DE60311526T2

DE60311526T2 - Immunogene zusammensetzung

Info

Publication number: DE60311526T2
Application number: DE60311526T
Authority: DE
Inventors: Yves Mayeresse; Jean GlaxoSmithKline Biologicals S.A STEPHENNE
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2002-11-01
Filing date: 2003-10-30
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2023-10-31
Also published as: NO342741B1; SI1556477T1; EP2395073A2; NO20051998L; IS7805A; US7927858B2; NO20052010D0; AR041880A1; NO20180874A1; IL168054A; TW200501980A; MX343419B; TW200501981A; EP2395073A3; PL213647B1; MY145693A; US20110159038A1; MY132859A; CA2503946C; EP1575612A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft immunogene Zusammensetzungen, die eine getrocknete feste oder hochviskose flüssige Formulierung von inaktiviertem Poliovirus (IPV) umfassen, die Immunogenität bewahrt. Die Erfindung schließt auch einen Impfstoff ein, der eine getrocknete feste oder hochviskose flüssige Formulierung von IPV umfaßt. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Konservieren von aktiviertem Poliovirus (IPV) als getrockneter Feststoff oder hochviskose Flüssigkeit. Dieses Verfahren umfaßt das Herstellen einer Probe durch Suspendieren oder Lösen von IPV und einem bakteriellen Polysaccharid in einer Lösung eines Stabilisierungsmittels und Unterwerfen der Probe solchen Temperatur- und Druckbedingungen, die zum Verlust von Lösungsmittel aus der Probe führen. Druck- und Temperaturbedingungen werden so gehalten oder eingestellt, daß Lösungsmittel entfernt wird und die Probe unter Bildung eines Feststoffs oder einer hochviskosen Flüssigkeit trocknet. Solche Formulierungen können vor der Verwendung rekonstituiert oder direkt verwendet werden.
IPV ist wohlbekannt als Komponente von Impfstoffen, jedoch wird es als Flüssigkeit formuliert, zum Beispiel in Infanrix penta^®. Das Verfahren zum Gefriertrocknen von IPV wird mit dem Verlust an Antigenität in Verbindung gebracht, so daß es schwierig ist, einen wirksamen Impfstoff zu formulieren, der eine getrocknete Form von IPV umfaßt. Getrocknete Impfstofformulierungen sind bekannt, insbesondere im Fall von bakteriellen Polysacchariden. Das PRP-Polysaccharid von Haemophilus influenzae b (Hib) wird häufig als getrockneter Feststoff formuliert, zum Beispiel in Infanrix hexa^® (WO 99/48525).
Es gibt mehrere Gründe, warum eine getrocknete Formulierung von IPV vorteilhaft wäre. Getrocknete Formulierungen haben gute Lagereigenschaften und können die Haltbarkeit eines IPV enthaltenden Impfstoffs erhöhen. Die Möglichkeit zur Trocknung von IPV macht IPV auch zu einem flexibleren Impfstoffbestandteil und ermöglicht seine Formulierung in neuen Kombinationsimpfstoffen, die zuvor nicht möglich waren. Einige Impfstoffe enthalten flüssige und getrocknete feste Komponenten, die unmittelbar vor der Verabreichung vermischt werden (zum Beispiel Infanrix hexa^®). Infanrix hexa enthält eine getrocknete Hib-Komponente, die mit DTPa-HepB-IPV unmittelbar vor der Verwendung rekonstituiert wird. Durch Formulieren von IPV zusammen mit Hib als getrockneter Feststoff wäre es möglich, weitere Komponenten zum flüssigen Anteil des Impfstoffs hinzuzugeben, die ansonsten inkompatibel mit IPV sein könnten.
Mehrere Techniken zum Trocknen von Impfstoffkomponenten sind auf diesem Gebiet bekannt. Herkömmlich wird dies unter Verwendung des Prozesses des Gefriertrocknens erreicht, in dem eine Lösung des Stoffs hergestellt und die Probe gefroren wird. Während der primären Trocknungsphase wird der Großteil des Wassers durch Sublimation aus Eis unter Bedingungen reduzierten Drucks entfernt, und ein poröser "Kuchen" wird gebildet. Diesem folgt gewöhnlich eine zweite Trocknungsphase, wenn Druck und Temperatur verändert werden und Wasser aus dem festen "Kuchen" verdampft wird. Die resultierende lyophilisierte Probe hat eine verbesserte Stabilität im Vergleich mit einer flüssigen Formulierung. Jedoch ist der Gefriertrocknungsprozeß langwierig und kann der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt in einem Herstellungsverfahren sein.
Die Produktschwankung ist auch ein Problem, wenn viele Proben chargenweise in einer großen Trocknereinheit lyophilisiert werden. Die Bedingungen auf den Regalböden des Gefriertrockners variieren zwischen unterschiedlichen Positionen, was dazu führt, daß Proben mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten unter unterschiedlichen Bedingungen lyophilisieren. Für bestimmte biologische Stoffe wie Lebendvirus kann es einen signifikanten Aktivitätsverlust während des Gefriertrocknungsprozesses geben (Pikal (1994), ACS Symposium 567: 120-133). Viele gefriergetrocknete Stoffe sind noch instabil bei Umgebungstemperatur (Carpenter et al. (1994), ACS Symposium 567: 134-147).
Der Schaden, der durch den Prozeß des Gefrierens verursacht wird, kann in einem gewissen Ausmaß durch die Verwendung von Frostschutzmitteln wie Polyolen umgangen werden. Weitere Verbesserungen im Prozeß der Lyophilisierung erfolgten durch Vermeidung des Einfrierens der Probe während des Prozesses und Entfernung von Wasser durch Sieden (WO 96/40077; US 6306345 ). Dieses Verfahren beinhaltet die Herstellung einer Mischung aus einem eine Glasmatrix bildenden Material in einem geeigneten Lösungsmittel zusammen mit der zu konservierenden Probe, Verdampfen von Masselösungs mittel aus der Mischung zum Erhalt eines Sirups, Inkontaktbringen des Sirups mit Druck und Temperatur, die ausreichend zum Sieden des Sirups sind, und Entfernen von Restlösungsmittel.
Ein ähnliches Verfahren wurde in US 5,766,520 beschrieben, in dem der Prozeß das teilweise Entfernen des Wassers unter Bildung einer viskosen Flüssigkeit und das weitere Unterwerfen des Sirups dem Vakuum, um ihn zu "Kochen", und das weitere Trocknen bei Temperaturen von wesentlich weniger als 100°C beinhaltet. Dieses Verfahren leidet noch an einigen der Probleme des herkömmlichen Gefriertrocknens. Wenn der Prozeß in einem großen Gefriertrockner durchgeführt wird, werden die Proben mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in Abhängigkeit von ihrer Position auf dem Regalboden trocknen, und dies führt dazu, daß unterschiedliche Proben unterschiedliche Aktivität während des Trocknungsprozesses verlieren. Dies führt zu einem Mangel an Konsistenz innerhalb einer Charge.
Bis heute wurde von keinem erfolgreichen Beispiel der Herstellung einer getrockneten festen Impfstofformulierung von IPV berichtet, die einen hohen Grad an Antigenität und/oder Immunogenität bewahrt.
Entsprechend offenbart die vorliegende Erfindung eine immunogene Zusammensetzung, die IPV und ein Stabilisierungsmittel umfaßt, formuliert als getrocknete Zusammensetzung oder hochviskose Flüssigkeit, die nach Rekonstituierung eine Immunreaktion gegen Poliovirus erzeugen kann. Die Gegenwart eines Stabilisierungsmittels ist wesentlich für die Konservierung von Antigenen, und es wurde gezeigt, daß Polyole wirksam sind. IPV wird bevorzugt in Gegenwart eines bakteriellen Polysaccharids getrocknet, was zur Bewahrung eines höheren Prozentanteils der ursprünglichen Antigene in bezug auf Antigenität und/oder Immunogenität führt. Die vorliegende Erfindung umfaßt Verfahren zur Konservierung einer Zusammensetzung, die IPV umfaßt, bevorzugt in Gegenwart eines Polyols und eines bakteriellen Polysaccharids, worin die Antigenität und/oder Immunogenität von IPV bewahrt wird. Lyophilisierung von IPV in Gegenwart von Polysacchariden führt zu einer Verbesserung der Antigenbewahrung für IPV im Vergleich zur Lyophilisierung von IPV allein. Zusätzlich wird die Immunogenität von Hib ebenfalls durch Formulierung zusammen mit IPV als getrockneter Feststoff oder hochviskose Flüssigkeit gesteigert. Insbesondere bei unvorbereiteter Rekonstituierung mit flüssigen DTP-Impfstoffen (nachfolgend beschrieben) haben die Erfinder festgestellt, daß Hib-Titer nicht so stark durch die Aluminiumhydroxidkomponente des DTP-Impfstoffs reduziert werden wie im Fall ohne die Gegenwart von IPV.
Das verwendete Trocknungsverfahren kann auch die Bewahrung der Antigenität und/oder Immunogenität von IPV beeinflussen. Ein Schaumtrocknungsverfahren zum Trocknen von IPV war wirksamer in der Bewahrung von Antigenität von IPV als herkömmliche Gefriertrocknungstechniken. Überraschend führte der Einschluß eines Gefrierschrittes im Schaumtrocknungsverfahren nicht zu Verlust an Antigenität, sondern führte vielmehr zur Entwicklung eines schnellen und wirksamen Konservierungsverfahrens. Ein weiteres bevorzugtes Verfahren der Erfindung bewahrt hohe Grade an IPV-Antigenität und/oder Immunogenität durch Trocknen der IPV enthaltenden Probe ohne Einfrieren oder Schaumbildung, was zur Bildung einer getrockneten Formulierung führt, bevorzugt einer hochviskosen flüssigen Formulierung.
Die Erfindung stellt eine getrocknete Formulierung von IPV bereit, die Vorzüge von Lagerstabilität haben wird. Die getrocknete Formulierung kann schnell und leicht unmittelbar vor der Verabreichung rekonstituiert werden. Wenn das bevorzugte Schaumtrocknungsverfahren verwendet wird, wird der geschäumte Kuchen besonders leicht aufgrund der größeren Oberfläche des Kuchens rekonstituiert.
Zusätzliche Vorzüge einer getrockneten festen oder hochviskosen flüssigen Formulierung von IPV und Hib schließen eine gesteigerte Immunogenität der Hib-Komponente ein. Es ist allgemein bekannt, daß in Mehrkomponentenimpfstoffen andere Teile der Impfstofformulierung zu Interferenz mit Hib-Immunogenität führen können (WO 96/40242, WO 97/00697). Der Einschluß von IPV in einer getrockneten Formulierung mit Hib kann dieses Problem reduzieren, speziell wenn die getrocknete IPV-Hib-Zusammensetzung mit Diphtherie-, Tetanus- und Pertussis-Komponenten vor der Verabreichung vermischt wird.
Obwohl die Lyophilisierung von IPV in Gegenwart eines bakteriellen Polysaccharids unter Verwendung eines herkömmlichen Gefriertrocknungsansatzes möglich ist, ist es bevorzugt, eine Schaumtrocknungstechnik oder ein sanftes Trocknungsverfahren zu verwenden, das nicht das Gefrieren oder die Schaumbildung beinhaltet. Diese Verfahren führen zu einer noch größeren Bewahrung der Antigenität und/oder Immunogenität von IPV, und der resultierende Kuchen ist auch leichter und schneller zu rekonstituieren. Die Verfahren besitzen auch Vorteile darin, daß sie schneller und energieeffizienter als Standard-Gefriertrocknungstechniken sind. Da der Lyophilisierungsschritt häufig der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt in der Impfstoffherstellung ist, würde die Verwendung der bevorzugten Verfahren zu größeren Mengen der Impfstoffproduktion ohne zusätzlich Investitionen in die Anlage führen. Die Einführung eines Gefriertrocknungsschrittes im bevorzugten Schaumtrocknungsverfahren führt ebenfalls zu einer verbesserten Chargenreproduzierbarkeit.
Beschreibung der Figuren
1 – Photographien von Flaschen, die die Konservierungsprobe enthalten, zu unterschiedlichen Stufen des Schaumtrocknungsprozesses.

A – zeigt das Erscheinungsbild der Konservierungsproben bei Einführung in die Gefriertrocknung als flüssige Formulierung.
B – zeigt das Erscheinungsbild der Konservierungsproben bei Reduzierung des Drucks auf 1,5 mbar. Die Proben beginnen mit leicht unterschiedlichen Geschwindigkeiten aufgrund unterschiedlicher Bedingungen in jeder Flasche zu gefrieren.
C – zeigt das Erscheinungsbild der Konservierungsproben bei 0,1 mbar, wenn alle Proben vollständig eingefroren sind.
D – zeigt das Erscheinungsbild der Konservierungsproben bei Erhöhung des Drucks auf 0,8–3,5 mbar. Ein geschäumtes Glas wird gebildet, als die Konservierungsprobe schäumt und das Lösungsmittel verdampft.

2 – Photographie der hochviskosen Flüssigkeit in umgedrehten Flaschen.
Ausführliche Beschreibung
Immunogene Zusammensetzungen der Erfindung
Die Erfindung schließt immunogene Zusammensetzungen ein, die als trockener Feststoff oder hochviskose Flüssigkeit formuliert sind, umfassend IPV und ein Stabilisierungsmittel, worin die Antigenität und/oder Immunogenität von IPV nach Rekonstituierung bewahrt ist. Die getrocknete feste oder hochviskose flüssige Formulierung von IPV kann eine Immunreaktion, vorzugsweise eine schützende Immunreaktion, gegen Poliovirus erzeugen, bevorzugt nach Rekonstituierung und Impfung.
IPV wird als inaktiviertes Poliovirus definiert (bevorzugt umfassend die Typen 1, 2 und 3, wie es auf dem Impfstoffgebiet Standard ist, am meisten bevorzugt Salk-Polioimpfstoff). Eine Impfstoffdosis von IPV enthält 20-80, bevorzugt 40 oder 80 D-Antigeneinheiten vom Typ 1 (Mahoney), 4-16, bevorzugt 8 oder 16 D-Antigeneinheiten vom Typ 2 (MEF-1) und 20-64, bevorzugt 32 oder 64 D-Antigeneinheiten vom Typ 3 (Saukett).
Bei Trocknung durch ein Verfahren der Erfindung wird bevorzugt die Antigenität von 1, 2 oder allen 3 der Typen 1, 2 und 3 von Poliovirus bewahrt; besonders bevorzugt wird die Antigenität vom Typ 1; Typ 2; Typ 3; Typ 1 und Typ 2; Typ 1 und Typ 3; Typ 2 und Typ 3; oder Typ 1, Typ 2 und Typ 3 auf einem Niveau von wenigstens 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oder 98 % der Antigenität einer Referenzprobe bewahrt, die nicht dem Trocknungsprozeß unterworfen wurde. Dies kann nach Rekonstituierung des getrockneten Feststoffs oder der hochviskosen Flüssigkeit in einer wäßrigen Lösung durch jedes geeignete Verfahren gemessen werden, einschließlich ELISA unter Verwendung polyklonaler und/oder monoklonaler Antikörper gegen Poliovirus Typ 1, 2 und/oder 3.
Bei Trocknung durch ein Verfahren der Erfindung wird bevorzugt die Immunogenität von 1, 2 oder allen 3 der Typen 1, 2 und 3 von Poliovirus bewahrt; besonders bevorzugt wird die Immunogenität vom Typ 1; Typ 2; Typ 3; Typ 1 und Typ 2; Typ 1 und Typ 3; Typ 2 und Typ 3; oder Typ 1, Typ 2 und Typ 3 auf einem Niveau von wenigstens 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oder 98 % der Immunogenität einer Referenzprobe bewahrt, die nicht dem Trocknungsprozeß unterworfen wurde. Dies kann nach Rekonstituierung des getrockneten Feststoffs oder der hochviskosen Flüssigkeit in einer wäßrigen Lösung durch jedes geeignete Verfahren gemessen werden. In einem bevorzugten Verfahren wird die getrocknete Formulierung in einer wäßrigen Lösung rekonstituiert und in ein Tier übergeimpft, bevorzugt eine Ratte. Nach einem geeigneten Zeitraum werden Antiseren aus den geimpften Tieren aufgefangen, und die Serokonversion wird untersucht. Bevorzugt wird eine relative Wirksamkeit von wenigstens 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 oder 0,9 im Vergleich mit einer ungetrockneten Referenzprobe erreicht.
Eine getrocknete feste Zusammensetzung ist eine Formulierung, in der das Lösungsmittel durch ein Verfahren der Lyophilisierung, Sublimation, Verdampfung oder des Wasserentzugs entfernt wurde, so daß gleich oder weniger als 15 %, 12 %, 10 %, 7 %, 5 %, 4 %, bevorzugt 3 %, 2 % oder am meisten bevorzugt 1 % Lösungsmittel zurückbleiben. Der Begriff "getrockneter Feststoff" umfaßt Gläser, Gummis oder kristalline Feststoffe mit festem Erscheinungsbild. Jedes der oben beschriebenen Verfahren kann zur Herstellung eines solchen getrockneten Feststoffs verwendet werden. Das Lösungsmittel wird durch Sublimation, Sieden oder Verdampfung entfernt, bevorzugt durch Verdampfung.
Eine hochviskose Flüssigkeit wird als ein Material mit einem Lösungsmittelgehalt von gleich oder weniger als 15, 12, 10, bevorzugt 8, 5, 4, 3, 2 oder 1 % definiert. Die hochviskose Flüssigkeit hat einen ausreichend niedrigen Lösungsmittelgehalt, so daß der Wirkstoff in einem stabilen Zustand für wenigstens 3, 6, 9, 12 oder 24 Monate bei 4°C konserviert wird, was dem Wirkstoff die Bewahrung von wenigstens 40, 50, 60, bevorzugt 70, 80, 90 oder 95 % seiner Antigenität und/oder Immunogenität über diesen Zeitraum erlaubt. Die hochviskose Flüssigkeit wurde nicht der Bildung von Bläschen ausgesetzt, die in der Schaumbildung involviert ist. Bevorzugt hat die hochviskose Flüssigkeit ein festes Erscheinungsbild, aber ist ein Glas und kann sehr langsam über einen Zeitraum von Tagen, bevorzugt Wochen, besonders bevorzugt Monaten fließen.
Immunogene Zusammensetzungen der Erfindung werden als getrockneter Feststoff oder hochviskose Flüssigkeit formuliert, der/die IPV und ein Stabilisierungsmittel und bevorzugt ein bakterielles Polysaccharid umfaßt. Das Stabilisierungsmittel ist jedes der nachfolgend beschriebenen Zusammensetzungen. Das bakterielle Polysaccharid umfaßt Kapselpolysaccharide, die aus einem beliebigen Bakterium stammen, bevorzugt aus einem oder mehreren aus Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, Gruppe A-Streptokokken, Gruppe B-Streptokokken, Staphylococcus aureus oder Staphylococcus epidermidis.
Bevorzugt ist das PRP-Kapselpolysaccharid von Haemophilus influenzae b als getrockneter Feststoff oder hochviskose Flüssigkeit vorhanden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt die immunogene Zusammensetzung getrocknete feste oder hochviskose flüssige Formulierungen von Kapselpolysacchariden, die aus einem oder mehreren der Serogruppen A, C, W-135 und Y von Neisseria meningitidis (Meningokokkenpolysaccharide) stammen. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform umfaßt getrocknete feste oder hochviskose flüssige Formulierungen von Kapselpolysacchariden, die aus Streptococcus pneumoniae stammen. Die Pneumokokken-Kapselpolysaccharidantigene sind bevorzugt ausgewählt aus den Serotypen 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F und 33F (am meisten bevorzugt aus den Serotypen 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F und 23F). Eine weitere bevorzugte Ausführungsform enthält die Kapselpolysaccharide vom Typ 5, 8 oder 336 aus Staphylococcus aureus. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform enthält die Kapselpolysaccharide vom Typ I, Typ II oder Typ III aus Staphylococcus epidermidis. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform enthält die Kapselpolysaccharide vom Typ Ia, Typ Ic, Typ II oder Typ III aus Streptococcus Gruppe B. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform enthält die Kapselpolysaccharide von Streptococcus Gruppe A, wobei sie bevorzugt ferner wenigstens ein M-Protein und besonders bevorzugt multiple Typen von M-Protein umfaßt.
In einer Ausführungsform der Erfindung haben die bakteriellen Polysaccharide die volle Länge, wobei sie gereinigte native Polysaccharide sind. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung sind die Polysaccharid zwischen 2- und 20-mal klassiert, bevorzugt 2-5-mal, 5-10-mal, 10-15-mal oder 15-20-mal, so daß die Polysaccharide eine geringere Größe zur leichteren Handhabung haben. Oligosaccharide werden in einer bevorzugten Ausführungsform verwendet. Oligosaccharide enthalten typischerweise zwischen 2 und 20 Struktureinheiten.
Die Erfindung schließt ferner immunogene Zusammensetzungen ein, die mehr als ein bakterielles Polysaccharid und IPV als getrockneten Feststoff oder hochviskose Flüssigkeit umfassen. bevorzugt ist IPV mit einem oder mehreren aus Hib-(Haemophilus influenzae Typ b)-PRP-Polysaccharid und/oder Meningokokkenpolysacchariden A, C, W und/oder Y und/oder Pneumokokkenpolysacchariden kombiniert. Am meisten bevorzugt umfassen die Wirkstoffe IPV und Hib; IPV und MenC; IPV und Hib und MenC; IPV und MenA und C; IPV und Hib und MenA und C; IPV und Hib und MenA und C und Y; oder IPV und Hib und MenC und Y.
Die obigen vereinzelten Wirkstoffe können auch ein oder mehrere Pneumokokken-Kapselpolysaccharide wie nachfolgend beschrieben umfassen. In den obigen Zusammensetzungen, wenn Polysaccharide verwendet werden, können auch Oligosaccharide eingesetzt werden (wie oben definiert). Obwohl diese Zusammensetzungen mit Hilfsstoff versetzt sein können (wie nachfolgend beschrieben), sind sie bevorzugt ohne Hilfsstoff oder umfassen vorzugsweise keine Aluminiumsalze.
Bevorzugt sind die Polysaccharide oder Oligosaccharide mit einem Peptid oder Trägerprotein konjugiert, das T-Helferepitope umfaßt (wie nachfolgend beschrieben).
In immunogenen Zusammensetzungen der Erfindung vorhandene Kapselpolysaccharide sind unkonjugiert oder an ein Trägerprotein wie Tetanustoxoid, Tetanustoxoid-Fragment C, Diphtherietoxoid, CRM197, Pneumolysin, Protein D (US6342224) konjugiert. Tetanustoxin, Diphtherietoxid und Pneumolysin sind entweder durch genetische Mutation und/oder vorzugsweise durch chemische Behandlung entgiftet. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung weist an Tetanustoxoid konjugiertes Hib auf.
Wenn mehr als ein konjugiertes Polysaccharid in der immunogenen Zusammensetzung der Erfindung vorhanden ist, sind die Polysaccharide an das gleiche Trägerprotein oder an unterschiedliche Trägerproteine konjugiert. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung enthalten an ein Trägerprotein konjugierte Menigokokkenpolysaccharide. Wenn konjugiertes Hib und Meningokokkenpolysaccharide vorhanden sind, sind sie an das gleiche Trägerprotein oder an unterschiedliche Trägerproteine konjugiert.
Das Polysaccharidkonjugat kann durch jede bekannte Kupplungstechnik hergestellt werden. In einer bevorzugten Kupplungstechnik wird das Polysaccharid über eine Thioetherbindung gekuppelt. Dieses Konjugationsverfahren beruht auf der Aktivierung des Polysaccharids mit 1-Cyano-4-dimethylaminopyridiniumtetrafluoroborat (CDAP) zur Bildung eines Cyanatesters. Das aktivierte Polysaccharid kann somit direkt oder über eine Spacer-Gruppe an eine Amino-Gruppe am Trägerprotein gekuppelt werden. Bevorzugt wird der Cyanatester mit Hexandiamin gekuppelt, und das Aminoderivatisierte Polysaccharid wird mit dem Trägerprotein unter Verwendung von Heteroligationschemie konjugiert, die die Bildung der Thioetherbindung beinhaltet. Solche Konjugate werden in WO 93/15760 (Uniformed Services University) beschrieben.
Die Konjugate können auch durch direkte reduktive Aminierungsverfahren hergestellt werden, sie sie in US 4365170 (Jennings) und US 4673574 (Anderson) beschrieben werden. Andere Verfahren werden in EP-0-161-188, EP-208375 und EP-0-477508 beschrieben.
Ein weiteres Verfahren beinhaltet die Kupplung eines Bromcyan-aktivierten Polysaccharids, das mit Adipinsäurehydrazid (ADH) derivatisiert ist, mit dem Proteinträger durch Carbodiimid-Kondensation (C. Chu et al., Infect. Immunity, 1983, 245-256).
Polysaccharide, die als Teil der immunogenen Zusammensetzung der Erfindung aufgenommen werden, können unabsorbiert oder an einen Hilfsstoff, bevorzugt ein Aluminiumsalz (Aluminiumphosphat oder Aluminiumhydroxid), am meisten bevorzugt Aluminiumphosphat, absorbiert sein.
Immunogene Zusammensetzungen der Erfindung umfassen ein Stabilisierungsmittel, das zur Verhinderung von Beschädigung während des Entwässerungsprozesses helfen kann. Jedes nachfolgend beschriebene Stabilisierungsmittel, einschließlich glasbildender Polyole, kann in die immunogene Zusammensetzung, ob als getrockneter Feststoff, geschäumtes Glas oder hochviskose flüssige Zusammensetzung, unter Verwendung der Verfahren der Erfindung aufgenommen werden. Bevorzugte Stabilisierungsmittel schließen Saccharose, Sorbit, Lactose und Trehalose ein.
Die bevorzugten Kombinationen, getrocknet durch die Verfahren der Erfindung, können mit anderen Antigenen in einem Kombinationsimpfstoff kombiniert werden, die entwässerte oder flüssige Formulierungen sind, die zur Rekonstituierung der getrockneten Komponenteen verwendet werden.
Zusätzliche Komponenten
Getrocknete feste oder hochviskose flüssige Formulierungen der Erfindung, die IPV und ein Stabilisierungsmittel beinhalten, können zusätzlich mit weiteren Impfstoffkomponenten formuliert werden. Ein bevorzugter Impfstoff enthält eine getrocknete feste oder hochviskose flüssige Formulierung von IPV und ein bakterielles Polysaccharid, die mit einer flüssigen Formulierung vermischt sein können, die zusätzliche Impfstoffkomponenten umfaßt. Nach der Rekonstituierung der festen Komponenten mit den flüssigen Komponenten wird der vollständige Impfstoff durch Injektion verabreicht.
Die zusätzlichen Komponenten schließen Kapselpolysaccharide ein, die aus einem oder mehreren aus Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptokokken Gruppe A, Streptokokken Gruppe B, Staphylococcus aureus oder Staphylococcus epidermidis stammen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die immunogene Zusammensetzung Kapselpolysaccharide, die aus einer oder mehreren der Serogruppen A, C, W-135 und Y von Neisseria meningitidis stammen. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform umfaßt Kapselpolysaccharide, die aus Streptococcus pneumoniae stammen. Die Pneumokokken-Kapselpolysaccharidantigene sind bevorzugt aus den Serotypen 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F und 33F ausgewählt (am meisten bevorzugt aus den Serotypen 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F und 23F). Eine weitere bevorzugte Ausführungsform enthält die Kapselpolysaccharide vom Typ 5, Typ 8 oder 336 von Staphylococcus aureus. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform enthält die Kapselpolysaccharide vom Typ 2, Typ III oder Typ III von Staphylococcus epidermidis. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform enthält die Kapselpolysaccharide vom Typ Ia, Typ Ic, Typ II oder Typ III von Streptococcus Gruppe B. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform würde die Kapselpolysaccharide von Streptococcus Gruppe A enthalten, bevorzugt ferner umfassend wenigstens ein M-Protein und besonders bevorzugt multiple Typen von M-Protein.
Die immunogene Zusammensetzung der Erfindung kann mit Proteinantigenen formuliert werden. Bevorzugte Pneumokokken-Proteinantigene sind diejenigen Pneumokokken-Proteine, die auf der äußeren Oberfläche des Pneumococcus exponiert sind (fähig zur Erkennung durch das Immunsystem eines Wirtes während zumindest eines Teils des Lebenszyklus des Pneumococcus), oder sind Proteine, die durch den Pneumococcus sezerniert oder freigesetzt werden. Am meisten bevorzugt ist das Protein ein Toxin, Adhäsin, 2-Komponenten-Signaltransduktor oder Lipoprotein von Streptococcus pneumoniae oder Fragmente davon. Besonders bevorzugte Proteine schließen ohne Beschränkung ein: Pneumolysin (bevorzugt entgiftet durch chemische Behandlung oder Mutation) [Mitchell et al., Nucleic Acids Res. 11. Juli 1990; 18(13): 4010 "Comparion of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell et al., Biochim. Biophys. Acta 23. Januar 1989; 1007(1): 67-72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties.", WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al.), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA und Transmembran-Deletionsvarianten davon ( US 5804193 – Briles et al.); PspC und Transmembran-Deletionsvarianten davon (WO 97/09994 – Briles et al.); PsaA und Transmembran-Deletionsvarianten davon (Berry & Paton, Infect. Immun. Dezember 1996; 64(12): 5255-62 "Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); Cholin-bindende Proteine aus Pneumokokken und Transmembran-Deletionsvarianten davon; CbpA und Transmembran-Deletionsvarianten davon (WO 97/41151; WO 99/51266); Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (Infect. Immun. 1996, 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato et al., FEMS Microbiol. Lett. 1998, 164:207-14); M-artiges Protein ( EP 0837130 ) und Adhäsin 18627 ( EP 0834568 ). Weitere bevorzugte Pneumokokken-Proteinantigene sind diejenigen, die in WO 98/18931 offenbart werden, insbesondere diejenigen, die in WO 98/18930 und PCT/US99/30390 ausgewählt werden.
Bevorzugte Neisseria-Proteine zur Formulierung mit der immunogenen Zusammensetzung der Erfindung schließen ein: TbpA (WO 93/06861; EP 586266 ; WO 92/03467; US 5912336 ), TbpB (WO 93/06861; EP 586266 ), Hsf (WO 99/31132), NspA (WO 96/29412), Hap (PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (auch bekannt als D15) (WO 00/23595), PilQ (PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (WO 96/31618, siehe SEQ ID NO:38), FrpA oder FrpC oder ein konservierter Anteil, der beiden gemeinsam ist, mit wenigstens 30, 50, 100, 500 oder 750 Aminosäuren (WO 92/01460), LpbA und/oder LbpB (PCT/EP98/05117; Schryvers et al., Med. Microbiol. 1999, 32: 1117), FhaB (WO 98/02547), HasR (PCT/EP99/05989), lip02 (PCT/EP99/08315), MltA (WO 99/57280) und ctrA (PCT/EP00/00135). Neisseria-Protein kann als gereinigte Proteine oder als Teil einer Außenmembranvesikelzubereitung hinzugegeben werden.
Die immunogene Zusammensetzung wird bevorzugt mit Antigenen formuliert, die Schutz gegen eine oder mehrere aus Diphtherie-, Tetanus- und Bordetella pertussis-Infektionen liefern. Die Pertussis-Komponente kann abgetötetes Vollzell-B. pertussis (Pw) sein oder ist bevorzugt azelluläres Pertussis (Pa), das wenigstens ein Antigen (bevorzugt zwei oder alle drei) aus PT, FHA und 69 kDa Pertactin enthält. Bestimmte andere azelluläre Impfstoffe enthalten auch Agglutinogene wie Fim 2 und Fim 3, und diese Impfstoffe werden auch zur Verwendung in der Erfindung erwogen. Typischerweise sind die Antigene, die Schutz gegen Diphtherie und Tetanus liefern, Diphtherietoxoid und Tetanustoxoid. Die Toxoide sind chemisch inaktivierte Toxine, zum Beispiel nach Behandlung mit Formaldehyd, oder Toxine, die durch Einführung einer oder mehrerer Punktmutationen inaktiviert sind.
Alternativ kann die immunogene Zusammensetzung der Erfindung als Kit mit dem getrockneten Feststoff, dem geschäumten Glas oder der hochviskosen Flüssigkeit in einem Behälter und flüssigem DTPa oder DTPw in einem anderen Behälter bereitgestellt werden. Solche Kits können zum Beispiel eine Doppelkammerspritze mit den getrockneten und flüssigen Komponenten umfassen, die in der gleichen Spritze, aber in unterschiedlichen Kammern enthalten sind. Die getrocknete Komponente wird dann mit dem flüssigen Impfstoff unmittelbar vor der Injektion als Einzelimpfstoff rekonstituiert. So wird beispielsweise der getrocknete Feststoff, das geschäumte Glas oder die hochviskose Flüssigkeit der Erfindung mit dem flüssigen DTPa- oder DTPw-Impfstoff (bevorzugt unvorbereitet) rekonstituiert und als Einzelimpfstoff verabreicht. Der DTPa- oder DTPw-Impfstoff ist typischerweise zumindest teilweise mit einem Aluminiumsalz wie Aluminiumphosphat und/oder Aluminiumhydroxid als Hilfsstoff versetzt (zum Beispiel Infanrix^®- und Tritanrix^®-Impfstoffe von GlaxoSmithKline Biologicals s.a.).
Die immunogene Zusammensetzung wird gegebenenfalls mit einem oder mehreren Antigenen, die einen Wirt gegen nicht-typisierbares Haemophilus influenzae schützen können, RSV und/oder einem oder mehreren Antigenen formuliert, die einen Wirt gegen Influenzavirus schützen können. Bevorzugte nicht-typisierbare H. influenzae-Proteinantigene schließen Fimbrinprotein ( US 5766608 ) und Fusionen ein, umfassend Peptide daraus (z.B. LB1-Fusion) ( US 5843464 – Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, Protein D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Hap und D15.
Bevorzugte Influenzavirusantigene schließen ganzes, Lebend- oder inaktiviertes Virus, Spalt-Influenzavirus, gezüchtet in Eiern oder MDCK-Zellen oder Vero-Zellen, oder ganze Grippevirosomen (wie beschrieben von R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) oder gereinigte oder rekombinante Proteine davon, wie zum Beispiel HA-, NP-, NA- oder M-Proteine, oder Kombinationen daraus ein.
Bevorzugte RSV-(respiratorisches Synzytialvirus)-Antigene schließen das F-Glycoprotein, das G-Glycoprotein, das HN-Protein, das M-Protein oder Derivate davon ein.
Kombinationsimpfstoffe, die DTB-Hib umfassen, sind fachbekannt. Jedoch sind Probleme mit bestimmten Formulierungen verbunden, die das einfache Vermischen von Hib mit anderen Antigenen beinhalten. Wenn sie nicht sorgfältig formuliert werden, können die Antikörpertiter, die gegen die Hib-Komponente erzeugt werden, niedriger als diejenigen sein, die durch die gleiche Dosis von Hib hervorgerufen werden, das separat geimpft wird, aufgrund von Interferenz mit anderen Komponenten des Impfstoffs. Obwohl dieses Problem allgemein fachbekannt ist und in verschiedenen Weisen angegangen wurde, liefern die immunogenen Zusammensetzungen der Erfindung, in denen Hib und IPV zusammen als getrockneter Feststoff oder hochviskose Flüssigkeit formuliert sind, eine alternative Lösung für dieses Problem.
Die immunogenen Zusammensetzungen der Erfindung können einen Teil eines Impfstoffkits bilden, in dem IPV und Hib in einer Komponente des Kits vorhanden sind und weitere Komponenten wie oben beschrieben in einer zweiten Komponente vorhanden sind, zum Beispiel eine Zweikammerspritze wie hier beschrieben. Die zwei Komponenten werden unmittelbar vor der Verabreichung des Impfstoffs zusammen vermischt. In solchen Formulierungen ist die Komponente, die IPV und Hib umfaßt, bevorzugt ein getrockneter Feststoff, ein geschäumtes Glas oder eine hochviskose Flüssigkeit, obwohl sie gegebenenfalls als Flüssigkeit formuliert ist. Diese Formulierung führt zu Antikörpertitern gegen die Hib-Komponente, die klinisch akzeptabel sind, um Schutz gegen das Haemophilus influenzae b-Pathogen zu liefern. Typischerweise sind die Antikörpertiter im Kombinationsimpfstoff zumindest 85 %, 90 %, bevorzugt ca. 100 o oder mehr derjenigen, die durch die gleiche Dosis von Hib in einem monovalenten Hib-Impfstoff hervorgerufen werden.
Impfstoffe der Erfindung
Die oben beschriebenen immunogenen Zusammensetzungen der Erfindung werden bevorzugt als Impfstoff formuliert. Bevorzugt enthält der Impfstoff eine Hilfsstoffmenge, die ausreichend zur Steigerung der Immunreaktion gegen das Immunogen ist. Geeignete Hilfsstoffe schließen ohne Beschränkung Aluminiumsalze wie Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat, Squalenmischungen (SAG-1), Muramylpeptid, Saponin-Derivat, Mycobakterium-Zellwand zubereitungen, Monophosphoryllipid A, Mycolsäure-Derivate, nichtionische Blockcopolymertenside, Quil A, Choleratoxin B-Untereinheit, Polyphosphazen und Derivate und immunstimulierende Komplexe (ISCOMs) ein, wie diejenigen, die beschrieben werden von Takahashi et al. (1990), Nature, 344:873-875. Zur veterinärmedizinischen Verwendung und zur Erzeugung von Antikörpern in Tieren können mitogene Komponenten von Freund-Adjuvans verwendet werden.
Die Impfstofformulierungen der Erfindung werden bevorzugt vor der Verwendung rekonstituiert. Die Rekonstituierung (Wiederherrichtung) beinhaltet das Vermischen einer flüssigen Komponente des Impfstoffs mit der getrockneten festen, geschäumten Glas- oder hochviskosen flüssigen Formulierung der Erfindung. Die Erfindung umfaßt auch einen Behälter mit einer wasserabstoßenden Innenoberfläche, der die immunogene Zusammensetzung oder den Impfstoff der Erfindung enthält. Die Verwendung eines solchen Behälters ist vorteilhaft, weil sie dazu führt, daß die getrocknete Zusammensetzung am Boden des Rohres in einer Form vorliegt, die leichter zu rekonstituieren ist.
Es ist vorteilhaft, einen gefärbten Farbstoff in der Konservierungsprobe aufzunehmen, um eine leichtere Visualisierung der getrockneten Zusammensetzung der Erfindung zu erlauben. Dies ist besonders wichtig während der Rekonstituierung zur Sicherstellung, daß der getrocknete Feststoff oder die hochviskose Flüssigkeit durchgehend vor der Verwendung rekonstituiert ist. Bevorzugt bewahrt der gefärbte Farbstoff seine Farbe bei einem neutralen pH und ist kompatibel mit der Injektion in einen Patienten. Am meisten bevorzugt ist der gefärbte Farbstoff Phenolrot.
Wie bei allen immunogenen Zusammensetzungen oder Impfstoffen müssen die immunologisch wirksamen Mengen der Immunogene empirisch bestimmt werden. Zu berücksichtigende Faktoren schließen die Immunogenität, ob das Immunogen mit einem Hilfsstoff oder Trägerprotein oder anderen Träger komplexiert oder kovalent daran gebunden wird oder nicht, den Verabreichungsweg und die Anzahl der immunisierenden Dosierungen zur Verabreichung ein. Solche Faktoren sind bekannt auf dem Impfstoffgebiet, und es liegt im Können der Immunologen, solche Bestimmungen ohne inakzeptables Experimentieren durchzuführen.
Die Substanz kann in variierenden Konzentrationen in der immunogenen Zusammensetzung der Erfindung vorhanden sein. Typischerweise ist die minimale Konzentration der Substanz eine Menge, die notwendig zum Erreichen ihrer beabsichtigten Verwendung ist, während die maximale Konzentration die maximale Menge ist, die in Lösung oder homogen suspendiert innerhalb der anfänglichen Mischung verbleiben wird. Zum Beispiel ist die minimale Menge eines Therapeutikums bevorzugt eine solche, die eine einzelne therapeutisch wirksame Dosierung liefern wird. Übersättigte Lösungen können ebenfalls verwendet werden, falls ein geschäumtes Glas vor der Kristallisierung gebildet wird. Für bioaktive Substanzen ist die minimale Konzentration eine Menge, die notwendig zur Bioaktivität bei Konstituierung ist, und die maximale Konzentration ist an dem Punkt erreicht, an dem eine homogene Suspension nicht mehr aufrechterhalten werden kann. Im Fall von einzeldosierten Einheiten ist die Menge diejenige einer einzelnen therapeutischen Anwendung. Allgemein wird erwartet, daß jede Dosis 1-100 μg Proteinantigen, bevorzugt 5-50 μg und am meisten bevorzugt 5-25 μg umfassen wird. Bevorzugte Dosen von bakteriellen Polysacchariden sind 10-20 μg, 10-5 μg, 5-2,5 μg oder 2,5-1 μg. Die bevorzugte Menge der Substanz variiert von Substanz zu Substanz, aber ist leicht durch einen Fachmann feststellbar.
Verfahren der Erfindung
Die Verfahren der Erfindung dienen der Konservierung einer Zusammensetzung, die IPV und ein Stabilisierungsmittel umfaßt, was zu einer Zusammensetzung führt, in der die Antigenität von IPV bewahrt ist. Bevorzugt wird ein bakterielles Polysaccharid in der zu trocknenden Probe aufgenommen.
In einer Ausführungsform beinhaltet das Verfahren der Erfindung das Trocknen von IPV und umfaßt die folgenden Schritte:

– Herstellen einer Konservierungsprobe durch Suspendieren oder Lösen von IPV in einer Lösung eines Stabilisierungsmittels; bevorzugt sind ein bakterielles Polysaccharid und/oder ein glasbildendes Polyol in der Konservierungsprobe vorhanden;
– Unterwerfen der Konservierungsprobe solchen Temperatur- und Druckbedingungen, daß Lösungsmittel aus der Konservierungsprobe verlorengeht; und
– Entfernen von Lösungsmittel, bis die Konservierungsprobe unter Bildung eines Feststoffs oder einer hochviskosen Flüssigkeit trocknet, in dem/der die Antigenität und/oder Immunogenität von IPV bewahrt ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Konservierungsprobe in einen Behälter mit einem wasserabstoßenden Inneren vor dem Trocknen eingeführt.
Ein weiteres Verfahren der Erfindung beinhaltet das Schaumtrocknen, umfassend die folgenden Schritte:

– Herstellen einer Konservierungsprobe durch Suspendieren oder Lösen von IPV in einer Lösung eines Stabilisierungsmittels; bevorzugt sind ein bakterielles Polysaccharid und/oder glasbildendes Polyol in der Konservierungsprobe vorhanden;
– Unterwerfen der Konservierungsprobe solchen Temperatur- und Druckbedingungen, daß die Konservierungsprobe einen Schaum bildet; und
– Entfernen von Lösungsmittel, bis der Schaum unter Bildung eines Feststoffs trocknet, in dem die Antigenität und/oder Immunogenität von IPV bewahrt ist.

Ein bevorzugtes Schaumtrocknungsverfahren der Erfindung verwendet einen Behälter mit einer wasserabstoßenden Innenoberfläche und enthält die folgenden Schritte:

– Herstellen einer Konservierungsprobe durch Suspendieren oder Lösen von IPV und bevorzugt einem bakteriellen Polysaccharid in einer Lösung eines Stabilisierungsmittels;
– Einführen der Konservierungsprobe in einen Behälter mit einer wasserabstoßenden Innenoberfläche;
– Unterwerfen des Behälters, der die Konservierungsprobe enthält, solchen Temperatur- und Druckbedingungen, daß die Konservierungsprobe einen Schaum bildet;
– Entfernen von Lösungsmittel, bis der Schaum unter Bildung eines Feststoffs trocknet, in dem die Antigenität und/oder Immunogenität von IPV bewahrt ist.

Die oben beschriebenen Schaumtrocknungsverfahren der Erfindung umfassen gegebenenfalls einen Gefrierschritt. Die Konservierungsprobe kann vollständig oder teilweise eingefroren werden. Deshalb umfassen einige Verfahren der Erfindung die folgenden Schritte:

– Herstellen einer zumindest teilweise gefrorenen Konservierungsprobe durch Suspendieren oder Lösen von IPV und bevorzugt einem bakteriellen Polysaccharid in einer Lösung eines Stabilisierungsmittels und Einfrieren der Mischung;
– Unterwerfen der wenigstens teilweise gefrorenen Konservierungsprobe solchen Temperatur- und Druckbedingungen, daß die Konservierungsprobe einen Schaum bildet; und
– Entfernen von Lösungsmittel, bis der Schaum unter Bildung eines Feststoffs trocknet, in dem die Antigenität oder Immunogenität von IPV bewahrt ist.

Der Gefrierschritt des obigen Verfahrens erfolgt bevorzugt durch das Verfahren des Abschreckgefrierens ("Quench Freezing"), in dem die Reduzierung des Drucks die Ursache des Gefrierens durch Verdampfung ist. Dies verursacht ein schnelles Einfrieren der Probe, was zu weniger Antigenverlust führt. Deshalb schließt ein Verfahren der Erfindung die folgenden Schritte ein:

– Herstellen einer Konservierungsprobe durch Suspendieren oder Lösen von IPV und bevorzugt einem bakteriellen Polysaccharid in einer Lösung eines Stabilisierungsmittels;
– Unterwerfen der Konservierungsprobe einem reduzierten Druck, so daß die Konservierungsprobe zumindest teilweise eingefroren wird;
– Unterwerfen der zumindest teilweise eingefrorenen Konservierungsprobe solchen Temperatur- und Druckbedingungen, daß die Konservierungsprobe einen Schaum bildet; und
– Entfernen von Lösungsmittel, bis der Schaum unter Bildung eines Feststoffs trocknet, in dem die Antigenität und/oder Immunogenität von IPV bewahrt ist.

Ein weiteres bevorzugtes Verfahren der Erfindung wird zur Konservierung von IPV verwendet und umfaßt die folgenden Schritte:

– Herstellen einer Konservierungsprobe durch Suspendieren oder Lösen von IPV in einer Lösung eines Stabilisierungsmittels;
– Unterwerfen der Konservierungsprobe solchen Temperatur- und Druckbedingungen, daß die Koservierungsprobe Lösungsmittel durch Verdampfung verliert, ohne Blasenbildung unter Bildung eines Schaums und bevorzugt ohne Einfrieren;
– Entfernen von Lösungsmittel, bis die Probe unter Bildung einer hochviskosen Flüssigkeit trocknet, in der die Antigenität und/oder Immunogenität von IPV bewahrt ist.

Die Verfahren der Erfindung erzeugen eine Formulierung von IPV, die ausgedehnter Lagerung standhalten kann, wobei die Antigenität und/oder Immunogenität von IPV bewahrt wird. Bevorzugt bewahrt das IPV wenigstens 40, 50, 60, 70, bevorzugt 80, 90 oder 95 % seiner ursprünglichen Antigenität und/oder Immunogenität über einen Zeitraum von wenigstens 3, 6, 9, 12 oder 24 Monaten Lagerung bei 4°C. Antigenität und Immunogenität werden nach Rekonstituierung von IPV in einer geeigneten wäßrigen Lösung unter Verwendung eines geeigneten Verfahrens gemessen, zum Beispiel mit den oben beschriebenen.
Das Trocknungsverfahren ohne Einfrieren oder Schaumbildung ist besonders anwendbar zur Verwendung, wenn die zu trocknenden aktiven Mittel zu Verlust von Aktivität und/oder Antigenität während des Trocknungsverfahrens aufgrund von Kontakt mit Einfrieren oder aufgrund der mit der Schaumbildung verbundenen Bläschenbildung neigen. Es ist auch besonders anwendbar zur Verwendung, wenn eine geringere Konzentration des glasbildenden Polyols vorteilhaft ist und/oder wenn ein kürzeres Trocknungsverfahren bevorzugt ist.
Stabilisierungsmittel
Das in den Verfahren der Erfindung zu verwendende Stabilisierungsmittel wird bevorzugt glasbildende Polyole umfassen. Geeignete Materialien schließen ohne Beschränkung alle Polyole ein, einschließlich von Kohlehydrat- und Nicht-Kohlehydratpolyolen. Bevorzugt ermöglicht das stabilisierende Polyol dem aktiven Mittel die Lagerung ohne wesentlichen Verlust an Aktivität durch Denaturierung, Aggregation oder auf andere weise. Besonders geeignete Stoffe schließen Zucker, Zuckeralkohole und Kohlehydratderivate ein. Bevorzugt ist das glasbildende Polyol ein Kohlehydrat oder Derivate davon, einschließlich Glucose, Maltulose, Isomaltulose, Lactulose, Saccharose, Maltose, Lactose, Isomaltose, Maltit, Lactit, Palatinit, Trehalose, Raffinose, Stachyose, Melezitose oder Dextran, am meisten bevorzugt Trehalose, Saccharose, Sorbit, Raffinose, Mannit, Lactose, Lactit oder Palatinit.
Bakterielle Polysaccharide wirken als Stabilisierungsmittel, und bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beinhalten bakterielle Polysaccharide als Bestandteil des Stabilisierungsmittels. Das bakterielle Polysaccharid spielt eine doppelte Rolle als Stabilisierungsmittel und Immunogen in dieser Ausführungsform.
Kohlehydrate schließen ohne Beschränkung Monosaccharide, Disaccharide, Trisaccharide, Oligosaccharide und ihre entsprechenden Zuckeralkohole, Polyhydroxy-Verbindungen wie Kohlehydratderivate und chemisch modifizierte Kohlehydrate, Hydroxyethylstärke und Zuckercopolymere ein. Sowohl natürliche als auch synthetische Kohlehydrate sind zur Verwendung geeignet. Synthetische Kohlehydrate schließen ohne Beschränkung diejenigen ein, in denen die glycosidische Bindung durch eine Thiol- oder Kohlenstoffbindung ersetzt ist. Sowohl D- als auch L-Formen der Kohlehydrate können verwendet werden. Das Kohlehydrat kann nicht-reduzierend oder reduzierend sein. Wenn ein reduzierendes Kohlehydrat verwendet wird, ist die Zugabe von Inhibitoren der Maillard-Reaktion bevorzugt.
Zur Verwendung in der Erfindung geeignete reduzierende Kohlehydrate sind die fachbekannten und schließen ohne Beschränkung Glucose, Maltose, Lactose, Fructose, Galactose, Mannose, Maltulose und Lactulose ein. Nicht-reduzierende Kohlehydrate schließen ohne Beschränkung nicht-reduzierende Glycoside von Polyhydroxy-Verbindungen ein, die aus Zuckeralkoholen und anderen geradkettigen Polyalkoholen ausgewählt sind. Andere nützliche Kohlehydrate schließen Raffinose, Stachyose, Melezitose, Dextran, Saccharose, Cellobiose, Mannobiose und Zuckeralkohole ein. Die Zuckeralkoholglycoside sind bevorzugt Monoglycoside, insbesondere die Verbindungen, die durch Reduktion von Disacchariden wie Lactose, Maltose, Lactulose und Maltulose erhalten werden.
Besonders bevorzugte Kohlehydrate sind Trehalose, Saccharose, Sorbit, Maltit, Lactit, Palatinit und Glucopyranosyl-1→6-Mannit.
Aminosäuren können als Stabilisierungsmittel wirken und können als solche und bevorzugt in Kombination mit einem Polyol verwendet werden. Bevorzugte Aminosäuren schließen Glycin, Alanin, Arginin, Lysin und Glutamin ein, obwohl jede Aminosäure oder eine Kombination von Aminosäuren, Peptid, hydrolysierte Proteine oder Protein wie Serumalbumin als Stabilisierungsmittel wirken kann.
Bevorzugt wird die Konservierungsprobe eine Komponente enthalten, die die Kristallbildung in dem getrockneten Feststoff oder der hochviskosen Flüssigkeit der Erfindung inhibieren kann. Salze und andere Moleküle, die Aminosäuren und Phenolrot einschließen, inhibieren die Kristallbildung.
Die Konzentration des im Verfahren der Erfindung verwendeten Stabilisierungsmittels kann zwischen 1 und 5 % Gewicht/Volumen sein, bevorzugt 1-5 %, 5-10 %, 5-10 %, 15-20 %, 20-25 % oder 25-50 %, am meisten bevorzugt weniger als 25 % (G/V). Die erforderliche Menge des Stabilisierungsmittels ist proportional zur Menge an vorhandenen Salzen. Obwohl Mengen von Stabilisierungsmittel zwischen 3 und 10 % bevorzugt sind, können deshalb höhere Konzentrationen von 10 bis 25 % (G/V) zur Trocknung von Proben mit einem hohen Salzgehalt erforderlich sein.
Behälter
Unterschiedliche Mischungen und verschiedene Behälterformen und -größen können gleichzeitig verarbeitet werden. Idealerweise ist die verwendete Behältergröße ausreichend, um die Anfangsmischung zu enthalten und das Volumen der daraus gebildeten getrockneten Formulierung aufzunehmen. Typischerweise wird dies durch die Masse des glasbildenden Materials, die Oberfläche des Behälters und die Temperatur- und Druck bedingungen bestimmt, die bestimmen, ob ein Schäumen auftritt. Die Masse des glasbildenden Materials muß ausreichend sein, um einen viskosen Sirup zu ergeben, gegebenenfalls zur Schäumung, was in der Praxis einer minimalen Masse pro Einheitsfläche der Behälteroberfläche entspricht. Dieses Verhältnis variiert von Mischung zu Mischung und verwendetem Behälter, aber wird leicht empirisch durch einen Fachmann unter Befolgen der hier wiedergegebenen Verfahren bestimmt. Alle solche Behälter können verwendet werden, einschließlich Flaschen in Wheaton-Form und Rohrform.
Die Verfahren der Erfindung verwenden bevorzugt Behälter mit einer wasserabstoßenden Innenoberfläche. Dies wird durch Beschichten der Innenoberfläche mit einer hydrophoben Zusammensetzung erreicht, zum Beispiel durch Siliconisierung. Siliconisierung wird durch Verfahren erreicht, die den Fachleuten wohlbekannt sind. In einem Verfahren wird der Behälter durch Spülen des Inneren des Behälters mit einer Siliconemulsion siliconisiert, gefolgt von Bearbeitung in einem Ofen bei hoher Temperatur, typischerweise 350°C. Alternativ wird die wasserabstoßende Innenoberfläche erreicht, indem der Behälter aus einer wasserabstoßenden Zusammensetzung hergestellt wird.
Die wasserabstoßende Innenoberfläche des Behälters führt dazu, daß eher Schaumbildung auftritt und sie reproduzierbarer ist. Dies erlaubt die Verwendung von niedrigeren Polyolkonzentrationen in der Konservierungsprobe, was wiederum die zur Trocknung der Probe notwendige Dauer verringert und die Wirkung von Maillard-Reaktionen oder anderen Wechselwirkungen mit dem Polyol reduziert, die das aktive Mittel schädigen. Wenn die Konservierungsproben einen Impfstoff umfassen, wird das resultierende geschäumte Glas schnell und leicht aufgrund der geringeren Menge an vorhandenem Polyol rekonstituiert, und die resultierende Impfstofflösung ist weniger viskos, was eine leichtere Verabreichung erlaubt. Die wasserabstoßende Innenoberfläche erlaubt eine leichtere Rekonstituierung des getrockneten Feststoffs oder der hochviskosen Flüssigkeit, da sie die Probe veranlaßt, am Boden des Behälters zu verbleiben, so daß sie leichter wirksam zu rekonstituieren ist.
Obwohl Einzelformen hier verwendet werden können, können mehr als ein Stabilisierungsmittel, mehr als ein Additiv und mehr als eine Substanz vorhanden sein. Wirksame Mengen dieser Komponenten werden leicht durch einen Fachmann bestimmt.
Lösungsmittel
Die Konservierungsprobe wird durch Lösen/Suspendieren von IPV und einem Stabilisierungsmittel in Wasser zur Herstellung einer wäßrigen Lösung hergestellt. Bevorzugt ist Wasser in der Konservierungsprobe in einer Menge von 5 bis 98 Vol.-%, besonders bevorzugt 80-98 Vol.-% und am meisten bevorzugt 85-98 Vol.-% vorhanden.
Das Volumen des Lösungsmittels kann variieren und wird vom Stabilisierungsmittel und der aufzunehmenden Substanz sowie von etwaigen Additiven abhängen. Das minimale erforderliche Volumen ist eine Menge, die zur Solubilisierung der verschiedenen Komponenten notwendig ist. Jedoch können auch homogen dispergierte Suspensionen der Substanz(en) verwendet werden. Geeignete Mengen der Komponenten in spezifischen Ausführungsformen sind durch die Fachleute angesichts der hier bereitgestellten Beispiele leicht feststellbar.
Verschiedene Additive können in die Konservierungsprobe gegeben werden. Typischerweise steigern die Additive die Schaumbildung und/oder den Trocknungsprozeß und/oder tragen zur Solubilisierung der Substanz bei. Alternativ tragen Additive zur Stabilität der im Feststoff aufgenommenen Substanzen bei. Ein oder mehrere Additive können vorhanden sein.
Beispielsweise erlaubt die Zugabe von flüchtigen/brausenden Salzen größere Anfangsvolumina und führt zu einer höheren Oberfläche im geschäumten Glas, wodurch eine überlegene Schaumbildung und ein schnelleres Trocknen bewirkt werden. Wie hier verwendet, sind flüchtige Salze solche Salze, die sich unter den zur Herstellung eines geschäumten Glases verwendeten Bedingungen verflüchtigen. Beispiele für geeignete flüchtige Salze schließen ohne Beschränkung Ammoniumacetat, Ammoniumbicarbonat und Ammoniumcarbonat ein. Salze, die sich unter Erhalt gasförmiger Produkte zersetzen, bewirken ebenfalls eine gesteigerte Schaumbildung und ein schnelleres Trocknen. Beispiele für solche Salze sind Natriumbicarbonat und Natriummetabisulfit. Bevorzugt sind die flüchtigen Salze in einer Menge von ca. 0,01 bis 5 M vorhanden. Konzentrationen von bis zu 5 M sind hier zur Verwendung geeignet. Das resultierende geschäumte Glas weist eine gleichförmige Schaumkonformation auf und ist signifikant trockener im Vergleich zu geschäumtem Glas, in dem flüchtige/brausende Salze nicht verwendet werden.
Ein weiteres geeignetes Additiv ist ein Schaumstabilisierungsmittel, das in Kombination mit entweder dem flüchtigen oder dem sich zersetzenden Salz verwendet werden kann. Dies kann entweder eine oberflächenaktive Komponente wie ein amphipathisches Molekül (d.h. wie Phospholipide und Tenside) oder ein Mittel zur Erhöhung der Viskosität des schäumenden Sirups, wie zum Beispiel ein Verdickungsmittel wie Guargummi und Derivate davon, sein.
Ein anderes Additiv ist ein Inhibitor der Maillard-Reaktion. Falls die Substanz und/oder das die Glasmatrix bildende Material Carbonyl- und Amino-, Amino- oder Guanidino-Gruppen enthält, enthalten die Zusammensetzungen ferner vorzugsweise wenigstens einen physiologisch akzeptablen Inhibitor der Maillard-Reaktion in einer zur wesentlichen Verhinderung der Kondensation von Amino-Gruppe und reaktiven Carbonyl-Gruppen in der Zusammensetzung wirksamen Menge. Der Inhibitor der Maillard-Reaktion kann jeder fachbekannte sein. Der Inhibitor ist in einer zur Verhinderung oder wesentlichen Verhinderung der Kondensation von Amino-Gruppen und reaktiven Carbonyl-Gruppen ausreichenden Menge vorhanden. Typischerweise sind die Amino-Gruppen auf der Substanz vorhanden, und die Carbonyl-Gruppen sind auf dem die Glasmatrix bildenden Material vorhanden, oder umgekehrt. Jedoch können die Aminosäuren und Carbonyl-Gruppen intramolekular in entweder der Substanz oder dem Kohlehydrat sein.
Verschiedene Klassen von Verbindungen sind dafür bekannt, eine inhibierende Wirkung auf die Maillard-Reaktion auszuüben, und sind deshalb von Nutzen in der hier beschriebenen Zusammensetzungen. Diese Verbindungen sind allgemein entweder kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren der Maillard-Reaktion. Kompetitive Inhibitoren schließen ohne Beschränkung Aminosäurereste (sowohl D als auch L), Kombinationen von Aminosäureresten und Peptide ein. Besonders bevorzugt sind Lysin, Arginin, Histidin und Tryptophan. Lysin und Arginin sind die am stärksten wirksamen. Es gibt viele bekannte nicht-kompetitive Inhibitoren. Diese schließen ohne Beschränkung Aminoguanidin und Derivate und Amphotericin B ein. EP-A-0 433 679 beschreibt auch geeignete Maillard-Inhibitoren, die 4-Hydroxy-5,8-dioxochinolin-Derivate einschließen.
Aktive Mittel
Die Verfahren der Erfindung werden zur Konservierung von inaktiviertem Poliovirus verwendet (IPV – bevorzugt umfassend die Typen 1, 2 und 3, wie es Standard auf dem Impfstoffgebiet ist, am meisten bevorzugt den Salk-Polioimpfstoff). IPV enthält 20-80, bevorzugt 40 oder 80 D-Antigeneinheiten vom Typ 1 (Mahoney), 4-20, bevorzugt 8 oder 16 D-Antigeneinheiten vom Typ 2 (MEF-1) und 20-64, bevorzugt 32 oder 64 D-Antigeneinheiten vom Typ 3 (Saukett). Die IPV-Impfstofformulierung ist geeignet zur Injektion nach Rekonstituierung in einer wäßrigen Lösung, die bevorzugte zusätzliche Impfstoffkomponenten enthält.
Die durch das Verfahren der Erfindung aufgenommenen bakteriellen Polysaccharide sind zum Beispiel Kapselpolysaccharide, die aus einem oder mehreren aus Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, Streptokokken Gruppe A, Streptokokken Gruppe B, Staphylococcus aureus oder Staphylococcus epidermidis stammen, bevorzugt die PRP-Kapselpolysaccharide von Haemophilus influenzae. Bevorzugte Kapselpolysaccharide schließen auch diejenigen ein, die aus einer oder mehreren der Serogruppen A, C, W-135 und Y von Neisseria meningitidis stammen. Weitere bevorzugte Kapselpolysaccharide stammen aus Streptococcus pneumoniae. Die Pneumokokken-Kapselpolysaccharidantigene werden bevorzugt ausgewählt aus den Serotypen 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F und 33F (am meisten bevorzugt aus den Serotypen 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F und 23 F). Eine weitere bevorzugte Ausführungsform enthält die Kapselpolysaccharide vom Typ 5, Typ 8 oder 336 von Staphylococcus aureus. Weitere bevorzugte Polysaccharide schließen die Kapselpolysaccharide vom Typ 2, Typ II oder Typ III von Staphylococcus epidermidis, die Kapselpolysaccharide vom Typ Ia, Typ Ic, Typ II oder Typ III von Streptococcus Gruppe B ein. Weitere bevorzugte Polysaccharide schließen die Kapselpolysaccharide von Streptococcus Gruppe A ein, bevorzugt ferner umfassend wenigstens ein M-Protein und besonders bevorzugt multiple Typen von M-Protein.
Bevorzugte Kombinationen aus aktiven Mitteln, die unter Verwendung der Verfahren der Erfindung konserviert werden sollen, umfassen IPV. Bevorzugt wird IPV mit bakteriellen Polysacchariden kombiniert, die eines oder mehrere aus Hib-PRP-Polysaccharid und/oder Meningokokken-Polysaccharid A, C, W und/oder Y und/oder Pneumokokken-Polysacchariden umfassen. Bevorzugte Kombinationen schließen IPV und Hib; IPV und MenC; IPV und MenA und C; IPV und Hib und MenC oder IPV, Hib, MenA und C ein. Jedes bakterielle Polysaccharid kann in Dosen von 1-5 μg, 5-10 μg, 10-20 μg oder 20-40 μg vorhanden sein.
Bakterielle Polysaccharide sind unkonjugiert oder mit einem Trägerprotein wie Tetanustoxoid, Tetanustoxoidfragment C, Diphtherietoxoid, CRM197, Pneumolysin oder Protein D ( US 6342224 ) konjugiert.
Die Polysaccharidkonjugate werden durch jede bekannte Kupplungstechnik hergestellt. Ein bevorzugtes Konjugationsverfahren beruht auf der Aktivierung des Polysaccharids mit 1-Cyano-4-dimethylaminopyridiniumtetrafluoroborat (CDAP) unter Bildung eines Cyanatesters. Das aktivierte Polysaccharid wird direkt oder über eine Spacer-Gruppe an eine Amino-Gruppe auf dem Trägerprotein gekuppelt. Bevorzugt wird der Cyanatester mit Hexandiamin gekuppelt, und das Amino-derivatisierte Polysaccharid wird mit dem Trägerprotein unter Verwendung von Heteroligationschemie konjugiert, die die Bildung der Tioetherbindung beinhaltet. Solche Konjugate werden in WO 93/15760 (Uniformed Services University) beschrieben.
Die Konjugate werden optional durch direkte reduktive Aminierungsverfahren hergestellt, wie sie in US 4365170 (Jennings) und US 4673574 (Anderson) beschrieben werden. Andere Verfahren werden beschrieben in EP-0-161-188, EP-208375 und EP-0-477508.
Ein weiteres Verfahren beinhaltet die Kupplung eines Bromcyan-aktivierten Polysaccharids, das mit Adipinsäurehydrazid (ADH) derivatisiert ist, an das Trägerprotein durch Carbodiimid-Kondensation (C. Chu et al., Infect. Immunity, 1983, 245-256).
Trocknungsverfahren
In einer Ausführungsform beinhaltet das Verfahren der Erfindung das Trocknen von IPV in Gegenwart eines Stabilisierungsmittels, bevorzugt in Gegenwart eines bakteriellen Polysaccharids. In diesem Verfahren wird die Konservierungsprobe reduzierten Temperatur- und Druckbedingungen unterworfen. Die Temperatur wird auf weniger als 20°C oder 0°C reduziert, bevorzugt auf weniger als –10°C oder –20°C, besonders bevorzugt auf –40°C oder –60°C. Der Druck wird auf weniger als 1 mbar reduziert, bevorzugt auf einen Druck von gleich oder weniger als 0;5, 0,1, besonders bevorzugt 0,05 oder 0,01 mbar. Die reduzierten Temperatur- und Druckbedingungen werden für wenigstens 10, 12, 16, 20, bevorzugt 24, 36, besonders bevorzugt 48 oder 72 Stunden gehalten. Lösungsmittel wird entfernt, bis die Konservierungsprobe unter Bildung eines Feststoffs trocknet.
Durchgehend in dieser Anmeldung schließt Feststoff Gläser, Gummis und Kristalle ein, die sich bilden, wenn die Probe trocknet. Solche Feststoffe bewahren bevorzugt einen Wassergehalt von 10-20 % oder 5-10 %, bevorzugt 5-6 %, 4-5 % oder 3-4 % oder 2-3 %, besonders bevorzugt 1-2 % oder 0-1 % (G/G).
Schaumtrocknung
Ein bevorzugtes Verfahren der Erfindung beinhaltet das Unterwerfen der Konservierungsprobe solchen Druck- und Temperaturbedingungen, daß die Probe zu perlen beginnt, wobei ein Schaum gebildet wird.
Die Temperatur innerhalb der Konservierungsprobe wird sich von derjenigen außerhalb der Probe aufgrund der endothermen Natur des Verdampfungsprozesses unterscheiden. Verweise auf die Temperatur beziehen sich auf die Bedingungen außerhalb der Konservierungsprobe, zum Beispiel auf die Temperatur des Regalbodens, wenn ein großer industrieller Gefriertrockner verwendet wird. Dies entspricht gewöhnlich der Temperatureinstellung des Gefriertrockners.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung erreicht dies durch Reduzieren des Drucks, während die Temperaturbedingungen gehalten werden. Der Druck wird auf gleich oder weniger als 8, 7, 6, bevorzugt 5, 4, 3, besonders bevorzugt 2, 1,5, 1, am meisten bevorzugt 0,8 oder 0,5 mbar eingestellt, während die Temperatureinstellung auf einer Temperatur oberhalb 0°C, bevorzugt zwischen 10 und 15°C; 15 und 20°C; 20 und 25°C; 25 und 30°C; oder 30 und 37°C gehalten wird. Diese Bedingungen werden für wenigstens 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 16 oder 24 Stunden gehalten.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung erreicht die Schaumbildung durch Veränderung der Temperatur, während die Druckbedingungen reduziert gehalten werden. Die Temperatureinstellung wird auf oberhalb 20°C, bevorzugt auf 20 bis 30°C; 30 bis 40°C; 40 bis 50°C; oder 50 bis 70°C erhöht; oder die Temperatureinstellung ist im Bereich von 10-50°C, bevorzugt 20-40°C, besonders bevorzugt 25-35°C. Druckbedingungen werden auf einem reduzierten Niveau von gleich oder unter 8, 7, 6, bevorzugt 5, 4, 3, besonders bevorzugt 2, 1,5, 1, am meisten bevorzugt 0,8 oder 0,5 mbar gehalten. Diese Bedingungen werden für wenigstens 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 16 oder 24 Stunden gehalten.
Entfernung von Lösungsmittel zur Bildung eines geschäumten Glases
Eine anschließende Stufe des Schaumtrocknungsverfahrens der Erfindung beinhaltet die Entfernung von Lösungsmittel, bis der Schaum unter Bildung eines Feststoffs trocknet. In einer Ausführungsform der Erfindung wird dies durch Halten der Druck- und Temperaturbedingungen auf denjenigen erreicht, die zum Erreichen der Schaumbildung angelegt werden. Zum Beispiel wird der Druck auf oder unterhalb 8, 7, 6, bevorzugt 5, 4, 3, besonders bevorzugt 2, 1,5, 1, am meisten bevorzugt 0,8 oder 0,5 mbar gehalten, während die Temperatureinstellung auf einer Temperatur von oberhalb 0°C, bevorzugt zwischen 2 und 10°C, 10 und 20°C; 20 und 30°C; 30 und 35°C, 35 und 40°C, am meisten bevorzugt zwischen 5 und 25°C gehalten wird. Diese Temperatur- und Druckbedingungen werden für 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 oder mehr Stunden gehalten, um einen Feststoff mit einem Lösungsmittelgehalt von gleich oder weniger als 10, 8, 5, 4, bevorzugt 3, 2 oder am meisten bevorzugt 1 % (G/G) zu erhalten.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung erhöht die Temperatureinstellung während der Lösungsmittelentfernung auf eine höhere Temperatureinstellung, als sie früher im Verfahren gehalten wird. Dies erlaubt vorteilhaft den Verlust des Lösungsmittels aus der Probe mit einer schnelleren Geschwindigkeit, so daß das Verfahren der Erfindung in einer kürzeren Zeit vollendet werden kann. Zum Beispiel wird die Temperatureinstellung auf oberhalb 0°C erhöht, bevorzugt zwischen 2 und 10°C; 10 und 20°C; 20 und 30°C; 30 und 40°C; 40 und 50°C; 50 und 60°C, während der Druck auf gleich oder unter 8, 7, 6 bevorzugt 5, 4, 3, besonders bevorzugt 2, 1,5, 1, am meisten bevorzugt 0,8 oder 0,5 mbar gehalten wird. Diese Temperatur- und Druckbedingungen werden für 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 oder mehr Stunden gehalten, um einen Feststoff mit weniger als 10, 8, 5, 4, bevorzugt 3, 2 oder am meisten bevorzugt 1 % (G/G) Wassergehalt zu erhalten.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung reduziert die Druckeinstellung während der Lösungsmittelentfernung auf eine geringere Druckeinstellung, als sie während der Schaumbildung verwendet wird. Dies erlaubt vorteilhaft den Verlust von Lösungsmittel aus der Probe mit einer schnelleren Geschwindigkeit, so daß das Verfahren der Erfindung in einer kürzeren Zeit vollendet werden kann. Zum Beispiel wird die Druckeinstellung auf gleich oder unter 5, 4, 3 oder bevorzugt 2, 1, 0,8, besonders bevorzugt 0,5, 0,1, am meisten bevorzugt 0,05 oder 0,01 mbar verringert, während die Temperatur auf gleich oder oberhalb 0°C, bevorzugt zwischen 10 und 20°C; 20 und 30°C; 30 und 35°C oder oberhalb 40°C gehalten wird. Diese Temperatur- und Druckbedingungen werden für 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 oder mehr Stunden gehalten, um einen Feststoff mit einem Lösungsmittelgehalt von gleich oder weniger als 5, 4, bevorzugt 3 oder 2 oder besonders bevorzugt 1 % (G/G) zu erhalten.
Schaumtrocknung einschließlich eines Gefrierschrittes
Das Verfahren der Erfindung beinhaltet gegebenenfalls das Einfrieren der Probe. Das Einfrieren der Probe vor der Schaumtrocknung hat den Vorteil der erhöhten Reproduzierbarkeit zwischen Proben in einer Charge. Dies beruht darauf, daß alle Proben das Verfahren vom gleichen physikalischen eingefrorenen Zustand beginnen. Die Konservierungsproben können vollständig oder teilweise eingefroren werden.
Das Einfrieren wird gegebenenfalls durchgeführt, bevor die Probe reduziertem Druck unterworfen wird, indem die Konservierungsprobe einer Temperatur von unter 0°C für eine geeignete Dauer ausgesetzt wird, um die Probe gefrieren zu lassen. Bevorzugt ist die verwendete Temperatur bei oder unterhalb –10°C, –15°C, –20°C, –30°C, –40°C, –70°C oder –140°C. Die Probe kann bei einer Temperatur von unter 0°C für 1, 2, 3, 4, 5, 8, 16 oder mehr Stunden belassen werden, um das Gefrieren zu erlauben.
Für einige Proben, insbesondere Proben, die leicht durch Lösungsmittelkristallbildung beschädigt werden, wie zum Beispiel Zellzubereitungen oder andere biologische Systeme, ist es bevorzugt, die Probe langsam mit einer Geschwindigkeit von gleich oder weniger als 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4 oder 5°C pro Stunde einzufrieren. Andere Zusammensetzungen werden wirksamer durch sofortiges Einfrieren konserviert, zum Beispiel durch Schockgefrieren ("Snap Freezing") in flüssigem Stickstoff. Dieses Verfahren ist besonders vorteilhaft für Proteine oder virale Partikel. Das Einfrieren durch Verdampfung führt ebenfalls zu einem schnellen Einfrieren der Probe.
Alternativ wird die Konservierungsprobe durch Unterwerfen der Probe einem solchen reduzierten Druck eingefroren, daß die Probe vollständig oder teilweise eingefroren wird. Ein solches Abschreckgefrieren wird innerhalb einer Masse-Gefriertrocknungsvorrichtung bei einer Regalbodentemperatur von gleich oder oberhalb 0°C, 10°C, 15°C, 20°C, 30°C oder 37°C durchgeführt. Bevorzugt ist die Regalbodentemperatur zwischen 5 und 35°C, besonders bevorzugt zwischen 10 und 20°C, am meisten bevorzugt bei 15°C. Der Druck wird gegebenenfalls anfänglich auf 200 mbar für 5, 10, 20, 30, 60 oder mehr Minuten reduziert, um ein Entgasen zu erlauben. Zum Einfrieren der Probe wird der Druck weiter auf einen Druck von gleich oder weniger als 2, 1, 0,5, 0,2 oder 0,1 mbar reduziert. Dieser Druck wird für wenigstens 5, 10, 20 oder 30 Minuten gehalten, bis die Probe vollständig oder teilweise gefroren ist.
Anschließende Schritte der Schaumbildung und der Entfernung von Lösungsmittel zur Bildung eines Feststoffs sind wie oben beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Schritte des Einfrierens der Probe im Gefriertrockner und der Schaumbildung bei einer konstanten Temperatur durchgeführt, bevorzugt unter Veränderung der Druckbedingungen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Schritte des Einfrierens der Probe im Gefriertrockner, der Schaumbildung und der Lösungsmittelentfernung zur Bildung eines Feststoffs bei einer konstanten Temperatur durchgeführt, bevorzugt unter Veränderung der Druckbedingungen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung unterscheiden sich sowohl die Druck- als auch Temperaturbedingungen während der Schritte des Einfrierens der Probe, der Schaumbildung und der Lösungsmittelentfernung zur Bildung eines Feststoffs.
Die Verfahren der Erfindung verwenden bevorzugt Behälter mit einer wasserabstoßenden Innenoberfläche. Dies wird durch Beschichten der Innenoberfläche mit einer hydrophoben Zusammensetzung erreicht, zum Beispiel durch Siliconisierung. Siliconisierung wird durch Verfahren erreicht, die den Fachleuten wohlbekannt sind. Alternativ wird die wasserabstoßende Innenoberfläche erreicht, indem der Behälter aus einer wasserabstoßenden Zusammensetzung hergestellt wird.
Die Gegenwart einer wasserabstoßenden Innenoberfläche des Behälters macht die Schaumbildung eher wahrscheinlich und reproduzierbarer. Dies erlaubt die Verwendung geringerer Polyolkonzentrationen in der Konservierungsprobe, was wiederum die zur Trocknung der Probe erforderliche Dauer verringert und die Wirkung von Maillard-Reaktionen oder anderen schädlichen Wechselwirkungen zwischen dem Polyol und dem aktiven Mittel reduziert. Wenn die Konservierungsprobe einen Impfstoff umfaßt, wird der resultierende Feststoff aufgrund der geringeren vorhandenen Mengen an Polyol schneller rekonstituiert, und die resultierende Impfstofflösung ist weniger viskos, was eine leichtere Verabreichung erlaubt.
Trocknung ohne Gefrieren oder Schaumbildung
Ein besonders bevorzugtes Verfahren der Erfindung beinhaltet das Trocknen von IPV in Gegenwart eines Stabilisierungsmittels und bevorzugt eines bakteriellen Polysaccharids unter Verwendung eines vorsichtigen Verfahrens, das den Kontakt von IPV mit Einfrieren oder Schaumbildung vermeidet, so daß IPV weniger Streß während des Trocknungsverfahrens unterworfen und ein höherer Antigenitätsgrad bewahrt wird.
Dieses Verfahren ist besonders geeignet zur Verwendung, wenn eine geringere Konzentration des glasbildenden Polyols, zum Beispiel eine Konzentration von unterhalb 10 % (G/V), besonders bevorzugt unterhalb 5 % (G/V), vorteilhaft ist und eine kürzere Trocknungszeit bevorzugt ist.
Verlust von Lösungsmittel durch Verdampfung (verdampfende Trocknung – Schritt b)
Das Verfahren zur Trocknung ohne Einfrieren oder Schaumbildung beinhaltet das Unterwerfen der Konservierungsprobe solchen Druck- und Temperaturbedingungen, daß die Konservierungsprobe Lösungsmittel durch Verdampfung verliert, ohne die Probe einzufrieren oder Bläschenbildung unter Bildung eines Schaums.
Die Temperatur in der Konservierungsprobe wird sich zeitweise von derjenigen außerhalb der Probe aufgrund der endothermen Natur des Verdampfungsprozesses unterscheiden. Verweise auf die Temperatur beziehen sich auf die Zustände außerhalb der Konservierungsprobe, zum Beispiel auf die Temperatur des Regalbodens, wenn ein großer industrieller Gefriertrockner verwendet wird. Die entspricht. gewöhnlich der Temperatureinstellung des Gefriertrockners.
Gegebenenfalls ist ein vorläufiger Schritt der Entgasung der Konservierungsprobe im Verfahren der Erfindung vorhanden. Der Druck wird auf gleich oder weniger als 200 mbar, bevorzugt 200 bis 35 mbar, für einen Zeitraum von wenigstens 5 Minuten reduziert, bevor der Druck weiter reduziert wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung erreicht die verdampfende Trocknung durch Reduzieren des Drucks, während die Temperaturbedingungen gesteuert werden. Der Druck wird auf gleich oder weniger als 30, 25, 20, bevorzugt 15, 12, am meisten bevorzugt 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 mbar eingestellt, während die Temperatureinstellung auf einer Temperatur oberhalb 0°C, bevorzugt zwischen 4 und 37°C, 4 und 10°C, 10 und 15°C; 15 und 20°C; 20 und 25°C; 25 und 30°C; oder 30 und 37°C, oder 37 und 45°C gehalten wird. Diese Bedingungen werden für wenigstens 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 16 oder 24 Stunden, bevorzugt für 2-4 Stunden, 4-6 Stunden, 6-8 Stunden, 8-12 Stunden oder 12-18 Stunden gehalten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Druck oberhalb 2 mbar gehalten, wenn die Temperatureinstellung 15°C ist, um das Gefrieren der Probe zu verhindern. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Temperatur auf 15°C gehalten und der Druck auf 5-10 mbar, besonders bevorzugt 6-9 mbar, am meisten bevorzugt etwa 8 mbar eingestellt. Wenn eine höhere Temperatureinstellung verwendet wird, ist ein leicht geringerer Druck möglich, ohne die Probe einzufrieren, und wenn eine niedrigere Temperatureinstellung verwendet wird, sollte der Druck auf einem höheren Niveau zur Verhinderung von Einfrieren gehalten werden. Bevorzugt werden die Bedingungen für einen ausreichenden Zeitraum gehalten, so daß die Verdampfungsgeschwindigkeit verlangsamt ist, so daß die Temperatur der Probe etwa die gleiche wie diejenige außerhalb der Probe ist.
Bevorzugt sollte die Konservierungsprobe nicht einfrieren oder unter Bildung eines Schaums sieden und verliert Lösungsmittel unter Bildung einer viskosen Flüssigkeit oder eine hochviskosen Flüssigkeit.
Entfernung von Lösungsmittel zur Bildung einer hochviskosen Flüssigkeit
Eine nachfolgende Stufe des Verfahrens der Erfindung beinhaltet die Entfernung von Lösungsmittel, bis die Konservierungsprobe unter Bildung einer hochviskosen Flüssigkeit ohne Schaumbildung und bevorzugt ohne Gefrieren trocknet.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird dies durch Halten der Druck- und Temperaturbedingungen auf denjenigen erreicht, die in der ersten verdampfenden Trocknungsstufe eingesetzt werden. Zum Beispiel wird der Druck auf gleich oder unterhalb 30, 25, 20, bevorzugt 15, 12, am meisten bevorzugt 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 mbar gehalten, während die Temperatureinstellung auf einer Temperatur von oberhalb 0°C, bevorzugt zwischen 5 und 37°C, 5 und 10°C, 10 und 15°C; 15 und 20°C; 20 und 25°C; 25 und 30°C; oder 30 und 37°C gehalten wird. Für eine Temperatureinstellung von 15°C wird ein Druck von 5-10 mbar, bevorzugt 6-9 mbar, am meisten bevorzugt etwa 8 mbar für 4-24 Stunden, bevorzugt 1-4, 4-8, 8-12 oder 12-16 Stunden gehalten. Diese Temperatur- und Druckbedingungen werden für 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 oder mehr Stunden gehalten, um eine hochviskose Flüssigkeit mit einem Lösungsmittelgehalt von gleich oder weniger als 15, 12, bevorzugt 10, 8, 5, 4, 3, 2 oder 1 % (G/G) zu erhalten.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung erhöht die Temperatureinstellung während der Lösungsmittelentfernung auf eine höhere Temperatureinstellung als diejenige, die früher im Verfahren gehalten wird. Dies erlaubt das Verlassen des Lösungsmittels aus der Probe mit einer schnelleren Geschwindigkeit, so daß das Verfahren der Erfindung in kürzerer Zeit vollendet werden kann. Zum Beispiel wird die Temperatureinstellung auf oberhalb 0°C, besonders bevorzugt oberhalb 20°C, bevorzugt zwischen 5 und 37°C, 5 und 10°C, 10 und 20°C; 20 und 30°C; besonders bevorzugt 30 und 40°C; besonders bevorzugt 40 und 50°C; besonders bevorzugt 50 und 60°C erhöht, während der Druck auf gleich oder unterhalb 30, 25, 20, bevorzugt 15, 12, am meisten bevorzugt 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 oder 1 mbar gehalten wird. Diese Temperatur- und Druckbedingungen werden für 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 oder mehr Stunden gehalten, um einen Feststoff mit gleich oder weniger als 15, 12, bevorzugt 10, 8, 5, 4, 3, 2 oder 1 % zu erhalten. Diese Ausführungsform erfordert, daß das aktive Mittel bei der für das erfolgreich durchzuführende Verfahren verwendeten Temperatur hitzestabil ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung reduziert die Druckeinstellung während der Lösungsmittelentfernung (Schritt c) auf eine geringere Druckeinstellung als diejenige, die früher im Verfahren (Schritt b) verwendet wird. Dies erlaubt es dem Lösungsmittel, die Probe mit einer schnelleren Geschwindigkeit zu verlassen, so daß das Verfahren der Erfindung in kürzerer Zeit vollendet werden kann. Es erlaubt ebenfalls einen höheren Anteil von Verlust des Lösungsmittels. Zum Beispiel wird die Druckeinstellung auf gleich oder unterhalb 7, 6, bevorzugt 5, 4, 3, besonders bevorzugt 2, 1,5, 1, am meisten bevorzugt 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05, 0,02, 0,01 oder 0,005 mbar eingestellt, während die Temperatur auf gleich oder oberhalb 0°C, bevorzugt zwischen 10 und 20°C; 20 und 30°C; 30 und 35°C oder oberhalb 40°C gehalten wird. Diese Temperatur- und Druckbedingungen werden für 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 oder mehr Stunden gehalten, um einen Feststoff mit einem Lösungsmittelgehalt von gleich oder weniger als 15, 12, bevorzugt 10, 8, 5, 4, 3, 2 oder 1 % (G/G) zu erhalten, bevorzugt gemäß Bestimmung durch coulometrische Karl-Fischer-Feuchtigkeitsanalyse (Eur. J. Pharm. Biopharm. (2000) 50; 277-284).
Bevorzugt sollten die Schritte b) und c) in einer Zeit von gleich oder weniger als 18 Stunden, besonders bevorzugt 16, 14, 12, am meisten bevorzugt 10, 8, 6 oder 4 Stunden vollendet sein.
Eine getrocknete Zusammensetzung ist eine Zusammensetzung, aus der Lösungsmittel durch Verdampfung, Sieden oder Sublimation entfernt wurde, wobei ein Lösungsmittelgehalt von gleich oder weniger als 15, 12, 10, besonders bevorzugt 8, 5, 4, 3, 2 oder 1 % (G/G) zurückbleibt, bevorzugt gemäß Bestimmung durch das Karl-Fischer-Verfahren. Bevorzugte Bereiche des Lösungsmittelsgehalts sind 1-3 %, 3-5 %, 5-10 % oder 10-15 % (G/G). Der Begriff schließt hochviskose Flüssigkeiten sowie getrocknetes, geschäumtes Glas und lyophilisierte Feststoffe ein.
Eine hochviskose Flüssigkeit wird als ein Material definiert, aus dem Lösungsmittel durch Verdampfung ohne Sieden entfernt wurde, wobei ein Lösungsmittelgehalt von gleich oder weniger als 15, 12, 10, bevorzugt 8, 5, 4, 3, 2 oder 1 % (G/G) zurückbleibt, bevorzugt gemäß Bestimmung durch das Karl-Fischer-Verfahren. Bevorzugte Bereiche des Lösungsmittelsgehalts sind 1-3 %, 3-5 %, 5-10 % oder 10-15 % (G/G). Die hochviskose Flüssigkeit hat einen ausreichend geringen Lösungsmittelgehalt, so daß das aktive Mittel in einem stabilen Zustand für wenigstens 3, 6, 9, 12 oder 24 Monate bei 4°C konserviert ist, was dem aktiven Mittel die Bewahrung von zumindest 40, 50, 60, bevorzugt 70, 80, 90 oder 95 % seiner Aktivität und/oder Antigenität über diesen Zeitraum erlaubt. Bevorzugt hat die hochviskose Flüssigkeit ein festes Erscheinungsbild, aber ist ein Glas und kann sehr langsam über einen Zeitraum von 2, 4 oder 6 Tagen, besonders bevorzugt 1, 2, 3, 4, 6, 7, 10 oder 12 Monaten fließen. Der äußerst langsame Fluß kann durch Umdrehen eines Behältnisses, das die hochviskose Flüssigkeit enthält, und Halten bei Raumtemperatur gemessen werden, bis ein Fluß der hochviskosen Flüssigkeit beobachtet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die hochviskose Flüssigkeit nach 2, 4 oder 6 Tagen, bevorzugt 2, 3 oder 4 Wochen, besonders bevorzugt 2, 4, 6, 8, 10 oder 12 Monaten in einer umgedrehten Position nicht zu fließen erscheinen.
Eine viskose Flüssigkeit wird als das Produkt der primären Phase der Lösungsmittelentfernung definiert, an deren Ende der Großteil des Lösungsmittels aus der Probe entfernt ist. Dieser Punkt kann erkannt werden, weil sich die Geschwindigkeit der Verdampfung verlangsamt, so daß die Temperatur der Probe auf die Umgebungstemperatur zurückkehrt, da der endotherme Effekt der Masseverdampfung verlorengeht.
Ein geschäumtes Glas ist eine getrocknete Zusammensetzung, die ein glasbildendes Polyol enthält, das durch ein Verfahren gebildet wird, indem die Konservierungsprobe solchen Temperatur- und Druckbedingungen unterworfen wird, daß die Probe kräftig Blasen bildet oder siedet, so daß ein Schaum gebildet wird, wenn die Probe trocknet.
Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele werden unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die den Fachleuten wohlbekannt sind und Routine sind, ausgenommen wenn anderweitig im Detail beschrieben. Die Beispiele sind illustrativ, aber beschränken nicht die Erfindung.
Beispiel 1. Verdampfendes Gefrierverfahren
Das Verfahren wurde unter Verwendung eines Gefriertrockners Heto Drywinner 8-85 durchgeführt, in dem die Regalbodentemperatur auf ± 1°C reguliert werden kann, die Endtemperatur des Kondensators –85°C ist, der Druck mit einem Entlüftungsventil reguliert wird und 6 Thermofühler zur Messung der Produkttemperatur verfügbar sind.
Eine Konservierungsprobe wurde durch Zugeben eines Stabilisierungsmittels (entweder 10 % Trehalose oder 3,5 % Saccharose) und eines aktiven Mittels zu einer wäßrigen Lösung hergestellt. Proben wurden in den Gefriertrockner gegeben, wobei die Regalbodentemperatur auf einer festen Temperatureinstellung von 15°C während des Verfahrens gehalten wurde. Der Druck wurde zunächst auf 200 mbar reduziert und auf diesem Niveau für 10 Minuten gehalten, bevor der Druck weiter reduziert wurde. Bei 1,5 mbar begannen die Lösungen aufgrund von Verdampfungsabkühlung zu gefrieren, wie in 1 gezeigt. Der Druck wurde weiter auf 0,1 mbar reduziert, um die Proben vollständig gefrieren zu lassen. Der Druck wurde dann auf 0,8 bis 3,5 mbar erhöht, worauf sich ein Schaum bildete, da Wasser aus der Probe verlorenging. Unter den Bedingungen des Experiments wurde kein Sieden in einer Kontrollprobe beobachtet, die nur Wasser enthielt. Die Proben können Wasser durch Verdampfung anstelle durch Sieden verlieren. Nach 18 Stunden unter diesen Bedingungen sind die Proben getrocknet und die geschäumte Lösung wird ein geschäumtes Glas.
Ein ähnliches Verfahren wurde erfolgreich durchgeführt, wobei die Regalbodentemperatur auf anderen Temperatureinstellungen von bis zu 37°C gehalten wurde.
Beispiel 2. Ermittlung von Gefrierbedingungen
Proben wurden durch Auflösen von Saccharose in Wasser zum Erhalt von 1%igen, 5%igen, 10%igen und 20%igen Lösungen hergestellt. Die Proben wurden in den Gefriertrockner gestellt, wobei eine Regalbodentemperatur von 15°C während des Verfahrens gehalten wurde. Der Druck wurde zunächst auf 200 mbar reduziert und auf diesem Niveau für 10 Minuten gehalten, bevor der Druck weiter auf 50 mbar, 5 mbar, 2,5 mbar, 0,75 mbar, 0,4 mbar und 0,2 mbar reduziert wurde. Jedes Druckniveau wurde für 20 Minuten gehalten, um die Temperatur äquilibrieren zu lassen, und die Temperatur der Probe wurde unter Verwendung eines Temperaturfühlers ausgelesen. Temperaturfühler wurden an Proben mit unterschiedlichen Saccharosekonzentrationen angebracht, und die in Tabelle 1 aufgezeichneten Temperaturen sind Mittelwerte der Temperaturen.
Ergebnisse
Alle Proben gefroren zwischen 1,66 und 1,11 mbar, unabhängig von der Konzentration der vorhandenen Saccharose. Die bei unterschiedlichen Drücken gemessenen Temperaturen waren nahe den aus der Tripelpunktkurve vorhergesagten. Deshalb scheint die Gegenwart von Saccharose keine große Wirkung auf die Temperatur der Proben bei unterschiedlichen Drücken zu haben.
In einem bevorzugten Verfahren der Erfindung ist es notwendig, das Gefrieren der Probe zu vermeiden. Dies konnte durch Halten des Drucks auf oberhalb 2 mbar unter Verwendung einer Regalbodentemperatur von 15°C erreicht werden. Bei niedrigeren Temperaturen sollte der Druck auf einem höheren Niveau gehalten werden, wohingegen die Verwendung einer höheren Temperatur die weitere Reduzierung des Drucks ohne Gefrieren der Proben erlauben würde.
Tabelle 1
Beispiel 3. Schäumungsbedingungen für Proben mit unterschiedlichen Zuckerkonzentrationen
Konservierungsproben, die 0 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % und 50 % Saccharose enthielten, wurden hergestellt. Proben wurden in den Gefriertrockner mit einer Regalbodentemperatur gestellt, die auf 15°C während des Verfahrens gehalten wurde. Der Druck wurde zunächst auf 200 mbar reduziert und auf diesem Niveau für 10 Minuten gehalten, bevor der Druck weiter reduziert wurde. Der Druck wurde weiter auf 0,1 mbar reduziert, um die Proben vollständig gefrieren zu lassen. Der Druck wurde dann auf entweder 0,788 mbar, 0,812 mbar oder 3,5 mbar in anschließenden Experimenten erhöht. Diese Bedingungen wurden für 3 Stunden für die Experimente mit 3,5 mbar und 0,812 mbar und für 6 Stunden für das Experiment mit 0,788 mbar gehalten. Die physikalischen Eigenschaften jeder Probe wurden ausgewertet.
Ergebnisse
Wie in Tabelle 2 gezeigt wird, war bei einem Druck von 3,5 mbar eine hohe Saccharosekonzentration von 50 % für eine verläßliche Schaumbildung erforderlich. Im Gegensatz erlaubte ein geringerer Druck von 0,8 mbar eine verläßliche Schaumbildung bei geringeren Saccharosekonzentrationen von 10-25 %. Die Verwendung von geringerer Saccharosekonzentration könnte vorteilhaft für konservierte Proben zur Verwendung in zum Beispiel Impfstoffen sein. Deshalb ist ein Verfahren unter Verwendung von 0,8 mbar und 10-25 % Saccharosegehalt bevorzugt.
Tabelle 2
Beispiel 4. Die Wirkung der Verwendung von siliconisierten Behältern
Konservierungsproben, die 5 %, 10 %, 15 % und 25 % Saccharose enthielten, wurden hergestellt und in Flaschen gegeben, von denen einige siliconisiert waren. In einem Experiment wurden die Proben in den Gefriertrockner mit einer Regalbodentemperatur gegeben, die auf 15°C während des Verfahrens gehalten wurde. Der Druck wurde zunächst auf 200 mbar reduziert und auf diesem Niveau für 15 Minuten behalten, bevor der Druck weiter reduziert wurde. Der Druck wurde weiter auf 2,8 mbar für 3 Stunden reduziert. Während dieses Zeitraums fiel der Druck auf 2,00 mbar, während die Gegenwart von Wasserdampf abnahm. Die physikalischen Eigenschaften jeder Probe wurden ausgewertet.
In einem zweiten Experiment wurden Proben in den Gefriertrockner mit einer Regalbodentemperatur gegeben, die auf 37°C während des Verfahrens gehalten wurde. Der Druck wurde zunächst auf 200 mbar reduziert und auf diesem Niveau für 10 Minuten gehalten, bevor der Druck weiter reduziert wurde. Der Druck wurde weiter auf 2,4 mbar für 3 Stunden reduziert. Während dieses Zeitraums fiel der Druck auf 1,06 mbar, während die Gegenwart von Wasserdampf abnahm. Die physikalischen Eigenschaften jeder Probe wurden ausgewertet.
Ergebnisse
Die Siliconisierung hatte eine Wirkung auf die Entgasung der Proben. Die Reduzierung des Drucks auf 200 mbar führte zur Entgasung von Proben in siliconisierten Flaschen, aber nicht in unsiliconisierten Flaschen. Die Entgasung wurde durch Bläschenbildung der Probe beobachtet.
Die Siliconisierung der Flasche führte auch zu einer wahrscheinlicheren und reproduzierbareren Schaumbildung (Tabelle 3). Die Siliconisierung von Flaschen erlaubt die reproduzierbare Schaumbildung bei geringeren Polyolkonzentrationen. Die geringere Polyolkonzentration verringert die Dauer, die zur Trocknung der Probe erforderlich ist, und reduziert die Wirkung von Maillard-Reaktionen oder anderen Wechselwirkungen mit dem Polyol, die das aktive Mittel schädigen. Wenn die beteiligte Probe ein Impfstoff ist, reduziert dies die Viskosität der Probe und erlaubt eine einfacherer Verabreichung.
Tabelle 3
Beispiel 5. Vergleich der Konservierung von Hib-IPV durch herkömmliche Gefriertrocknung oder durch Schaumtrocknung
Das zu konservierende aktive Mittel war eine Mischung aus dem PRP-Polysaccharid von Haemophilus influenzae b (Hib) und drei Stämmen von inaktiviertem Poliovirus (IPV). Die Konservierungsprobe wurde durch Auflösen von Hib-IPV entweder einer 3,15%igen Saccharoselösung oder einer 10%igen Trehaloselösung hergestellt.
Die Proben wurden unter Verwendung entweder einer herkömmlichen Gefriertrocknung, die 3 Tage zur Durchführung in einem großen Gefrier trockner erforderte, oder unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Schaumtrocknungsverfahrens lyophilisiert.
Die Proben wurden in Wasser rekonstituiert, und ein ELISA wurde zur Bewertung der Bewahrung der Antigenität der drei Poliovirusstämme verwendet. Drei polyklonale Antikörper und drei monoklonale Antikörper, einer gegen jeden Stamm, wurden in separaten ELISAs verwendet. Die Ergebnisse sind als Prozentwert der Auslesung dargestellt, die für eine Probe erhalten wurde, die nicht dem Gefriertrocknungs- oder Schaumtrocknungsverfahren unterworfen wurde.
Die konservierten Proben werden auf ihre Immunogenität in vivo durch Impfen von Gruppen von 10 Mäusen mit dem rekonstituierten IPV-Hib, Entnahme von Blut aus den Mäusen und Überwachung der Antikörperspiegel gegen IPV und Hib-Polysaccharide, zum Beispiel durch ELISA oder Western-Blotting, bewertet. Der Schutzgrad wird in einem Expositions-Mäusemodell bewertet.
Ergebnisse
Unter Verwendung von entweder Saccharose oder Trehalose als Polyol wurde die Antigenität von IPV besser unter Verwendung der Schaumtrocknungstechnik im Vergleich zur Verwendung der herkömmlichen Gefriertrocknung bewahrt.
Tabelle 4

* Das experimentelle Gefriertrocknen in Gegenwart von 3,15 Saccharose wurde 5-mal wiederholt, und die gezeigten Ergebnisse sind aus einem repräsentativen Experiment.

Beispiel 6. Schutzwirkung der Gefriertrocknung von IPV in Gegenwart von Hib-Polysacchariden
Konservierungsproben wurden hergestellt, die 3,15 % Saccharose und IPV oder eine Mischung aus IPV und Hib-Polysacchariden enthielten. Die Proben wurden in einen Gefriertrockner Heto Drywinner 8-85 eingesetzt und bei einer Temperatureinstellung von –32°C für 40 Stunden getrocknet, gefolgt von fortgesetztem Trocknen bei 4°C für 16 Stunden.
Die Proben wurden in Wasser rekonstituiert, und ein ELISA wurde zur Bewertung der Bewahrung von Antigenität der drei Poliovirusstämme ver wendet. Drei monoklonale Antikörper, einer gegen jeden Stamm, wurden in separaten ELISAs zur Bewertung des Grades der Antigenbewahrung in den rekonstituierten, gefriergetrockneten Probe im Vergleich mit einer Referenzprobe verwendet, die nicht eingefroren worden war. Ergebnisse sind als Prozentwert der Auslesung dargestellt, die für eine Probe erhalten wurde, die nicht dem Gefriertrocknungs- oder Schaumtrocknungsverfahren unterworfen worden war.
Ergebnisse
Wie in Tabelle 5 gezeigt wird, führt die Gegenwart von Hib-Polysaccharid in der Konservierungsprobe mit IPV zu größerer Bewahrung von IPV-Antigenen nach Gefriertrocknung als diejenige, die erreicht wurde, wenn IPV allein gefriergetrocknet wurde. Die Hib-Polysaccharide haben eine konservierende Wirkung auf die IPV-Antigenität, zusätzlich zu derjenigen, die durch das Vorliegen von Saccharose als Stabilisierungsmittel erreicht wird.
Tabelle 5
Beispiel 7. Wirkung unterschiedlicher Stabilisierungsmittel auf die Gefriertrocknung von IPV-Hib
Konservierungsproben wurden hergestellt, die IPV-Hib enthielten und entweder 3,15 % Saccharose; 2,5 % Sorbit, 0,8 % Glutamin und 0,01 % HSA; MMR-Stabilisator und Lactose; 3 % Glycin, 2 % Arginin und 4 % Saccharose; oder 4 % Saccharose und 2 % Glycin als Stabilisierungsmittel verwendeten. Das Experiment schloß eine Probe mit 3,15 % Saccharose als Stabilisierungsmittel unter Verwendung der doppelten Konzentration von IPV-Hib ein. Die Proben wurden unter Verwendung eines herkömmlichen dreitätigen Gefriertrocknungszyklus in einem Chargen-Gefriertrockner gefriergetrocknet.
Die Proben wurden in Wasser rekonstituiert, und ein ELISA wurde zur Bewertung der Bewahrung von Antigenität der drei Poliovirusstämme verwendet. Drei polyklonale Antikörper und drei monoklonale Antikörper, einer gegen jeden Stamm, wurden in separaten ELISAs verwendet. Ergebnisse sind als Prozentwert der Auslesung angegeben, die für eine Probe erhalten wurde, die nicht dem Gefriertrocknungs- oder Schaumtrocknungsverfahren unterworfen worden war.
Die konservierten Proben werden auf ihre Immunogenität in vivo durch Impfen von Gruppen von 10 Mäusen mit dem rekonstituierten IPV-Hib, Entnahme von Blut aus den Mäusen und Überwachung der Antikörperspiegel gegen IPV und Hib-Polysaccharide, zum Beispiel durch ELISA oder Western-Blotting, bewertet. Der Schutzgrad wird in einem Expositions-Mäusemodell bewertet.
Ergebnisse
Die Erhöhung der Dosis von IPV von 40/8/32 DU/Dosis auf 80/16/64 DU/Dosis führte zu einer Zunahme der Bewahrung an Antigenität von IPV, wie in Tabelle 6 gezeigt. Die Variation des Stabilisierungsmittels beeinflußte ebenfalls die Bewahrung von Antigenen, wobei 4 % Saccharose/2 % Glycin und 2,5 % Sorbit/0,8 % Glutamin/0,01 % HAS eine höhere Bewahrung von Antigenen erzeugte, wie durch die ELISA-Daten gezeigt wird.
Tabelle 6
Beispiel 8. Reproduzierbarkeit der Probenqualität nach Gefriertrocknung, Schaumtrocknung oder Schaumtrocknung mit einem Gefrierschritt
Konservierungsproben werden angesetzt, die IPV, Mumps, Masern, Rubella, Varicella zoster-Virus, CMV, Hepatitis, HSV1, HSV2, respiratorisches Synzytialvirus, Dengue, Paramyxoviridae wie Parainfluenza, Togaviridae und Influenzaviren und/oder Hib als aktives Mittel umfassen. Das aktive Mittel wird in einer wäßrigen Lösung gelöst, die ein Polyol enthält. Multiple Proben werden durch entweder Gefriertrocknung, Schaumtrocknung unter Verwendung eines Gefrierschritts und Befolgen des in Beispiel 1 beschriebenen Protokolls, oder durch Schaumtrocknung ohne einen Gefrierschritt unter Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Protokolls konserviert. Proben werden in einer wäßrigen Lösung rekonstituiert und ihre Aktivität bewertet. Die wird unter Verwendung von ELISA-Tests wie in Beispiel 5 beschrieben unter Verwendung von Antikörpern erreicht, die spezifisch für native Antigene sind. Im Fall von Lebendviren wird der Titer jeder Probe unter Verwendung des Virus zur Infektion geeigneter Wirtszellen und Bewertung der Infektiosität durch Plaquebildung oder durch Immunocytochemie ermittelt. Wenn immunogene Zusammensetzungen oder Impfstoffe schaumgetrocknet werden, kann die Bewahrung der Immunogenität in einem Tiermodell durch Immunisieren von Gruppen von Tieren mit Impfstoff, der schaumgetrocknet oder gefriergetrocknet ist, und Auffrischen der Immunreaktion zum Beispiel 14 und 28 Tage nach der Erstimmunisierung getestet werden. Serum wird aus Tieren am Ende des Immunisierungsschemas isoliert, und sein Titer gegen den Impfstoff wird unter Verwendung von Standardtests, zum Beispiel durch ELISA, Immunocytochemie, Western-Blotting, Immunopräzipitation, bakteriziden Serumtest oder Agglutinationstest, untersucht. Die Ergebnisse werden zusammengestellt, zuerst durch Vergleich der Aktivität des aktiven Mittels nach Gefriertrocknung, Schaumtrocknung mit einem Gefrierschritt oder Schaumtrocknung ohne einen Gefrierschritt. Zweitens wird der Grad der Reproduzierbarkeit der Konservierungstechnik durch Vergleich des Bereichs an Aktivitäten nach Unterwerfen der Proben jedem der drei Konservierungsverfahren bewertet.
Beispiel 9. Langzeitlagerung von aktiven Mitteln, die durch Gefriertrocknung und Schaumtrocknung konserviert wurden
Konservierungsproben werden angesetzt, die IPV, Mumps, Masern, Rubella, Varicella zoster-Virus, CMV, Hepatitis, HSV1, HSV2, respiratorisches Synzytiavirus, Dengue, Paramyxoviridae wie Parainfluenza, Togaviridae und Influenzaviren und/oder Hib als aktives Mittel umfassen. Das aktive Mittel wird in einer wäßrigen Lösung gelöst, die ein Polyol enthält. Multiple Proben werden durch entweder Gefriertrocknung, Schaumtrocknung unter Verwendung eines Gefrierschritts unter Befolgen des in Beispiel 1 beschriebenen Protokolls oder Schaumtrocknen ohne einen Gefrierschritt unter Verwendung eines in Beispiel 4 beschriebenen Protokolls konserviert. Die Proben werden durch Lagern bei 37 oder 23°C für 7 Tage gealtert und auf Aktivität mit Proben verglichen, die bei 4°C gehalten wurden. Die Proben werden in einer wäßrigen Lösung rekonstituiert und ihre Aktivität bewertet. Dies wird unter Verwendung von ELISA-Tests wie in Beispiel 5 beschrieben unter Verwendung von Antikörpern erreicht werden, die spezifisch für native Antigene sind. Im Fall von Lebendviren wird der Titer jeder Probe unter Verwendung des Virus zur Infektion geeigneter Wirtszellen und Bewertung der Infektiosität durch Plaquebildung oder durch Immunocytochemie ermittelt. Ergebnisse werden zusammengestellt, zuerst durch Vergleich der Aktivität des aktiven Mittels nach Lagerung bei erhöhten Temperaturen mit der Lagerung bei 4°C. Zweitens wird der Grad der Reproduzierbarkeit der Konservierungstechnik durch Vergleich des Bereichs an Aktivitäten nach Unterwerfen der Proben jedem Satz von Bedingungen bewertet.
Beispiel 10. Verfahren zur Trocknung ohne Gefrieren ohne Schaumbildung
Konservierungsproben, die 5 %, 10 %, 15 % und 25 % Saccharose enthalten, wurden hergestellt und in Flaschen gegeben. Die Proben werden in einen Gefriertrockner bei einer Temperatureinstellung von 15°C während des Verfahrens gegeben. Der Druck wurde zunächst auf 200 mbar reduziert und auf diesem Niveau für 10 Minuten gehalten, um ein Entgasen zu erlauben, bevor der Druck weiter reduziert wurde. Der Druck wurde weiter auf 8 mbar für zwei bis drei Stunden reduziert, während Thermofühler innerhalb der Proben zeigten, daß die Probentemperatur auf 4°C aufgrund von Verdampfungskühlung reduziert war. Nach 2-3 Stunden kehrte die Temperatur der Proben auf 15°C zurück, was anzeigte, daß die Verdampfung unter diesen Temperatur- und Druckbedingungen annähernd vollständig war. Während dieser Stufe des Verfahrens siedete die Probe nicht unter Bildung eines Schaum oder gefror, so daß ein aktives Mittel in der Probe so wenig Streß wie möglich ausgesetzt wird. Die Proben haben ein festes Erscheinungsbild, ähnlich dem fertigen Produkt.
Weiteres Trocknen der Proben wurde durch weiteres Reduzieren des Druck auf 0,1 mbar erreicht, während die Regalbodentemperatureinstellung bei 15°C gehalten wurde. Diese Bedingungen wurden für weitere 10-16 Stunden gehalten. Während dieser Phase blieb die Probentemperatur auf 15°C, da die Verdampfungsrate niedrig war. weiteres Trocknen erfolgte, und die resultierende Probe hatte ein festes Erscheinungsbild. Falls die Probe auf ihre Seite gelegt wurde, floß der Probeninhalt sehr langsam über einen Zeitraum von Tagen oder Monaten, was zeigt, daß die Probe ein flüssiges Glas hoher Viskosität ist. 2 zeigt, daß der Behälter, der die hochviskose Flüssigkeit beinhaltet, umgedreht werden kann, ohne einen unmittelbaren Fluß der hochviskosen Flüssigkeit hervorzurufen.
Beispiel 11. Bewahrung von IPV-Immunogenität nach Trocknung ohne Gefrieren oder Schaumbildung
Gemäß dem Verfahren von Beispiel 10 getrocknete Proben wurden nicht dem Streß ausgesetzt, der mit der Bläschenbildung verbunden ist, die die Schaumbildung oder das Gefrieren begleitet. Experimente wurden zur Bestimmung durchgeführt, ob dieses Verfahren ein hohes Maß an Antigenbewahrung bei Verwendung zur Trocknung von IPV erzeugt.
Drei separate Experimente wurden durchgeführt, in denen IPV in einer wäßrigen Lösung mit 10 % Saccharose oder 10 % Trehalose als Stabilisierungsmittel resuspendiert wurde. Die Proben wurden in silikonisierte Flaschen gegeben, die in einen Gefriertrockner Heto Drywinner 8-85 gestellt wurden, und die Temperatur wurde auf 15°C eingestellt. Der Druck wurde zunächst auf 35 mbar zur Entgasung der Proben reduziert. Nach 10 Minuten wurde der Druck weiter auf 8 mbar reduziert und auf diesem Niveau für 2 Stunden gehalten. Während dieses Zeitraums wurde die Temperatureinstellung bei 15°C gehalten, und die Temperatur in der Probe wurde überwacht. Als Wasser aus der Probe verdampfte, fiel die Temperatur auf 4°C, aber zum Ende der zwei Stunden kehrte die Temperatur auf 15°C zurück, als sich die Verdampfungsrate verlangsamte. Keine Bläschenbildung oder Schaumbildung trat unter diesen Bedingungen auf. Der Druck wurde dann weiter auf 0,1 mbar reduziert, und diese Bedingungen wurden für 16 weitere Stunden in den ersten zwei Experimenten und für 10 weitere Stunden im dritten Experiment aufrechterhalten.
Die Proben wurden in Wasser rekonstituiert, und ein ELISA wurde zur Bewertung der Bewahrung von Antigenität der drei Poliovirusstämme verwendet. Der monoklonale Antikörper gegen Typ 3 IPV wurde in einem ELISA verwendet, um den Grad der Antigenbewahrung in der rekonstituierten, gefriergetrockneten Probe im Vergleich mit einer Referenzprobe zu bewerten, die nicht eingefroren worden war. Ergebnisse sind als Prozentwert der Auslesung dargestellt, die für eine Probe erhalten wurde, die nicht einem Trocknungsverfahren unterworfen worden war.
Ergebnisse
Die getrockneten Proben hatten ein festes Erscheinungsbild, jedoch schienen sie in Form einer hochviskosen Flüssigkeit/eines Glases zu sein, da der getrocknete Feststoff über einen Zeitraum von Tagen fließen konnte, falls der Behälter bei Raumtemperatur umgedreht wurde.
Tabelle 7: Bewahrung von Typ 3-IPV-Antigen gemäß Bestimmung durch ELISA unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers (Trocknung ohne Schäumen oder Gefrieren)
Diese Werte der Typ 3-IPV-Antigenbewahrung zeigen einen sehr vorteilhaften Vergleich mit den nachfolgend gezeigten Gefriertrocknungsergebnissen, wo gewöhnlich sehr geringe Werte im gleichen ELISA-Format gefunden wurden, wenn ein monoklonaler Antikörper gegen Typ 3 verwendet wurde.
Tabelle 8: Bewahrung von Typ 1, 2 und 3 IPV-Antigenen gemäß Bestimmung durch ELISA unter Verwendung monoklonaler und polyklonaler Antikörper (Gefriertrocknung).

Beispiel 12. Langzeitlagerstabilität von getrocknetem IPV, das als hochviskose Flüssigkeit/Glas gelagert wurde
Unter Verwendung des in Beispiel 11 beschriebenen Verfahrens getrocknetes IPV wurde bei 4°C für 9 Monate gelagert. Die Proben wurden in Wasser mit 150 mM NaCl rekonstituiert, und ein ELISA wurde zur Bewertung der Bewahrung von Antigenität der drei Poliovirusstämme verwendet. Drei monoklonale Antikörper, einer gegen jeden Stamm, wurden in separaten ELISAs zur Bewertung des Grads der Antigenbewahrung in der rekonstituierten gelagerten Probe verwendet. Ein ähnliches ELISA wurde an rekonstituierten Proben aus der gleichen Charge vor der Lagerung durchgeführt. Alle Ergebnisse wurden mit einer Referenzprobe verglichen, die nicht getrocknet worden war. Ergebnisse sind als Prozentwert der Auslesung dargestellt, die für eine Probe erhalten wurde, die nicht einem Trocknungsverfahren unterworfen worden war.
Ergebnisse
Tabelle 9. Bewahrung von IPV-Antigenen nach Lagerung als hochviskose Flüssigkeit für 9 Monate
Deshalb kann IPV, das durch das in Beispiel 11 beschriebene Verfahren getrocknet wurde, bei 4°C für wenigstens 9 Monate ohne Verlust an Antigenität gelagert werden.
Beispiel 13. Vergleich der Immunogenität in vivo von IPV nach Trocknung zur Bildung einer hochviskosen Flüssigkeit und Rekonstituierung im Vergleich mit ungetrocknetem IPV
Gruppen von 10 Wistar-Ratten wurden mit verschiedenen Verdünnungen von IPV geimpft, das in Gegenwart von 10 % Saccharose zur Bildung einer hochviskosen Flüssigkeit unter Verwendung des in Beispiel 10 offenbarten Verfahrens getrocknet und rekonstituiert worden war. Weitere Gruppen von 10 Wistar-Ratten wurden mit Referenzproben von IPV geimpft, das in der gleichen Weise hergestellt worden war, aber nicht getrocknet worden war.
Nach 21 Tagen wurden Seren aus allen Ratten entnommen, und die Seren wurden in separaten Immunpräzipitationstests unter Verwendung von Typ 1-, Typ 2-, Typ 3-Poliovirus getestet.
Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt, die folgendes enthält: a) die Anzahl von reagierenden Ratten für jede IPV-Verdünnung, b) der ED50-Wert, der die Dosis ist, die zur Sicherstellung erforderlich ist, das 50 % der Ratten serokonvertieren, gemäß Bewertung durch den Immunpräzipitationstest, und c) die relative Wirksamkeit des getrockneten und rekonstituierten IPV, verglichen mit dem ungetrockneten Referenz-IPV.
Tabelle 10. Immunogenität von IPV nach Trocknung zur Bildung einer hochviskosen Flüssigkeit (JLE017/05) und Rekonstituierung, verglichen mit einer ungetrockneten Referenz von IPV (JLE097).
JLE017/05 ist eine IPV-Charge, die unter Bildung einer hochviskosen Flüssigkeit getrocknet und anschließend rekonstituiert wurde. JLE097 ist die ungetrocknete Referenz.
Tabelle 10 zeigt, daß die Anzahl der reagierenden Ratten, die mit jeder Verdünnung von IPV geimpft wurden, ähnlich zwischen den zwei Chargen von getrocknetem und rekonstituiertem IPV und der ungetrockneten Referenzprobe ist. Allgemein rief Typ 1 IPV die beste Immunreaktion hervor, wobei Typ 2 eine Immunreaktion in geringfügig weniger Ratten hervorrief. Typ 3 rief die schwächste Immunreaktion hervor.
Das Verfahren der Trocknung unter Bildung einer hochviskosen Flüssigkeit beeinträchtigt nicht die Fähigkeit von IPV, die Immunpräzipitation von Antikörpern in vivo hervorzurufen. Eine Auslesung der relativen Wirkung (RP) von 1,0 zeigt, daß die Probe eine äquivalente Reaktion zur Referenzprobe hervorruft. Beide getrockneten Proben erzeugen RP-Auslesungen von nahe 1,0 für alle drei Typen von Poliovirus, was zeigt, daß das Trocknungsverfahren nicht die Fähigkeit der Probe beeinflußt, eine Immunreaktion hervorzurufen.
Beispiel 14. Wirkung der Trocknung zur Bildung einer hochviskosen Flüssigkeit unter Verwendung von Saccharose oder Trehalose als Stabilisierungsmittel auf die Fähigkeit von IPV, eine immunpräzipitierende Immunreaktion in vivo hervorzurufen
Gruppen von 10 Wistar-Ratten wurden mit IPV geimpft, das in Gegenwart von 10 % Saccharose oder 10 % Trehalose wie in Beispiel 2 beschrieben getrocknet und dann rekonstituiert worden war. Weitere Gruppen von 10 Wistar-Ratten wurden mit einer äquivalenten Menge von IPV, das nicht getrocknet worden war, als Referenzproben geimpft.
Nach 21 Tagen wurden Seren aus allen Ratten aufgefangen, und ein Immunneutralisationstest wie in Beispiel 5 beschrieben wurde zur Bewertung der Menge an immunneutralisierendem Antikörper verwendet, der gegen jedes aus Typ 1-, Typ 2- und Typ 3-Poliovirus erzeugt worden war.
Relative Wirksamkeiten wurden für jede Probe durch Vergleich der Immunreaktion mit der durch die ungetrocknete Referenzprobe hervorgerufenen berechnet.
Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.
Tabelle 11: Vergleich der Trocknung in Saccharose und Trehalose
Die in den Proben verbliebene Wassermenge war geringer, wenn Saccharose als Stabilisierungsmittel verwendet wurde, wobei ca. 5 % Feuchtigkeit zurückblieb, verglichen mit ca. 10 %, wenn Trehalose als Stabilisierungsmittel verwendet wurde, gemessen durch das Karl-Fischer-Verfahren.
Sowohl Saccharose als auch Trehalose waren wirksam in der Stabilisierung von IPV während des Trocknungsverfahrens, so daß das rekonstituierte IPV relative Wirksamkeitsauslesungen von annähernd 1,0 für die meisten der unterschiedlichen Typen von Poliovirus ergab. Die relativen Wirksamkeiten waren besonders gut für Typ 3-Poliovirus, das seine Immunogenität relativ leicht verliert.
Beispiel 15: Messung der Feuchtigkeit nach Karl Fischer
Die Analyse wurde in einem Karl-Fischer-Titrometer (Aqua 30.00-Elektrochemie Halle) durchgeführt. Die Probe wurde ausgewogen und in den Ofen bei einer Einstellung von 80°C gestellt. Die Probe wurde mit Stickstoffgas gespült und dann zu Hydranal-Reagens (Riedel de Haen) gegeben, um die Analyse durch Coulometrie durchzuführen.

Claims

Immunogene Zusammensetzung, die inaktiviertes Poliovirus, ein bakterielles Polysaccharid oder Oligosaccharid und ein Stabilisierungsmittel umfaßt, die alle als getrocknete Zusammensetzung formuliert sind, und nach Rekonstituierung eine Immunreaktion gegen Poliovirus erzeugen kann.
Immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, die ein Kapselpolysaccharid- oder -oligosaccharid-Antigen aus Haemophilus influenzae b (Hib) umfaßt.
Immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das Polysaccharid oder Oligosaccharid an ein Trägerprotein konjugiert ist.
Immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, worin das Polysaccharid oder Oligosaccharid an Tetanustoxoid konjugiert ist.
Immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 2 bis 4, worin das Polysaccharid oder Oligosaccharid an Aluminiumphosphat adsorbiert ist.
Immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 bis 5, die ein Kapselpolysaccharid oder -oligosaccharid umfaßt, das aus N. meningitidis C stammt.
Immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 bis 6, die zusätzlich ein Kapselpolysaccharid oder -oligosaccharid umfaßt, das aus einem beliebigen aus N. meningitidis A, Y oder W oder einer Kombination daraus stammt.
Immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 6 bis 7, worin die Meningokokken-Polysaccharide oder -Oligosaccharide an ein Trägerprotein konjugiert sind.
Immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, die ein Hib-Polysaccharid oder -Oligosaccharid und wenigstens ein Meningokokken-Polysaccharid oder -Oligosaccharid umfaßt, konjugiert an den gleichen Typ von Trägerprotein.
Immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, die ein Hib-Polysaccharid oder -Oligosaccharid und wenigstens ein Meningokokken-Polysaccharid oder -Oligosaccharid umfaßt, konjugiert an unterschiedliche Trägerproteine.
Immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 bis 10, die ferner Phenolrot umfaßt.
Immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 bis 11, worin die getrocknete Zusammensetzung gefriergetrocknet ist.
Immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 bis 12, worin die getrocknete Zusammensetzung ein geschäumtes Glas ist.
Immunogene Zusammensetzung gemäß Ansprüchen 1 bis 11, worin die getrocknete Zusammensetzung eine hochviskose Flüssigkeit ist.
Immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, worin die hochviskose Flüssigkeit nicht eingefroren wurde.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, das den Schritt des Rekonstituierens der immunogenen Zusammensetzung gemäß Ansprüchen 1 bis 15 in einer wäßrigen Lösung umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 16, worin die wäßrige Lösung Diphtheriatoxoid, Tetanustoxoid und Pertussis-Antigene (azellulär oder ganze Zelle) umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 17, worin der DTP-Impfstoff wenigstens zum Teil mit Aluminiumhydroxid als Hilfsstoff versetzt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18, worin die wäßrige Lösung Hepatitis B-Oberflächenantigen umfaßt.
Kit, das die immunogene Zusammensetzung gemäß Ansprüchen 1 bis 15 in einem Behälter und flüssigen DTP-Impfstoff (azellulär oder ganze Zelle) in einem zweiten Behälter umfaßt.
Kit gemäß Anspruch 20, das ferner Hepatitis B-Oberflächenantigen im zweiten Behälter umfaßt.
Impfstoff, der die immunogene Zusammensetzung gemäß Ansprüchen 1 bis 15 umfaßt.
Impfstoff gemäß Anspruch 22, der vor der Verwendung zu einer wäßrigen Lösung rekonstituiert wird.
Behälter mit einer wasserabstoßenden Innenoberfläche, der den Impfstoff gemäß Anspruch 22 bis 23 enthält.
Verfahren zur Konservierung einer Zusammensetzung, die inaktiviertes Poliovirus (IPV), ein bakterielles Polysaccharid oder Oligosaccharid und ein Stabilisierungsmittel umfaßt, umfassend die folgenden Schritte: a) Herstellen einer Konservierungsprobe durch Suspendieren oder Lösen von IPV und einem bakteriellen Polysaccharid oder Oligosaccharid in einer Lösung eines Stabilisierungsmittels; b) Unterwerfen der Konservierungsprobe solchen Temperatur- und Druckbedingungen, daß Lösungsmittel aus der Konservierungsprobe verlorengeht; und c) Entfernen von Lösungsmittel, bis die Konservierungsprobe unter Bildung eines Feststoffs oder einer hochviskosen Flüssigkeit trocknet, in dem/der die Antigenität von IPV bewahrt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 25, worin die Konservierungsprobe in einem Behälter mit einer wasserabstoßenden Innenoberfläche getrocknet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 25 oder 26, worin die Konservierungsprobe unter Bildung eines Schaums im Schritt b) perlt.
Verfahren gemäß Anspruch 27, worin die Probe zumindest teilweise vor dem Einleiten des Trocknungsprozesses gefroren wird.
Verfahren gemäß Anspruch 27, worin die Konservierungsprobe zumindest teilweise im Schritt b) gefroren wird.
Verfahren gemäß Anspruch 25, worin im Schritt b) die Konservierungsprobe solchen Temperatur- und Druckbedingungen unterworfen wird, daß die Konservierungsprobe Lösungsmittel durch Verdampfung verliert, ohne Beteiligung von Gefrieren oder Perlen in der Schaumbildung, unter Bildung einer viskosen Flüssigkeit, und im Schritt c) Lösungsmittel entfernt wird, bis die Konservierungsprobe unter Bildung einer hochviskosen Flüssigkeit trocknet.
Verfahren gemäß Anspruch 26 bis 30, worin die Konservierungsprobe Hib-Polysaccharid oder -Oligosaccharid umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 26 bis 31, worin die Konservierungsprobe Polysaccharid oder Oligosaccharid umfaßt, das aus einem beliebigen aus N. meningitidis A, C, Y oder W oder einer Kombination daraus stammt.