DE60309482T2

DE60309482T2 - Polyethylenglykol-aldehydderivate

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Publication number: DE60309482T2
Application number: DE60309482T
Authority: DE
Inventors: Chee-Youb Livingston WON
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2002-07-24
Filing date: 2003-07-16
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2023-07-17
Also published as: BR0312863A; IL165920A0; JP4071238B2; RU2005105568A; KR20050025974A; DE60309482D1; UY27902A1; CA2493221C; MXPA05000799A; ES2274277T3; NO336974B1; JP2005533913A; WO2004013205A1; AU2003250971A1; KR100615753B1; GT200300154A; US7273909B2; PL214871B1; TW200416241A; NO20050019L

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Polyethylenglykolaldehyde und auf verwandte Verfahren zur Herstellung und Verwendung dieser Derivate, wie bei der Pegylierung von Polypeptiden und anderen Biomolekülen.
Polyethylenglykol („PEG") ist ein linearer oder verzweigter, neutraler Polyether, der in einer Vielzahl von Molekulargewichten erhältlich ist. Die Struktur von PEG ist HO-(CH₂-CH₂-O)_n-H, worin n die Anzahl an Wiederholungen der Ethylenoxideinheit in dem PEG angibt.
PEG und PEG-Derivate sind eingesetzt worden, um eine Vielzahl von Biomolekülen zu modifizieren. Wenn an solchen Molekülen angelagert, erhöht PEG ihre Löslichkeit und erhöht ihre Größe, aber hat wenig Einfluß auf die gewünschten Eigenschaften. Vorteilhafterweise können PEG-konjugierte Biomoleküle erhöhte Retention und verzögerten Stoffwechsel im Körper zeigen.
Eine Vielzahl von PEG-Derivaten ist für solche Anwendungen eingesetzt worden. Diese PEG-Derivate sind beispielsweise in US-Patent 5,252,714; US-Patent 5,672,662; US-Patent 5,959,265; US-Patent 5,990,237 und US-Patent 6,340,742 beschrieben.
Zwei allgemeine Ansätze sind zur Funktionalisierung von PEG verwendet worden: (1) Verändern der terminalen Hydroxylgruppe durch eine Reihe von Reaktionen zu einer aktiveren funktionellen Gruppe und/oder (2) Reaktion des PEG unter kontrollierten Bedingungen mit difunktionellen Verbindungen, so daß eine ihrer funktionellen Gruppen mit dem PEG-Polymer reagiert und die andere aktiv bleibt. In den meisten Fällen müssen mehrere Schritte durchgeführt werden, um die gewünschten PEG-Derivate zu erreichen. Die gewünschten PEG-Derivate werden oftmals in niedrigen Ausbeuten hergestellt und erfordern ein kompliziertes Reinigungsverfahren zur Isolation. Außerdem können PEG-Derivate nicht-spezifische Bindung an die Biomoleküle von Interesse zeigen, was zu mehrfachen PEGs führt, die an ein einziges Biomolekül binden, und/oder PEG-Anlagerung an der aktiven Stelle. Mehrfache PEG-Anlagerungen können Schwierigkeiten bei der Reinigung des pegylierten Biomoleküls hervorrufen. Mehrfache PEG-Anlagerungen und/oder Pegylierung an der aktiven Stelle können ebenso zu verringerter Aktivität des Biomoleküls führen.
Es würde deshalb vorteilhaft sein, verbesserte PEG-Derivate bereitzustellen, die zur Konjugation mit einer Vielzahl von anderen Molekülen, einschließlich Polypeptiden und anderen Biomolekülen, die eine α-Aminogruppe enthalten, geeignet sind. Es besteht Bedarf an PEG-Derivaten, die in hoher Ausbeute und Reinheit hergestellt werden und die konjugiert sein können, um Biomoleküle mit verbesserten Leistungsmerkmalen bereitzustellen.
Diese und andere Gegenstände der vorliegenden Erfindung werden nachstehend ausführlicher beschrieben.
Die Verbindungen der Erfindung sind Aldehydderivate von Polyethylenglykol mit der allgemeinen Formel (I): R₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-X-Y-NH-(CH₂)_p-CHO (I)worin R₁ Halogen, Epoxid, Maleimid, Orthopyridyldisulfid, Tosylat, Isocyanat, Hydrazinhydrat, Cyanursäurehalogenid, N-Succinimidyloxy, Sulfo-N-succinimidyloxy, 1-Benzotriazolyloxy, 1-Imidazolyloxy, p-Nitrophenyloxy und
ist,
X O oder NH ist, Y aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus
Z eine Seitenkette einer Aminosäure ist, m 1 bis 17 ist, n 10 bis 10.000 ist und p 1 bis 3 ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso eine Verbindung der Formel (II) bereit:
worin R₁, m, n und p wie oben definiert sind.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt eine bifunktionelle Polyethylenglykolaldehydverbindung der Formel (VIII) bereit:
worin m, n und p wie oben definiert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso Zwischenverbindungen der Formel (IX) bereit: R₁-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂-CH₂-X-Y-NH-(CH₂)_p-CH-(OCH₂-CH₃)₂ (IX),worin R₁, X, Y, Z, m, n und p wie oben definiert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Zwischenverbindungen der Formel (X) bereit:
worin R₁, m, n und p wie oben definiert sind.
Ebenso wird eine Zwischenverbindung der Formel (XI) bereitgestellt:
worin jedes m, n und p dasselbe oder verschieden ist und wie oben definiert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds bereit, umfassend das Hydrolysieren einer Verbindung der Formel (IX): R₁-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂CH₂-X-Y-NH-(CH₂)_p-CH-(OCH₂-CH₃)₂ (IX)zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds der Formel (I): R₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-X-Y-NH-(CH₂)_p-CHO (I),worin R₁, X, Y, Z, m, n und p wie oben definiert sind.
Wenn sich die vorliegende Erfindung auf eine „Methode zur Herstellung" bezieht, ist ein „Verfahren zur Herstellung" gemeint.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds bereit, umfassend das Hydrolysieren einer Verbindung der Formel (X):
zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds der Formel (II):
worin R₁, m, n und p wie oben definiert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds bereit, umfassend das Hydrolysieren einer Verbindung der Formel (XVII):
zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds der Formel (VIII):
worin m, n und p wie oben definiert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Vielzahl von Verbindungen und chemischen Zwischenprodukten und Verfahren bereit, die zusammen mit der Pegylierung von Polypeptiden und anderen Biomolekülen verwendet werden können. Die vorliegende Erfindung stellt eine neue chemische Struktur für Polyethylenglykolaldehyde bereit.
Die Verbindungen der Erfindung sind Aldehydderivate von Polyethylenglykol mit der allgemeinen Formel (I): R₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-X-Y-NH-(CH₂)_p-CHO (I),worin R₁ wie oben definiert ist, X O oder NH ist, Y aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus
Z eine Seitenkette einer Aminosäure ist, m 1 bis 17 ist, n 10 bis 10.000 ist und p 1 bis 3 ist.
R₁ ist eine funktionelle Gruppe, die mit einer anderen funktionellen Gruppe wie einem Amin und/oder Sulfhydryl in einem Peptid und/oder Protein reagieren kann. R₁ ist eine funktionelle Gruppe, die ohne weiteres mit elektrophilen oder nucleophilen Gruppen an anderen Molekülen reagieren kann, im Gegensatz zu den Gruppen, die starke Katalysatoren oder stark unpraktische Reaktionsbedingungen zur Reaktion benötigen. Der Polyethylenglykolaldehyd ist bifunktionell und kann daher mit zwei chemischen Einheiten kovalent binden.
R₁ ist ausgewählt aus Halogen, Epoxid, Maleimid, Orthopyridyldisulfid, Tosylat, Isocyanat, Hydrazinhydrat, Cyanursäurehalogenid, N-Succinimidyloxy, Sulfo-N-succinimidyloxy, 1-Benzotriazolyloxy, 1-Imidazolyloxy, p-Nitrophenyloxy und
Der Ausdruck „Halogen" bedeutet Fluor, Chlor, Brom oder Iod.
Eine bevorzugte allgemein reaktive R₁-Schutzgruppe ist
Die Verwendung dieser R₁-Gruppe führt zu einem Polyethylenglykolaldehyd mit Aldehydgruppen an beiden Enden des Polyethylenglykolaldehyds. Und folglich zeigt der resultierende Polyethylenglykolaldehyd Bindungseigenschaften an beiden Enden. Es ist jedoch selbstverständlich, daß diese bifunktionellen Verbindungen nicht perfekt symmetrisch sein müssen, und daß das erste m, n und/oder p dasselbe oder verschieden von dem zweiten m, n und/oder p in der Formel sein kann. Es ist jedoch bevorzugt, daß die Verbindung symmetrisch ist, was bedeutet, daß beide angegebenen m denselben Wert haben, beide n denselben Wert haben und beide p denselben Wert haben.
In den Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist X O oder NH. Bevorzugt ist X O. Außerdem ist Y ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
worin Z eine Seitenkette einer Aminosäure ist.
In der vorliegenden Erfindung ist m 1 bis 17. In einer bevorzugten Ausführungsform ist m 1 bis 14. Stärker bevorzugt ist m 1 bis 7 und noch stärker bevorzugt ist m 1 bis 4. Am stärksten bevorzugt ist m 1.
In dem Fall einer Y-Gruppe mit der allgemeinen Struktur:
zeigt die Y-Gruppe eine Verknüpfung mit der Aminosäure durch eine Peptidbindung. Folglich führt diese allgemeine Struktur zu speziellen so einfachen Strukturen wie:
wenn ein einzelnes Glycin als die Aminosäure verwendet wird. Wenn Z CH₃ ist, dann ist die Aminosäure Alanin. Wenn Z CH₂OH ist, ist die Aminosäure Serin.
Offensichtlich sind komplexere Strukturen möglich, wenn mehr und unterschiedliche Aminosäuren verwendet werden, wie aus einer Untersuchung der nachstehend gezeigten verschiedenen Aminosäurestrukturen zu erkennen ist. Bevorzugt wird nur eine Aminosäure verwendet.
In der vorliegenden Erfindung ist n 10 bis 10.000. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist n 20 bis 5.000. Bevorzugt ist n 50 bis 2.500, noch stärker bevorzugt ist n 75 bis 1.000. Am stärksten bevorzugt ist n 100 bis 750.
In der vorliegende Erfindung ist p 1 bis 3. Bevorzugt ist p 3.
Die vorliegende Erfindung umfaßt, ist aber nicht darauf beschränkt, Verbindungen der Formel I, die Verbindungen der folgenden Formeln II bis VI sind:
Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung fallen in die obige Gruppe A. Folglich stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel (II) bereit:
worin R₁, m, n und p wie oben definiert sind.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt eine bifunktionelle Polyethylenglykolaldehydverbindung der Formel (VIII) bereit:
worin m, n und p wie oben definiert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso eine Vielzahl an chemischen Zwischenprodukten bereit, die zu den oben beschriebenen erfindungsgemäßen Polyethylenglykolaldehydverbindungen umgewandelt werden können. Diese Zwischenprodukte umfassen Verbindungen der Formel (IX): R₁-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂CH₂-X-Y-NH-(CH₂)_p-CH-(OCH₂-CH₃)₂ (IX),worin R₁, X, Y, Z, m, n und p wie oben definiert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Zwischenverbindungen der Formel (X) bereit:
worin R₁, m, n und p wie oben definiert sind.
Es werden ebenso Zwischenverbindungen der Formel (XI) bereitgestellt:
worin jedes m, n und p dasselbe oder verschieden ist und wie oben definiert ist.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können durch jedes geeignete Verfahren unter Verwendung bekannter Reagenzien und Verfahren hergestellt werden. Jedoch stellt die vorliegende Erfindung ein spezielles Verfahren zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds bereit, umfassend das Hydrolysieren einer Verbindung der Formel (IX): R₁-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂CH₂-X-Y-NH-(CH₂)_p-CH-(OCH₂-CH₃)₂ (IX)zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds der Formel (I): R₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-X-Y-NH-(CH₂)_p-CHO (I),worin R₁, X, Y, Z, m, n und p wie oben definiert sind. Bevorzugt ist die Hydrolyse säurekatalysiert. Geeignete katalytische Säuren umfassen: Trifluoressigsäure, Salzsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und Salpetersäure. Bevorzugt ist die Säure Trifluoressigsäure.
Die Polyethylenglykolaldehydverbindungen der Formel (II) können ebenso durch jedes geeignete Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können jedoch Polyethylenglykolaldehyde der Formel (II) folgendermaßen hergestellt werden: Zunächst wird das Polyethylenglykol getrocknet. Dann wird das Polyethylenglykol mit einem halogenierten Derivat von Essigsäure umgesetzt. Das Hydrolysieren des resultierenden Reaktionsgemisches führt zu einer PEG-Carbonsäure. Alternativ kann das Produkt PEG-Carbonsäure ebenso von der direkten Oxidation des PEG nach dem Trocknungsschritt abgeleitet werden. Anschließend wird die PEG-Carbonsäure dann mit einem Aminderivat von Diethylacetal zur Herstellung eines PEG-Acetalamins behandelt, das mit einer halogenierten Carbonsäure zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds der Formel umgesetzt wird. Das Polyethylenglykolaldehydprodukt wird dann gesammelt und gereinigt.
Das Polyethylenglykolaldehydprodukt kann in jeder geeigneten Weise gesammelt und gereinigt werden. Beispielsweise kann das Polyethylenglykolaldehydprodukt mit Dichlormethan extrahiert werden. Die organische Schicht wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, konzentriert und mit Diethylether ausgefällt. Das Produkt, PEG-Aldehyd, wird durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds bereit, umfassend das Hydrolysieren einer Verbindung der Formel (X):
zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds der Formel (II):
worin R₁, m, n und p wie oben definiert sind.
Die Verbindung der Formel (X) kann durch Umsetzen einer Verbindung der Formel (XII): R₁-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-COOH (XII)mit einer Verbindung der Formel (XIII): H₂N-(CH₂)_p-CH-(OCH₂-CH₃)₂ (XIII)hergestellt werden.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung von PEG-Säure oder PEG-Carbonsäure ist die direkte Oxidation. In diesem Fall können Oxidationsmittel, wie CrO₃ oder K₂Cr₂O₇/H₂SO₄, HNO₃ in Gegenwart von Ammoniumvanadat oder Jone's Reagens (CrO₃ und H₂SO₄) verwendet werden.
Die Verbindung der Formel (XII) kann durch Hydrolysieren einer Verbindung der Formel (XIV) hergestellt werden: R₁-O-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-COOR₃ (XIV),worin R₃ ein verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₄-Alkyl ist.
Die Verbindung der Formel (XIV) kann durch Umsetzen einer Verbindung der Formel (XV): R₁-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂-CH₂-OH (XV)mit einer Verbindung der Formel (XVI): R₂-(CH₂)_m-COOR₃ (XVI),worin R₂ Halogen ist, hergestellt werden. Bevorzugt ist R₂ Brom oder Chlor. Geeignete Verbindungen der Formel (XVI) umfassen t-Butylbromacetat, Methylbromacetat, Ethylbromacetat, t-Butylchloracetat, Methylchloracetat und Ethylchloracetat. Andere Reagenzien, die für diesen Reaktionsschritt verwendet werden können, d. h. Ersatzverbindungen für Formel (XVI), sind beispielsweise t-Butylbromacetat, Methylbromacetat, Ethylbromacetat, t-Butylchloracetat, Methylchloracetat oder Ethylchloracetat in Gegenwart von Kalium-t-butoxid, einem Alkalimetallhydrid, wie Natriumhydrid oder Kaliumnaphthalid. Bevorzugt ist die Verbindung der Formel (XVI) t-Butylbromacetat.
Verbindungen der Formeln (III) bis (VI) (ebenso als Gruppen B bis E gekennzeichnet) können ebenso durch jedes geeignete Mittel hergestellt werden. Beispielsweise können jedoch die folgenden Reaktionsschemen zur Herstellung der Verbindungen der Formeln (III) bis (VI) (Gruppen B bis E) verwendet werden.
Was die oben erläuterten Polyethylenglykolaldehyde angeht, können die bifunktionellen Polyethylenglykolaldehyde durch jedes geeignete Mittel hergestellt werden. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds bereit, umfassend das Hydrolysieren einer Verbindung der Formel (XVII):
zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds der Formel (VIII):
worin m, n und p wie oben definiert sind.
Die Verbindung der Formel (VI) kann durch Umsetzen einer Verbindung der Formel (XVIII): HOOC-(CH₂)_m-O-CH₂CH₂-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-COOH (XVIII)mit einer Verbindung der Formel (XIX): H₂N-(CH₂)_p-CH-(OCH₂-CH₃)₂ (XIX)hergestellt werden.
Die Verbindung der Formel (XVIII) kann durch Hydrolysieren einer Verbindung der Formel (XX): R₃OOC-(CH₂)_m-CH₂CH₂-O-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-COOR₃ (XX),worin R₃ ein verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₄-Alkyl ist, hergestellt werden.
Die Verbindung der Formel (XX) kann durch Umsetzen einer Verbindung der Formel (XXI): HO-CH₂CH₂-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂CH₂-OH (XXI)mit einer Verbindung der Formel (XVI): R₂-(CH₂)_m-COOR₃ (XVI),worin R₂ Halogen ist, hergestellt werden.
Die oben erläuterten Polyethylenglykolaldehydzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um eine Vielzahl von Molekülen, einschließlich Biomolekülen, unter Verwendung jeglicher geeigneter Verfahren zu derivatisieren.
Die PEG-Aldehydverbindungen der vorliegenden Erfindung sind N-terminal-regiospezifisch für die Pegylierung von Peptiden und anderen Biomolekülen. Die PEG-Aldehyde der vorliegenden Erfindung bilden ein Konjugat mit der N-terminalen α-Aminogruppe des Biomoleküls oder Proteins, was eine stabile sekundäre Aminverknüpfung zwischen dem PEG und dem Biomolekül oder Protein bildet.
Biomoleküle, pegyliert mit den erfindungsgemäßen PEG-Aldehyden, zeigen Reproduzierbarkeit in der Anzahl und Lokation der PEG-Anlagerung, was zu einer Reinigungsstrategie führt, die weniger kompliziert ist. Diese regiospezifische Pegylierung kann zu einem Konjugat führen, wo die Peglyierungsstelle von der Stelle entfernt ist, wo das Biomolekül oder das Peptid an die Zellrezeptoren bindet, was ermöglicht, daß pegylierte Biomoleküle, Proteine oder Peptide viel ihrer oder ihre gesamte biologische(n) Aktivität beibehalten. Die PEG-Aldehyde der vorliegenden Erfindung können mit jeglichen Biomolekülen, die eine alpha-Aminogruppe (α-Aminogruppe) enthalten, umgesetzt werden.
In Abhängigkeit des ausgewählten Polyethylenglykolaldehyds kann das Polyethylenglykol kovalent an ein Biomolekül an einem Ende (monofunktionelles Polyethylenglykolaldehyd) oder an beiden Enden (bifunktionelles Polyethylenglykolaldehyd) gebunden sein.
Wie angegeben, können die erfindungsgemäßen Polyethylenglykolaldehyde zur N-terminalen regiospezifischen Pegylierung verwendet werden. Die regiospezifische N-terminale Verknüpfung führt zu pegylierten Polypeptiden, die das Vernetzen und mehrfache Derivatisierungen eines einzelnen Polypeptids vermeiden. Um diese regiospezifische kovalente Verknüpfung herzustellen, können jegliche geeigneten Reaktionsbedingungen verwendet werden. Im allgemeinen ist der pH des Reaktionsgemisches ausreichend sauer, um die α-Aminosäure des Polypeptids, das pegyliert werden soll, zu aktivieren. Typischerweise beträgt der pH etwa 5,5 bis etwa 7,4, bevorzugt etwa 6,5.
Folglich wird ein Verfahren zum Anlagern eines Polyethylenglykolmoleküls an ein Polypeptid, umfassend: das Umsetzen mindestens eines Polypeptids der Formel (XXII): NH₂B (XXII)mit einem Polyethylenglykolaldehydmolekül der Formel (I): R₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-X-Y-NH-(CH₂)_p-CHO (I),worin R₁, X, Y, Z, m, n und p wie oben definiert sind,
zur Herstellung einer Verbindung der Formel (XXIII): R₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-X-Y-NH-(CH₂)_p-NHB (XXIII),worin das Polyethylenglykolaldehydmolekül an die N-terminale Aminogruppe des Polypeptids gebunden ist, bereitgestellt.
Die Verbindungen der Formel (XXII) können jedes Polypeptid sein, einschließlich Interferon-alpha, Interferon-beta, Consensus-Interferon, Erythropoietin (EPO), Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor (GCSF), Granulozyten/Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Interleukine (einschließlich IL-2, IL-10 und IL-12) und Kolonie-stimulierender Faktor.
Die Verbindungen der Formel (XXII) können ebenso Immunoglobuline sein, wie IgG, IgE, IgM, IgA, IgD und Unterklassen davon, und Fragmente davon. Der Ausdruck „Antikörper" oder „Antikörperfragmente" bezieht sich auf polyklonale und monoklonale Antikörper, ein vollständiges Immunoglobulin oder Antikörper oder jedes funktionelle Fragment eines Immunglobinmoleküls, das an das Zielantigen bindet. Beispiele von solchen Antikörperfragementen umfassen Fv (fragmentvariabel), einkettiges Fv, complementary determining regions (CDRs), VL (Leichtketten-variable Region), VH (Schwerketten-variable Region), Fab (Fragmentantigenbindung), F(ab)2', und jede Kombination von diesen oder jeglichen anderen funktionellen Gruppe eines Immunglobinpeptids das an ein Zielantigen binden kann.
Wie angegeben, kann die pegylierte Verbindung in jeder gewünschten Weise hergestellt werden. Bedingungen, beispielsweise pH, sollten ausgewählt werden, die die regiospezifische Pegylierung von α-Aminogruppen favorisieren.
Im allgemeinen können Polypeptide mit Polyethylenglykolverbindungen der Erfindung durch Zugeben der Verbindung der Formel (XXII) und des PEG-Reagens in einem Molverhältnisbereich von 1:1 bis 1:100 pegyliert werden. Die Reaktionskonzentration kann dann in einem Borat-, Phosphat- oder Tripuffer bei Raumtemperatur oder 4 °C für etwa 0,5 bis 24 Stunden bei einem pH-Bereich von 5,5 bis 9,0 plaziert werden. Das Molverhältnis des PEG-Reagens zu Peptid/Proteinen beträgt im allgemeinen 1:1 bis 100:1. Die Konzentration von Peptid/Proteinen beträgt im allgemeinen 1 bis 10 mg/ml. Die Konzentration von Puffer beträgt normalerweise 10 bis 500 mM.
Die pegylierte Verbindung kann in jeder gewünschten Weise isoliert oder gereinigt werden. Beispielsweise kann das resultierende Reaktionsgemisch mit einem Äquilibrierungspuffer (20 mM Tris, pH 7,5) verdünnt werden, und das resultierende Gemisch wird dann auf eine Q-Sepharose-Säule aufgebracht. Nachdem das Gemisch auf die QA-Säule aufgebracht wurde, wurde sie mit dem Äquilibrierungspuffer gewaschen, eluiert mit 75 M NaCl; eluiert mit 200 mM NaCl; eluiert mit 1 M NaCl; und regeneriert mit 1 M HOAC + 1 M NaCl und 0,5 NaOH. Unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC ist es möglich, das N-terminale, monopegylierte Produkt von anderen Nebenprodukten in dem Gemisch abzutrennen und zu isolieren. Jedes gesammelte Produkt kann dann durch matrixbasierte Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeitmassenspektrometrie (MALDI-TOF) bestätigt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Pegylierungsverfahrens der Erfindung wird ein Polypeptid der Formel (XXII): NH₂B (XXII)mit einem Polyethylenglykolaldehydmolekül der Formel (II): R₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-CO-NH-(CH₂)_p-CHO (II),worin R₁, m, n und p wie oben definiert sind,
zur Herstellung einer Verbindung der Formel (XXIV): R₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-CO-NH-(CH₂)_p-NHB (XXIV),worin das Polyethylenglykolaldehydmolekül an die N-terminale Aminogruppe des Polypeptids gebunden ist, umgesetzt.
Zusätzliche Darstellungen der Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen werden in den gleichzeitig eingereichten US-Patent-Anmeldungen mit dem Titel „Pegylated T20 Polypeptide," US Serien-Nr. 60/398,195 eingereicht am 24. Juli 2002, und „Pegylated T1249 Polypeptide," US Serien-Nr. 60/398,190 eingereicht am 24. Juli 2002, und US Serien-Nr. 60/439,213 eingereicht am 10. Januar 2003, offenbart, die durch Verweis, wenn vollständig zitiert, aufgenommen werden.
Ferner wird ein Verfahren zum Anlagern eines Polyethylenglykolmoleküls an ein Polypeptid bereitgestellt, umfassend:
das Umsetzen eines Polypeptids der Formel (XXII): NH₂B (XXII)mit einem Polyethylenglykolaldehydmolekül der Formel (VIII):
worin jedes m, n und p dasselbe oder verschieden ist und wie oben definiert ist,
zur Herstellung einer Verbindung der Formel (XXV):
worin das Polyethylenglykolaldehydmolekül an die N-terminale Aminogruppe der Polypeptide gebunden ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist p 3, ist m 1 und ist n 100 bis 750; oder ist p 2, ist m 1 und ist n 100 bis 750; oder ist p 1, ist m 1 und ist n 100 bis 750.
Die pegylierten Polypeptide können in jeder gewünschten Weise verwendet werden. Geeigneterweise werden sie jedoch verwendet, um pharmazeutische Zusammensetzungen durch Beimischung eines pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoffes herzustellen. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Einheitsdosierungsform vorliegen. Sie können injizierbare Lösungen oder Suspensionen, transdermale Abgabevorrichtungen oder jede andere gewünschte Form sein.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung weiter darzustellen. Diese Beispiele sind nur illustrativ.
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung von PEG-Aldehydverbindungen
5 g PEG (Molekulargewicht von 1.000 bis 60.000 Dalton) in 50 bis 100 ml Toluol wurden durch Rückflußkochen für 1 bis 3 Stunden azeotrop getrocknet, gefolgt von der Entfernung von 20 bis 30 ml Toluol. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, dann wurde Kalium-tert-butoxid (1 bis 10 molarer Überschuß) in 20 bis 50 ml absolutem tert-Butanol und 20 bis 50 ml Toluol zu der PEG-Lösung zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde dann für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt.
Tert-Butylbromacetat (1 bis 10 molarer Überschuß) wurde zu der Reaktion über eine Spritze zugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur unter Argongas gerührt. In Abhängigkeit der gewünschten Größe der „m"-Gruppe, definiert in Formel (XVI), kann tert-Butylbromacetat durch ein anderes halogeniertes Derivat von Essigsäure, z.B. Propionsäure, Buttersäure usw., ersetzt werden.
Die Reaktionslösung wurde dann durch Rotationsverdampfung kondensiert und der Rest durch die Zugabe von Diethylether ausgefällt. Das ausgefällte Produkt, PEG-t-Butylcarboxyester, wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet.
PEG-t-Butylcarboxyester (4 g) wurde dann in 50 bis 100 ml 1N Natriumhydroxid gelöst und die Lösung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Der pH des Gemisches wurde auf 2,5 bis 3,0 durch die Zugabe von 1 bis 6N Salz säure eingestellt, und das Gemisch mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Schicht wurde dann über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, konzentriert und in Diethylether ausgefällt. Das Produkt, PEG-Carbonsäure, wurde durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet.
Die PEG-Carbonsäure (3 g) wurde dann in wasserfreiem Dichlormethan (20 bis 30 ml) gelöst, gefolgt von der Zugabe von 4-Aminobutyraldehyddiethylacetal (1 bis 5 molarer Überschuß), 1-Hydroxybenzotriazol (1 bis 5 molarer Überschuß) und Dicyclohexylcarbodiimid (1 bis 5 molarer Überschuß). In Abhängigkeit der gewünschten Größe der „p"-Gruppe, definiert in Formel (XIII), kann 4-Aminobutyraldehyddiethylacetal durch ein anderes Aminderivat von Diethylacetal, z.B. 3-Aminopropionaldehyddiethylacetal oder 2-Aminoacetalaldehyddiethylacetal, ersetzt werden.
Das resultierende Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Argongas gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, konzentriert und mit einem Gemisch aus 2-Propanol und Diethylether (1:1) ausgefällt. Das PEG-Acetalprodukt wurde im Vakuum über Nacht getrocknet.
Das PEG-Acetalprodukt wurde dann in 10 bis 200 ml 1 bis 90 % CF₃COOH gelöst, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Der pH des Gemisches wurde auf 6,0 durch die Zugabe von 1N NaOH-Lösung eingestellt und Natriumchlorid (10 Gew.-%) wurde dann zugegeben und der pH der Lösung wurde auf 7,0 durch die Zugabe von 1N NaOH eingestellt. Das Gemisch wurde dann mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, konzentriert und in Diethylether ausgefällt. Das Produkt, PEG-Aldehyd, wurde durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet.
Beispiel 2
Herstellung von mPEG_10K-Butanoaldehyd
Folgendes stellt ein allgemeines Reaktionsschema zur Herstellung von mPEG_10k-Butanoaldehyd dar:
Zunächst wurde Carboxymethyl-PEG (mPEG) mit einem Molekulargewicht von 10.000 Dalton (30,0 g, 3 mmol) in 300 ml Toluol durch Rückflußkochen für 2 Stunden azeotrop getrocknet, gefolgt von der Entfernung von 100 ml Toluol. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, dann wurden Kalium-tert-butoxid (0,68 g, 6 mmol) in 20 ml absolutem tert-Butanol und 20 ml Toluol zu der PEG-Lösung (1) zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt.
Tert-Butylbromacetat (1,00 ml, 6,75 mmol) wurde zu der Reaktion über eine Spritze zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann durch Rotationsverdampfung kondensiert. Der Rest wurde durch die Zugabe von Diethylether ausgefällt. Das ausgefällte Produkt wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 28 g. NMR (d₆-DMSO): 1,40 ppm (t, 9H, -CH₃); 3,21 ppm (s, -OCH₃); 3,50 ppm (s, -O-CH₂CH₂-O-); 3,96 ppm (s, 2H, -O-CH₂-COO-).
Anschließend wurde mPEG_10k-t-Butylcarboxymethylester (20 g) in 200 ml 1N Natriumhydroxid gelöst, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht (2) gerührt. Der pH des Gemisches wurde auf 2,5 durch die Zugabe von 6 N Salzsäure eingestellt, und das Gemisch wurde mit Dichlormethan (50 ml, 40 ml und 30 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, konzentriert und mit Diethylether ausgefällt. Das Produkt, mPEG_10k-Carboxymethylsäure, wurde durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet. Ausbeute: 18 g. NMR (d₆-DMSO): 3,21 ppm (s, -OCH₃); 3,5 ppm (s, -O-CH₂CH₂-O-); 3,99 ppm (s, 2H, -O-CH₂-COOH).
Die mPEG_10k-Carboxymethylsäure (3 g, 0,3 mmol) wurde in wasserfreiem Dichlormethan (20 ml) gelöst, gefolgt von der Zugabe von 4-Aminobutyraldehyddiethylacetal (50 mg, 0,3 mmol), 1-Hydroxybenzotriazol (40 mg, 0,3 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (80 mg, 0,39 mmol) (3). Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, konzentriert, und mit einem Gemisch aus 2-Propanol und Diethylether (1:1) ausgefällt. Das Produkt, mPEG_10k-Butanoacetal, wurde im Vakuum über Nacht getrocknet. Ausbeute: 2,7 g. NMR (d₆-DMSO): 1,07–1,12 ppm (t, 6H, (-O-CH₂-CH₃)₂); 1,46 ppm (m, 4H, -NHCH₂CH₂CH₂-CH-); 3,08–3,11 ppm (q, 2H, -NHCH₂CH₂CH₂-CH-); 3,21 ppm (s, -OCH₃); 3,5 ppm (s, -O-CH₂CH₂-O-); 3,85 ppm (s, 2H, -O-CH₂-CO-NH-); 4,44 ppm (t, 1H, -NHCH₂CH₂CH₂-CH-); 7,67 ppm (-NH-).
Schließlich wurde das mPEG_10k-Butanoacetal (5 g, 0,5 mmol) in 50 ml 10 % CF₃COOH gelöst, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur über Nacht (4) gerührt. Der pH des Gemisches wurde auf 6,0 durch die Zugabe von 1 N NaOH-Lösung eingestellt, und Natriumchlorid (10 Gew.-%) wurde zugegeben und dann wurde der pH der Lösung auf 7,0 durch die Zugabe von 1 N NaOH eingestellt. Das Gemisch wurde mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, konzentriert, und in Diethylether ausgefällt. Das Produkt, mPEG_10k-Butanoaldehyd (5), wurde durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet. Ausbeute: 4,1 g (82 %). NMR (d₆-DMSO): 3,21 ppm (s, -OCH₃); 3,5 ppm (s, -O-CH₂CH₂-O); 3,85 ppm (s, 2H, -O-CH₂-CO-NH-); 7,67 ppm (-NH-); 9,66 ppm (-CHO-).
Beispiel 3
Herstellung von mPEG_10k-Acetalaldehyd
mPEG_10k-Acetalaldehyd wurde durch Lösen von mPEG_10k-Diethylacetal (1 g, Mol.-Gew. 10.000), das gemäß der Verfahrensweise in Beispiel 1 hergestellt wurde, in 10 ml 80 % Trifluoressigsäure (Aldrich, 99+%) hergestellt. Die Reaktionslösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Argongas gerührt. 1N NaOH wurde dann tropfenweise zu der Reaktionslösung zugegeben, bis ein pH von 6,0 erhalten wurde. Anschließend wurde NaCl (10 Gew.-%) zu der obigen Lösung zugegeben. Der pH wurde dann auf 6,95 ± 0,05 durch Zugeben von 0,1 N NaOH eingestellt. Die Lösung wurde dann mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde dann über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, konzentriert und mit Diethylether ausgefällt. Das Produkt, mPEG_10k-Acetalaldehyd, wurde durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet. Ausbeute: 0,85 g (85 %).
Beispiel 4
Herstellung von mPEG_10k-Propionaldehyd
mPEG_10k-Propionaldehyd wurde durch Lösen von mPEG_10k-Propionacetal (2 g, Mol.-Gew. 10.000), das gemäß der Verfahrensweise in Beispiel 1 hergestellt wurde, in 20 ml 80 % Trifluoressigsäure (Aldrich, 99+%) hergestellt. Die Reaktionslösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Argongas gerührt. 1N NaOH wurde dann tropfenweise zu der Reaktionslösung zugegeben, bis ein pH von 6,0 erhalten wurde. Anschließend wurde NaCl (10 Gew.-%) zu der obigen Lösung zugegeben. Der pH wurde dann auf 6,95 ± 0,05 durch Zugeben von 1 N NaOH eingestellt. Die Lösung wurde dann mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde dann über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, konzentriert und mit Diethylether ausgefällt. Das Produkt, mPEG_10k-Propionaldehyd, wurde durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet. Ausbeute: 1,8 g (90 %).
Beispiel 5
Herstellung von PEG_20k-Di-butanoaldehyd
PEG_20k-Di-butanoaldehyd wurde durch Lösen von PEG_20k-Di-butyraldehyddiethylacetal (3,1 g, Mol.-Gew. 20.000), das gemäß der Verfahrensweise von Beispiel 1 hergestellt wurde, in 20 ml 80 % Trifluoressigsäure (Aldrich, 99+%) hergestellt. Die Reaktionslösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Argongas gerührt. 1N NaOH wurde dann tropfenweise zu der Reaktionslösung zugegeben, bis ein pH von 6,0 erhalten wurde. Anschließend wurde NaCl (10 Gew.-%) zu der obigen Lösung zugegeben. Der pH wurde dann auf 6,95 ± 0,05 durch Zugeben von 0,1 N NaOH eingestellt. Die Lösung wurde dann mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde dann über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, konzentriert und mit Diethylether ausgefällt. Das Produkt, PEG_20k-Di-butanoaldehyd, wurde durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet. Ausbeute: 2,5 g (81 %).
Beispiel 6
Herstellung von mPEG_20k-Butanoaldehyd
mPEG_20k-Butanoaldehyd wurde durch Lösen von mPEG_20k-Butyraldehyddiethylacetal (3,0 g, Mol.-Gew. 20.000), das gemäß der Verfahrensweise in Beispiel 1 hergestellt wurde, in 30 ml 80 % Trifluoressigsäure (Aldrich, 99+%) hergestellt. Die Reaktionslösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Argongas gerührt. 1N NaOH wurde dann tropfenweise zu der Reaktionslösung zugegeben, bis ein pH von 6,0 erhalten wurde. Anschließend wurde NaCl (10 Gew.-%) zu der obigen Lösung zugegeben. Der pH wurde dann auf 6,95 ± 0,05 durch Zugeben von 1 N NaOH eingestellt. Die Lösung wurde dann mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde dann über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, konzentriert und mit Diethylether ausgefällt. Das Produkt, mPEG_20k-Butanoaldehyd, wurde durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet. Ausbeute: 2,5 g (83,3 %).
Beispiel 7
Herstellung von mPEG_20k-Butanoaldehyd
mPEG_20k-Butanoaldehyd wurde durch Lösen von mPEG_20k-Butyraldehyddiethylacetal (14,7 g, Mol.-Gew. 20.000), das gemäß der Verfahrensweise in Beispiel 1 hergestellt wurde, in 200 ml 10 % Trifluoressigsäure (Aldrich, 99+%) hergestellt. Die Reaktionslösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Argongas gerührt. 1N NaOH wurde dann tropfenweise zu der Reaktionslösung zugegeben, bis ein pH von 6,0 erhalten wurde. Anschließend wurde NaCl (10 Gew.-%) zu der obigen Lösung zugegeben. Der pH wurde dann auf 6,95 ± 0,05 durch Zugeben von 0,1 N NaOH eingestellt. Die Lösung wurde dann mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde dann über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, konzentriert und mit Diethylether ausgefällt. Das Produkt, mPEG_20k-Butanoaldehyd, wurde durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet. Ausbeute: 13,1 g (89 %).

Claims

Verbindung der Formel (I): R₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-X-Y-NH-(CH₂)_p-CHO (I),worin R¹ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Halogen, Epoxid, Maleimid, Orthopyridyldisulfid, Tosylat, Isocyanat, Hydrazinhydrat, Cyanursäurehalogenid, N-Succinimidyloxy, Sulfo-N-succinimidyloxy, 1-Benzotriazolyloxy, 1-Imidazolyloxy, p-Nitrophenyloxy und
X O oder NH ist, Y aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus
Z eine Seitenkette einer Aminosäure ist, m 1 bis 17 ist, n 10 bis 10.000 ist, und p 1 bis 3 ist.
Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel (III)
Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel (IV):
Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel (V)
Verbindung nach Anspruch 1 mit der Formel (VI):
Verbindung der Formel (II):
worin R¹ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Halogen, Epoxid, Maleimid, Orthopyridyldisulfid, Tosylat, Isocyanat, Hydrazinhydrat, Cyanursäurehalogenid, N-Succinimidyloxy, Sulfo-N-succinimidyloxy, 1-Benzotriazolyloxy, 1-Imidazolyloxy, p-Nitrophenyloxy und
m 1 bis 17 ist, n 10 bis 10.000 ist und p 1 bis 3 ist.
Verbindung nach Anspruch 6, worin p 3 ist.
Verbindung der Formel (VIII)
worin m 1 bis 17 ist, n 10 bis 10.000 ist und p 1 bis 3 ist.
Verbindung der Formel (IX): R₁-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂-CH₂-X-Y-NH-(CH₂)_p-CH-(OCH₂-CH₃)₂ (IX), worin R¹ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Halogen, Epoxid, Maleimid, Orthopyridyldisulfid, Tosylat, Isocyanat, Hydrazinhydrat, Cyanursäurehalogenid, N-Succinimidyloxy, Sulfo-N-succinimidyloxy, 1-Benzotriazolyloxy, 1-Imidazolyloxy, p-Nitrophenyloxy und
X O oder NH ist, Y aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus
Z eine Seitenkette einer Aminosäure ist, m 1 bis 17 ist, n 10 bis 10.000 ist und p 1 bis 3 ist.
Verbindung der Formel (X)
worin R¹ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Halogen, Epoxid, Maleimid, Orthopyridyldisulfid, Tosylat, Isocyanat, Hydrazinhydrat, Cyanursäurehalogenid, N-Succinimidyloxy, Sulfo-N-succinimidyloxy, 1-Benzotriazolyloxy, 1-Imidazolyloxy, p-Nitrophenyloxy und
m 1 bis 17 ist, n 10 bis 10.000 ist und p 1 bis 3 ist.
Verbindung der Formel (XI):
worin m 1 bis 17 ist, n 10 bis 10.000 ist und p 1 bis 3 ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds, umfassend das Hydrolysieren einer Verbindung der Formel (IX) R₁-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂-CH₂-X-Y-NH-(CH₂)_p-CH-(OCH₂-CH₃)₂ (IX)zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds der Formel (I) R₁-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-X-Y-NH-(CH₂)_p-CHO (I),worin R¹ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Halogen, Epoxid, Maleimid, Orthopyridyldisulfid, Tosylat, Isocyanat, Hydrazinhydrat, Cyanursäurehalogenid, N-Succinimidyloxy, Sulfo-N-succinimidyloxy, 1-Benzotriazolyloxy, 1-Imidazolyloxy, p-Nitrophenyloxy und X O oder NH ist, Y aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus
Z eine Seitenkette einer Aminosäure ist, m 1 bis 17 ist, n 10 bis 10.000 ist und p 1 bis 3 ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds, umfassend das Hydrolysieren einer Verbindung der Formel (X):
zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds der Formel (II):
worin R¹ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Halogen, Epoxid, Maleimid, Orthopyridyldisulfid, Tosylat, Isocyanat, Hydrazinhydrat, Cyanursäurehalogenid, N-Succinimidyloxy, Sulfo-N-succinimidyloxy, 1-Benzotriazolyloxy, 1-Imidazolyloxy, p-Nitrophenyloxy und
m 1 bis 17 ist, n 1 0 bis 10.000 ist und p 1 bis 3 ist.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die Verbindung der Formel (X) durch Umsetzen einer Verbindung der Formel (XII) R₁-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-COOH (XII)mit einer Verbindung der Formel (XIII) H₂N-(CH₂)_p-CH-(OCH₂-CH₃)₂ (XIII)hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Verbindung der Formel (XII) durch das Hydrolysieren einer Verbindung der Formel (XIV) R₁-O-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-COOR₃ (XIV),worin R₃ ein verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₄-Alkyl ist, hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Verbindung der Formel (XIV) durch Umsetzen einer Verbindung der Formel (XV) R₁-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂-CH₂-OH (XV)mit einer Verbindung der Formel (XVI) R₂-(CH₂)_m-COOR₃ (XVI),worin R₂ Halogen ist, hergestellt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Polyethylenglykolaldehyds, umfassend das Hydrolysieren einer Verbindung der Formel (XVII)
zur Herstellung eines Polyethylenglykols der Formel (VIII)
worin m 1 bis 17 ist, n 10 bis 10.000 ist und p 1 bis 3 ist.
Verfahren nach Anspruch 17, worin die Verbindung der Formel (VIII) durch Umsetzen einer Verbindung der Formel (XVIII): HOOC-(CH₂)_m-O-CH₂CH₂-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-COOH (XVIII)mit einer Verbindung der Formel (XIX) H₂N-(CH₂)_p-CH-(OCH₂-CH₃)₂ (XIX)hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, worin die Verbindung der Formel (XVIII) durch Hydrolysieren einer Verbindung der Formel (XX): R₃OOC-(CH₂)_m-CH₂CH₂-O-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-COOR₃ (XX),worin R₃ ein verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₄-Alkyl ist, hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die Verbindung der Formel (XX) durch Umsetzen einer Verbindung der Formel (XXI) HO-CH₂CH₂-(CH₂-CH₂-O)_n-CH₂CH₂-OH (XXI)mit einer Verbindung der Formel (XVI) R₂-(CH₂)_m-COOR₃ (XVI),worin R₂ Halogen ist, hergestellt wird.