DE60312997T2

DE60312997T2 - Nf-kb-inhibitoren

Info

Publication number: DE60312997T2
Application number: DE60312997T
Authority: DE
Inventors: James F. King of Prussia CALLAHAN; Zehong King of Prussia WAN
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 2002-06-06
Filing date: 2003-05-29
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2023-05-30
Also published as: JP2005532359A; WO2003104219A1; EP1532135A1; ES2285125T3; US20060058371A1; ATE358673T1; DE60312997D1; EP1532135B1; US7300952B2; EP1532135A4; AU2003240935A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft im allgemeinen ein Verfahren zur Inhibition der pathologischen Aktivierung des Transkriptionsfaktor NF-κB (nukleärer Faktor κB) unter Verwendung von Aminobenzothiophen-Verbindungen. Solche Verfahren sind insbesondere zur Behandlung von Erkrankungen nützlich, an denen eine Aktivierung von NF-κB implizit beteiligt ist. Genauer gesagt können diesen Verfahren verwendet werden um die IKK-β (IκB-Kinase-β, auch bekannt als IKK-2) Phosphorylierung von IκB (inhibitorisches Protein κB) zu inhibieren, was einen darauffolgenden Abbau und Aktivierung von NF-κB-Dimeren verhindert. Solche Verfahren sind für die Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen nützlich, die mit einer NF-κB-Aktivierung assoziiert sind, einschließlich entzündlicher und Gewebsreparaturstörungen, insbesondere rheumatoider Arthritis, chronischer entzündlicher Darmerkrankung, Asthma und COPD (chronisch obstruktive Lungenkrankheit), Osteoarthritis, Osteoporose und fibrotischen Erkrankungen, Dermatose einschließlich Psoriasis, Neurodermitis und ultravioletten Strahlungs-(UV)-induzierten Hautschäden, Autoimmunerkrankungen einschließlich systemischem Lupus erythematosus, multipler Sklerose, psoriatischer Arthritis, ankylosierender Spondylitis, Gewebs- und Organabstoßung, Alzheimerscher Erkrankung, Schlaganfall, Atherosklerose, Restenose, Diabetes, Glomerulonephritis, Krebs einschließlich der Hodgkin-Krankheit, Cachexie, einer mit Infektion assoziierten Entzündung und bestimmten viralen Infektionen einschließlich dem erworbenen Immundefizienzsyndrom (AIDS), dem Atemnotsyndrom beim Erwachsenen und einer Ataxia telangiectasia.
Hintergrund der Erfindung
Kürzliche Fortschritte in der Wissenschaft bezüglich Mediatoren, die an akuten und chronischen entzündlichen Erkrankungen und Krebs beteiligt sind, haben zu neuen Strategien bei der Suche nach effektiven Therapeutika geführt. Traditionelle Ansätze beinhalteten direkte Zielinterventionen, wie zum Beispiel die Verwendung spezifischer Antikörper, Rezeptorantagonisten oder Enzyminhibitoren. Ein Durchbruch der letzten Zeit bei der Aufklärung regulatorischer Mechanismen, die an der Transkription und Translation einer Vielzahl von Mediatoren beteiligt sind, haben zu einem gestiegenen Interesse an den therapeutischen Ansätzen geführt, die auf das Niveau der Gentranskription gerichtet sind.
Der nukleäre Faktor κB (NF-κB) gehört zu einer Familie von eng verwandten dimeren Transkriptionsfaktorkomplexen, die aus verschiedenen Kombinationen der Rel/NF-κB-Familie von Polypeptiden gehören. Die Familie besteht aus fünf individuellen Genprodukten bei Säugern RelA (p65), NF-κB1 (p50/p105), NF-κB2 (p49/p100), c-Rel und RelB, von denen alle Hetero- oder Homodimere bilden können. Diese Proteine teilen sich eine hoch homologe 300 Aminosäure-"Rel Homologiedomäne", die die DNA-Bindung und Dimerisierungsdomänen enthält. Am extremen C-Terminus der Rel-Homologiedomäne befindet sich eine nukleäre Translokationssequenz, die beim Transport von NF-κB vom Cytoplasma zum Kern wichtig ist. Zusätzlich besitzen p65 und cRel starke Transaktivierungsdomänen an ihren C-terminalen Enden.
Die Aktivität von NF-κB wird durch seine Wechselwirkung mit einem Mitglied der Inhibitor IκB-Familie von Proteinen reguliert. Diese Interaktion blockiert effektiv die nukleäre Lokalisierungssequenz der NF-κB-Proteine und verhindert so eine Migration des Dimers zum Kern. Eine breite Vielzahl von Stimuli aktiviert NF-κB über was vermutlich multiple Signaltransduktionswege sind. Beinhaltet sind bakterielle Produkte (LPS), einige Viren (HIV-1, HTLV-1), entzündliche Cytokine (TNFα, IL-1), Umweltund oxidativer Streß und DNA-schädigende Mittel. Offensichtlich ist allen Stimuli jedoch die Phosphorylierung und der darauffolgende Abbau von IκB gemeinsam. IκB wird an zwei N-terminalen Serinen durch die kürzlich identifizierten IκB-Kinasen (IKK-α und IKK-β) phosphoryliert. Ortsgerichtete Mutagenesestudien zeigen an, daß diese Phosphorylierungen für die darauffolgende Aktivierung von NF-κB darin kritisch sind, daß sie sobald sie phosphoryliert sind, das Protein für einen Abbau über den Ubiquitin-Proteasomen Weg markiert ist. Frei von IκB sind die aktiven NF-κB-Komplexe dazu in der Lage sich zum Kern zu translozieren, wo sie auf selektive Weise an bevorzugte genspezifische Enhancersequenzen binden. Beinhaltet in den durch NF-κB regulierten Genen ist eine Anzahl von Cytokinen und Chemokinen, Zelladhäsionsmolekülen, Akutphasenproteine, immunregulatorische Proteine, Eicosanoid-metabolisierende Enzyme und anti-Apoptose Gene.
Es ist wohlbekannt, daß NF-κB eine Schlüsselrolle bei der regulierten Expression einer großen Anzahl von pro-inflammatorischen Mediatoren einschließlich Cytokinen spielt, wie z.B. TNF, IL-1β, IL-6 und IL-8, Zelladhäsionsmolekülen wie ICAM und VCAM und der induzierbaren Stickoxidsynthase (iNOS). Es ist bekannt, daß solche Mediatoren eine Rolle bei der Anziehung von Leukozyten zu Entzündungsstellen spielen und im Fall von iNOS kann dies zu einer Organzerstörung bei einigen entzündlichen und Autoimmunerkrankungen führen.
Die Wichtigkeit von NF-κB bei entzündlichen Störungen wird weiter durch Studien von Luftwegentzündungen einschließlich dem Asthma gestärkt, wobei gezeigt wurde, daß NF-κB aktiviert wurde. Diese Aktivierung könnte der erhöhten Cytokinproduktion wie auch den Leukozyteninfiltrationseigenschaften dieser Störungen zugrunde liegen. Es ist zusätzlich bekannt, daß inhalierte Steroide die Luftwegshyperreaktivität reduzieren und die entzündliche Reaktion in den asthmatischen Luftwegen unterdrücken. Im Lichte der kürzlichen Feststellungen im Hinblick auf die Glucocorticoid-Inhibition von NF-κB kann man spekulieren, daß diese Wirkungen durch eine Inhibition von NF-κB vermittelt werden.
Weitere Hinweise auf eine Rolle von NF-κB bei entzündlichen Störungen ergeben sich aus Studien der rheumatoiden Gelenkhaut. Obwohl NF-κB normalerweise als inaktiver cytoplasmatischer Komplex vorliegt, haben kürzliche immunhistochemische Studien angezeigt, daß NF-κB in den Kernen vorliegt und daher in den Zellen aktiv ist, die die rheumatoide Gelenkhaut umfassen. Weiterhin wurde gezeigt, daß NF-κB in menschlichen Synovialzellen als Reaktion auf eine Stimulierung mit TNF-α oder Il-1β aktiviert wird. Eine solche Verteilung kann der zugrundeliegende Mechanismus für die erhöhte Cytokin- und Eicosanoid-Produktionseigenschaften dieses Gewebes sein. Siehe Roshak, A.K. et al., J. Biol. Chem. 271, 31496–31501 (1996). Die Expression von IKK-β wurde in Synoviozyten von Patienten mit rheumatoider Arthritis dargestellt und Gentransferstudien haben die zentrale Rolle von IKK-β in der stimulierten entzündlichen Mediatorproduktion dieser Zellen demonstriert. Siehe Aupperle et al., J. Immunology 1999, 163: 427–433 und Aupperle et al., J. Immunology 2001; 166: 2705–11. In der letzteren Zeit wurde gezeigt, daß die intraartikuläre Verabreichung eines Wildtyp-IKK-β-Adenovirus-Konstrukts ein Anschwellen der Pfoten auslöst, während eine intraartikuläre Verabreichung von dominant-negativem IKK-β die Adjuvans-induzierte Arthritis bei der Ratte inhibierte. Siehe Tak et al., Arthritis and Rheumatism 2001; 44: 1897–1907.
Es ist auch wahrscheinlich, daß die NF-κB/Rel- und IκB-Proteine eine Schlüsselrolle bei der neoplastischen Transformation und Metastase spielen. Familienmitglieder sind mit einer Zelltransformation in vitro und in vivo als Ergebnis einer Überexpression, Genamplifikation, Genumanordnungen oder Translokationen assoziiert. Zusätzlich wird eine Umanordnung und/oder Amplifikation der Gene, die diese Proteine codieren bei 20 bis 25 % bestimmter menschlicher Lymphoidtumoren beobachtet. Weiterhin wird NF-κB durch onkogene Ratten aktiviert, dem häufigsten Defekt bei menschlichen Tumoren und eine Blockade der NF-κB-Aktivierung inhibiert eine rasvermittelte Zelltransformation. Zusätzlich wurde über eine Rolle von NF-κB bei der Regulation der Apoptose berichtet, was die Rolle dieses Transkriptionsfaktors bei der Regulation der Tumorzellproliferation unterstreicht. TNF, ionisierende Strahlung und DNA-schädigende Mittel aktivieren ebenfalls erwiesenermaßen NF-κB, was wiederum zu der hochregulierten Expression etlicher Anti-Apoptoseproteine führt. Demgegenüber wurde gezeigt, daß die Inhibition von NF-κB das apoptotische Abtöten durch diese Mittel bei etlichen Tumorzelltypen verstärkt. Da dies vermutlich einen Hauptmechanismus der Tumorzellresistenz gegenüber einer Chemotherapie repräsentiert, können Inhibitoren der NF-κB-Aktivierung nützliche Chemotherapeutika entweder einzeln oder in einer Hilfsmitteltherapie sein. Kürzliche Berichte haben NF-κB als Inhibitor der Skelettzelldifferenzierung wie auch als Regulator des Cytokin-induzierten Muskelschwunds impliziert (Guttridge et al., Science; 2000; 289; 2363–2365), was das Potential der NF-κB-Inhibitoren al neue Krebstherapie weiter unterstützt.
Etliche NF-κB-Inhibitoren werden bei C. Wahl et al., J. Clin. Invest. 101(5), 1163–1174 (1998), R.W. Sullivan et al., J. Med. Chem. 41, 413–419 (1998), J.W. Pierce et al., J. Biol. Chem. 272, 21096–21103 (1997) beschrieben.
Das marine natürliche Produkt Hymenialdisin inhibiert bekanntlich NFκB. Roshak, A. et al., JPET, 283, 955–961 (1997), Breton, J.J. und Chabot-Fletcher, M.C., JPET, 282, 459–466 (1997).
Zusätzlich wurden Patentanmeldungen im Hinblick auf Aminothiophen-Inhibitoren von IKK-2 eingereicht, siehe Callahan, et al., WO 2002030353; Baxter et al., WO 2001058890, Faull et al., WO 2003010158; Griffith et al., WO 2003010163; Fancelli et al., WO 200198290; Imidazol-Inhibitoren von IKK-2, siehe Callahan et al., WO 200230423; Anilinophenylpyrimidin-Inhibitoren von IKK-2, siehe Kois et al., WO 2002046171; β-Carbolin-Inhibitoren von IKK-2, siehe Ritzeler et al., WO 2001068648, Ritzeler et al., EP 1134221 ; Nielsch et al., DE 19807993 ; Ritzeler et al., EP 1209158 ; Indol-Inhibitoren von IKK-2, siehe Ritzeler et al., WO 2001030774; Benzimidazol-Inhibitoren von IKK-2, siehe Ritzeler et al., DE 19928424 ; Ritzeler et al., WO 2001000610; Aminopyridin-Inhibitoren von IKK-2, siehe Lowinger et al., WO 2002024679; Murata et al., WO 2002024693; Murata et al., WO 2002044153; Pyrazolachinazolin-Inhibitoren von IKK-2, siehe Beaulieu et al., W0 2002028860; Burke et al., WO 2002060386, Burke et al., US 20030022898 ; Chinolin-Inhibitoren von IKK-2, Browner et al., WO 2002041843, Browner et al., US 20020161004 und Pyridylcyanoguanidin-Inhibitoren von IKK-2, siehe Bjorkling et al., WO 2002094813, Binderup et al., WO 2002094322 und Madsen et al., WO 200294265. Die natürlichen Produkte Staurosporin, Quercetin, K252a und K252b sind erwiesenermaßen IKK-2-Inhibitoren, siehe Peet, G.W. und Li, J.J. Biol. Chem. 274, 32655–32661 (1999) und Wisniewski, D. et al., Analytical Biochem. 274, 220–228 (1999). Synthetische Inhibitoren von IKK-2 wurden ebenfalls beschrieben, siehe Burke et al., J. Biol. Chem, 278, 1450–1456 (2003) und Murata et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 13, 913–198 (2003) haben 2KK-2-Inhibitoren beschrieben.
Das US-Patent Nr. 3,963,750 beschreibt die Herstellung bestimmter Aminothiophene. Die EP 0747052 beschreibt Modulatoren des NF-κB-Transkriptionsfaktors mit einem Benzothiophen-Bestandteil.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung involviert neue Verbindungen und ein neues Verfahren zur Inhibition der Aktivierung des Transkriptionsfaktor NF-κB unter Verwendung der vorliegenden Verbindungen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen bereitzustellen, die durch Veränderung der Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB therapeutisch modifiziert werden können.
Dementsprechend stellt diese Erfindung in einem ersten Aspekt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend eine Verbindung gemäß Formel (I).
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen bereit, worin die Erkrankungspathologie therapeutisch durch Inhibition der Phosphorylierung und dem darauffolgenden Abbau von IκB durch IKK-β modifiziert werden kann.
In noch einem weiteren Aspekt stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen bereit, wobei die Erkrankungspathologie therapeutisch durch Inhibition der pathologischen Aktivierung von NF-κB modifiziert werden kann.
In einem besonderen Aspekt stellt diese Erfindung Verfahren zur Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen bereit, die mit einer NF-κB-Aktivierung assoziiert sind, einschließlich entzündlichen und Gewebsreparaturstörungen, insbesondere rheumatoider Arthritis, chronischer entzündlicher Darmerkrankung, Asthma und COPD (chronisch obstruktive Lungenkrankheit), Osteoarthritis, Osteoporose und fibrotischen Erkrankungen, Dermatose einschließlich Psoriasis, Neurodermitis und ultravioletten Strahlungs-(UV)-induzierten Hautschäden, Autoimmunerkrankungen einschließlich systemischem Lupus erythematosus, multipler Sklerose, psoriatischer Arthritis, ankylosierender Spondylitis, Gewebs- und Organabstoßung, Alzheimerscher Erkrankung, Schlaganfall, Atherosklerose, Restenose, Diabetes, Glomerulonephritis, Krebs einschließlich der Hodgkin-Krankheit, Cachexie, einer mit Infektion assoziierten Entzündung und bestimmten viralen Infektionen einschließlich dem erworbenen Immundefizienzsyndrom (AIDS), dem Atemnotsyndrom beim Erwachsenen und einer Ataxia telangiectasia.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden aus Formel (I) unten gewählt:
R₁ bedeutet CONH₂;
R₂ bedeutet NR₄R₅;
R₃ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, CN, CF₃, Halogen, Aryl, Heteroaryl, Alkyl, O-Alkyl und S-Alkyl und kann an entweder C₄, C₅, C₆ oder C₇ angebunden sein;
R₄ bedeutet H oder Alkyl; und
R₅ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, CO-Alkyl, SO₂-Alkyl, CONH₂, CONH-Alkyl, CONH-Aryl, CONH-Heteroaryl, CSNH₂, CSNH-Alkyl, CSNH-Aryl, CSNH-Heteroaryl, SO₂NH₂, SO₂NH-Alkyl, SO₂NH-Aryl und SO₂NH-Heteroaryl,
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Bevorzugte Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, beinhalten: 2-Amino-6-(4-fluor-phenyl)-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureamid und 2-Ureido-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureamid.
Diese Erfindung stellt Verfahren zur Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen bereit, die mit einer NF-κB-Aktivierung assoziiert sind, einschließlich entzündlichen und Gewebsreparaturstörungen, insbesondere rheumatoider Arthritis, chronischer entzündlicher Darmerkrankung, Asthma und COPD (chronisch obstruktive Lungenkrankheit), Osteoarthritis, Osteoporose und fibrotischen Erkrankungen, Dermatose einschließlich Psoriasis, Neurodermitis und ultravioletten Strahlungs-(UV)-induzierten Hautschäden, Autoimmunerkrankungen einschließlich systemischem Lupus erythematosus, multipler Sklerose, psoriatischer Arthritis, ankylosierender Spondylitis, Gewebs- und Organabstoßung, Alzheimerscher Erkrankung, Schlaganfall, Atherosklerose, Restenose, Diabetes, Glomerulonephritis, Krebs einschließlich der Hodgkin-Krankheit, Cachexie, einer mit Infektion assoziierten Entzündung und bestimmten viralen Infektionen einschließlich dem erworbenen Immundefizienzsyndrom (AIDS), dem Atemnotsyndrom beim Erwachsenen und einer Ataxia telangiectasia.
Definitionen
Die vorliegende Erfindung beinhaltet alle Hydrate, Solvate und Komplexe sowie Prodrugs der Verbindungen dieser Erfindung. Prodrugs sind jegliche kovalent gebundenen Verbindungen, die das aktive Elternarzneimittel gemäß Formel (I) in vivo freisetzen. Wenn ein chirales Zentrum oder eine andere Form eines isomeren Zentrums in einer Verbindung der vorliegenden Erfindung vorliegt, sollen alle Formen eines solchen Isomers oder von Isomeren, einschließlich Enantiomeren und Diastereomeren hier mit umfaßt sein. Erfinderische Verbindungen, die ein chirales Zentrum enthalten, können als racemische Mischung verwendet werden, als enantionmer angereicherte Mischung oder die racemische Mischung kann unter Verwendung wohlbekannter Techniken getrennt werden und ein individuelles Enantiomer kann allein verwendet werden. In den Fällen, in denen die Verbindungen ungesättigte Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen aufweisen liegen sowohl die cis-(Z)- als auch trans-(E)-Isomeren im Umfang dieser Erfindung. In den Fällen, in denen die Verbindungen in tautomeren Formen existieren können, wie z.B. Keto-Enol-Tautomere, ist jede tautomere Form als in dieser Erfindung beinhaltet umfaßt, egal ob sie im Gleichgewicht oder vorherrschend in einer Form existiert.
Die Bedeutung von jedem Substituenten bei jedem Auftreten in Formel (I) oder irgendeiner Unterformel davon ist unabhängig von seiner Bedeutung oder irgendeiner anderen Bedeutung eines Substituenten bei einem anderen Auftreten, falls nicht anders angegeben.
Wie hier verwendet, bezieht sich "Alkyl" auf eine optional substituierte Kohlenwasserstoff-Gruppe, gebunden durch einzelne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen und mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, die miteinander verbunden sind. Die Alkylkohlenwasserstoff-Gruppe kann linear, verzweigt oder cyclisch, gesättigt oder ungesättigt sein. Substituenten an optional substituiertem Alkyl werden aus der Gruppe gewählt, bestehend aus Aryl, OH, O-Alkyl, CO, Halogen, CF₃ und OCF₃.
Wie hier verwendet, bezieht sich "Aryl" auf eine optional substituierte aromatische Gruppe mit mindestens einem Ring mit einem konjugierten pi-Elektronensystem, enthalten bis zu zwei konjugierte oder kondensierte Ringsysteme. Aryl beinhaltet carbocyclische Aryl- und Biaryl-Gruppen, die alle optional substituiert sein können. Substituenten werden aus der Gruppe gewählt, bestehend aus Halogen, C_1-4-Alkyl, NH₂, OCF₃, CF₃, O-Alkyl, S-Alkyl, CN, CHO, SO₂-Alkyl und NO₂.
Wie hier verwendet bezieht sich "Heteroaryl" auf eine optional substituierte aromatische Gruppe, wobei mindestens ein Ring ein konjugiertes pi-Elektronensystem aufweist, enthaltend bis zu zwei konjugierte oder kondensierte Ringsysteme und 1 bis 3 Heteroatome, gewählt aus O, S und N. Heteroaryl beinhaltet carbocyclische Heteroarylaryl-, Arylheteroaryl- und Biheteroarylaryl-Gruppen, die alle optional substituiert sein können. Ein bevorzugtes Aryl beinhaltet Phenyl und Naphthyl. Ein noch bevorzugteres Aryl beinhaltet Phenyl. Bevorzugte Substituenten werden gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Halogen, C_1-4-Alkyl, NH₂, OCF₃, CF₃, O-Alkyl, S-Alkyl, CN, CHO, SO₂-Alkyl und NO₂. Beispiele für Heteroarylringe beinhalten Pyrrol, Furan, Thiophen, Indol, Isoindol, Benzofuran, Isobenzofuran, Benzothiophen, Pyridin, Chinolin, Isochinolin, Chinolizin, Pyrazol, Imidazol, Isoxazol, Oxazol, Isothiazol, Thiazol, Pyridazin, Pyrimidin und Pyrazin.
Wie hier verwendet bezieht sich "Halogen" auf F, Cl, Br und I.
Herstellungsverfahren
Die folgenden Verfahren und Beispiele sollen die vorliegende Erfindung illustrieren jedoch auf keine Weise begrenzen.
Die allgemeine Herstellung von Analogen von 2-Aminobenzothiophen-3-carbonsäureamid ist in Schema I dargestellt.
Die Synthese beginnt mit kommerziell erhältlichem Ethyl-2-amino-4,5,6,7-tetrahydrobenzothiophen-3-carboxylat (1). Der Schutz der Amino-Gruppe mit Acetylchlorid (AcCl) und eine Oxidation mit 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-1,4-benzochinon (DDQ) stellt Benzothiophen 3 bereit. Die Entfernung der Schutzgruppe des Acetamids, gefolgt von einer Bromierung mit N-Bromsuccinimid (NBS) stellt 2-Aminobenzothiophen 5 bereit. Ein Palladium(0)-vermittelte Suzuki-Kreuzkupplung mit Boronsäure/Ester ergibt dann 6. Einen neuerlichen Schutz der Amino-Gruppe mit Di-tert-butyldicarbonat [(Boc)₂O] und eine Hydrolyse der Ester-Gruppe erzeugt die Säure 8. Die resultierende Säure wird mit 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI) aktiviert, gefolgt von einer Umsetzung mit Ammoniumhydroxid und einer Behandlung mit Trifluoressigsäure (TFA), um dann 2-Amino-benzothiophen-3-carbonsäureamid 10 zu ergeben. Verbindung 10 kann einfach in den primären Harnstoff 11 durch Umsetzung mit Chlorsulfonylisocyanat umgewandelt werden oder in substituierten Harnstoff 12 durch Isocyanate (Schema II).
Schema I
Schema II
Harnstoff 15 wird aus 2-Amino-benzo[b]thiophen-3-carbonitril (13, Schema III) unter Verwendung eines zweistufigen Verfahrens synthetisiert; eine Nitrilhydrolyse gefolgt von einer Harnstoffbildung. Schema III
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung illustrieren jedoch auf keine Weise begrenzen.
Beispiele und Versuchsmaterialien
Allgemein
Die kernmagnetischen Resonanzspektren wurden mit entweder 250, 300 oder 400 MHz unter Verwendung von entweder einem Bruker AM 250-, Bruker ARX 300- oder Bruker AC 400-Spektrometer aufgezeichnet. CDCl₃ ist Deuteriochloroform, DMSO-d₆ ist Hexadeuteriodimethylsulfoxid und CD₃OD ist Tetradeuteriomethanol. Chemische Shifts werden als Teile pro Million (d) feldabwärts von dem inneren Standart Tetramethylsilan berichtet. Abkürzungen für die NMR-Daten sind wie folgt: s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, q = Quartett, m = Multiplett, dd = Dublett von Dubletts, dt = Dublett von Tripletts, app = anscheinend, br = breit. J zeigt die NMR-Kupplungskonstante, gemessen in Hertz, an. Kontinuierliche Wellen-Infrarot (IR)-Spektren wurden auf einem Perkin-Elmer 683 Infrarotspektrometer aufgezeichnet und die Fourier-Transform-Infrarot (FTIR)-Spektren wurden auf einem Nicolet Impact 400 D Infrarot-Spektrometer aufgezeichnet. Die IR- und FTIR-Spektren wurden im Transmissionsmodus aufgezeichnet und die Bandenpositionen wurden als inverse Wellenzahlen (cm ^–1) angegeben. Die Massenspektren wurden auf entweder einem VG 70 FE-, PE Syx API III- oder VG ZAB HF-Instrument unter Verwendung von Fast-Atom-Bombardment (FAB) oder Elektrospray-(ES)-Ionisierungstechniken genommen. Die Elementaranalysen wurden unter Verwendung eines Perkin-Elmer 240C-Elementaranalysators erhalten. Die Schmelzpunkte wurden auf einem Thomas-Hoover-Schmelzpunktapparat genommen und sind nicht korrigiert. Alle Temperaturen werden in Grad Celsius angegeben.
Analtech Silica Gel GF und E. Merck Silica Gel 60 F-254-Dünnschichtplatten wurden für die Dünnschichtchromatographie verwendet. Sowohl Flash als auch Schwerkraftchromatographie wurden auf E. Merck Kieselgel 60 (230–400 mesh) Silicagel durchgeführt.
Wo angegeben, wurden bestimmte Materialien von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, TCI America, Portland, OR, erworben.
Beispiel 1
Herstellung von 2-Amino-6-(4-fluor-phenyl)-benzo[b]thiophen-2-carbonsäureamid
1a) 2-Acetylamino-4,5,6,7-tetrahydrobenzothiophen-3-carbonsäureethylester
Zu einer Lösung aus Ethyl-2-amino-4,5,6,7-tetrahydrobenzothiophen-3-carboxylat (16 g, 71,1 mmol) in THF (100 ml) wurden 4-(Dimethylamino)pyridin (434 mg, 3,55 mmol) und Acetylchlorid (6,1 ml, 85,3 mmol) zugefügt. Nach zweistündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung mit Solelösung (500 ml) verdünnt und mit Ethylacetat (500 ml, 3×) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO₄ getrocknet, gefiltert und konzentriert, um die Titelverbindung (18,3 g, 96 %) als hellgelben Feststoff bereitzustellen:
MS (ES) m/z 268 (M+H)⁺.
1b) 2-Acetylamino-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureethylester
Eine Lösung aus 1a (3,0 g, 11,24 mmol) in Benzol (100 ml) wurde mit 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-1,4-benzochinon (3,8 g, 16,85 mmol) vermischt. Die resultierende Mischung wurde im Rückfluß 2 h erwärmt, mit gesättigter NaHCO₃-Lösung (300 ml) verdünnt und mit Ethylacetat (300 ml, 3×) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO₄ getrocknet, gefiltert und konzentriert. Eine Flash-Chromatographie (Hexan/Ethylacetat, 8:1) ergab dann die Titelverbindung (1,06 g, 35 %) als gelben Feststoff:
MS (ES) m/z 264 (M+H)⁺;
1c) 2-Amino-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureethylester
Zu einer Lösung aus 1b (1,06 g, 4,03 mmol) in Toluol (100 ml) wurde Pyrrolidin (5 ml) zugefügt. Die resultierende Mischung wurde 8 h auf 100°C erwärmt, mit Solelösung (200 ml) verdünnt und mit Ethylether (300 ml, 3×) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO₄ getrocknet, gefiltert und konzentriert. Eine Flash-Chromatographie (Hexan/Ethylacetat, 4:1) ergab dann die Titelverbindung (0,76 g, 85 %) als gelben Feststoff:
MS (ES) m/z 222 (M+H)⁺;
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8,14 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,53 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,28 (m, 1H), 7,04 (m, 1H), 6,51 (brs, 2H), 4,45 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 1,50 (t, J = 7,2 Hz, 3H).
1d) 2-Amino-6-Brom-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureethylester
Zu einer Lösung aus 1c (760 mg, 3,44 mmol) in CHCl₃ (10 ml) wurde N-Bromsuccinimid (673 mg, 3,78 mmol) zugefügt. Die resultierende Mischung wurde 1 h gerührt, dann mit gesättigter NaHCO₃-Lösung (100 ml) vermischt und mit Methylenchlorid (100 ml, 3×) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO₄ getrocknet, gefiltert und konzentriert. Eine Flash-Chromatographie (Hexan/Ethylacetat, 4:1) ergab dann die Titelverbindung (930 mg, 90 %) als gelben Feststoff:
MS (ES) m/z 300 (M+H)⁺;
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7,96 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,63 (s, 1H), 7,42 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,52 (brs, 2H), 4,42 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 1,48 (t, J = 7,2 Hz, 3H).
1e) 2-Amino-6-(4-fluor-phenyl)-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureethylester
Zu einer Lösung von 1d (200 mg, 0,67 mmol) in 1,4-Dioxan/Wasser (40 ml, 3:1) wurde 4-Fluorphenylboronsäure (209 mg, 1,34 mmol), NaHCO₃ (225 mg, 2,68 mmol) und Pd(PPh₃)₄ (9 % Pd, 79 mg, 0,067 mmol) zugefügt. Die resultierende Mischung wurde 1 h auf 110°C erwärmt, mit Solelösung (50 ml) verdünnt und mit Ethylacetat extrahiert (50 ml, 3×). Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO₄ getrocknet, gefiltert und konzentriert. Eine Flash-Chromatographie (Hexan/Ethylacetat, 4:1) ergab dann die Titelverbindung (190 mg, 90 %) als klebriges rosa Öl:
MS (ES) m/z 316 (M+H)⁺;
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8,16 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H), 7,62 (m, 2H), 7,50 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,15 (m, 2H), 6,58 (brs, 2H), 4,46 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 1,50 (t, J = 7,2 Hz, 3H).
1f) 2-tert-Butoxycarbonylamino-6-(4-fluor-phenyl)-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureethylester
Zu einer Lösung aus 1e (190 mg, 0,603 mmol) in THF (10 ml) wurde 4-(Dimethylamino)pyridin (7,4 mg, 0,06 mmol) und Di-tert-butyldicarbonat (158 mg, 0,724 mmol) zugefügt. Die resultierende Mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt, es wurde mit Solelösung (50 ml) verdünnt und mit Ethylacetat (50 m, 3×) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO₄ getrocknet, gefiltert und konzentriert. Eine Flash- Chromatographie (Hexan/Ethylacetat, 4:1) ergab dann die Titelverbindung (200 mg, 80 %) als gelben Feststoff:
MS (ES) m/z 416 (M+H)⁺.
1g) 2-tert-Butoxycarbonylamino-6-(4-fluor-phenyl)-benzo[b]thiophen-3-carbonsäure
Eine Lösung aus 1f (80 mg, 0,193 mmol) in Ethanol/Wasser (1:1, 10 ml) wurde mit KOH (21,6 mg, 0,39 mmol) vermischt. Die resultierende Mischung wurde für 1 h auf 60°C erwärmt, mit HCl (30 ml, 1N) verdünnt und mit Ethylacetat (30 ml, 3×) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO₄ getrocknet, gefiltert und konzentriert, um die Titelverbindung (62 mg, 84 %) als weißen Feststoff zu ergeben:
MS (ES) m/z 388 (M+H)⁺.
1h) [3-Carbamoyl-6-(4-fluor-phenyl)-benzo[b]thiophen-2-yl]carbaminsäure-tert-butylester
Zu einer Lösung aus 1 g (150 mg, 0,38 mmol) in DMF (3 ml) wurde 1,1'-Carbonyldiimidazol (125 mg, 0,78 mmol) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt und mit Ammoniumhydroxid (37 %, 5 ml) vermischt. Die Mischung wurde mit Solelösung (10 ml) verdünnt und mit Ethylacetat (20 ml, 3×) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO₄ getrocknet, gefiltert und konzentriert. Eine Flash-Chromatographie (Hexan/Ethylacetat, 1:1) ergab dann die Titelverbindung (48 mg, 32 %) als weißen Feststoff.
MS (ES) m/z 387 (M+H)⁺;
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 11,14 (s, 1H), 7,94 (s, 1H), 7,85 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 7,61 (m, 3H), 7,18 (m, 2H), 5,87 (brs, 2H), 1,59 (s, 9H).
1i) 2-Amino-6-(4-fluor-phenyl)-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureamid
Eine Lösung aus 1h (20 mg, 0,051 mmol) in CH₂Cl₂ (5 ml) wurde mit Trifluoressigsäure (0,5 ml) vermischt. Die resultierende Lösung wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt, dann mit gesättigter NaHCO₃-Lösung (30 ml) vermischt und mit Ethylacetat (30 ml, 3×) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO₄ getrocknet, gefiltert und konzentriert. Eine Flash-Chromatographie (Hexan/Ethylacetat, 1:1) ergab die Titelverbindung (8 mg, 55 %) als weißen Feststoff:
MS (ES) m/z 287 (M+H);
¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 7,73 (s, 1H), 7,63–7,50 (m, 3H), 7,42 (m, 1H), 7,08 (m, 2H).
Beispiel 2
Herstellung von 2-Ureido-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureamid
2a) 2-Amino-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureamid
Eine Lösung aus 2-Amino-benzo[b]thiophen-3-carbonitril (50 mg, 0,29 mmol) in konzentrierter H₂SO₄ (1,5 ml) wurde für 2 h auf 60°C erwärmt. Die Lösung wurde in Eiswasser (5 ml) gegossen, mit gesättigter NaHCO₃-Lösung (30 ml) vermischt und mit Ethylacetat (30 ml, 3×) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über MgSO₄ getrocknet, gefiltert und konzentriert. Eine Flash-Chromatographie (Hexan/Ethylacetat 1:1) ergab dann die Titelverbindung (23 mg, 41 %) als weißen Feststoff:
MS (ES) m/z 193 (M+H)⁺.
2b) 2-Ureido-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureamid
Zu der Mischung aus 2a (20 mg, 0,104 mmol) in CH₂Cl₂ (10 ml) wurde Chlorsulfonylisocyanat (15 μl, 0,15 mmol) zugefügt. Die resultierende Mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt und mit Wasser (0,5 ml) vermischt. Eine Trennung über eine Umkehrphasen-HPLC ergab die Titelverbindung (10 mg, 40 %) als weißen Feststoff:
MS (ES) m/z 236 (M+H)⁺;
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10,77 (s, 1H), 7,84 (m, 2H), 7,56 (brs, 3H), 7,20 (m, 1H), 7,08 (m, 1H), 6,98 (brs, 1H).
Diese Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine Verbindung gemäß Formel (I) umfaßt und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, ein Verdünnungsmittel oder ein Exzipienz. Dementsprechend können die Verbindungen der Formel (I) bei der Herstellung eines Medikaments verwendet werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen der Verbindungen der Formel (I) wie vorher beschrieben hergestellt können als Lösungen oder lyophilisierte Pulver für die parenterale Verabreichung formuliert werden. Pulver können durch Zugabe eines geeigneten Verdünnungsmittels oder eines anderen pharmazeutisch annehmbaren Trägers vor der Verwendung rekonstituiert werden. Die flüssige Formulierung kann eine gepufferte, isotonische, wäßrige Lösung sein. Beispiele für geeignete Verdünnungsmittel sind normale isotonische Salzlösung, Standard 5 % – Dextrose in Wasser oder gepufferte Natrium- oder Ammoniumacetat-Lösung. Solche Formulierungen sind insbesondere für die parenterale Verabreichung geeignet, können jedoch auch für die orale Verabreichung verwendet werden, oder in einem eingeteilten Dosisinhalator oder Zerstäuber für das Einatmen enthalten sein. Es kann wünschenswert Exzipienten wie Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Hydroxycellulose, Akazin, Polyethylenglykol, Mannit, Natriumchlorid oder Natriumcitrat zuzufügen.
Alternativ können diese Verbindungen verkapselt, tablettiert oder als Emulsion oder Sirup für die orale Verabreichung hergestellt werden. Pharmazeutisch annehmbare feste oder flüssige Träger können zugefügt werden um die Zusammensetzung zu verstärken oder zu stabilisieren oder um die Herstellung der Zusammensetzung zu erleichtern. Feste Träger beinhalten Stärke, Lactose, Calciumsulfatdihydrat, Terra alba, Magnesiumstearat oder Stearinsäure, Talk, Pectin, Acazin, Agar oder Gelatine. Flüssige Träger beinhalten Sirup, Erdnußöl, Olivenöl, Salzlösung und Wasser. Die Träger können auch ein Material zur verzögerten Freisetzung beinhalten wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, allein oder mit einem Wachs. Die Menge an festem Träger variiert, wird jedoch vorzugsweise zwischen ungefähr 20 mg und ungefähr 1 g pro Dosierungseinheit liegen. Die pharmazeutischen Präparationen werden folgend den konventionellen Techniken der Pharmazie hergestellt, die ein Mahlen, Vermischen, Granulieren und Komprimieren involvieren, falls nötig für Tablettenformen; oder ein Mahlen, Vermischen und Befüllen für Hartgelatinekapselformen. Wenn ein flüssiger Träger verwendet wird, wird sich die Präparation in Form eines Sirups, Elixiers, einer Emulsion oder einer wäßrigen oder nicht-wäßrigen Suspension befinden. Eine solche flüssige Formulierung kann direkt p.o. verabreicht werden oder in eine Weichgelatinekapsel gefüllt werden.
Typische Zusammensetzungen für die Inhalation befinden sich in Form eines trockenen Pulvers, einer Lösung, einer Suspension oder Emulsion. Die Verabreichung kann beispielsweise durch einen Trockenpulverinhalator geschehen (wie zum Beispiel einen Einheitsdosis- oder Multidosisinhalator, z.B. wie beschrieben im US-Patent 5590645 oder durch Zerstäubung oder in Form eines Druckaerosols). Trockene Pulverzusammensetzungen verwenden typischerweise einen Träger wie Lactose, Trehalose oder Stärke. Zusammensetzungen für die Zerstäubung verwenden typischerweise Wasser als Vehikel. Unter Druck stehende Aerosole verwenden typischerweise ein Treibmittel wie zum Beispiel Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan oder noch bevorzugter 1,1,1,2-Tetrafluorethan, 1,1,1,2,3,3,3-Heptafluor-n-propan oder Gemische davon. Unter Druck stehende Aerosolformulierungen können sich in Form einer Lösung befinden (die möglicherweise ein löslichmachendes Mittel wie Ethanol verwendet) oder einer Suspension, die frei von Exzipienten sein kann oder Exzipienten verwendet, einschließlich Tensiden und/oder Co-Lösungsmitteln (z.B. Ethanol). In Trockenpulverzusammensetzungen und Suspensionsaerosolzusammensetzungen wird der Wirkstoff vorzugsweise eine für die Inhalation geeignete Größe aufweisen (typischerweise mit einem mittleren Massedurchmesser (MMD) von weniger als 20 μm, z.B. 1–10, insbesondere 1–5 μm). Eine Größenreduktion des Wirkstoffs kann beispielsweise durch Mikronisierung nötig sein.
Unter Druck stehende Aerosolzusammensetzungen werden allgemein in Behälter gefüllt, die mit einem Ventil ausgerüstet sind, insbesondere einem Dosierventil. Die Behälter können optional mit Kunststoffmaterialien beschichtet sein, z.B. einem Fluorkohlenstoff-Polymer wie in WO 96/32150 beschrieben. Die Behälter können in ein Betätigungsglied eingepaßt sein, das für die bukkale Zufuhr angepaßt ist.
Typische Zusammensetzungen für die nasale Zufuhr beinhalten die oben erwähnten für die Inhalation und beinhalten weiterhin nicht unter Druck stehende Zusammensetzungen in Form einer Lösung oder Suspension in einem inerten Vehikel wie zum Beispiel Wasser, optional in Kombination mit konventionellen Exzipienten wie Puffern, antimikrobiellen Mitteln, die Tonizität modifizierenden Mitteln und die Viskosität modifizierenden Mitteln, die von einer nasalen Pumpe verabreicht werden können.
Für die rektale Verabreichung können die Verbindungen dieser Erfindung auch mit Exzipienten wie Kakaobutter, Glycerin, Gelatine oder Polyethylenglykolen kombiniert werden und zu einem Suppositorium geformt werden.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung beinhalten die topisch inhalierte und Intrakolon-Verabreichung der Verbindungen der Formel (I). Unter topischer Verabreichung wird eine nicht-systemische Verabreichung verstanden, einschließlich einer Anwendung einer Verbindung der Erfindung extern auf die Epidermis, der Bukkalhöhlung und das Eintröpfeln einer solchen Verbindung in das Ohr, das Auge und die Nase, wobei die Verbindung den Blutstrom nicht signifikant betritt. Unter systemischer Verabreichung wird eine orale, intravenöse, intraperitoneale und intramuskuläre Verabreichung verstanden. Die Menge einer Verbindung der Erfindung (hiernach als Wirkstoff bezeichnet), die für eine therapeutische oder prophylaktische Wirkung bei topischer Verabreichung nötig ist, wird natürlich je nach dieser gewählten Verbindung, der Art und Schwere der zu behandelnden Bedingung und dem die Behandlung durchmachenden Tier variieren und befindet sich schlußendlich in der Entscheidungsgewalt des behandelnden Arztes.
Während es möglich ist, daß ein Wirkstoff allein als Rohchemikalie verabreicht wird, wird es bevorzugt ihn als pharmazeutische Formulierung zu präsentieren. Der Wirkstoff kann für die topische Verabreichung 0,01 bis 5,0 Gew.% der Formulierung umfassen.
Die topischen Formulierungen der vorliegenden Erfindung, sowohl für veterinärmedizinische als auch für die humanmedizinische Verwendung umfassen einen Wirkstoff zusammen mit einem oder mehr annehmbaren Trägern hierfür und optional irgendwelchen anderen therapeutischen Bestandteilen. Der Träger muß in dem Sinne "annehmbar" sein, daß er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel ist und sich auf den Empfänger nicht nachteilig auswirkt.
Für die topische Verabreichung geeignete Formulierungen beinhalten flüssige oder halbflüssige Präparationen, wie die für die Durchdringung der Haut zu der Stelle, an der eine Behandlung nötig ist geeignet sind, wie zum Beispiel: Einreibemittel, Lotionen, Cremes, Salben oder Pasten und für die Verabreichung in das Auge, Ohr oder die Nase geeignete Tropfen.
Die Tropfen gemäß der vorliegenden Erfindung können sterile wäßrige oder ölige Lösungen oder Suspensionen umfassen und können hergestellt werden, indem der Wirkstoff in einer geeigneten wäßrigen Lösung eines bakteriziden und/oder fungiziden Mittels und/oder irgendeinem anderen geeigneten Konservierungsmittel gelöst wird und beinhalten vorzugsweise ein Tensid. Die resultierende Lösung kann dann durch Filtration aufgeklärt, in einen geeigneten Behälter übertragen werden, der dann versiegelt wird und durch Autoklavieren sterilisiert werden oder indem sie für eine halbe Stunde bei 90-100°C gehalten werden. Alternativ kann die Lösung durch Filtration sterilisiert werden und durch aseptische Verfahren in den Behälter übertragen werden. Beispiele für bakterizide und fungizide Mittel, die zum Einschluß in die Tropfen geeignet sind, sind Phenylmercurinitrat oder -acetat (0,002 %), Benzalkoniumchlorid (0,01 %) und Chlorhexidinacetat (0,01 %). Geeignete Lösungsmittel für die Herstellung einer öligen Lösung beinhalten Glycerin, verdünnten Alkohol und Propylenglykol.
Lotionen gemäß der vorliegenden Erfindung beinhalten diejenigen die für die Anwendung auf die Haut oder ins Auge geeignet sind. Eine Augenlotion kann eine sterile wäßrige Lösung umfassen, die optional ein Bakterizid enthält und kann durch Verfahren hergestellt werden, die denjenigen für die Herstellung von Tropfen ähnlich sind. Lotionen oder Einreibemittel für die Anwendung auf die Haut können auch Mittel beinhalten, um das Austrocknen zu beschleunigen und die Haut zu kühlen, wie zum Beispiel einen Alkohol oder Aceton und/oder ein Anfeuchtungsmittel wie Glycerin oder ein Öl wie Castoröl oder Arachinöl.
Cremes, Salben oder Pasten gemäß der vorliegenden Erfindung sind halbfeste Formulierungen des Wirkstoffs für die externe Anwendung. Sie können durch Vermischen des Wirkstoffs in fein verteilter oder pulverförmiger Form, allein oder in Lösung oder Suspension in einem wäßrigen oder nicht-wäßrigen Fluid hergestellt werden, unter Zuhilfenahme einer geeigneten Maschinerie, mit fettiger oder nichtfettiger Basis. Die Basis kann Kohlenwasserstoffe umfassen, wie zum Beispiel hartes, weiches oder flüssiges Paraffin, Glycerin, Bienenwachs, eine metallische Seife, ein Mucilago, ein Öl von natürlichem Ursprung, wie zum Beispiel Mandelöl, Maisöl, Arachisöl, Castoröl oder Olivenöl, Wollfett oder seine Derivate oder eine Fettsäure wie zum Beispiel Stearin- oder Ölsäure zusammen mit einem Alkohol wie Propylenglykol oder Macrogole. Die Formulierung kann jedes geeignete Tensid wie zum Beispiel anionische, kationische oder nichtionische Tenside wie Sorbitanester oder Polyoxyethylen-Derivate davon beinhalten. Suspendiermittel wie natürliche Kautschuks, Cellulose-Derivate oder anorganische Materialien wie kieselförmige Siliciumoxide und andere Bestandteile wie Lanolin können ebenfalls beinhaltet sein.
Verwendbarkeit der vorliegenden Erfindung
Die Verbindungen der Formel I sind als Inhibitoren der IKK-β-Kinasephosphorylierung von IκB geeignet und sind als solche Inhibitoren der NFκB-Aktivierung. Das vorliegende Verfahren verwendet Zusammensetzungen und Formulierungen der Verbindungen, einschließlich pharmazeutischer Zusammensetzungen und Formulierungen der Verbindungen.
Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen bereit, die mit einer nicht richtigen NF-κB-Aktivierung assoziiert sind, wobei die Verfahren die Verabreichung von ein oder mehr Verbindungen der Formel (I) an ein Tier, insbesondere einen Säuger, insbesondere einen Menschen, die dessen bedürfen, umfaßt. Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere Verfahren zur Behandlung von entzündlichen und Gewebsreparaturstörungen bereit, insbesondere rheumatoider Arthritis, chronischer entzündlicher Darmerkrankung, Asthma und COPD (chronisch obstruktive Lungenkrankheit), Osteoarthritis, Osteoporose und fibrotischen Erkrankungen, Dermatose einschließlich Psoriasis, Neurodermitis und ultravioletten Strahlungs-(UV)-induzierten Hautschäden, Autoimmunerkrankungen einschließlich systemischem Lupus erythematosus, multipler Sklerose, psoriatischer Arthritis, ankylosierender Spondylitis, Gewebs- und Organabstoßung, Alzheimerscher Erkrankung, Schlaganfall, Atherosklerose, Restenose, Diabetes, Glomerulonephritis, Krebs einschließlich der Hodgkin-Krankheit, Cachexie, einer mit Infektion assoziierten Entzündung und bestimmten viralen Infektionen einschließlich dem erworbenen Immundefizienzsyndrom (AIDS), dem Atemnotsyndrom beim Erwachsenen und einer Ataxia telangiectasia.
Für die akute Therapie ist eine parenterale Verabreichung von ein oder mehr Verbindungen der Formel (I) nützlich. Eine intravenöse Infusion der Verbindung in 5 % Dextrose in Wasser oder normaler Salzlösung oder eine ähnliche Formulierung mit geeigneten Exzipienten ist besonders effektiv, obwohl eine intramuskuläre Bolusinjektion auch nützlich ist. Typischerweise wird die parenterale Dosis bei ungefähr 0,01 bis ungefähr 50 mg/kg liegen; vorzugsweise zwischen 0,1 und 20 mg/kg auf eine Weise um die Konzentration eines Arzneimittels im Plasma bei einer effektiven Konzentration zur Inhibition von IKK-beta und daher einer Aktivierung von NF-κB zu erhalten. Die Verbindungen werden ein- bis viermal täglich auf einem Niveau verabreicht, um eine gesamte tägliche Dosis von 0,4 bis ungefähr 80 mg/kg/Tag zu erreichen. Die präzise Menge der in dem vorliegenden Verfahren verwendeten Verbindung, die therapeutisch effektiv ist, und die Art und Weise, durch die die Verbindung am besten verabreicht wird, wird durch den Fachmann auf dem Gebiet einfach bestimmt, indem das Blutniveau des Mittels mit der nötigen Konzentration für einen therapeutischen Effekt verglichen wird.
Die Verbindungen der Formel (I) können dem Patienten auch oral verabreicht werden, auf eine Weise, daß die Konzentration des Arzneimittels ausreicht um IKK-beta und daher die Aktivierung von NF-κB zu inhibieren oder um irgendeine andere therapeutische Indikation wie hier offenbart zu erreichen. Typischerweise wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die Verbindung enthält, mit einer oralen Dosis von ungefähr 0,1 bis ungefähr 50 mg/kg auf eine Weise verabreicht, die dem Zustand des Patienten entspricht. Vorzugsweise würde die orale Dosis bei ungefähr 0,5 bis ungefähr 20 mg/kg liegen.
Die Verbindungen der Formel (I) können dem Patienten auch topisch verabreicht werden, auf eine Weise, daß die Konzentration des Arzneimittels ausreicht um IKK-beta und daher die Aktivierung von NF-κB zu inhibieren oder um irgendeine andere therapeutische Indikation wie hier offenbart zu erreichen. Typischerweise wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die Verbindung in einer topischen Formulierung mit ungefähr 0,01 bis ungefähr 5 % G/G verabreicht.
Es werden keine nicht-akzeptablen toxikologischen Wirkungen erwartet, wenn die Verbindungen der vorliegenden Erfindung gemäß der vorliegenden Erfindung verabreicht werden.
Die Fähigkeit der hier beschriebenen Verbindungen, die Aktivierung von NF-κB zu inhibieren wird deutlich durch ihre Fähigkeit belegt, die Phosphorylierung des N-terminalen Fragments von IκB-α durch IKK-β zu inhibieren (siehe Tabelle 1 für die Beispiele). Diese Verbindungen blockieren auch den Abbau von IκB-α und die nukleäre Translokation von NF-κB in menschliche Monozyten und andere Säugerzellen bei Aktivierung der Zellen mit proinflammatorischen Stimuli (z.B. TNF-α, LPS usw.). Zusätzlich inhibieren diese Verbindungen eine proinflammatorische Mediatorproduktion von LPS-stimulierten menschlichen Monozyten und stimulierten menschlichen primären Synovialfibroblasten. Die Verwendbarkeit der gegenwärtigen NF-κB-Inhibitoren bei der Therapie von Erkrankungen wird durch die Wichtigkeit der NF-κB-Aktivierung bei einer Vielzahl von Erkrankungen vorhergesagt.
NF-κB spielt eine Schlüsselrolle bei der regulierten Expression einer großen Anzahl von proinflammatorischen Mediatoren einschließlich Cytokinen wie TNF, IL-1β, IL-6 und IL-8 (Mukaida et al., 1990; Libermann und Baltimore, 1990; Matsusaka et al., 1993), Zelladhäsionsmolekülen wie ICAM und VCAM (Marui et al., 1993; Kawai et al., 1995; Ledebur and Parks, 1995) und der induzierbaren Stickoxidsynthase (iNOS) (Xie et al., 1994; Adcock et al., 1994). (Vollständige Referenzzitate befinden sich am Ende dieses Abschnitts). Von sochen Mediatoren ist bekannt, daß sie eine Rolle bei dem Anziehen von Leukozyten an Entzündungsstellen spielen und im Fall von iNOS zu einer Organzerstörung bei einigen entzündlichen und Autoimmungerkrankungen führen können (McCarney-Francis et al., 1993; Kleemann et al., 1993).
Beweise für die Wichtigkeit der Rolle von NF-κB bei entzündlichen Störungen werden bei Studien asthmatischer Patienten erhalten. Bronchialbiopsien, die von mild atopischen Asthmatikern entnommen wurden, zeigen einen signifikanten Anstieg der Zahl von Zellen in der Submucosa-Färbung für aktiviertes NF-κB, Gesamt-NF-κB und NF-κB-regulierte Cytokine, wie zum Beispiel GM-CSF und TNFα im Vergleich mit Biopsien von normalen nichtatopischen Kontrollen (Wilen et al., 1998). Weiterhin ist der Prozentsatz an Gefäßen, die eine NF-κB-Immunreaktivität exprimieren erhöht, wie die IL-8-Immunreaktivität im Epithel der Biopsieproben (Wilson et al., 1998). Als solche würde vorhergesagt werden, daß die Inhibition der IL-8-Produktion durch Inhibition von NF-κB, wie durch diese Verbindungen demonstriert, für Luftwegsentzündungen günstig sein würde.
Kürzliche Studien legen nahe, daß NF-κB auch eine kritische Rolle bei der Pathogenese von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) spielen kann. Aktiviertes NF-κB wird Kolonbiopsieproben der Morbus Chron und Patienten mit ulzerativer Kolitis beobachtet (Ardite et al., 1998; Rogler et al., 1998; Schreiber et al., 1998). Eine Aktivierung ist in der entzündeten Mucosa evident jedoch nicht in der nicht entzündeten Mucosa (Ardite et al., 1998; Rogler et al., 1998) und ist mit einer erhöhten IL-8 mRNA-Expression an denselben Stellen assoziiert (Ardite et al., 1998). Weiterhin inhibiert die Kortikosteroidbehandlung die intestinale NF-κB-Aktivierung deutlich und reduziert die Kolonentzündung (Ardite et al., 1998; Schreiber et al., 1998). Wiederum würde vorhergesagt werden, daß die Inhibition der IL-8-Produktion durch Inhibition von NF-κB, wie durch diese Verbindungen demonstriert für chronisch entzündliche Darmerkrankungen nützlich sein würde.
Tiermodelle der gastrointestinalen Entzündung stellen weitere Stützen für NF-κB als Schlüsselregulator der Colonentzündung bereit. Eine erhöht NF-κB-Aktivität wird in Lamina propria-Makrophagen bei einer 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS)-induzierten Kolitis bei Mäusen beobachtet, wobei p65 ein Hauptbestandteil der aktivierten Komplexe ist (Neurath et al., 1996; Neurath und Pettersson, 1997). Eine lokale Verabreichung von p65-Antisense hebt die Zeichen der etablierten Kolitis bei den behandelten Tieren ohne Zeichen einer Toxizität auf (Neurath et al., 1996; Neurath und Pettersson, 1997). Als solches würde man vorhersagen, daß kleine Molekülinhibitoren von NF-κB bei der Behandlung von IBD nützlich sein würden.
Weitere Beweise für eine Rolle von NF-κB bei entzündlichen Störungen ergeben sich aus Studien der rheumatoiden Gelenkhaut. Obwohl NF-κB normalerweise als inaktiver Cytoplasmakomplex vorliegt, haben kürzliche immunhistochemische Studien angezeigt, daß NF-ĸB in den Kernen vorliegt und daher in Zellen aktiv ist, umfassend die menschliche rheumatoide Gelenkhaut (Handel et al., 1995; Marok et al., 1996; Soud et al, 1998) und bei Tiermodellen der Erkrankung (Tsao et al., 1997). Die Färbung ist mit Wildtyp A-Synoviozyten und vaskulärem Endothel assoziiert (Marok et al., 1996). Weiterhin wird eine konstitutive Aktivierung von NF-κB bei kultivierten Synoviozyten beobachtet (Roshak et al., 1996; Miyazawa et al., 1998) sowie auch bei Synovialzellkulturen, die mit IL-1β oder TNFα stimuliert wurden (Roshak et al., 1996; Fujisawa et al., 1996; Roshak et al., 1997). So kann die Aktivierung von NF-κB der erhöhten Cytokinproduktion und der Leukozyteninfiltrationseigenschaft der entzündeten Gelenkhaut zugrunde liegen. Die Fähigkeit dieser Verbindungen NF-κB zu inhibieren und dadurch die Erzeugung von proinflammatorischen Mediatoren (z.B. Cytokine und Prostanoide) durch diese Zellen, sollten sie damit für die rheumatoide Arthritis günstig erscheinen lassen.
Biologische Assays
Die Verbindungen dieser Erfindung können in einem von etlichen biologischen Assays getestet werden um die Konzentration der Verbindung zu bestimmen, die nötig ist, um einen gegebenen pharmakologischen Effekt zu erreichen.
Die NF-κB-Aktivität kann auch in einem Elektrophoresemobilitäts-Shiftassay (EMSA) gemessen werden um die Gegenwart von NF-κB-Protein im Kern zu bewerten. Die Zellen von Interesse werden auf eine Dichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml kultiviert. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet, in PBS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ gewaschen und in PBS mit Ca²⁺ und Mg²⁺ bei 1 × 10⁷ Zellen/ml resuspendiert. Um die Wirkung der Verbindung auf die Aktivierung von NF-κB zu überprüfen, werden die Zellsuspensionen mit verschiedenen Konzentrationen von Arzneimittel oder Vehikel (DMSO, 0,1 %) für 30 min bei 37°C vor der Stimulierung mit TNF-α (5,0 ng/ml) für zusätzliche 15 min behandelt. Zelluläre und nukleäre Extrakte werden wie folgt hergestellt. Kurz gefaßt werden nach Ende der Inkubationszeitspanne die Zellen (1 × 10⁷ Zellen) 2× in PBS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ gewaschen. Die resultierenden Zellpellets werden in 20 μl Puffer A (10 mM Hepes (pH 7,9), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,5 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,1 % NP-40) resuspendiert und 10 min auf Eis inkubiert. Die Kerne werden durch Mikrozentrifugation bei 3500 Upm 10 min bei 4°C pelletisiert. Der resultierende Überstand wird als zellulärer Extrakt gesammelt und das Kernpellet wurde in 15 μl Puffer C (20 mM Hepes (pH 7,9), 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 25 % Glycerin, 0,2 M EDTA, 0,5 mM DTT und 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) resuspendiert. Die Suspensionen werden vorsichtig 20 min bei 4°C gemischt und dann bei 14000 Upm für 10 min bei 4°C mikrozentrifugiert. Der Überstand wird gesammelt und auf 60 μl mit Puffer D (20 mM Hepes (pH 7,9), 50 mM KCl, 20 % Glycerin, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT und 0,5 mM PMSF) verdünnt. Alle Proben werden bei – 80°C gelagert bis sie analysiert werden. Die Proteinkonzentration der Extrakte wird gemäß dem Verfahren von Bradford (Bradford, 1976) mit BioRad-Reagentien bestimmt.
Die Wirkung der Verbindungen auf die Transkriptionsfaktoraktivierung wird in einem Elektrophoresemobilitäts-Shiftassay (EMSA) unter Verwendung von Kernextrakten von behandelten Zellen wie oben beschrieben bewertet. Die Doppelstrang-NF-κB-Konsensusoligonukleotide (5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3') werden mit T₄-Polynukleotidkinase und [g-³²P]ATP markiert. Die Bindungsmischung (25 μl) enthält 10 mM Hepes-NaOH (pH 7,9), 4 mM Tris-HCl (pH 7,9), 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol, 10 % Glycerin, 0,3 mg/mol Rinderserumalbumin, und 1 μg Poly(dI-dC)·Poly(dI-dC). Die Bindungsmischungen (10 μg Kernextraktprotein) werden 20 min bei Raumtemperatur mit 0,5 ng ³²P-markiertem Oligonukleotid (50 000–100 000 cpm) in Gegenwart oder Abwesenheit von nicht-markiertem Kompetitor inkubiert, woraufhin die Mischung auf ein 4%iges Polyacrylamidgel geladen wird, hergestellt in 1X Trisborat/EDTA und werden bei 200 V 2 h elektrophoretisch aufgetrennt. Folgend auf die Elektrophorese werden die Gels getrocknet und belichtet, um einen Nachweis der Bindungsreaktion zu ermöglichen.
Die Wirkung der Verbindungen auf die Phosphorylierung von IκB können in einem Western-Blot überwacht werden. Zelluläre Extrakte werden in einer Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophores (SDS-PAGE) auf 10 % Gelen (RioRad, Hercules, CA) unterworfen und die Proteine auf Nitrocellulosesheets (Hybond^TM-ECL, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) übertragen. Immunoblot-Assays werden unter Verwendung eines polyklonalen Kanichen-Antikörpers gegen IκBα oder IκBβ durchgeführt, gefolgt von einem Peroxidase-konjugierten Esel-Antikaninchen-sekundären-Antikörper (Amersham Corp., Arlington Heights, IL). Immunreaktive Banden werden unter Verwendung des Enchanced Chemiluninescence (ECL)-Assaysystems (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) nachgewiesen.
Die Assays im Hinblick auf IκB-Kinasen wurden wie folgt durchgeführt: IKK-α wurde als Hexahistidin-Tag-versehenes Protein in Baculovirusinfizierten Insektenzellen exprimiert und über eine Ni-NTA-Affinitätssäule gereinigt. Die Kinaseaktivität wurde unter Verwendung von 50 ng gereinigtem Protein in Assaypuffer (20 mM Hepes, pH 7,7, 2 mM MgCl₂, 1 mM MnCl₂, 10 mM β-Glycerophosphat, 10 mM NaF, 10 mM PNPP, 0,3 mM Na₃VO₄, 1 mM Benzamidin, 2 μM PMSF, 10 μg/ml Aprotinin, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Pepstatin, 1 mM DTT), enthaltend verschiedene Konzentrationen der Verbindung oder DMSO-Vehikel und ATP wie angegeben (Pharmacia Biotech Inc. Piscataway, NJ) überprüft. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 200 ng IκB-GST (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) in einem Gesamtvolumen von 50 μl begonnen. Man ließ die Reaktion bei 30°C 1 h fortschreiten, woraufhin sie durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration von 20 mM beendet wurde. Die Kinaseaktivität wurde durch einen dissoziationsverstärkten Lanthanid-Fluoreszenz-Immunoassay (Wallac Oy, Turku, Finnland) unter Verwendung eines Phospho-IκB-α-(Ser32)-Antikörpers (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) und eines Eu³⁺-markierten Antikaninchen-IgG (Wallac Oy, Turku, Finnland) bestimmt. Die Platten wurden in einem VICTOR 1420 Multilabel Counter (Wallac) abgelesen, wobei ein Standard-Europiumprotokoll (Anregung 340 nm, Emission 615 nm; Fluoreszenz gemessen für 400 μs nach einer 400 μs-Verzögerung) verwendet wurde. Die Daten sind als Fluoreszenz (cps)-Einheiten ausgedrückt.
IKK-β wurde als GST-tag-Protein exprimiert und seine Aktivität in einem Szintillations-Proximitätsassay mit 96 Vertiefungen (SPA) bewertet. Kurz gefaßt wurde IKK-β in einem Assaypuffer wie oben beschrieben (Endkonzentration 20 nM) mit verschiedenen Konzentrationen von Verbindung oder DMSO-Vehikel, 240 nM ATP und 200 nCi [γ-³³P]-ATP (10 mCi/ml, 2000 Ci/mmol; NEN Life Science Products, Bosten, MA) verdünnt. Die Reaktion wurde durch Zugabe eines biotinylierten Peptids begonnen, umfassend die Aminosäuren 15–46 von IκB-α (American Peptide) auf eine Endkonzentration von 2,4 μM in einem Gesamtvolumen von 50 μl. Die Probe wurde eine Stunde bei 30°C inkubiert, gefolgt von Zugabe von 150 μl Stoppuffer (PBS w/o Ca²⁺, Mg²⁺, 0,1 % Triton X-100 (V/V), 10 mM EDTA), enthaltend 0,2 mg Streptavidinbeschichtete SPA PVT-Kügelchen (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Die Probe wurde gemischt, 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, zentrifugiert (1000 × g, 2 Minuten) und auf einer Hewlett-Packard-TopCount gemessen.
Zusätzlich wird die IKK-β- oder IKK-α-Aktivität durch Phosphorylierung von rekombinantem GST-IkappaBalpha unter Verwendung eines zeitaufgelösten Fluoreszenzresonanzenergietransfers (TR-FRET) in Mikrotiterplatten mit 384 Vertiefungen gemessen. Kurz gefaßt wird IKK-β oder IKK-α in Assay-Puffer (50 mM HEPES, pH 7,4, enthaltend 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM CHAPS, 1 mM DTT und 0,01 % G/V BSA) auf eine 5 nM-Endkonzentration verdünnt. Dies wird zu verschiedenen Konzentrationen der Verbindung oder DMSO-Vehikel zugefügt und die Reaktion durch Zugabe von 25 nM GST-IkappaBalpha und 1 μM ATP in Assaypuffer auf ein Volumen von 30 μl begonnen. Nach 30-minütiger Inkubation bei Umgebungstemperatur wird die Reaktion durch Zugabe von 50 mM EDTA (15 μl) pH 7,4 beendet. Der Nachweis des phosphorylierten Produkts wurde durch Zugabe eines LANCE-Europium-Chelat-markierten spezifischen Antiphosphoserin-monoklonalen Antikörpers mit einer Endkonzentration von 0,5 nM (Cell signalling Technology via Perkin Elmer) und Allophycocyaninmarkierten Anti-GST-Antikörper mit einer Endkonzentration von 10 nM (Prozyme) zum Erhalt eines Endvolumens von 60 μl erreicht. Nach weiterer Inkubation von mindestens 30 min bei Umgebungstemperatur wurde das Signal auf einem Perkin Elmer Discovery-Fluorimeter abgelesen.
Die Wirkung von IKK-β-Inhibitoren auf die primäre Synovial-Fibroblasten-Mediatorproduktion wurde wie folgt bewertet: Primäre Kulturen von humanem RSF wurden durch enzymatischen Verdau von Gelenkhaut, erhalten von erwachsenen Patienten mit rheumatoider Arthritis wie vorher beschrieben (Roshak et al., 1996b) erhalten. Die Zellen wurden in Earl's Minimal Essential Medium (EMEM) kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (GIBCO, Grand Island, NY) enthielt, und zwar bei 37°C und 5 % CO₂. Die Kulturen wurden in den Passagen 4 bis 9 verwendet um eine einheitlichere Typ B-Fibroblastenpopulation zu erhalten. Aus einigen Studien wurden die Fibroblasten mit 5 × 10⁴ Zellen/ml in 16 mm (Durchmesser) Platten mit 24 Vertiefungen ausplattiert (Costar, Cambridge, MA). Die Zellen (70–80 % Konfluenz) wurden gegenüber IL-1β (1 ng/ml) (Genzyme, Cambridge, MA) für eine bestimmte Zeitspanne ausgesetzt. Die Arzneimittel in DMSO-Vehikel (1 %) wurden den Zellkulturen 15 Minuten vor Zugabe von IL-1 zugefügt. Die Studien wurden 3- bis 4-mal unter Verwendung von Synovialzellen von unterschiedlichen Spendern durchgeführt. Die RSF-Zellextrakte wurden aus Zellen, die wie oben beschrieben behandelt wurden, hergestellt. Kurz gefaßt wurden menschliche RSF durch Trypsin/EDTA entfernt, gewaschen und durch Zentrifugation geerntet. Zellextrakte wurden wie vorher beschrieben hergestellt (Dignam et al., 1983; Osborn et al., 1989). Kurz gefaßt wurden nach Ende der Inkubationszeitspanne die Zellen (1 × 10⁷ Zellen) zweimal in PBS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺ gewaschen. Die resultierenden Zellpellets wurden in 20 μl-Puffer A (10 mM Hepes (pH 7,9), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,5 mM) resuspendiert.
Die Wirkung der IKK-β-Inhibition auf menschliche Monozytenstimulierte Eicosanoid- und Cytokinproduktion wurde wie folgt bewertet: die Monozyten wurden aus mit Heparin behandeltem Gesamtblut durch Doppelgradientenzentrifugation wie vorher beschrieben isoliert. Isolierte Monozyten-angereicherte PBMCs wurden dann an Kulturplatten mit 24 Vertiefungen bei 2 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640 10 % FBS (Hyclone, Logan, Utah) für 2 h angehaftet, um die Monozytenpopulation weiter anzureichern. Daraufhin wurden die Medien entfernt, die Zellen einmal mit RPMI 1640 gewaschen und 1 ml RPMI 1640, 10 % FBS wurde den Vertiefungen zugefügt. Die Testverbindungen wurden den Vertiefungen mit einer endgültigen Vehikelkonzentration von 0,05 % DMSO zugefügt. Die Monocyten wurden durch Zugabe von 200 ng/ml Endotoxin (LPS; E. coli Serotyp 0,26:B6) (Sigma, St. Louis, MO) aktiviert und 24 h inkubiert. Zellfreie Überstände wurden durch ELISA für TNF-α (EIA entwickelt bei SB), PGE₂ (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) und IL-8 und IL-6 (Biosource International, Camarillo, CA) analysiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch einen Trypan-Blau-Ausschluß bestimmt.
Die Wirkung der IKK-β-Inhibitoren auf die Phorbolester-induzierte Entzündung wurde wie folgt bewertet: Die entzündliche Reaktion, die durch kutane Anwendung von Phorbolester (PMA) auf die externen Pinnae von Balb/c-Mäusen induziert wurde, hat sich als nützliches Modell zur Untersuchung der multifaktoriellen entzündlichen Zellinfiltration und entzündlichen Veränderung der Epidermis erwiesen. Die intensive entzündliche Läsion wird durch Neutrophilen-Infiltration dominiert, die einfach durch Messung der Gewebekonzentration der Myeloperoxidase quantifiziert werden kann, einem azurophilen granulären Enzym, das in Neutrophilen vorliegt. Zusätzlich kann die Gesamtintensität der entzündlichen Reaktion durch Bestimmung der Ohrdicke gemessen werden. Balb/c-Mäusen (n=6/Gruppe) wurde die Arzneimittelbehandlung oder das Vehikel, gefolgt von PMA (4 μg/Ohr) verabreicht. Die Mäuse wurden 4 h später geopfert, die Ohrdicke bestimmt und die NF-κB-Aktivierung durch IκBα-Western- oder EMSA-Analyse überwacht.
Die Wirkung der IKK-β-Inhibitoren auf ein Ratten-Carrageenaninduziertes Pfotenödem wurde wie folgt bewertet: Männliche Lewis-Ratten (Charles River, Raleigh, NC) wurden in Käfigen gehalten und man erlaubte ihnen freien Zugang zu Nahrungsmitteln und Wasser und sie wogen zwischen 200 und 275 g für jedes Experiment. Verbindung oder Vehikel (0,5 % Tragacanth (p.o.) oder 10 % DMSO, 5 % DMA, 30 % Cremophor (i.p.)) wurde 30 Minuten bis 1 Stunde vor der Carrageenan-Injektion verabreicht. Das Ödem wurde durch Injektion von 1 % Carrageenan in sterilem dH₂O (0,05 ml/Pfote) induziert und zwar in die plantare Oberfläche der rechten Hinterpfote. Die Pfotendicke wurde vor der Verabreichung von Verbindung oder Vehikel und wiederum nach 3 Stunden gemessen, um die Veränderung des Pfotenvolumens zu bestimmen. Die Ratten wurden durch CO₂-Inhalation getötet und der rechte Hinterfuß wurde entfernt, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C für die Analyse gelagert.
Um die Wirkungen eines IKK-2-Inhibitors auf das Maus-Collageninduzierte Arthritis (CIA)-Modell zu bestimmen, wurden 12 männliche DBA/1- Mäuse (20–22 g) pro Behandlungsgruppe am Tag 0 mit einer Gesamtmenge von 100 μl komplettem Freund-Adjunvas (CFA), enthaltend 200 μg bovines Typ II-Collagen immunisiert. Am Tag 21 wurden die Mäuse mit 100 μl Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 200 μg bovines Typ II-Collagen (die 100 μl Collagen/CFA oder Collagen/PBS wurden subkutan in den Schwanz injiziert) einem Antigen ausgesetzt. Der IKK-2-Inhibitor im Vehikel oder das Vehikel allein wurde intraperitoneal zweimal täglich an den Tagen 1 bis zum Tag 40 verabreicht (die Erkrankungssymptome werden beginnend an den Tagen 25–28 deutlich). Zwei zusätzliche Behandlungsgruppen beinhalten die Positivkontrolle Etanercept (Enbrel) (4 mg/kg, intraperitoneal, jeden zweiten Tag) und das Etanercept-Vehikel (PBS). Die Mäuse wurden täglich nach einem Punktesystem eingeteilt, bis zum Tag 50 und zwar im Hinblick auf klinische Symptome (siehe unten) und die Pfotendicken wurden gemessen. Zusätzlich zu den 12 Mäusen pro Behandlungsgruppen, die während des Experiments überwacht wurden, wurden an etlichen Zeitpunkten während des Verlaufs der Erkrankung Satellitenmäuse (3–5 pro Behandlungsgruppe), die wie oben beschrieben behandelt wurden, verwendet um die Cytokin/Chemokin-Niveaus und p65-Niveaus in der Pfote zu messen, die ex vivo Antigen-Recall-Reaktion durch Drainage der Lymphknoten.
Induktion von Arthritis
AIA wird durch eine Einzelinjektion von 0,75 mg Mycobacterium butyricum (Difco, Detroit, MI), suspendiert in Paraffinöl in die Basis des Schwanzes von männlichen Lewis-Ratten im Alter von 6–8 Wochen (160–180 g) induziert. Hinterpfotenvolumina werden durch das Wasserersatzverfahren am Tag 16 und/oder Tag 20 gemessen. Die Testverbindungen werden in einem geeigneten Vehikel homogenisiert und durch einen geeigneten Weg verabreicht. Den Kontrolltieren wird nur Vehikel verabreicht. Zwei Dosierungsprotokolle werden allgemein verwendet: prophylaktische Dosierung, die am Tag der Adjuvansinjektion begonnen wird und therapeutische Verabreichung, begonnen am Tag 10, sobald die Entzündung etabliert ist.
Klinische Einteilung
Jeder Pfote wurde eine Bewertung von 0–4 zugeordnet, basierend auf den folgenden Kriterien:

0: = keine Entzündung
1: = einzelner geschwollener Zeh
2: = etliche geschwollene Zehen, leichtes Pfotenschwellen
3: = etliche geschwollene Zehen, moderates Pfotenschellen
4: = alle Zehen geschwollen, starkes Pfotenschwellen

Die obige Beschreibung offenbart die Erfindung einschließlich bevorzugter Ausführungsformen vollständig. Modifikationen und Verbesserungen der spezifisch hier offenbarten Ausführungsformen liegen im Umfang der folgenden Ansprüche. Ohne weitere Ausführungen wird angenommen, daß ein Fachmann auf dem Gebiet unter Verwendung der vorstehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in ihrem breitesten Ausmaß verwenden kann. Daher sollen die hier angefügten Beispiele nur illustrativ sein und den Umfang der vorliegenden Erfindung auf keine Weise begrenzen. Die Ausführungsformen der Erfindung, worin ein exklusives Eigentum oder Privileg beansprucht wird, sind wie folgt definiert.

Claims

Verbindung gemäß Formel (I) unten:
R₁ bedeutet CONH₂; R₂ bedeutet NR₄R₅; R₃ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, CN, CF₃, Halogen, Aryl, Heteroaryl, Alkyl, O-Alkyl und S-Alkyl und kann an entweder C₄, C₅, C₆ oder C₇ angebunden sein; R₄ bedeutet H oder Alkyl; und R₅ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, CO-Alkyl, SO₂-Alkyl, CONH₂, CONH-Alkyl, CONH-Aryl, CONH-Heteroaryl, CSNH₂, CSNH-Alkyl, CSNH-Aryl, CSNH-Heteroaryl, SO₂NH₂, SO₂NH-Alkyl, SO₂NH-Aryl und SO₂NH-Heteroaryl, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: 2-Amino-6-(4-fluorphenyl)-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureamid und 2-Ureido-benzo[b]thiophen-3-carbonsäureamid.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung einer Erkrankung, die durch eine pathologische NF-κB-Aktivierung gekennzeichnet ist.
Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei die Erkrankung eine entzündliche oder Gewebsreperaturstörung ist.
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus entzündlichen und Gewebsreparaturstörungen, insbesondere rheumatoider Arthritis, chronischer entzündlicher Darmerkrankung, Asthma und COPD (chronisch obstruktive Lungenkrankheit), Osteoarthritis, Osteoporose und fibrotischen Erkrankungen, Dermatose einschließlich Psoriasis, Neurodermitis und ultravioletten Strahlungs-(UV)induzierten Hautschäden, Autoimmunerkrankungen einschließlich systemischem Lupus erythematosus, multipler Sklerose, psoriatischer Arthritis, ankylosierender Spondylitis, Gewebs- und Organabstoßung, Alzheimerscher Erkrankung, Schlaganfall, Atherosklerose, Restenose, Diabetes, Glomerulonephritis, Krebs einschließlich der Hodgkin-Krankheit, Cachexie, einer mit Infektion assoziierten Entzündung und bestimmten viralen Infektionen einschließlich dem erworbenen Immundefizienzsyndrom (AIDS), dem Atemnotsyndrom beim Erwachsenen und einer Ataxia telangicstasia.
Verbindung gemäß 1 zur Verwendung bei der Therapie.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, ein Verdünnungsmittel oder einen Exzipienten umfaßt.