DE60316424T2

DE60316424T2 - Beta-untereinheit von glucosedehydrogenase und diese kodierende dna

Info

Publication number: DE60316424T2
Application number: DE60316424T
Authority: DE
Inventors: Koji Sode
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-04-26
Filing date: 2003-04-25
Publication date: 2008-06-26
Anticipated expiration: 2023-04-26
Also published as: EP1498484A4; US7094585B2; US20050214766A1; US20060252123A1; CN1650006A; DE60316424D1; ATE373706T1; WO2003091430A1; US20060211094A1; US7329519B2; EP1498484A1; JP4107389B2; US7432094B2; AU2003235854A1; EP1498484B1; JPWO2003091430A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Cytochrom C, das eine Glucosedehydrogenase-β-Untereinheit bildet, eine das Cytochrom C kodierende DNS und ihre Verwendung. Die Glucosedehydrogenase ist als Glucosesensor unter Verwendung einer Enzymelektrode oder Ähnlichem nützlich.
Stand der Technik
Ein Enzym, welches mit einem bestimmten Substrat spezifisch reagiert, nutzende Biosensoren werden in verschiedenen industriellen Bereichen aktiv entwickelt. So werden für einen Glucosesensor, der einer dieser Biosensoren ist, hauptsächlich in der Medizin insbesondere Messverfahren und Vorrichtungen unter Verwendung solcher Verfahren aktiv entwickelt. Z.B. hat der Glucosesensor eine etwa 40-jährige Geschichte, seit Clark und Lyons 1962 erstmals über einen Biosensor berichteten, der Glucoseoxidase und eine Sauerstoffelektrode in Kombination einschloss (Ref.: Clark, J. und Lyonas C.: „Elektrode Systems for continous monitoring in cardiovascular surgery.", Ann.n.y. Acad. Sci., 105: 20-45).
Damit hat die Verwendung von Glucoseoxidase als ein Enzym für den Glucosesensor eine lange Geschichte. Der Grund ist, dass Glucoseoxidase eine hohe Substratspezifität für Glucose und hervorragende thermische Stabilität hat, dieses Enzym weiterhin in großem Maßstab hergestellt werden kann und seine Herstellungskosten geringer als diejenigen anderer Enzyme sind. Die hohe Substratspezifität bedeutet, dass dieses Enzym nicht mit anderen Sacchariden als Glucose reagiert und das hat den Vorteil, dass eine genaue Messung ohne Fehler der Messwerte erzielt werden kann. Weiterhin bedeutet hervorragende thermische Stabilität, dass Probleme hinsichtlich Denaturierung des Enzyms oder Inaktivierung seiner enzymatischen Aktivität auf Grund von Wärme vermieden werden können. was den Vorteil hat, dass über einen langen Zeitraum eine genaue Messung durchgeführt werden kann.
Obwohl Glucoseoxidase Vorteile wie die oben beschriebenen hat, besteht jedoch das Problem, dass das Enzym durch gelösten Sauerstoff beeinflusst wird und das beeinflusst die Messergebnisse.
Zwischenzeitlich ist auch zusätzlich zu Glucoseoxidase ein Glucosesensor, der Glucosedehydrogenase verwendet (im Folgenden als „Glucosedehydrogenase" oder „GDH” bezeichnet) entwickelt worden. Dieses Enzym ist auch in Mikroorganismen zu finden. Z.B. sind eine von Bacillus (EC 1.1.1.47) stammende Glucosedehydrogenase und eine von Cryptococcus (EC 1.1.1.119) stammende Glucosedehydrogenase bekannt.
Die erstere Glucosedehydrogenase (EC 1.1.1.47) ist ein Enzym, das die Reaktion von β-D-Glucose + NAD(P)⁺ → D-δ-Gluconolacton + NAD(P)H + H⁺ katalysiert und die letztere Glucosedehydrogenase ist ein Enzym, das eine Reaktion von D-Glucose + NADP⁺ → D-δ-Gluconolacton + NADPH + H⁺ katalysiert. Die vorgenannten von Mikroorganismen stammenden Glucosedehydrogenasen werden bereits vermarktet.
Diese Glucosedehydrogenasen haben den Vorteil, dass sie nicht durch in einer zu messenden Probe gelösten Sauerstoff beeinflusst wird. Das hat den Vorteil, dass genaue Messungen erzielt werden können, ohne dass Fehler in den Messergebnissen verursacht werden, selbst dann, wenn die Messung in einer Umgebung mit niedrigem Sauerstoffpartialdruck durchgeführt werden, oder wenn eine hochkonzentrierte Probe für die Messung verwendet wird, bei der eine große Sauerstoffmenge nötig ist.
Obwohl konventionelle Glucosedehydrogenase nicht durch gelösten Sauerstoff beeinflusst wird, gibt es jedoch Probleme durch geringe thermische Stabilität und eine Substratspezifität, die schlechter als diejenige von Glucoseoxidase ist. Als Enzym zur Verwendung in einem Sensor war ein Enzym erwünscht, das die Nachteile sowohl von Glucoseoxidase wie auch von Glucosedehydrogenase überwindet.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung berichteten über Ergebnisse ihrer Studien über GDH, bei denen sie Proben verwendeten, die aus Böden in der Nähe heißer Quellen gewonnen wurden, in Sode, K., Tsugawa, W., Yamazaki, T., Watanabe, M., Ogasawara, N. und Tanaka, M.: Enzyme Microb. Technol. 19, 82-85 (1996); Yamazaki, T., Tsugawa, W. und Sode, K.: Appli. Biochemi. and Biotec., 77-79/0325 (1999) und Yamazaki, T., Tsugawa, W. und Sode, K.; Biotec. Lett., 21, 199-202 (1999). Die Mikroorganismen in solchen Proben produzieren eine Coenzym-bindende GDH und die enzymatischen Eigenschaften wie optimale Reaktionstemperatur, thermische Stabilität und Substratspezifität waren bereits klar (s. die vorgenannten Dokumente). Dieses Enzym ist ein hetero-oligomeres Enzym, das aus einer Katalysator-Untereinheit mit großem thermischem Widerstand (α-Untereinheit), einer Elektronen übertragenden Untereinheit (β-Untereinheit) und einer γ-Untereinheit mit einer unbekannten Funktion besteht, und seine Aktivitätspeaks wurden bei 45°C und 75°C, respektive, beobachtet. Weiterhin wurden die Gene für die γ und die α-Untereinheit geklont, und es wurde aufgeklärt, dass der vorgenannten Mikroorganismus zu Burkhorderia cepacia gehört und die N-ständige Aminosäuresequenz der β-Untereinheit wurde aufgeklärt (Ken Inose, Tokyo Agricultural Engineering Master's Thesis (2001)). Die Struktur der β-Untereinheit ist jedoch nicht bereichtet worden.
Kondo und Hirnouchi (Appl. Environ. Microbiol. (1997) Vol 63(3):1131-8) offenbaren die Charakterisierung der Gene, die die aus drei Komponenten bestehende, membrangebundene Alkoholdehydrogenase aus Gluconobacter suboxydans kodieren, und ihre Expression in Acetobacter pasteurianus. Die aus drei Komponenten bestehende, membrangebundene Alkoholdehydrogenase (ADH) aus Gluconobacter suboxydans IFO12528 wurde gereinigt und die NH₂-ständige Aminosäuresequenz jeder Untereinheit wurde bestimmt. Auf der Grundlage der Aminosäuresequenzen wurden die Gene adhA, das die 72-kDa-Dehydrogenase kodiert, adhB, das das 44-kDa-Cytochtom c-553 kodiert (ein CO-bindendes Cytochrom c) und adhS, das ein 15-kDa-Gen kodiert, geklont, und die Aminosäuresequenzen ihrer Produkte wurden von den Nukleinsäuresequenzen abgeleitet. Die Dehydrogenase- und Cytochromgene wurden mit derselbem Transkriptionspolarität wie im Falle von Acetobacter, einer anderen Art von Essigsäurebakterien, geclustert. Diese AdhA- und AdhB-Untereinheiten zeigten Ähnlichkeiten in der Aminosäuresequenz zu derjenigen von Acetobacter spp., während AdhS keine Ähnlichkeit zur entsprechenden Untereinheit des ADH-Komplexes von Acetobacter pasteurianus zeigte. Konsistenterweise konnte adhS von G. suboxydans einen Defekt in der entsprechenden Untereinheit von A. pasteurianus nicht ergänzen. Wenn der adhA-adhB-Gencluster von G. suboxydans in einer Mutante von A. pasteurianus mit ADH-Defekt exprimiert wurde, zeigte der Transformant bestimmte ADH-Aktivität. Der ADH-Komplex wurde bis fast zur Homogenität aufgereinigt und er bestand aus zwei Untereinheiten: die von G. suboxydans stammenden Dehydrogenase- und die Cytochrom c-Untereinheiten, ohne irgendeine andere Untereinheit. Diese Daten legten nahe, dass AdhS, die kleinste Untereinheit von ADH, von G. suboxydans für die ADH-Aktivität in A. pasteurianus nicht essentiell ist, im Gegensatz zur essenziellen Rolle von A. pasteurianus AdhS, welches für die korrekte Anordnung der Dehydrogenase- und Cytochrom c-Untereinheiten auf der Membran notwendig ist.
Offenlegung der Erfindung
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine DNS zur Verfügung zu stellen, die eine GDH-β-Untereinheit eines zur Burkhorderia-Art gehörenden Mirkoorganismus kodiert, und ein Verfahren zur Verwendung der DNS.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Studien an GDH des Burkhorderia cepacia KS1-Stammes weiter vorangetrieben und hatten Erfolg, eine DNS zu isolieren, die eine GDH-β-Untereinheit kodiert, womit sie die vorliegende Erfindung gemacht haben.
Das heißt, dass die vorliegende Erfindung folgendermaßen beschrieben werden kann:

(1) DNS, die ein durch (A) oder (B) definiertes Protein kodiert: (A) Protein, das mindestens die aus den Aminosäuren 23 bis 425 der SEQ ID Nr. 16 bestehende Aminosäuresequenz umfasst; (B) Protein, das mindestens die aus den Aminosäuren 23 bis 425 der SEQ ID Nr. 16 bestehende Aminosäuresequenz einschließlich Substitution, Deletion, Insertion oder Addition von einem bis 20 Aminosäureresten umfasst.
2. DNS nach Punkt (1), wobei die DNS durch (a) oder (b) definiert ist: (a) DNS, die die Nukleotidsequenz, die aus den Nukleotiden 187 bis 1398 der SEQ ID Nr. 15 besteht, umfasst; (b) DNS, die mit der der aus den Nukleotiden 187 bis 1398 der SEQ ID Nr. 15 bestehenden DNS unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist.
3. DNS nach Punkt (2), die darüber hinaus eine aus den Nukleotiden 121 bis 187 der SEQ ID Nr. 15 bestehende Nukleotidsequenz umfasst.
4. Rekombinanter Vektor, der die DNS nach einem der Punkte (1) bis (3) umfasst.
5. Transformant, der mit der DNS nach einem der Punkte (1) bis (3) oder dem rekombinanten Vektor nach Punkt (4) transformiert ist.
6. Verfahren zur Herstellung einer Glucosedehydrogenase-β-Untereinheit, die das Kultivieren des Transformanten nach Punkt (5) zur Herstellung einer Glucosedehydrogenase-β-Untereinheit als Expressionsprodukt der DNS und das Gewinnen der hergestellten β-Untereinheit umfasst.
7. DNS nach Punkt (2) oder (3), die weiterhin eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine α-Untereinheit und eine γ-Untereinheit von Burkhorderia cepacia kodiert.
8. Rekombinanter Vektor, der die DNS nach Punkt (7) umfasst.
9. Transformant, der mit der DNS nach Punkt (7) oder dem rekombinanten Vektor nach Punkt (8) transformiert worden ist.
10. Verfahren zur Herstellung eines Glucosedehydrogenasekomplexes, das das Kultivieren des Transformanten nach Punkt (9) zur Herstellung eines Glucosedehydrogenasekomplexes als Expressionsprodukt der DNS und Gewinnen des hergestellten Komplexes umfasst.

Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung genau beschrieben.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nach einer DNS des Burkhorderia cepacia KS1-Stammes, die eine GDH-β-Untereinheit kodiert, gesucht und diese isoliert. Der vorgenannte Stamm wurde am 25. September 2000 an der Internationalen Patent-Organismenhinterlegungsstelle, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Central 6, 1-1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, Postleitzahl 305-8566) hinterlegt und erhielt die Mikroorgansimenzugriffsnummer FERM BP-7306. In der vorliegenden Spezifikation wird die die GDH-β-Untereinheit kodierende DNS manchmal mit „erfindungsgemäße DNS", „Strukturgen für die β-Untereinheit" oder einfach „β-Untereinheit-Gen" bezeichnet.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bestätigt, dass vom Burkhorderia cepacia KS1-Stamm hergestellte GDH ein polymeres Protein ist, das eine α-Untereinheit, β-Untereinheit und γ-Untereinheit enthält. Das erfindungsgemäße Protein entspricht der β-Untereinheit unter diesen Untereinheiten. Spektrophotometrische Analysen von GDH zeigen, dass die Absorptionswellenlänge einer oxidierten GDH den Absorptionswellenlängen von Alkoholdehydrogenase und Aldehyddehydrogenase von Gluconobacter sp. und Acetobacter sp. ähneln, die aus dem Dehydrogenase-Cytochrom c-Komplex bestehen, und diese Absorption geht durch Wärmebehandlung verloren. Diese Tatsache und der Unterschied bei der optimalen Reaktionstemperatur der GDH in Gegenwart und bei Fehlen der β-Untereinheit, wie im Folgenden beschrieben, legten nahe, dass die β-Untereinheit aus Cytochrom c besteht.
Physikalische und chemische Eigenschaften der obengenannten GDH werden im Folgenden aufgeführt.

(1) Funktion: Das Enzym katalysiert die Dehydrogenierungsreaktion von Glucose
(2) Das Enzym besteht aus Untereinheiten mit einem Molekülgewicht von etwa 60 kDa und einem Molekülgewicht von etwa 43 kDa bei der SDS-Polyacrylamind-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen.
(3) Das Enzym hat ein Molekülgewicht von etwa 380 kDa bei der Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von TSK Gel G300SW (hergestellt von der Tosoh Corporation).
(4) Optimale Reaktionstemperatur: etwa 45°C (Tris-HCl-Puffer, pH 8,0).

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der α-Untereinheit alleine sind im Folgenden dargestellt:

(1)': Das Protein hat Glucosedehydrogenaseaktivität.
(2)': Das Protein hat ein Molekülgewicht von etwa 60 kDa bei der SDS-Polyacrylamind-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen.
(3)': Optimale Reaktionstemperatur: etwa 75°C (Tris-HCl-Puffer, pH 8,0)

Die β-Untereinheit kann zusammen mit anderen Untereinheiten aus einer Kultur des Burkhorderia cepacia KS1-Stammes durch Aufreinigen eines GDH-Komplexes unter Verwendung der GDH-Aktivität als Index gewonnen werden. Die GDH-Aktivität kann auf dieselbe Weise wie bei den bekannten GDH-Messverfahren gemessen werden. Speziell kann die Messung folgendermaßen durchgeführt werden: Ein 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), der 594 μM 1-Methoxiphenazinmethosulfat (mPMS) und 5,94 μM 2,6-Dichlorphenolindophenol (DCIP) enthält, wird zu einer Enzymprobe und Glucose als Substrat zugegeben und das Gemisch wird bei 37°C inkubiert. Eine Veränderung der Absorption von DCIP bei 600 nm wird unter Verwendung eines Spektrophotometers verfolgt und die Abklingrate der Absorption wird als Enzymreaktionsrate definiert.
Zusätzlich kann die β-Untereinheit auch, weil die Nukleotidsequenz eines die β-Untereinheit kodierenden Gens (SEQ ID Nr. 15) in der vorliegenden Erfindung bestimmt worden ist, durch Expression einer DNS mit der Nukleotidsequenz oder einer DNS, die dieselbe Aminosäuresequenz wie die durch diese DNS kodierte Amonisäuresequenz kodiert, in einem geeigneten Wirt hergestellt werden. Die Aminosäuresequenz, die durch das offene Leseraster (ORF) von SEQ ID Nr. 15 kodiert sein kann, ist in SEQ ID Nr. 16 dargestellt. Die N-ständige Aminosäuresequenz einer vom Protein bestimmten β-Untereinheit war identisch zu den Aminosäuren 23 bis 38 von SEQ ID Nr. 16. Es wird daher angenommen, dass die Aminosäuren 1 bis 22 ein Signalpeptid sind. Es ist auch zu bemerken, dass, obwohl in den SEQ ID Nr. 15 und 16 der Aminosäurerest 1 als Val beschrieben wird, eine große Wahrscheinlichkeit besteht, dass er Met ist, und es besteht auch eine große Wahrscheinlichkeit, dass er nach der Translation abgestoßen wird.
Ergebnisse von Homologieuntersuchungen der vorgenannten Aminosäuresequenz durch BLAST zeigten insgesamt große Homologien; eine 65% Homologie mit einer Cytochrom C-Untereinheit der von Ralstonia solanacearum stammenden Oxireduktasedehydrogenase, eine 48% Homologie mit einer Cytochrom C-Untereinheit von von Gluconobacter oxydans stammender Sorbitoldehydrogenase, eine 44% Homologie mit einer Cytochrom C-Untereinheit von von Eriwinia cypripedii stammender Gluconsäuredehydrogenase und eine 55,7% Homologie bei der Nukleotidsequenz oder eine 46,4% Homologie bei der Aminosäuresequenz mit einer Cytochrom C-Untereinheit von von Pantoea citrea stammender 2-Keto-Gluconsäuredehydrogenase. Weiterhin bewahrten die Aminosäuresequenzen dieser Cytochrom C-Sorten ein Häm-verknüpfendes Motiv (SEQ ID Nr. 17). Diese Tatsachen zeigen, dass die erfindungsgemäße β-Untereinheit Cytochrom C ist.
Die erfindungsgemäße β-Untereinheit kann ein Protein sein, das aus den Aminosäuren 23 bis 425 von SEQ ID Nr. 16 einschließlich Substitution, Deletion, Insertion oder Addition von einem bis 20, vorzugsweise einem bis 10, bevorzugter einem bis 5 Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz besteht, solange es als eine GDH-β-Untereinheit wirken kann. Es ist zu bemerken, dass der Begriff „wirkt als eine GDH-β-Untereinheit" bedeutet „wirkt als Cytochrom C, ohne die Enzymaktivität der GDH zu beeinträchtigen".
Die erfindungsgemäße DNS ist eine DNS, die die vorgenannte β-Untereinheit kodiert und z.B. vom Burkhorderia cepacia KS1-Stamm erhalten werden kann. Die erfindungsgemäße DNS ist aus chromosomaler DNS des Burkhorderia cepacia KS1-Stammes im Zuge der Vollendung dieser Erfindung isoliert worden. Die erfindungsgemäße DNS kann z.B. durch PCR unter Verwendung von Primern mit Nukleotidsequenzen der SEQ ID Nr. 13 und 14 und der chromosomalen DNS des Burkhorderia cepacia KS1-Stammes als Templat erhalten werden. Zusätzlich kann die erfindungsgemäße DNS auch, weil die Nukleotidsequenz der erfindungsgemäßen DNS und die durch die Nukleotidsequenz kodierte Aminosäuresequenz durch die vorliegende Erfindung aufgeklärt wurden, durch Durchführen chemischer Synthesen auf der Grundlage dieser Sequenzen erhalten werden. Weiterhin kann die erfindungsgemäße DNS von chromosomaler DNS des Burkhorderia cepacia KS1-Stammes durch Hybridisierung unter Verwendung des Oligonukleotides als Sonden, das auf der Grundlage der vorgenannten Sequenzen hergestellt wurde, erhalten werden. Ähnlich können Varianten von anderen Stämmen als Burkhorderia cepacia erhalten werden.
Die erfindungsgemäße DNS kann eine sein, die ein Protein mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die aus den Aminosäuren 23 bis 425 der SEQ ID Nr. 16 besteht, oder eine, die die Aminosäuresequenz einschließlich Substitution, Deletion, Insertion oder Addition von einem bis 20, vorzugsweise einem bis 10, bevorzugter einem bis 5 Aminosäurereste hat und ein Protein kodiert, das als eine GDH-β-Untereinheit funktioniert.
Die erfindungsgemäße DNS schließt speziell eine DNS mit einer Nukleotidsequenz ein, die aus den Nukleotiden 187 bis 1398 der SEQ ID Nr. 15 besteht. Weiterhin kann die erfindungsgemäße DNS eine DNS sein, die mit SEQ ID Nr. 15 hybridisiert, oder eine Sonde, die aus dieser Sequenz unter stringenten Bedingungen hergestellt werden kann und ein Protein kodiert, das als eine β-Untereinheit funktionieren kann. Die stringenten Bedingungen schließen solche Bedingungen ein, bei denen DNS mit einer Homologie von 70% oder darüber, bevorzugter 80% oder darüber, noch bevorzugter 90% oder darüber zueinander hybridisieren, speziell Bedingungen von 1 × SSC, 0,1% SDS und 60°C.
Die GDH-β-Untereinheit kann durch Kultivieren eines Transformanten hergestellt werden, der die erfindungsgemäße DNS beherbergt, oder einen die erfindungsgemäße DNS enthaltenden rekombinanten Vektor, um die GDH-β-Untereinheit als Expressionsprodukt der DNS herzustellen, und durch Gewinnen der GDH-β-Untereinheit aus den Mikroorganismenzellen oder dem Kulturmedium. In diesem Falle kann die die erfindungsgemäße GDH-β-Untereinheit kodierende DNS zusammen mit einer eine α-Untereinheit kodierenden DNS oder darüber hinaus einer eine γ-Untereinheit kodierenden DNS exprimiert werden, um einen GDH-Komplex herzustellen. Ein DNS-Fragment, das sequenziell die γ-Untereinheit und die α-Untereinheit kodiert, kann mittels PCR unter Verwendung von Primern mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 18 und 19 erhalten werden.
Beispiele für den Mikroorganismus, der die GDH-β-Untereinheit oder den GDH-Komplex herstellt, schließen ein: Enterobakterien einschließlich Escherichia coli, Gram-negative Bakterien wie Pseudomonas und Gluconobacter, Gram-positive Bakterien einschließlich Bakterien, die zur Bacillus-Art gehören wie Bacillus subtilis, Hefen wie Saccharomyces cervisiae und Pilze wie Aspergillus niger. Jedoch ist der Mikroorganismus nicht auf diese beschränkt, und es kann irgendein Mikroorganismus verwendet werden, solange er ein für die Herstellung fremder Proteine geeigneter Wirtsmikroorganismus ist.
Vektoren, die zum Klonieren oder Exprimieren der erfindungsgemäßen DNS verwendet werden, sind geeigneterweise solche, die zur Genrekombination aus Plasmiden oder Phagen konstruiert worden sind, die sich in den Wirtsmechanismen autonom replizieren können. Beispiele für Vektoren für E. coli schließen pBR322, pUC18, pUC118, pUC19, pUC119, pTrc99A, pBluescript oder SuperCosl, welches ein Cosmid ist, ein. Das Überführen der DNS vom Vektor, der verwendet worden ist, die erfindungsgemäße DNS zu klonieren, in andere rekombinante, zur Expression geeignete Vektoren, etc., kann einfach durch Gewinnen der erfindungsgemäßen DNS von einem rekombinanten Vektor, der die erfindungsgemäße DNS enthält, mit einem Restriktionsenzym oder dem PCR-Verfahren und sein Legieren mit einem Vektorfragment durchgeführt werden. Weiterhin kann die Transformation von Mikroorganismen mit diesen Vektoren mittels des Kompetenten-Zellen-Verfahrens durch Behandlung mit Calcium im Falle von zur Escherichia-Art gehörenden Bakterien, dem Protoplast-Verfahren im Falle von zur Art der Bacillus gehörenden Bakterien, dem KU-Verfahren oder dem KUR-Verfahren im Falle von Hefen und dem Mikromanipulationsverfahren im Falle von Pilzen usw. durchgeführt werden. Zusätzlich kann auch das Elektroporationsverfahren breit angewandt werden.
Die Selektion von Wirtsmechanismen auf der Grundlage der Tatsache, ob der rekombintante Zielvektor darin eingeführt wurde oder nicht, kann unter Verwendung eines chemischen Resistenzmarkers des die Ziel-DNS enthaltenden Vektors oder Ähnlichem durchgeführt werden. Z.B. kann ein Mikroorganismus, der in einem selektiven Medium auf der Grundlage eines chemischen Resistenzmarkers wachsen kann und GDH herstellt, selektiert werden.
Was das Kultivierungsverfahren des Transformanten betrifft, können die Kultivierungsbedingungen in Anbetracht der Ernährungs- und physiologischen Eigenschaften des Wirts ausgewählt werden. In vielen Fällen wird Flüssigkultur durchgeführt. Es ist für die Industrie vorteilhaft, eine Belüftungskultur unter Schütteln durchzuführen.
Was die Nährstoffe des Mediums anbetrifft, können diejenigen, die gewöhnlich bei der Kultivierung von Mikroorganismen verwendet werden, breit verwendet werden. Als Kohlenstoffquelle kann jede assimilierbare Kohlenstoffquelle verwendet werden und Beispiele für die verwendbaren Verbindungen schließen Glucose, Sucrose, Lactose, Maltose, Lactose, Molasse, Bernsteinsäure usw. ein. Weiterhin können als Stickstoffquelle alle verwendbaren Stickstoffquellen verwendet werden, und Beispiele für die verwendbaren Verbindungen schließen Pepton, Fleischextrakte, Hefeextrakte, Caseinhydrolysate, alkalische Extrakte von Sojabohnen-Kuchen usw. ein. Zusätzlich werden wie nötig Phosphat, Carbonat, Sulfat, Magnesium-, Calcium-, Kalium-, Eisen-, Mangan-, Zinksalze usw., bestimmte Aminosäuren, bestimmte Vitamine usw. verwendet.
Obwohl die Kultivierungstemperatur in einem Bereich, in dem ein Bakterium wächst und das erfindungsgemäße Protein produziert, geeignet verändert werden kann, liegt sie vorzugsweise bei etwa 20°C bis 42°C. Die Kultivierungszeit variiert etwas in Abhängigkeit von den Bedingungen. Die Kultivierung kann jedoch zu einer geeigneten Zeit abgeschlossen werden, von der angenommen wird, dass die maximale GDH-Ausbeute vorliegt, und die Kultivierungszeit beträgt gewöhnlich 12 bis 72 Stunden. Obwohl der pH-Wert des Mediums in einem Bereich, in dem ein Bakterium wächst und das erfindungsgemäße Protein produziert, geeignet verändert werden kann, liegt er vorzugsweise im Bereich von etwa pH 6,0 bis 9,0.
Das Kultivierungsmedium, das Zellen des in der Kultur das erfindungsgemäße Protein herstellenden Mikroorganismus enthält, kann gewonnen und so, wie es vorliegt, verwendet werden. Wenn das erfindungsgemäße Protein jedoch im Kulturmedium vorliegt, wird das Kulturmedium gewöhnlich auf konventionelle Weise mittels Filtration, Zentrifugieren oder Ähnlichem in eine das erfindungsgemäße Protein enthaltende Lösung und Mikroorganismenzellen aufgetrennt und dann verwendet. Wenn das erfindungsgemäße Protein in den Zellen vorliegt, werden die Zellen aus der erhaltenen Kultur mittels Filtration, Zentrifugieren oder Ähnlichem gewonnen und dann mittels eines mechanischen Verfahrens oder eines enzymatischen Verfahrens wie der Verwendung von Lysozym aufgebrochen. Weiterhin werden ein Chelat bildender Wirkstoff wie EDTA und ein oberflächenaktiver Stoff zu den Zellen soweit nötig zugegeben, um das erfindungsgemäße Protein zu solubilisieren, gefolgt von Isolieren und Gewinnen als eine wässrige Lösung.
Das Protein kann aus der so erhaltenen Protein enthaltenden Lösung mittels z.B. Aufkonzentrieren im Vakuum, Membrankonzentration, Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Natriumsulfat oder Ähnlichem, oder einer fraktionierten Fällung mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol oder Aceton ausgefällt werden. Weiterhin sind auch Wärmebehandlung und Behandlung am isoelektrischen Punkt effektive Reinigungsverfahren. Dann kann die Reinigung mittels einer geeigneten Kombination von Gelfiltration unter Verwendung eines Adsorbens, Gelfiltrationswirkstoff, etc., Absorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Affinitätschromatographie durchgeführt werden, um das gereinigte erfindungsgemäße Protein zu erhalten.
Eine aufgereinigte Enzymzubereitung kann durch Isolieren und auf Säulechenchromatographie basierender Reinigung erhalten werden. Obwohl die aufgereinigte Enzymzubereitung vorzugsweise soweit aufgereinigt wird, dass bei der Elektrophorese (SDS-PAGE) eine einzelne Bande erhalten wird, kann sie eine α-Untereinheit oder eine γ-Untereinheit enthalten.
Das so erhaltene, gereinigte Enzym kann z.B. durch Gefriertrocknung, Vakuumtrocknung, Sprühtrocknung oder Ähnliches in ein Pulver überführt und vertrieben werden.
Der aus einer erfindungsgemäßen β-Untereinheit, α-Untereinheit oder wann immer nötig einer γ-Untereinheit bestehende GDH-Komplex oder diese enthaltende Transformanten können als Enzymelektrode eines Glucosesensors verwendet werden. Als Elektrode kann eine Kohleelektrode, Goldelektrode, Platinelektrode oder Ähnliches verwendet werden, und die erfindungsgemäße GDH wird auf der Elektrode immobilisiert. Beispiele für das Immobilisierungsverfahren schließen ein Verfahren unter Verwendung eines Vernetzungsreagenzes ein Verfahren zum Einschließen des Enzyms in eine Polymermatrix, ein Verfahren des Bedeckens des Enzyms mit einer Dialysemembran, Verfahren der Verwendung eines Photovernetzungspolymers, leitfähigen Polymers, Oxidations-Reduktionspolymers oder Ähnliche ein. Alternativ kann das Enzym durch Adsorption in einem Polymer oder auf einer Elektrode zusammen mit einem Elektronenvermittler für den ein typisches Beispiel Ferrocen und Derivate Davon sind, immobilisiert werden, oder diese Verfahren können in Kombination angewandt werden. Typischerweise wird die erfindungsgemäße Glucosedehydrogenase unter Verwendung von Glutaraldehyd auf einer Kohleelektrode immobilisiert und dann wird der Glutaraldehyd durch Behandlung mit einem Reagenz, das eine Amingruppe hat, blockiert.
Die Glucosekonzentration kann wie folgt gemessen werden. In eine thermostatische Zelle wird ein Puffer gegeben und ein Vermittler wird zugegeben. Dann wird auf einer konstanten Temperatur gehalten. Als Vermittler kann Kaliumferricyanid, Phenazinmethosulfat usw. verwendet werden. Eine Elektrode, auf der das erfindungsgemäße Enzym immobilisiert ist, wird als Arbeitselektrode verwendet und es werden eine Gegenelektrode (z.B. Platinelektrode) und eine Referenzelektrode (Silber/Silberchlorid) verwendet. Nachdem an die Kohleelektrode eine konstante Spannung angelegt worden ist, um einen stationären Strom zu erhalten, wird eine Glucose enthaltende Probe zugegeben und der Stromanstieg wird gemessen. Die Glucosekonzentration in der Probe kann entsprechend einer Kalibrierkurve berechnet werden, die unter Verwendung von Glucoselösungen mit Standardkonzentrationen hergestellt wurde.
Der die erfindungsgemäße β-Untereinheit enthaltende GDH-Komplex kann als ein Bestandteil in einem Assay-Set für Saccharide wie Glucose verwendet werden. Typischerweise schließt das Set zusätzlich zum GDH-Komplex einen für das Assay nötigen Puffer, einen Vermittler, eine Standardlösung von z.B. Glucose zur Herstellung einer Kalibrierkurve und eine Bedienungsanleitung zur Verwendung des Sets ein. Das erfindungsgemäße Enzym kann in unterschiedlichen Formen, z.B. als gefriergetrocknetes Reagenz oder als Lösung in einer verwendbaren Vorratslösung zur Verfügung gestellt werden.
Beispiele
Im Folgenden wird die Erfindung in Bezug auf Beispiele genau beschrieben.
Vergleichsbeispiel 1: Isolieren des eine GDH-α-Untereinheit kodierenden Gens aus dem Burkhorderia cepacia KS1-Stamm
<1> Herstellen chromosomaler DNS aus dem Burkhorderia cepacia KS1-Stamm
Auf herkömmliche Weise wurde ein chromosomales Gen aus dem Burkhorderia cepacia KS1-Stamm hergestellt. Das heißt, der Bakterienstamm wurde bei 34°C unter Verwendung eines TL-Flüssigmediums (10 g Polypepton, 1 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 2 g KH₂PO₄, 5 g Glucose in 1 L, pH-Wert 7,2) geschüttelt. Die gewachsenen Zellen wurden mittels Zentrifugieren gewonnen. Die Zellen wurden in einer Lösung suspendiert, die 10 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% SDS und 100 μg/mL Proteinase K enthielt, und bei 50°C sechs Stunden lang behandelt. Dieses Gemisch wurde zum selben Volumen Phenol-Chloroform zugegeben und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, und dann wurde der Überstand durch Zentrifugieren gewonnen. Der Überstand wurde zu Natriumacetat gegeben, so dass die Endkonzentration 0,3 M betrug, und mit dem zweifachen Volumen Ethanol überschichtet, um in der Zwischenschicht chromosomale DNS auszufällen. Die DNS wurde mit einem Glasstab aufgenommen, mit 70% Ethanol gewaschen und in einer geeigneten Menge TE-Puffer gelöst, um eine Lösung chromosomaler DNS zu erhalten.
<2> Bestimmung der N-ständigen Aminosäuresequenz der GDH-α-Untereinheit
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 gereinigte GDH wurde mittels Gefriertrocknung aufkonzentriert und mittels SDS-Elektrophorese unter Verwendung von 12,5% Polyacrylamid aufgetrennt, um die α-Untereinheit zu isolieren. Die so erhaltene α-Untereinheit wurde auf eine Polyvinylidenfluoridmembran überführt und dann wurde unter Verwendung eines Aminosäuresequenzbestimmungsgerätes (PPSQ-10, hergestellt von der Shimadzu Corporation) die N-ständige Aminosäuresequenz bestimmt. Als Ergebnis wurde gefunden, dass das Enzym eine aus 11 Resten der Aminosäuren Nr. 2 bis 12 der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 bestehende Peptidsequenz enthielt.
<3> Klonieren eins die α-Untereinheit kodierenden Gens
Die in <1> hergestellte DNS (1 μg) wurde einem partiellen Abbau mit einem Restriktionsenzym Sau3Al, gefolgt von einer Behandlung mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase (CIAP), unterzogen. Getrennt davon wurde das Cosmid SuperCosl (bezogen von Stratagene), mit BamHI behandelt, und das DNS-Fragment, das durch den partiellen Abbau des aus dem α-15 Stamm stammenden chromosomalen DNS-Fragment mit Sau3AI erhalten wurde, wurde unter Verwendung von T4-DNS-Ligase in SuperCosl eingeführt. E. coli XL-1 Blue MR (bezogen von Stratagene) wurde mit der erhaltenen rekombinanten DNS transformiert. Basierend auf einer Neomycin- und Ampicillinresistenz, die antibiotische Resistenten auf SuperCosl sind, wurde auf einem LB-Agarmedium, das 10 μg/mL Neomycin und 25 μg/mL Ampicillin enthielt, ein Transformant selektiert. Der erhaltene Transformant wurde im flüssigen LB-Medium kultiviert. Diese Transformantenzellen wurden gewonnen und in einem Reagenz zur Messung der GDH-Aktivität suspendiert, und es wurde unter Verwendung der Dehydrogenaseaktivität für Glucose als Index ein Klon selektiert. Als Ergebnis wurde ein Glucosedehydrogenaseaktivität aufweisender Klon erhalten.
<4> Subklonbieren
Das Zielgen enthaltende DNS-Fragmente wurden vom in <3> erhaltenen Cosmid SuperCosl, das das die α-Untereinheit kodierende Gen enthielt, hergestellt. Die eingeführten Genfragmente wurden unter Verwendung des Restriktionsenzyms NotI abgespalten. Diese DNS-Fragmente wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI behandelt und in das mit XbaI abgebaute Plasmid pUC18 eingeführt. Der E. coli DH5 α-MCR-Stamm wurde mit dem jeweils das insertierte Fragment enthaltenden Plasmid pUC18 transformiert und Kulturen, die auf einem 50 μg/mL Ampicillin enthaltenden LB-Agarmedium erschienen, wurden gewonnen. Die erhaltenen Transformanten wurden im flüssigen LM-Medium kultiviert, gefolgt von der Untersuchung im Hinblick auf die GDH-Aktivität in den Zellen auf die selbe Weise wie in <3>.
Als Ergebnis wurde ein Transformant, der GDH-Aktivität aufwies, erhalten. Das Plasmid wurde aus diesem Transformanten extrahiert und das eingeführte DNS-Fragment wurde analysiert. Es wurde als Ergebnis ein Insert von etwa 8,8 kbp bestätigt. Dieses Plasmid wurde als pKS1 bezeichnet.
<5> Bestimmung der Nukleotidsequenz
Es wurde eine Restriktionsenzymanalyse des in pKS1 eingefügten DNS-Fragments durchgeführt und die Nukleotidsequenz des Fragments wurde entsprechend des konventionellen Verfahrens bestimmt. Als Ergebnis wurde die Sequenz der in <2> gefundenen DNS, die die N-ständige Aminosäuresequenz der α-Untereinheit kodiert, in diesem eingeführten DNS-Fragment bestätigt und es wurde ein diese Sequenz enthaltenes offenes Leseraster gefunden. Die bestimmte Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz, die durch diese Nukleotidsequenz kodiert sein kann, sind als SEQ ID Nr. 1 und 3 dargestellt. In der Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 1 kodiert die Nukleotidsequenz abwärts vom Nukleotid Nr. 2386 die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 4 und damit die β-Untereinheit.
Vergleichsbeispiel 2: Herstellung einer GDH-α-Untereinheit durch rekombinante E. coli
Nachdem die Nukleotidsequenz der α-Untereinheit bestimmt worden ist, wurde unter Verwendung des vorgenannten Strukturgens der α-Untereinheit ein Vektor hergestellt und unter Verwendung dieses Vektors wurde weiter ein Transformant hergestellt.
Zunächst wurde ein in den Vektor zu insertierendes Gen folgendermaßen hergestellt.
Die Anreicherung wurde mittels PCR durchgeführt, bei der ein vom KS1-Stamm stammendes Genomfragment als Templat verwendet wurde, so dass eine gewünschte Restriktionsenzymstelle eingeschlossen ist. Das folgende Paar Oligonukleotidprimer wurde bei der PCR verwendet.

(Vorwärts) 5'-CCCAAGCTTGGGCCGATACCGATACGCA-3' (SEQ ID Nr. 5)
(Rückwärts) 5'-GAGAAGCTTTCCGCACGGTCAGACTTCC-3' (SEQ ID Nr. 6)

Das durch PCR angereicherte Gen wurde mit dem Restriktionsenzym HindIII abgebaut und in den Expressionsvektor pFLAG-CTS (Sigma) an seiner Klonierungsstelle, der HindIII-Stelle eingeführt. Das erhaltene Plasmid wurde als pFLAG-CTS/α bezeichnet.
Der E. coli DH5αMCR-Stamm wurde mit dem vorgenannten Plasmid pFLAG-CTS/α transformiert und Kolonien, die auf 50 μg/mL Ampicillin enthaltendem LB-Agarmedium auftraten, wurden gewonnen.
Weiterhin wurde bei der Suche des offenen Leserasters des insertierten pKS1-Fragments der α-Untereinheit vorgelagert ein aus 507 Nukleotiden bestehendes Strukturgen, das ein Polypeptid kodiert, das 168 in SEQ ID Nr. 2 dargestellte Aminosäurereste kodiert (Nukleotide Nummer 258 bis 761 in SEQ ID Nr. 1), erstmals gefunden. Es wurde angenommen, dass dieses Strukturgen die γ-Untereinheit kodiert.
Nachdem gefunden worden ist, dass die Region, die die γ-Untereinheit kodiert, der die α-Untereinheit kodierenden Region vorgelagert war, wurde ein rekombinanter Vektor mit einer polycistronischen Struktur hergestellt, die kontinuierlich die γ-Untereinheit und die α-Untereinheit einschließt, und es wurde ein Transformant, in den dieser Vektor eingeführt worden war, konstruiert.
Zuerst wurde wie folgt ein in den Vektor einzuführendes Gen hergestellt.
Die Anreicherung erfolgte durch PCR unter Verwendung eines vom KS1-Stamm stammenden Genomfragments als Templat, das kontinuierlich das Strukturgen der γ-Untereinheit und der α-Untereinheit einschließt, so dass eine gewünschte Restriktionsenzymstelle eingeschlossen ist. Für die PCR wurde das folgende Paar Oligonukleotidprimer verwendet:

(Vorwärts) 5'-CATGCCATGGCACACAACGACAACACT-3' (SEQ ID Nr. 7)
(Rückwärts) 5'-CCCAAGCTTGGGTCAGACTTCCTTCTTCAGC-3' (SEQ ID Nr. 8)

Das 5'-Ende und das 3'-Ende des durch PCR angereicherten Gens wurden mit NcoI und HindIII, respektive, abgebaut und das Gen wurde in den Vektor pTrc99A (Pharmacia) an seiner Klonierungsstelle, der NcoI/HindIII-Stelle, insertiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pTrc99A/γ + α bezeichnet.
Der E. coli DH5αMCR-Stamm wurde mit dem vorgenannten Plasmid pTrc99A/γ + α transformiert und Kolonien, die auf 50 μg/mL Ampicillin enthaltendem LB-Agarmedium auftraten, wurden gewonnen.
Die α-Untereinheit wurde unter Verwendung des mit jedem der vorgenannten Plasmide pKS1, pFlag-CTS/α und pTrc99A/γ + α transformierten E. coli DH5αMCR-Stamm transformiert. Jeder Transformant wurde in 3 mL des 50 μg/mL Ampicillin enthaltenden LB-Mediums eingeimpft und 12 Stunden lang bei 37°C kultiviert, und die Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen. Die Zellen wurden mit einer französischen Presse aufgebrochen (1500 kgf) und eine Membranfraktion (1 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,0) wurde durch Ultrazentrifugieren (4°C, 160 400 × g, 90 Minuten) isoliert.
Vergleichsbeispiel 3: Nachweis der GDH-Aktivität
Zuerst gesagt wurde die GDH-Aktivität in jeder der vorgenannten Membranfraktionen bestätigt. Genauer wurde eine visuelle Bestimmung unter Verwendung von 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), der 594 μM Methylphenazinmethosulfat (mPMS) und 5,94 μM 2,6-Dichlorphenolinophenol (DCIP) enthielt, durchgeführt. Die Ergebnisse sind unten dargestellt. Die Anzahl an +-Zeichen stellt das Ausmaß des Farbwechsels von blau nach farblos dar.

Membranfraktion des kultivierten, mit pFLAG-CTS/α transformierten Transformanten: +
Membranfraktion des kultivierten, mit pKS1 transformierten Transformanten: ++
Membranfraktion des kultivierten, mit pTrc99A/γ + α transformierten Transformanten: +++

Die GDH-Aktivität der Membranfraktion des kultivierten, mit pFLAG-CTS/α transformierten Transformanten, der nur die α-Untereinheit enthielt, war am geringsten, und die GDH-Aktivität der Membranfraktion des kultivierten, mit pTrc99A/γ + α transformierten Transformanten, mit dem ein Vektor effektiv konstruiert worden war, war die höchste.
Obwohl die α-Untereinheit auch im Transformanten exprimiert wurde, der mit einem Vektor unter Verwendung von nur des Strukturgens der α-Untereinheit transformiert worden war, konnte die α-Untereinheit unter Verwendung eines Vektors, der das Strukturgen der γ-Untereinheit und das Strukturgen der α-Untereinheit in Kombinantion enthielt, effektiv erhalten werden.
Glucose wurde unter Verwendung der erfindungsgemäßen Glucosedehydrogenase untersucht. Die enzymatische Aktivität der erfindungsgemäßen Glucosedehydrogenase (α-Untereinheit) wurde unter Verwendung von Glucose in unterschiedlichen Konzentrationen gemessen. Die GDH-Aktivität wurde in 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) gemessen, der 594 μM Methylphenazinmethosulfat (mPMS) und 5,94 μM 2,6-Dichlorphenolinophenol (DCIP) enthielt. Eine Enzymprobe und als Substrat dienende Glucose wurden zugegeben, gefolgt von Inkubation bei 37°C, und die Änderung der Absorption von DCIP bei 600 nm wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers beobachtet. Die Rate der Verringerung der Absorption wurde als enzymatische Reaktionsrate gemessen. Glucose konnte im Bereich von 0,01 bis 1,0 mM unter Verwendung der erfindungsgemäßen GDH quantifiziert werden.
Beispiel 1: Isolierung des eine GDH-β-Untereinheit kodierenden Gens des Burkhorderia cepacia KS1-Stammes
<1> Suche nach der GDH-β-Untereinheit des Burkhorderia cepacia KS1-Stammes
Das vom KS1-Stamm stammende GDH-β-Untereinheit-Gen wurde unter Verwendung der Burkhorderia cepacia J2315-Stamm Genomdatenbank des Sanger Centers (http://www.sanger.ac.uk/) gesucht. Mit Bezug auf eine bekannte N-ständige Sequenz der GDH-β-Untereinheit des KS1-Stammes (SEQ ID Nr. 9) wurde eine Aminosäuresequenz gebildet (SEQ ID Nr. 10), die große Homologie zu allen Cytochrom c-Untereinheiten von von Acetobacter Sp. oder Gluconobacter Sp. stammender Alkoholdehydrogenase (Tamaki T. et al.: Biochim Biophys Acta 1088 (2): 292-300 (1991), Matsushita K. et al.: Biosci. Biotech. Biochem., 56, 304-310 (1992), Takemura H. et al.: J. Bacteriol, 175, 6857-66 (1993), Kondo K. et al.: Appl. Environ. Microbiol, 63, 1131-8 (1997)), von Erwinia sp. oder Pseudomonas sp. stammender Gluconatdehydrogenase (Yum D.Y. et al.: J. Bacteriol. 179, 6566-72 (1997), Matsushita K. et al.: J. Biochem. 85, 1173-81(1979)), von Gluconobacter sp. stammender Sorbitoldehydrogenase (Choi E. S. et al.: FEMS Microbiol. Lett., 125, 45-50 (1995)); und von Erwinia sp. oder Pantoea sp. stammender 2-Ketogluconatdehydrogenase (Pujol C.J. et al.: J. Bacteriol., 182, 2230-7 (2000)) hat.
Auf der Grundlage der vorgenannten Aminosäuresequenz wurden Gensequenzen, die Aminosäuresequenzen mit großer Homologie kodieren, mit BLAST aus der vorgenannten Datenbank des Burkhorderia cepacia J2315-Stammes ausgesucht. Dann wurden die erhaltenen fünf Sequenzen im Hinblick auf Homologie mit der C-ständigen Sequenz der GDH-α-Untereinheit des KS1-Stammes untersucht. Als Ergebnis zeigten von zwei Genfragmenten übertragene Aminosäuresequenzen große Homologien (> 90%). Jedes Genfragment war kurz und hatte nur 200 bis 500 Basenpaare, so dass Sequenzen mit großen Homologien mit diesen Sequenzen mit BLAST aus der vorgenannten Genomdatenbank des Burkhorderia cepacia J2315-Stammes ausgesucht wurden, und die Sequenzen wurden miteinander vereint. Als Ergebnis wurde ein Fragment mit 3110 Basenpaaren erhalten. In der erhaltenen Sequenz existierte ein ORF (open reading frame = offenes Leseraster), von dem angenommen wird, dass es das C-Ende der GDH darstellt, und ein ORF, von dem angenommen wird, dass es das 1275 Basenpaare lange Cytochrom c-Strukturgen (SEQ ID Nr. 11) ist. Die vom ORF kodierte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID Nr. 12 dargestellt. Ergebnisse des Vergleichs zwischen der vom J2315-Stamm erhaltenen Nukleotidsequenz und der Nukleotidsequenz der α-Untereinheit des KS1-Stammes, die bereits geklont worden ist, zeigen, dass in der Unterseite der α-Untereinheit die Nukleotidsequenz mit einer großen Homologie zur Nukleotidsequenz des J2315 Stammes, die das Signalpeptid von Cytochrom c kodiert, enthalten ist.
Aus dem Vorherigen ist anzunehmen, dass das dritte ORF im geklonten Fragment des Burkhorderia cepacia KS1-Stamms, das im Vergleichsbeispiel 1 erhalten wurde (Nukleotide 2386 und die Sequenz von SEQ ID Nr. 1) die β-Untereinheit kodiert. Die Aminosäuresequenz am N-Ende der aufgereinigten β-Untereinheit entspricht den 5 Aminosäureresten, die durch die aus den Nukleotiden 2452 bis 2466 der SEQ ID Nr. 1 bestehenden Sequenz translatiert wird, was auch nahe legt, dass das oben genannte ORF die β-Untereinheit kodiert.
<2> Anreicherung des Strukturgens der β-Untereinheit unter Verwendung des inversen PCR-Verfahrens
(1) Kultivierung der Mikroorganismenzellen und Extraktion des Genoms
Unter Verwendung von 5 mL Komplettmedium (0,5% Polypepton, 0,3% Hefeextrakt, 0,5% NaCl) wurde der KS1-Stamm unter Schütteln über Nacht kultiviert. Das Genom wurde aus den erhaltenen Mikroorganismenzellen unter Verwendung von GenomicPrep^TM-Zellen und dem Gewebe-DNS-Isolierset (Amersham Pharmacia Biotech) extrahiert. Das Verfahren wurde entsprechend der beigefügten Bedienungsanleitung durchgeführt. Das erhaltene Genom wurde einer Behandlung mit Phenol/Chloroform unterzogen und mit Ethanol ausgefällt und dann in gereinigtem Wasser gelöst.
(2) Zyklisierung des Genomfragments
Das vom KS1-Stamm extrahierte Genomfragment wurde mit BamHI, EcoRI, HindIII, SmaI, SacI und XhoI abgebaut und die Genomfragmente wurden durch Ausfällen mit Ethanol gewonnen. Dann wurde 1 μg des mit den Restriktionsenzymen abgebauten Genoms unter Verwendung eines DNS-Legierungs-Sets (Takara Shuzo Co., Ltd) über Nacht bei 16°C einer Legierungsreaktion unterzogen.
(3) PCR
50 pmol Vorwärtsprimer (EF1 SEQ ID Nr. 13), der basierend auf der Nukleotidsequenz in der N-ständigen Signalsequenzregion der GDH-β-Untereinheit des KS1-Stammes gebildet worden war, 50 pmol Reversprimer (ER1 SEQ ID Nr. 14) (alle Primer wurden im Auftrag von Invitrogen synthetisiert), 0,5 mL LATaq (Takara Bio Co., Ltd), 8 μL dNTP-Lösung und 5 μL 10 × PCR-Puffer wurden zu gereinigtem Wasser gegeben, so dass sich ein Gesamtvolumen von 50 μL ergab, und unter Verwendung eines Programm-Temperatur-Steuerungssystem PC-801 (ASTEC) wurde PCR durchgeführt. Die PCR-Reaktion wurde unter der folgenden Bedingungen durchgeführt: nach 30 Zyklen von 5 Minuten bei 94°C, 20 Sekunden bei 98°C, 30 Sekunden bei 62°C, 6 Minuten bei 72°C und 10 Minuten bei 72°C. Wenn das mit einem Restriktionsenzym (SmaI) abgebaute Genom als Templat verwendet wird, wurde ein Fragment mit einer Größe von etwa 2,1 kbp durch Agarose-Elektrophorese bestätigt.
<3> Sequenzierung des durch PCR angereicherten Fragments
(1) TA-Klonierung
Nachdem das vorgenannte Produkt der inversen PCR einer Elektrophorese auf Agarosegel unterzogen worden war, wurde die Bande ausgeschnitten und unter Verwendung eines Gene clean II-Sets (Bio101 inc.) gereinigt. Das Fragment wurde unter Verwendung der pGEMR-T und pGEMR-T EASY Vektor Systeme (Promega) an einen pGEM-T-Vektor legiert. Mit dem legierten Vektor wurde E. coli DH5α transformiert und der Transformant wurde über Nacht auf einem L-Agarmedium kultiviert, das 50 μg/mL Ampicillin, 40 μg/mL X-Gal und 0,1 μg/mL IPTG enthielt. A
Aus den aufgetrennten Kulturen wurden weiße Kolonien selektiert und in einem L-Medium, das 50 μg/mL Ampicillin enthielt, über Nacht kultiviert, gefolgt von der Extraktion von Plasmiden aus den Zellen mittels des Alkali-Verfahrens.
(2) Herstellung einer Sequenzprobe
Das erhaltene Plasmid wurde mit RNase behandelt und es wurde 0,6 Volumen 20% PEG6000/2,5 M NaCl zugegeben. Man ließ das Gemisch eine Stunde lang auf Eis stehen. Danach wurde das Gemisch 15 Minuten lang bei 15 000 Upmin und 4°C zentrifugiert, um einen Niederschlag zu erhalten. Der Niederschlag wurde mit 70% Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde in gereinigtem Wasser gelöst.
(3) Analyse der Nukleotidsequenz der DNS
Die Nukleotidsequenz des insertierten Fragments des in (2) erhaltenen Plasmids wurde unter Verwendung eines ABI PRISM^TM 310 Genetic Analysers (PERKIN-ELMER Applied Biosystems) analysiert. Ein Bereich der Sequenz des insertierten Fragments wurde unter Verwendung von M13-Primer aus der Multiklonierungsstelle des Vektors bestimmt. Als Ergebnis wurde die das N-Ende der β-Untereinheit enthaltende Nukleotidsequenz, die bereits analysiert worden war, bestätigt. Basierend auf dieser Sequenz wurden nacheinander Primer hergestellt und zur Bestimmung der Nukleotidsequenz des insertierten Fragments verwendet. Das Ergebnis ist in SEQ ID Nr. 15 dargestellt. Weiterhin ist die durch das ORF in der Nukleotidsequenz kodierte Aminosäuresequenz in SEQ ID Nr. 16 dargestellt.
Die β-Untereinheit hat insgesamt 425 Aminosäurereste, und durch den Vergleich mit der bereits erhaltenen N-ständigen Aminosäuresequenz werden 22 Reste unter ihnen als Signalpeptid betrachtet. Das Molekülgewicht der β-Untereinheit, berechnet basierend auf der Aminosäuresequenz, beträgt 45 275 Da und das Molekülgewicht von 42 731 Da des Bereichs ohne das Signalpeptid ist im Wesentlichen identisch zum Molekülgewicht von 43 kDa der GDH-β-Untereinheit des KS1-Stammes. In der Aminosäuresequenz der β-Untereinheit wurden an 3 Stellen Vernetzungsmotive (SEQ ID Nr. 17) nachgewiesen, die mit Häm in Cytochrom c vernetzen. Die ORFs befanden sich direkt in Folge des ORF des Strukturgens der α-Untereinheit und eine Sequenz, von der angenommen wird, dass sie eine SD-Sequenz ist, existierte dem Initiierungs-Codon vorgelagert.
Eine Homologiesuche für die erhaltene Aminosäuresequenz mittels BLAST zeigte insgesamt große Homologien: eine 65% Homologie mit der Cytochrom c-Untereinheit von Oxidoreductasedehydrogenase von Ralstonia solanacearum, eine 48% Homologie mit einer Cytochrom c-Untereinheit von Sorbitoldehydrogenase von Gluconobacter oxydans, eine 44% Homologie mit einer Cytochrom c-Untereinheit von Gluconsäuredehydrogenase von Erwinia cypripedii und eine 46,4% Homologie bei den Aminosäuren mit einer Cytochrom c-Untereinheit von 2-Ketogluconsäuredehydrogenase von Pantoea citrea. Weiterhin waren in den Aminosäuresequenzen der unterschiedlichen Cytochrom C Häm-verknüpfende Motive konserviert (SEQ ID Nr. 18).
Das Strukturgen der GDH-β-Untereinheit des KS1-Stammes hat eine Homologie von 92% im Bereich der Nukleotidsequenz und 92,2% im Bereich der Aminosäuresequenz mit dem Strukturgen der GDH-β-Untereinheit des J2315-Stammes.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt die GDH-β-Untereinheit eines zur Art der Burkhorderia gehörenden Mikroorganismus und die sie kodierende DNS zur Verfügung.
Sequenzliste

Claims

DNS, die ein durch (A) oder (B) definiertes Protein kodiert: (A) Protein, das mindestens die aus den Aminosäuren 23 bis 425 bestehende Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 16 umfasst; (B) Protein, das mindestens die aus den Aminosäuren 23 bis 425 bestehende Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 16 einschließlich Substitution, Deletion, Insertion oder Addition von einem bis 20 Aminosäureresten umfasst.
DNS nach Anspruch 1, wobei die DNS durch (a) oder (b) definiert ist: (a) DNS, die eine Nukleotidsequenz, die aus den Nukleotiden 187 bis 1398 der SEQ ID Nr. 15 besteht, einschließt; (b) DNS, die mit der aus den Nukleotiden 187 bis 1398 der SEQ ID Nr. 15 bestehenden DNS unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist.
DNS nach Anspruch 2, die darüber hinaus eine aus den Nukleotiden 121 bis 187 der SEQ ID Nr. 15 bestehende Nukleotidsequenz umfasst.
Rekombinanter Vektor, der die DNS nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.
Transformant, der mit der DNS nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder dem rekombinanten Vektor nach Anspruch 4 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer Glucosedehydrogenase-β-Untereinheit, das das Kultivieren des Transformanten nach Anspruch 5 zur Herstellung einer Glucosedehydrogenase-β-Untereinheit als Expressionsprodukt der DNS und das Gewinnen der hergestellten β-Untereinheit umfasst.
DNS nach Anspruch 2 oder 3, die weiterhin eine Nukleotidsequenz umfasst, die eine α-Untereinheit und eine γ-Untereinheit von Burkhorderia cepacia kodiert.
Rekombinanter Vektor, der die DNS nach Anspruch 7 umfasst.
Transformant, der mit der DNS nach Anspruch 7 oder dem rekombinanten Vektor nach Anspruch 8 transformiert worden ist.
Verfahren zur Herstellung eines Glucosedehydrogenasekomplexes, das das Kultivieren eines Transformanten nach Anspruch 9 zur Herstellung eines Glucosedehydrogenasekomplexes als Expressionsprodukt der DNS und Gewinnen des hergestellten Komplexes umfasst.