DE60312091T2

DE60312091T2 - Verfahren, Vorrichtung und Reagenziensatz zum Zählen von Bakterien

Info

Publication number: DE60312091T2
Application number: DE60312091T
Authority: DE
Inventors: Yasuyuki Kobe-shi Kawashima; Yoshiro Kobe-shi Ikeuchi; Yasuhiro Kobe-shi Sakai
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2002-10-04
Filing date: 2003-10-01
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2023-10-02
Also published as: ATE355387T1; DE60312091D1; JP4236893B2; EP1405918B1; JP2004121143A; US7422870B2; US20040067548A1; EP1405918A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Bakterienzählverfahren, Bakterienzählvorrichtungen und die Verwendung von Bakterienzählreagenzkits. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung Bakterienzählverfahren, Bakterienzählvorrichtungen und Bakterienzählreagenzkits zum Klassifizieren und Zählen von toten Bakterien und lebenden Bakterien unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen.
Das Zählen der Anzahl von Bakterien, die in Proben lebender Organismen oder Nahrungsmitteln enthalten sind, um zu bestimmen, ob in dem Nahrungsmittel oder dem lebendigen Organismus Bakterien existieren, wird im Bereich der klinischen Untersuchungen und Nahrungsmittelhygiene durchgeführt. Herkömmliche Zählverfahren umfassen das Kultivieren, ATP-Assays und Fluoreszenzassayverfahren.
Das Kultivierungsverfahren ist ein Verfahren, Bakterien zu zählen durch Auftragen einer Beschichtung einer Probe auf eine Agarplatte, Kultivieren für 18 bis 24 Stunden, und dann Zählen der Bakterien in der gebildeten Kolonie. In Kultivierungsverfahren kann, nachdem die Probenbeschichtung zu einem flüssigen Medium hinzugefügt und kultiviert wurde, das Wachstum der Bakterien durch das Vorliegen einer Suspension bestimmt werden.
Das ATP-Assayverfahren ist ein Verfahren, Bakterien durch Extrahieren von ATP aus einer Probe zu zählen, welches die bakterielle Aktivität repräsentiert, Hinzufügen eines leuchtenden Reagenzes, um mit ATP zu reagieren, und Detektieren der Intensität des durch das leuchtende Reagenz ausgestrahlten Lichtes.
Das Fluoreszenzassayverfahren färbt eine Probe unter Verwendung einer Kombination eines Fluoreszenzfarbstoffs, um lebendige Bakterien zu färben, und eines Fluoreszenzfarbstoffs, um tote Bakterien zu färben, und detektiert und zählt die lebendigen Bakterien und die toten Bakterien durch ein Durchflusszytometer und ein Fluoreszenzmikroskop.
Es bestehen jedoch verschiedene Probleme bei konventionellen Verfahren. Zum Beispiel wird das Kultivierungsverfahren im Wesentlichen manuell durchgeführt, und benötigt komplexe Handlungen. Da das Kultivieren eine lange Zeit braucht, muss eine erhebliche Zeit verstreichen, bevor die Bakterien gezählt werden können. Des Weiteren können nur kultivierbare Bakterien gezählt werden.
Das ATP-Assayverfahren benötigt komplexe Vorbehandlungen, wie das ATP-Extraktionsverfahren. Da die Bakterien nicht direkt gezählt werden und die Bakterien auf Basis der ATP-Konzentration anhand der Intensität der Lichtemission des leuchtenden Reagenzes gezählt werden, besteht die Möglichkeit für Berechnungsfehler. Des Weiteren können nur Bakterien gezählt werden, welche ATP produzieren.
Fluoreszenzassays benötigen zwei Arten von Farbstoffen, welche erheblich unterschiedliche Detektionswellenlängen für die Detektion von lebenden Bakterien bzw. die Detektion von toten Bakterien aufweisen. Dementsprechend muss, um lebende und tote Bakterien zu zählen, dieselbe Probe unter Verwendung unterschiedlicher Detektionseinrichtungen für jeden Farbstoff gemessen werden, wodurch die Struktur der Assayvorrichtung kompliziert wird. Zusätzlich wird das Funktionieren der Assayvorrichtung ebenfalls kompliziert.
Wie oben beschrieben, sind die konventionellen Verfahren nachteilig, da sie nur lebende Bakterien zählen können, kompliziert zu betreiben sind, oder komplexe Messvorrichtungen benötigen, die in der Lage sind, lebende und tote Bakterien zu zählen.
Wenn ein Antibiotikum zu der Probe, welche die Bakterien enthält, hinzugefügt wird, und die Veränderung der Anzahl von Bakterien über die Zeit bestimmt wird, um den antibakteriellen Effekt zu bestimmen, ist es wünschenswert, nicht nur die Anzahl der lebenden Bakterien zu erhalten, sondern auch die Anzahl der toten Bakterien. Des Weiteren müssen, wenn zuvor das Vorhandensein von Bakterien in einer Probe bestätigt wurde, die Bakterien gezählt werden und Kulturstudien durchgeführt werden, wenn die Bakterien lebendig sind, wohingegen Kultivierungsuntersuchungen unnötig sind, wenn die Bakterien tot sind. Daher ist es wünschenswert, eine Zählung lebendiger Bakterien von der Probe zu erhalten, um zu bestimmen, ob eine Kultivierungsstudie erforderlich ist.
Die europäische Patentveröffentlichung Nr. 1 136 563 A2 beschreibt ein Verfahren zum Färben von Bakterien durch Anwenden eines kationischen Tensids auf eine Probe, enthaltend Bakterien, und dem darauf folgenden Hinzufügen eines Farbstoffs. Der Erhalt einer Zählung von sowohl lebendigen als auch toten Bakterien wird nicht erwähnt.
Suller et al., 1999, offenbaren das Fluoreszenz-Monitoring einer antibiotisch induzierten Bakterienschädigung unter Verwendung von Durchflusszytometrie. Die Fluoreszenzfarbstoffe Bis(1,3-dibutylbarbitursäure)trimethinoxonol, Sytox-Grün und der Redoxfarbstoff, 5-Cyano-2,3-ditolyltetrazoliumchlorid sowie der Baclite-Lebensfähigkeitstestkit wurden verwendet, um die Effekte von Ceftazidim, Ampicillin und Vancomycin auf klinische Isolate verschiedener Bakterien zu untersuchen.
EP 1 203 825 offenbart ein Verfahren zum Färben, Nachweisen und Zählen von Bakterien in klinischen Proben, enthaltend Nitritionen, wie Harnproben, unter Verwendung von Polymethinfarbstoffen.
SU 1 306 947 offenbart ein Verfahren zum Quantifizieren von Mikroorganismen in deionisiertem Wasser, worin die Mikroorganismen mit Ethidiumbromid gefärbt werden.
Kurz gesagt, wäre ein einfaches Verfahren, das in der Lage ist, Zählungen von sowohl lebenden als auch toten Bakterien zur Verfügung zu stellen, wünschenswert.
Zusammenfassung
Der Umfang der vorliegenden Erfindung wird einzig durch die beigefügten Ansprüche definiert und wird in keinster Weise durch die Aussagen in dieser Zusammenfassung beeinflusst.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Zählen von Bakterien in einer klinischen Probe, umfassend:
Herstellen einer ersten Messprobe durch Teilen einer Probe in zumindest zwei Teile und Färben eines ersten Probenteils unter Verwendung eines ersten Fluoreszenzfarbstoffs, wodurch ein Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen lebenden und toten Bakterien erzeugt wird; Herstellen einer zweiten Messprobe durch Färben aller Bakterien in einem zweiten Probenteil unter Verwendung eines zweiten Fluoreszenzfarbstoffs, der der gleiche oder ein anderer sein kann wie der erste Fluoreszenzfarbstoff, und eine oberflächenaktive Substanz; Detektieren einer ersten optischen Information umfassend Fluoreszenzlicht aus der ersten Messprobe; Detektieren einer zweiten optischen Information umfassend Fluoreszenzlicht aus der zweiten Messprobe; Klassifizieren und Zählen von toten Bakterien in der ersten Messprobe basierend auf der ersten optischen Information; Klassifizieren und Zählen aller Bakterien in der zweiten Messprobe basierend auf der zweiten optischen Information; und Berechnen einer Anzahl von lebenden Bakterien auf Basis der gesamten Bakterienanzahl erhalten aus der zweiten Messprobe und einer toten Bakterienanzahl erhalten aus der ersten Messprobe.
Des Weiteren betrifft die Erfindung eine Bakterienzählvorrichtung zum Zählen von Bakterien in einer klinischen Probe, umfassend:
einen Messproben-Vorbereitungsteil, umfassend eine Probenbereitstellungsvorrichtung zum Bereitstellen einer ersten Probe und einer zweiten Probe aus der gleichen ursprünglichen Probe, zum Vorbereiten einer ersten Messprobe durch Färben der ersten Probe unter Verwendung eines ersten Fluoreszenzfarbstoffs, wodurch ein Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen den lebenden und toten Bakterien erzeugt wird, und zum Herstellen einer zweiten Messprobe durch Färben aller Bakterien der zweiten Probe unter Verwendung eines zweiten Fluoreszenzfarbstoffs, der der gleiche oder ein anderer sein kann wie der erste Fluoreszenzfarbstoff, und eine oberflächenaktive Substanz; eine Detektionseinheit zum Detektieren einer ersten optischen Information umfassend Fluoreszenzlicht aus der ersten Messprobe und zum Detektieren einer zweiten optischen Information umfassend Fluoreszenzlicht aus der zweiten Messprobe; und
eine Analyseeinheit, welche Mittel hat zum Klassifizieren und Zählen von toten Bakterien in der ersten Messprobe auf Basis der ersten optischen Information, zum Klassifizieren und Zählen aller Bakterien in der zweiten Messprobe auf Basis der zweiten optischen Information und zum Berechnen einer Anzahl von lebenden Bakterien auf Basis einer gesamten Bakterienanzahl, erhalten aus der zweiten Messprobe, und
einer Anzahl toter Bakterien, erhalten aus der ersten Messprobe.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Reagenzkits zum Zählen von Bakterien, umfassend:
eine erste Verdünnungsflüssigkeit, die im Wesentlichen frei ist von einem Tensid; eine zweite Verdünnungsflüssigkeit, enthaltend ein Tensid; und eine Farbstoffflüssigkeit, enthaltend einen Fluoreszenzfarbstoff in einem Verfahren zum Zählen von Bakterien in einer klinischen Probe gemäß der Erfindung.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 ist ein Diagramm, das die Position zeigt, an welcher jedes Bakterium auftritt, wenn es klassifiziert und gezählt wird durch ein Verfahren, das Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpert.
2 ist ein Diagramm, das die Position zeigt, an welcher jedes Bakterium auftritt, wenn es klassifiziert und gezählt wird durch ein Verfahren, das Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpert.
3 ist eine schematische Darstellung einer Bakterienzählvorrichtung, die Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpert.
4 ist eine schematische Darstellung, die das Funktionieren der Bakterienzählvorrichtung, welche Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpert, darstellt.
5 zeigt ein Scattergramm, erhalten aus der Assayprobe I in Beispiel 1.
6 zeigt ein Scattergramm, erhalten aus einer Assayprobe II in Beispiel 2.
7 zeigt ein Scattergramm, erhalten aus E. coli-Serien in Beispiel 3.
8 zeigt ein Scattergramm, erhalten von S. aureus-Serien in Bespiel 3.
9 zeigt ein Scattergramm, erhalten von E. faecalis-Serien in Beispiel 3.
10 zeigt Darstellungen des Prozentsatzes lebender und toter Bakterien in einer Probe, erhalten aus Bespiel 3, wie sie durch die verschiedenen angegebenen Verfahren gezählt wurden.
11 ist eine Darstellung der Anzahl von Bakterien, erhalten aus Beispiel 4, wie sie durch die verschiedenen angegebenen Verfahren gezählt wurden.
12 zeigt ein Scattergramm, erhalten aus der Assayprobe I in Beispiel 5.
13 zeigt ein Scattergramm, erhalten aus der Assayprobe II in Beispiel 5.
14 zeigt ein Scattergramm, erhalten aus einer Probe, gefärbt mit Baclight in Beispiel 5.
Detaillierte Beschreibung
Die Proben, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen klinische Proben. Repräsentative Beispiele umfassen, jedoch nicht limitiert auf, Urin, Blut, Spinalflüssigkeit und dergleichen, sowie Kulturen davon.
Die Bakterien können jegliche Bakterien sein, die den menschlichen Körper oder die Umwelt beeinflussen, umfassend, aber nicht limitiert auf, E. coli, S. aureus, E. faecalis, S. marcescens, P. aeruginosa, und dergleichen.
Wenn eine Probe mit einem Fluoreszenzfarbstoff behandelt wird, ist es wünschenswert, dass das Verfahren bei einem pH zwischen etwa 2,0 und etwa 4,5 durchgeführt wird. Aus diesem Grund kann eine Pufferlösung im sauren pH-Bereich von etwa 2,0 bis etwa 4,5 verwendet werden. Beispiele von verwendbaren Säuren umfassen, sind jedoch nicht limitiert, auf Zitronensäure, Phosphorsäure, Phthalsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure und dergleichen. Diese Säuren können in beliebigen Mengen verwendet werden, sofern der zuvor genannte pH-Bereich beibehalten wird; eine Konzentration im Bereich von etwa 10 bis etwa 500 mM ist wünschenswert. Beispiele von nützlichen Pufferlösungen mit einem ungefähren pH im Bereich von etwa 2,0 bis etwa 4,5 umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf, Britton-Robinson-Pufferlösung, Clark-Lubs-Pufferlösung, Kolthoff-Pufferlösung, McIlvaine-Pufferlösung, Michaelis-Pufferlösung, Sorensen-Pufferlösung und dergleichen. In dem oben genannten pH-Bereich wird das nicht-spezifische Färben von anderem Material als den Bakterien im Vergleich zu neutralem oder alkalischem pH unterdrückt.
Der erste Fluoreszenzfarbstoff ruft einen Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen lebenden und toten Bakterien hervor und färbt wünschenswerterweise tote Bakterien im sauren Bereich. Unter solchen Farbstoffen sind gegenwärtig Polymethinfarbstoffe wünschenswert. Repräsentative Polymethinfarbstoffe werden in (1) bis (11) nachstehend gezeigt:

(1) Thizol-Orange
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10) Verbindungen mit der allgemeinen Formel:
worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen darstellt; R₂ und R₃ Wasserstoffatome, Alkylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, oder Alkoxygruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen darstellen; R₄ ein Wasserstoffatom, Acylgruppe oder Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen darstellt; R₅ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, welche optional substituiert sein können, darstellt; Z ein Schwefelatom, Sauerstoffatom oder Kohlenstoffatom, substituiert mit einer Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, darstellt; n 1 oder 2 darstellt; und X ein Anion darstellt.
(11) Verbindungen mit der allgemeinen Formel:
worin R₆ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen darstellt; R₇ und R₈ Wasserstoffatome, Alkylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder Alkoxygruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen darstellen; R₉ ein Wasserstoffatom, Acylgruppe oder Alkylgruppe mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen darstellt; Z ein Kohlenstoffatom mit einer Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, ein Schwefelatom oder ein Sauerstoffatom darstellt; n 0, 1 oder 2 darstellt; und X ein Anion darstellt.

Beispiele von nützlichen Alkylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf Methyl, Ethyl, Propyl und dergleichen. Beispiele von nützlichen Alkylgruppen mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Octyl, Dodecyl, Tetradecyl und dergleichen.
Beispiele von nützlichen Alkoxygruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf Methoxy, Ethoxy, Propoxy und dergleichen.
Beispiele von nützlichen Acylgruppen umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf: Alkanoyle mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl und dergleichen; Alkenoyle mit 3 bis 18 Kohlenstoffatomen, wie Acryloyl, Propyroyl, Oleoyl und dergleichen; und Aroylen mit 7 bis 11 Kohlenstoffatomen, wie Benzoyl, Toluoyl, Xyloyl, Naphthoyl und dergleichen.
Beispiele von nützlichen Anionen umfassen, sind jedoch limitiert auf Halogenionen, wie Fluor, Brom, Iod, Chlor und dergleichen, und ClO₄, BF₄ und dergleichen.
Unter diesen Farbstoffen ist (1) kommerziell erhältlich, (2) und (3) erhältlich von dem Japan Photosensitive Dye Research Center, und (5) bis (9) erhältlich von Molecular Probes, Inc. Der Farbstoff (10) kann durch das Verfahren, welches in dem US-Patent Nr. 5,821,127 beschrieben wird, hergestellt werden. Der Farbstoff (11) kann durch das Verfahren, das in dem US-Patent Nr. 6,004,816 beschrieben wird, hergestellt werden.
Unter den Farbstoffen, die durch die allgemeine Formel (10) dargestellt werden, ist gegenwärtig der nachstehende Farbstoff besonders wünschenswert.
Betreffend die Konzentration des ersten Fluoreszenzfarbstoffs ist, obwohl die geeignete Konzentration in Abhängigkeit von der Art des Fluoreszenzfarbstoffs unterschiedlich sein wird, eine Konzentration im Bereich von z.B. etwa 0,1 bis etwa 100 ppm (Endkonzentration) gegenwärtig wünschenswert.
Das Prozessieren der Probe und des ersten Fluoreszenzfarbstoffs kann durch Mischen der Probe, des Farbstoffs und eines Puffers erfolgen. Beim Mischen kann ein Lösungsmittel zu der Probe, dem Farbstoff und dem Puffer, wie nötig, hinzugefügt werden, um auf eine gewünschte Konzentration zu verdünnen oder aufzulösen. Des Weiteren kann das Mischen bewerkstelligt werden durch Hinzufügen eines Lösungsmittels zu einer oder mehreren der Probe, des Farbstoffs und des Puffers, um so die verdünnte, aufgelöste oder suspendierte Lösung einzustellen, gefolgt durch Mischen der Lösung. Verwendbare Lösungsmittel umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf, Wasser und wasserlösliche organische Lösungsmittel, wie Ethanol, Ethylenglykol und dergleichen. Wenn die Probe Urin ist, wird das Färben mit dem Fluoreszenzfarbstoff durch den Einfluss von der von manchen Bakterien hergestellten salpetrigen Säure unterdrückt. Um diesen Einfluss zu eliminieren, kann ein Reduziermittel für salpetrige Säure bei dem Prozessieren der Probe und des ersten Fluoreszenzfarbstoffs hinzugefügt werden. Als ein Beispiel kann Amidosulfonsäure als das Reduziermittel für salpetrige Säure verwendet werden.
Obwohl die Temperatur und die Dauer des Prozessierens der Probe und des ersten Fluoreszenzfarbstoffs nicht limitiert sind, sind gegenwärtig eine Temperatur von etwa 35 bis etwa 50°C, und eine Dauer von etwa 10 bis etwa 30 Sekunden wünschenswert. Durch dieses Verfahren kann die erste Assayprobe hergestellt werden.
Die hergestellte erste Assayprobe wird beleuchtet und die optische Information, umfassend das Fluoreszenzlicht und das gestreute Licht, das von jedem Bakterium, das von dem Fluoreszenzfarbstoff gefärbt wurde, ausgestrahlt wird, wird in der Assayprobe detektiert. Gestreutes Licht umfasst seitlich gestreutes Licht, vorwärts gestreutes Licht und dergleichen. Fluoreszenzlicht umfasst Seitenfluoreszenzlicht, Vorwärtsfluoreszenzlicht und dergleichen. Ein Durchflusszytometer kann verwendet werden, um derartige optische Information zu detektieren.
Die toten und lebendigen Bakterien werden unter Verwendung der so erhaltenen optischen Information klassifiziert und gezählt. Im Vergleich zu toten Bakterien ist das Material in den lebendigen Bakterien gegenüber Fluoreszenzfärben widerstandsfähig infolge des Wirkens der bakteriellen Membran (Zellwand). Diese Tatsache wird gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, um eine Probe unter Verwendung eines ersten Fluoreszenzfarbstoffs unter Bedingungen zu prozessieren, dass tote Bakterien adäquatem Fluoreszenzfärben unterworfen sind, und lebendige Bakterien entweder schwachem Fluoreszenzfärben oder im Wesentlichen keinem Fluoreszenzfärben unterworfen sind, im Vergleich zu toten Bakterien. Auf diese Art tritt ein Unterschied im Grad der Färbung zwischen den lebenden und toten Bakterien auf, so dass ein Unterschied in der Intensität von Fluoreszenzlicht, das von jedem Bakterium detektiert wird, hergestellt wird.
Wenn ein Unterschied in der Fluoreszenzlichtintensität von lebenden und toten Bakterien hergestellt wird, können die lebenden Bakterien, welche eine niedrige detektierte Fluoreszenzlichtintensität haben, und die toten Bakterien, welche eine hohe detektierte Fluoreszenzlichtintensität haben, klar klassifiziert und detektiert werden, wie in
1 gezeigt. In diesem Fall können die lebenden und toten Bakterien klassifiziert und gezählt werden auf Basis der Fluoreszenzlichtintensität alleine. Wenn bezüglich der Fluoreszenzlichtintensität der Grenzwert bei einem Wert, der höher ist als die Fluoreszenzlichtintensität gesetzt wird, die von lebenden Bakterien ausgestrahlt wird, und niedriger als die Fluoreszenzlichtintensität, die von toten Bakterien ausgestrahlt wird, können die Bakterien mit einer geringeren Fluoreszenzlichtintensität als dem Grenzwert als lebende Bakterien klassifiziert und gezählt werden, und die Bakterien mit einer Fluoreszenzlichtintensität, die höher ist als der Grenzwert können als tote Bakterien klassifiziert und gezählt werden. Wenn die Fluoreszenzlichtintensität in dieser Weise verwendet wird, kann ein Histogramm mit der Fluoreszenzlichtintensität und der Anzahl von Bakterien als Achsen hergestellt werden, anstelle des zweidimensionalen Scattergramms, das in 1 gezeigt wird. Des Weiteren können die lebenden und toten Bakterien anhand dieses Histogramms gezählt und klassifiziert werden.
Darüber hinaus können lebende und tote Bakterien durch Kombinieren der vorwärts gestreuten Lichtintensität und der Fluoreszenzlichtintensität klassifiziert und gezählt werden. Dieses Verfahren kann verwendet werden, wenn es schwierig ist, die lebenden und toten Bakterien durch die Fluoreszenzlichtintensität allein adäquat zu klassifizieren. Wenn ein Scattergramm unter Verwendung von vorwärts gestreuter Lichtintensität und Fluoreszenzlichtintensität als Achsen erzeugt wird, wie in 1 gezeigt, können Bereiche gesetzt werden, um die lebende Bakterienpopulation und die tote Bakterienpopulation zu umschreiben. Dann können die Bakterien innerhalb jeder dieser Regionen gezählt werden, um eine Zählung der lebenden bzw. toten Bakterien zu erhalten.
Zusätzlich zu dem oben beschriebenen Verfahren wird ein Teil derselben Probe mit einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff prozessiert, in Abhängigkeit von der Art der verwendeten Probe und der Art von den in der Probe enthaltenen Bakterien, so dass die Bakterien mit höherer Genauigkeit durch Berechnung der Gesamtbakterienzahl klassifiziert und gezählt werden können.
Die mit dem zweiten Fluoreszenzfarbstoff prozessierte Probe wird wünschenswerterweise zuvor in zwei Teile aufgeteilt, und ein Teil wird, wie oben beschrieben, mit dem ersten Fluoreszenzfarbstoff prozessiert, wohingegen der andere Teil unter Verwendung des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs prozessiert wird.
Der zweite Fluoreszenzfarbstoff kann ausgewählt werden unter den oben beschriebenen Beispielen des ersten Fluoreszenzfarbstoffs. Die Konzentration des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs ist wünschenswerterweise im Wesentlichen die gleiche wie jene des ersten Fluoreszenzfarbstoffs. Die Detektionswellenlänge des ersten Fluoreszenzfarbstoffs und des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs sind wünschenswerterweise unter Verwendung derselben Detektionsvorrichtung detektierbar, und es ist besonders wünschenswert, dass der zweite Fluoreszenzfarbstoff und der erste Fluoreszenzfarbstoff identisch sind.
Bei dem Verfahren mit dem zweiten Fluoreszenzfarbstoff ist es wünschenswert und wichtig, dass ein Tensid verwendet wird. Beispiele eines nützlichen Tensids umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf, kationische Tenside, anionische Tenside, amphotere Tenside, nicht-ionische Tenside und dergleichen. Das Tensid schädigt die Zellmembran (Zellwand) der Bakterien, so dass der Fluoreszenzfarbstoff effektiv in die Bakterien eindringen kann, und dadurch die Bakterien im Allgemeinen färbt. Unter diesen Tensiden sind gegenwärtig kationische Tenside aufgrund ihrer Fähigkeit, effektiv Bakterien zu färben, wünschenswert. Kationische Tenside können zähflüssige Fäden, welche in der Probe vorhanden sind, Erythrozyten, Zellfragmente und dergleichen auflösen und kontrahieren, und sind daher wünschenswert aufgrund ihrer überlegenen Effektivität beim Verhindern der Beeinflussung der Bakterienzählung.
Kationische Tenside sind nicht limitiert, und nützliche Beispiele umfassen quaternäre Ammoniumsalze, wie jene, die in der nachstehenden Formel gezeigt werden:
In dieser Formel stellt R¹⁰ eine Alkylgruppe mit 6 bis 18 Kohlenstoffatomen oder (C₆H₅)-CH₂- dar; R¹¹, R¹² und R¹³ stellen die gleiche oder unterschiedliche Alkylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder Benzylgruppen dar; und Y stellt ein Halogenion dar.
Beispiele nützlicher Alkylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf Methyl, Ethyl, Propyl und dergleichen. Beispiele von nützlichen Alkylgruppen mit 6 bis 18 Kohlenstoffatomen umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf Hexyl, Pentyl, Octyl, Decyl, Dodecyl, Tetradecyl und dergleichen. Beispiele von nützlichen Halogenen umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf Fluor, Brom, Iod, Chlor und dergleichen.
Geeignete Ammoniumsalze umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf Hexyltrimethylammoniumsalz, Octyltrimethylammoniumsalz, Decyltrimethylammoniumsalz, Dodecyltrimethylammoniumsalz, Tetradecyltrimethylammoniumsalz, Hexadecyltrimethylammoniumsalz, Octadecyltrimethylammoniumsalz, Benzyltrimethylammoniumsalz und dergleichen.
Andere Beispiele von kationischen Tensiden umfassen Pyridiniumsalze entsprechend der Formel: [(C₅H₅)N⁺-(CH₂)_n-CH₃]_Y ^–.
In dieser Formel stellt n 7 bis 17 dar; und Y stellt ein Halogenion dar.
Geeignete Pyridiniumsalze umfassen, sind aber nicht limitiert auf Octylpyridiniumsalz, Decylpyridiniumsalz, Dodecyltrimethylpyridiniumsalz, Tetradecyltrimethylpyridiniumsalz, Hexadecyltrimethylpyridiniumsalz und dergleichen.
Obwohl die Konzentration des kationischen Tensids in Abhängigkeit von der verwendeten Art unterschiedlich sein wird, kann die Endkonzentration z.B. in einem Bereich von etwa 10 bis etwa 50.000 mg/ml liegen, und wünschenswerterweise in einem Bereich von etwa 100 bis etwa 3.000 mg/ml.
Das anionische Tensid ist nicht limitiert, und geeignete Beispiele umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf Lauroylsarcosinsäuresalz als ein N-Acylaminoessigsäuresalz, Myristoylsarcosinsäuresalz, Oleoylsarcosinsäuresalz, Ölsäuresalz und dergleichen.
Obwohl die Konzentration des anionischen Tensids unterschiedlich sein wird in Abhängigkeit der verwendeten Art, kann die Endkonzentration z.B. in einem Bereich von etwa 0,1 bis etwa 10 mg/ml liegen, und wünschenswerterweise in einem Bereich von etwa 0,5 bis etwa 5 mg/ml.
Das amphotere Tensid ist nicht limitiert, und nützliche Beispiele umfassen das Betainacetat, gezeigt durch die Formel:
In dieser Formel stellt R¹⁴ eine Alkylgruppe mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen dar; R¹⁵ und R¹⁶ stellen die gleiche oder eine unterschiedliche Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Alkenylgruppen oder Alkinylgruppen mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen dar.
Die Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen kann dieselbe wie oben sein. Beispiele von nützlichen Alkenylgruppen mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf Vinyl, Allyl und dergleichen. Beispiele von nützlichen Alkinylgruppen mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf Acetylenyl, Propinyl und dergleichen. Beispiele von nützlichen Alkylgruppen mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf Octyl, Decyl, Dodecyl, Tetradecyl und dergleichen.
Beispiele geeigneter Betainacetate umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf Dodecyldimethylammoniumbetainacetat, Hexadecyldimethylammoniumbetainacetat, Decyldimethylammoniumbetainacetat, Lauryldimethylammoniumbetainacetat und dergleichen.
Obwohl die Konzentration des Tensids in Abhängigkeit von der Art unterschiedlich sein wird, kann eine Endkonzentration von z.B. etwa 1 bis etwa 100 mg/ml verwendet werden, wobei eine Endkonzentration von etwa 5 bis etwa 20 mg/ml gegenwärtig wünschenswert ist.
Nicht-ionische Tenside sind nicht limitiert, und geeignete Beispiele von Polyoxyethylen(n)alkylethern haben wünschenswerterweise eine Alkylgruppe mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen, worin n 10 bis 20 darstellt. Wünschenswerterweise haben die Polyoxyethylen(n)alkylphenylether eine Alkylgruppe mit 8 bis 10 Kohlenstoffatomen, worin n 2 bis 20 darstellt (z.B. POE(10)octylphenylether und dergleichen).
Obwohl die Konzentration der nicht-ionischen Tenside sich in Abhängigkeit von der Art unterscheiden wird, kann eine Endkonzentration von z.B. etwa 1 bis etwa 100 mg/ml verwendet werden, wobei eine Endkonzentration von etwa 5 bis etwa 20 mg/ml gegenwärtig wünschenswert ist.
Andere Tenside als die oben beschriebenen, von denen anerkannt ist, dass sie die Eigenschaft haben, die Zellmembranen von Bakterien zu beschädigen, umfassen die unten stehenden Materialien, welche verwendet werden können als Tensid gemäß der vorliegenden Erfindung: Triton X-100 (Polyethylenglykolmono[p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenyl]ether), CHAPS (3-[(3-Chloramidpropyl)diethylammonio]propansulfonsäure), CHAPSO (3-[(3-Chloramidpropyl)dimethylammonio]-2-hydroxypropansulfonsäure), BIGCHAP (N,N-Bis(3-D-gluconamidpropyl)chloramid), Dioxy-BIGCHAP (N,N-Bis(3-D-gluconamidpropyl)dioxychloramid) Sucrosemonocaprat, Sucrosemonocholat, n-Octyl-α-D-glucopyranosid, n-Heptyl-α-D-thioglucopyranosid, n-Octyl-α-D-thioglucopyranosid, n-Dodecyl-α-D-maltopyranosid, n-Nonyl-α-thiomaltopyranosid und dergleichen.
Obwohl die Konzentration dieser Tenside sich in Abhängigkeit von der Art unterscheiden wird, kann eine Endkonzentration von z.B. etwa 0,5 bis etwa 50 mg/ml verwendet werden, wobei eine Endkonzentration von etwa 1,0 bis etwa 10 mg/ml gegenwärtig wünschenswert ist.
Das Prozessieren der Probe und des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs kann durch Mischen der Probe, des Farbstoffs, des Tensids und des Puffers durchgeführt werden. Beim Mischen kann ein Lösungsmittel zu der Probe, dem Farbstoff, dem Tensid und dem Puffer, wie erforderlich hinzugefügt werden, um das Material auf eine gewünschte Konzentration zu verdünnen oder aufzulösen. Des Weiteren kann Lösungsmittel unabhängig hinzugefügt werden zu einer oder mehreren der Probe, dem Farbstoff, dem Tensid und dem Puffer, um die verdünnte, aufgelöste oder suspendierte Lösung einzustellen, und das Mischen kann dann durchgeführt werden durch Mischen der Lösung. Geeignete Lösungsmittel umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf Wasser und wasserlösliche organische Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Ethylenglykol und dergleichen. Wenn die Probe Harn ist, wird das Färben durch den Fluoreszenzfarbstoff durch den Einfluss der salpetrigen Säure inhibiert, die von manchen Bakterien hergestellt wird. Um diesen Einfluss zu unterdrücken, kann ein Reduziermittel für salpetrige Säure bei diesem Prozessieren der Probe und des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs hinzugefügt werden. Zum Beispiel kann Amidosulfonsäure als Reduziermittel für die salpetrige Säure verwendet werden.
Obwohl die Temperatur und die Dauer des Prozessierens der Probe und des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs nicht limitiert sind, wird eine Temperatur von etwa 35 bis etwa 50°C und eine Dauer von etwa 30 Sekunden bis etwa 10 Minuten erwünscht. Die zweite Assayprobe kann durch dieses Verfahren hergestellt werden.
Die hergestellte zweite Assayprobe wird beleuchtet und optische Information, umfassend Fluoreszenzlicht und gestreutes Licht, das von jedem Bakterium, welches mit dem Fluoreszenzfarbstoff gefärbt wurde, in der Probe ausgestrahlt wird, wird in derselben Weise detektiert wie in der ersten Assayprobe. Zum Beispiel sind die gesamten Bakterien verteilt, z.B. in einem Scattergramm von vorwärts gestreuter Lichtintensität und Fluoreszenzlichtintensität, wie in 2 gezeigt. Ein Bereich kann gesetzt werden, um die Populationen zu umschreiben, so dass eine Gesamtbakterienzahl erhalten werden kann durch Zählen der Bakterien innerhalb des Bereiches.
Die lebenden Bakterien können berechnet werden durch Abziehen der toten Bakterienzahl, erhalten aus der ersten Assayprobe von der Gesamtbakterienzahl, erhalten aus der zweiten Assayprobe. Obwohl die lebenden Bakterien auch aus der ersten Assayprobe klassifiziert und gezählt werden können, können Unreinheiten in dem Bereich, welcher die Population der lebenden Bakterien in dem Scattergramm bildet, gemischt sein, und so eine genaue Zählung der lebenden Bakterien verhindern. In Bezug auf die gleiche Probe ist es wünschenswerter, die Berechnung durchzuführen unter Verwendung der Gesamtbakterienzahl, erhalten aus der zweiten Assayprobe und der toten Bakterienzahl, erhalten aus der ersten Assayprobe, da dann eine genaue Zahl der lebenden Bakterien erhalten werden kann.

Die folgenden Beispiele und repräsentativen Verfahren illustrieren Merkmale gemäß der vorliegenden Erfindung und sind nur zur Illustration zur Verfügung gestellt. Sie dienen nicht dazu, den Umfang der beigefügten Ansprüche zu limitieren. Beispiele Zusammensetzung der Verdünnungsflüssigkeit I (ohne Tensid)

Zitronensäure	100 mmol
Natriumsulfat	90 mmol
Amidosulfonsäure	100 mmol
NaOH	ausreichend, um einen Lösungs-pH von 2,5 zu erhalten
gereinigtes Wasser	1 Liter

Zusammensetzung der Verdünnungsflüssigkeit II (mit Tensid)

Zitronensäure	100 mmol
Natriumsulfat	90 mmol
Amidosulfonsäure	100 mmol
NaOH	ausreichend, um einen Lösungs-pH von 2,5 zu erreichen
Tetradecyltrimethylammoniumbromid	1 g
gereinigtes Wasser	1 Liter

Zusammensetzung der Färbelösung:

Fluoreszenzfarbstoff (Struktur nachstehend) – 40 mg

Ethylenglykol – 1 Liter

Bakterienzählvorrichtung
In den folgenden Beispielen 1 bis 5 wird eine Bakterienzählvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung in Bezug auf 3 beschrieben. Diese Bakterienzählvorrichtung umfasst eine Assayprobenvorbereitungseinheit 1, eine Detektionseinheit 2 und eine Analyseeinheit 3. Die Assayprobenvorbereitungseinheit 1 prozessiert eine Probe unter Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffes und optional eines Tensids bei einem pH von etwa 2,0 bis etwa 4,5, um eine Assayprobe herzustellen. Die Assayprobenvorbereitungseinheit 1 umfasst eine Probensaugpipette 6, ein Probenentnahmeventil 5, Reaktionskammern 14 und 15, Verdünnungsflüssigkeitsbehälter 9 und 10, einen Farbstoffbehälter 8, Saugpumpen 4, 11, 12 und 13 und Rohre, die die verschiedenen Teile verbinden, und Flusskontrollventile (nicht gezeigt). Die Verdünnungsflüssigkeit I wird in den ersten Verdünnungsflüssigkeitsbehälter 9 geladen, und die Verdünnungsflüssigkeit II wird in den zweiten Verdünnungsflüssigkeitsbehälter 10 geladen. Der Farbstoff wird in den Farbstoffbehälter 8 geladen.
Das Funktionieren der Bakterienzählvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung wird nachstehend beschrieben. Das Funktionieren der Bakterienzählvorrichtung umfasst einen Assayprobenvorbereitungsvorgang, durchgeführt durch die Assayprobenvorbereitungseinheit 1, einen Vorgang des Detektierens optischer Information, durchgeführt durch die Detektionseinheit 2, und einen Analysevorgang, durchgeführt durch die Analyseeinheit 3. Jeder Vorgang wird automatisch ausgeführt.
Asssayprobenvorbereitungsvorgang
In der Assayprobenvorbereitungseinheit 1 wird eine Probe in einem Teströhrchen 7 zunächst von der Probensaugpipette 6 aufgesaugt über das Wirken der Saugpumpe 4. Dann wird die aufgesaugte Probe gemessen durch das Probenentnahmeventil 5, und den Reaktionskammern 14 bis 15 zugeführt. So wird eine vorherbestimmte Menge der Probe den Reaktionskammern 14 und 15 aus derselben ursprünglichen Probe zugewiesen. Die Verdünnungsbehälter 9 und 10 sind jeweils verbunden mit den Reaktionskammern 14 und 15, so dass die Verdünnungsflüssigkeit I in der ersten Reaktionskammer 14 bereitgestellt wird und die Verdünnungsflüssigkeit II in der Reaktionskammer 15 bereitgestellt wird durch Röhren über die jeweiligen Saugpumpen 12 und 13. Der Farbstoffbehälter 8 ist verbunden mit den Reaktionskammern 14 und 15, so dass eine vorbestimmte Menge von Färbeflüssigkeit, enthaltend Fluoreszenzfarbstoff, den jeweiligen Reaktionskammern 14 und 15 durch Rohre über die Saugpumpe 11 zur Verfügung gestellt wird. In der ersten Reaktionskammer 14 werden 50 μl der Probe, 340 μl der Verdünnungsflüssigkeit I und 10 μl des Farbstoffes gemischt in einem Bakterienfärbevorgang, um eine Assayprobe herzustellen. In der zweiten Reaktionskammer 15 werden 50 μl der Probe, 340 μl der Verdünnungsflüssigkeit II und 10 μl Farbstoff gemischt in einem Bakterienfärbeverfahren, um eine Assayprobe herzustellen. Wenn nur die Assayprobe, hergestellt unter Verwendung der Verdünnungsflüssigkeit 1, gemessen wird, dann müssen die Probe, Verdünnungsflüssigkeit II, und der Farbstoff nicht an die zweite Reaktionskammer 15 zur Verfügung gestellt werden. Die Assayproben, die in jeder Reaktionskammer vorbereitet wurden, fließen zu der Durchflusszelle 16 der nachfolgend beschriebenen Detektionseinheit 2.
Optischer Informationsdetektionsprozess
Die Detektionseinheit 2 detektiert Fluoreszenzlicht und gestreutes-Licht-Information von jedem Teilchen in der Assayprobe, und hat die Struktur des Durchflusszytometers, das in 4 gezeigt wird. Die Detektionseinheit 2 ist ausgestattet mit einer Durchflusszelle 16 für das Fließen der Assayproben, der Lichtquelle 19 zum Beleuchten der Assayprobe, welche durch die Durchflusszelle 16 mit Licht fließt, die Fotoverstärkerröhre 18 zum Erhalten des seitlich gestreuten Fluoreszenzlichts, ausgestrahlt von den Teilchen in der Assayprobe, und einer Fotodiode 17 zum Erhalten des vorwärts gestreuten Lichts. Eine rote Halbleiterlaserlichtquelle, welche Licht bei einer Wellenlänge von 630 nm ausstrahlt, wird als Lichtquelle 19 verwendet. Die Fotoverstärkerröhre 18 wandelt das detektierte Seitwärts-Fluoreszenzlicht fotoelektrisch um (d.h. wandelt Licht in elektrische Signal um), und gibt das Licht als laterales Fluoreszenzlichtsignal aus. Die Fotodiode 17 wandelt fotoelektrisch das detektierte vorwärts gestreute Licht um und gibt das Licht als vorwärts gestreute Lichtsignale aus. Diese Fotodetektionssignale werden an die Analyseeinheit 3 übermittelt. In der Detektionseinheit 2 mit der oben erwähnten Struktur werden Fluoreszenzlicht und gestreutes Licht generiert, in dem Maß, dass jedes Teilchen, das in der Assayprobe enthalten ist, die von dem Laserlicht, ausgestrahlt von der Lichtquelle 19, bestrahlte Region kreuzt. Das Seitwärts-Fluoreszenzlicht, welches durch die Fotoverstärkerröhre 18 aufgefangen wird, und das vorwärts gestreute Licht, welches aufgefangen wird durch die Fotodiode 17, werden der fotoelektrischen Umwandlung unterworfen, und ausgegeben an die Analyseeinheit 3 als optische Detektionssignale (d.h. Seitwärts-Fluoreszenzlichtsignale bzw. vorwärts gestreute Lichtsignale).
Analyseverfahren
Die Analyseeinheit 3 analysiert die optischen Detektionssignale jedes Teilchens, die von der Detektionseinheit 2 detektiert wurden, erzeugt ein zweidimensionales Scattergramm und zählt die Bakterien. Die Analyseeinheit 3 umfasst einen Computer, enthaltend CPU, ROM, RAM und dergleichen, und Schaltungen zum Verstärken der Signale und dem Eliminieren von Störungen. Die Analyseeinheit 3 analysiert die Signalintensität, die erhalten wird von den Spitzenwerten der optischen Detektionssignalpulse. Die Intensität des Fluoreszenzlichtsignals repräsentiert die Intensität des detektierten Fluoreszenzlichts von jedem Teilchen, und ist ein Parameter, der den Grad der Färbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff widerspiegelt. Die Intensität des vorwärts gestreuten Lichts stellt die Intensität des von jedem Teilchen detektierten vorwärts gestreuten Lichts dar, und ist ein Parameter, der die Größe der Teilchen widerspiegelt. Durch Kombinieren dieser Parameter kann ein zweidimensionales Scattergramm erzeugt werden, wie in 1 und 2 gezeigt. In den Scattergrammen wird die Anzahl der Bakterien erhalten durch Zählen der Blöcke von Teilchen, die innerhalb der Regionen auftreten, welche gesetzt wurden, um mit den Positionen des Auftretens von den lebenden bzw. den toten Bakterien und allen Bakterien zu korrespondieren. Die Analyseeinheit 3 hat eine LCD-Displayeinheit zum Ausgeben der Scattergramme, die zur Analyse erzeugt wurden und der Ergebnisse der Bakterienzählungen.
Die nachstehenden Beispiele 1 bis 5 wurden hergestellt unter Verwendung der Verdünnungsflüssigkeit I, Verdünnungsflüssigkeit II und Färbeflüssigkeit mit den oben beschriebenen Zusammensetzungen, und einer Bakterienzählvorrichtung mit der oben beschriebenen Struktur. Eine Zusammenfassung jedes Beispiels wird nachstehend zur Verfügung gestellt.
Beispiel 1: Eine Assayprobe I mit einem Unterschied in der Fluoreszenzlichtintensität zwischen lebenden und toten Bakterien, die in der Probe enthalten sind, wurde unter Verwendung der Verdünnungsflüssigkeit I und der Färbeflüssigkeit hergestellt, und die Probe wurde gemessen, um eine Zahl lebender bzw. toter Bakterien zu erhalten.
Beispiel 2: Eine Assayprobe II, in welcher alle Bakterien fluoreszenzgefärbt wurden, wurde hergestellt durch Prozessieren der gleichen Probe, die in Beispiel 1 verwendet worden war, mit der Verdünnungsflüssigkeit II (mit Tensid) und der Färbeflüssigkeit, und die Probe wurde gemessen, um die Gesamtzahl der Bakterien zu erhalten. Die Zahl der lebenden Bakterien wurde berechnet durch Abziehen der Zahl der toten Bakterien, erhalten in Beispiel 1, von der Gesamtbakterienzahl.
Beispiel 3: Eine Serie von Proben einer Mischung von festen Prozentsätzen von lebenden und toten Bakterien wurde gemessen, und das Verfahren zum Berechnen der lebenden Bakterienzahl durch Abziehen der toten Bakterienzahl von der Gesamtbakterienzahl wurde, wie in Beispiel 2, verwendet. Die Detektionsgenauigkeit wurde mit jener konventioneller Verfahren verglichen.
Beispiel 4: Eine vorherbestimmte Menge von Bakterien wurde zu einem Kulturmedium hinzugefügt, zu welchem ein Antibiotikum hinzugefügt worden war, und die Effektivität des Antibiotikums wurde getestet durch Messen der Anzahl von lebenden Bakterien in dem Medium über die Zeit. Die lebende Bakterienzahl wurde bestimmt unter Verwendung des Verfahrens der Berechnung der lebenden Bakterienzahl durch Subtrahieren der toten Bakterienzahl von der Gesamtbakterienzahl in derselben Weise wie in Beispiel 2.
Beispiel 5: Eine Harnprobe wurde gemessen unter Verwendung des Verfahrens der Berechnung der lebenden Bakterienzahl durch Subtrahieren der toten Bakterienzahl von der Gesamtbakterienzahl in derselben Weise wie in Beispiel 2.
Beispiel 1
Probenvorbereitung
Reine Kulturen von E. coli bzw. S. aureus wurden verwendet, um eine Serie von Proben 1 bis 6 von Mischungen, enthaltend feste Prozentsätze von lebenden und toten Bakterien, wie in Tabelle 1 nachstehend gezeigt, zu erhalten. Die Proben waren Suspensionen von Bakterien in einer heißen Infusionslösung. In jeder Serie war die Gesamtbakterienzahl (100 %) etwa 10⁵ Bakterien/ml (tote Bakterien wurden hergestellt durch Prozessieren von lebenden Bakterien mit Alkohol, Zentrifugieren, Eliminieren des Überstandes und Hinzufügen zu der Flüssigkultur).
Tabelle 1
Die Probe von E. coli, Serie 4, wurde gemessen unter Verwendung der in 3 gezeigten Vorrichtung. In der Reaktionskammer 14 der Assayprobenvorbereitungseinheit 1 wurde eine Assayprobe 1 hergestellt durch Prozessieren der Probe, Färbelösung und Verdünnungslösung I bei 40°C für 10 Sekunden in den unten gezeigten Verhältnissen.

Probe 50 μl

Verdünnungsflüssigkeit I 340 μl

Farbstoff 10 μl

Assayprobe I 400 μl
Die vorwärts gestreuten Lichtsignale und die Seitwärts-Fluoreszenzsignale von der Assayprobe I werden detektiert durch die Detektionseinheit 2, und ein zweidimensionales Scattergramm wird erzeugt durch die Analyseeinheit 3 unter Verwendung der Parameter der vorwärts gestreuten Lichtintensität und Seitwärts-Fluoreszenzlichtintensität. Auf dem Scattergramm werden Bereiche, welche die Blöcke der lebenden und toten Bakterien umfassen, gesetzt, und die Bakterienzahl in jeder Probe wird bestimmt durch Zählen der Blöcke in jedem Bereich. Das Scattergramm, erhalten von der Assayprobe I, wird in 5 gezeigt. In 5 ist der Bereich VIA1 der Bereich, in welchem lebende Bakterien auftreten, und der Bereich LD1 ist der Bereich, in welchem tote Bakterien auftreten. Obwohl tote Bakterien mit der Färbeflüssigkeit adäquat fluoreszenzgefärbt wurden, waren die lebenden Bakterien tatsächlich nicht mit dem Fluoreszenzfarbstoff gefärbt, so dass lebende Bakterien bzw. tote Bakterien als Populationen in den Bereichen VIA1 und LD1 in jedem Gating-Bereich auftraten.
Die Ergebnisse der Klassifikation und Zählung der lebenden Bakterien und toten Bakterien auf Basis des in 5 gezeigten Scattergramms zeigen, dass die Population der lebenden Bakterien 5,9 × 105 Bakterien/ml war, und die Population der toten Bakterien 7,1 × 105 Bakterien/ml war.
Messung durch andere Verfahren
(1) Die Probe von E. coli, Serie 4, wurde kultiviert unter Verwendung der Agarkulturmethode, und die lebenden Bakterien wurden gezählt. Die Zahl lebender Bakterien, die so erhalten wurde, war 4 × 10⁵ Bakterien/ml.
(2) Die Probe von E. coli, Serie 4, wurde gefärbt mit einem Fluoreszenzfarbstoff für die Gesamtbakterien und tote Bakterien unter Verwendung eines Baclight L-7012-Färbekits, hergestellt von Molecular Probes, Inc. Dann wurde die Serie 4-Probe gemessen unter Verwendung eines kommerziellen Durchflusszytometers (FACS Calibur; Becton-Dickinson, Inc.). Baclight L-7012 ist ein Kit, welcher einen grünen Fluoreszenzfarbstoff für die Gesamtzahl der Bakterien enthält, und einen roten Fluoreszenzfarbstoff für die Zahl der toten Bakterien. Die Zahl der lebenden Bakterien (erhalten durch Subtrahieren der toten Bakterienzahl von der Gesamtzahl der Bakterien) und die Zahl der toten Bakterien war 6 × 10⁵ Bakterien/ml bzw. 8 × 10⁵ Bakterien/ml.
Die lebende Bakterienzahl und die tote Bakterienzahl, erhalten durch die Verfahren, die Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpern, unter Verwendung derselben Probe, stimmte gut überein mit den Zahlen für lebende und tote Bakterien, erhalten durch die anderen Verfahren.
Beispiel 2
Unter den in Beispiel 1 hergestellten Proben wurde die E. coli-Probe, Serie 4, gemessen unter Verwendung der Vorrichtung, die in 3 gezeigt wird. In der zweiten Reaktionskammer 15 der Assayprobenvorbereitungseinheit 1 wurde eine Assayprobe II vorbereitet durch Prozessieren der Probe, des Farbstoffs und der Verdünnungsflüssigkeit II bei 40°C für 30 Sekunden in den nachstehend gezeigten Verhältnissen.

Probe 50 μl

Verdünnungsflüssigkeit II 340 μl

Farbstoff 10 μl

Assayprobe II 400 μl
Ein Scattergramm wurde erzeugt auf Basis der vorwärts gestreuten Lichtintensität und der Seitenfluoreszenzlichtintensität, erhalten von der Assayprobe II, wie in 6 gezeigt, in derselben Weise wie in Beispiel 1. In dem Scattergramm der 6 wurde ein Bereich, in welchem alle Bakterien auftreten, an derselben Position gesetzt wie die Region der toten Bakterien in dem Scattergramm von 5 (d.h. die Region LD1). Die Gesamtbakterien wurden gezählt unter Verwendung dieses Scattergramms. Die Gesamtbakterienzahl war 1,3 × 10⁶ Bakterien/ml. Wenn die Zahl toter Bakterie, erhalten von
5, abgezogen wurde von dieser Gesamtbakterienzahl, wurde eine Zahl lebender Bakterien von 5,9 × 10⁵ Bakterien/ml erhalten. Diese Zahl lebender Bakterien ist in guter Übereinstimmung mit der Zahl lebender Bakterien, erhalten aus dem Scattergramm von 5 und der Zahl lebender Bakterien, erhalten durch die anderen Verfahren.
Beispiel 3
Die Proben von E. coli, S. aureus und E. faecalis von Serie 1 bis 6, hergestellt in Beispiel 1, wurden prozessiert mit Farbstoff und Verdünnungsflüssigkeit I, in derselben Weise wie in Beispiel 1, um eine Assayprobe I zu erhalten, und prozessiert mit Farbstoff und Verdünnungsflüssigkeit II in derselben Weise wie in Beispiel 2, um eine Assayprobe II zu erhalten. Diese Assayproben wurden in derselben Weise wie in Beispiel 1 und 2 gemessen, und Scattergramme wurden erzeugt. Die Scattergramme für Serien 2 werden in 7 bis 9 gezeigt. E. coli wird in 7A, 7B und 7C gezeigt. S. aureus wird in 8A, 8B und 8C gezeigt. E. faecalis wird in 9A, 9B und 9C gezeigt.
In 7 bis 9 wurden 7A, 8A und 9A erhalten durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der Assayprobe I. In der Abbildung ist der Bereich, der mit VIA1 bezeichnet ist, der Bereich, in welchem lebende Bakterien auftreten, und der Bereich, welcher mit LD1 bezeichnet ist, der Bereich, in welchem tote Bakterien auftreten. In den 7 bis 9 wurden 7B, 8B und 9B erhalten durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der Assayprobe II. Der Bereich, der als LD1 bezeichnet ist, ist der Bereich, in welchem alle Bakterien auftreten. In den 7 bis 9 wurden 7C, 8C und 9C erhalten durch Färben der gleichen Probe unter Verwendung des Baclight L-7012-Färbekits (Molecular Probe, Inc.), und Messen der Bakterien unter Verwendung eines kommerziellen Durchflusszytometers (FACS Calibur; Becton-Dickinson, Inc.). Die vertikale Achse zeigt die Intensität des roten Fluoreszenzlichts, detektiert von toten Bakterien, und die horizontale Achse zeigt die Intensität des grünen Fluoreszenzlichts, detektiert von den gesamten Bakterien.
Die Zahl lebender Bakterien und die Zahl toter Bakterien in jeder Probe wurde erhalten durch Analysieren jedes Scattergramms, wie in Beispiel 2 beschrieben (die Zahl lebender Bakterien wurde berechnet durch Abziehen der Zahl toter Bakterien von der Gesamtzahl der Bakterien). Abbildungen, die den erhaltenen Prozentsatz lebender Bakterien und toter Bakterien in jeder Probe zeigen, werden in den 10A, 10B und 10C gezeigt. 10A zeigt E. coli, 10B zeigt S. aureus und 10C zeigt E. faecalis. Der Prozentsatz von lebenden Bakterien, erhalten aus der gleichen Probe durch das Agarkulturverfahren, wird auf derselben Abbildung gezeigt.
Die Prozentsätze der lebenden Bakterien, gemessen durch das Verfahren, welches Merkmale der vorliegenden Erfindung verwirklicht, stimmt genau überein mit den Prozentsätzen der lebenden Bakterien in jeder Serie, berechnet unter Verwendung der Agarkulturmethode. Jedoch unterschied sich der Prozentsatz der lebenden Bakterien, gemessen unter Verwendung des Baclight-Kits, von den Gesamtwerten, erhalten durch den Baclight-Kit in dem Fall von S. aureus.
Beispiel 4
(1) Eine abgemessene Menge (in etwa 105 Bakterien/ml) von Bakterien (E. coli) wurde zu einem kationischen Müller-Hinton-Flüssigmedium hinzugefügt mit einer fixierten Menge eines Antibiotikums (ABPC 8 μg/ml).
(2) Als eine Bakterienwachstumskontrolle wurde eine Flüssigkultur (ohne Antibiotikum) vorbereitet und die gleiche Menge von Bakterien, wie oben in (1), hinzugefügt.
(3) Die Medien von (1) und (2) wurden bei 35°C kultiviert.
(4) Proben wurden aus Kulturen (1) und (2) entnommen unmittelbar nach dem Hinzufügen der Bakterien (0 h), und 2 h, 4 h und 24 h nach dem Beginn der Kulturen. Dann wurde jede Probe gemessen durch die nachstehend beschriebenen Verfahren unter Verwendung der Vorrichtung, die in 3 gezeigt wird. Prozessieren der Probe aus Kultur (1)

Probe aus Kultur (1) 50 μl

Verdünnungsflüssigkeit I 340 μl

Farbstoff 10 μl

Assayprobe I 400 μl

(Reagieren gelassen für 10 Sekunden bei 40°C)

Probe aus Kultur (1)	50 μl
Verdünnungsflüssigkeit II	340 μl
Farbstoff	10 μl
Assayprobe II	400 μl

(Reagieren gelassen für 30 Sekunden bei 40°C)

Probe aus Kultur (2)	50 μl
Verdünnungsflüssigkeit II	340 μl
Farbstoff	10 μl
Assayprobe III	400 μl

(Reagieren gelassen für 30 Sekunden bei 40°C)

Die vorwärts gestreute Lichtintensität und Seiten-Fluoreszenzlichtintensität wurden detektiert von den Assayproben I, II und III in derselben Weise wie in Beispielen 1 und 2, und die Anzahl der Bakterien wurde gezählt. Die Zahl toter Bakterien wurde aus dem Scattergramm, erhalten von der Assayprobe I, erhalten, und die Gesamtzahl der Bakterien wurde erhalten aus den Scattergrammen der Assayprobe II und Assayprobe III. Die Zahl lebender Bakterien wurde erhalten durch Subtrahieren der toten Bakterienzahl von der Gesamtbakterienzahl der Assayproben II und III.
Des Weiteren wurde eine Zahl lebender Bakterien erhalten durch Messen der Proben, erhalten aus Kultur (1), über das Agarkulturverfahren als Vergleich mit den Verfahren, die Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpern. Zusätzlich wurde die Probe, erhalten aus Kultur (1), prozessiert mit dem Baclight L-7012-Färbekit (Molecular Probe, Inc.), und die lebenden Bakterien wurden gezählt unter Verwendung eines kommerziellen Durchflusszytometers (FACS Calibur; Becton-Dickinson, Inc.).
Die Ergebnisse werden in der Darstellung von 11 gezeigt. Wie in 11 gezeigt, hatte die Assayprobe III, welche kein Antibiotikum hinzugefügt hatte, eine Zunahme der Gesamtzahl der Bakterien. Die Zahl der lebenden Bakterien jedoch, welche aus der Agarkulturmethode erhalten wurde, zeigte eine deutliche Abnahme der Zahl lebender Bakterien 2 Stunden und mehr nach der Zugabe eines Antibiotikums. Die Gesamtbakterienzahl, nachdem Antibiotikum hinzugefügt worden war, erhalten aus der Assayprobe II, durch die Verfahren, die Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpern, war ungefähr gleich bleibend und zeigte nicht die Abnahme in der Zahl der lebendigen Bakterien. Jedoch stimmte die Zahl lebender Bakterien, nachdem Antibiotika hinzugefügt worden waren, erhalten aus den Assayproben I und II, durch die Verfahren, die Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpern, nahe überein mit der Zahl lebender Bakterien, erhalten durch die Agarkulturmethode, und zeigt, dass die Effizienz von Antibiotika untersucht werden kann unter Verwendung von Verfahren, die Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpern.
Beispiel 5
Harnprobenassay
Eine Harnprobe wurde unter Verwendung der Bakterienzählvorrichtung untersucht, die in 3 gezeigt wird. Unter Verwendung der Verdünnungsflüssigkeiten I und II und des Farbstoffs in der gleichen Weise wie in Beispielen 1 und 2, wurde eine Assayprobe I, prozessiert durch die Verdünnungsflüssigkeit, welche kein Tensid enthält, und eine Assayprobe II, prozessiert durch die Verdünnungsflüssigkeit, die ein Tensid enthält, vorbereitet und gemessen. Das Scattergramm, erhalten von dem Assay der Assayprobe I, wird in 12 gezeigt. In 12 ist der VIA1-Bereich der Bereich, in welchem lebende Bakterien auftreten, und der LD1-Bereich ist der Bereich, in welchem tote Bakterien auftreten. Das Scattergramm der Assayprobe II wird in 13 gezeigt. Der LD1-Bereich ist der Bereich, in welchem die toten Bakterien auftreten. In beiden Fällen stellt die vertikale Achse die vorwärts gestreute Lichtintensität dar, und die horizontale Achse stellt die Seiten-Fluoreszenzlichtintensität dar. Beispiel 5 umfasst Unreinheiten in der Probe, wie Debris (z.B. Zellüberreste von Leukozyten und dergleichen) und viskose Fäden, da die Ergebnisse für eine tatsächliche Harnprobe erhalten wurden. Daher traten in dem Scattergramm von 12 Unreinheiten in dem VIA1-Bereich auf, in welchem die lebenden Bakterien auftreten, so dass es schwierig ist, eine genaue Anzahl lebender Bakterien zu berechnen anhand des Scattergramms von 12 unter Verwendung der Analysemethode von Beispiel 1. Die Anzahl von Bakterien wurde bestimmt durch die Analysemethode von Beispiel 2 unter Verwendung des Scattergramms von 13. Eine Zahl toter Bakterien von etwa 3,8 × 10⁵/ml wurde erhalten aus dem Scattergramm von 12.
Eine Gesamtbakterienzahl von 6,8 × 10⁵/ml wurde erhalten aus dem Scattergramm von 13. Daher wurde eine Zahl lebender Bakterien von 3,0 × 10⁵/ml erhalten durch Abziehen der toten Bakterienzahl, erhalten aus dem Scattergramm von 12, von der Gesamtbakterienzahl, erhalten aus dem Scattergramm von 13.
Als eine Kontrolle wurde dieselbe Harnprobe prozessiert durch den Baclight L-7012-Färbekit (Molecular Probes, Inc.) und gemessen unter Verwendung eines kommerziellen Durchflusszytometers (FACS Calibur; Becton-Dickinson, Inc.). Das so erhaltene Scattergramm wird in 14 gezeigt. Die vertikale Achse stellt die Intensität des roten Fluoreszenzlichts dar, welche von den toten Bakterien detektiert wurde, und die horizontale Achse stellt die Intensität des grünen Fluoreszenzlichts dar, die von allen Bakterien detektiert wurde. In diesem Scattergramm bildeten die gefärbten Bakterien keine gut definierten Populationen, und die lebenden und die toten Bakterien konnten nicht klassifiziert und gezählt werden. Es wird angenommen, dass dies das Ergebnis der Färbung von Unreinheiten, außer den in der Harnprobe enthaltenen Bakterien, ist.
Wenn die gleiche Harnprobe untersucht wurde durch die Agarkulturmethode als eine Kontrolle, war die Zahl lebender Bakterien 2,7 × 10⁵/ml. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Verfahren und Vorrichtungen, die Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpern, eine Zahl lebender Bakterien ergeben, die nahe ist an jener, die sich aus dem Agarkulturverfahren ergibt, selbst wenn das Detektionsobjekt nicht eine aufgereinigte Probe ist, wie im Fall einer Harnprobe.
Die vorliegende Erfindung zählt lebende Bakterien und tote Bakterien in einer Probe durch Messen bei einer einzigen Wellenlänge. Da eine Gesamtbakterienzahl bestimmt werden kann durch ein Verfahren unter Verwendung eines Tensids, kann die zuvor erhaltene Zahl toter Bakterien und eine Zahl lebender Bakterien, erhalten von der Gesamtzahl der Bakterien, mit größerer Genauigkeit erhalten werden. Daher ist es möglich, die bakterizide Effektivität von Antibiotika rasch zu bestätigen, und die bakterizide Effektivität der Verarbeitung von Nahrungsmitteln. Des Weiteren kann, da es möglich ist, Bakterien schneller als durch herkömmliche Techniken zu detektieren, die Notwendigkeit für Kulturuntersuchungen schnell bestimmt werden in dem Fall von klinischen Proben und dergleichen. Zusätzlich ist die Vorbehandlung von Proben einfach und der Ablauf der Verfahrensschritte, umfassend Detektieren optischer Information von vorbereiteten Assayproben, bis zur Analyse kann komplett automatisiert werden, so dass die technischen Fähigkeiten des Benutzers oder das Verfahren das Analyseergebnis nicht beeinflussen werden.

Claims

Verfahren zum Zählen von Bakterien in einer klinischen Probe, umfassend: Herstellen einer ersten Meßprobe durch Teilen einer Probe in zumindest zwei Teile und Färben eines ersten Probenteils unter Verwendung eines ersten Fluoreszenzfarbstoffs, wodurch ein Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen lebenden und toten Bakterien erzeugt wird; Herstellen einer zweiten Meßprobe durch Färben aller Bakterien in einem zweiten Probenteil unter Verwendung eines zweiten Fluoreszenzfarbstoffs, der der gleiche oder ein anderer sein kann wie der erste Fluoreszenzfarbstoff, und eine oberflächenaktive Substanz; Detektieren einer ersten optischen Information umfassend Fluoreszenzlicht aus der ersten Meßprobe; Detektieren einer zweiten optischen Information umfassend Fluoreszenzlicht aus der zweiten Meßprobe; Klassifizieren und Zählen von toten Bakterien in der ersten Meßprobe basierend auf der ersten optischen Information; Klassifizieren und Zählen aller Bakterien in der zweiten Meßprobe basierend auf der zweiten optischen Information; und Berechnen einer Anzahl von lebenden Bakterien auf Basis der gesamten Bakterienanzahl erhalten aus der zweiten Meßprobe und einer toten Bakterienanzahl erhalten aus der ersten Meßprobe.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der erste Fluoreszenzfarbstoff einen Polymethinfarbstoff umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der zweite Fluoreszenzfarbstoff einen Polymethinfarbstoff umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der zweite Fluoreszenzfarbstoff identisch zum ersten Fluoreszenzfarbstoff ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die oberflächenaktive Substanz eine kationische oberflächenaktive Substanz umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Färbung bei einem pH von zwischen 2,5 und 4,5 durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die erste optische Information und die zweite optische Information Fluoreszenzlicht und gestreutes Licht umfaßt.
Bakterienzählvorrichtung zum Zählen von Bakterien in einer klinischen Probe, umfassend: einen Meßproben-Vorbereitungsteil, umfassend eine Probenbereitstellungsvorrichtung zum Bereitstellen einer ersten Probe und einer zweiten Probe aus der gleichen ursprünglichen Probe, zum Vorbereiten einer ersten Meßprobe durch Färben der ersten Probe unter Verwendung eines ersten Fluoreszenzfarbstoffs, wodurch ein Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen den lebenden und toten Bakterien erzeugt wird, und zum Herstellen einer zweiten Meßprobe durch Färben aller Bakterien der zweiten Probe unter Verwendung eines zweiten Fluoreszenzfarbstoffs, der der gleiche oder ein anderer sein kann wie der erste Fluoreszenzfarbstoff, und eine oberflächenaktive Substanz; eine Detektionseinheit zum Detektieren einer ersten optischen Information umfassend Fluoreszenzlicht aus der ersten Meßprobe und zum Detektieren einer zweiten optischen Information umfassend Fluoreszenzlicht aus der zweiten Meßprobe; und eine Analyseeinheit, welche Mittel hat zum Klassifizieren und Zählen von toten Bakterien in der ersten Meßprobe auf Basis der ersten optischen Information, zum Klassifizieren und Zählen aller Bakterien in der zweiten Meßprobe auf Basis der zweiten optischen Information und zum Berechnen einer Anzahl von lebenden Bakterien auf Basis einer gesamten Bakterienanzahl erhalten aus der zweiten Meßprobe und einer toten Bakterienanzahl erhalten aus der ersten Meßprobe.
Vorrichtung gemäß Anspruch 8, worin besagte Meßproben-Vorbereitungseinheit umfaßt: eine erste Kammer zum Enthalten der ersten, durch die Probenbereitstellungsvorrichtung bereitgestellten Probe, eine zweite Kammer zum Enthalten der zweiten, durch die Probenbereitstellungsvorrichtung bereitgestellten Probe, einen Farbstoffbehälter zum Enthalten einer Farbstoffflüssigkeit zum Bereitstellen an die erste und zweite Kammer, und einen Flüssigkeitsbehälter zum Enthalten einer Flüssigkeit enthaltend eine oberflächenaktive Substanz zum Bereitstellen an die zweite Kammer, worin eine erste Meßprobe hergestellt wird in der ersten Kammer durch Mischen der ersten Probe und der Farbstoffflüssigkeit, die bereitgestellt wird von dem Farbstoffbehälter, und eine zweite Meßprobe in der zweiten Kammer hergestellt wird durch Mischen der zweiten Probe, der Farbstoffflüssigkeit, die bereitgestellt wird von dem Farbstoffbehälter und der Flüssigkeit enthaltend eine oberflächenaktive Substanz, bereitgestellt von dem Flüssigkeitsbehälter.
Vorrichtung gemäß Anspruch 8 oder 9, worin der erste Fluoreszenzfarbstoff einen Polymethinfarbstoff umfaßt.
Vorrichtung gemäß Anspruch 8 oder 9, worin der zweite Fluoreszenzfarbstoff einen Polymethinfarbstoff umfaßt.
Vorrichtung gemäß Anspruch 8 oder 9, worin der zweite Fluoreszenzfarbstoff identisch zu dem ersten Fluoreszenzfarbstoff ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 8 oder 9, worin die oberflächenaktive Substanz eine kationische oberflächenaktive Substanz enthält.
Vorrichtung gemäß Anspruch 8 oder 9, worin die Färbung bei einem pH von zwischen 2,5 und 4,5 durchgeführt wird.
Vorrichtung gemäß Anspruch 8 oder 9, worin die erste optische Information und die zweite optische Information Fluoreszenzlicht und gestreutes Licht enthält.
Verwendung eines Reagenskits zum Zählen von Bakterien, umfassend: eine erste Verdünnungsflüssigkeit frei von einer oberflächenaktiven Substanz; eine zweite Verdünnungsflüssigkeit enthaltend eine oberflächenaktive Substanz; und eine Farbstoffflüssigkeit enthaltend einen Fluoreszenzfarbstoff in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.
Verwendung gemäß Anspruch 16, worin der Fluoreszenzfarbstoff einen Polymethinfarbstoff umfaßt.
Verwendung gemäß Anspruch 16, worin die oberflächenaktive Substanz eine kationische oberflächenaktive Substanz umfaßt.
Verwendung gemäß Anspruch 16, worin sowohl die erste als auch die zweite Verdünnungsflüssigkeit einen pH im Bereich von 2,0 bis 4,5 hat.
Verwendung gemäß Anspruch 16, worin sowohl die erste als auch die zweite Verdünnungsflüssigkeit ein Reduziermittel für salpetrige Säure enthält.