittlere Teilchengröße von 0,32 μm, eine Koerzitivkraft von 5,18 kA/m (65 Oersted) und eine Sättigungsmagnetisierung von 68,3 A·m²/kg (68,3 emu/g). Die Menge des aufgetragenen Silikas betrug 19,4 Gew.-% bezogen auf die Magnetitteilchen bei Umwandlung in SiO₂. Durch REM wurde die Haftung von Silika in der Oberflächenumgebung jedes Magnetitteilchens beobachtet.
Beispiel 5
Wie im Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß die Temperatur einer ausgeschiedenes Eisendihydroxid enthaltenden Suspension von 85 °C auf 60 °C im Syntheseschritt der Magnetitteilchen geändert wurde, wurden Magnetitteilchen mit einer mittleren Teilchengröße von 0,13 μm synthetisiert.
Mit Hilfe dieser Magnetitteilchen und wie im Beispiel 1 wurde Silika aufgetragen, um einen magnetischen Träger für Nukleinsäure zu ergeben.
Dieser magnetische Träger war kugel- oder körnchenförmig und zeigte eine mittlere Teilchengröße von 0,17 μm, eine Koerzitivkraft von 7,57 kA/m (95 Oersted) und eine Sättigungsmagnetisierung von 63,4 A·m²/kg (63,4 emu/g). Die Menge des aufgetragenen Silikas betrug 19,8 Gew.-% bezogen auf die Magnetitteilchen bei Umwandlung in SiO₂. 2 zeigt eine REM-Abbildung dieses magnetischen Trägers, in der die Haftung von Silika in der Oberflächenumgebung jedes Magnetitteilchens beobachtet werden kann.
Vergleichsbeispiel 1
Handelsübliche Maghemit- (γ-Fe₂O₃-) Teilchen wurden als ferromagnetische Eisenoxidteilchen verwendet. Die Maghemitteilchen haben eine mittlere Teilchengröße von etwa 0,26 μm, eine Koerzitivkraft von 8,76 kA/m (110 Oersted) und eine Sättigungsmagnetisierung von 83,5 A·m²/kg (83,5 emu/g).
Wasser (25 g) wurde zugegeben, um die Maghemitteilchen (5 g) zu suspendieren. Natriumsilicat (28 g) wurde dieser Suspension zugegeben und gelöst. Sorbitanmonolaurat (1,44 g) wurde in Hexan (96 g) gelöst, und diese Lösung wurde mit der o. g. Maghemitsuspension mit gelöstem Natriumsilicat gemischt. Die Mischung wurde durch einen Homomixer gerührt, um eine Emulsion zu ergeben.
Ammoniumsulfat (64 g) wurde in Reinwasser (288 cm³) gelöst, und unter Rühren der Lösung wurde die o. g. Emulsion tropfenweise zugegeben, um einen magnetischen Träger zu ergeben, der mit Silika beschichtete Maghemitteilchen aufwies, mit Wasser gewaschen und bei 60 °C getrocknet wurde.
Der so erhaltene magnetische Träger zeigte eine mittlere Teilchengröße von etwa 5,6 μm, die viel größer als die 0,1 bis 0,5 μm des magnetischen Trägers der Erfindung war. Die Koerzitivkraft betrug 7,33 kA/m (92 Oersted), und die Sättigungsmagnetisierung betrug 22,1 A·m²/kg (22,1 emu/g). Die Menge des aufgetragenen Silikas betrug 260 Gew.-% bezogen auf die Maghemitteilchen bei Umwandlung in SiO₂. Bei diesem magnetischen Träger weist die Silikabeschichtung eine Gruppe aus Maghemitteilchen anders als beim magnetischen Träger der Erfindung auf, bei dem Silika nahe der Oberfläche jedes Magnetitteilchens haftet, was anhand der REM-Abbildung nachgewiesen wurde.

Die mittlere Teilchengröße, Koerzitivkraft, Sättigungsmagnetisierung und Menge der Silikabeschichtung auf Magnetitteilchen (Maghemitteilchen im Vergleichsbeispiel 1) bei Umwandlung in SiO₂ als Haupteigenschaften jeweiliger magnetischer Träger zur Bindung mit Nukleinsäure, die durch die o. g. beispiele 1 bis 5 und das Vergleichsbeispiel 1 erhalten wurden, sind in der folgenden Tabelle 1 gemeinsam dargestellt. Tabelle 1

	Mittlere Teilchengröße (μm)	Koerzitivkraft (kA/m)	Sättigungsmagnetisierung (A·m²/kg)	Menge der Silikabeschichtung (Gew.-%)
Beispiel 1 Beispiel 2 Beispiel 3 Beispiel 4 Beispiel 5	0,32 0,29 0,34 0,32 0,20	4,78 4,38 5,97 5,18 7,57	66,8 75,1 60,1 63,8 63,4	19,4 9,8 78,9 19,4 19,8
Vergleichsbeispiel 1	5,6	7,33	22,1	260

Danach wurden die jeweiligen magnetischen Träger zur Bindung mit Nukleinsäure, die in den o. g. Beispielen 1 bis 5 und im Vergleichsbeispiel 1 erhalten wurden, den im folgenden dargestellten Extraktionsprüfungen unterzogen. Nukleinsäuren wurden durch Extraktion aus biologischen Proben zurückgewonnen, und die Rückgewinnungsleistung wurde untersucht. In Tabelle 2 sind die Ergebnisse dargestellt.
(A) Reagens zur Extraktionsprüfung

(i) Ein magnetischer Träger für Nukleinsäure wurde mit 0,2 mg/ml in sterilem Wasser dispergiert, um eine Dispersionslösung zu ergeben.
(ii) Als biologische Probe zur Isolierung von Nukleinsäure wurden Bakterienzellen verwendet, die durch 20-stündige Kultivierung von Escherichia coli [Escherichia coli JM109 (erhältlich von Toyobo Co., Ltd., TAKARA SHUZO CO., LTD., Invitrogen Corporation u. ä.) in 3 ml TB-Medium/Reagenzglas bei 37 °C erhalten wurden.
(iii) Als Lösung zur Nukleinsäureextraktion wurde Puffer A verwendet, der ein Puffer ist, der eine chaotrope Substanz (7 M Guanidinhydrochlorid (Nacalai Tesque, Inc.) und 50 mM Tris-HCl (Sigma), pH 7,5] enthält.
(iv) Als Waschlösung wurde Puffer A verwendet, der ein
Puffer ist, der eine chaotrope Substanz (7 M Guanidinhydrochlorid (Nacalai Tesque, Inc.) und 50 mM Tris-HCl (Sigma), pH 7,5] enthält.
(v) Als Mittel zur Entfernung eines hochkonzentrierten Salzes wurden eine 70 %ige Ethanollösung und eine Acetonlösung verwendet.
(vi) als Elutionslösung zur Rückgewinnung von Nukleinsäure, die mit dem magnetischen Träger gebunden war, wurde steriles Wasser verwendet.

(B) Extraktionsprüfverfahren

(1) Die Bakterienzellentrübung (OD660) wurde gemessen, und die Bakterienzellen (OD660; 1,0) wurden durch Zentrifugaltrennung in einem 1,5-cm³-Eppendorfröhrchen hergestellt. Danach wurde eine Lösung zur Nukleinsäureextraktion (1000 μl) injiziert und gemischt.
(2) Anschließend wurde eine Dispersion (20 μl) des magnetischen Trägers für Nukleinsäure zugegeben.
(3) Während sie etwa alle 2 min gemischt wurde, wurde die Mischung 10 min bei Raumtemperatur stehengelassen.
(4) Das o. g. Röhrchen wurde auf ein Magnetgestell mit einer Form gesetzt, in die sich das 1,5-cm3-Eppendorfröhrchen einpaßt, um den magnetischen Träger zur Seite des Magneten aufzufangen.
(5) Die Lösung wurde mit einer Filterspitze abgesaugt und entsorgt.
(6) Das Röhrchen wurde vom Magnetgestell entfernt, und eine Guanidinhydrochlorid enthaltende Waschlösung (1 cm³) wurde eingegossen.
(7) Nach gründlichem Mischen mit dem magnetischen Träger wurde das Röhrchen wieder auf das Magnetgestell gesetzt, und die Lösung wurde auf die gleiche Weise wie zuvor abgegeben.
(8) Der Waschschritt wurde wiederholt.
(9) Der mit Nukleinsäure gebundene magnetische Träger wurde mit 1 cm³ 70 %igem Ethanol auf die gleiche Weise wie zuvor gewaschen, und hochkonzentriertes Guanidinhydrochlorid wurde entfernt.
(10) Der Rückstand wurde erneut mit 1 cm³ 70 %igem Ethanol und 1 cm³ Aceton gewaschen.
(11) Das o. g. Röhrchen wurde in einen Wärmeblock mit etwa 56 °C gesetzt, etwa 10 min stehengelassen, und Aceton im Röhrchen und im magnetischen Träger wurde durch vollständige Verdampfung entfernt.
(12) Steriles Wasser (100 μl) wurde dem mit Nukleinsäure durch das o. g. Verfahren gebundenen magnetischen Träger zugegeben, und das o. g. Röhrchen wurde in einen Wärmeblock mit etwa 56 °C gesetzt, und die Mischung wurde etwa 10 min stehengelassen, während sie alle 2 min gemischt wurde.
(13) Das Röhrchen wurde auf ein Magnetgestell gesetzt, die Lösung wurde durch Absaugen mit einer Filterspitze zurückgewonnen und in ein frisches Röhrchen überführt. Allgemein betrug die zurückgewonnene Menge etwa 70 μl. Die Konservierung erfolgte bei –70 °C.
(14) An der so zurückgewonnenen Nukleinsäure wurde die Absorbanz (OD 260 nm) mit einem Absorptionsmesser bestimmt, und die Nukleinsäurekonzentration wurde bestimmt. Diese wurde mit dem Rückgewinnungsvolumen multipliziert und als Nukleinsäure-Rückgewinnungsmenge zugrunde gelegt.

Von den o. g. Vorgängen entsprechen (1) bis (3) dem Schritt des Bildens eines Komplexes, in dem ein magnetischer Träger und eine biologische Substanz gebunden sind, (4) und (5) entsprechen dem Schritt des Trennens eines Komplexes von einer Probe, und (6) bis (12) entsprechen dem Schritt des Eluierens einer biologischen Substanz aus einem Komplex. Tabelle 2

Rückgewonnene Menge von Nukleinsäure (ng)

Beispiel 1 Beispiel 2 Beispiel 3 Beispiel 4 Beispiel 5 2030 1960 1990 2050 2010

Vergleichbeispiel 1 1070
Wie aus den vorstehenden Ergebnissen deutlich wird, hatten die magnetischen Träger der Beispiele 1 bis 5, die durch Haften von Silika in einer Menge von 3 bis 100 Gew.-% der Magnetitteilchen nahe der Oberfläche jedes kugel- oder körnchenförmigen Magnetitteilchens erhalten wurden, eine mittlere Teilchengröße von 0,1 bis 0,5 μm, eine Koerzitivkraft und eine Sättigungsmagnetisierung von 2,39 bis 11,94 kA/m (30 bis 150 Oersted) bzw. 30 bis 80 A·m²/kg (30 bis 80 emu/g), und ausgezeichnetes Isoliervermögen für Nukleinsäure im Vergleich zum magnetischen Träger des Vergleichsbeispiels 1 mit einer Struktur, bei der eine Gruppe von Maghemitteilchen in Silika eingeschlossen ist.
Dies ist auf folgendes zurückzuführen: Da bei den magnetischen Trägern der Beispiele 1 bis 5 Silika nahe der Oberfläche jedes Magnetitteilchens haftet, steigt die Menge von Silika, die sich mit Nukleinsäure wirksam binden kann, zudem verhindert Silika Ausflockung jeweiliger Magnetitteilchen, und die Bindungsfähigkeit mit Nukleinsäure/Auffangbarkeit mit magnetischem Träger durch das Magnetfeld sowie die Dispergierbarkeit des magnetischen Trägers/Elutionsfähigkeit von Nukleinsäure sind kompatibel.
Referenzbeispiel 1
(1) Synthese von Magnetitteilchen
Wie im Beispiel 1 wurden Magnetitteilchen (Suspension erhalten). Die Magnetitteilchen waren nahezu kugelförmig und hatten eine mittlere Teilchengröße von etwa 0,28 μm.
(2) Beschichtungsbehandlung mit Silika
Eine Magnetitteilchensuspension wurde mit Reinwasser gründlich gewaschen, und Reinwasser wurde ohne Trocknen so zugegeben, daß das Gesamtgewicht dieser Suspension 468 g betrug. In dieser Dispersion wurden 70 g Natriumsilicat gelöst. Getrennt von der Magnetitteilchendispersion mit gelöstem Natriumsilicat wurden 1500 cm³ Hexanlösung, in der 22,5 g Sorbitanmonolaurat als Surfactant gelöst waren, der o. g. Suspension zugegeben, um eine Mischlösung zu erhalten. Diese Mischlösung wurde 10 min mit einem Homomixer (TOKUSHU KIKA KOGYO CO., LTD.) gerührt und dispergiert, um eine Dispersion zu ergeben. Danach wurden 1000 g Ammoniumsulfat in 4500 cm³ Reinwasser gelöst. Die o. g. Dispersion wurde dieser Ammoniumsulfatlösung über etwa 1 h unter Rühren tropfenweise zugegeben. Nach Abschluß der tropfenweisen Zugabe wurde die Mischung 2 weitere Stunden zur Neutralisation gerührt. Durch die Neutralisation mit Ammoniumsulfat wurde Silika so ausgeschieden, daß es die Magnetitteilchen umschloß, um eine Beschichtung (Silikaschicht) zu bilden.
(3) Wärmebehandlung
Die wie zuvor erhaltenen, mit Silika beschichteten Magnetitteilchen wurden mit Reinwasser gründlich gewaschen, gefiltert und 8 h bei 60 °C luftgetrocknet. Wie zuvor erwähnt, zeigen die Magnetitteilchen unterschiedliche magnetische Eigenschaften je nach Kristallinität und Kristallgröße der Teilchen. Zur Steuerung der magnetischen Eigenschaften kam eine Wärmebehandlung zur Anwendung. Zur Wärmebehandlung wurden die Teilchen 2 Stunden bei 600 °C mit Hilfe eines Röh renofens in einem Stickstoffgasstrom erwärmt. Nach der Wärmebehandlung wurden die Teilchen unter Strömenlassen eines Stickstoffgases auf Raumtemperatur abgekühlt und entnommen, um einen magnetischen Träger zu ergeben. Wie bei den o. g. Magnetitteilchen wurde eine Messung durchgeführt, um die mittlere Teilchengröße des magnetischen Trägers mit 5 μm zu ermitteln. Die beobachtete Form des magnetischen Trägers war kugelförmig. Der erhaltene magnetische Träger wurde der Messung mit einem Schwingprobenmagnetometer (TOEI INDUSTRY CO. LTD) und Anlegen eines Magnetfelds von 796,5 kA/m (10 Kilooersted) unterzogen. Als Ergebnis betrug die Sättigungsmagnetisierung 47,1A·m²/kg (47,1 emu/g), und die Koerzitivkraft betrug 5,18 kA/m (65 Oersted).
Der magnetische Träger wurde der wäßrigen Ziellösung einer Probe zugegeben, die eine biologische Substanz enthielt, und in einem Vortexmischer dispergiert, um zu bestimmen, ob eine gleichmäßige Suspension erhalten wird. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß mindestens 20 mg in 1 ml einer wäßrigen Lösung einer Probe dispergiert waren, die eine biologische Substanz enthielt. Diese Suspension wurde auf einen Magneten gegeben, und das Gewicht des durch den Magneten in einer bestimmten Zeit aufgefangenen magnetischen Trägers wurde gemessen. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß im o. g. Dispersionszustand mindestens 90 Gew.-% davon in 3 Sekunden durch eine magnetische Kraft von 2000 bis 3000 Gauß aufgefangen wurden. Durch Nachweis mit Hilfe einer quantitativen Bestimmungsanalyse von Nukleinsäure vor und nach Bindung und Dispersion mit Nukleinsäure als biologischer Substanz wurde außerdem die reversible Bindung mit mindestens 0,4 μg einer biologischen Substanz je 1 mg des magnetischen Trägers beobachtet.
Referenzbeispiel 2
Hergestellt wurde ein magnetischer Träger wie im Referenzbeispiel 1 mit der Ausnahme, daß die Suspension mit ausgeschiedenem Eisendihydroxid während der Magnetitteilchensynthese auf 60 °C erwärmt wurde. Der erhaltene magnetische Träger war kugelförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 4 μm (mittlere Teilchengröße von Magnetitteilchen 0,13 μm), eine Sättigungsmagnetisierung von 45,3 A·m²/kg (45,3 emu/g) und eine Koerzitivkraft von 6,53 kA/m (82 Oersted) in der Messung wie im Referenzbeispiel 1.
Wie im Referenzbeispiel 1 wurde nachgewiesen, daß mindestens 20 mg dieses magnetischen Trägers in 1 ml einer wäßrigen Lösung einer Probe, die eine biologische Probe enthielt, im o. g. Dispersionszustand dispergiert werden konnten, wovon mindestens 90 Gew.-% in 3 Sekunden durch eine magnetische Kraft von 2000 bis 3000 Gauß aufgefangen wurden, und er konnte sich mit mindestens 0,4 μg einer biologischen Substanz je 1 mg des magnetischen Trägers reversibel binden.
Referenzbeispiel 3
Hergestellt wurde ein magnetischer Träger wie im Referenzbeispiel 1 mit der Ausnahme, daß eine Suspension mit ausgeschiedenem Eisendihydroxid während der Magnetitteilchensynthese auf 98 °C erwärmt wurde. Der erhaltene magnetische Träger war kugelförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 7 μm (mittlere Teilchengröße von Magnetitteilchen 0,42 μm), eine Sättigungsmagnetisierung von 47,5 A·m²/kg (47,5 emu/g) und eine Koerzitivkraft von 3,66 kA/m (46 Oersted) in der Messung wie im Referenzbeispiel 1.
Wie im Referenzbeispiel 1 wurde nachgewiesen, daß dieser magnetische Träger (mindestens 20 mg) in 1 ml einer wäßrigen Lösung einer Probe, die eine biologische Probe enthielt, im o. g. Dispersionszustand dispergiert werden konnten, wovon mindestens 90 Gew.-% in 3 Sekunden durch eine magnetische Kraft von 2000 bis 3000 Gauß aufgefangen wurden, und er konnte sich mit mindestens 0,4 μg einer biologischen Substanz je 1 mg des magnetischen Trägers reversibel binden.
Referenzbeispiel 4
Hergestellt wurde ein magnetischer Träger wie im Referenzbeispiel l mit der Ausnahme, daß die in der Magnetitteilchendispersion gelöste Natriumsilicatmenge während der Silikabeschichtungsbehandlung 58 g betrug. Der erhaltene magnetische Träger war kugelförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 4 μm, eine Sättigungsmagnetisierung von 51,2 A·m²/kg (51,2 emu/g) und eine Koerzitivkraft von 5,42 kA/m (68 Oersted) in der Messung wie im Referenzbeispiel 1.
Wie im Referenzbeispiel 1 wurde nachgewiesen, daß mindestens 20 mg dieses magnetischen Trägers in 1 ml einer wäßrigen Lösung einer Probe, die eine biologische Probe enthielt, im o. g. Dispersionszustand dispergiert werden konnten, wovon mindestens 90 Gew.-% in 3 Sekunden durch eine magnetische Kraft von 2000 bis 3000 Gauß aufgefangen wurden, und er konnte sich mit mindestens 0,4 μg einer biologischen Substanz je 1 mg des magnetischen Trägers reversibel binden.
Referenzbeispiel 5
Hergestellt wurde ein magnetischer Träger wie im Referenzbeispiel 1 mit der Ausnahme, daß die in der Magnetitteilchendispersion gelöste Natriumsilicatmenge während der Silikabeschichtungsbehandlung 90 g betrug. Der erhaltene magnetische Träger war kugelförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 6 μm, eine Sättigungsmagnetisierung von 40,3 A·m²/kg (40,3 emu/g) und eine Koerzitivkraft von 4,86 kA/m (61 Oersted) in der Messung wie im Referenzbeispiel 1.
Wie im Referenzbeispiel 1 wurde nachgewiesen, daß mindestens 20 mg dieses magnetischen Trägers in 1 ml einer wäßrigen Lösung einer Probe, die eine biologische Probe enthielt, im o. g. Dispersionszustand dispergiert werden konn ten, wovon mindestens 90 Gew.-% in 3 Sekunden durch eine magnetische Kraft von 2000 bis 3000 Gauß aufgefangen wurden, und er konnte sich mit mindestens 0,4 μg einer biologischen Substanz je 1 mg des magnetischen Trägers reversibel binden.
Referenzbeispiel 6
Hergestellt wurde ein magnetischer Träger wie im Referenzbeispiel 1 mit der Ausnahme, daß eine 2-ständige Wärmebehandlung bei 800 °C in einem Stickstoffgasstrom zur Anwendung kam. Der erhaltene magnetische Träger war kugelförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 5 μm, eine Sättigungsmagnetisierung von 47,8 A·m²/kg (47,8 emu/g) und eine Koerzitivkraft von 2,63 kA/m (33 Oersted) in der Messung wie im Referenzbeispiel 1.
Wie im Referenzbeispiel 1 wurde nachgewiesen, daß mindestens 20 mg dieses magnetischen Trägers in 1 ml einer wäßrigen Lösung einer Probe, die eine biologische Probe enthielt, im o. g. Dispersionszustand dispergiert werden konnten, wovon mindestens 90 Gew.-% in 3 Sekunden durch eine magnetische Kraft von 2000 bis 3000 Gauß aufgefangen wurden, und er konnte sich mit mindestens 0,4 μg einer biologischen Substanz je 1 mg des magnetischen Trägers reversibel binden.
Referenzbeispiel 7
Hergestellt wurde ein magnetischer Träger wie im Referenzbeispiel 1 mit der Ausnahme, daß eine 2-ständige Wärmebehandlung bei 400 °C in einem Stickstoffgasstrom zur Anwendung kam. Der erhaltene magnetische Träger war kugelförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 5 μm, eine Sättigungsmagnetisierung von 43,0 A·m²/kg (43,0 emu/g) und eine Koerzitivkraft von 8,37 kA/m (105 Oersted) in der Messung wie im Referenzbeispiel 1.
Wie im Referenzbeispiel 1 wurde nachgewiesen, daß mindestens 20 mg dieses magnetischen Trägers in 1 ml einer wäßrigen Lösung einer Probe, die eine biologische Probe ent hielt, im o. g. Dispersionszustand dispergiert werden konnten, wovon mindestens 90 Gew.-% in 3 Sekunden durch eine magnetische Kraft von 2000 bis 3000 Gauß aufgefangen wurden, und er konnte sich mit mindestens 0,4 μg einer biologischen Substanz je 1 mg des magnetischen Trägers reversibel binden.
Referenzbeispiel 8
Hergestellt wurde ein magnetischer Träger wie im Referenzbeispiel 1 mit der Ausnahme, daß Argongas als Atmosphärengas während der Wärmebehandlung verwendet wurde. Der erhaltene magnetische Träger war kugelförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 5 μm, eine Sättigungsmagnetisierung von 47,9 A·m²/kg (49 emu/g) und eine Koerzitivkraft von 5,34 kA/m (67 Oersted) in der Messung wie im Referenzbeispiel 1.
Wie im Referenzbeispiel 1 wurde nachgewiesen, daß mindestens 20 mg dieses magnetischen Trägers in 1 ml einer wäßrigen Lösung einer Probe, die eine biologische Probe enthielt, im o. g. Dispersionszustand dispergiert werden konnten, wovon mindestens 90 Gew.-% in 3 Sekunden durch eine magnetische Kraft von 2000 bis 3000 Gauß aufgefangen wurden, und er konnte sich mit mindestens 0,4 μg einer biologischen Substanz je 1 mg des magnetischen Trägers reversibel binden.
Referenzbeispiel 9
Hergestellt wurde ein magnetischer Träger wie im Referenzbeispiel 1 mit der Ausnahme, daß eine 2-ständige Wärmebehandlung bei 300 °C mit Hilfe von Wasserstoffgas als Atmosphärengas zur Anwendung kam. Der erhaltene magnetische Träger war kugelförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 5 μm, eine Sättigungsmagnetisierung von 50,3 A·m²/kg (50,3 emu/g) und eine Koerzitivkraft von 4,06 kA/m (51 Oersted) in der Messung wie im Referenzbeispiel 1.
Wie im Referenzbeispiel 1 wurde nachgewiesen, daß mindestens 20 mg dieses magnetischen Trägers in 1 ml einer wäß rigen Lösung einer Probe, die eine biologische Probe enthielt, im o. g. Dispersionszustand dispergiert werden konnten, wovon mindestens 90 Gew.-% in 3 Sekunden durch eine magnetische Kraft von 2000 bis 3000 Gauß aufgefangen wurden, und er konnte sich mit mindestens 0,4 μg einer biologischen Substanz je 1 mg des magnetischen Trägers reversibel binden.
Referenzbeispiel 10
Als Magnetitteilchen wurde handelsübliches Trockenprodukt (TODA KOGYO CORP.) verwendet. Diese Magnetitteilchen hatten eine Sättigungsmagnetisierung von 83,5 A·m²/kg (83,5 emu/g), eine Koerzitivkraft von 8,76 kA/m (110 Oersted) und eine mittlere Teilchengröße von 0,26 μm. Reinwasser wurde diesen Magnetitteilchen bis zum Gesamtgewicht von 468 g zugegeben, um eine Magnetitteilchensuspension zu erhalten.
Wie im Referenzbeispiel 1 mit der Ausnahme, daß 70 g Natriumsilicat zugegeben wurden und eine Ultraschalldispersionsvorrichtung zur Dispersion verwendet und eine Natriumsilicatlösung hergestellt wurde, in der Magnetitteilchen dispergiert waren, wurden eine Beschichtungsbehandlung mit Silika und eine Wärmebehandlung angewendet, um einen magnetischen Träger zu ergeben. Der erhaltene magnetische Träger war kugelförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 6 μm, eine Sättigungsmagnetisierung von 40,1 A·m²/kg (40,1 emu/g) und eine Koerzitivkraft von 9,56 kA/m (120 Oersted) in der Messung wie im Referenzbeispiel 1.
Wie im Referenzbeispiel 1 wurde nachgewiesen, daß mindestens 20 mg dieses magnetischen Trägers in 1 ml einer wäßrigen Lösung einer Probe, die eine biologische Probe enthielt, im o. g. Dispersionszustand dispergiert werden konnten, wovon mindestens 90 Gew.-% in 3 Sekunden durch eine magnetische Kraft von 2000 bis 3000 Gauß aufgefangen wurden, und er konnte sich mit mindestens 0,4 μg einer biologischen Substanz je 1 mg des magnetischen Trägers reversibel binden.
Referenzbeispiel 11
Wie im Referenzbeispiel 1 wurden die Magnetitteilchensynthese und eine Beschichtungsbehandlung mit Silika durchgeführt. Die erhaltenen, mit Silika beschichteten Magnetitteilchen wurden mit Reinwasser gründlich gewaschen, gefiltert und 8 h bei 60 °C luftgetrocknet, um einen magnetischen Träger ohne Anwendung einer anschließenden Wärmebehandlung zu ergeben. Der erhaltene magnetische Träger war kugelförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 5 μm, eine Sättigungsmagnetisierung von 38,8 A·m²/kg (38,8 emu/g) und eine Koerzitivkraft von 7,81 kA/m (98 Oersted) in der Messung wie im Referenzbeispiel 1.
Wie im Referenzbeispiel 1 wurde nachgewiesen, daß mindestens 20 mg dieses magnetischen Trägers in 1 ml einer wäßrigen Lösung einer Probe, die eine biologische Probe enthielt, im o. g. Dispersionszustand dispergiert werden konnten, wovon mindestens 90 Gew.-% in 3 Sekunden durch eine magnetische Kraft von 2000 bis 3000 Gauß aufgefangen wurden, und er konnte sich mit mindestens 0,4 μg einer biologischen Substanz je 1 mg des magnetischen Trägers reversibel binden.
Referenzbeispiel 12
Wie im Referenzbeispiel 5 wurden die Magnetitteilchensynthese und eine Beschichtungsbehandlung mit Silika durchgeführt. Die erhaltenen, mit Silika beschichteten Magnetitteilchen wurden mit Reinwasser gründlich gewaschen, gefiltert und 8 h bei 60 °C luftgetrocknet, um einen magnetischen Träger ohne Anwendung einer anschließenden Wärmebehandlung zu ergeben. Der erhaltene magnetische Träger war kugelförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 6 μm, eine Sättigungsmagnetisierung von 32,8 A·m²/kg (32,8 emu/g) und eine Koerzitivkraft von 8,76 kA/m (110 Oersted) in der Messung wie im Referenzbeispiel 1.
Wie im Referenzbeispiel 1 wurde nachgewiesen, daß mindestens 20 mg dieses magnetischen Trägers in 1 ml einer wäßrigen Lösung einer Probe, die eine biologische Probe enthielt, im o. g. Dispersionszustand dispergiert werden konnten, wovon mindestens 90 Gew.-% in 3 Sekunden durch eine magnetische Kraft von 2000 bis 3000 Gauß aufgefangen wurden, und er konnte sich mit mindestens 0,4 μg einer biologischen Substanz je 1 mg des magnetischen Trägers reversibel binden.
Vergleichsreferenzbeispiel 2
Wie im Referenzbeispiel 1 mit der Ausnahme, daß Luft als Atmosphärengas während der Wärmebehandlung verwendet wurde, wurde ein magnetischer Träger hergestellt. Der erhaltene magnetische Träger war kugelförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 5 μm, eine Sättigungsmagnetisierung von 25,3 A·m²/kg (25,3 emu/g) und eine Koerzitivkraft von 10,76 kA/m (135 Oersted) in der Messung wie im Referenzbeispiel 1. Durch die Wärmebehandlung wurden die Magnetitteilchen oxidiert und in Maghemit (γ-Fe₂O₃) umgewandelt (nachgewiesen anhand der Position des Beugungspeaks durch das Röntgenbeugungsverfahren).
Vergleichsreferenzbeispiel 3
Handelsübliche Trockenmaghemit- (γ-Fe₂O₃-) Teilchen (TODA KOGYO CORP.) wurden verwendet, um einen magnetischen Träger herzustellen. Diese Magnetitteilchen hatten eine Sättigungsmagnetisierung von 74,2 A·m²/kg (74,2 emu/g), eine Koerzitivkraft von 12,75 kA/m (160 Oersted) und eine mittlere Teilchengröße von 0,21 μm. Reinwasser wurde diesen Maghemitteilchen bis zum Gesamtgewicht von 468 g zugegeben, um eine Maghemitteilchensuspension zu erhalten.
Wie im Referenzbeispiel 1 mit der Ausnahme, daß 70 g Natriumsilicat zugegeben wurden und eine Ultraschalldispersionsvorrichtung zur Dispersion verwendet und eine Natriumsilicatlösung hergestellt wurde, in der Maghemitteilchen disper giert waren, wurden eine Beschichtungsbehandlung mit Silika und eine Wärmebehandlung angewendet, um einen magnetischen Träger zu ergeben. Der erhaltene magnetische Träger war kugelförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 5 μm, eine Sättigungsmagnetisierung von 34,0 A·m²/kg (34,0 emu/g) und eine Koerzitivkraft von 12,75 kA/m (160 Oersted) in der Messung wie im Referenzbeispiel 1.
Vergleichsreferenzbeispiel 4
Wie im Referenzbeispiel 1 mit der Ausnahme, daß die Menge von Natriumsilicat, das in der Magnetitteilchendispersion zu lösen war, während der Beschichtungsbehandlung mit Silika auf 120 g eingestellt war, wurde ein magnetischer Träger hergestellt. Der erhaltene magnetische Träger war kugelförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 6 μm, eine Sättigungsmagnetisierung von 29,8 A·m²/kg (29,8 emu/g) und eine Koerzitivkraft von 4,54 kA/m (57 Oersted) in der Messung wie im Referenzbeispiel 1.
Vergleichsreferenzbeispiel 5
Wie im Vergleichsreferenzbeispiel 4 mit der Ausnahme, daß kein Wärmebehandlungsschritt angewendet wurde, wurde ein magnetischer Träger hergestellt. Der erhaltene magnetische Träger war kugelförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 6 μm, eine Sättigungsmagnetisierung von 20,4 A·m²/kg (20,4 emu/g) und eine Koerzitivkraft von 2,39 kA/m (30 Oersted) in der Messung wie im Referenzbeispiel 1.

Die wichtigen Herstellungsbedingungen der in den o. g. Referenzbeispielen 1 bis 12 und Vergleichsreferenzbeispielen 2 bis 5 erhaltenen magnetischen Träger sind in Tabelle 3 gezeigt, und Haupteigenschaften der erhaltenen magnetischen Träger sind in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 3

	Art	Mittlere Teilchengröße (μm)	Anfangszustand	Silikagehalt (Gew.-%)	Wärmebehandlungsbedingungen
Referenzbeispiel 1	Magnetit	0,28	Suspension	90	in Stickstoffgas, 600 °C, 2 h
Referenzbeispiel 2	Magnetit	0,13	Suspension	90	in Stickstoffgas, 600 °C, 2 h
Referenzbeispiel 3	Magnetit	0,42	Suspension	90	in Stickstoffgas, 600 °C, 2 h
Referenzbeispiel 4	Magnetit	0,28	Suspension	75	in Stickstoffgas, 600 °C, 2 h
Referenzbeispiel 5	Magnetit	0,28	Suspension	115	in Stickstoffgas, 600 °C, 2 h
Referenzbeispiel 6	Magnetit	0,28	Suspension	90	in Stickstoffgas, 800 °C, 2 h
Referenzbeispiel 7	Magnetit	0,28	Suspension	90	in Stickstoffgas, 400 °C, 2 h
Referenzbeispiel 8	Magnetit	0,28	Suspension	90	in Argongas, 600 °C, 2 h
Referenzbeispiel 9	Magnetit	0,28	Suspension	90	in Wasserstoffgas, 300 °C, 2 h
Referenzbeispiel 10	Magnetit	0,26	trocken	90	in Stickstoffgas, 600 °C, 2 h
Referenzbeispiel 11	Magnetit	0,28	Suspension	90	keine Wärmebehandlung
Referenzbeispiel 12	Magnetit	0,28	Suspension	115	keine Wärmebehandlung
Vergleichsreferenzbeispiel 2	Magnetit	0,26	trocken	90	in Luft, 600 °C, 2 h
Vergleichsreferenzbeispiel 3	Magnetit	0,21	trocken	90	in Stickstoffgas, 600 °C, 2 h
Vergleichsreferenzbeispiel 4	Magnetit	0,28	Suspension	155	in Stickstoffgas, 600 °C, 2 h
Vergleichsreferenzbeispiel 5	Magnetit	0,28	Suspension	155	keine Wärmebehandlung

Tabelle 4

	Sättigungsmagnetisierung (A·m²/kg)	Koerzitivkraft (kA/m)	Mittlere Teilchengröße (μm)
Referenzbeispiel 1 Referenzbeispiel 2 Referenzbeispiel 3 Referenzbeispiel 4 Referenzbeispiel 5 Referenzbeispiel 6 Referenzbeispiel 7 Referenzbeispiel 8 Referenzbeispiel 9 Referenzbeispiel 10 Referenzbeispiel 11 Referenzbeispiel 12	47,1 45,3 47,5 51,2 40,3 47,8 43,0 47,9 50,3 40,1 38,8 32,8	5,18 6,53 3,66 5,42 4,86 2,63 8,37 5,34 4,06 9,56 7,81 8,76	5 4 7 4 6 5 5 5 5 6 5 6
Vergleichsrefenzbeispiel 2	25,3	12,76	5
Vergleichsrefenzbeispiel 3	34,0	12,75	5
Vergleichsrefenzbeispiel 4	25,0	4,54	6
Vergleichsrefenzbeispiel 5	20,4	2,39	6

Anschließend wurde mit Hilfe der jeweiligen magnetischen Träger zur Bindung mit Nukleinsäure, die in den o. g. Referenzbeispielen 1 bis 12 und Vergleichsreferenzbeispielen 2 bis 5 erhalten wurden, die Nukleinsäure aus den biologischen Proben gemäß der o. g. Extraktionsprüfung extrahiert und zurückgewonnen, und die Rückgewinnungsleistung wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5

		Rückgewinnungsmenge von Nukleinsäure (ng)
Referenzbeispiel 1 Referenzbeispiel 2 Referenzbeispiel 3 Referenzbeispiel 4 Referenzbeispiel 5 Referenzbeispiel 6 Referenzbeispiel 7 Referenzbeispiel 8 Referenzbeispiel 9 Referenzbeispiel 10 Referenzbeispiel 11 Referenzbeispiel 12		1920 1900 1850 1820 1800 1900 1780 1910 1900 1560 1580 1470
Vergleichsrefenzbeispiel 2 Vergleichsrefenzbeispiel 3 Vergleichsrefenzbeispiel 4 Vergleichsrefenzbeispiel 5		1010 1190 1080 935

Aus den vorstehenden Ergebnissen wird deutlich, daß der magnetische Träger mit ferromagnetischen Eisenoxidteilchen und Silika, das die Oberfläche der ferromagnetischen Oxidteilchen beschichtet, sowie mit einer Sättigungsmagnetisierung von 30 bis 80 A·m²/kg, einer Koerzitivkraft von 2,39 bis 11,94 kA/m und einer mittleren Teilchengröße von 0,1 bis 10 μm in einer Menge von mindestens 20 mg in 1 ml einer wäßrigen Lösung einer Probe dispergieren kann, die eine biologische Substanz enthält, mit mindestens 90 Gew.-% in 3 Sekunden in Gegenwart eines Magnetfelds von 2000 bis 3000 Gauß aufgefangen werden kann und sich mit mindestens 0,4 μg einer biologischen Substanz je 1 mg Träger binden kann, wobei mit diesem Träger ein Isolierverfahren für biologische Substanzen mit einem eindrucksvoll verbesserten Isolier- und Reinigungsvermögen für die biologische Substanz im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren geschaffen wurde. Grund dafür ist, daß der Gebrauch eines magnetischen Trägers mit den o. g. speziellen Eigenschaften die Bindungsfähigkeit mit Nukleinsäure/Auffangbarkeit des magnetischen Trägers durch ein Magnetfeld und die Dispergierbarkeit des magnetischen Trägers/Elutionsfähigkeit von Nukleinsäure kompatibel gemacht hat.
Referenzbeispiel 13
Synthese von Magnetitteilchen
Eisensulfat (100 g, Fe₂O₄·7H₂O, 100 g) wurde in 1000 cm³ Reinwasser gelöst. Natriumhydroxid (28,8 g, äquimolare Menge zu Eisensulfat) wurde in 500 cm³ Reinwasser gelöst. Unter Rühren der wäßrigen Eisensulfatlösung wurde eine wäßrige Natriumhydroxidlösung über 1 h tropfenweise zugegeben, um eine Eisendihydroxidausscheidung zu erhalten. Nach Abschluß der tropfenweisen Zugabe wurde die Temperatur der die Eisendihydroxidausscheidung enthaltenden Suspension unter Rühren auf 75 °C erhöht, und es erfolgte eine Oxidation durch 8-ständiges Einblasen von Luft mit Hilfe einer Luftpumpe mit einem Durchfluß von 250 Litern/h, um Magnetitteilchen zu ergeben. Diese Teilchen waren nahezu kugelförmig und hatten eine mittlere Teilchengröße von etwa 0,22 μm.
Bestimmt wurde diese mittlere Teilchengröße der Magnetitteilchen durch Messen der Größe von 300 Teilchen auf einer transmissionselektronenmikroskopischen Fotografie und Berechnen ihres Zahlenmittels.
Haftenlassen einer Silicium und Aluminium aufweisenden Verbindung
Nach gründlichem Waschen der wie zuvor erhaltenen Magnetitteilchensuspension mit Reinwasser wurde das Gewicht der Magnetitteilchen und des Wassers auf 10 g bzw. 200 g ohne Trocknen eingestellt. Die Menge des Magnetits in der Suspension nach Waschen mit Wasser wurde durch Beprobung und Trocknung eines Teils davon bestimmt.
Getrennt von der Magnetitteilchensuspension wurde Natriumsilicat (2 g) in Reinwasser (10 g) gelöst. Aluminiumchlorid (0,5 g) wurde in 1 N wäßriger Natriumhydroxidlösung (10 g) gelöst. Die Beiden Lösungen wurden gemischt, um eine Mischlösung aus Natriumsilicat und Aluminiumchlorid zu ergeben, die der o. g. Magnetitteilchensuspension zugegeben wurde, und eine mit Reinwasser verdünnte wäßrige Salzsäurelösung wurde unter Rühren über etwa 1 h zur Neutralisation auf den nahezu neutralen Zustand tropfenweise zugegeben. Nach Abschluß der tropfenweisen Zugabe wurde die Mischung eine weitere Stunde gerührt.
Ist die Menge der Magnetitteilchen bezogen auf Wasser auf 1 bis 10 Gew.-% eingestellt, kann eine Silicium und Aluminium aufweisende Verbindung nahe der Oberfläche der Magnetitteilchen bevorzugt haften. Die so behandelte Suspension wurde gefiltert und bei 90 °C luftgetrocknet. Nach dem Trocknen wurden die Teilchen zermahlen und einer 2-ständigen Wärmebehandlung in einem Stickstoffgas bei 200 °C unterzogen.
Nach der Wärmebehandlung wurden die Teilchen mit Reinwasser gewaschen, um nicht zur Reaktion gekommene Materialien und Reaktionsprodukte zu entfernen, die an anderen Stellen als der Magnetitteilchenoberfläche ausgeschieden waren.
Der so erhaltene magnetische Träger für Nukleinsäure war kugel- oder körnchenförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 0,29 μm, eine Koerzitivkraft von 5,58 kA/m (70 Oersted) und eine Sättigungsmagnetisierung von 67,9 A·m²/kg (67,9 emu/g). Die Menge von Aluminium im Mischoxid aus dem haftenden Silicium und Aluminium betrug 8,9 Gew.-% der Gesamtmenge von Silicium und Aluminium. Der Gehalt von Silicium und Aluminium betrug 23,5 Gew.-% der Magnetitteilchen bei Umwandlung in Silika- (SiO₂-) und Aluminiumoxid- (Al₂O₃-) Gehalte.
3 zeigt eine REM-Abbildung des magnetischen Trägers. Dieses Bild zeigt deutlich Magnetitteilchen, keine andere Ausscheidung als auf den Magnetitteilchen liegt vor, und ein Mischoxid von Silicium und Aluminium haftet nahe der Oberfläche der Magnetitteilchen.
Danach wurde dieser magnetische Träger (0,5 g) in ein säulenförmiges Glasröhrchen mit 10 mm Durchmesser gegeben, Reinwasser (1,5 g) wurde zugegeben, und die Mischung wurde 30 min mit einer Ultraschalldispersionsvorrichtung dispergiert. Danach wurde die Mischung aus der Ultraschalldispersionsvorrichtung entnommen, 15 min stehengelassen, und das Absetzvolumen der magnetischen Träger wurde gemessen. Das Absetzvolumen der magnetischen Träger betrug 860 mm³ (Höhe 11 mm).
Referenzbeispiel 14
Erhalten wurde ein magnetischer Träger für Nukleinsäure wie im Referenzbeispiel 13 mit der Ausnahme, daß im Schritt des Haftenlassens einer Silicium und Aluminium aufweisenden Verbindung die Menge von Natriumsilicat von 2 g auf 1,8 g ge ändert und die Menge von Aluminiumchlorid von 0,5 g auf 1 g geändert, eine Silicium und Aluminium aufweisende Verbindung an den Magnetitteilchen haften gelassen und eine anschließende Wärmebehandlung wie im Referenzbeispiel 13 angewendet wurde.
Dieser magnetische Träger war kugel- oder körnchenförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 0,31 μm, eine Koerzitivkraft von 5,98 kA/m (75 Oersted) und eine Sättigungsmagnetisierung von 66,8 A·m²/kg (66,8 emu/g). Die Menge von Aluminium im Mischoxid aus dem haftenden Silicium und Aluminium betrug 17,5 Gew.-% der Gesamtmenge von Silicium und Aluminium. Der Gehalt von Silicium und Aluminium betrug 24,8 Gew.-% der Magnetitteilchen bei Umwandlung in Silika- (SiO₂-) und Aluminiumoxid- (Al₂O₃-) Gehalte.
Anhand der REM-Beobachtung wurde die Haftung von Mischoxid von Silicium und Aluminium nahe der Oberfläche jedes Manetitteilchens in diesem magnetischen Träger eindeutig nachgewiesen. Bei diesem magnetischen Träger wurde das Absetzvolumen wie im Referenzbeispiel 13 gemessen und mit 903 mm³ (Höhe 11,5 mm) ermittelt.
Referenzbeispiel 15
Erhalten wurde ein magnetischer Träger für Nukleinsäure wie im Referenzbeispiel 13 mit der Ausnahme, daß im Schritt des Haftenlassens einer Silicium und Aluminium aufweisenden Verbindung die Menge von Natriumsilicat von 2 g auf 2,2 g geändert und die Menge von Aluminiumchlorid von 0,5 g auf 0,3 g geändert, eine Silicium und Aluminium aufweisende Verbindung an den Magnetitteilchen haften gelassen und eine anschließende Wärmebehandlung wie im Beispiel 1 angewendet wurde.
Dieser magnetische Träger war kugel- oder körnchenförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 0,30 μm, eine Koerzitivkraft von 5,18 kA/m (65 Oersted) und eine Sättigungsmagnetisierung von 69,0 A·m²/kg (69,0 emu/g). Die Menge von Alu minium im Mischoxid aus dem haftenden Silicium und Aluminium betrug 4,5 Gew.-% der Gesamtmenge von Silicium und Aluminium. Der Gehalt von Silicium und Aluminium betrug 22,0 Gew.-% der Magnetitteilchen bei Umwandlung in Silika- (SiO₂-) und Aluminiumoxid- (Al₂O₃-) Gehalte.
Anhand der REM-Beobachtung wurde die Haftung von Mischoxid von Silicium und Aluminium nahe der Oberfläche jedes Manetitteilchens in diesem magnetischen Träger eindeutig nachgewiesen. Bei diesem magnetischen Träger wurde das Absetzvolumen wie im Referenzbeispiel 13 gemessen und mit 942 mm³ (Höhe 12 mm) ermittelt.
Vergleichsreferenzbeispiel 6
Erhalten wurde ein magnetischer Träger für Nukleinsäure wie im Referenzbeispiel 13 mit der Ausnahme, daß im Schritt des Haftenlassens einer Silicium und Aluminium aufweisenden Verbindung die Menge von Natriumsilicat von 2 g auf 2,3 g geändert und die Menge von Aluminiumchlorid von 0,5 g auf 0 g geändert, nur eine Siliciumverbindung an den Magnetitteilchen haften gelassen und eine anschließende Wärmebehandlung wie im Referenzbeispiel 13 angewendet wurde.
Dieser magnetische Träger war kugel- oder körnchenförmig und hatte eine mittlere Teilchengröße von 0,29 μm, eine Koerzitivkraft von 5,58 kA/m (70 Oersted) und eine Sättigungsmagnetisierung von 68,1 A·m²/kg (68,1 emu/g). Der Siliciumgehalt betrug 23,1 Gew.-% der Magnetitteilchen bei Umwandlung in den Silika- (SiO₂-) Gehalt. Bei diesem magnetischen Träger wurde das Absetzvolumen wie im Referenzbeispiel 13 gemessen und mit 1178 mm³ (Höhe 15 mm) ermittelt.

Für die jeweiligen magnetischen Träger zur Bindung mit Nukleinsäure, die in den o. g. Referenzbeispielen 13 bis 15 und im Vergleichsreferenzbeispiel 6 erhalten wurden, sind die mittlere Teilchengröße, das Verhältnis von Aluminium in der Gesamtmenge von Silicium und Aluminium [Al/(Si + Al)] und das Verhältnis von Silika und Aluminiumoxid bezogen auf die ferromagnetischen Eisenoxidteilchen [ (SiO₂ + Al₂O₃)/Fe₃O₄] gemeinsam in Tabelle 6 gezeigt. Für die jeweiligen magnetischen Träger zur Bindung mit Nukleinsäure, die in den o. g. Referenzbeispielen 13 bis 15 und im Vergleichsreferenzbeispiel 6 erhalten wurden, sind die Koerzitivkraft, die Sättigungsmagnetisierung und das Absetzvolumen gemeinsam in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 6

	Mittlere Teilchengröße (μm)	Al/(Si + Al) (Gew.-%)	(SiO₂ + Al₂O₃)/(Fe₃O₄) (Gew.-%)
Referenzbeispiel 13 Referenzbeispiel 14 Referenzbeispiel 15	0,29 0,31 0,30	8,9 17,5 4,5	23,5 24,8 22,0
Vergleichsreferenzbeispiel 6	0,29	0	23,1

Tabelle 7

	Koerzitivkraft (kA/m)	Sättigungsmagnetisierung (A·²/kg)	Absetzvolumen (mm³)
Referenzbeispiel 13 Referenzbeispiel 14 Referenzbeispiel 15	5,58 5,98 5,18	67,9 66,8 69,0	860 903 942
Vergleichsreferenzbeispiel 6	5,58	68,1	1178

Für die jeweiligen magnetischen Träger zur Bindung mit Nukleinsäure, die in den o. g. Referenzbeispielen 13 bis 15 und im Vergleichsreferenzbeispiel 6 erhalten wurden, wurde die Nukleinsäure aus den biologischen Proben gemäß der o. g.
Extraktionsprüfung extrahiert und zurückgewonnen, und die Rückgewinnungsleistung wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8

Rückgewinnungsmenge von Nukleinsäure (ng)

Referenzbeispiel 13 Referenzbeispiel 14 Referenzbeispiel 15 1920 1930 1920

Vergleichsrefenzbeispiel 6 1910
Danach wurde die in der o. g. Extraktionsprüfung zurückgewonnene Nukleinsäure (5 μl) auf 1 %igem Agarosegel durch Elektrophorese behandelt, mit Ethidiumbromid angefärbt, und die Fluoreszenz bei Ultraviolettbestrahlung wurde detektiert. Die Ergebnisse entsprechen 4. Die Elektrophoresebedingungen waren eine Konstantspannung von 100 V für 30 min. Das Betriebsverfahren und andere Bedingungen folgten der Technik, die in Maniatis et al., "Molecular Cloning" (1982) beschrieben ist. Zusätzlich zur Nukleinsäurelösung wurde gleichzeitig auch ein Molekulargewichtsmarker elektrophoresiert und als Index zum Vergleich der Kettenlänge der detektierten Nukleinsäure verwendet.
Im Elektrophoresebild gemäß 4 bezeichnet "M" den o. g. Molekulargewichtsmarker, die Spuren "1" und "2" zeigen die Ergebnisse (2 Proben) der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäure mit Hilfe des Trägers des Referenzbeispiels 13, die Spuren "3" und "4" zeigen die Ergebnisse (2 Proben) der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäure mit Hilfe des Trägers des Referenzbeispiels 14, die Spuren "5" und "6" zeigen die Ergebnisse (2 Proben) der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäure mit Hilfe des Trägers des Referenzbeispiels 15, und die Spuren "7" und "8" zeigen die Ergebnisse (2 Proben) der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäure mit Hilfe des Trägers des Vergleichsreferenzbeispiels 6.
Wie aus den o. g. Ergebnissen in den Tabellen 6 bis 8 hervorgeht, zeigten die magnetischen Träger der Referenzbeispiele 14 und 15, bei denen eine Silicium und Aluminium aufweisende Verbindung nahe der Oberfläche der Magnetitteilchen haftete, nahezu die gleiche Menge von Nukleinsäureextraktion, ein deutlich kleines Absetzvolumen, hohe Oberflächenglätte und gute Fließfähigkeit, waren in der Extraktionsleistung für Nukleinsäure keinesfalls unterlegen und zeigten ausgezeichnete Haftungsgleichmäßigkeit.
Ein weiteres Experiment zum Nachweis des Fließvermögens wurde gemäß der nachfolgenden Darstellung durchgeführt.
Das heißt, eine bestimmte Menge der magnetischen Träger zur Bindung mit Nukleinsäure der Referenzbeispiele 13 bis 15 und des Vergleichsreferenzbeispiels 6 wurde in Wasser dispergiert, und eine bestimmte Menge der wäßrigen Suspension wurde auf eine Glasplatte getropft. Danach wurde diese wäßrige Suspension mit Hilfe eines Magneten von der Rückseite der Glasplatte geradlinig bewegt. Nach Bewegen über eine bestimmte Entfernung wurde das Gewicht des mit der wäßrigen Suspension bewegten magnetischen Trägers gemessen.
Als Ergebnis war der magnetische Träger, der sich mit der Suspension bewegte, deutlich schwerer in den Referenzbeispielen 13 bis 15 als im Vergleichsreferenzbeispiel 6. Dies bedeutet, daß die magnetischen Träger der Referenzbeispiele 13 bis 15 dem magnetischen Träger des Vergleichsreferenzbeispiels 6 in der Haftungsgleichmäßigkeit der Verbindung (Oxid), die nahe der Oberfläche der Magnetitteilchen haftet, überlegen sind und eine bessere Fließfähigkeit haben.
Wie aus den o. g. Ergebnissen gemäß 4 deutlich wird, zeigt die mit Hilfe der magnetischen Träger der Referenzbeispiele 13 bis 15 zurückgewonnene Nukleinsäure eine kleinere Molekulargewichtsverteilung als die Nukleinsäure, die mit Hilfe des magnetischen Trägers des Vergleichsreferenzbeispiels 6 zurückgewonnen wurde. Der Grund dafür ist nicht klar, aber man geht davon aus, daß die Haftung einer Silicium und Aluminium aufweisenden Verbindung am Magnetitteilchen die Teilchenoberfläche des magnetischen Trägers glättet, was Spaltung der Nukleinsäure Widerstand entgegensetzt. Dagegen zeigt ein magnetischer Träger, an dem nur eine Silciumverbindung haftet, schlechtere Haftungsgleichmäßigkeit. Daher geht man davon aus, daß die Teilchenoberfläche des magnetischen Trägers Konkavitäten und Konvexitäten hat, die Spaltung der Nukleinsäure begünstigen, was wiederum die Molekulargewichtsverteilung der Nukleinsäure verbreitert.
Wie zuvor erläutert, hat der magnetische Träger der Erfindung ausgezeichnete Dispergierbarkeit in wäßriger Lösung, Auffangbarkeit durch ein Magnetfeld, reversible Bindungsfähigkeit mit einer biologischen Substanz, Elutionsfähigkeit der gebundenen biologischen Substanz sowie Isolier- und Reinigungseffizienz für biologische Substanzen verglichen mit herkömmlichen Trägern.

Claims

Magnetischer Träger für eine Nukleinsäure, der eine Sättigungsmagnetisierung von 30 bis 80 A·m²/kg und eine Koerzitivkraft von 2,39 bis 11,94 kA/m hat, wobei der magnetische Träger Magnetitteilchen und eine Silikabeschichtung auf der Oberfläche der Magnetitteilchen aufweist, wobei die Menge der Silikabeschichtung 3 bis 100 Gew.-% der Magnetitteilchen beträgt und der magnetische Träger eine mittlere Teilchengröße von 0,12 bis 0,45 μm hat.
Verwendung des magnetischen Trägers nach Anspruch 1 zur Bindung einer Nukleinsäure durch In-Kontakt-bringen des Trägers mit der Nukleinsäure in einer wäßrigen Lösung einer die Nukleinsäure enthaltenden Probe.
Verfahren zum Isolieren einer Nukleinsäure, das aufweist: Bilden eines Komplexes aus einer Nukleinsäure und einem magnetischen Träger durch In-Kontakt-bringen des magnetischen Trägers nach Anspruch 1 mit der Nukleinsäure in einer wäßrigen Lösung einer die Nukleinsäure enthaltenden Probe, Trennen des Komplexes von der Probe durch ein externes Magnetfeld, und Eluieren der Nukleinsäure aus dem Komplex.
Herstellungsverfahren des magnetischen Trägers nach Anspruch 1, das die folgenden Schritte aufweist: a) Herstellen einer wäßrigen Lösung mit 100 Gewichtsteilen Wasser und 1 bis 10 Gewichtsteilen Magnetitteilchen mit einem Aspektverhältnis von 1,0 bis 1,2, die im Wasser suspendiert sind, b) Zugeben von 0,3 bis 2 Gewichtsteilen Natriumsilicat bei Umwandlung zu SiO₂ zur wäßrigen Suspension, und c) Neutralisieren von Natriumsilicat durch Zugeben einer Säure, damit Silika ausscheiden kann.
Herstellungsverfahren nach Anspruch 4, ferner mit einer Wärmebehandlung des Trägers in einem Inertgas.
Herstellungsverfahren nach Anspruch 4 oder 5, ferner mit Einwirkenlassen einer Wärmebehandlung bei 200 bis 800 °C auf Magnetitteilchen, die mit Silika beschichtet sind.
Herstellungsverfahren nach Anspruch 6, wobei die Wärmebehandlung in einem Atmosphärengas aus einem Inertgas oder einem Reduktionsgas durchgeführt wird.
Herstellungsverfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Magnetitteilchen durch Oxidation in einer wäßrigen Lösung synthetisiert und Silikabeschichtungsbehandlung ohne Trocknen ausgesetzt werden.