DE60315863T2

DE60315863T2 - A3ar als ein marker für einen erkrankungszustand

Info

Publication number: DE60315863T2
Application number: DE60315863T
Authority: DE
Inventors: Pnina Fishman; Lea Madi; Sara Bar Yehuda
Original assignee: Can Fite Biopharma Ltd
Current assignee: Can Fite Biopharma Ltd
Priority date: 2002-10-22
Filing date: 2003-10-21
Publication date: 2008-05-15
Anticipated expiration: 2023-10-22
Also published as: WO2004038419A1; JP2006503574A; US20040137477A1; EP1554583A1; ATE371191T1; AU2003274648A1; DE60315863D1; EP1554583B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnose und insbesondere biologische, mit Erkrankungszuständen assoziierte Marker, die für die Diagnose verwendet werden.
STAND DER TECHNIK
Nachstehend findet sich eine Liste von bekanntem Stand der Technik, der als einschlägig erachtet wird, den Stand der Technik auf dem Gebiet der Erfindung zu beschreiben. Würdigung dieser Literaturstellen erfolgt hierin durch Angabe der Nummer aus ihrer nachstehenden Liste in Klammern.

(1) Olah M.E. und Stiles G.L., The role of receptor structure in determining adenosine receptor activity, Pharmacol. There., 85:55–75 (2000);
(2) Poulsen S.A. und Quinn R.J., Adenosine receptors: new opportunities for future drugs, Bioorg. Med. Chem., 6:619–641 (1998);
(3) Fang X. et al., Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3 by protein kinase A, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:11960–11965 (2000);
(4) Fishman P. et al., Involvement of Wnt Signaling Pathway in IB-MECA Mediated Suppression of Melanoma Cells, Oncogene, 21:4060–4064 (2002);
(5) Ferkey D.M. und Kimelman D., GSK-3: New Thoughts an an Old Enzyme, Dev. Biol., 225:471–479 (2000);
(6) Bonvini P. et al., Nuclear beta-catenin displays GSK-3beta- and APC-independent proteasome sensivity in melanoma cells, Biochim. Biophys. Acta, 1495:308–318 (2000);
(7) Olah M.E. und Stiles G.L., The role of receptor structure in determining adenosine receptor activity, Pharmacol. Ther., 85:55–75 (2000).

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
A₃-Adenosin-Rezeptoren gehören der Familie der Gi-Proteinassoziierten Zelloberflächenrezeptoren an. Rezeptoraktivierung führt zu dessen Internalisierung und der nachfolgenden Inhibition der Aktivität von Adenylatcyclase, cAMP-Bildung und Expression von Proteinkinase A (PKA) was in der Initiierung verschiedener Signalwege resultiert ^(1,2). PKA enthält eine katalytische Untereinheit PKAc, welche nach Aktivierung mit cAMP vom Elternmolekül dissoziiert. Neuere Studien haben gezeigt, dass PKAc GSK-3β phosphoryliert und inaktiviert ⁽³⁾.
Vor kurzem wurde gezeigt, dass 1-Desoxy-1-[6[[(3-iodphenyl)methyl]amino]-9H-purin-9-yl]-N-methyl-β-Dribofura-nuronamid (IB-MECA), ein stabiler Agonist von A3AR, die Expression von GSK-3β und β-Catenin, Schlüsselkomponenten des Wnt-Signalwegs, verändert. Infolgedessen führt es zu einer Inhibition der Expression der Zellzyklusprogressionsgene c-myc und cyclin D1 ⁽⁴⁾.
Fishman et al. (2002), Anticancer Drugs 13:437–443, berichten, dass Targeting des A₃-Adenosin-Rezeptors durch Adenosin oder einen synthetischen Agonisten dieses Rezeptors (IB-MECA und Cl-IB-MECA) in einer differentiellen Wirkung auf Tumorzellen und auf normale Zellen resultiert.
Madi et al. (2001), Abstract from Purines 72, berichten, dass hohe Expression von A3AR in Melanom- und Kolonkarzinomzelllinien ein Target für Wachstumsinhibition von Tumorzellen definiert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, dass es in Krebszellen eine Erhöhung des Niveaus der Expression des A₃-Adenosin-Rezeptors gibt, im Vergleich zu nicht-krebsartigen Zellen, die beispielsweise von dem gleichen Patienten erhalten wurden, aus dem die Krebszellen erhalten wurden. Dieser Befund ebnet den Weg für die Verwendung des Expressionsniveaus des A₃-Adenosin-Rezeptors als ein Mittel für die Diagnose eines Erkrankungszustandes.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem ihrer Aspekte ein Verfahren zur Detektierung eines Erkrankungszustandes, bestehend aus einem Krebs oder einem Tumor, in einem Patienten, umfassend:

(a) Erhalten einer Probe von Zellen, die im Verdacht stehen, in einem Erkrankungszustand zu sein, aus dem Patienten;
(b) Detektieren des Expressionsniveaus des A₃-Adenosin-Rezeptors (A3AR) in der Probe von Zellen; und
(c) Vergleichen des Niveaus der A3AR-Expression in den Zellen mit einem Kontrollniveau, welches das Niveau der A3AR-Expression in normalen Zellen des Patienten ist, wobei die normalen Zellen zu demselben Gewebe wie die Probe von Zellen gehören; wobei ein Unterschied im Niveau zwischen der Kontrolle und der Probe von Zellen ein Anzeichen für den Erkrankungszustand darstellt.

Obwohl das vorstehende Verfahren qualitativ oder binär ist, d.h. es zeigt an, ob die Person die Erkrankung hat oder nicht, kann das Verfahren in manchen Fällen auch in einer quantitativen Weise verwendet werden, um in einem Patienten, bei dem die Erkrankung bereits diagnostiziert worden ist, die Schwere des Erkrankungszustandes zu bestimmen, d.h. je größer der Unterschied zwischen dem Expressionsniveau des A₃-Adenosin-Rezeptors in der Probe von Zellen, die im dem Verdacht stehen, in einem Erkrankungszustand zu sein, und dem Kontrollniveau der A3AR-Expression (was das Expressionsniveau in normalen Zellen, oder die Standardreferenzexpression ist), umso schwerwiegender ist die Erkrankung.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem weiteren Aspekt ein Verfahren zum Bestimmen der Schwere eines Erkrankungszustandes in einem Patienten, umfassend:

(a) Erhalten einer Probe von Zellen, die im Verdacht stehen, in einem Erkrankungszustand zu sein, aus dem Patienten;
(b) Detektieren des Expressionsniveaus des A₃-Adenosin-Rezeptors (A3AR) in der Probe von Zellen; und
(c) Vergleichen des Niveaus der A3AR-Expression in den Zellen mit einer vorbestimmten Kalibrierungskurve des Niveaus von A3AR, wobei die Werte der Kalibrierungskurve in Korrelation zu der Schwere des Erkrankungszustandes stehen, wodurch die Schwere des Erkrankungszustandes des Patienten bestimmt wird.

In einem nochmals weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Bestimmung des A3AR-Expressionsniveaus, um zu testen und um vorherzusagen, ob ein Patient für eine therapeutische Behandlung mit A3AR-Modulatoren, welche A3AR-Agonisten und A3AR-Antagonisten, typischerweise A3AR-Agonisten sind, geeignet ist. Ein Beispiel einer derartigen Behandlung ist die Verabreichung eines A3AR-Agonisten wie etwa IB-MECA oder Cl-IB-MECA für die Behandlung von Krebs oder entzündlichen Erkrankungen.
Wenn es gewünscht ist, im voraus vorherzusagen, welche Patienten eine bessere Chance haben, auf eine Behandlung mit A3AR-Modulatoren, insbesondere A3AR-Agonisten, anzusprechen, ist es möglich, das vorstehende Verfahren dazu zu verwenden, um zu bestimmen, ob die Zellen, die im Verdacht stehen, in einem Erkrankungszustand zu sein, A3AR in einem von der Kontrolle signifikant verschiedenen Niveau exprimieren. Im Falle einer bejahenden Antwort kann vorhergesagt werden, dass der Patient eine höhere Wahrscheinlichkeit hat, auf eine Behandlung mit einem A3AR-Modulator, insbesondere einem A3AR-Agonist, anzusprechen.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, um zu bestimmen ob erwartet werden kann, dass ein Patient auf eine therapeutische Behandlung eines Erkrankungszustandes, bestehend aus einem Krebs oder einem Tumor, durch die Verabreichung eines A3AR-Agonisten anspricht, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Erhalten einer Probe von Zellen, welche mit dem Erkrankungszustand assoziiert sind, von dem Patienten;
(b) Detektieren des Expressionsniveaus des A₃-Adenosin-Rezeptors (A3AR) in der Probe; und
(c) Vergleichen des Niveaus der A3AR-Expression in den Zellen mit einem Kontrollniveau, wobei das Kontrollniveau das Niveau der A3AR-Expression in normalen Zellen des Patienten ist, wobei die normalen Zellen zu demselben Gewebe wie die Probe von Zellen gehören; wobei ein Unterschied zwischen dem Kontrollniveau und dem Niveau der Probe von Zellen ein Anzeichen dafür ist, dass der Patient eine hohe Wahrscheinlichkeit aufweist, auf eine therapeutische Behandlung durch die Verabreichung von A3AR-Agonisten anzusprechen.

Der Begriff "Erkrankungszustand", wie hierin verwendet, bezeichnet einen beliebigen Erkrankungszustand, bei dem bekannt ist oder experimentell herausgefunden wird, dass die A3AR-assoziierten Signaltransduktionswege involviert sind. Erfindungsgemäß können derartige Erkrankungen mit einer abnormalen und unerwünschten Zellproliferationsrate assoziiert sein, so dass die Behandlung der Erkrankung eine Modulierung (entweder eine Erhöhung oder eine Verringerung) des Zellzyklus erfordert. Proliferative Erkrankungen, welche durch exzessive Proliferation gekennzeichnet sind, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, alle Typen von Krebs und insbesondere alle Typen von festen Tumoren, proliferative Hauterkrankungen, und Erkrankungen, die durch exzessive Bildung von Blutgefässen gekennzeichnet sind, wie etwa Restinose. Degenerative Erkrankungen, welche durch unerwünschten Zelltod gekennzeichnet sind, umfassen neurodegenerative oder neurotraumatische Erkrankungen; wie etwa Alzheimer-Krankheit, Stirnlappendegeneration, Argyrophilic Grain Disease oder subakute sklerosierende Panencephalitis; neurotraumatische Erkrankungen, wie etwa Akut-Schlaganfall, Schizophrenie, oder manische Depression; Autoimmunerkrankungen, umfassend rheumatoide Arthritis (RA), Morbus Crohn (CD) und multiple Sklerose (MS); nicht-Insulin-abhängigen Diabetes mellitus (Insulindiabetes Typ II), und andere.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Erkrankung ein Tumor, bevorzugt ein fester Tumor.
Der Begriff "feste Tumoren" bezeichnet Karzinome, Sarkome, Adenome und Krebsarten neuronalen Ursprungs, und in der Tat jeden Typ von Krebs, der seinen Ursprung nicht in hämatopoetischen Zellen hat, und er bezieht sich insbesondere auf: Karzinom, Sarkom, Adenom, hepatozelluläres Karzinom, hepatozelluläres Karzinom, Hepatoblastom, Rhabdomyosarkom, Speiseröhrenkarzinom, Schilddrüsenkarzinom, Ganglioblastom, Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, osteogenes Sarkom, Chordom, Angiosarkom, Endotheliosarkom, Lymphangiosarkom, Synoviom, Ewing-Tumor, Leiomyosarkom, Rhabdotheliosarkom, Kolonkarzinom, Speicheldrüsenkrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Schuppenzellkarzinom, Basal zellkarzinom, Adenokarzinom, Nierenzellkarzinom, Hämatom, Gallengangskarzinom, Melanom, Choriokarzinom, Seminom, Embryonalkarzinom, Wilms-Tumor, Gebärmutterhalskrebs, Hodentumor, Lungenkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, Blasenkarzinom, Epithelkarzinom, Gliom, Astrozytom, Medulloblastom, Craniopharyngiom, Ependynom, Pinealom, Retinoblastom, multiples Myelom, Rektalkarzinom, Schilddrüsenkrebs, Kopf- und Nackenkrebs, Gehirnkrebs, Krebs des peripheren Nervensystems, Krebs des zentralen Nervensystems, Neuroblastom, Endometriumkrebs, sowie Metastasen von allen der vorstehenden. Es wurde gemäß der Erfindung gezeigt, dass eine erhöhte Expression von A3AR nicht nur am Ort des Primärtumors sondern auch in Metastasen davon gefunden werden kann.
Der Begriff "Zellen, die im Verdacht stehen, in einem Erkrankungszustand zu sein", bezeichnet Zellen, Gewebeproben oder Zellkomponenten (wie etwa zelluläre Membranen oder zelluläre Komponenten), welche im Verdacht stehen, die Erkrankung zu manifestieren. Wenn die Erkrankung beispielsweise Krebs vom Typ X ist, sind die Zellen die Zellen des Krebsgewebes (Brust, Kolon, Haut, Leber, Lungen, Zellen, etc.), die im Verdacht stehen, transformiert zu sein. Wenn die Erkrankung Krebs ist, können die Zellen, die im Verdacht stehen, transformiert zu sein, durch bekannte Methoden zum Erhalten von "verdächtigen" Zellen erhalten werden, wie etwa Biopsie, Nadelbiopsie, etc. Der Verdacht auf einen Erkrankungszustand kann durch verschiedene abbildende (NMR, MR, Abtasten (scanning), Ultraschall, Memograph), pathologische oder histologische Techniken erhoben werden.
Wenn die Erkrankung beispielsweise Psoriasis ist, sind die Zellen Hautzellen. Wenn in einem anderen Beispiel die Erkrankung eine Autoimmunerkrankung ist, können die Zellen Zellen des Immunsystems oder von durch das Immunsystem angegriffenem Gewebe sein (Synovium bei RA, Nervenzellen bei MS, etc.), etc.
Die Zellen können erhalten werden durch in der Technik gut bekannte Mittel, wie beispielsweise etwa durch Blutabnahme, Gewebebiopsie, Nadelbiopsie, Gewebeaspiration, etc.
Der Begriff "A3AR" bezeichnet den Adenosin-A3-Rezeptor (Protein) und ein Fragment davon, welches beispielsweise ein auf der externen Oberfläche der Zelle vorhandenes extrazelluläres Fragment sein kann, sowie mRNA des A3AR-Rezeptors oder ein Fragment der mRNA.
Der Begriff "Detektieren des A3AR-Niveaus in den Zellen" bezeichnet jede in der Technik bekannte Technik um die Gegenwart eines Proteins, oder eines Fragments eines Proteins, in Zellen zu detektieren, entweder im Zytosol, der Membran, oder in jeder intrazellulären Komponente der Zellen, sowie Techniken zur Detektion von mRNA-Niveaus (umfassend Fragmente der Volllängen-mRNA) in jeder Komponente der Zellen.
Methoden zur Detektion des Proteinniveaus können umfassen: Extrahieren des Proteingehalts der Zellen, oder Extrahieren von Proteinfragmenten aus den Membranen der Zellen oder aus dem Zytosol, beispielsweise unter Verwendung herkömmlicher Lyse- Verdau-, Auftrennungs-, Fraktionierungs- und Reinigungstechniken, und Auftrennen des Proteingehalts der Zellen (entweder des Rohgehalts oder des gereinigten Gehalts) auf einem Western Blot, und danach Detektieren der Gegenwart des A3AR-Proteins oder von A3AR-Proteinfragment mittels verschiedener, in der Technik bekannter Identifizierungstechniken. Die auf einem Gel aufgetrennten Gehalte können beispielsweise unter Verwendung geeigneter Molekulargewichtsmarker zusammen mit einer Technik zur Identifizierung von Proteinen, oder unter Verwendung geeigneter Detektionsgruppen (wie etwa markierte Antikörper, markierte Lecithine, markierte Agonisten oder Antagonisten des A3AR-Rezeptors), gebunden an eine markierte Gruppe, identifiziert werden. Die Detektion kann auch durch in situ-Bindung von spezifischen Erkennungssubstanzen für A3AR erfolgen, entweder wenn "auf den Zellen", in situ, vorhanden oder wenn auf Zellen in dem Gewebe vorhanden, und derartige Substanzen können markierte A3AR-Agonisten wie etwa markiertes IB-MECA sein, markierte A3AR-Antagonisten MG132, Antikörper gegen A3AR, wie etwa die in den detaillierten Beispielen genannten, etc., und danach Detektieren der Gegenwart der Erkennungsgruppen unter Verwendung von Techniken, die für die Natur des Markers geeignet sind.
Wenn die Erkennungssubstanzen Fluoreszenz-markiert sind, kann die Detektion ausgeführt werden unter Verwendung eines confokalen Mikroskops und direktes Ansehen des Niveaus an markierten, an den Rezeptor gebundenen Gruppen. Wenn die Erkennungssubstanzen radioaktiv markiert sind, kann das Niveau bestimmt werden durch die Bestimmung des Niveaus an radioaktiver Markierung in den Zellen.
Die Bestimmung des A3AR-Expressionsniveaus kann auch die Bestimmung des mRNA-Niveaus (oder eines Fragments der Volllängen-mRNA) umfassen. Beispielsweise kann die Detektion durch beliebige Methoden erfolgen, die in der Technik für die Detektion von RNA in einer Zellenenthaltenden Probe verwendet werden, wie etwa durch die Verwendung von in situ Hybridisierung mit einer detektierbaren Sonde, beispielsweise mit einer komplementären Sequenz, die eine detektierbare Gruppe (fluoreszierende, radioaktive, chromatophore Gruppe, etc.) enthält. Bei einer derartigen in situ Hybridisierung ist es nicht erforderlich, die RNA aus den Zellen zu extrahieren, und alles was notwendig ist, ist eine Behandlung um die Zellen porös zu machen. Verschiedene Amplifikationsmethoden, die empfindlich genug sind um geringste Mengen an RNA zu detektieren, sind jedoch bevorzugt. Derartige Methoden umfassen PCR, RT-PCR, in situ PCR, in situ RT-PCR (alle der vorstehenden beziehen sich auch auf "geschachtelte" (nested) PCR und geschachtelte RT-PCR), LCR (Ligase-Kettenreaktion) und 3SR (self sustained sequence replication, selbsterhaltende Sequenzreplikation). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden RT-PCR und geschachtelte RT-PCR verwendet. Die Amplifikationsprodukte werden identifiziert durch Methoden, die in der Technik verwendet werden, wie etwa durch Auftrennen auf einem Gel und Detektion unter Verwendung einer geeigneten markierten Sonde.
Die Probe kann Zellmembranen, aus Zellmembranen extrahierte Proteine, ganze Zellen, Zytosolinhalte von Zellen, von einem Patienten erhaltene Gewebeproben, umfassend in Paraffin eingebettete Gewebeproben, aus dem Zytosol erhaltene Proteine, oder aus dem Kern oder dem Zytosol erhaltene mRNA sein.
Das A3AR-Expressionsniveau in den Zellen, die in einem Erkrankungszustand sind, sollte mit dem Kontrollexpressionsniveau verglichen werden. Dieses Kontrollniveau kann definiert werden als das Niveau des gleichen Moleküls (z.B. Protein, Proteinfragment), erhalten aus der gleichen zellulären Komponente in nicht-erkrankten Zellen, erhalten von dem gleichen Patienten, bevorzugt aus dem gleichen Gewebe, aus dem die Zellen, die im Verdacht stehen, in einem Erkrankungszustand zu sein, erhalten wurden. Wenn beispielsweise die erkrankten Zellen Brustkrebszellen sind, die aus einem unter Tumorverdacht stehenden Ort erhalten wurden (unter Verdacht beispielsweise aufgrund von abbildenden Techniken), kann die Kontrolle das A3AR-Expressionsniveau in Brustzellen sein, die von einem vom Tumorort verschiedenen Ort erhalten wurden, bevorzugt von Zellen, die benachbart zum Tumorort erhalten wurden. Alternativ kann das A3AR-Kontrollniveau von einer normalen Kontrolle erhalten werden, beispielsweise durch Bestimmung des A3AR-Expressionsniveaus in einem Zellpool (des gleichen Typs wie die erkrankten Zellen), erhalten aus mehreren normalen Personen.
Der Begriff "ein Unterschied im Niveau" kann jeden statistisch signifikanten Unterschied bezeichnen. Alternativ kann ein "Schwellenwertunterschied" bestimmt werden, durch Bestimmen des Unterschieds zwischen dem mittleren Niveau in mehreren diagnostizierten erkrankten Proben und dem mittleren Niveau in mehreren diagnostizierten nicht erkrankten Kontrollproben. Ein Unterschied, der größer ist als der Schwellenwertunterschied, wird als ein "Unterschied im Niveau" zwischen Behandlung und Kontrolle angesehen, und ein Unterschied, der kleiner ist als der Schwellenwertunterschied, wird nicht als ein "Unterschied im Niveau" angesehen.
Erfindungsgemäß stellt jeder Unterschied (statistisch signifikant, oder unter Verwendung eines Schwellenwertunterschieds wie vorstehend beschrieben) zwischen dem A3AR-Expressionsniveau in den Zellen, die im Verdacht stehen, erkrankt zu sein, im Vergleich zu Kontrollzellen (entweder nicht erkrankte, aus dem gleichen Patienten erhaltene Zellen, oder von gesunden Standardkontrollen) ein Anzeichen für die Existenz des Erkrankungszustandes dar. Typischerweise ist erfindungsgemäß eine Erhöhung des A3AR-Niveaus, im Vergleich zur Kontrolle, ein Anzeichen für das Vorhandensein einer proliferativen Erkrankung wie etwa Krebs, anderen proliferativen Erkrankungen wie etwa Psoriasis, oder mit Gefäßbildung verwandten Erkrankungen (wie etwa Restinose), entzündlichen Erkrankungen wie etwa RA, CD oder MS.
Manchmal ist es erwünscht, die Schwere der Erkrankung zu bestimmen, insbesondere bei Patienten, bei denen die Erkrankung bereits positiv diagnostiziert worden ist. In derartigen Fällen sollte das A3AR-Expressionsniveau quantifiziert werden, durch Vergleich mit einer zuvor erstellten Kalibrierungskurve. Eine derartige Kalibrierungskurve wird erstellt durch Bestimmen des Niveaus der A3AR-Expression (was das Niveau an A3AR-Protein, Proteinfragment oder mRNA-Niveau, etc. sein kann, wie vorstehend diskutiert), welches in Zellen vorhanden ist, die von mehreren Patienten erhalten wurden, bei denen positiv diagnostiziert worden ist (oder durch andere Mittel, beispielsweise durch einen Arzt, durch histologische Techniken, etc.), dass sie den Erkrankungszustand aufweisen, mit variierenden Niveaus der Schwere der Erkrankung, als eine Funktion der Schwere der Erkrankung, beispielsweise als eine Funktion des Erkrankungsgrads, der Tumormasse, des Auftretens von Metastasen, der Anzahl an Metastasen, der Mortalität (von Objektträgern, die nachdem sie erhalten wurden, während eines Zeitraums aufbewahrt wurden). Für die Erstellung der Kalibrierungskurve kann die Schwere der Erkrankung auch durch verschiedene akzeptable Methoden wie etwa durch pathologische Techniken bestimmt werden.
Beispielsweise könnte ein Niveau des Proteingehalts zwischen X₁ und X₂ pro 1.000.000 Zellen definiert werden, einen Krebs des Grads 1 anzuzeigen, ein höherer Proteingehalt von Y₁ bis Y₂ pro 1.000.000 Zellen könnte definiert werden, einen Krebs des Grads 2 anzuzeigen, etc. Die Kalibrierungskurve kann das Expressionsniveau als eine Funktion des Erkrankungsgrads, der Tumorgröße, ob die Erkrankung ein primärer oder ein metastatischer Tumor ist, etc., darstellen. Nachdem eine derartige Kalibrierungskurve erstellt worden ist, ist es möglich, das aus einem spezifischen Individuum erhaltene Niveau der A3AR-Expression mit dem entsprechenden Wert in der Kalibrierungskurve zu vergleichen, und somit eine gewisse Bewertung der Schwere der Erkrankung zu erhalten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens Krebs zusammen mit zusätzlichen Tumormarkern zu detektieren, bevorzugt zusammen mit gewebespezifischen Tumormarkern, um die Empfindlichkeit zu erhöhen und falsch-positive/falschnegative Ergebnisse zu vermindern.
Beispiele derartiger Tumormarker sind: CEA, CK19, CK20, c-Met, MAGE-A3, b-hCG, GalNAc-T, CK18, Mucin-1 (MUC-1), und karzinoembryonales Antigen (für Brust und Kolon); EWS-FL11EWS (für Ewing-Sarkom, pNET's); ERG, Pax3-FKHR, FAX7-FKHR (für alveoläres Rhabdomyosarkom); Prostataspezifisches Antigen (PSA), Prostata-spezifisches Membran-Antigen (Prostatakrebs); Tyrosinhydroxylase, PGP 9.5 (für Neuroblastom), Tyrosinase, PG6 9.5. MAGE (für Melanom), Alpha-Fetoprotein, Albumin (für Hepatom); Zytokeratine (Epithelzellen).
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Um die Erfindung zu verstehen, und um zu erkennen, wie sie in der Praxis ausgeführt werden könnte, werden nunmehr ein paar bevorzugte Ausführungsformen beschrieben, in Form von ausdrücklich nicht-einschränkenden Beispielen, unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, in denen:
1A Immunhistochemie von normalem Gewebe und Tumorgewebe aus einer Karzinomläsion zeigt.
1B einen Western Blot von A3AR, erhalten aus humanen Karzinomzellen und von benachbartem normalem Gewebe zeigt.
2 einen Western Blot von A3AR, erhalten aus drei Patienten mit Kolonkrebs, im Vergleich zu A3AR-Niveaus in benachbartem normalem Gewebe zeigt.
3 einen Western Blot von A3AR, erhalten aus Brusttumorzellen (rechts), im Vergleich zu dem Niveau in normalen benachbarten Brustzellen (links) zeigt.
4A einen in Paraffin eingebetteten histologischen Schnitt, erhalten durch Nadelbiopsie des in 4B getesteten Patienten, zeigt.
4B eine Auftrennung von RT-PCR-Produkten einer mRNA-Amplifikation, erhalten aus normalen Brustzellen eines Patienten und von Brusttumorzellen zeigt, A3AR wurde durch Molekulargewichtsmarker identifiziert.
5 einen Western Blot (oben) oder einen Northern Blot (unten) der A3AR-Expression bei einem Kolon- und Brustpatienten von normalem Gewebe und Tumorgewebe zeigt.
6 RT-PCR von A3AR-mRNA, erhalten aus normalen Zellen und Tumorzellen von primärem Melanom (rechts) und metastatischem Melanom, zeigt.
EXPERIMENTELLE VERFAHREN
Materialien und Methoden
IB-MECA und MRS 1523 wurden von RBI/Sigma (Natick, MA, USA) bezogen. Für beide Reagenzien wurde eine Vorratslösung von 10 mM in DMSO hergestellt und weitere Verdünnungen wurden in RPMI-Medium durchgeführt.
RPMI, fötales Rinderserum (FBS) und Antibiotika für Zellkulturen wurden von Beit Haemek, Haifa, Israel, bezogen.
Polyklonale Antikörper aus Kaninchen gegen A3AR aus Maus und Mensch wurden von Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA, bezogen.
Polyklonale Antikörper aus Kaninchen gegen Cyclin D1 aus Maus und Mensch (Upstate, NY), A₂B-Adenosinrezeptor, Cy3-konjugiertes anti-Ziege-IgG und Fluorescein-konjugiertes anti-Kaninchen-IgG wurden von Chemicon, CA, bezogen.
Identifizierung von A3AR-Protein
Western Blot Analyse
Um das Expressionsniveau der A3AR-Proteine zu detektieren, wurde Western Blot Analyse durchgeführt. Zellen wurden in eiskalten Lysepuffer (TNN-Puffer, 50 mM Tris-Puffer, pH = 7,5, 150 mM NaCl, NP 40) transferiert. Zelltrümmer wurden mittels Zentrifugation während 10 min bei 7500 G entfernt. Der Überstand wurde für Western Blot Analyse verwendet. Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung des Bio-Rad Proteinassay Färbereagenzes bestimmt. Gleiche Mengen der Probe (50 μg) wurden mittels SDS-PAGE unter Verwendung von 12% Polyacrylamidgelen aufgetrennt. Die aufgetrennten Proteine wurden danach auf Nitrocellulosemembranen (Schleicher & Schuell, Keene, NH, USA) elektrogeblottet. Die Membranen wurden mit 1% Rinderserumalbumin blockiert und während 24 Stunden bei 4°C mit dem A3AR-Primärantikörper (Verdünnung 1:1000) inkubiert. Die Blots wurden danach gewaschen und während 1 h bei Raumtemperatur mit einem sekundären Antikörper inkubiert. Banden wurden unter Verwendung des BCIP/NBT-Farbentwicklungskits (Promega, Madison, WI, USA) aufgezeichnet. Die in den verschiedenen Figuren gezeigten Daten sind repräsentativ für mindestens drei unterschiedliche Experimente.
Identifizierung von A3AR-mRNA
Northern Blot Analyse
Gesamt-RNA stammte von Zellen, unter Verwendung von Tri-Reagenz (Sigma, Saint-Louis). Die Proben wurden danach zweimal einer Phenol:Chloroform-Extraktion unterzogen und mit Chloroform gewaschen. RNA wurde mit Natriumacetat/Ethanol präzipitiert, anschließend mit Ethanol gewaschen, danach denaturiert, in 1,1% Formaldehyd-Agarose-Gelen aufgetrennt (25 μg pro Bahn), und auf Hybond- N-Membran transferiert. Das 390 bp EcoRI-Fragment eines A3AR-cDNA-Klons aus Maus (TAA3I.S), freundlicherweise von Dr. Kathia Ravid zur Verfügung gestellt, wurde mittels random-geprimter Synthese hergestellt. Die Sonden wurden in der RNA Blot Analyse bei einer Hybridisierungstemperatur von 42°C in der Gegenwart von 50% Formamid verwendet.
Beispiel 1: Bestimmung des Expressionsniveaus von A3AR- Protein in Kolonzellen gegenüber normalen Zellen
Von Kolonkarzinom- und Brustkrebspatienten wurden während Biopsie Proben erhalten. 1A zeigt einen Immunhistochemie-Objektträger eines Krebspatienten, wobei Bereiche durch einen Patholgen als normal (oben) oder krebsartig (unten) identifiziert wurden. Der Inhalt von Zellen, erhalten aus dem in 1A gezeigten zusammenhängenden Bereich, wurde extrahiert und A3AR wurde mittels Western Blot aufgetrennt und A3AR wurde identifiziert unter Verwendung von A3AR-Antikörpern und markierten anti-Kaninchen-IgG-Antikörpern. Wie aus 1B ersichtlich ist, zeigten Tumorzellen ein signifikant höheres Niveau der Expression von A3AR-Protein als normale Zellen, die aus dem gleichen Patienten erhalten worden waren. 2 zeigt die gleichen Ergebnisse für drei verschiedene Kolonkrebspatienten, und wie ersichtlich ist, war in allen drei Fällen das Niveau der A3AR-Expression in den Krebszellen des Patienten höher, im Vergleich zu den normalen Zellen.
Beispiel 2: Bestimmung von A3AR-Protein und des Expressionsniveaus in Brustkrebszellen gegenüber normalen Zellen
Brustkrebszellen, identifiziert von einem Pathologen, wurden mittels Biopsie aus dem Patienten erhalten, zusammen mit normalen Brustkrebszellen aus dem benachbarten Gewebe. Die Proteininhalte der zwei Typen wurden mittels Auftrennung auf einem Western Blot und unter Verwendung von markierten Antikörpern identifiziert.
Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Wie ersichtlich ist, exprimierten Brusttumorzellen im Vergleich zu den benachbarten normalen Zellen ein signifikant höheres Niveau der A3AR-Proteinexpression.
Beispiel 3: Bestimmung des Expressionsniveaus von A3AR-mRNA in Brustkrebspatienten gegenüber normalen Zellen
Aus einem Bereich, der im Verdacht stand, krebsartig zu sein, in der Brust eines Patienten wurde unter Verwendung von Nadelbiopsie eine Probe erhalten. Die Probe wurde zu einem Pathologen gesandt, der normale Zellen und Brustkarzinomzellen markierte (4A). An den Tumorzellen und normalen Zellen, die aus dem zusammenhängenden, in 4A markierten Bereich erhalten worden waren, wurde RT-PCR durchgeführt, und die Amplifikationsprodukte wurden durch Northern Blot aufgetrennt und unter Verwendung geeigneter Molekulargewichtsmarker identifiziert. Die Ergebnisse sind in 4B gezeigt. Wie ersichtlich ist, waren die Niveaus an A3AR-mRNA in Brusttumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen signifikant höher. Dies ist ein Anzeichen dafür, dass Krebs unter Verwendung einer Bestimmung der Expressionsniveaus sowohl von mRNA als auch von Protein detektiert werden kann.
Beispiel 4: Gleichzeitige Detektion des Niveaus von A3AR-Protein und mRNA in Proben, erhalten von Kolonkrebs- und Brustkrebspatienten
Normale Zellen und Krebszellen, erhalten von Kolon- und Brustkrebspatienten, wurden von einem Pathologen identifiziert, und von jedem Gewebe wurden Zellproben erhalten. Das Niveau an A3AR-Protein wurde aus den Tumorzellen und Krebszellen unter Verwendung eines Western Blots, gefolgt von Identifizierung mit Antikörpern bestimmt, und das RNA-Niveau wurde bestimmt unter Verwendung von RT-PCR-Amplifikation, gefolgt von Auftrennung auf einem Northern Blot. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt. Wie ersichtlich ist, wurde ein krebsartiger Zustand von sowohl Brust- als auch Kolonkrebs bestimmt durch Detektieren eines höheren Niveaus an A3AR-Proteinexpression oder A3AR-mRNA-Expression in den Krebszellen, im Vergleich zu dem Niveau in den nichtkrebsartigen Zellen.
Beispiel 5: Detektion des A3AR-mRNA-Niveaus in primärem und metastatischem Melanom
Zellen, die von einem Pathologen als Melanomzellen identifiziert wurden, waren aus einem primären Melanomort erhalten worden, und Krebszellen waren auch aus einem sekundären Melanomort erhalten worden. Zusätzlich wurden Zellen aus dem gleichen Patienten erhalten, die von dem Pathologen als normal identifiziert wurden.
Die mRNA-Gehalte der Primärmelanomzellen, der metastatischen Zellen und der normalen Zellen wurden unter Verwendung von RT-PCR amplifiziert und auf einem Northern Blot aufgetrennt. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Wie ersichtlich ist, exprimierte sowohl der primäre als auch der metastatische Tumor A3AR-mRNA in einem höheren Niveau als normale Zellen, was ein Anzeichen dafür ist, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch für die Detektion von metastatischem Krebs geeignet ist.

Claims

Verfahren zur Detektierung eines Erkrankungszustandes, bestehend aus einem Krebs oder einem Tumor, in einem Patienten, umfassend: (a) Detektieren des Expressionsniveaus des A₃-Adenosin-Rezeptors (A3AR) in einer aus dem Patienten erhaltenen Probe von Zellen, die im Verdacht stehen, in einem Erkrankungszustand zu sein; und (b) Vergleichen des Niveaus der A3AR-Expression in der Probe von Zellen mit dem Niveau der A3AR-Expression in normalen Zellen des gleichen Patienten, wobei die normalen Zellen zu demselben Gewebe wie die Probe von Zellen gehören, wobei ein Unterschied im Niveau zwischen den normalen Zellen und der Probe von Zellen ein Anzeichen für den Erkrankungszustand darstellt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Unterschied eine Erhöhung im Niveau des A3AR-Expressionsniveaus, im Vergleich zu den normalen Zellen, darstellt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Tumor ein fester Tumor ist.
Verfahren zum Bestimmen der Schwere eines Erkrankungszustandes, bestehend aus einem Krebs oder einem Tumor, in einem Patienten, umfassend: (a) Detektieren des Expressionszustands des A3-Adenosin-Rezeptors (A3AR) in einer aus dem Patienten erhaltenen Probe von Zellen, die im Verdacht stehen, in einem Erkrankungszustand zu sein; und (b) Vergleichen des Niveaus der A3AR-Expression in den Zellen mit einer vorbestimmten Kalibrierungskurve des Niveaus von A3AR, wobei die Werte der Kalibrierungskurve in Korrelation zu der Schwere des Erkrankungszustandes stehen, wodurch die Schwere des Erkrankungszustandes des Patienten bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Tumor ein fester Tumor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Niveau der A3AR-Expression durch Detektieren des Niveaus an A3AR-Protein oder A3AR-Proteinfragment in der Probe von Zellen bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Niveau der A3AR-Expression durch Detektieren des Niveaus an A3AR-mRNA in der Probe von Zellen bestimmt wird.
Verfahren, um zu bestimmen, ob ein Patient eine hohe Wahrscheinlichkeit aufweist, auf eine therapeutische Behandlung eines Erkrankungszustandes, bestehend aus einem Krebs oder einem Tumor, durch die Verabreichung eines A3AR-Agonisten oder eines A3AR-Antagonisten anzusprechen, wobei das Verfahren umfasst: (a) Detektieren des Expressionsniveaus des A₃-Adenosin-Rezeptors (A3AR) in einer aus dem Patienten erhaltenen Probe von Zellen, die mit dem Erkrankungszustand assoziiert sind; und (b) Vergleichen des Niveaus der A3AR-Expression in der Probe von Zellen mit dem Niveau der A3AR-Expression in normalen Zellen des Patienten, wobei die normalen Zellen zu demselben Gewebe wie die Probe von Zellen gehören; wobei ein Unterschied im Niveau zwischen den normalen Zellen und der Probe von Zellen ein Anzeichen dafür ist, dass der Patient eine hohe Wahrscheinlichkeit aufweist, auf eine therapeutische Behandlung durch einen A3AR-Agonisten oder A3AR-Antagonisten anzusprechen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Unterschied im Niveau eine Erhöhung des A3AR-Expressionsniveaus in der Probe von Zellen, im Vergleich zu normalen Zellen, darstellt.