DE60310383T2

DE60310383T2 - Vorbeugung von gewebeadhäsion

Info

Publication number: DE60310383T2
Application number: DE60310383T
Authority: DE
Inventors: Philippe Koninckx; Peter Carmeliet; Desire London COLLEN; Roger Carlos MOLINAS SANABRIA
Original assignee: Katholieke Universiteit Leuven; Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB; Thromb X NV
Current assignee: Katholieke Universiteit Leuven; Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB; Thromb X NV
Priority date: 2002-01-29
Filing date: 2003-01-29
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2023-01-30
Also published as: EP1482975B1; EP1482975A2; US20050163781A1; ATE347908T1; DE60310383D1; WO2003063904A2; WO2003063904A3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen zur Verwendung in der medizinischen Wissenschaft. Die Erfindung betrifft insbesondere die Anwendungen von Inhibitoren gegen Hypoxie-induzierte Gene zur Herstellung eines Medikamentes zur Vorbeugung und/oder zur Unterdrückung einer postoperativen/Postwund-Adhäsionsbildung. Postoperative Adhäsionen sind ein unerwünschtes Ergebnis des chirurgischen Eingriffs und sind eine Hauptquelle für postoperative Morbidität und Mortalität. Die Erfindung kann auf Menschen und Tiere angewandt werden. Bis heute hat sich kein einziger therapeutischer Ansatz als bei der Vorbeugung der Bildung von postoperativen Adhäsionsbildungen universal wirksam erwiesen.
Hintergrund der Erfindung
Eine postoperative Adhäsionsbildung (POA) ist eine häufige chirurgische Komplikation in gynäkologischen, Becken- und kardiologischen chirurgischen Eingriffen. Eine chirurgische Verletzung bzw. Trauma gegenüber den Geweben verursacht oftmals eine permanente Narbenbildung, die das traumatisierte Gewebe an ein anderes Organ bindet. Somit werden am Ort der Verletzung innere Gewebe, die normalerweise getrennt bleiben, oftmals miteinander verbunden. Komplikationen, die sich aus der Adhäsionsbildung ergeben, sind Darmverschlüsse, Dünndarmverschlüsse, chronische Beckenschmerzen und bei Frauen Unfruchtbarkeit. Eine POA tritt sowohl in der traditionellen Chirurgie als auch in der laparoskopischen Chirurgie ein. Exakte Daten bezüglich der Prävalenz und des Schweregrads dieser Konsequenzen sind nicht verfügbar, weil Adhäsionen mit dem Schweregrad des chirurgischen Eingriffes variieren und weil systematische Laparoskopien auf den zweiten Blick aus ethischen Gründen nicht durchgeführt werden können. Die Adhäsionen treten bei über 50% der Patienten im Anschluss an eine Laparotomie auf, wohingegen das Risiko eines erneuten Eingriffes wegen der Adhäsionen im Anschluss an eine Laparotomie kürzlich innerhalb von 10 Jahren in einer großen Studie in Schottland als 35% bewertet wurde (Ellis H. et al., Lancet 353: 1476-1480, 1999). Die morphologischen Ereignisse, die in die Adhäsionsbildung involviert sind, sind wohlbekannt (Holmdahl L et al., Eur J Surg Suppl 56-62, 1997 und DiZerega GS, Eur J. Surg Suppl 10-16, 1997). Ein peritonealer Defekt verursacht eine Exsudation, Fibrinablagerung, gefolgt von einer inflammatorischen Reaktion, Fibrinolyse und vollständiger Re-Epithelisierung innerhalb von 3 bis 8 Tagen. Diese rasche Heilung ist eine Konsequenz der Regenerierung der mesothelialen Schicht aus multiplen Foci in der Verletzung und nicht aus den Grenzflächen, wie es während der Reparatur eines anderen Epithels zu finden ist. Die direkte Konsequenz hiervon ist, dass die Dauer der Re-Epithelisierung von der entblößten Fläche im Peritoneum unabhängig ist. Falls dieser rasche Heilungsprozess durch eine Überbelastung an Fibrin (beispielsweise durch Blutung), durch eine gesenkte Fibrinolyse (beispielsweise als Folge eines schwereren Gewebstraumas), was eine persistierende Fibrinmatrix zur Folge hat (Bittinger F, J Surg Res 82: 28-33, 1999) oder durch das Vorhandensein einer verlängerten entzündlichen Reaktion (beispielsweise durch eine Infektion oder durch Nahtmaterial) fehlschlägt, wird dies eine verlängerte Fibroblastenproliferation, Collagenablagerung, Angiogenese und letztendlich Adhäsionsbildung zur Folge haben. Jedoch sind die biochemischen und zellulären Prozesse, die in den Heilungsprozess und in die Adhäsionsbildung involviert sind, größtenteils unbekannt (Holmdahl L and Ivarsson ML: Eur J Surg 165: 1012-1019, 1999) und dies widerspiegelt die nach wie vor inadäquate klinische Prävention der Adhäsionsbildung. In Tiermodellen können postoperative Adhäsionen durch eine Vielzahl von Mitteln, wie beispielsweise intraperitoneale Anwendung von antiinflammatorischen Arzneistoffen (Rodgers KE 10 Prog Clin Biol Res 358: 119-129, 1990), t-PA zur Erhöhung der Fibrinolyse, als die Einbringung einer Überbelastung an mesenchymalen Zellen in die Peritonealkavität nach dem chirurgischen Eingriff (Bertram P et al., Eur J Surg 165: 705-709, 1999) reduziert werden. Eine Adhäsionsbildung kann ebenfalls durch Cytokine, wie beispielsweise TGF-β und TNF-α (Chegini N et al., J Soc Gynecol Investig 6: 153-157, 1999), durch Calciumkanalblocker, Phospholipase A, Natrium-Carboxymethylzellulose, Vitamin E und Phosphatidylinositol moduliert werden. Klinisch gesehen basiert die Prävention der Adhäsionsbildung auf einer guten Chirurgie-Technik, die überwiegend in der Vermeidung von Blutungen und Gewebsverletzungen, entweder mechanisch oder durch Austrocknung besteht. Eine Adhäsionsbildung kann weiterhin durch verschiedene Ansätze, wie beispielsweise lösliche oder mechanische Barrieremethoden (Haney AF and Doty E: Fertil Steril 70: 145-151, 1998; Diamond MP Fertil Steril 69: 1067-1074, 1998; Sawada T. et al., Hum Reprod 14: 1470-1472, 1999; Wiseman DM J Reprod Med 44: 325- 331, 1999; Thornton MH. et al., Hum Reprod 13: 1480-1485, 1998) oder durch die Hemmung der Entzündungsreaktion durch Corticoide und/oder nicht-steroidale antiinflammatorische Mittel (Buckenmaier CC. et al., Am Surg 65: 274-282, 1999) reduziert werden. In extremen Fällen können behindernde Adhäsionen durch Adhäsiotomie, chirurgische Schnitte oder Lyse der Adhäsion (Adhäsiolyse) behandelt werden. Ein endoskopischer chirurgischer Eingriff, eine so genannte minimal-invasive Chirurgie, verursachte angenommenermaßen geringere postoperative Adhäsionen als eine Laparotomie, jedoch sind die Daten bis heute widersprüchlich. Die Diskrepanz in den berichteten Ergebnissen kann bis zu einem gewissen Umfang durch die Zeitdauer des chirurgischen Eingriffes erklärt werden, die in diesen Studien nicht in Erwägung gezogen wurde. Tatsächlich wurde kürzlich berichtet, dass die Dauer eines CO₂ Pneumoperitoneums ein Haupt-Cofaktor in der Adhäsionsbildung in Kaninchen (Ordonez JL, Dominguez J, Evrard V, Koninckx PR: Hum Reprod 12: 2654-2657, 1997; Molinas CR, Koninckx PR: Hum Reprod 15: 1758-1763, 2000 und Yesildaglar N, Koninckx PR: Adhesion formation in intubated rabbits increases with high insufflation pressure during endoscopic surgery. Hum Reprod 15: 687-691, 2000) und in Mäusen (Molinas CR, Mynbaev O, Pauwels A, Novak P, Koninckx PR: Fertil-Steril 76: 560-567, 2001 und Yesildaglar N, Ordonez JL, Laermans I, Koninckx PR: Hum Reprod 14: 55-59, 1999) ist. Zahlreiche Patente sind in der Technik verfügbar, die Verfahren und Zusammensetzungen zur Prävention einer Adhäsionsbildung beanspruchen. Im Allgemeinen fallen die Behandlungen in unterschiedliche Kategorien, wie beispielsweise (i) (bio)mechanisch durch Vermeiden eines direkten Kontaktes zwischen den Geweben, (ii) Vorbeugung einer Fibrin- oder Collagenablagerung im Peritoneal-Exsudat oder Entfernung einer Fibrinablagerung (iii), Reduktion einer lokalen Gewebsentzündung, (iv) Hemmung einer oxidativen Schädigung des Gewebes (v), Inhibitoren der Vitronectine oder (vi) Anoxämie verhindernde Verbindungen oder Kombinationen hiervon. Bis jetzt hat sich keiner der existierenden therapeutischen Ansätze als universal wirksam bei der Vorbeugung einer postoperativen Adhäsionsbildung erwiesen. Es besteht nach wie vor ein Bedarf nach Zusammensetzungen und Verfahren, die sicher und effektiv zur Vorbeugung einer Adhäsionsbildung in einer Vielzahl von unterschiedlichen Einstellungen verwendet werden können. Es hat sich in der Technik gezeigt, dass ein bedeutender Faktor, der eine Adhäsionsbildung während eines chirurgischen Eingriffes verursacht, eine Hypoxämie ist (Molinas CR and Koninckx PR (2000) Hum Reprod 15(8): 1758-63). Eine Hypoxie hat tatsächlich eine dramatische Auswirkung auf die Gen-Expression und Micro-Array Berichte, die in der Technik beschrieben sind, betreffen zumindest 10% der Gene, die in den untersuchten Systemen eine Veränderung der Expression aufweisen (Jin K et al., (2002) Neurochem. Res. 27(10): 1105-12). In der vorliegenden Erfindung haben wir mehrere Gene identifiziert, deren Überexpression in hypoxischen Zuständen zu einer erhöhten Adhäsionsbildung führt. Wir haben gezeigt, dass die Hemmung der Expression von vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor B (VEGF-B), placentarem Wachtstumsfaktor (PIGF) und Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF) zu einer bemerkenswerten Expression einer postoperativen Adhäsionsbildung führt.
Figuren
1: Das Kaninchen- und Maus-Laparoskopie-Modell.
2: Auswirkung der Dauer eines CO₂ Pneumoperitoneums auf die Adhäsionsbildung in in nicht-intubierten Kaninchen (A) und Mäusen (B). Der Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts ist zusammen mit dem P-Wert (Wilcoxon) angegeben.
3: Auswirkung eines Insufflationsdrucks (5 gegen 20 mm Hg) und der Strömungsgeschwindigkeit (1 gegen 10 l/min) in intubierten Kaninchen (A) und eines Insufflationsdrucks (5 gegen 15 cm Wasser) und der Dauer eines Pneumoperitoneums (10 gegen 60 Minuten) in intubierten Mäusen (B) nach Adhäsionsbildung. Der Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts ist zusammen mit dem P-Wert (zweiseitige Varianzanalyse) angegeben. (A: Hum Reprod 15, 687-691; B: Fertil Steril, 76, 560-567).
4: Auswirkung des Zusatzes unterschiedlicher Anteile von Sauerstoff zum CO₂ Pneumoperitoneum nach Adhäsionsbildung in Kaninchen (A) und Mäusen (B). Der Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts ist zusammen mit dem P-Wert (Wilcoxon) angegeben. (B: Fertil Steril, 76, 560-567).
5: Auswirkung von Insufflationsgas (CO₂
gegen Helium
), der Dauer des Pneumoperitoneums (10m gegen 45 Minuten) und des Zusatzes von Sauerstoff (0 gegen 4%) in Kaninchen (A) und von Insufflationsgas (CO₂ gegen Helium) und des Zusatzes von Sauerstoff (0 gegen 3%) in Mäusen (B) nach Adhäsionsbildung. Der Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts ist zusammen mit dem P-Wert (zweiseitige Varianzanalyse) angegeben (A: Hum Reprod 15, 1758-1763; B: Fertil Steril, 76, 560-567).
Ziele und ausführliche Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung (insbesondere der Vorbeugung oder Unterdrückung) der Bildung oder erneuten Bildung von Adhäsionen, insbesondere in den Peritoneal- oder Becken-Kavitäten, die sich aus einer Wunde, einem chirurgischen Eingriff, einer Infektion, Entzündung oder einem Trauma ergeben. Die Erfindung ist zur Hemmung, Unterdrückung oder Linderung einer Adhäsionsbildung bei Säugetieren einschließlich Menschen von Nutzen. Die Erfindung betrifft humane und veterinäre Anwendungen. Die Behandlungen zeigen sich insbesondere bei der Behandlung einer Adhäsionsbildung im Peritoneum im Anschluss an einen chirurgischen Eingriff wirksam. Zusätzlich findet die vorliegende Erfindung in anderem Kontext Anwendbarkeit, beispielsweise für kardiovaskuläre, orthopädische, thoraxbezogene, ophthalmische, ZNS- und andere Anwendungen, bei denen die Vorbeugung der Bildung von Adhäsionen ein signifikantes Anliegen ist.
Einige Begriffe und Definitionen in der vorliegenden Erfindung werden zuerst definiert werden. Der Begriff "Adhäsionsbildung", wie hierin verwendet in seinem medizinischen Sinne, betrifft eine Konglutination, der Prozess des Anhaftens oder der Vereinigung zweier Oberflächen oder Teile. Beispielsweise die Vereinigung gegenüberliegender Flächen einer Wunde oder gegenüberliegender Oberflächen des Peritoneums. Ebenfalls kann der Begriff "Adhäsionen" im Plural inflammatorische Bänder betreffen, die gegenüberliegende seröse Oberflächen verbinden. Der Begriff Adhäsion, wie hierin verwendet, schließt ebenfalls Bindegewebsadhäsionen ein, die Adhäsionen sind, die aus feinen Fibrinfäden bestehen, die sich aus einem Exsudat von Plasma oder Lymphe bilden oder einer Extravasion von Blut. Ein Keloid, eine glatte Überwucherung von fibroblastischem Gewebe, die sich am Ort der Verletzung oder gelegentlich spontan bildet, ist ebenfalls eine Form der Adhäsion. Die Basal-Adhäsionsbildung wie hierin in ihrem medizinischen Sinne verwendet, ist das Basalniveau der Adhäsionsbildung, die nach einer Verletzungsverwundung (beispielsweise einem chirurgischen Eingriff) eintritt, die gegenüber einer Atmosphäre exponiert ist, die ausreichend Sauerstoff enthält, um einen Zustand der Hypoxie oder der Hyperoxie zu vermeiden. Unter den experimentellen Bedingungen erhöhte eine Intubation kleiner Tiere mit CO₂ Pneumoperitoneum ohne Sauerstoff das Niveau der postoperativen Adhäsionsbildung ("Hypoxie-verstärkte Adhäsionsbildung"). Der Begriff "Anoxämie", wie hierin verwendet, bedeutet in ihrem medizinischen Sinne eine gesenkte Verfügbarkeit von Sauerstoff gegenüber der Zelle und die Folgen hiervon. Eine Anoxämie umfasst deswegen eine Hypoxämie, die eine Konsequenz einer gesenkten Sauerstoffabgabe an die Zellen ist (beispielsweise durch gesenkte Sauerstoffkonzentration in der Luft oder durch ein Versagen des Abgabesystems, wie beispielsweise Hämoglobin oder das kardiovaskuläre System) oder durch eine gesenkte Fähigkeit der Zellen, Sauerstoff zu verwenden.
Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" wird hierin adjektivisch verwendet und bedeutet, dass das modifizierte Hauptwort zur Verwendung in einem pharmazeutischen Produkt geeignet ist. Der Begriff "Behandlung" betrifft irgendein Verfahren, eine Wirkung, Anwendung, Therapie oder dergleichen, bei der ein Säugetier einschließlich eines Menschen, einer medizinischen Hilfe mit dem Objekt der Verbesserung des Zustandes des Säugetiers unterworfen wird, direkt oder indirekt. In der gegenwärtigen Erfindung bedeutet "Behandlung" Prävention. Wenn die Adhäsionsbildung vermieden wird, bedeutet diese hier, dass das Auftreten einer Adhäsionsbildung im Vergleich mit dem Säugetier, das nicht mit einem Inhibitor der Erfindung behandelt wurde, unterdrückt wird. Unterdrückung bedeutet, dass die Adhäsionsbildung oder spezieller, die postoperative Adhäsionsbildung zumindest 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder sogar 100% weniger im Vergleich zu einem Säugetier auftritt, das nicht mit einem Inhibitor der Erfindung behandelt wurde (beispielsweise HIF- oder PIGF- oder VEGF-B-Inhibitor). Die Adhäsionsbildung kann, wie hierin weiterhin in den Beispielen beschrieben ist, gemessen (oder gescored) werden.
Die Erfindung stellt die Verwendung einer Verbindung bereit, die die Expression und/oder Aktivität eines Placentawachstumsfaktors hemmt, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung der Adhäsionsbildung. Der Begriff "eine Verbindung, die die Expression hemmt", betrifft hier die Gen-Expression und somit die Hemmung der Gen-Transkription und/oder Translation eines Gen-Transkripts (mRNA), wie beispielsweise des PIGF-Gens oder PIGF mRNA. Vorzugsweise ist diese Hemmung zumindest 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder sogar noch mehr. Der Begriff "eine Verbindung, die die Aktivität hemmt", betrifft hier das Protein, das erzeugt wird, wie beispielsweise das PIGF-Protein. Die Hemmung der Aktivität führt zu einer verringerten Interaktion (beispielsweise im Falle von PIGF mit dem VEGFR-1) mit seinem Rezeptor und eine Hemmung der Signaltransduktion oder eine verminderte Transaktivierung (wie im Falle von Hypoxie-induzierbaren Faktoren, die Transkriptionsfaktoren sind). Vorzugsweise ist diese Hemmung zumindest 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder sogar noch mehr.
Die vorliegende Offenbarung zeigt, dass die Adhäsionsbildung in adulten PIGF^-/- Mäusen unterdrückt wird und dass die Adhäsionsbildung durch Verwendung von Inhibitoren von PIGF unterdrückt werden kann. Somit betrifft in einer Ausführungsform die vorliegende Erfindung die Verwendung von Molekülen, die eine Region umfassen, die spezifisch an placentaren Wachstumsfaktor oder an seinen Rezeptor (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktorrezeptor-1) binden und folglich diese Moleküle die Bindung von PIGF an ihren Rezeptor, der die Signaltransduktion von PIGF stört, und die Moleküle können zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer Adhäsionsbildung verwendet werden. Somit betrifft die Erfindung insbesondere Moleküle, die die Aktivität von PIGF durch Stören ihrer Synthese, Translation, Dimerisierung, Rezeptorbindung und/oder Rezeptorbindungs-vermittelten Signaltransduktion neutralisieren. Der Begriff Moleküle bedeutet Peptide, tetramerische Peptide, Proteine, organische Moleküle, Mutanten des VEGFR-1, lösliche Rezeptoren von VEGFR-1 und irgendein Fragment oder Homolog hiervon mit derselben neutralisierenden Wirkung wie oben festgestellt. Ebenfalls umfassen in der vorliegenden Erfindung die Moleküle Antagonisten von PIGF, wie beispielsweise Anti-PIGF-Antikörper und funktionelle Fragmente, die hiervon abgeleitet sind, anti-sense RNA und DNA-Moleküle und Ribozyme, die dazu dienen, die Translation von PIGF zu hemmen, die alle dazu in der Lage sind, die VEGFR-1 Signaltransduktion zu stören/oder zu hemmen. Der Begriff Synthese bedeutet eine Transkription von PIGF. Kleine Moleküle können an die Promoterregion von PIGF binden und die Bindung eines Transkriptionsfaktors hemmen oder diese Moleküle können den Transkriptionsfaktor binden und die Bindung an den PIGF-Promotor hemmen. Der Begriff PIGF bedeutet ebenfalls Isoformen, die als Folge eines alternativen Spleißens auftreten und Allele- Varianten hiervon. Als Folge des alternativen Spleißens wurden drei PIGF RNAs beschrieben, die monomeres humanes PIGF-1, PIGF-2 und PIGF-2 Isoformvorläufer codieren, die 149, 179 bzw. 219 Aminosäurereste enthalten. In normalen Mausgeweben wurde nur eine Maus PIGF mRNA, die das Äquivalent von humanem PIGF-2 codiert, identifiziert. Geeignete Inhibitoren von PIGF, die in WO 0185796 beschrieben wurden, können ebenfalls zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer (postoperativen) Adhäsionsbildung verwendet werden.
Der Begriff "Antikörper" oder "mehrere Antikörper" betrifft einen Antikörper, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er speziell gegen PIGF, VEGFR-1 oder irgendein funktionelles Derivat hiervon gerichtet ist, wobei die Antikörper vorzugsweise monoklonale Antikörper sind; oder ein Antigen bindendes Fragment hiervon, das F(ab')₂, F(ab) oder Einzelketten Fv-Typs oder irgendeines Typs einem rekombinantem Antikörper, der hiervon abgeleitet ist. Diese Antikörper der Erfindung einschließlich spezifischer polyklonaler Antiseren, die gegen PIGF, VEGFR-1 oder irgendein funktionelles Derivat hiervon hergestellt sind, weisen keine Cross-Reaktivität mit anderen Proteinen auf. Die monoklonalen Antikörper der Erfindung können beispielsweise durch irgendeine Hybridoma hergestellt werden, die durch klassische Verfahren aus Milzzellen eines Tieres, insbesondere einer Maus oder einer Ratte, die gegen PIGF, VEGFR-1 oder irgendein funktionelles Derivat hiervon immunisiert wurde, erzeugt werden kann, und können aus Zellen einer Myelomazell-Linie auf Grund der Fähigkeit der Hybridoma, monoklonale Antikörper zu erzeugen, die PIGF, VEGFR-1 oder irgendein funktionelles Derivat hiervon erkennen können, das initial zur Immunisierung der Tiere verwendet wurde, ausgewählt werden. Die monoklonalen Antikörper gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung können humanisierte Versionen der monoklonalen Maus-Antikörper sein, die mittels DNA-Rekombinationstechnologie hergestellt wurden, die von den Maus- und/oder humanen genomischen DNA-Sequenzen abweichen, die für H- und L-Ketten codieren oder von cDNA-Klonen, die für H- und L-Ketten codieren. Alternativ können die monoklonalen Antikörper gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung humane monoklonale Antikörper sein. Derartige humane monoklonale Antikörper werden beispielsweise mittels einer humanen peripheren Blut-Lymphozyten (peripheral blood lymphocytes = PBL) Neupopulation von Mäusen mit einem schweren kombinierten Immundefekt (severe combined immune deficiency = SCID), hergestellt, wie in PCT/EP 99/03645 beschrieben ist oder durch Anwendung von transgenen nicht-humanen Tieren, die dazu in der Lage sind, humane Antikörper zu erzeugen, wie es im US-Patent Nr. 5 545 806 beschrieben ist. Ebenfalls bilden Fragmente, die von diesen monoklonalen Antikörpern abgeleitet wurden, wie beispielsweise Fab, F(ab)'₂ und ssFv ("Einketten-variables Fragment"), vorausgesetzt, sie haben die ursprünglichen Bindungseigenschaften aufrechterhalten, Teil der vorliegenden Erfindung. Derartige Fragmente werden üblicherweise beispielsweise durch enzymatischen Verdau der Antikörper mit Papain, Pepsin oder anderen Proteasen erzeugt. Es ist für den Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt, dass monoklonale Antikörper oder Fragmente hiervon für verschiedene Anwendungen modifiziert werden können. Die in der vorliegenden Erfindung einbezogenen Antikörper können durch eine geeignete Markierung des enzymatischen, fluoreszierenden oder radioaktiven Typs markiert werden.
Kleine Moleküle, beispielsweise kleine organische Moleküle und andere Arzneistoffkandidaten können beispielsweise aus kombinatorischen und natürlichen Produkte-Bibliotheken gewonnen werden.
Zufallsbedingte Peptid-Bibliotheken, wie beispielsweise die Verwendung von tetrameren Peptid-Bibliotheken, wie sie beispielsweise in WO 0185796 beschrieben sind, die aus allen möglichen Kombinationen von Aminosäuren bestehen, die an einen Festphasenträger gebunden sind, können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ebenfalls können transdominant-negative Mutantenformen von VEGF-Rezeptoren (beispielsweise ein transdominant-negativer Rezeptor von VEGF-R1) dazu verwendet werden, die Signaltransduktion von PIGF zu hemmen. Die transdominant-negativen Mutantenformen von VEGF-Rezeptoren sind im US-Patent Nr. 5 851 999 voll beschrieben. Ebenfalls innerhalb des Umfangs der Erfindung liegt die Verwendung von Oligoribonukleotid-Sequenzen, die anti-sense RNA und DNA-Moleküle einschließen und Ribozymen, die dazu dienen, die Translation von VEGFR-1 mRNA oder PIGF mRNA zu hemmen. Anti-sense RNA- und DNA-Moleküle dienen dazu, die Translation von mRNA durch Bindung an Ziel mRNA direkt zu blockieren und die Proteintranslation zu verhindern. Bezüglich von anti-sense DNA sind Oligodeoxyribonukleotide, die aus der Translationsstartstelle abgeleitet sind, beispielsweise zwischen –10 und +10 Regionen des VEGFR-1 oder PIGF Nukleotidsequenz bevorzugt. Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die dazu in der Lage sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Der Mechanismus der Ribozymwirkung schließt eine Sequenz-spezifische Hybridisierung des Ribozym-Moleküls an komplementäre Target-RNA gefolgt von einer endonukleolytischen Spaltung ein.
Innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen gentechnisch veränderte Hammerhead-Motiv-Ribozym-Moleküle, die die endonukleolytische Spaltung von VEGFR-1 oder PIGF-Sequenzen effizient katalysieren. Spezielle Ribozymenspaltstellen innerhalb jedes potenziellen RNA-Targets werden anfänglich durch Scannen des Zielmoleküls bezüglich Ribozymspaltstellen identifiziert, die die folgenden Sequenzen einschließen, GUA, GUU und GUC. Wenn sie einmal identifiziert sind, können kurze RNA-Sequenzen von zwischen 15 und 20 Ribonukleotiden, die der Region des Ziel-Genes entsprechen, das die Spaltstelle enthält, bezüglich vorhergesagter struktureller Merkmale, wie beispielsweise Sekundärstruktur ausgewertet werden, die die Oligonukleotidsequenz ungeeignet macht. Sowohl anti-sense RNA- als auch DNA-Moleküle und Ribozyme der Erfindung können durch irgendein Verfahren hergestellt werden, das in der Technik zur Synthese von RNA-Molekülen bekannt ist. Diese schließen Techniken zum chemischen Synthetisieren von Oligodeoxyribonukleotiden ein, die in der Technik wohlbekannt sind, wie beispielsweise Festphasen, Phosporamidit-chemische Synthese. Alternativ können RNA-Moleküle durch in vitro- und in vivo Transkription von DNA-Sequenzen erzeugt werden, die das anti-sense RNA-Molekül codieren. Derartige DNA-Sequenzen können in eine breite Vielzahl von Vektoren eingebaut werden, die geeignete RNA-Polymerase-Promotoren inkorporieren, wie beispielsweise die T7 oder SP6 Polymerase-Promotoren. Alternativ können anti-sense cDNA Konstrukte, die anti-sense RNA konstitutiv oder induzierbar synthetisieren, abhängig vom verwendeten Promotor, stabil in die Zell-Linien eingeführt werden.
Es sollte klar sein, dass das therapeutische Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Behandlung einer Unterdrückung der Adhäsionsbildung ebenfalls in Kombination mit irgendeiner anderen Therapie verwendet werden kann, die in der Technik zur Behandlung einer postoperativen Adhäsionsbildung bekannt ist. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur Vorbeugung einer Adhäsionsbildung werden vorzugsweise in Verbindung mit einem Arzneistoffabgabesystem verabreicht, das eine wirksame Konzentration der Verbindung an einem Ort der potenziellen Adhäsionsbildung während der perioperativen Intervalls aufrechterhält. Diese Inhibitoren zur Verwendung in der Behandlung der Unterdrückung und/oder Minimierung einer Adhäsionsbildung kann als das primäre therapeutische Mittel verabreicht werden oder kann mit ein oder mehreren zusätzlichen therapeutischen Mitteln gleichzeitig verabreicht werden.
Der Begriff "Medikament zur Behandlung" betrifft eine Zusammensetzung, die Moleküle wie oben beschrieben und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder einen Trägerstoff (beide Begriffe können in austauschbarer Weise verwendet werden) zur Behandlung von Erkrankungen, wie oben angezeigt, umfassen. Geeignete Träger oder Trägerstoffe, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, sind Salzlösung, Ringer'sche Lösung, Dextroselösung, Hanks-Lösung, fette Öl, Ethyloleat, 5% Dextrose in Salzlösung, Substanzen, die die Isotonität und die chemische Stabilität erhöhen, Puffer und Konservierungsmittel. Andere geeignete Träger schließen irgendwelche Träger ein, die nicht selbst die Erzeugung von Antikörpern induzieren, die für das Individuum, das die Zusammensetzung empfängt, gefährlich sind, wie beispielsweise Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren und Aminosäure-Copolymere. Das "Medikament" kann durch irgendein geeignetes Verfahren innerhalb des Wissens des Fachmanns verabreicht werden. Der bevorzugte Verabreichungsweg ist parenteral. Bei der parenteralen Verabreichung wird das Medikament der Erfindung in einer Einzeldosisinjizierbaren Form formuliert, wie beispielsweise einer Lösung, Suspension oder Emulsion, in Verbindung mit den pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen, wie oben definiert. Jedoch hängt die Dosierung und der Verabreichungsweg vom Individuum ab. In Allgemeinen wird das Medikament so verabreicht, dass das Protein, Polypeptid, Peptid der vorliegenden Erfindung in einer Dosis zwischen 1 μg/kg und 10 mg/kg gegeben wird, besonders bevorzugt zwischen 10 μg/kg und 5 mg/kg, am meisten bevorzugt zwischen 0,1 und 2 mg/kg. Vorzugsweise wird sie als Bolus-Dosis gegeben. Eine kontinuierliche Infusion kann ebenfalls verwendet werden und schließt eine kontinuierliche subcutane Abgabe über osmotische Minipumpen ein. Wenn dies der Fall ist, kann das Medikament in einer Dosis zwischen 5 und 20 μg/kg/min, besonders bevorzugt zwischen 7 und 15 μg/kg/min infundiert werden.
Ein weiterer Aspekt der Verabreichung zur Behandlung ist die Anwendung einer Gen-Therapie zur Abgabe des oben erwähnten anti-sense Gens oder funktioneller Teile des PIGF-Gens oder eines Ribozyms, das gegen die PIGF mRNA oder einen funktionellen Teil hiervon gerichtet ist. Gen-Therapie bedeutet die Behandlung durch Abgabe therapeutischer Nukleinsäuren an Patientenzellen. Ein umfassender Überblick findet sich in Lever und Goodfellow 1995; Br. Med Bull., 51, 1-242; Culver 1995; Ledley, F.D. 1995. Hum. Gene Ther. 6, 1129. Um eine Gen-Therapie zu erreichen, muss ein Verfahren existieren, Gene an die Patientenzellen abzugeben, und zusätzliche Verfahren müssen existieren, um die wirksame Erzeugung jeglicher therapeutischer Gene sicherzustellen. Es existieren zwei allgemeine Ansätze, um eine Gen-Abgabe zu erreichen; diese sind eine nicht-virale Abgabe und Virus-vermittelte Gen-Abgabe.
In einer speziellen Ausführungsform können kurze Interferenz RNA-Moleküle (siRNA) zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer Adhäsionsbildung verwendet werden. Diese Interferenz RNA-Moleküle können auf Grundlage der genetischen Sequenzen von PIGF erzeugt werden. Die RNA-Interferenz (RNAi) basiert auf dem Abbau spezieller Zielsequenzen durch das Design von kurzen Interferenz RNA Oligos (siRNA), die die Zielsequenz erkennen (hier PIGF) und anschließend ihren Abbau durch einen schlecht verstandenen Stoffwechselweg auslösen. Im Allgemeinen sind es siRNA Duplexe kürzer als 30 Nukleotide, weil längere Strecken von dsRNA den PKR-Weg in Säugetierzellen aktivieren, ein globales, unspezifisches Abschalten der Proteinsynthese zur Folge hat. Die Herstellung Gen-Therapievektoren für die intrazelluläre Expression von siRNA Duplexes ist in WO 0244321 offenbart.
In einer weiteren speziellen Ausführungsform können RNA-Aptamere zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer Adhäsionsbildung verwendet werden. Diese RNA-Aptamere können gegen PIGF erzeugt werden. Kürzlich wurden RNA-Aptamere als therapeutische Reagenzien wegen ihrer Fähigkeit, die Proteinfunktion zu stören, verwendet. Die Auswahl von Aptameren in vitro ermöglicht die rasche Isolation von extrem seltenen RNAs, die eine hohe Spezifität und Affinität für spezifische Proteine aufweisen. Beispielhafte RNA-Aptamere sind im US-Patent Nr. 5 270 163 auf den Namen Gold et al., Ellington und Szostak, "In vitro Selection of RNA Molecules that Bind Specific, Ligands", Nature 346: 818-822 (1990) und Tuerk and Gold, "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: RNA Ligands to Bacteriophage T4 DNA Polymerase," Science 249: 505-510 (1990) beschrieben. Anders als Anti-Sense-Verbindungen, deren Targets eindimensionale Gitter sind, können RNA-Aptamere an dreidimensionale Oberflächen eines Proteins binden. Überdies können RNA-Aptamere häufig fein zwischen diskreten funktionellen Orten eines Proteins unterscheiden (Gold et al., "Diversity of Oligonucleotide Functions", Annu. Rev. Biochem. 64: 763-797 (1995)). Als Forschungs- und Therapiereagenzien weisen Aptamere nicht nur kombinierte Vorteile von Antikörpern und Arzneistoffen mit kleiner Molekülmasse auf, sondern die in vitro Produktion von RNA-Aptameren kann ebenfalls genetisch kontrolliert werden. Derartige RNA-exprimierende Gene sind üblicherweise kleiner als Protein-codierende Gene und können einfach in Gen-Therapievektoren eingefügt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung der Adhäsionsbildung durch Verabreichen einer Verbindung bereit, die die Expression und/oder Aktivität eines Hypoxie-induzierten Genes hemmt, wobei das Hypoxie-induzierte Gen Placentawachstumsfaktor ist. Die Verbindung, die die Expression und/oder Aktivität von Placentawachstumsfaktor hemmt, ist vorzugsweise aus der Liste ausgewählt, die aus einem Nukleotid (anti-sense siRNA, RNA-Aptamer), einem kleinen Molekül, einem Antikörper, einem Ribozym, einem transdominanten Rezeptor, einem tetrameren Peptid ausgewählt ist.
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen bevorzugte Merkmale der Erfindung noch vollständiger, sollen jedoch die Erfindung keinesfalls einschränken. Alle Ausgangsmaterialen und Reagenzien, die unten offenbart sind, sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind kommerziell erhältlich oder können unter Verwendung wohlbekannter Techniken hergestellt werden.
Beispiele und Vergleichsbeispiele
1. Die Rolle der Hypoxie-induzierbaren Faktoren und vom Placentawachstumsfaktor in der Adhäsionsbildung
1.1 Kaninchenmodelle und Experimente mit einer Pneumoperitoneum-induzierten Adhäsionsbildung
In adulten, weiblichen weißen Neuseeland-Kaninchen wurden Adhäsionen induziert und während einer Laparoskopie ausgewertet. Für das Pneumoperitoneum wurden 1 oder schließlich 2 Insufflatoren (Termoflator^®, Karl Storz, Deutschland) verwendet, 1 für CO₂ oder Helium und 1 für Sauerstoff. Die Outputs beider Insufflatoren wurden in einer Mischkammer verbunden, um ein homogenes Gasgemisch zu erzielen. Das Gas wurde auf 37 °C erhitzt (Optitherm^®, Karl Storz, Deutschland) und befeuchtet (Dräger, Deutschland), um die bekannten Wirkungen der Hypothermie zu reduzieren (Ott DE: J Laparoendosc Surg 1: 183-186, 1991; Ott DE: J Laparoendosc Surg 1: 127-131, 1991 and Puttick MI, Scott-Coombes DM, Dye J, Nduka CC, Menzies-Gow NM, Mansfield AO, Darzi A: Surg Endosc 13: 572-575, 1999), und um die Austrockung zu reduzieren (Ryan GB, Grobety J, Majno G: Mesothelial injury and recovery. Am J Pathol 71: 93-112, 1973). Die diskontinuierliche Abgabe von Gas durch einen Insufflator induziert kleine Variationen des Drucks. Sie sind in kleinen Tieren entscheidend, weil ein Überdruck letal sein kann, und weil ein konstanter Druck essentiell ist, wenn der Effekt des Insufflationsdruckes Ziel der Untersuchung ist. Deswegen wurde ein Wasserventil mit einer freien Entweichbarkeit von Gas verwendet. Der Druck, der am Insufflator eingestellt wurde, war geringfügig höher als im Wasserventil, basierend auf der Kenntnis, dass der gesamte Überschuss an Gas sich frei verflüchtigen würde, was Überdrücke vermeidet und einen konstanten und gleichförmigen Insufflationsdruck aufrechterhält. Um die vorher definierte Konzentration des Insufflationsgases aufrechtzuerhalten, wurde eine kontinuierliche Strömungsgeschwindigkeit durch das Tier unter Verwendung eines 26-Gauge-Katheters eingeführt (1). Der erste laparoskopische Zugang (12 mm) zur Insufflation und für das Endoskop wurde caudal an den Brustbeinen durch offene Laparoskopie eingefügt. Nach der Etablierung des Pneumoperitoneums wurden die zweiten Öffnungen (5 mm) unter direkter laparoskopischer Wahrnehmung eingebracht. Während eines ersten chirurgischen Eingriffes wurden standardisierte gegenüberliegende Verletzungen in den Gebärmutterzipfeln und Beckenseitenwänden mit Scheren oder durch bipolare Koagulation oder durch einen CO₂ Laser durchgeführt. Nach 7 Tagen wurden die Adhäsionen während eines zweiten chirurgischen Eingriffs gescort, indem Umfang, Typ und Zähigkeit festgestellt wurde. In der ersten Studie führte ein unerfahrener Laparoskopie-Chirurg 50 aufeinander folgende chirurgische Eingriffe durch, um mechanische und bipolare Verletzungen unter Verwendung eines CO₂ Pneumoperitoneums bei 5 mm Hg zu induzieren. Das Pneumoperitoneum wurde unmittelbar am Ende des chirurgischen Verfahrens gestoppt. Die Dauer des chirurgischen Eingriffes nahm (Spearman) von 12 ± 2 Minuten in den ersten 10 chirurgischen Eingriffen auf 8 ± 1 Minute in den letzten 10 ab (P = 0,0001). Gleichzeitig nahm der Gesamt-Adhäsionsscore (Spearman) von 10 ± 0,8 in den ersten 10 chirurgischen Eingriffen auf 4,6 ± 0,5 in den letzten 10 (P = 0,002) ab. Die Dauer des chirurgischen Eingriffes und die Erfahrung des Chirurgen, festgestellt durch die aufeinanderfolgende Anzahl von chirurgischen Eingriffen jedoch korrelierte so stark, dass der Effekt von beidem nicht getrennt werden konnte. Es war somit nicht möglich, den Beitrag der Unerfahrenheit des Chirurgen und/oder die Zeitdauer des chirurgischen Eingriffes auf die Adhäsionsbildung festzustellen (Ordonez JL, Dominguez J, Evrard V, Koninckx PR: Hum Reprod 12: 2654-2657, 1997). Deswegen wurde die Wirkung der Dauer des CO₂ Pneumoperitoneums ausgewertet. Laser- und bipolare Läsionen wurden in 5 bis 6 Minuten durchgeführt, und das Pneumoperitoneum wurde für 10, 20, 30 und 60 Minuten aufrechterhalten. Der Gesamt-Adhäsionsscore nahm von 3,2 ± 1,9 nach 10 Minuten auf 6,8 ± 2,4, 10,4 ± 2,6 und 14,4 ± 0,9 nach 20, 30 bzw. 60 Minuten zu (P = 0,001) (2A). Ähnliche Effekte wurden bezüglich des Umfangs, Typs und Zähigkeits-Scores beobachtet. Diese Daten zeigten, dass ein CO₂ Pneumoperitoneum ein Co-Faktor in der Adhäsionsbildung war. Um auszuwerten, ob dies durch Veränderungen im pH oder durch mesotheliale Hypoxie vermittelt wurde, wurde die Auswirkung des Insufflationsdruckes, des Zusatzes von Sauerstoff und von Helium als Insufflationsgas untersucht. In den intubierten Kaninchen wurden bipolare und Laserläsionen durchgeführt, und ein CO₂ Pneumoperitoneum wurde während 30 Minuten bei 5 und 20 mm Hg aufrechterhalten, um die Auswirkung des Insufflationsdruckes auszuwerten. Weil in vitro Studien eine höhere Austrocknung mit höheren Durchflussgeschwindigkeiten zeigten (Yesildaglar N, Koninckx PR: Hum Reprod 15: 687-691, 2000 und Yesildaglar N, Ordonez JL, Laermans I, Koninckx PR: Hum Reprod 14: 55-59, 1999) wurde eine Strömung von 1 und 10 Litern/min durch das Tier dazu verwendet, die Wirkung der Austrocknung zu bewerten. Die Adhäsionsbildung nahm (zweiseitige Varianzanalyse) mit einem höheren Insufflationsdruck (P = 0,002) und mit einer höheren Durchströmungsrate (P = 0,0003) zu (Yesildaglar N, Koninckx PR: Hum Reprod 15: 687-691, 2000) (3A). Weil höhere Insufflationsdrücke die Kompression der kapillaren Strömung erhöhen, sind diese Ergebnisse mit der Erkenntnis konsistent, dass eine mesotheliale Hypoxie eine Schlüsselrolle bei der Adhäsionsbildung spielt, was zum selben Zeitpunkt eine Rolle zur Austrocknung nach Adhäsionsbildung nahe legt. Der Zusatz von Sauerstoff zum CO₂ Pneumoperitoneum wurde unter Verwendung eines Gemisches aus CO₂ und Sauerstoff bei unterschiedlichen Anteilen ausgewertet. Laserverletzungen wurden durchgeführt, und ein Pneumoperitoneum mit 0, 1, 2,5, 5, 10 und 20% Sauerstoff wurde für eine Stunde aufrechterhalten. Die Adhäsionsbildung nahm ab (Wilcoxon) durch Zusatz von Sauerstoff, und eine maximale Wirkung wurde bei 5% Sauerstoff (P = 0,0005) beobachtet (4A). Um den Effekt einer Azidose auszuschließen, wurde ein Inertgas, wie beispielsweise Helium verwendet. 100% CO₂ und Helium für 10 und 45 Minuten wurden dazu verwendet, die Auswirkung des Insufflationsgases und die Dauer des Pneumoperitoneums auszuwerten. In ähnlicher Weise wurden CO₂ und Helium mit 0 und 4% Sauerstoff dazu verwendet, den Effekt des Insufflationsgases und den Zusatz von Sauerstoff zu evaluieren. Durch zweiseitige Varianzanalyse nahm die Adhäsionsbildung mit der Dauer des CO₂ und des Helium Pneumoperitoneums (P = 0,0003) zu und nahm unter Zusatz von Sauerstoff (P = 0,002) ab, wohingegen keine Unterschiede zwischen CO₂ und Helium zu finden waren (Molinas CR, Koninckx PR: Hum Reprod 15: 1758-1763, 2000) (5A). Weil die mesotheliale Hypoxie durch Sauerstoff reduziert werden sollte und nicht durch die Art des Gases beeinflusst werden sollte und weil es wohlbekannt ist, dass sowohl eine systemische (Fernandez-Cruz L, Saenz A, Taura P, Sabater L, Astudillo E, Fontanals J: Helium and carbon dioxide pneumoperitoneum in patients with pheochromocytoma undergoing laparoscopic adrenalectomy. World J Surg 22: 1250-1255, 1998; Fitzgerald SD, Andrus CH, Baudendistel W, Dahms TE, Kaminski DL:. Am J Surg 163: 186-190, 1992; Fleming RY, Dougherty TB, Feig BW: Surg Endosc 11: 230-234, 1997 und Junghans T, Bohm B, Grundel U, Schwenk W: Arch Surg 132: 272-278, 1997) als auch eine lokale (Kuntz C, Wunsch A, Bodeker C, Bay F, Rosch R, Windeler J, Herfarth C: Surg Endosc 14: 367-371, 2000 und West MA, Hackam DJ, Baker J, Rodriguez JL, Bellingham J, Rotstein OD: Ann Surg 226: 179-190, 1997) Azidose durch CO₂, jedoch nicht durch Helium verursacht wird, stützen diese Ergebnisse stark die Hypothese, dass eine mesotheliale Hypoxie ein Co-Faktor in der Adhäsionsbildung ist.
1.2 Das Mausmodell und Experimente bezüglich einer Pneumoperitoneum-induzierten Adhäsionsbildung
In addulten weiblichen NMRI (Naval Medical Research Institute) Mäusen wurden Adhäsionen durch Laparoskopie induziert und durch Laparotomie unter mikroskopischer Ansicht ausgewertet, um ähnliche Variablen wie im Kaninchenmodell festzustellen. Weil die meisten Insufflatoren eine diskontinuierliche Gaszufuhr aufwiesen, wurde ein elastischer Ballon zum vorher beschriebenen Aufbau hinzugefügt, um Druckveränderungen abzuschwächen, die für diese kleinen Tiere entscheidend sind ( 1). Das Endoskop mit einer Außenfutteral-Insufflation (Gesamtdurchmesser 3,2 mm) wurde kausal am Brustbein durch eine offene Laparoskopie eingebracht. Das Überleben nach unterschiedlichen Insufflationsdrücken und der Zeitdauer des Pneumoperitoneums wurde in nicht-intubierten und intubierten Mäusen ausgewertet. In nicht-intubierten Mäusen wurde das Pneumoperitoneum für 10 Minuten bei 2,5, 5, 7,5, 10 und 15 cm Wasser aufrechterhalten, und das Überleben betrug 100, 100, 95, 85 bzw. 60%, wohingegen keine Mortalität zu finden war, wenn das Pneumoperitoneum bis zu 120 Minuten bei 2,5 cm Wasser aufrechterhalten wurde (Yesildaglar N., Ordonez JL, Laermans I, Koninckx PR: Hum Reprod 14: 55-59, 1999). In intubierten Mäusen wurde das Pneumoperitoneum für 60 Minuten bei 5, 10, 15, 20, 25 und 30 cm Wasser aufrechterhalten, und das Überleben betrug 100, 100, 100, 100, 90 bzw. 90%, wohingegen keine Mortalität zu finden war, wenn das Pneumoperitoneum bis zu 180 Minuten bei 15 cm Wasser aufrechterhalten wurde (Molinas CR, Mynbaev O, Pauwels A, Novak P, Koninckx PR: Fertil Steril 76: 560-567, 2001). Zur Induktion von Adhäsionen wurden nach Etablierung des Pneumoperitoneums die zweiten und dritten Öffnungen (14-Gauge-Katheter) in die linke und rechte Flanke unter laparoskopischer Sicht eingeführt. Standardisierte, gegenüberliegende lineare Läsionen in den anti-mensenterischen Grenzen der Gebärmutterzipfel und in den Beckenseitenwänden wurden durch mono-polare Koagulation durchgeführt. Nach 7 oder 28 Tagen wurden die Adhäsionen durch Scoring des Umfangs, Typs und der Zähigkeit und durch eine quantitative Messung ausgewertet. In nicht-intubierten Mäusen wurde das CO₂ Pneumoperitoneum bei 2,5 cm Wasser für 5, 15, 30, 60 und 120 Minuten aufrechterhalten, um die Auswirkung der Dauer des Pneumoperitoneums auszuwerten. Die Adhäsionsbildung nimmt progressiv mit der Dauer des Pneumoperitoneums zu (2B). Um diese Wirkung zu bestätigen und um die Auswirkung der Austrocknung auf Grund der Durchströmungsrate durch das Tier zu evaluieren, wurde das Pneumoperitoneum für 5 und 60 Minuten ohne Strömung und für 60 Minuten mit 1 und 10 ml/min Strömungsgeschwindigkeit bzw. -Rate aufrechterhalten. Die Adhäsionsbildung nahm (Anova) mit der Zeitdauer des Pneumoperitoneums zu (P < 0,001) und mit höheren Strömungsgeschwindigkeiten (P < 0,001), was die Beobachtungen in Kaninchen bestätigt (Yesildaglar N., Ordonez JL, Laermans I, Koninckx PR: Hum Reprod 14: 55-59, 1999). In intubierten Mäusen wurde ein CO₂ Pneumoperitoneum für 10 und 60 Minuten bei 5 und 15 cm Wasser aufrechterhalten, um die Auswirkung der Zeitdauer des Pneumoperitoneums und den Insufflationsdruck auszuwerten. Die Auswirkung von Sauerstoff wurde ausführlich unter Zusatz von 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 6, 9 und 12% Sauerstoff zum CO₂ Pneumoperitoneum bestimmt. Zusätzlich wurde CO₂ und Helium Pneumoperitoneum mit 0 und 3% Sauerstoff dazu verwendet, die Auswirkung des Zusatzes von Sauerstoff zu unterschiedlichen Insufflationsgasen auszuwerten. Das Gemisch aus CO₂ oder Helium mit Sauerstoff wurde mit dem Termoflator Plus^® (Karl Storz, Deutschland) durchgeführt, ein Insufflator, der in dieser Studie zum ersten Mal verwendet wurde und der auf Grundlage der vielversprechenden Ergebnisse entwickelt wurde, die im Kaninchenmodell erzielt wurden. Die Adhäsionsbildung nahm mit der Zeitdauer des CO₂ Pneumoperitoneums und mit einem hohen Insufflationsdruck (3B) zu und senkte sich unter Zusatz von Sauerstoff (4B). Tatsächlich wurde eine halbmaximale Reduktion der Adhäsionen bei ungefähr 1,5% Sauerstoff gefunden, wohingegen eine maximale Reaktion nur 2 bis 3% Sauerstoff erforderte. Der Zusatz von Sauerstoff zu CO₂ und Helium Pneumoperitoneum wies eine ähnliche Auswirkung auf die Reduktion der Adhäsionen auf (5B) (Molinas CR, Mynbaev O, Pauwels A, Novak P, Koninckx PR: Fertil Steril 76: 560-567, 2001). Diese Daten bestätigen die Beobachtungen in Kaninchen und unterstützen die Hypothese einer mesothelialen Hypoxie als Antriebsmechanismus. Im Kaninchen- und Mausmodell wurde beobachtet, dass (i) die postoperative Adhäsionsbildung mit der Zeitdauer und dem Druck des CO₂ Pneumoperitoneums zunahm. (ii) die Zunahme der postoperativen Adhäsionen, verursacht durch CO₂ Pneumoperitoneum kann zumindest teilweise durch Verwendung eines Gemisches aus CO₂ und Sauerstoff vermieden werden. (iii) ähnliche Effekte nach einer postoperativen Adhäsionsbildung wurden beobachtet, wenn Helium anstelle von CO₂ für das Pneumoperitoneum verwendet wird. Die Adhäsionen nehmen mit der Zeitdauer des Pneumoperitoneums zu und nehmen nach Zusatz von Sauerstoff ab.
1.3 HIF und PIGF Mausmodelle
PIGF -/- wurde ausführlich in Lyer, N.V. et al., Genes Dev 12, 149-62 (1998); Carmeliet, P. et al., Nature 394, 485-90 (1998); Ryan, H.E., Lo, J. & Johnson, R.S. Embo J. 17, 3005-15, (1998) und Carmeliet, P. et al., Nat. Med. 7, 575-83 (2001) beschrieben.
Die Materialien und Methoden von HIF 1α+/+ und HIF 1α+/- (50% Swiss, 50% 129) Mäusen und von HIF 2α+/+ und HIF 2α+/- (87,5% Swiss, 12,5% 129) Mäusen wurde in Lyer, N.V. et al., Genes Dev 12, 149-62 (1998); Carmeliet, P. et al., Nature 394, 485-90 (1998); Ryan, H.E., Lo, J. & Johnson, R.S. Embo J. 17, 3005-15, (1998) und Carmeliet, P. et al., Nat. Med. 7, 575-83 (2001) ausführlich beschrieben.
1.4 Einfluss von HIF auf die postoperative Adhäsionsbildung
Eine Reihe von Experimenten in Wildtyp- und Knockoutmäusen wurde für HIF, wie beispielsweise von HIF 1α+/-, HIF 2α+/- an transgenen Mäusen in unserem laparoskopischen Maus-Modell durchgeführt. Adhäsionen wurden in Gebärmutterzipfeln und Beckenseitenwänden durch lineare monopolare und bipolare Läsionen von 10 Watt induziert. In allen Experimenten wurde das Pneumoperitoneum für 10 Minuten aufrechterhalten, um die basalen Adhäsionen auszuwerten und für 60 Minuten, um die Pneumoperitoneum-verstärkten Adhäsionen auszuwerten. Reines CO₂ wurde bei 20 cm Wasser (15 mm Hg) Insufflationsdruck angewendet. Nach 7 Tagen wurden die Adhäsionen quantitativ und qualitativ durch Laparotomie gescored.
1.4.1 HIF 1α
Das Experiment wurde in HIF 1α+/+ und HIF 1α+/- (50% Swiss, 50% 129) Mäusen durchgeführt. In HIF 1α+/+ Mäusen nahm die Adhäsionsbildung mit der Zeitdauer des Pneumoperitoneums zu, wohingegen in HIF 1α+/- Mäusen eine geringfügige Reduktion der basalen Adhäsionen ohne weitere Zunahme nach dem Pneumoperitoneum zu finden war. In HIF 1α+/+ Mäusen nahm der Anteil von Adhäsionen von 12 ± 2% nach 10 Minuten (n = 5) auf 19 ± 4% nach 60 Minuten (n = 5) des Pneumoperitoneums zu. In HIF 1α+/- Mäusen war der Anteil der Adhäsionen nur 4 ± 0,2% nach 10 Minuten (n = 5) und 6 ± 4% nach 60 Minuten des Pneumoperitoneums (n = 5). Ähnliche Ergebnisse wurden für Umfang-, Typ-, Zähigkeits- und Gesamt-Adhäsionsscores beobachtet.
1.4.2 HIF 2α
Das Experiment wurde in HIF 2α+/+ und HIF 2α+/- (87,5% Swiss, 12,5% 129) Mäusen durchgeführt. In HIF 2α+/+ Mäusen nahm die Adhäsionsbildung mit der Zeitdauer des Pneumoperitoneums zu, wohingegen in HIF 2α+/- Mäusen eine Reduktion der Basal-Adhäsionen zu finden war, mit keiner weiteren Steigerung des Pneumoperitoneums. In HIF 2α+/+ Mäusen nahm der Anteil der Adhäsionen von 26 ± 7% nach 10 Minuten (n = 3) auf 36 ± 7% nach 60 Minuten (n = 3) des Pneumoperitoneums zu. In HIF 2α+/- Mäusen betrug der Anteil der Adhäsionen lediglich 9 ± 3% nach 10 Minuten (n = 5) und 14 ± 4,5% nach 60 Minuten (n = 5) des Pneumoperitoneums. Ähnliche Ergebnisse wurden für Umfang-, Typ-, Zähigkeits- und Gesamt-Adhäsionsscores beobachtet.
1.5. Einfluss von PIGF-Inhibitoren auf die Adhäsionsbildung
Eine Reihe von Experimenten wurden in Wildtyp- und Knockout-PIGF Mäusen in unserem laparoskopischen Maus-Modell durchgeführt. Die Adhäsionen wurden in Gebärmutterzipfeln und Beckenseitenwänden durch lineare monopolare und bipolare Läsionen von 10 Watt induziert. In allen Experimenten wurde das Pneumoperitoneum für 10 Minuten aufrechterhalten, um die basalen Adhäsionen auszuwerten und für 60 Minuten, um die durch Pneumoperitoneum vergrößerten Adhäsionen auszuwerten. Reines CO₂ bei 20 cm Wasser (15 mm Hg) Insufflationsdruck wurde angewendet. Nach 7 Tagen wurden die Adhäsionen quantitativ und qualitativ durch Laparotomie gescored.
Das Experiment wurde in PIGF+/+ und PIGF-/- (50% Swiss, 50% 129) Mäusen durchgeführt. In PIGF+/+ Mäusen nahm die Adhäsionsbildung mit der Zeitdauer des Pneumoperitoneums zu, wohingegen in PIGF-/- Mäusen eine geringe Reduktion der basalen Adhäsionen ohne weitere Zunahme nach dem Pneumoperitoneum zu finden war. In PIGF+/+ Mäusen nahm der Anteil der Adhäsionen von 7 ± 3 % nach 10 Minuten (n = 5) auf 26 ± 5% nach 60 Minuten (n = 5) des Pneumoperitoneums zu. In PIGF-/- Mäusen war der Anteil der Adhäsionen nur 5 ± 2% nach 10 Minuten (n = 5) und 3 ± 1% nach 60 Minuten des Pneumoperitoneums (n = 5). Ähnliche Ergebnisse wurden bezüglich des Umfangs, Typs, der Zähigkeit der Gesamt-Adhäsionsscores beobachtet.
1.5.1 Antikörper gegen PIGF
Das Experiment wurde in 100% Swiss Mäusen durchgeführt. Alle Tiere empfingen alle 2 Tage (Tage 0, 2, 4 und 6) eine intraperitoneale Injektion (20 μg/mg, gelöst in 200 μl) von einem der nachfolgenden Immunglobuline: Maus IgG (Gruppe I), Maus Anti-PIGF (nicht neutralisierend: PLGE1G11) (Gruppe II), Maus Anti-PIGF (neutralisierend: PL17A10F12) (Gruppe III), Maus Anti-PIGF (neutralisierend: PL5D11D4) (Gruppe IV) und Maus Anti-PIGF (neutralisierend: PLGH12G5) (Gruppe V). In den Gruppen I und II nahm der Anteil der Adhäsionen von 21 ± 3% (n = 5) und 16 ± 4% (n = 5) nach 10 Minuten auf 44 ± 7% (n = 5) und 39 ± 7% (n = 5) nach 60 Minuten Pneumoperitoneum jeweils zu. In Gruppe III wurde eine Reduktion der Basal-Adhäsionen ohne weitere Zunahme des Pneumoperitoneums gefunden. Der Anteil von Adhäsionen betrug 11 ± 3% nach 10 Minuten (n = 5) und 12 ± 5% nach 60 Minuten (n = 5) des Pneumoperitoneums. In Gruppe IV nahmen die Basal-Adhäsionen signifikant ab, jedoch wurde eine Steigerung des Pneumoperitoneums beobachtet. Der Anteil der Adhäsionen betrug 4 ± 2% nach 10 Minuten (n = 5) und 11 ± 4% nach 60 Minuten (n = 5) des Pneumoperitoneums. In Gruppe V ergaben sich keine signifikanten Unterschiede bei den Gruppen I und II. Der Anteil der Adhäsionen betrug 19 ± 4% nach 10 Minuten (n = 5) und 34 ± 7% nach 60 Minuten (n = 5) des Pneumoperitoneums. In allen Gruppen wurden ähnliche Ergebnisse für Umfang-, Typ-, Zähigkeits- und Total-Adhäsionsscores beobachtet.
2. Die Rolle des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors B in der Adhäsionsbildung
In der VEGF-B Studie wurde ein laparoskopisches Maus-Modell, das die Auswertung einer basalen Adhäsionsbildung und einer Pneumoperitoneum-erhöhten Adhäsionsbildung ermöglichte, angewendet. Wir erkennen, dass die so genannten "basalen Adhäsionen" sich nicht nur aus der peritonealen Läsion ergeben, die mit Elektroätzen zugefügt wurden, sondern auch aus dem Effekt des CO₂ Pneumoperitoneums, der vorlag, wenn auch nur für 10 Minuten. "Basal-Adhäsionen" ohne irgendeinen zusätzlichen Effekt des CO₂ Pneumoperitoneums erfordern die kürzestmögliche Zeitspanne, den minimalsten Insufflationsdruck und ungefähr 3% Sauerstoff, hinzugefügt zum CO₂ Pneumoperitoneum, weil die Adhäsionsbildung mit einer kürzeren Zeitdauer, niedrigerem Druck und unter Zusatz von Sauerstoff abnimmt (Ordonez JL, Dominguez J, Evrard V, Koninckx PR. The effect of training and duration of surgery on adhesion formation in the rabbit model. Hum Reprod 1997; 12: 2654-7 – Yesildaglar N, Koninckx PR. Adhesion formation in intubated rabbits increases with high insufflation pressure during endoscopic surgery. Hum Reprod 2000; 15: 687-91 – Molinas CR, Koninckx PR. Hypoxaemia induced by CO(2) or helium pneumoperitoneum is a cofactor in adhesion formation in rabbits. Hum Reprod 2000; 15: 1758-63 – Molinas CR, Mynbaev O, Pauwels A, Novak P, Koninckx PR. Peritoneal mesothelial hypoxia during pneumoperitoneum is a cofactor in adhesion formation in a laparoscopic mouse model. Fertil Steril 2001; 76: 560-7). In diesen Experimenten wurde für die Auswertung von basalen Adhäsionen das Pneumoperitoneum für die minimale Zeitspanne aufrechterhalten, die zur Durchführung der Läsionen erforderlich war (standardisiert auf 10 Minuten). Wir verwendeten jedoch 100% CO₂ bei 20 cm H₂O, weil ein niedrigerer Druck unter Zusatz von Sauerstoff, obwohl theoretisch besser, zusätzliche Variablen einführen würde, wie beispielsweise Druck und Sauerstoff. Beide Kontrollen durchzuführen war wegen der begrenzten Verfügbarkeit transgener Tiere nicht möglich.
In diesem Experiment wurden 20 100% C57BI/6J Wildtyp-Mäuse (VEGF-B^+/+) (weiblich, 10 bis 20 Wochen alte Tiere mit einem Gewicht 30 bis 40 Gramm) und transgene Mäuse, die bezüglich VEGF-B defizient waren (VEGF-B^-/-) verwendet. Als Kontrolle wurden 50 100% Swiss Wildtyp-Mäuse verwendet. VEGF-B^-/- und Wildtyp-Mäuse wurden vom Ludwig Institute for Cancer Research, Zweigstelle Stockholm, Schweden bezogen. Die transgenen Mäusen wurden wie von Aase K. et al. (2002) Circulation 104: 358-64 beschrieben, erzeugt. Die Tiere wurden unter Standardlaborbedingungen (Temperatur 20 °C bis 22 °C, relative Feuchtigkeit 50 bis 60%, 14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit) an den Tiereinrichtungen der KUL gehalten. Sie wurden mit Standardlabornahrung gefüttert (Muracon. G, Carsil Quality, Turnhout, Belgien), mit freiem Zugang zu Futter und Wasser zu jedem Zeitpunkt. Die Studie wurde durch das Institutional Review Animal Care Committee zugelassen.
2.1 Laparoskopischer chirurgischer Eingriff zur Induktion intraperitonealer Adhäsionen
Eine Laparoskopie und eine Induktion von Adhäsionen wurde wie beschrieben durchgeführt (Molinas CR, Mynbaev O, Pauwels A, Novak P, Koninckx PR. Peritoneal mesothelial hypoxia during pneumoperitoneum is a cofactor in adhesion formation in a laparoscopic mouse model. Fertil Steril 2001; 76: 560-7). Eine 3,5 mm Mittellinien-Inzision wurde caudal am Brustbein-Appendix durchgeführt, und ein 2 mm Endoskop mit einer 3,3 mm Außenhülle zur Insufflation (Karl Storz, Tüttlingen, Deutschland) wurde in die Bauchhöhle eingeführt. Das Endoskop an eine Videokamera (Karl Storz, Tüttlingen, Deutschland) und an eine Lichtquelle (Karl Storz, Tüttlingen, Deutschland) angeschlossen, wurde in einem Halter gesichert. Weil die Bauchdecke einer Maus sehr dünn ist, trat eine variable Gas-Leckage und somit ein variabler Strom durch den Bauch auf. Deswegen wurde der Einschnitt gasdicht um das Endoskop herum mit 6/0 Polypropylennähten verschlossen (Prolene, Ethicon, Johnson & Johnson International, Brüssel, Belgien). Für das Pneumoperitoneum wurde Gas durch den Hauptzugang mit dem Termoflator Plus (Karl Storz, Tüttlingen, Deutschland) unter Verwendung von erhitztem (37 °C; Optitherm, Karl Storz, Tüttlingen, Deutschland) und befeuchtetem (Aquapor, Dräger, Lübeck, Deutschland) CO₂ als Insufflationsgas insuffliert. Ein Insufflationsdruck von 17 mm Hg und eine Strömungsgeschwindigkeit von 1,5 Litern/min zusammen mit einem Wasserventil und einem elastischen Ballon wurden verwendet, um einen kontinuierlichen Insufflationsdruck von 20 cm H₂O (= 15 mm Hg) sicherzustellen. Das Wasserventil und der Ballon sind notwendig, um die Strömungsgeschwindigkeit an eine Maus anzupassen und die Druckveränderungen während der Insufflation zu dämpfen. Tatsächlich verflüchtigt sich das gesamte überschüssige CO₂ frei aus dem Wasserventil, wohingegen der Druck im Wasserventil genau aufrechterhalten wird und Druckveränderungen minimiert werden. Weil das Peritoneum eine große Oberfläche und eine hohe Austauscherkapazität aufweist, konnte theoretisch eine gewisse Menge Sauerstoff aus dem Kreislauf bzw. der Zirkulation der Bauchhöhle defundieren. Um kontinuierlich eine konstante 100%-ige CO₂ Konzentration in der Abdominalhöhle bzw. Bauchhöhle sicherzustellen, wurde das Gas kontinuierlich ersetzt. Dies wurde durch Einfügen einer 26-Gauge-Nadel (BD Plastipak, Becton, Dickinson, Madrid, Spanien) durch die Bauchdecke hindurch erreicht, wodurch sich eine kontinuierliche Strömung durch die Bauchhöhle von 10 ml/min bei 20 cm H₂O ergab. Nach der Etablierung des CO₂ Pneumoperitoneums wurden zwei 14-Gauge-Katheter (Insyte-W, Vialon, Becton Dickinson, Madrid, Spanien) unter laparoskopischer Sicht in sowohl rechte als auch linke Flanke für Arbeitsinstrumente eingefügt. Der Uterus wurde an der Mittellinie mit einem 1,5 mm Greifer ergriffen, und standardisierte 10 mm × 1,6 mm Läsionen wurden in der antimesenterischen Grenze sowohl des rechten als auch linken Uteruszipfels durch monopolare oder bipolare Koagulation durchgeführt (10 Watt, Standard-Koagulationsverfahren, 10 Sekunden) (Autocon 350, Karl Storz, Tüttlingen, Deutschland). Zusätzlich wurden identische Läsionen in den rechten und linken Beckenseitenwänden durchgeführt. Der Typ der Läsion in jeder Seite wurde zufallsbedingt bestimmt. Eine monopolare Koagulation wurde mit einer hausgemachten 1,6 mm Ball-Elektrode durchgeführt, wohingegen die bipolare Koagulation mit einer 1,6 mm Sonde (Bicap, Circon Corporation, Santa Barbara, CA, USA) durchgeführt wurde. Obwohl in allen vorherigen Experimenten monopolare Läsionen mehr Adhäsionen als bipolare Läsionen induzierten, wird das experimentelle Design zum Induzieren von Adhäsionen konstant gehalten, um einen Vergleich zwischen den Experimenten zu ermöglichen und eventuelle Differenzen des Mechanismus' der Adhäsionsbildung zwischen beiden Läsionen nachzuweisen. Um eine postoperative "Basal-Adhäsionsbildung" und "Pneumoperitoneum-verstärkte Adhäsionsbildung" auszuwerten, wurde das Pneumoperitoneum für die minimale Zeit aufrechterhalten, die notwendig ist, um die peritonealen Läsionen zu induzieren (standardisiert bei 10 Minuten) oder jeweils für eine längere Zeitspanne (60 Minuten). Die sekundären Öffnungen wurden nach Beendigung der peritonealen Läsionen entfernt, und die Einschnitte wurden geschlossen. Der erste Einschnitt wurde am Ende des chirurgischen Eingriffs geschlossen. Alle Einschnitte wurde in einer einzigen Schicht mit 6/0 Polypropylennähten (Prolene, Ethicon, Johnson & Johnson International, Brüssel, Belgien) verschlossen.
2.2 Experimentelles Design
Die Experimente wurden unter Verwendung einer Block-Randomisierung tagsüber durchgeführt. Deswegen wurde ein Block von Mäusen, der ein Tier jeder Gruppe umfasste, während desselben Tages operiert. Innerhalb eines Blocks der Tiere wurde in zufallsbedingter Reihenfolge operiert. Im Experiment (n = 20) wurden Basal-Adhäsionen und Pneumoperitoneum-verstärkte Adhäsionen in VEGF-B^+/+ Mäusen (n = 5 bzw. n = 5) und VEGF-B^-/- Mäusen (n = 5 bzw. n = 5) bestimmt.
2.3 Ergebnisse
Alle Tiere überlebten die chirurgischen Prozeduren, und alle von diesen waren für das Adhäsionsscoring nach 7 Tagen verfügbar. Die Adhäsionen bildeten sich nur zwischen dem verletzten viszeralen Ort und dem Beckenfett oder zwischen der verletzten Seitenwand und dem Beckenfett. Keine Adhäsionen wurden am Ort der laparoskopischen Öffnungen oder an anderen Orten beobachtet. In allen Experimenten induzierten monopolare Läsionen systematisch mehr Adhäsionen als bipolare Läsionen. Weil keine offensichtlichen Unterschiede in der Regulation der Adhäsionen im Anschluss an monopolare oder bipolare Läsionen beobachtet wurden, und um eine statistische Signifikanz zu maximieren, wurden nur die Mittel beider Läsionen in dieser Erfindung diskutiert. In VEGF-B Wildtyp-Mäusen erhöhte ein Pneumoperitoneum die Adhäsionsbildung (Anteil: P = 0,02; Typ: P = 0,04; total: P = 0,05). Im Vergleich mit VEGF-B Wildtyp-Mäusen waren Basal-Adhäsionen in VEGF-B^-/- Mäusen ähnlich. In VEGF-B^-/- Mäusen erhöhte ein Pneumoperitoneum eine Adhäsionsbildung nicht. Deswegen war im Vergleich mit VEGF-B Wildtyp-Mäusen die Pneumoperitoneum- verstärkten Adhäsionen offensichtlich in VEGF-B^-/- Mäusen niedriger (Anteil: P = 0,05; Typ: P = 0,03; gesamt: P = 0,05).
Diese Studie bestätigt unsere frühere Erkenntnis, dass das Pneumoperitoneum ein Co-Faktor in der Adhäsionsbildung ist, weil Pneumoperitoneum-verstärkte Adhäsionen in allen Wildtyp-Mäusen beobachtet wurden, die als Kontrolltiere verwendet wurden (Ordonez JL, Dominguez J, Evrard V, Koninckx PR. The effect of training and duration of surgery on adhesion formation in the rabbit model. Hum Reprod 1997; 12: 2654-7 – Yesildaglar NJ Koninckw PR. Adhesion formation in intubated rabbits increases with high insufflation pressure during endoscopic surgery. Hum Reprod 2000; 15: 687-91 – Molinas CR, Koninckx PR. Hypoxaemia induced by CO(2) or helium pneumoperitoneum is a cofactor in adhesion formation in rabbits. Hum Reprod 2000; 15: 1758-63 – Molinas CR, Mynbaev O, Pauwels A, Novak P, Koninckx PR. Peritoneal mesothelial hypoxia during pneumopentoneum is a cofactor in adhesion formation in a laparoscopic mouse model. Fertil Steril 2001; 76: 560-7). Nach unserem besten Wissen ist dies die erste Studie, die eine direkte Rolle von VEGF-B in der postoperativen Adhäsionsbildung demonstriert. Unsere Ergebnisse können erklärt werden, indem postuliert wird, dass ein Pneumoperitoneum eine Adhäsionsbildung zumindest teilweise durch eine Nach-Oben-Regulierung von VEGF-B verstärkt. In VEGF-B^-/- Mäusen waren Basal-Adhäsionen mit solchen Wildtyp-Mäusen vergleichbar, was nahe legt, dass VEGF-B keine Hauptrolle in der basalen Adhäsionsbildung spielt. In diesen VEGF-B^-/- Mäusen nahm die Adhäsionsbildung im Anschluss an 60 Minuten eines CO₂ Pneumoperitoneums nicht zu, was demonstriert, dass der Mechanismus von CO₂ Pneumoperitoneum-verstärkten Adhäsionen VEGF-B involviert, das offensichtlich in diesen Mäusen nicht oben reguliert werden kann.
3. Scoring von Adhäsionen
Ein Brustbein-Mittellinienschnitt und ein bilateraler subcostaler Schnitt wurden durchgeführt, und die gesamte Abdominalhöhle bzw. Bauchhöhle wurde unter Verwendung einer Laparotomie 7 Tage, nachdem die Induktion der Adhäsionen erfolgte, untersucht, wie beschrieben (Molinas CR, Mynbaev O, Pauwels A, Novak P, Koninckx PR. Peritoneal mesothelial hypoxia during pneumoperitoneum is a cofactor in adhesion formation in a laparoscopic mouse model. Fertil Steril 2001; 76: 560-7). Nach der Auswertung der Öffnungs-Orte und der Eingeweide wurde das Hüftfettgewebe sorgfältig entfernt, und die Adhäsionen wurden blind unter mikroskopischer Begutachtung unter Verwendung eines qualitativen und eines quantitativen Scoringsystems gescort. Im qualitativen Scoringsystem wurden die folgenden Eigenschaften überprüft (modifiziert von Leach) (Leach RE, Borns J W, Dawe EJ, SmithBarbour MD, Diamond MP. Reduction of postsurgical adhesion formation in the rabbit uterine horn model with use of hyaluronate/carboxymethylcellulose gel. Fertil Steril 1998; 69: 415-8): Umfang (0: keine Adhäsionen; 1: 1 bis 25%; 2: 26 bis 50%; 3: 51 bis 75%; 4: 76 bis 100% der verletzten involvierten Oberfläche), Typ (0: keine Adhäsionen; 1: filmförmig; 2: dicht; 3: Kapillaren vorhanden), Zähigkeit (0: keine Adhäsionen; 1: fallen im Wesentlichen ab; 2: erfordern ein Abziehen; 3: erfordern einen scharfen Schnitt) und total (Umfang + Typ + Zähigkeit). Zusätzlich wurde ein quantitatives Scoringsystem verwendet, wie von Holmdahl beschrieben (Holmdahl L, al Jabreen M, Risberg B. Experimental models for quantitative studies on adhesion formation in rats and rabbits. Eur Surg Res 1994; 26: 248-56). Dieses System weist den Vorteil auf, dass jegliche subjektive Interpretationen fehlen. Es misst den Anteil der Läsionen, das durch die Adhäsionen abgedeckt ist, unter Verwendung der folgenden Formel: Adhäsionen (%) = (Summe der Länge der individuellen Anlagerungen/Länge der Läsion) × 100. Die Ergebnisse liegen als Durchschnitt der Adhäsionen vor, die sich an vier individuellen Stellen gebildet haben (rechtes und linkes viszerales und seitliches Peritoneum mit Läsionen, die durch monopolare oder bipolare Koagulation zugefügt wurden), die individuell gescort werden.
4. Statistik
Eine statistische Analyse wurde mit dem SAS-System durchgeführt (SAS Institute, Cary, NC, USA) unter Verwendung des nicht-parametrischen Kruskal-Wallis-Tests zum Vergleichen individueller Gruppen und der Spearman-Korrelation zur Auswertung einer Assoziation. Alle Daten sind als Durchschnitt ± Standardabweichung angegeben.
5. Anästhesie
Nach der IM-Anästhesie mit Pentobarbital (Nembutal, Sanofi Sante Animale, Brüssel, Belgien; 0,07 mg/g) wurde der Bauch rasiert und das Tier am Tisch in Rückenlage befestigt. Eine endotracheale Intubation wurde mit einem 22-Gauge-Katheter (Insyte-W, Vialon, Becton Dickinson, Madrid, Spanien) durch Transillumination der Stimmbänder wie beschrieben durchgeführt (Molinas CR, Mynbaev O, Pauwels A, Novak P, Koninckx PR. Peritoneal mesothelial hypoxia during pneumoperitoneum is a cofactor in adhesion formation in a laparoscopic mouse model. Fertil Steril 2001; 76: 560-7). Der Katheter wurde an einen mechanischen Ventilator angeschlossen (Rodent Ventilator, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA), und das Tier wurde mit einem Atemzugvolumen von 500 μl und einer Respirationsrate von 85 Zügen/min ventiliert.
Sequenzprotokoll

Claims

Verwendung einer Verbindung, die die Expression und/oder Aktivität eines Plazenta-Wachstumsfaktors hemmt, zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer Adhäsionsbildung.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung aus der Liste ausgewählt ist, die aus einem Nukleotid, einem Antikörper, einem Ribozym, einem transdominanten Rezeptor, einem tetrameren Peptid besteht.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 2, wobei das Nukleotid eine Antisense-DNA oder RNA, siRNA oder ein RNA Aptamer ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, der spezifisch gegen P1GF oder ein antigen-bindendes Fragment hiervon gerichtet ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment humanisiert ist.