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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Analyse von biologischen
Proben und insbesondere auf eine solche Analyse, die ein Array von
Sonden verwendet. Ein Hauptziel der Erfindung ist es, eine schnellere
Probenanalyse unter Verwendung von kleineren Volumen von bisweilen
knappen Gewebeproben zu liefern.
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Viele
der Wunder der modernen medizinischen Wissenschaft können auf
Fortschritte bei der Analyse von Biomolekülen zurückgeführt werden. Insbesondere haben
Fortschritte bei der DNA-Analyse ermöglicht, dass das menschliche
Genom decodiert wurde, und bieten weiterhin die Aussicht auf Heilmittel
für eine
große
Bandbreite von Krankheiten. Eine Klasse von bioanalytischen Techniken
verwendet biologische Sonden, um sich selektiv an jeweilige Zielmoleküle in der
Probe zu binden. Verschiedene Techniken, die ein Fluoreszenzmarkieren
von Zielmolekülen
umfassen, können
verwendet werden, um das Vorhandensein von Zielmolekülen, die
an eine Sonde gebunden sind, und somit das Vorhandensein der entsprechenden
Komponente in der ursprünglichen
Probe zu erfassen. Außerdem
kann die Konzentration der Probenkomponenten in der ursprünglichen
Probe durch ein Messen der Anzahl oder Quantität von Zielmolekülen, die
sich an jeweilige Sonden gebunden haben, bestimmt werden.
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So
wirksam bioanalytische Techniken auch geworden sind, die langen
Zeitdauern, die damit verbunden sind, stellen eine Belastung für den medizinischen
Fortschritt dar und haben sich als ein Nachteil beim Diagnostizieren
von einzelnen Patienten erwiesen. Es ist oft nötig, auf Tausende von Probenkomponenten
zu testen, aber die Aussicht auf eine derartig große Anzahl
von langwierigen Analysen kann abschreckend sein. Ergebnisse können analysiert
werden, bevor Reaktionen abgeschlossen sind, jedoch nur auf Kosten
von Erfassungs- und Messempfindlichkeit, was oft kritisch ist.
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Außerdem stehen
Analysen oft begrenzten Probenmengen, die oft aus Gewebe gewonnen
werden, gegenüber,
was es schwieriger macht, große Anzahlen
von Tests durchzuführen,
selbst wenn Zeit und Ausrüstung
keine begrenzenden Faktoren sind.
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Sondenarrays
stellen einen beträchtlichen Fortschritt
dabei dar, es zu ermöglichen,
eine große Anzahl
von Analysen gleichzeitig bei einer kleinen Probenmenge durchzuführen. Ein
Sondenarray ist normalerweise ein zweidimensionales Array von Sonden,
die an eine Oberfläche
gebunden sind. Jede Sonde kann verwendet werden, um eine unterschiedliche
wirksame Probenkomponente quantitativ zu bestimmen, so dass viele
verschiedene Analysen gleichzeitig bei einer einzigen Probe durchgeführt werden
können.
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Bei
einem Deckglaslösungsansatz
werden 25–100
Mikroliter (μl)
einer flüssigen
Probe auf einem Glasobjektträger
platziert, der dann mit einem weiteren Glasobjektträger bedeckt
wird, der ein Sondenarray trägt.
Die Struktur wird durch die Viskosität und die Oberflächenspannung,
die der flüssigen
Probe zugeordnet sind, in Position gehalten. Bei dem Deckglaslösungsansatz
beabstandet die Probenflüssigkeit
selbst die Objektträger.
Dieser Lösungsansatz stellt
jedoch nicht sicher, dass die Objektträgeroberflächen parallel sind, so dass
Ungleichmäßigkeiten eingeführt werden
können.
Eine Alternative besteht darin, Hebegläser zu verwenden, bei denen
die Abdeckung Teflon-Stege um das Sondenarray aufweist. Die starren
Teflon-Stege halten die Parallelität der Basis und der Abdeckung
aufrecht, während
es dieselben beabstandet. Die zusammengesetzte Reaktionszelle kann
an den Seiten, vier Ecken oder einem Paar von sich diagonal gegenüberliegenden
Ecken offen sein, um zu erlauben, dass Blasen austreten.
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Wenn
sich die Probe in Kontakt mit dem Array befindet, bindet sich jede
Sonde mit entsprechenden Zielmolekülen in ihrer Nähe. Wenn
Zielmoleküle gebunden
werden, wird die Sondennähe
bezüglich des
Zielmoleküls
verarmt, was die Reaktionsgeschwindigkeit verlangsamt. Die Nähe wird
durch eine Diffusion von anderen Regionen der Probenflüssigkeit
nachgefüllt,
jedoch nur mit einer Geschwindigkeit von etwa 5 Millimetern (mm)
pro Tag. Bei gegebenen typischen Arrayabmessungen von 2 cm × 2 cm („cm" = „Zentimeter") kann es Tage dauern,
bevor sich ein Binden bei irgendeinem Maximum einpendelt.
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Ein
Mischen kann eine gleichmäßige Probenverteilung
aufrechterhalten, wodurch eine lokale Verarmung minimiert wird und
dadurch Reaktionsgeschwindigkeiten erhöht werden. Mischen ist jedoch bei
kleinen Volumen aufgrund von Oberflächenspannungseffekten problematisch.
Um ein Mischen zu erleichtern, kann eine Probe z. B. auf 500 μl verdünnt werden,
um einen größeren hydraulischen
Durchmesser zu erreichen, wodurch Oberflächenspannungseffekte verringert
werden. Bei einem derartigen Volumen kann ein Mischen durch eine
mechanische Handhabung, z. B. ein Rütteln, der Reaktionszelle erreicht
werden. Eine kommerzielle Hybridisiereinrichtung, die von Affymetrix
(Santa Clara, Kalifornien) hergestellt wird, verwendet ein aktives
Pumpen, um die Ziellösung
zu bewegen. Ein anderer Lösungsansatz
besteht darin, Luftstrahle zu verwenden, um die Probe in Bewegung
zu halten. Gummiabdichtungen können
zwischen einer Basis und einer Abdeckung verwendet werden, um die
Probe während
eines Bewegens in Position benachbart zu dem Array zu halten. Die
U.S.-Patente Nr. 6,361,486 und 6,309,875 für Gordon offenbaren die Verwendung
einer Zentrifuge, um die Effekte von Oberflächenspannung und Viskosität weiter
zu verringern, um ein turbulentes und somit gründlicheres Mischen zu fördern.
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Während ein
Mischen die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht, wird dieser Gewinn teilweise durch
eine niedrigere Reaktionsgeschwindigkeit ausgeglichen, die der verdünnteren
Probe zugeordnet ist. Als eine Alternative können 500 μl unverdünnte Probe verwendet werden.
Da jedoch die Probe oft aus Gewebe gewonnen wird, ist diese Probenmenge nicht
immer verfügbar.
Selbst wenn sie verfügbar
ist, ist es im Allgemeinen erwünscht,
weniger Probe für eine
gegebene Analyse zu verwenden.
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Die
Oberflächenspannung
kann durch ein Hinzufügen
eines oberflächenaktiven
Mittels verringert werden. Diese Technik ermöglicht, dass kleinere Probenvolumen,
z. B. 250 μl,
gemischt werden. Dieses Volumen ist jedoch immer noch größer, als
es in vielen Fällen
erwünscht
ist. Ein Hinzufügen
eines oberflächenaktiven
Mittels erreicht nicht immer eine zufriedenstellende Verringerung
der Oberflächenspannung.
Auch kann es sein, dass das oberflächenaktive Mittel nicht für alle Proben
und Puffer geeignet ist, die bei einer Analyse verwendet werden
können. Außerdem kann
das oberflächenaktive
Mittel die Sondenwechselwirkungen für einige Probenkomponenten
stören,
so dass es nicht immer durchführbar ist,
Volumenanforderungen unter Verwendung dieses Lösungsansatzes zu verringern.
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Einige
Mischtechniken sind vorgestellt oder vorgeschlagen worden, um ein
Mischen von kleineren Volumen zu ermöglichen. Elektrische Felder
können
mit der Eigenladung bei DNA verwendet werden, um Moleküle zu treiben
und die Probe in Bewegung zu halten. Nanogen, Inc., (San Diego,
Kalifornien) lehrt, dass ein derartiger Lösungsansatz zum Bewegen bei
kleinen Probenvolumen wirksam ist. Die beteiligten Ströme führen jedoch
eine elektrochemische Aktivität
ein, was unerwünschte
Elektrolyseprodukte, wie z. B. Säuren,
erzeugt. Ein weiteres Verfahren bewirkt Ultraschallwellen in dem
Arraysubstrat; dieser Lösungsansatz
hat sich jedoch nicht als kommerziell durchführbar erwiesen.
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Die
erfolgreichsten der Mischlösungsansätze haben
Reaktionszeiten auf etwa 17 Stunden verringert. Normalerweise werden
Reaktionen, die an einem Tag begonnen werden, am nächsten abgeschlossen.
Trotzdem sind Latenzzeiten über
Nacht zweifellos nicht erwünscht,
insbesondere während ein
Patient auf eine Diagnose wartet oder eine Reihe von Analy sen die
Ergebnisse einer Analyse benötigt, bevor
zu der nächsten übergegangen
wird. Weitere Verbesserungen der Reaktionsgeschwindigkeiten werden
für Sondenarrays
ohne ein Verringern der Empfindlichkeit benötigt.
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Die
vorliegende Erfindung liefert ein Bewirken einer Nachfüllbewegung
bei einer Probe, die in einer flachen Reaktionszelle enthalten ist,
die Ultraschwerkraftzentrifugalkräften unterworfen wird. Die
Reaktionszelle kann einen peripheren Steg aufweisen, der eine Basis
und eine Abdeckung beabstandet und auch eine Barriere liefert, um
zu verhindern, dass eine Probe aus der Reaktionszelle austritt, während dieselbe
während
eines Zentrifugierens reagiert. Der Steg kann eine geschlossene
Figur (und somit eine vollständige
Abdichtung) oder eine offene Figur (wodurch eine Öffnung zum
Einführen
und Evakuieren von Proben- und
Spülfluiden
geliefert wird) definieren, die ein Sondenarray umschließt. (Eine
offene Figur umschließt
ein Sondenarray, falls die geschlossene Figur, die durch die offene
Figur plus ein Liniensegment, das ihre Enden verbindet, definiert ist,
das Array umschließt.)
Die durchschnittliche Tiefe der Reaktionszelle bei dem Sondenarray
beträgt
weniger als 200 μm
und bevorzugt weniger als 50 μm oder
zumindest weniger als 100 μm.
Der Steg kann aus einem nachgiebigen Material bestehen, so dass derselbe
als eine vollständige
oder teilweise Abdichtung dienen kann, während sich derselbe unter Druck zwischen
der Basis und der Abdeckung befindet.
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Eine
Zentrifuge wird verwendet, um die Zentrifugalkräfte zu erzeugen, die 10 g überschreiten
(1 g ist gleich der Kraft der Schwerkraft der Erde an ihrer Oberfläche). Mit
Hilfe der Ultraschwerkraftzentrifugalkraft wird der Widerstand gegen
die Probenbewegung, der der Viskosität und Oberflächenspannung der
Probe zugeordnet ist, überwunden.
Insbesondere wird die Ultraschwerkraft verwendet, um die Probe gerade über dem
Array angeordnet, frei von Blasen und frei von „ausgelassenen" Bereichen zu halten, die
durch die Oberflächenspannung
und variierende Oberflächeneigenschaften
hervorgerufen werden, die bewirken, dass die Probe die Oberfläche nur
selektiv „benetzt". Somit macht es
die Ultraschwerkraft praktizierbar, eine Nachfüllbewegung bei kleinen Volumen,
z. B. 10–200
Mikroliter, zu bewirken. Die Nachfüllbewegung kann durch eine
Beliebige einer Vielzahl von Alternativen, z. B. durch ein Schütteln einer
Reaktionszelle während
eines Zentrifugierens, bewirkt werden.
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Der
Steg kann an der Basis oder an der Abdeckung gebildet sein oder
es kann sich dabei um ein getrenntes Element handeln. Die Basis
kann eine Wanne aufweisen, in die Probenflüssigkeit vor einem Zusammensetzen
der Reaktionszelle eingeführt wird.
Eine Zusammensetzung der Reaktionszelle umfasst ein Einbauen einer
Abdeckungsplatte, die normalerweise das Sondenarray trägt. Falls
der Steg offen ist, kann die Öffnung
zum Einführen
und/oder Entfernen einer Flüssigkeit,
z. B. einer Probenflüssigkeit
oder Spülflüssigkeit,
verwendet werden. Die zusammengesetzte Reaktionszelle kann zentrifugiert werden.
Ein Mischen kann während
des Zentrifugierens unter Verwendung einer Beliebigen einer Vielzahl
von Techniken bewirkt werden, einschließlich eines Schüttelns der
Reaktionszelle unter Verwendung einer zweiten Drehachse, die durch
die Zentrifuge bereitgestellt ist. Alternativ dazu können Zellkompression,
Ultraschall, elektrische Felder oder ein Pumpen verwendet werden,
um die Probenflüssigkeit
zusammen mit der Zentrifugiereng zu mischen.
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Im
Laufe der vorliegenden Erfindung wurde entdeckt, dass die möglichen
Reaktionsgeschwindigkeitsgewinne, die durch die verschiedenen Mischlösungsansätze erreicht
werden, in hohem Maße
durch die Verdünnung
der Probe (um die Probenflüssigkeit bei
normaler Schwerkraft „mischbar" zu machen) ausgeglichen
werden. Während
Lösungsansätze kleiner
Volumen gemäß dem Stand
der Technik durch die Abwesenheit oder die Unwirksamkeit eines Mischens
eingeschränkt
sind und während die Mischlösungsansätze gemäß dem Stand
der Technik dazu neigen, durch niedrige Konzentrationen oder Anforderungen
einer übermäßig großen Probenmenge
eingeschränkt
zu sein, liefert die vorliegende Erfindung ein rasches Erhalten
von starken Signalen unter Verwendung kleiner Probenmengen.
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Zusätzlich zu
einem Liefern stärkerer
Erfassungssignale in kürzeren
Zeiträumen
liefert die vorliegende Erfindung eine robustere Erfassung von schwach
exprimierten Probenkomponenten. Während sich freie Zielmoleküle an die
Sonden binden, werden gebundene Zielmoleküle in das Probenfluid freigegeben.
Die Freigebungsrate korreliert mit der Anzahl von Zielmolekülen, die
an die Sonde gebunden sind, und der lokalen Konzentration der Zielmoleküle in der
Probenflüssigkeit.
Wenn die Geschwindigkeit, mit der Zielmoleküle an eine Sonde gebunden werden,
gleich der Anzahl von Molekülen
ist, die von der Sonde freigegeben werden, befindet sich die Sonde
in einem Gleichgewicht, das eine maximale Signalstärke für diese
Probenkomponente darstellt. Relativ zu Sondenverfahren, die verdünntere Proben verwenden,
liefert die vorliegende Erfindung ein stärkeres Maximalsignal. Relativ
zu den Lösungsansätzen kleiner
Volumen gemäß dem Stand
der Technik ermöglicht
die Nachfüllbewegung
der Erfindung, dass eine maximale Signalstärke innerhalb von Stunden anstelle
von Tagen erreicht wird.
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Die
vorliegende Erfindung bemüht
sich nicht um das gründliche
turbulente Mischen, das in dem U.S.-Patent 6,309,875 für Gordon
offenbart ist. Stattdessen reicht ein laminarer Fluss kombiniert
mit einer vertikalen Diffusion bei der gegebenen Flachheit der Reaktionszelle
für ein
Nachfüllen
aus. Somit kombiniert die Erfindung die Vorteile einer hohen Konzentration
und eines Nachfüllens,
um die verbesserten Reaktionsgeschwindigkeiten zu liefern.
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Die
vorliegende Erfindung liefert allgemein höhere Reaktionsgeschwindigkeiten.
Die höheren Reaktionsgeschwindigkeiten
können
verwendet werden, um feste Signalstärken rascher zu erreichen oder
um stärkere
Signale innerhalb einer relativ kurzen Zeit zu erreichen. Außerdem liefert
die Erfindung eine größere Maximalempfindlichkeit,
als dieselbe durch die Mischlösungsansätze gemäß dem Stand der
Technik geliefert wird. Außerdem
werden die Verbesserungen der Empfindlichkeit und Geschwindigkeit
unter Verwendung von kleinen Probenvolumen erreicht, wobei sogar
Proben eines kleinen Volumens ausgenutzt werden. Schließlich erreicht
die Erfindung diese Ziele, während
die Probe in einem zusammenhängenden
blasenfreien Volumen über
dem Array gehalten wird. Diese und andere Merkmale und Vorteile
der Erfindung sind aus der folgenden Beschreibung unter Bezugnahme
auf die folgenden Zeichnungen ersichtlich.
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1 ist
eine schematische Darstellung eines bioanalytischen Systems gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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2 ist
ein Flussdiagramm eines Verfahrens der Erfindung, die unter Verwendung
des Systems von 1 praktiziert wird.
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3 ist
ein Graph, der die Leistung der vorliegenden Erfindung gegenüber zwei
alternativen Verfahren, die große
Reaktionszellen verwenden, vergleicht.
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4 ist
eine Photographie einer Probenverteilung in der Reaktionszelle von 1 in
Abwesenheit einer Zentrifugalkraft.
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Ein
bioanalytisches System AP1 weist eine Zentrifuge 100 und
drei Reaktionszellen 101, 102 und 103 auf,
wie es in 1 gezeigt ist. Die Zentrifuge 100 verwendet
einen Koaxialantrieb, um sowohl eine Zentrifugenbewegung als auch
eine Schüttelbewegung
zu liefern. Insbesondere weist die Zentrifuge eine innere Antriebswelle 111 auf,
die sich entlang der Achse einer hohlen äußeren Antriebswelle 113 erstreckt.
Ein jeweiliger Servomotor treibt jede Antriebswelle so an, dass
ihre Drehgeschwindigkeiten unabhängig gesteuert
werden können.
Die äußere Antriebswelle 113 ist
mit einem Zentrifugenrotor 115 gekoppelt, an dem Reaktionszellenbefestigungsplatten 117 schwenkbar
befestigt sind. Die innere Antriebswelle 111 ist starr
mit einem Getriebe 119 gekoppelt, das sich mit den Befestigungsplatten 117 in Eingriff
befindet; dementsprechend wird die Ausrichtung jeder Befestigungsplatte 117 relativ
zu einem Lokalzentrifugalkraftvektor C durch die Ausrichtung der
inneren Antriebswelle 111 bestimmt.
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Jede
Reaktionszelle 101, 102, 103 weist eine Basis 121, 122, 123,
eine Dichtung 131, 132, 133 und eine
Abdeckungsplatte 141, 142, 143 auf. Jede
Abdeckungsplatte 141, 142, 143 trägt ein jeweiliges
100 × 100-Probenarray 151, 152, 153 von
2 cm × 2
cm. Nach einer Zusammensetzung kann jede Reaktionszelle 101, 102, 103 ein
jeweiliges Probenfluid 161, 162, 163 halten.
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Die
Dichtungen 131, 132 und 133 werden durch
ein Spritzen eines Silikonmonomers direkt auf die jeweilige Basis
und dann ein Polymerisieren gebildet, um einen nachgiebigen Steg
zu liefern. Die Dichtungen bestimmen die Beabstandung der jeweiligen
Basis und Abdeckungsplatte für
eine zusammengesetzte Reaktionszelle. Die vorliegende Erfindung
erfordert, dass die durchschnittliche Beabstandung zwischen der
Basis und dem Objektträger über dem
Array weniger als 200 Mikrometer beträgt. Für die Reaktionszellen 101, 102 und 103 beträgt diese durchschnittliche „Tiefe" 25 Mikrometer. Das
ist eine Größenordnung
weniger als für
die meisten Reaktionszellen, die ein Mischen liefern. Die Tiefe
ist mit derjenigen vergleichbar, die unter Verwendung der Deckglas-
und Hebeglaslösungsansätze erreichbar ist.
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Zusätzlich zu
einem Einrichten der Reaktionszelltiefen sind die Dichtungen 131, 132 und 133 nachgiebig,
so dass dieselben unter Druck zwischen Basis und Abdeckung ihre
jeweiligen Reaktionskammern (das Innere der Reaktionszellen) gegenüber einem
Flüssigkeitsverlust
während
des Zentrifu gierens und Mischens abdichten. Hier ist ein Material „nachgiebig", falls dasselbe
weniger als 80a auf der Shore„A"-Skala aufweist (http://www.calce.umd.edu/general/Facilities/Hardness
ad .htm#3.5).
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Die
Dichtung 133 weist eine geschlossene Form auf und bildet
eine vollständige
Abdichtung für die
Reaktionszelle 103. Die Dichtungen 131 und 132 weisen
an einem Ende Öffnungen
auf, um ein praktischeres manuelles und automatisiertes Füllen und Reinigen
der Reaktionszellen 101 und 102 zu ermöglichen.
Während
einer Hybridisierung oder einer anderen Bindereaktion ist die Öffnung in
dem lokalen Ultraschwerkraftfeld im Allgemeinen „nach oben" ausgerichtet. Die Öffnung kann jedoch nach unten ausgerichtet
sein, um verarmte Probenflüssigkeit
abzuführen,
nachdem die Reaktion abgeschlossen ist. Ebenso kann dieselbe nach
unten ausgerichtet sein, um Waschfluid abzuführen.
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Ein
Verfahren M1 der Erfindung, das das bioanalytische System AP1 verwendet,
ist in 2 in einem Flussdiagramm gezeigt. Schritt ST1
umfasst ein Bilden einer Reaktionszelle, die eine Probenflüssigkeit
enthält.
Bei einer geschlossenen Reaktionszelle, wie z. B. Zelle 103,
kann ein Silikonmonomer auf die Basis gespritzt werden, um eine
geschlossene Figur zu bilden. Nachdem das Silikon gehärtet ist, um
eine Dichtung zu bilden, kann eine Probe auf die Basis eingeführt werden,
wie es bei Teilschritt SA1 angezeigt ist. Dann kann die Abdeckung
(mit dem Array) auf die Dichtung gesetzt werden. Diese Zusammensetzung
kann dann an der Zentrifuge befestigt werden. Alternativ dazu kann
ein Teil der Zusammensetzung mit der Basis auf der Zentrifuge erfolgen.
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Die
Verteilung der Probenflüssigkeit
vor dem Zentrifugieren ist in 3 gezeigt.
Es sei darauf hingewiesen, dass die Probenverteilung willkürlich und unzusammenhängend ist.
Bestimmte Regionen der Zelle werden durch die Probe nicht benetzt,
und Blasen sind in der Probenflüssigkeit
einge schlossen. Das Zentrifugieren entfernt die Blasen und treibt
die Probenflüssigkeit
in ein zusammenhängendes
Volumen, das gerade über
dem Array angeordnet ist.
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Die
vorhergehenden Schritte können
bei einer offenen Reaktionszelle, wie z. B. Zelle 101,
verwendet werden, die Teilschritte SA1 und SA2 können ebenfalls verwendet werden.
Eine offene Zelle kann jedoch, wie bei Teilschritt SB1, zusammengesetzt werden,
bevor eine Probenflüssigkeit,
z. B. durch ein Pipettieren durch die Zellöffnung, eingeführt wird,
wie bei Teilschritt SB2. Die offene Reaktionszelle ist für ein automatisiertes
Probeneinspritzen geeignet.
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Die
Reaktionszelle und die Probe werden dann zentrifugiert, so dass
das Probenfluid bei Ultraschwerkraft- (> 10 g) Bedingungen bei Schritt ST2 gemischt
wird. Zu diesem Zweck wird die Zentrifuge 100 mit einer
Geschwindigkeit gedreht, die ausreichend ist, um eine Kraft von
100 g auf die Probenflüssigkeit
zu bewirken. Das Mischen wird durch ein Schütteln der Reaktionszelle durch
ein Beschleunigen und Abbremsen der inneren Antriebswelle 111 relativ
zu der äußeren Antriebswelle 113 durchgeführt, während die
letztere den Zentrifugenrotor 115 antreibt. Dieses Mischen
und Zentrifugieren kann ein „ausreichendes" Reaktionsintervall
lang, z. B. 100 Minuten, fortgesetzt werden. Was ausreichend ist, hängt natürlich von
der Beschaffenheit der Probe ab.
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Eine
Zentrifugierung verhindert ein Problem beim herkömmlichen Mischen, dass sich
Blasen über Bereichen,
die entweder etwas hydrophob sind, oder Bereichen, die einfach austrocknen,
bilden. Wenn sich dieselben einmal gebildet haben, ist es schwierig,
dieselben zu entfernen, falls die Kammer dünn ist. Die Wahrscheinlichkeit
einer Blasenentfernung nimmt mit ihrem Auftrieb zu, nimmt jedoch
mit ihrer Fläche
in der Ebene der Kammer ab. Falls eine Kammer halb so dick gemacht
wird, weist eine Blase eines gegebenen Durchmessers in der Ebene
die gleiche Neigung zum Anhaften auf, da ihre Fläche die gleiche ist; dieselbe
weist jedoch nur den halben Auftrieb auf, wobei die Kraft dazu neigt,
dieselbe zu entfernen. Es ist ersichtlich, dass die Wahrscheinlichkeit,
dass eine Blase haftet, bei dünneren
Kammern umgekehrt proportional zu der Dicke einer Kammer zunimmt.
Das ist der Grund dafür,
warum die praktizierbare Grenze die Größenordnung von 250–500 Mikrometern
zum Mischen nur unter Verwendung von Schwerkraft aufweist. Wenn
die Kammer dünner ist,
ist es wahrscheinlich, dass sich Blasen bilden und an der Oberfläche haften,
wobei ein Mischen unter denselben oder sogar ein Zugang der Probe
zu dem Abschnitt des darunter liegenden Arrays nicht möglich ist.
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Wenn
die Reaktion abgeschlossen ist, kann das Array bei Schritt ST3 gewaschen
und getrocknet werden. Dabei kann es sich um einen einfachen Prozess
eines Entfernens der Abdeckung von der Reaktionszelle, eines Tauchens
derselben in einen Puffer und eines Ermöglichens, dass überschüssiger Puffer von
der Abdeckung abtropft, handeln. Eine offene Zelle kann jedoch während des
Zentrifugierens teilweise umgedreht werden, um eine verarmte Probenflüssigkeit
ohne eine Demontage aus der Zelle zu treiben. Außerdem kann ein Waschfluid
durch die Öffnung
eingeführt
werden, und eine Waschaktion kann durch ein Verwenden der inneren
Antriebswelle, um die Zelle in ihrer normalen „aufrechten" Ausrichtung zu schütteln, erreicht
werden. Dann kann die Zelle umgedreht werden, um das verwendete Waschfluid
zu entfernen. Der Waschzyklus kann so oft wie nötig wiederholt werden. Nachdem
die letzte Spülung
abgeführt
worden ist, kann das Zentrifugieren fortgesetzt werden, um das Array
zu trocknen.
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Nachdem
das Array ordnungsgemäß gewaschen
und getrocknet worden ist, kann dasselbe in einer Arrayabtastvorrichtung
gelesen werden. Zum Beispiel kann das Probenfluid Fluoreszenzmarkierungen
umfassen. Vorausgesetzt, dass sich eine ausreichende Anzahl von
Fluoreszenzzielmolekülen an
eine Sonde bindet, kann das Ziel erfasst werden. Diese Erfassung (oder
ihr Fehlen) kann für
alle 10.000 Sonden bei einer einzigen Abtastung durchgeführt werden.
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4 ist
ein Graph, der die Leistung der vorliegenden Erfindung, die die
flache Reaktionszelle verwendet, gegenüber zwei Beispielen zeigt,
die große
Reaktionszellen verwenden. Signalstärke wird in Zählwerten
gemessen, wobei 50 Zählwerte
etwa einem Farbstoffmolekül
entsprechen. Der Graph zeigt an, dass die Erfindung bei Verwendung
von 1/10 des Probenvolumens der Leistung eines System großer Zellen
gleichkommt. (Offensichtliche Unterschiede zwischen den Hochkonzentrationsfällen bei
dem Graphen von 4 werden als unerheblich betrachtet.)
Wenn die Erfindung die gleiche Probenmenge, jedoch mit zehn mal
höherer
Konzentration verwendet, liefert dieselbe eine größere Signalstärke in weniger
Zeit und eine größere Endsignalstärke. Diese Vorteile
können
ausgetauscht werden, so dass die Erfindung eine größere Empfindlichkeit
in weniger Zeit unter Verwendung von weniger Probe liefern kann.
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Die
vorliegende Erfindung liefert eine Vielzahl von Nachfüllbewegungen,
die bei einer Zentrifugierung zu verwenden sind. Obwohl die Erfindung
ein vollständiges
Mischen liefert, kann ein laminarer Fluss zusammen mit einer Diffusion
ausreichend sein und wird leichter erreicht. Die Nachfüllbewegung kann
durch ein Schütteln
(Hin- und Herkippen) der Reaktionszelle relativ zu der Zentrifugalkraft,
d. h. dem Ultraschwerkraftfeld, erreicht werden. Alternativ dazu
kann die Nachfüllbewegung
durch ein Biegen der Seiten der Reaktionszelle bewirkt werden. Dieses
Biegen kann ohne weiteres durch ein Steigern und Verringern der
Zentrifugendrehgeschwindigkeit erreicht werden. Eine nachgiebige
Basis kann verwendet werden, um Fluid aufzunehmen, das sich leicht
radial bewegt, wenn die Geschwindigkeit und die Zentrifugalkraft
variiert werden. Auch kann die Kompression mechanisch erreicht werden,
ohne die Zentrifugengeschwindigkeit zu variieren. Die Probe kann
in eine Wanne innerhalb der Reaktionszelle oder aus derselben heraus „gegossen" werden, indem die
Reaktionszelle in dem Ultraschwerkraftfeld neu ausgerichtet wird.
Schließlich
können
andere Mischtechniken, wie z. B. ein Verwenden von Schall, Ultraschall
oder Elektrophorese, um die Probe zu bewegen, in dem Kontext einer
Zentrifugierung verwendet werden. Obwohl ein gründliches Mischen nicht erforderlich
ist, kann eine beliebige Technik, von der bekannt ist, dass dieselbe
ein gründliches
Mischen erreicht, in dem vorliegenden Kontext ebenfalls angewendet
werden.
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Obwohl
die Erfindung für
eine bestimmte Reaktionszellengeometrie und eine spezifische Technik zum
Nachfüllen
beschrieben wurde, liefert dieselbe eine große Bandbreite von Reaktionszellengeometrien
und Nachfülltechniken.
Die Erfindung ist bei einer großen
Auswahl von Zielmolekülen
anwendbar, einschließlich
RNA, DNA, Peptide und Proteine. Außerdem kann eine Auswahl von
Zentrifugengeschwindigkeiten verwendet werden, um die Viskosität und die
Oberflächenspannungsformen
zu überwinden, die
ansonsten ein Mischen des geringen Volumens von Probenfluid verhindern
würden.
Das Nachfüllen kann
ein Schwenken oder Rütteln
der Kammer, während
Ultraschall oder oszillierenden elektrischen Feldern, oder Fluidpumpen
oder Luftstrahle umfassen. Diese und andere Variationen und Modifizierungen bei
den offenbarten Ausführungsbeispielen
werden durch die vorliegende Erfindung geliefert, deren Schutzbereich
durch die folgenden Ansprüche
definiert ist.