DE60309927T2

DE60309927T2 - Gen 2.2 dendritische zelllinien

Info

Publication number: DE60309927T2
Application number: DE60309927T
Authority: DE
Inventors: Joel Plumas; Laurence Dubonnet CHAPEROT
Original assignee: Etablissement Francais du Sang
Current assignee: Etablissement Francais du Sang
Priority date: 2002-12-16
Filing date: 2003-12-16
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2023-12-17
Also published as: CA2510596A1; FR2848565A1; EP1572989B1; DE60309927D1; US20050272151A1; WO2004061089A1; ATE346140T1; AU2003300629A1; FR2848565B1; CA2510596C; US7341870B2; EP1572989A1; AU2003300629B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft humane, plasmazytoide, dendritische Zellen (pDC), Verfahren, um diese zu erhalten sowie eine Kultur dieser Zellen. Die Erfindung betrifft ferner Verwendungen dieser Zellen und pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese humanen, plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) aufweisen.
Diese dendritischen Zellen sind Schlüsselakteure der Immunantwort: Sie sind verantwortlich für das Einfangen von Antigenen und deren Vorbereitung in Bezug auf ihre Präsentation an T-Lymphozyten. Aus dem Blut wurden verschiedene Vorläufer von dendritischen Zellen isoliert, die HLA-DR und CD4 bei Abwesenheit jedes anderen spezifischen Markers der Linie exprimieren. Von diesen Vorläufern sind die besser charakterisierten von myeloischem Ursprung, exprimieren die Moleküle CD11c, CD13 und CD33 und differenzieren sich (unter anderem) in Langerhans'sche Zellen; diese Zellen werden auch als DC1 bezeichnet. Ferner wurde eine andere Population von Vorläufern identifiziert, CD11c-, die durch eine sehr starke Expression des Rezeptors für IL3 (CD123) charakterisiert ist, die außerdem in der Lage ist unter Einwirkung von IL3 oder in Gegenwart eines Virus sich in reife dendritische Zellen zu differenzieren, die als DC2 oder plasmazytoide dendritische Zellen (pDC) bezeichnet werden.
Die pDC wurden in Mandeln im Jahre 1997 durch G. Grouard et al. im Detail (Grouard G. et al., J Exp. Med., 1997; 185: 1101–1111), ferner im Blut (O'Doherty U. et al., Immunology., 1994; 82: 487–493; Robinson SP. et al., Eur J Immunol., 1999; 29: 2769–2778), in den Ganglien (Cella M. et al., Nat Med., 1999; 5: 919–923) sowie dem Thymus identifiziert (Res PC. et al., Blood., 1999; 94: 2647–2657; Bendriss-Vermare N. et al., J Clin Invest., 2001; 107: 835–844). Diese Zellen sind durch ihre Morphologie vom plasmazytoiden Typus und durch ihren Phänotyp charakterisiert. Die pDC exprimieren die Moleküle CD4, HLA-DR und CD45RA, und weisen keine Marker vom myeloischen Typ CD11c und CD13 (Cella M. et al., Nat Med., 1999; 5: 919–923), oder Marker, die spezifisch sind für die Linien CD3, CD14 und CD19 auf, obwohl gelegentlich eine Expression von CD2, CD5 oder CD7 beobachtet worden ist (Cella M. et al., Nat Med., 1999; 5: 919–923; Res PC. et al., Blood., 1999; 94: 2647–2657). Vor kurzem konnte das Lectin BDCA2 identifiziert werden, das spezifisch von den pDC exprimiert wird; BDCA4 wird auf pDC gefunden, ist jedoch auch auf den DC-Derivaten der Monozyten vorhanden (Dzionek A. et al., J. Immunol., 2000; 165: 6037–6046 et Human Immunology, Band 63, 2002, Seiten 1133–1148). Ein Argument zu Gunsten der Zugehörigkeit dieser Zellen zur lymphoiden Linie ist deren Expression von mRNA, die für die Ketten preTalpha (Res PC. et al., Blood., 1999; 94: 2647–2657), Lambda-ähnliches 14.1 und SpiB (Bendriss-Vermare N. et al., J Clin Invest., 2001; 107: 835–844) kodieren. Diese Zellen exprimieren sehr stark den Rezeptor für IL-3 und schwach den Rezeptor für GM-CSF (Cella M. et al. Nat Med., 1999; 5: 919–923; Rissoan MC. et al., Science., 1999; 283: 1183–1186), wobei diese beiden Cytokine das Überleben der pDC begünstigen (Grouard G. et al., J Exp Med., 1997; 185: 1101–1111; Kohrgruber N. et al., J Immunol., 1999; 163: 3250–3259; Robinson SP. et al., Eur J Immunol., 1999; 29: 2769–2778), die andernfalls in vitro sehr schnell absterben. Die Moleküle zur Co-Stimulation CDF80 und CD86 sind nicht vorhanden oder werden schwach exprimiert (Grouard G. et al., J Exp Med., 1997; 185: 1101–1111), und im unreifen Stadium sind diese Zellen nicht in der Lage T-Lymphozyten zu aktivieren (Kohrgruber N. et al., J. Immunol., 1999; 163: 3250–3259). Andererseits reifen die pDC in Gegenwart von IL-3, von CD40L oder eines Virus, zeigen eine starke Expression der akzessorischen Moleküle zur Präsentation von Antigenen (CD40, CD80, CD86 und HLA-DR) und werden ebenso leistungsstark wie DC von myeloischem Ursprung, um die Proliferation von allogenen T-Zellen zu aktivieren (Kohrgruber N. et al., J. Immunol., 1999; 163: 3250–3259; Grabbe S. et al., Immunol Today., 2000; 21: 431–433; Kadowaki N. et al., J. Exp Med., 2000; 192: 219–226). Entsprechend dem Stimulus, der für deren Reifung verantwortlich ist (IL3 oder Virus), werden die pDC die Antwort von nativen T-Lymphozyten polarisieren, die sie mehr oder weniger stark in die Richtung eines Th1- oder Th2-Profils aktivieren (Rissoan MC. et al., Science., 1999; 283: 1183–1186; Cella M. et al., Nat Immunol., 2000; 1: 305–310; Kadowaki N. et al., J. Exp Med., 2000; 192: 219–226).
Ferner sind die pDC im unreifen Stadium verantwortlich für die Sekretion von IFN-alpha, das als Antwort auf Viren detektiert wurde (Cella M. et al., Nat Med., 1999; 5: 919–923; Siegal FP. et al., Science., 1999; 284: 1835–1837): Sie entsprechen den „inteferon producing cells", die in den 80er-Jahren beschrieben wurden. Außerdem sind sie in der Lage auf bakterielle DNA und auf Produkte von viralem Ursprung zu antworten, die sie erkennen, denn sie exprimieren die Moleküle TLR7 (Ito T. et al., J Exp Med., 2002; 195: 1507–1512) und TLR9 (Bauer S. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 2001; 98: 9237–9242). Die normalen pDC sind also an den Rand der angeborenen und adaptiven Immunantworten einzuordnen, und können eine sehr wichtige Rolle bei der Initiation der antiviralen Antworten einnehmen.
Die plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) eröffnen neue therapeutische Perspektiven, denn diese Zellen sind Schlüsselakteure der Immunantwort. Die dendritischen Zellen spielen folglich eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr gegenüber infektiösen Agenzien (Bakterien, Viren, Parasiten), bei der Immunabwehr gegen Krebs, bei allergischen Prozessen, bei Autoimmunantworten, bei der Induktion von Toleranz und in der Immunologie bei Transplantationen. Die dendritischen Zellen werden deshalb in verschiedenen therapeutischen Anwendungen eingesetzt. Hier ist insbesondere die Zelltherapie bei Krebs zu nennen (Fong L. und Engleman E., Annu. Rev. Immunol., 2000, 18: 245–273).
Ein Haupthindernis bei der Entwicklung von verschiedenen Anwendungen für plasmazytoide dendritische Zellen ist das Problem der Isolierung und der Reinigung von ausreichenden Mengen von Zellen. In der Tat repräsentieren die plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) beim Menschen weniger als 0,5 % der zirkulierenden Zellen, was ihre Isolierung ausgehend von peripherem Blut in großen Mengen sehr schwierig macht: Außerdem proliferieren die isolierten Zellen in vitro nicht und sterben in Kultur rasch ab. Deshalb steht momentan keine Linie von immortalisierten plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) zur Verfügung. Allein eine Linie von dendritischen Zellen von myeloischem und murinem Ursprung ist beschrieben worden (Winzler C. et al., J Exp Med., 1997; 185: 317–328).
Chaperot et al. (Chaperot L. et al., Blood., 2001; 97: 3210–3217) haben eine neue Leukämieentität identifiziert, die ein tumorales Äquivalent von plasmazytoiden dendritischen Zellen mit einschließt. Diese Zellen sind bei Untersuchungen an leukämischen Tumorzellen als CD4+ CD56+ identifiziert worden. In der Tat können diese Zellen nicht in eine der Kategorien von Leukämien klassifiziert werden, die bis dahin beschrieben wurden. Chaperot et al. (Chaperot L. et al., Blood., 2001; 97: 3210–3217) haben die Hypothese aufgebracht, dass diese Zellen zur Linie der pDC gehören könnten: In der Tat war der Phänotyp, der für Tumorzellen bekannt ist, abgesehen von CD56, mit jenem der pDC deckungsgleich, insbesondere: CD4+, CD11c-, HLA-DR+, CD123+, CD45RA+. In einer funktionellen Studie konnte gezeigt werden, dass, wie für normale pDC, IL3 und GM-CSF in vitro das Überleben der Tumorzellen begünstigt. Außerdem exprimieren diese Tumorzellen mRNA, die für die Ketten preTalpha und Lambda-ähnliches 14.1 kodieren, und in Gegenwart von Viren sind sie in der Lage Interferon alpha zu sekretieren. Ferner, wenn diese Tumorzellen in Gegenwart von IL3 kultiviert werden, durchlaufen sie eine deutliche Reifung, insbesondere verbunden mit einer sehr starken Erhöhung der Expression der Moleküle zur Co-Stimulation CD40, CD80, CD86, sowie dem Aufkommen von CD1a, CD1c und CD83. Diese Reifung wird von dem Erwerb der Fähigkeit begleitet, native T-Lymphozyten zu aktiveren, die dann auf ein Profil zur Produktion von Cytokinen vom Typus Th2 ausgerichtet werden. Die Identifizierung von leukämischen pDC bietet neue Perspektiven, was die phänotypische und funktionelle Charakterisierung von normalen pDC betrifft. In der Tat stellen sie eine Quelle von Zellen dar, die dieselben Eigenschaften aufweisen, wie normale pDC. Die Pathologie bleibt jedoch selten, 23 Patienten wurden identifiziert durch GEIL: „Groupe d'études immunologique des leucémies" (Feuillard J. et al., Blood., 2002; 99: 1556–1563), wobei das Sammeln von Zellen mit guter Qualität in großen Mengen sehr schwierig ist. Ferner vermehren sich die pDC-Zellen, die diesen Patienten entnommen werden, in vitro nicht auf natürliche Art und Weise, und Verfahren, um diese Zellen in vitro in Kultur zu bringen und zu kultivieren, sind nicht beschrieben worden.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren vorzuschlagen, mit dem in vitro eine Zelllinie von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen (pDC) isoliert werden kann. Für jede so erhaltene Zelllinie gibt es eine Vielzahl von Anwendungen, insbesondere im therapeutischen Bereich und in der fundamentalen Immunologie.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Linien von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen des Phänotyps CD4+, HLA-DR+, CD123+, CD45 RA+, CD11c- und CD13-, und ein Verfahren, um diese zu erhalten.
Der Begriff „Zelllinie" bezieht sich auf Säugetierzellen, die in vitro kultiviert werden. Die Primärkulturen von Säugetierzellen vermehren sich in Kultur nicht oder hören nach einer begrenzten Anzahl von Teilungen auf sich zu vermehren. Die Zelllinien gemäß der vorliegenden Erfindung sind in der Lage sich unbegrenzt zu vermehren, obwohl deren Primär- oder Sekundärkulturen von Säugetierzellen hierzu nicht in der Lage sind. Diese Eigenschaften der Linien von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen (pDC) gemäß der Erfindung, ermöglichen es auf vorteilhafte Art und Weise große Mengen von Zellen durch Vervielfältigung oder Proliferation dieser Zellen in vitro zu erhalten. Vorzugsweise werden die Zelllinien gemäß der Erfindung nach zumindest 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 und vorzugsweise nach zumindest 100 Zellteilungen isoliert.
Die Linien der plasmazytoiden, dendritischen Zellen, die gemäß der Erfindung erhalten werden, können also als immortal qualifiziert werden, da sich diese in vitro unbegrenzt vermehren.
Die sog. plasmazytoiden, dendritischen Zellen als solche sind dem Fachmann bekannt und lassen sich durch ihre morphologischen Eigenschaften und durch ihren Oberflächenphänotyp identifizieren. Diese morphologischen Eigenschaften betreffen ein ausgedehntes Zytoplasma, das reich an endoplasmatischem Retikulum und deshalb basophil ist sowie einen Kern aufweist, der vom Zentrum entfernt angeordnet ist, wodurch eine Ähnlichkeit mit Plasmozyten gegeben ist (Siegal, Science, 1999, 284: 1835–1837, Grouard G. et al., J Exp Med., 1997). Diese Linien von plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) sind ferner durch ihren spezifischen Oberflächenphänotyp charakterisiert und insbesondere durch Rezeptoren/Antigene, die auf der Oberfläche dieser Zellen exprimiert werden. So ist die Unterscheidung der verschiedenen Klassen von Zellen des Immunsystems in Abhängigkeit der Rezeptoren/Antigene (zelluläre Marker), die auf der Oberfläche der Zellen exprimiert werden, eine Technik, die in der Literatur umfassend beschrieben ist. Diese Analysen des Oberflächenphänotyps werden üblicherweise mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Die humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen exprimieren so insbesondere die Antigene CD4, HLA-DR, CD123 und CD45RA. Sie weisen keine Marker CD11c und CD13 auf, die den myeloischen, dendritischen Zellen eigen sind. Diese Methoden zur Identifizierung von Zellen, die diesen Phänotyp aufweisen, werden insbesondere beschrieben von Cella M. et al., (Nat Med., 1999; 5: 919–923).
Unter „plasmazytoiden dendritischen Zellen" werden Zellen verstanden, die die erforderlichen morphologischen Eigenschaften und einen Phänotyp CD4+, HLA-DR+, CD123+, CD45RA+, CD11c- und CD13- aufweisen.
Die plasmazytoiden dendritischen Zellen exprimieren auf charakteristische Art und Weise die zellulären Marker BDCA2 und BDCA4. Die Zellen haben folglich den Phänotyp BDCA2+ und BDCA4+.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren, um eine Linie von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen in vitro zu isolieren, das folgende Schritte aufweist:

a) Kultivierung von adhärenten Stromazellen;
b) In-Kultur-Bringen von leukämischen Tumorzellen eines Patienten, der an einer Leukämie von plasmazytoiden dendritischen Zellen erkrankt ist, auf den adhärenten Stromazellen in einem geeigneten Kultivierungsmedium, und
c) Vermehrung der Zellen durch sukzessive Zellteilungen auf den adhärenten Stromazellen in einem geeigneten Kultivierungsmedium, um eine Linie von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen zu erhalten.

Eine Leukämieentität, die ein tumorales Äquivalent von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen enthält, wurde beschrieben von Chaperot et al. (Blood, 2001; 97: 3210–3217). Vorzugsweise weisen die in Kultur gebrachten leukämischen Tumorzellen einen Phänotyp CD4+, HLA-DR +, CD123+, CD45 RA+, CD11c- und CD13- auf. Vorzugsweise weisen die Tumorzellen gleichermaßen den Phänotyp CD56+ auf. Der Phänotyp lässt sich gemäß Methoden bestimmen, die im Stand der Technik bekannt sind.
Vorzugsweise erfolgt die Isolierung der Linie durch In-Kultur-Bringen und Kultivierung auf den adhärenten Stromazellen der Mauslinie MS-5.
Vorzugsweise erfolgen die Schritte des In-Kultur-Bringens der leukämischen Tumorzellen und der Vermehrung der Zellen durch sukzessive Zellteilungen, um eine Linie von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen zu erhalten, in Gegenwart von Cytokinen, die die Proliferation und Amplifikation von humanen hämatopoetischen Zellen unterstützen.
In den Verfahren zur Isolierung einer Linie von plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) können gemäß der Erfindung verschiedene Cytokine verwendet werden, die die Proliferation und Amplifikation von Vorläufern und von humanen hämatopoetischen Zellen unterstützen. Die Mengen der Cytokine, die in den Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden können, entsprechen jenen, die üblicherweise für Zellkulturen in vitro eingesetzt werden.
Vorzugsweise erfolgt das In-Kultur-Bringen und die Vermehrung der Zellen in Gegenwart von zumindest einem Cytokin, das ausgewählt ist auf der Gruppe bestehend aus IL6, FLT3-L, SCF, IL3, IL7, G-CSF und GM-CSF. Weiter bevorzugt erfolgt das In-Kultur-Bringen und die Vermehrung der Zellen in Gegenwart von zumindest einem Cytokin, das ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend SCF und FLT3-Ligand.
Vorzugsweise werden die Zelllinien gemäß der Erfindung nach zumindest 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 und vorzugsweise nach zumindest 100 Zellteilungen etabliert und isoliert.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung weist das Verfahren, um in vitro eine Linie der humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen zu erhalten, einen zusätzlichen Schritt (d) der Klonierung der Linien der humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen auf, die in Schritt (c) erhalten wurden, um verschiedene Linien von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen oder „Klone" zu erhalten.
Unter „Klonieren einer Linie" wird die Vereinzelung von Zellen dieser Linie, das Kultivieren und die Vermehrung dieser vereinzelten Zellen verstanden, um Klone oder Linien der Zellen zu erhalten. Unter „Klon" wird eine Ansammlung von gene tisch identischen Zellen verstanden, die ausgehend von derselben Zelle erhalten wurden.
In einer besonderen Ausführungsform weist das Verfahren, um in vitro eine humane, plasmazytoide, dendritische Zelle zu isolieren, folglich einen zusätzlichen Schritt (e) des Selektierens dieser verschiedenen Linien oder Klone von plasmazytoiden, humanen, dendritischen Zellen auf, um die Klone zu identifizieren, die einen interessierenden Phänotyp zeigen. Gemäß einem Kriterium von Interesse kann es die Selektion von Varianten, die eine besondere Eigenschaft aufweisen, bspw. ermöglichen, die Rolle eines Moleküls zu untersuchen, das für die Funktion von pDC bestimmt ist.
Unter den verschiedenen Klonen, die ausgehend von der Vermehrung einer Zelle erhalten werden, werden so bspw. Klone von plasmazytoiden, humanen, dendritischen Zellen mit dem Phänotyp CD56+ oder CD56+ selektiert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine isolierte Zelllinie, die gemäß einem Verfahren der Erfindung erhalten werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Erfindung die humane, plasmazytoide, dendritische Zelllinie, die die Bezeichnung GEN2.2 trägt und am 24. September 2002 unter der Nummer CNCM I-2938 gemäß der Regel 6.1 des Budapester Vertrages bei der CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris) hinterlegt wurde, oder eine Linie von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen, die die Bezeichnung GEN 3 trägt und am 16. Oktober 2003 unter der Nummer CNCMI-3110 gemäß der Regel 6.1 des Budapester Vertrages hinterlegt wurde, zum Gegenstand.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung und Vermehrung einer Linie von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen, das die folgenden Schritte aufweist:

a) Kultivieren von adhärenten Stromazellen, und
b) Kultivieren der Linie von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen auf den adhärenten Stromazellen in einem geeigneten Kultivierungsmedium.

Die Linien von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen gemäß der Erfindung sind in der Lage sich unbegrenzt zu vermehren, wenn sie auf adhärenten Stromazellen kultiviert werden. Dem Fachmann sind verschiedene Linien von adhärenten Stromazellen bekannt.
Üblicherweise erfolgt die Kultivierung der Zellen in Flakons, Gefäßen und Kunststoffschalen, die gewöhnlich auf diesem Gebiet verwendet werden und die das Adhärieren der Zellen an einen festen Träger ermöglichen. Vorzugsweise sind die Flakons, Gefäße und Kunststoffschalen mit adhärenten Stromazellen „vorbeschichtet" oder vorplattiert.
In einer besonderen Ausführungsform werden die Stromazellen bis zur Konfluenz kultiviert.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform werden die Stromazellen anschließend bestrahlt, um deren Proliferation zu stoppen, bevor mit der Kultivierung der Linien von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen auf den Stromazellen begonnen wird.
Stromazellen sind dem Fachmann bekannt. Es handelt sich typischerweise um tierische oder menschliche Stromazellen, die aus dem Knochenmark oder anderen Organen stammen. Vorzugsweise werden adhärente Stromazellen verwendet, die in der Lage sind, die Proliferation von humanen Vorläuferzellen zu unterstützen.
Vorzugsweise sind die adhärenten Stromazellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Stromazellen S17, den Stromazellen AFT024, M2-10B4 (ATCC CRL1972), den Stromazellen HESS-5 und den Stromazellen MS-5 (Itoh et al., Exp. Hematol., 1989, 17: 143–147).
Vorzugsweise handelt es sich bei den adhärenten Stromazellen um adhärente Stromazellen der Mauslinie MS-5 (hinterlegt bei der DSMZ unter der Nr. ACC441).
Die Kultivierungsmedien, um die Linien von Säugetierzellen in vitro zu kultivieren, sind dem Fachmann wohl bekannt und werden von diesem gewöhnlich verwendet. Vorzugsweise werden übliche Kultivierungsmedien verwendet, wie bspw. RPMI 1640 Glutamax (GIBCO^TM), das ergänzt ist durch Natriumpyruvat, nichtessentielle Aminosäuren und nicht-ergänztes fötales Kälberserum.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren, um aktivierte, humane, plasmazytoide, dendritische Zellen in vitro zu erhalten, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte aufweist:

a) Bereitstellen einer isolierten Zelllinie gemäß der Erfindung;
b) Aktivieren der Zelllinie aus Schritt a), um aktivierte, humane, plasmazytoide, dendritische Zellen zu erhalten.

Vorzugsweise wird die Zelllinie durch ein Virus und/oder IL3 und/oder CD40 aktiviert.
Die Verfahren, um in vitro eine Linie von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen gemäß der Erfindung zu aktivieren, ermöglichen es, aktivierte oder reife, plasmazytoide, dendritische Zellen in großer Zahl zu erhalten. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf aktivierte oder reife, humane, plasmazytoide, dendritische Zellen, die ausgehend von Zelllinien gemäß der Erfindung erhalten wurden.
Verfahren zur Aktivierung von plasmazytoiden dendritischen Zellen sind dem Fachmann bekannt (Grouard G. et al. J Exp Med., 1997; Cella M. et al., Nat. Immunol., 2000; 1: 305–310). Die Aktivierung oder Reifung von Linien von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen wird folglich gemäß den üblichen Techniken durchgeführt. Im Gegensatz zu Verfahren aus dem Stand der Technik ermöglichen es die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung dank der Verwendung von Linien von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen gemäß der Erfindung eine große Zahl von aktivierten oder reifen Zellen zu erhalten.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung werden die Zelllinien durch ein umhülltes oder nacktes, einzelsträngiges oder doppelsträngiges, RNA-(bspw. HIV, HTLV, Influenza, Mumps, Masern, Denguefieber und Ebola), DNA-Virus (z.B. Adenovirus, HSV, CMV, EBV) oder deren Abkömmlinge (poly-IC), durch Bakterien (z.B. M. tuberculosis) oder deren Abkömmlinge (CpG ODN), durch Parasiten (bspw. Leishmanies) oder durch Pilze (bspw. Candida albicans) aktiviert.
Vorzugsweise erfolgt die Aktivierung in Gegenwart von zumindest einem Virus, das ausgewählt ist aus Influenza, HIV und HSV.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform werden die Linien von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen gemäß der Erfindung durch Stimuli von T-lymphozytärem Ursprung aktiviert, bei denen es sich um lösliche Faktoren handelt, wie den Cytokinen (z.B. IL3, GM-CSF oder IFNα) oder Liganden, die mit Oberflächenrezeptoren interagieren, wie die Proteine der TNF-Familie (z.B. CD40L oder Anti-CD40).
Vorzugsweise werden die Linien von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen gemäß der Erfindung durch IL3 und/oder CD40L aktiviert.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform werden die Linien von humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen gemäß der Erfindung durch IL3, CD40L und ein Virus aktiviert.
Beispielsweise wird die Aktivierung oder Reifung der Linien von plasmazytoiden dendritischen Zellen durch Zugabe des Virus, von IL3-CD40L oder von Virus-IL3-CD40L in das Kultivierungsmedium induziert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine aktivierte, humane, plasmazytoide, dendritische, isolierte Zelllinie, die gemäß jedem der zuvor beschriebenen Verfahren erhalten werden kann.
Die aktivierten oder reifen, humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen sind dem Fachmann bekannt und können gemäß üblicher Techniken identifiziert oder detektiert werden.
Typischerweise sekretieren die aktivierten oder reifen, humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen zumindest ein Molekül, das ausgewählt ist aus den proinflammatorischen Cytokinen (z.B. IL6, TNFα und IFNα), den Cytokinen, die die Immunantwort steuern (z.B. IL12 und IFNα), den Chemokinen (z.B. IL-8, RANTES, IP10, MIG, MDC, TARC, I309) und den antiviralen Cytokinen (z.B. IFNα).
Vorzugsweise sekretieren die aktivierten (oder reifen) humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen, die sich von den Zelllinien gemäß der Erfindung ableiten, zumindest ein Molekül, das ausgewählt ist aus IL12, TNF, IL6, IL8 und IFNα.
Üblicherweise sind die aktivierten oder reifen, humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen außerdem auf morphologischer Ebene durch zahlreiche Dendriten und durch ihren Phänotyp charakterisiert. Die Reifung oder Aktivierung der Zellen wird folglich von einer starken Erhöhung der Expression von HLA-Molekülen und Molekülen zur Co-Stimulation (z.B. CD40, CD80, CD83, CD86) sowie von Rezeptoren für Chemokine (z.B. CCR6 und CCR7) begleitet. Die Zellen sind dann in der Lage native T-Lymphozyten zu aktivieren (Grouard G. et al., J Exp Med., 1997, Cella M. et al., Nat. Immunol., 2000; 1: 305–310, Rissoan MC. et al., Science., 1999; 283: 1183–1186).
Vorzugsweise exprimieren die aktivierten (oder reifen) humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen, die sich von der Zelllinie gemäß der Erfindung ableiten, zumindest einen zellulären Marker, der ausgewählt ist aus HLA I, CD86, CD80, CCR6 und CCR7 und CD83.
Die Zellen, die aus der Aktivierung oder Reifung einer Zelllinie von plasmazytoiden dendritischen Zellen gemäß der Erfindung resultieren, weisen zumindest eine der Eigenschaften (Sekretion, Morphologie, Phänotyp, Fähigkeit zur Aktivierung von nativen T-Lymphozyten) von aktivierten oder reifen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen auf.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren, um in vitro T-Lymphozyten zu aktivieren, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte aufweist:

a) Bereitstellen einer isolierten Zelllinie gemäß der Erfindung;
b) Aktivieren der Zelllinie aus Schritt a), um aktivierte, humane, plasmazytoide, dendritische Zellen zu erhalten;
c) In-Kontakt-Bringen von T-Lymphozyten mit den aktivierten, humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen aus Schritt b).

Vorzugsweise wird die Zelllinie von plasmazytoiden dendritischen Zellen durch ein Virus, IL3 und/oder CD40 aktiviert.
Dieses Verfahren kann mit jeder biologischen Probe durchgeführt werden, die T-Lymphozyten enthält. Vorzugsweise handelt es sich um eine humane oder tierische biologische Probe. Bei der Probe handelt es sich vorzugsweise um eine Blutprobe und bei Anwendungen vom Typus Immuntherapie und Zelltherapie handelt es sich um autologes Blut.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren, um Verbindungen zu identifizieren, die humane, plasmazytoide, dendritische Zellen aktivieren, das folgende Schritte aufweist:

a) In-Kontakt-Bringen der Verbindung mit einer Linie von plasmazytoiden dendritischen Zellen gemäß der Erfindung;
b) Detektion der Aktivierung der Zelllinie.

Die Detektion der Aktivierung oder Reifung der humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen erfolgt gemäß üblichen Techniken, die dem Fachmann bekannt sind.
In einer Ausführungsform wird die Sekretion von zumindest einem Molekül detektiert, das ausgewählt ist aus den proinflammatorischen Cytokinen (z.B. IL6, TNFα und IFNα), den Cytokinen, die die Immunantwort steuern (z.B. IL12 und IFNα), den Chemokinen (z.B. IL-8, RANTES, IP10, MIG, MDC, TARC, I309) und den antiviralen Cytokinen (z.B. IFNα).
Vorzugsweise wird die Sekretion von zumindest einem Molekül detektiert, das ausgewählt ist aus IL12, TNF, IL6, IL8 und IFNα.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Erhöhung der Expression von HLA-Molekülen, Molekülen zur Co-Stimulierung (z.B. CD40, CD80, CD86), von CD83 und Rezeptoren für Chemokine (z.B. CCR6 und CCR7) detektiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zumindest eine Zelle einer Linie von plasmazytoiden dendritischen Zellen gemäß der Erfindung aufweist.
Die Linien von plasmazytoiden dendritischen Zellen gemäß der Erfindung zeigen im Bereich der antimikrobiellen und antitumoralen Immunantwort einen therapeutischen Nutzen.
Die Linien von plasmazytoiden dendritischen Zellen gemäß der Erfindung können in der Behandlung von verschiedenen Typen von Pathologien verwendet werden, insbesondere in der Behandlung von Pathologien, die mit infektiösen oder mikrobiellen Agenzien (Bakterien, Viren, Parasiten, Pilze), Krebs, Allergien oder Autoimmunkrankheiten verbunden sind.
Außerdem sind die plasmazytoiden dendritischen Zellen auf vorteilhafte Art und Weise in der Lage Tumor- oder mikrobielle Antigene in Systemen in vitro oder ex vivo derart zu präsentieren, dass eine Immunantwort induziert wird, die sich gegen Tumorzellen oder infizierte Zellen richtet.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf den Bereich der Zelltherapie und der antitumoralen Immuntherapie. Die plasmazytoiden dendritischen Zellen gemäß der Erfindung können folglich als Agens in der Immuntherapie verwendet werden.
Die Linien von dendritischen Zellen gemäß der Erfindung werden außerdem zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung und vorteilhafterweise zur Herstellung einer Zusammensetzung verwendet, die dazu geeignet ist, eine antitumorale Immunantwort zu begünstigen, um Krebs zu behandeln, oder eine antimikrobielle Antwort, um Infektionskrankheiten zu behandeln.
Durch die nachfolgenden Beispiele und Figuren werden einige Vorteile und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung verdeutlicht.
Beschreibung der Figuren
1 Proliferation der Linie GEN2.2
Nach den ersten 35 Tagen der Kultivierung stellt sich ein gleichmäßiger Proliferationsrythmus ein.
Jede Woche werden 0,6 Millionen der Zellen GEN2.2 mit Zellen der Linie MS-5 co-ausplattiert, anschließend nach 3 Tagen verdünnt. Es werden zwei Zählungen pro Woche durchgeführt. Ausgehend von diesen Zählungen wird die theoretische kumulierte Zellzahl berechnet.
2: Klonierung der Linie GEN2.2
22 Unterklone der Linie GEN2.2, die durch Grenzverdünnung erhalten wurden, exprimieren variable Spiegel von CD56 und BDCA2 (Messung der mittleren Fluoreszenz oder des Prozentsatzes von positiven Zellen in der Durchflusszytometrie) (A). Zwischen den Spiegeln der Expression dieser beiden Marker besteht keine Korrelation. Unter diesen untersuchten Klonen war 1 Klon negativ hinsichtlich der Expression von CD56 (3B9), 16 waren heterogen (ex : 3A9), und 5 waren stark positiv (ex : 1B10)(B).
3 Reifung der Zellen der Linie GEN2.2
Die Zellen der Linie GEN2.2 wurden für 48 Std. in Gegenwart von IL3 + CD40L, von Influenzavirus oder drei Signalen in Kultur gegeben, anschließend erfolgte eine Phänotypisierung in der Durchflusszytometrie. Unter den drei Bedingungen wird eine deutliche Reifung der Zellen, die sich in einer Erhöhung der Expression von Molekülen ausdrückt, die mit Funktionen der Präsentation von Antigenen in Zusammenhang stehen (HLA I, CD40, CD80, CD86) (A), und weitere Modifikationen (Erhöhung von CCR6 und CCR7, Verringerung von CXCR4 und BDCA2) beobachtet (B).
4 Aktivierung und Th1/Th2-Polarisierung von nativen T-Lymphozyten
Nach 48 Std. der Kultivierung in Gegenwart von IL3 + CD40L, von Virus oder von drei Signalen, sind die Zellen der Linie GEN2.2 in der Lage, die Proliferation von nativen CD4+ T-Lymphozyten zu induzieren (A).
Die Proliferation wurde durch Inkorporation von Tritium-markiertem Thymidin für 18 Std. am Ende der 6-tägigen gemischten Kultivierung gemessen. Die während dieses MLR-Experimentes aktivierten T-Lymphozyten exprimieren CCR4, wenn diese durch voraktivierte GEN2.2-Zellen in Gegenwart von IL3 + CD40L aktiviert werden, während sie CCRS und CXCR3 exprimieren, wenn sie durch Zellen der voraktivierten GEN2.2-Linie in Gegenwart von Virus oder Virus + IL3 + CD40L aktiviert wurden (B). Die Überstände der gemischten Kultur und der reaktivierten T-Lymphozyten weisen am Ende der MLR durch PMA + Ionomycin mehr INFg auf, wenn die T-Zellen durch die Zellen der voraktivierten Linie GEN2.2 in Gegenwart von Virus oder Virus + IL3 + CD40L aktiviert wurden, während mehr IL4 oder IL5 gefunden wird, wenn die T-Zellen durch Zellen der voraktivierten Linie GEN2.2 in Gegenwart von IL3 + CD40L aktiviert wurden (Bestimmung durch die Technik CBA (Becton Dickinson) in der Zytometrie) (C). Die Detektion des prozentualen Anteils von Zellen, die INFg oder IL4 sekretieren, erfolgt nach der Aktivierung der T-Lymphozyten durch PMA + Ionomycin am Ende der MLR. Die fixierten und permeabilisierten Zellen werden mit Antikörpern markiert, die spezifisch für Cytokine sind, und passieren das Zytometer (D).
BEISPIELE
Bespiel 1: Herstellung einer humanen Linie von plasmazytoiden dendritischen Zellen
Die Leukämiezellen pDC wurden aus einer Probe aus peripherem Blut des Patienten GEN isoliert, wie zuvor beschrieben (Chaperot L. et al., Blood., 2001; 97: 3210–3217). Die isolierten mononukleären Zellen, die eingefroren wurden, enthielten mehr als 98 % Tumorzellen. Die adhärente Stromazelllinie aus der Maus MS-5 (Bennaceur-Griscelli A. et al., Blood., 1999; 94: 529–538; Issaad C. et al., Blood., 1993; 81: 2916–2924) wurde als „Feeder" verwendet. Fünf Millionen Tumorzellen wurden in einem Flakon in Kultur gebracht, der mit Zellen der Linie MS-5 bis zur Konfluenz vorbeschichtet war, und zwar in 5 ml Komplettmedium (RPMI 1640 Glutamax (Gibco), das mit 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml Pennicilin, 100 μg/ml Streptomycin, nicht-essentiellen Aminosäuren und 10 % nicht-ergänztem fötalem Kälberserum versetzt wurde. Während der ersten fünf Wochen der Kultivierung wurden SCF (Nishi N. et al., Exp Hematol., 1996; 24: 1312–1321) (Stammzellfaktor) und Flt3-Ligand (Pulendran B. et al., J Immunol., 2000; 165: 566–572; Blom B. et al. J Exp Med., 2000; 192: 1785–1796) hinzugegeben. Die Zellen wurden jede Woche gezählt und mit kaltem Medium verdünnt, das die Cytokine enthielt. In diesem Stadium der Kultivierung wurde eine regelmäßige Proliferation beobachtet, die während der vier darauffolgenden Wochen andauerte, 0,6 Millionen Zellen (die dann GEN2 genannt wurden), wurden jede Woche in einen neuen Flakon mit 0,6 Millionen Zellen MS-5 coausplattiert. Der SCF und Flt3-L wurden dann entfernt und die Linie proliferierte weiterhin auf zufriedenstellende Art und Weise auf der Unterschicht von MS-5; sie wurde dann als GEN2.2 bezeichnet. Diese Linie konnte für zumindest 5 Monate in Kultur gehalten werden (1). Die Verdoppelungszeit der Linie beträgt 1,1 Tage. Die Bestrahlung der Unterschicht aus MS-5 (60 Gy) ermöglicht es auf gleiche Art und Weise die Proliferation der Linie GEN2.2 zu unterstützen, indem die MS-S-Kontaminanten, die durch ihre Proliferation bestimmte Funktionsanalysen stören könnten, eliminiert werden. In Abwesenheit der MS-5 hören die Zellen GEN2.2 auf zu proliferieren und sterben ab.
Beispiel 2: Phänotypische und karyotypische Analyse der Linie GEN2.2
Der Phänotyp der Zellen der Linie GEN2.2 wird in der Durchflusszytometrie mit der Hilfe von Antikörpern bestimmt, die direkt mit FITC oder PE markiert waren.
Wie die normalen pDC werden die frischen Zellen der Linie GEN2.2 über deren Expression von CD4, HLA ABC, HLA-DR, CD45RA, CD123 (IL3-Ra), ILT-3, BDCA2 und BDCA4 charakterisiert (Tabelle 1). CD7 ist vorhanden und 50 % der Zellen exprimieren CD56, auch wenn die anderen Marker pan-T, B und NK nicht detektierbar sind (CD3, CD8, CD19, CD20, CD16, CD57). Die myeloischen Marker (CD13, CD11b, CD11c, CD14, CD64) sind negativ, auch wenn CD33 positiv ist. Was die Moleküle zur Co-Stimulation betrifft, exprimieren die GEN2.2-Zellen CD86, 27 % sind positiv für CD40, auch wenn CD80 abwesend ist. CD1a, CD1c und CD83 werden nicht detektiert. Die Rezeptoren von Chemokinen/Homing, wie bspw. CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CXCR5 und CLA werden nicht exprimiert, CCR6 und CCR7 werden auf 10 bis 15 % der Zellen gefunden. Mehr als 40 % der Zellen der Linie GEN2.2 exprimieren CXCR3, CXCR4 und CD62L. Tabelle 1: Phänotyp der Zellen GEN2.2
Unter den 11 analysierten Mitosen hatten 7 den folgenden Karyotyp, nämlich 49, XY, +6, t(6:8)(p21;q24), +r(12), +20, und 4 den folgenden Karyotyp, nämlich 49, idem, t(3;5)(q21;q21). Dieser Karyotyp ist identisch mit jenem von zwei Subklonen, die in den ursprünglichen Tumorzellen vorhanden sind (Patient UPN24) (Leroux D. et al. Blood., 2002; 99: 4154–4159).
Beispiel 3: Subklonierung der Linie GEN2.2
Eine Suspension der Zellen GEN2.2 wurde auf einer Unterschicht aus konfluenten MS-5 in Platten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden in 0,2 ml vollständigem Medium in Kultur gegeben. In zwei Platten (mit der Bezeichnung 1 und 2) wurden 0,3 Zellen pro Vertiefung und in einer Platte (mit der Bezeichnung 3) 1 Zelle pro Vertiefung ausplattiert. Nach 2 bis 5 Wochen der Kultivierung wurden die Zellen der Vertiefungen, bei denen Proliferation stattfand, in Platten mit 24 Vertiefungen, und anschließend in Kultivierungsflakons überführt, und zwar stets auf einer Unterschicht von MS-5.
In der Platte 3 fand in 19 von 96 Vertiefungen, und in den Platten 1 und 2 fand in 12 von 192 Vertiefungen Wachstum statt. 22 dieser Klone (10 von den Platten 1 und 2, und 12 von der Platte 3) wurden amplifiziert, phänotypisiert und eingefroren. 5 dieser Klone zeigten eine starke Expression für das Molekül CD56 (mehr als 99 % positive Zellen, mit einer MFI (mittlere Fluoreszenzintensität) > 1000); 1 Klon exprimierte kein CD56 (zumindest 10 % positive Zellen, MFI<10); 16 Klone zeigten eine heterogene Expression von CD56 (49 bis 98 % positive Zellen, 33<MFI<800) (2). Sämtliche Klone waren positiv für HLA-DR und CD4, und verhalten sich in Bezug auf das Wachstum genauso, wie die Linie GEN2.2.
Beispiel 4: Induktion der Reifung der Zellen GEN2.2 durch das Influenzavirus und/oder IL3 + CD40L
Die Zellen wurden in Komplettmedium in Abwesenheit von MS-5 bei 0,5 Millionen/ml kultiviert. Es wurden drei Kultivierungsbedingungen evaluiert:

„Virus" in Gegenwart des Influenzavirus (Stamm A/New Caledonia/20/99, von dem Untertyp H1N1, Aventis Pasteur, 137.10^–3μg Hämagglutinin/ml),
„IL3-CD40L", durch Zugabe von IL3 (10 ng/ml) und von löslichem rekombinanten CD40L (1 μg/ml, Alexis),
„Virus-IL3-CD40L".

Nach 48 Std. der Kultivierung wurden die Überstände eingefroren, um IFNα durch ELISA (Beckman Coulter) und IL1-β, IL2, IL4, IL5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IFN und TNF durch die Kits Th1/Th2 und die inflammatorischen Cytokine durch den „Cytometric Bead Array" (CBA, BD bioscience) zu bestimmen. Die Zellen wurden durch eine Phänotypisierung in der Zytometrie und die Ausstriche der Zytozentrifugation mit einer Färbung gegen MGG zurückgewonnen.
Wie in 3 gezeigt, reifen die Zellen der Linie GEN2.2, wenn diese in Gegenwart von IL3-CD40L, des Virus, oder der drei Signale in Kultur gebracht werden. Diese Reifung äußert sich in einer sehr deutlichen Erhöhung der Expressionsniveaus für die Moleküle HLA I, CD86 und CD80, die mit Funktionen der Präsentation von Antigenen assoziiert sind. Die Moleküle HLA-DR verstärken sich ebenfalls, jedoch in einem geringeren Maß. Die Expression von CD40 und CD83 wird besonders unter den beiden Bedingungen erhöht, unter denen das Virus vorhanden ist. Die Zellen GEN 2.2 erwerben ferner die Moleküle CD1a und CD1c, von denen bekannt ist, dass sie von DC des myeloischen Typs exprimiert werden. Außerdem verlieren sie BDCA2 unter sämtlichen Bedingungen, sowie CXCR4. Die Expression von BDCA2 ist in der Tat mit einem unreifen Stadium der DC assoziiert, was es ihnen ermöglicht, die Viren einzufangen (Dzionek A. et al., J Exp Med., 2001; 194: 1823–1834), und ist in die Regulation der Sekretion von IFNα verwickelt. Der Verlust von CXCR4, dessen Ligand SDF1 ist, ein Molekül, das in sekundären lymphoiden Organen vorhanden ist, könnte darauf hinweisen, dass die pDC nicht die gleichen Zirkulationswege verfolgen, wie die myeloischen DC, um wieder auf die Ganglien zu treffen, und in der Tat exprimieren die MDC im reifen Stadium kein CXCR4 (Sallusto F. et al., Eur J Immunol., 1998; 28: 2760–2769). Im Laufe ihrer Reifung erwerben die GEN2.2-Zellen das CCR7, welches ihnen ermöglichen könnte, in Richtung der sekundären lymphoiden Organe zu migrieren, wo sie den nativen T-Lymphozyten begegnen könnten, um diese zu aktivieren; diese Hochregulierung wird auch für DC vom myeloischen Ursprung beschrieben (Sallusto F. et al., Eur J Immunol., 1998; 28: 2760–2769). Bei dieser Umkehrung des Verhältnisses von CD45RA/RO, die bei der Reifung dieser Zellen beobachtet wird, sowie dem Erwerb von CCR6, handelt es sich um Daten, die noch nicht für normale pDC beschrieben wurden.
Die Überstände der Zellen, die durch das Virus aktiviert wurden, enthalten TNFα, IL6, IL8 und IFNα. Die Sekretion dieser Cytokine ist unter der Bedingung „IL3-CD40L" gleich Null oder sehr schwach, allerdings verdreifacht sich die Menge von detektiertem TNFα, IL6 und IL8 in Bezug auf die Bedingung „Virus", wenn die drei Signale angewendet werden (Tabelle 2), während IFNα unverändert bleibt oder leicht zurückgeht. Besonders interessant ist die Tatsache, dass unter der Bedingung „Virus-IL3-CD40L" IL12p70 vorhanden ist. Dieses Cytokin spielt eine sehr wichtige Rolle in der Aktivierung der Th1-Lymphozyten und in der Differenzierung der zytotoxischen T-Lymphozyten, die fundamental in dem Kampf gegen Viren sind. Die Produktion von IL12 durch normale pDC wurde von verschiedenen Autoren beschrieben (Cella M. et al., Nat med., 1999; 5: 919–923; Cella M. et al., Nat. Immunol., 2001; 1: 305–310; Krug A. et al., Eur J Immunol., 2001; 31: 3026–3037), während in zahlreichen anderen Studien eher deren Unfähigkeit, diese Cytokine zu produzieren, beschrieben wurde (Rissoan MC, et al., Science., 1999; 283: 1183–1186; Ito T. et al., J Exp Med., 2002; 195: 1507–1512; Gilliet M. und Liu YJ., J Exp Med., 2002; 195: 695–704; Kadowaki N. et al., J Exp Med., 2001; 194: 863–869; Bauer M. et al., J Immunol., 2001; 166: 5000–5007). Wir haben keine anderen Cytokine, die getestet wurden, in den Überständen dieser Zellen gefunden.
Beispiel 5: Th1/Th2-Polarisierung der nativen T-Lymphozyten
Die Zellen der Linie GEN2.2 wurden unter den drei Bedingungen voraktiviert, die in Beispiel 4 beschrieben sind, um ihre Kapazität, die Proliferation von nativen T-Lymphozyten zu stimulieren und deren Differenzierung in den Th1- oder Th2-Weg zu induzieren. Die nativen T-Lymphozyten CD4+ wurden ausgehend von mononukleären Zellen des Nabelschnurbluts durch eine immunmagnetische Technik (Stem Cell Technology) gereinigt. Um die Proliferation zu messen, wurden 25.000 native T-Lymphozyten pro Vertiefung durch 25.000, 10.000, 5.000, 1.000 und 250 Zellen der voraktivierten Linie GEN2.2 stimuliert. Die Inkorporation von Tritiummarkiertem Thymidin wurde am 6. Tag über die 18 letzten Stunden der Kultivierung gemessen. Zur Evaluierung der Th1/Th2-Polarisierung wurden 50.000 native T-Lymphozyten pro Vertiefung durch 10.000 Zellen der voraktivierten Linie GEN2.2 stimuliert. Nach 6 Tagen der Kultivierung wurden die Überstände der Kultur eingefroren, und die Zellen wurden zurückgewonnen und phänotypisiert (CCR4, CCRS, CXCR3), und wurden mit Phorbolmyristatacetat (PMA 5 ng/ml) + Ionomycin (0,5 μg/ml) für 4 Stunden oder 6 Std. in Gegenwart von Monensin (3 μM, Sigma) für die letzten 4 Stunden aktiviert. Es erfolgte eine Bestimmung von IL2, IL4, IL5, IL10, TNFα und IFNγ in den Überständen vor und nach der Aktivierung durch PMA + Ionomycin während 4 Std. mit dem Kit CBA Th1/Th2. Die durch PMA + Ionomycin für 6 Std. in Gegenwart des Sekretionsinhibitors aktivierten Zellen wurden fixiert (FACS Lysing, Solution, Becton Dickinson), anschließend permeabilisiert (FACS Permeabilizing Solution, Becton Dickinson). Die Gegenwart von Th1- oder Th2-Zellen wurde in der Zytometrie durch intrazytoplasmatische Markierung mit den Antikörpern Anti-IFNγ und Anti-IL4 detektiert.
Die stärkste Proliferation (25.000 cpm) von nativen CD4⁺-T-Zellen wird mit Zellen erhalten, die unter der Bedingung „Virus-IL3-CD40L" voraktiviert wurden, wobei die mit „IL3-CD40L" und „Virus" voraktivierten Zellen allerdings in der Lage sind, die Proliferation von nativen T-Zellen zu induzieren (10.000 cpm), was die APC-Potentiale des Typs dendritische Zelle von den Zellen der Linie GEN2.2 bestätigt (4A). In der Tat sind diese dendritischen Zellen allein in der Lage, wirksam native T-Zellen zu aktivieren. Die Polarisierung der Lymphozyten, die so in den Th1- oder Th2-Weg aktiviert wurden, wurde nach mehreren Kriterien evaluiert. Zunächst wird die Expression von CCR4, was als mit Th2 assoziiert beschrieben wurde, an der Oberfläche der durch die Zellen „IL3-CD40L" aktivierten T-Zellen stark erhöht, während die Expression von CCRS und CXCR3, die für Th1 beschrieben wird, auf den durch die „Virus"- und „Virus-IL3-CD40L"-Zellen stärker ist (Sallusto F. et al., Immunol Today., 1998; 19: 568–574) (4B). Die Analyse der Cytokine in den Kulturüberständen zeigt, dass IL5 und IL4 (Th2-Cytokine) unter solchen Bedingungen produziert werden, in denen die T-Zellen durch die „IL3-CD40L"- und „Virus-IL3-CD40L"-Zellen aktiviert werden, während IFNγ (Th1) besonders unter den Bedingungen „Virus" und „Virus-IL3-CD40L" detektiert wird. IL10 ist in jedem der Fälle wiedergefunden worden, was das Vorhandensein von regulierenden Lymphozyten suggerieren könnte (Levings MK. et al., J Exp Med., 2001; 193: 1295–1302; Dieckmann D. et al., J Exp Med., 2001; 193: 1303–1310) (4C). Die Detektion von intrazytoplasmatischen Cytokinen zeigt einen sehr großen prozentualen Anteil unter den T-Zellen, die durch die Zellen „Virus" und „Virus-IL3-CD40L" aktiviert wurden, einen sehr hohen prozentualen Anteil, und einen geringeren prozentualen Anteil der Zellen, die unter der Bedingung „Virus" IL4 produzieren (4D), was diese Ergebnisse bestätigen.
Diese Ergebnisse zeigen folglich eine bevorzugte Ausrichtung der durch die GEN2.2-Zellen „IL3-CD40L" aktivierten nativen T-Zellen in den Th2-Weg, während durch die „Virus"-Zellen eher ein Th1-Profil induziert wird, wie das für die normalen pDC beschrieben wird (Rissoan MC. et al., Science., 1999; 283: 1183–1186; Cella M. et al., Nat. Immunol., 2000; 1: 305–310; Kadowaki N. et al., J Exp Med., 2000; 192: 219–226). Die Bedingung „Virus-IL3-CD40L" induziert die stärkste Aktivierung der T-Lymphozyten, die eher auf ein Th1-Profil (CCR5+, CXCR3+, sehr starke Produktion von IFNγ) ausgerichtet werden, mit jedoch einer parallelen Th2-Differenzierung (Produktion von IL4 und IL5).
Beispiel 6: Zelllinie GEN 3
Die leukämischen pDC-Zellen wurden aus einer Probe aus peripherem Blut des Patienten GEN isoliert, wie zuvor beschrieben (Chaperot L. et al., Blood., 2001; 97: 3210–3217). Die isolierten mononukleären Zellen, die eingefroren wurden, enthielten mehr als 98 % Tumorzellen. Die adhärente Stromazelllinie aus der Maus MS-5 (Bennaceur-Griscelli A. et al., Blood., 1999; 94: 529–538; Issaad C. et al., Blood., 1993; 81: 2916–2924) wurde als „Feeder" verwendet; sie wurde bestrahlt mit 60 Gy verwendet. Eine Millionen Tumorzellen wurden in einem Flakon in Kultur gebracht, der mit 1 Millionen Zellen der Linie MS-5 vorbeschichtet war, und zwar in 5 ml Komplettmedium (RPMI 1640 Glutamax (Gibco), versetzt mit 1 mM Natriumpyruvat, 100 U/ml Pennicilin, 100 μg/ml Streptomycin, nicht-essentiellen Aminosäuren, und 10 % nicht-ergänztem fötalem Kälberserum). Die Zellen wurden jede Woche gezählt und mit frischem Medium verdünnt, und es wurde eine regelmäßige Proliferation erhalten. Diese Linie konnte für zumindest 3 Monate in Kultur gehalten werden. Die Linie ist bei der CNCM am 16.10.2003 unter der Nummer I-3110 hinterlegt worden.

Claims

Zelllinie, die aus immortalisierten, humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen besteht, die die Bezeichnung GEN 2.2 haben und am 24. September 2002 unter der Nummer CNCMI-2938 bei der CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris) hinterlegt wurden.
Zelllinie, die aus immortalisierten, humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen besteht, die die Bezeichnung GEN 3 haben und am 16. Oktober 2003 unter der Nummer CNCMI-3110 bei der CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75015 Paris) hinterlegt wurden.
Cozellkultur, die Zellen der Zelllinie gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2 und adhärente Stromazellen aufweist.
Verfahren, um aktivierte, humane, plasmazytoide dendritische Zellen in vitro zu erhalten, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte aufweist: a) Bereitstellen von Zellen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2; b) Aktivieren der Zellen aus Schritt a) durch Viren oder deren Abkömmlinge, durch Parasiten, durch Pilze und/oder durch Stimuli von T-lymphozytärem Ursprung, um aktivierte, humane, plasmazytoide, dendritische Zellen zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen durch ein Virus und/oder durch IL3 und/oder durch CD40 aktiviert werden.
Verfahren, um T-Lymphozyten in vitro zu aktivieren, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte aufweist: a) Bereitstellen von Zellen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2; b) Aktivieren der Zellen aus Schritt a) durch Viren oder deren Abkömmlinge, durch Bakterien oder deren Abkömmlinge, durch Parasiten, durch Pilze und/oder durch Stimuli von T-lymphozytärem Ursprung, um aktivierte, humane, plasmazytoide, dendritische Zellen zu erhalten; c) In-Kontakt-Bringen von T-Lymphozyten mit den aktivierten, humanen, plasmazytoiden, dendritischen Zellen aus Schritt b).
Verfahren, um T-Lymphozyten in vitro zu aktivieren, gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) die Zellen durch einen Virus und/oder durch IL2 und/oder durch CD40 aktiviert werden.
Verfahren, um Verbindungen zu identifizieren, die humane, plasmazytoide, dendritische Zellen aktivieren, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte aufweist: a) In-Kontakt-Bringen der Verbindung mit den Zellen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2; b) Detektion der Aktivierung der Zellen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass diese Zellen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2 aufweist.