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Diese
Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen US-Anmeldung 60/362,163,
die am 5. März 2002
eingereicht wurde. Auf den Inhalt der früheren Anmeldung wird hiermit
ausdrücklich
Bezug genommen.
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Bereitgestellt
wird ein verbessertes und reproduzierbares Verfahren zur Herstellung
von ES-Mäusen aus
ingezüchteten
ES-Zellen, ohne eine chimäre
Maus als Zwischenstufe erzeugen zu müssen. Die ingezüchteten
ES-Zellen können
rekombinant oder genetisch modifiziert sein, was zu ES-Mäusen führt, die
transgen sind. Das Verfahren kann auch für die schnelle Herstellung
von ES-Mäusestämmen, die
homozygot für
eine definierte genetische Veränderung
sind, verwendet werden.
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Hintergrund
der Erfindung
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Genetisch
veränderte
Mäuse,
die spezifische Transgene oder gentechnisch erzeugte Mutationen
beherbergen, erwiesen sich als äußerst nützliche
Werkzeuge für
die Analyse der Genfunktion, das Studium von Krankheitsabläufen und
die Entwicklung und das Testen von neuen Therapien. Die derzeitigen
Verfahren zur Erzeugung von rekombinanten Mäusen sind jedoch aufwändig, zeitraubend
und teuer. Ein häufig
verwendetes Verfahren zur Einführung
von gezielten Mutationen oder Transgenen in die Keimbahn von Mäusen beinhaltet die
Verwendung von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) als Empfänger eines
gentechnisch erzeugten Gens. ES-Zellen sind pluripotente Zellen,
die direkt von der inneren Zellmasse von Blastocysten (Evans et
al. (1981), Nature 292: 154-156; Martin (1981), Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 78: 7634-7638; Magnusson et al. (1982), J. Embryo. Exp.
Morph. 81: 211-217; Doetchman et al. (1988), Dev. Biol. 127: 224-227),
disaggregierten Blastocysten (Eistetter (1989), Dev. Gro. Differ.
31: 275-282) und primordialen Keimzellen (Matsui et al. (1992),
Cell 70: 841-847; Resnick et al. (1992), Nature 359: 550-551) abgeleitet
sein können.
Rekombinante Gene können
unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens, das für die Genübertragung
in Zellen geeignet ist, in ES-Zellen eingeführt werden, zum Beispiel durch
Transfektion, Zellfusion, Elektroporation, Mikroinjektion, DNA-Viren und RNA-Viren
(Johnson et al. (1989), Fetal Ther. 4 (Suppl. 1): 28-39). Zu den
Vorteilen der Verwendung von ES-Zellen gehören ihre Fähigkeit zur Bildung von permanenten
Zelllinien in vitro, so dass man eine unerschöpfliche Quelle von genetischem
Material erhält.
Außerdem
sind ES-Zellen die am stärksten pluripotenten
bekannten kultivierten Tierzellen. Wenn ES-Zellen zum Beispiel bei
einem Embryo im Blastocystenstadium in eine intakte Blastocystenhöhle oder
unter die Zona pellucida injiziert werden, sind sie in der Lage,
zu allen Körpergeweben
einschließlich
der Keimbahn in den resultierenden Tieren beizutragen. Neben der Maus,
wie weiter unten beschrieben ist, wurden ES-artige Zellen auch aus
der Ratte (Iannaccone P.M. et al. (1994), Dev. Biol. 163: 288-292),
dem Schwein (Chen L. R. et al. (1999), Theriogenology 52: 195-212),
dem Rind (Talbot N.C. et al. (1995), Mol. Reprod. Dev. 42: 35-52),
dem Kaninchen (Schoonjans L. et al. (1996), Mol. Reprod. Dev. 45:
439-443), Primaten (Thomson J.A. et al. (1995), PNAS 92: 7844-7848)
und dem Menschen (Thomson J.A. et al. (1998), Science 282: 1145-1147),
isoliert.
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Herkömmliche
Verfahren zur Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen beinhalten die Verwendung
von gentechnisch veränderten
ES-Zellen zur Schaffung von genetisch veränderten chimären Mäusen entweder
durch Aggregation mit diploiden Embryos oder Injektion von veränderten
ES-Zellen in diploide Blastocysten und anschließende Einführung der resultierenden chimären Embryos
in scheinträchtige
weibliche Mäuse
(Capecchi, Science 244: 1288-1292 (1989); Capecchi, Trends in Genetics
5: 70-76 (1989)). Dann werden die resultierenden chimären Mäuse gezüchtet, wobei
man Mäuse
erhält,
die bezüglich
der gewünschten genetischen
Veränderungen
heterozygot oder homozygot sind. Trotz der hohen Erfolgsrate dieses
Ansatzes zur Erzeugung von rekombi nanten Mäusen weist dieses Verfahren
schwerwiegende Einschränkungen
auf, insbesondere bei der Erzeugung einer großen Zahl von verschiedenen
rekombinanten Mäusen,
die Veränderungen
in verschiedenen Genen tragen, bei einer Produktion mit hohem Durchsatz
oder bei der Kombination von Veränderungen
in mehreren Genen in demselben Mausstamm. Die Schaffung einer Maus
mit einer homozygoten Mutation durch den obigen Ansatz erfordert
zum Beispiel einen Schritt der in-vitro-ES-Zellmanipulation, um
das interessierende Gen gezielt anzusprechen, und dann wird eine
chimäre
Maus erzeugt. Das chimäre
Founder-Tier wird dann gezüchtet,
so dass heterozygote Nachkommen entstehen, die anschließend untereinander
gekreuzt werden, so dass Mäuse
entstehen, die bezüglich
der gewünschten
Veränderung
homozygot sind. Das Verfahren zur Gewinnung einer homozygoten Mutantenmaus
erfordert also wenigstens drei Mäusegenerationen
oder 9 Monate Züchtungszeit,
um den gewünschten
Mäusestamm
zu schaffen. Diese Manipulationen werden bezüglich der Züchtungsanforderungen weiter
verkompliziert, wenn noch andere Mutationen oder Transgene in den
gewünschten
mutanten Mäusestamm
eingebaut werden. Aufgrund der langen Züchtungszeit und der Kosten
und des Aufwands der Tierhaltung ist es insbesondere bei kommerzieller
Produktion oder Produktion mit hohem Durchsatz in hohem Maße wünschenswert,
alternative Verfahren zu entwickeln, um routinemäßig genetisch veränderte Mäuse erzeugen
zu können,
die keine Erzeugung einer chimären Maus-Zwischenstufe
erfordern.
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Die
Verwendung von tetraploiden Embryos anstelle von diploiden Embryos
für die
Injektion oder Aggregation mit genetisch veränderten ES-Zellen ist ein Ansatz,
der verwendet wird, um die Erzeugung einer chimären Maus-Zwischenstufe und langwierige Züchtungsschritte
zu umgehen (Nagy A. et al. (1990), Development. 110: 815-21; Misra
R.P. et al. (2001), BMC Biotechnology 1: 12). Dieses Verfahren,
das "tetraploide
Komplementierung" genannt
wird, macht sich die Eigenschaft zu Nutze, dass Blastomere leicht
durch Elektrofusion eines zweizelligen Embryos tetraploid (4N) gemacht
werden können
und die resultierenden tetraploiden Zellen die Fähigkeit haben, sich zu replizieren
und Trophoblasten und Endoderm der Plazenta sowie extraembryonale
Membranen zu bilden, aber keine fetalen Strukturen bilden. Andererseits
haben ES-Zellen die Fähigkeit,
fetale Strukturen zu bilden, können
aber keine Trophoblasten und extraembryonales Endoderm bilden. Folglich bilden
chimäre
Embryos, die durch die Einführung
von ES-Zellen in tetraploide Embryos entweder durch Injektion oder
durch Aggregation gebildet wurden, aufgrund der komplementären Beiträge von ES-
und tetraploiden Zellen erfolgreich normale Konzepten (Nagy et al.,
1990; Nagy et al., PNAS (1993), 90: 8424-8428; und James et al.,
Dev. Biol. (1995) 167(1): 213-26). Das Verfahren der tetraploiden
Komplementierung scheint also vielversprechend zu sein als einfacher
Weg zur Schaffung von nichtchimären,
von ES-Zellen abgeleiteten Mäusen ("ES-Mäusen") in einem Schritt
ohne zusätzliche
Züchtungsschritte.
In zahlreichen Studien, in denen versucht wurde, das Verfahren der
tetraploiden Komplementierung auf die Erzeugung von ES-Mäusen anzuwenden, waren
die Ergebnisse jedoch bestenfalls in hohem Maße variabel, und meistens wurden
lebensfähige
und fruchtbare ES-Mäuse in einer
enttäuschend
geringen Ausbeute erzeugt (Nagy A. et al. (1990), loc. cit.; Nagy A.
et al. (1993), loc. cit.; Ueda O. et al. (1995), Exp. Anim. 44:
205-10; Wang Z.Q. et al. (1997), Mech. Dev. 62: 137-45; PCT-Veröffentlichung
WO 98/06834). Insbesondere hat es sich als besonders schwierig erwiesen,
lebensfähige
und fruchtbare ES-Mäuse über tetraploide
Komplementierung unter Verwendung von ES-Zellen zu erhalten, die
von ingezüchteten
Mäuselinien
stammten (Nagy et al., 1993, loc. cit., Ueda et al., 1995, loc.
cit.). Außerdem
schien die genetische Manipulation von ES-Zellen oder die kontinuierliche
Vermehrung von ES-Zellen in vitro während längerer Zeiträume die
Effizienz der Erzeugung von ES-Mäusen
noch weiter zu reduzieren (Nagy et al., loc. cit.). Leider weisen
diese Ergebnisse zusammengenommen also darauf hin, dass es aufgrund von äußerst geringen
Effizienzen vielleicht kommerziell nicht durchführbar ist, die tetraploide
Komplementierung für
die routinemäßige Erzeugung
von gentechnisch veränderten
ES-Mäusen
aus ingezüchtetem
genetischem Hintergrund zu verwenden. Dies ist besonders problematisch,
da ingezüchtete
Linien aufgrund des konstanten genetischen Hintergrunds bei ingezüchteten
Stämmen
die bevorzugten Linien zur Verwendung für Vergleichsstudien bezüglich der
biologischen Funktion, Krankheitsabläufen oder therapeutischen Wirksamkeit sind.
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Vor
kurzem beschrieben Eggan et al. (Eggan K. et al. (2001), PNAS 98:
6209-6214) eine
Gruppe von sorgfältig
kontrollierten Experimenten, bei denen das Verhalten von ingezüchteten
ES-Zellen mit dem von F1-Hybrid-ES-Zellen bezüglich der Fähigkeit verglichen wurde, über tetraploide
Komplementierung lebensfähige
ES-Mäuse
zu erzeugen. Die F1-Hybrid-ES-Zellen in dieser Studie stammten von
ausgezüchteten F1-Nachkommen
von Kreuzungen zwischen verschiedenen ingezüchteten Mäuselinien, z.B. 129 × C57BL/6, BALB/c × C57BL6,
CBA × 129,
129/SvJ × 129/SV-CP
und andere. Bemerkenswerterweise zeigte diese Studie einen reproduzierbaren
und großen
Unterschied in der Fähigkeit
von ingezüchteten
ES-Zellen gegenüber F1-Hybrid-ES-Zellen
zur Erzeugung von lebensfähigen
adulten ES-Mäusen:
Ingezüchtete
ES-Zellen ergaben lebensfähige
adulte ES-Mäuse
je nach dem verwendeten Stamm mit einer geringen Häufigkeit
von nur 0-1,4%, während
F1-Hybrid-ES-Zellen adulte ES-Mäuse
mit einer mittleren Häufigkeit
von 15% ergaben. In dieser Studie erwiesen sich ingezüchtete ES-Zellen
also wiederum als ungeeignet zur Verwendung bei der routinemäßigen Erzeugung
von ES-Mäusen,
obwohl dies bei F1-Hybridzellen mit einer brauchbaren Häufigkeit
funktionierte. Obwohl diese Studie das Problem, wie man ES-Mäuse effizient
und routinemäßig aus
ingezüchteten ES-Zellen
erzeugt, nicht löste,
zeigte sie, dass Unterschiede, die vermutlich durch Auszüchten in
F1-Nachkommen eingeführt wurden,
irgendwie die Effizienz der Erzeugung von ES-Mäusen
sogar auf das 50fache erhöhten.
Dennoch blieb die Komplexität
und mechanistische Basis dieses durch Auszüchten der F1-Hybridlinien verursachten
Unterschieds undefiniert, und daher legten diese Ergebnisse nicht
direkt ein Verfahren nahe, um die Isolierung oder Manipulation von
reinen ingezüchteten
ES-Linien so zu modifizieren, dass ingezüchtete ES-Linien eine erhöhte Effizienz
bei der Erzeugung von ES-Mäusen über tetraploide
Komplementierung aufweisen.
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Mehrere
unabhängige
Studien konzentrierten sich auf die Entwicklung von Verfahren zur
Verbesserung der Isolierung und Kultur von undifferenzierten pluripotenten
ES-Zelllinien aus einer Vielzahl von Quellen. Der Leukämieinhibierende
Faktor (LIF) wird schon lange als Schlüsselkomponente eines Kulturmediums
zur Isolierung und Vermehrung von undifferenzierten ES- Zelllinien verwendet
(Pease et al. (1990), Dev. Biol. 141: 344-52). LIF ist ein löslicher
sezernierter Proteinfaktor, der über
einen Komplex auf Empfängerzellen
wirkt, die zwei Rezeptoren enthalten, gp130 und den LIF-Rezeptor
mit geringer Affinität
LIF-R. Das Ansprechen von Zellen auf LIF scheint intrazellulär durch
Komponenten der STAT- und MAPK-Signalwege vermittelt zu werden (Smith
A. und Burdon T., WO 00/15764). Für die Vermehrung von ES-Zellen
wird LIF typischerweise entweder durch eine Feeder-Schicht von Zellen
in der Kultur, die LIF exprimieren, durch Vorkonditionieren des
Kulturmediums durch Einwirkenlassen von Zellen, die LIF exprimieren,
oder durch Zugabe von rekombinantem LIF zum Kulturmedium geliefert
(Pease et al., loc. cit.). Neben LIF wurden noch andere lösliche proteinartige
Faktoren partiell charakterisiert, die die Isolierung und Kultur
von undifferenzierten ES-Zellen zu verbessern scheinen; Dani et
al. haben einen ESRF genannten Faktor beschrieben (Dani et al. (1998),
Dev. Biol. 203: 149-162; PCT-Anmeldung WO 97/30151), und Schoonjans
und Moreadith haben ein konditioniertes Medium mit verbesserten
Eigenschaften beschrieben, das von rekombinanten Kaninchen-Fibroblasten
stammt, die Kaninchen-LIF exprimieren (PCT-Anmeldung WO 02/00847).
Außerdem
haben Burdon et al. Daten präsentiert,
dass die Hemmung des MAPK-Signalwegs durch Zugabe des ERK-Inhibitors
PD098059 zum Kulturmedium das Wachstum von undifferenzierten ES-Zellen
verstärkt
(Burdon et al. (1999), Dev. Biol. 210: 30-43; PCT-Anmeldung WO 00/15764).
Es wurde jedoch nicht gezeigt, dass solche Faktoren, die die Isolierung
und Kultur von ES-Zellen in Kultur fördern, das Problem der Förderung
der tetraploiden Komplementierung von ingezüchteten ES-Zellen zur Erzeugung
von ES-Mäusen
lösen können. Zum
Beispiel wird LIF verwendet, um sowohl ingezüchtete als auch F1-Hybrid-ES-Zellen
zu kultivieren; dennoch gab es in einer Studie eine 50fach größere Effizienz
in der Erzeugung von adulten ES-Mäusen unter Verwendung der F1-Hybrid-ES-Zellen
im Vergleich zu den ingezüchteten
ES-Zellen (Eggan et al., loc. cit.). Folglich gibt es keine sichtbare
direkte Beziehung zwischen Faktoren, die die Isolierung und/oder
Kultur von ES-Zellen
verbessern, im Vergleich zu Faktoren, die das Entwicklungspotential
von ES-Zellen in tetraploiden Aggregaten spezifisch verbessern könnten.
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Es
bleibt also in der Technik ein Bedürfnis nach verbesserten und
reproduzierbaren Verfahren zur Erzeugung von genetisch veränderten
ES-Mäusen
aus gentechnisch veränderten
ingezüchteten
ES-Zellen.
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Auf
alle hier zitierten Literaturstellen wird ausdrücklich Bezug genommen.
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Kurzbeschreibung
der Erfindung
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Die
Erfindung stellt ein verbessertes und reproduzierbares Verfahren
zur Erzeugung von nichthumanen ES-Säugern, vorzugsweise ES-Mäusen aus
ingezüchteten
ES-Zellen, bereit, ohne dass eine chimäre Maus-Zwischenstufe erzeugt
werden muss. Das Verfahren umfasst die Schritte des Vermehrens einer
ingezüchteten
embryonalen Stammzelle (ES-Zelle) in einem Kulturmedium, das eine
vorbestimmte Menge eines Inhibitors des ras/MAPK-Kinase-Stoffwechselwegs
enthält.
In bevorzugten Ausführungsformen
hemmt der ras/MAPK-Inhibitor
MEK1 und/oder MEK2. Ein bevorzugter MEK-Inhibitor ist PD098095.
Bevorzugte nichthumane Tiere sind Nagetiere, wie Mäuse, Ratten
usw., wobei Mäuse
am meisten bevorzugt sind. Die Erfindung wird im Folgenden unter
Bezugnahme auf Mäuse
beschrieben, was jedoch nicht als Einschränkung der Erfindung anzusehen
ist.
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Die
ras/MAPK-gehemmten ES-Zellen, die erzeugt werden, werden durch Injektion
in eine tetraploide Blastocyste oder Aggregation mit einer tetraploiden
Morula in einen tetraploiden Embryo eingeführt, wobei ein mit ES-Zellen
komplementierter tetraploider Embryo entsteht. Der mit ES-Zellen
komplementierte tetraploide Embryo wird in eine weibliche Maus transplantiert,
und es wird eine lebensfähige
ES-Maus-Nachkommenschaft erzeugt. In einer bevorzugten Ausführungsform
sind die ingezüchteten
ES-Zellen insofern rekombinant oder genetisch modifiziert, als sie
eine definierte genetische Veränderung,
wie eine Mutation, ein definiertes Knock-out oder Knock-in eines
Gens, einen Genersatz und/oder bedingten Knock-out, in ihrem Genom
beherbergen, und daher sind die resultierenden ES-Mäuse transgen.
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Das
Verfahren kann für
die schnelle Produktion von ES-Mäusestämmen, die
homozygot bezüglich
einer definierten genetischen Veränderung sind, verwendet werden.
In diesem Aspekt der Erfindung werden männliche ES-Zellen, die eine
definierte genetische Veränderung
beherbergen, unter ras/MAPK-Stoffwechselweg hemmenden Bedingungen
vermehrt, wobei männliche
(XY) Zellen und weibliche (X0) Zellen entstehen. Eine tetraploide
Embryokomplementierung wird mit den männlichen (XY) Zellen durchgeführt, so
dass lebensfähige
männliche
(XY) ES-Mäuse
entstehen, und mit isolierten weiblichen (X0) Zellen durchgeführt, so
dass lebensfähige
weibliche (X0) ES-Mäuse
entstehen. Die männlichen
(XY) ES-Mäuse
und die weiblichen (X0) Mäuse
werden miteinander gekreuzt, wobei F1-Nachkommenmäuse entstehen,
die homozygot bezüglich
der genetischen Veränderung
sind.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Wir
haben herausgefunden, dass lebensfähige und fruchtbare embryonale
Stammzellen (ES-Zellen), die von nichthumanen Säugern (ES-Säugern), wie von ES-Zellen abgeleiteten
Mäusen
(ES-Mäusen),
stammen, mit viel größerer Häufigkeit
als bei den früher
beschriebenen Verfahren, bei denen ingezüchtete ES-Zellen und tetraploide
Komplementierung verwendet wurden, erzeugt werden können, wenn
die für
die tetraploide Komplementierung verwendeten ingezüchteten
ES-Zellen in einem Kulturmedium vermehrt wurden, das einen Inhibitor
des ras/MAPK-Stoffwechselwegs enthält. Die Erfindung stellt also
ein verbessertes und reproduzierbares Verfahren zur Erzeugung von
ES-Mäusen
aus ingezüchteten
ES-Zellen bereit, ohne dass eine chimäre Maus-Zwischenstufe erzeugt
werden muss.
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Vermehrung von ingezüchteten
embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)
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Bei
den Verfahren der Erfindung wird eine ingezüchtete ES-Stammzelle erhalten,
zum Beispiel unter Verwendung einer verfügbaren Zelllinie oder durch
Erzeugung von primären
ES-Zellen unter Verwendung von Standardverfahren (siehe Hogan et
al., Manipulating the Mouse Embryo, CSHL Press 1994, S. 253-289).
Zum Beispiel lässt
man männliche
und weibliche Mäuse
von ingezüchteten
Stämmen
sich natürlich
paaren, und die ES-Zellen von den Blastocysten von befruchteten
Mäusen
werden erhalten. Jeder ingezüchtete
Stamm kann verwendet werden; zu den bevorzugten Stämmen gehören C57BL/6,
Balb/c, C3H, CBA, SJL und 129SvEv/TAC (erhältlich von Janvier Le Genest-St-Isle,
Frankreich, und Taconic M&B,
Dänemark).
Die ES-Zellen werden in Medium und unter Standardbedingungen kultiviert,
die für
die Vermehrung von ES-Zellen geeignet sind (Torres und Kuehn, Laboratory
Protocols For Conditional Gene Targeting (1997), Oxford University
Press; Hogan et al. (1994); Manipulating the Mouse Embryo, 2. Auflage,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY). Außerdem wird das Kulturmedium
mit einem exogen zugefügten
Inhibitor des Raf/MEK/ERK-Stoffwechselwegs (auch als ras/MAPK-Stoffwechselweg
bezeichnet) versetzt. Der ras/MAPK-Stoffwechselweg steuert die Aktivierung
von vielen so verschiedenen (und zuweilen scheinbar widersprüchlichen)
zellulären Funktionen
wie Zellvermehrung, Zellzyklus-Arrest, terminale Differenzierung
und Apoptose (siehe Murakami M.S., Morrison D.K., Sci STKE (2001)
99: PE30; und Peyssonnaux C., Eychene A., Biol. Cell 2001 Sep; 93(1-2):
53-62).
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Inhibitoren
des ras/MAPK-Stoffwechselwegs, die verwendet werden können, sind
in der Technik bekannt. Beispiele für kleine Moleküle als Inhibitoren
sind ZM 336372 (N-[5-(3-Dimethylaminobenzamido)-2-methylphenyl]-4-hydroxybenzamid),
ein Inhibitor von c-raf; 5-Iodtubercidin (CAS-Nr. 24386-93-4), ein
Inhibitor von ERK2; PD-98059 (2'-Amino-3'-methoxyflavon; CAS-Nr.
167869-21-8), ein
Inhibitor von MEK (Alessi, D.R. et al. (1995), J. Biol. Chem. 270:
27489-27494); und U 0126 (Bis[amino[(2-aminophenyl)thio]methylen]butandinitril;
CAS-Nr. 109511-58-2), ebenfalls ein Inhibitor von MEK (Dudley, D.T.
et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7686-7689) (alle vorgenannten
Inhibitoren des ras/MAPK-Stoffwechselwegs sind von BIOMOL Research
Labs, Plymouth Meeting, PA, erhältlich).
Ein Beispiel für
einen Proteininhibitor des ras/MAPK-Stoffwechselwegs ist der letale
Anthrax-Faktor, der MEK hemmt (Duesbery N.S., Vande Woude G.F.,
J. Appl. Microbiol. (1999), 87(2): 289-93; Duesbery N.S. et al.
(2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 4089-94). Bevor zugte Inhibitoren
hemmen MEK1 und/oder MEK2. Ein besonders bevorzugter Inhibitor ist
PD-98059.
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Weitere
Inhibitoren des ras/MAPK-Stoffwechselwegs können unter Verwendung von verfügbaren Assays
identifiziert werden. Zum Beispiel kann die Hemmung von MEK nachgewiesen
werden, indem man eine in-vitro-Phosphorylierung eines ERK:GST-Fusionsproteins
in Gegenwart verschiedener Konzentrationen eines mutmaßlichen
MEK-Inhibitors durchführt.
Die Anwesenheit des aktivierten ERK wird mit Hilfe eines Western
Blot und von Antikörpern,
die spezifisch für
aktives ERK sind, nachgewiesen (Said et al., Promega Notes, Nr.
69, 1998, S. 6). Inhibitoren in Form von kleinen Molekülen werden
typischerweise innerhalb eines Bereichs von 10 nM bis 100 mM verwendet.
Bevorzugte Konzentrationen für
PD98059 liegen im Bereich von 10-50 μM. Bevorzugte Konzentrationen
für U0126
liegen im Bereich von 100 nM-10 μM.
Die optimale Konzentration eines besonderen Inhibitors kann mit
Routineexperimenten bestimmt werden. Die Konzentration des ras/MAPK-Inhibitors
kann reduziert werden, sobald sich Zelllinien etabliert haben.
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Das
Kulturmedium wird mit einem "exogen
hinzugefügten" Inhibitor des ras/MAPK-Stoffwechselwegs versetzt,
was bedeutet, dass das Medium in kontrollierter Weise mit dem Inhibitor
versetzt wird. Typischerweise wird dies erreicht, indem man eine
bekannte Menge eines gereinigten Inhibitors zu dem Kulturmedium
gibt, so dass man eine gewünschte
Endkonzentration im Kulturmedium erzielt. Im Falle von Proteininhibitoren
kann das Kulturmedium jedoch auch durch Zellen, die einen rekombinanten
Inhibitor in ausreichender Menge exprimieren, um eine Hemmung des
ras/MAPK-Stoffwechselwegs zu erreichen (z.B. rekombinante Feeder-Zellen), mit
einem "exogen hinzugefügten" Inhibitor des ras/MAPK-Stoffwechselwegs
versorgt werden. Aus den obigen Beispielen geht also hervor, dass
der Ausdruck "exogen
hinzugefügt" nicht die Situation
umfasst, in der Feeder-Zellen in einem konditionierten Medium oder
die ES-Zellen selbst
einen endogen erzeugten ras/MAPK-Inhibitor sezernieren. Inhibitoren
des ras/MAPK-Stoffwechselwegs, die in den Verfahren der Erfindung
verwendet werden, sind typischerweise kleine Moleküle oder
Proteininhibitoren, wie die oben beschriebenen, können aber
auch andere inhibitorische Mittel umfassen, wie Nucleinsäureinhibitoren
(z.B. Antisense, RNAi (siehe PCT WO 01/75164) usw.). Die ES-Zellen
werden in dem Medium unter Bedingungen kultiviert, die die Vermehrung
fördern.
Die Zellen können
mehrmals in frisches Medium übergeführt werden,
bis die gewünschte
Zahl von Zellen erhalten wird; dann können sie bei der tetraploiden
Komplementierung verwendet oder eingefroren und zur späteren Verwendung
aufbewahrt werden. ES-Zellen, die in Gegenwart eines Inhibitors
des ras/MAPK-Stoffwechselwegs vermehrt werden, werden hier als "ras/MAPK-gehemmte
ES-Zellen" bezeichnet.
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Tetraploide
Komplementierung
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Die
ras/MAPK-gehemmten ES-Zellen können
ohne weitere Modifikation für
die tetraploide Komplementierung verwendet werden, so dass klonierte
ES-Mäuse
entstehen, oder sie können
zuerst genetisch modifiziert und dann für die Erzeugung von transgenen
ES-Mäusen
verwendet werden (weiter unten diskutiert).
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Tetraploide
Embryos werden unter Verwendung von bekannten Verfahren erzeugt
(Wang et al., loc. cit.; WO 98/06834; Eggan et al., loc. cit.).
Als Beispiel werden weibliche Mäuse
einer Superovulation unterzogen und dann gepaart. Befruchtete Zygoten
werden gesammelt und kultiviert, so dass man zweizellige Embryos
erhält,
die dann einer Elektrofusion unterzogen werden, wobei einzellige
tetraploide Embryos entstehen. Die tetraploiden Embryos werden in
vitro bis zum Blastocystenstadium kultiviert. Ras/MAPK-gehemmte
ingezüchtete
ES-Zellen werden
in einen tetraploiden Embryo eingeführt, wobei man bekannte Verfahren
verwendet, wie Aggregation mit einer tetraploiden Morula (Nagy et
al. (1990), loc. cit.) oder Injektion in eine tetraploide Blastocyste
(Eggan et al., loc. cit.). Typischerweise werden in jeden Embryo
etwa 10-15 ES-Zellen eingeführt, was
zu dem führt,
was hier ein "ES-Zell-komplementierter
tetraploider Embryo" genannt
wird. Ungefähr
5-15 ES-Zell-komplementierte tetraploide Embryos werden in weibliche
Empfängermäuse implantiert
und sich so weit entwickeln gelassen, bis sie ex utero überleben
können.
Der Ausdruck "lebensfähige ES- Maus-Nachkommenschaft" bezeichnet hier
eine ES-Maus, die nach dem oben beschriebenen Verfahren erzeugt
wurde und nach Entnahme aus dem Uterus ihrer weiblichen Empfängermaus
wenigstens 2 Tage lang überleben
kann.
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Transgene ES-Mäuse
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Vor
der tetraploiden Komplementierung können die ras/MAPK-gehemmten
ES-Zellen genetisch
modifiziert werden, so dass rekombinante ES-Zellen entstehen (d.h.
solche, die eine definierte genetische Veränderung, wie eine Mutation,
ein definiertes Knock-out oder Knock-in eines Gens, einen Genersatz
und/oder bedingten Knock-out, in ihrem Genom beherbergen), und somit
sind die resultierenden ES-Mäuse
transgen und werden verwendet, um transgene ES-Mäuse zu erzeugen. Alternativ
dazu stammen die ES-Zellen selbst aus einer transgenen oder rekombinanten
Maus und sind also bereits "genetisch
modifiziert". Als
weitere Alternative werden primäre
ES-Zellen oder vorhandene ES-Zelllinien vor der ras/MAPK-Hemmung
genetisch modifiziert. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten
ES-Zellen sind in der Technik wohlbekannt (Gene Knockout Protocols,
in Methods in Molecular Biology, Vol. 158 (2001), Hrsg. M.J. Tymms
und I. Kola, Humana Press, Totowa, New Jersey). Rekombinante ES-Zellen
beherbergen eine veränderte
Expression (erhöhte
oder gesenkte Expression, einschließlich einer fehlenden Expression)
von einem oder mehreren Genen. Eine veränderte Expression von Genen
in ES-Zellen kann durch Knock-out eines Gens, Knock-in eines Gens
und gezielte Mutationen erreicht werden.
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In
einer Ausführungsform
beherbergen die rekombinanten ES-Zellen und resultierenden transgenen Tiere
ein "Knock-out" eines Gens mit einer
heterozygoten oder homozygoten Veränderung in der Sequenz eines
endogenen Gens, die zu einer Abnahme der Genfunktion führt, vorzugsweise
so, dass die Genexpression nicht nachweisbar oder unerheblich ist.
Knock-out-Zellen werden typischerweise durch homologe Rekombination
mit einem Vektor erzeugt, der ein Transgen umfasst, das wenigstens
einen Teil des auszuschaltenden Gens aufweist. Typischerweise wurde
eine Deletion, Addition oder Substitution in das Transgen eingeführt, so dass
es funktionell unterbrochen wird. Das Transgen kann ein humanes
Gen sein (z.B. von einem Humangenomklon), aber besonders bevorzugt
handelt es sich um ein Orthologon des humanen Gens, das von transgenen
Wirtsspezies stammt. Zum Beispiel wird ein Mäusegen verwendet, um einen
homologen rekombinanten Vektor aufzubauen, der geeignet ist, um
ein endogenes Gen im Mausgenom zu verändern. Ausführliche Beschreibungen von
Methoden für
die homologe Rekombination bei Mäusen
sind verfügbar
(siehe Capecchi, Science (1989), 244: 1288-1292; Joyner et al.,
Nature (1989), 338: 153-156). Verfahren zur Erzeugung von transgenen
Säugern,
die keine Nagetiere sind, und anderen Tieren sind ebenfalls verfügbar (Houdebine
und Chourrout, loc. cit.; Pursel et al., Science (1989) 244: 1281-1288;
Simms et al., Bio/Technology (1988) 6: 179-183).
-
In
einer anderen Ausführungsform
beherbergen die rekombinante ES-Zelle und die resultierenden transgenen
Tiere ein "Knock-in" eines Gens, d.h.
sie weisen eine Veränderung
im Genom auf, die zu einer veränderten
Expression (z.B. erhöhten
(einschließlich
ektopischen) oder gesenkten Expression) des Gens führt, z.B.
durch Einführung
zusätzlicher
Kopien eines Gens oder durch funktionelles Einsetzen einer regulatorischen
Sequenz, die für
eine veränderte
Expression einer endogenen Kopie des Gens sorgt. Zu diesen regulatorischen
Sequenzen gehören
induzierbare, gewebespezifische und konstitutive Promotoren und
Enhancer-Elemente. Das Knock-in kann homozygot oder heterozygot
sein.
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ES-Zellen
können
auch verwendet werden, um transgene nichthumane Tiere zu erzeugen,
die ausgewählte
Systeme enthalten, die eine regulierte Expression eines Transgens
ermöglichen.
Ein Beispiel für
ein solches System, das erzeugt werden kann, ist das cre/loxP-Rekombinase-System
des Bakteriophagen P1 (Lakso et al., PNAS (1992), 89: 6232-6236;
US-Patent Nr. 4,959,317). Wenn ein cre/loxP-Rekombinase-System verwendet
wird, um die Expression des Transgens zu regulieren, sind Tiere
erforderlich, die Transgene enthalten, welche sowohl die Cre-Rekombinase
als auch ein ausgewähltes
Protein codieren. Solche Tiere können über die
Konstruktion von "doppelt" transgenen Tieren
erhalten werden, z.B. durch Paaren von zwei transgenen Tieren, von
denen eines ein Transgen enthält,
das ein ausgewähltes
Protein codiert, und das andere ein Transgen enthält, das
eine Rekombinase codiert. Ein weiteres Beispiel für ein Rekombinase-System
ist das FLP-Rekombinase-System von Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al. (1991),
Science 251: 1351-1355; US-Patent Nr. 5,654,182). In einer bevorzugten
Ausführungsform
werden sowohl Cre-loxP als auch Flp-Frt in demselben System verwendet,
um die Expression des Transgens zu regulieren und eine sequentielle
Deletion von Vektorsequenzen in derselben Zelle zu erreichen (Sun
X et al. (2000), Nat. Genet. 25: 83-6).
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Die
Zielkonstrukte, die verwendet werden, um rekombinante ES-Zellen
zu erzeugen, können
mit Hilfe von Standardverfahren hergestellt werden und umfassen
vorzugsweise die Nucleotidsequenz, die in die genomische Wildtypsequenz
(WT) eingebaut werden soll, sowie einen oder mehrere Selektionsmarker
(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
zweite Auflage, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York; E.N. Glover
(Hrsg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, Band I und II;
P.M. Ausubel et al., 1994, Current Protocols In Molecular Biology,
John Wiley and Sons, Inc.). Das Zielkonstrukt kann unter Verwendung irgendeines
in der Technik bekannten Verfahrens, wie Mikroinjektion, Elektroporation,
Retrovirus-vermittelte Übertragung,
spermavermittelte Genübertragung,
Transfektion und Calciumphosphat/DNA-Copräzipitation und andere, in die
Wirts-ES-Zelle eingeführt
werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Zielkonstrukt
durch Elektroporation in Wirts-ES-Zellen eingeführt (Potter H. et al. (1994),
PNAS 81: 7161-7165). Dann wird die Anwesenheit des Zielkonstrukts
in Zellen nachgewiesen, indem man Zellen identifiziert, die das
Selektionsmarker-Gen exprimieren. Zum Beispiel sind Zellen, die
ein eingeführtes
Neomycin-Resistenz-Gen exprimieren, resistent gegenüber der
Verbindung G418.
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Zur
schnellen Erzeugung von genetisch veränderten ingezüchteten
Mäusestämmen können transgene
weibliche ES-Mäuse,
die von männlichen
ES-Zellen stammen, erzeugt werden. Männliche ES-Zellen, die genetische
Veränderungen
beherbergen, können
vermehrt werden, so dass ras/MAPK-gehemmte Zellen entstehen, wie
es oben beschrieben ist. In seltenen Fällen führen Zellteilungen zu einer
Chromosomen-Fehlverteilung, wobei ES-Zellen mit einem X0-Genotyp (ES-Zellen,
die ein X-, aber kein Y-Chromosom enthalten) unter den Nachkommen
der elterlichen ES-Zellen entstehen. ES-Zellen mit XY- bzw. X0-Genotyp
können
mit Hilfe von Y-spezifischen Markern voneinander unterschieden werden.
Dann werden XY- und X0-ES-Zellen verwendet, um transgene ES-Mäuse zu erzeugen,
wie oben beschrieben ist. Im Gegensatz zum Menschen (Turner-Syndrom) sind weibliche
X0-Mäuse
fruchtbar. Daher werden ES-Mäuse
mit XY- und X0-Genotyp
dann gepaart, was zu 25% Nachwuchs führt, der homozygot bezüglich einer
genetischen Veränderung
ist, die in den elterlichen männlichen
ES-Zellklon eingeführt
wurde.
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Die
unter Verwendung der Verfahren der Erfindung erzeugten transgenen
ES-Mäuse können in
einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, wie in genetischen
Studien zur Aufklärung
von Signalwegen oder zum Identifizieren von zusätzlichen Genen, die an demselben
Stoffwechselweg beteiligt sind, der auch am Fortschritt einer Krankheit
beteiligt ist. Zum Beispiel können
zwei verschiedene transgene Mäuse,
die jeweils ein verändertes
Gen beherbergen, von dem man weiß, dass es an Krebs beteiligt
ist, gepaart werden, wobei ein doppelt transgenes Tier entsteht.
Dann wird das doppelt transgene Tier verwendet, um die Häufigkeit und
Geschwindigkeit der Krebsentwicklung zu bestimmen. Die Identifizierung
von Genen, die den malignen Fortschritt in einem spezifischen Gewebe
beschleunigen oder die Tumoren in anderen Geweben induzieren, ergibt
weitere Angriffspunkte für
eine therapeutische Behandlung.
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Transgene
Tiere werden auch als Tiermodelle für Krankheiten und Störungen verwendet,
die eine defekte Genfunktion implizieren. Sie können auch bei der Wirkstoffentwicklung
zum in-vivo-Testen von in Frage kommenden therapeutischen Mitteln
verwendet werden, um die Wirksamkeit und Toxizität der Verbindungen zu bewerten.
Die in Frage kommenden therapeutischen Mittel werden einem transgenen
Tier verabreicht, das eine veränderte
Genfunktion aufweist, und die phänotypischen
Veränderungen
werden mit geeigneten Kontrolltieren verglichen, wie genetisch modifizierten
Tieren, die eine Placebobehandlung erhalten, und/oder Tiere mit
einer nicht veränderten
Genexpression, die das in Frage kommende therapeutische Mittel erhalten.
Assays erfordern im Allgemei nen eine systemische Gabe der in Frage
kommenden Modulatoren, wie etwa durch orale Verabreichung, Injektion
usw. Nach einem anfänglichen
Screening wird ein in Frage kommendes therapeutisches Mittel, das
vielversprechend zu sein scheint, weiterhin dadurch bewertet, dass
man verschiedene Konzentrationen der Verbindung an die transgenen
Tiere verabreicht, um einen ungefähren therapeutischen Dosisbereich
zu bestimmen.
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Beispiele
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Der
folgende experimentelle Abschnitt und die folgenden Beispiele dienen
zur Veranschaulichung und sind nicht als Einschränkung anzusehen.
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I. Ableitung von ingezüchteten
Wildtyp- und mutanten C57BL/6- oder 129SvEv/Tac-ES-Zelllinien
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Die
Ableitung der ES-Zellen wurde im Wesentlichen so durchgeführt, wie
es von Hogan et al. (Manipulating the mouse embryo, CSHL Press 1994,
S. 253-89) beschrieben wurde, außer dass die Zellkultur bei 39 °C anstatt
bei 37 °C
durchgeführt
wurde. Männliche
und weibliche Mäuse
der Stämme
C57BL/6 (Janvier, Frankreich), 129SvEv/Tac (Taconic M&B, Dänemark)
oder C57BL/6-APCMin (Jackson Laboratories, USA) wurden miteinander
gepaart, wobei man Blastocysten von befruchteten Weibchen erhielt.
Der Mäusestamm C57BL/6-APCMin
beherbergt eine spontane Mutation im APC-Tumorsuppressor-Gen (Su
L.K. et al. (1992), Science 256: 668-670) und liefert ein genetisches
Modell für
den familiären
Darmkrebs beim Menschen. Weibchen mit Vaginalpfropf wurden aussortiert,
und 3 Tage später
wurden Blastocysten isoliert, indem man ihre Uteri ausspülte. Die
Blastocysten wurden über
Nacht in CZB-Medium (Chatot et al. (1990), Biol. Reprod. 42: 432-440)
weiterkultiviert und dann in 12-Napf-Gewebekulturplatten (1 Blastocyste pro
Napf), die mit einer Monoschicht von Mitomycin-C-inaktivierten primären Mausembryo-Fibroblasten
vorbeschichtet waren, in Standard-ES-Zellkulturmedium ("Standardbedingungen") (Torres und Kuehn,
Laboratory protocols for conditional gene targeting, Oxford University
Press 1997) oder in Standardmedium, das mit dem MEK-Inhibitor PD
98059 (NEB Biolabs) (Konzentration 50 mikromolar, verdünnt aus
einer 50-millimolaren Stammlösung
in DMSO und aufbewahrt bei –20 °C) oder mit
dem MEK-Inhibitor UO126 (Konzentration 10 mikromolar; NEB Biolabs)
versetzt war, übergeführt. Diese
Kulturen wurden 6 Tage lang bei 39 °C in einem Gewebekulturinkubator
(Heraeus) in einer Atmosphäre
mit 10% CO2 inkubiert. Die herausgewachsene
innere Zellmasse jeder Blastocyste wurde mit einer Pipettenspitze
unter geringer Vergrößerung isoliert,
in einen 50-Mikroliter-Tropfen Trypsin-Lösung übergeführt und 5-10 Minuten lang bei
39 °C inkubiert.
Dieser Zellklumpen wurde weiterhin durch Pipettieren dissoziiert,
die Zellen wurden in Gewebekulturplatten übergeführt und bei 39 °C unter Verwendung
von Standard-ES-Zellkulturbedingungen (Torres und Kuehn 1997, loc.
cit.) mit und ohne PD98059 (50 mikromolar) oder UO126 (10 mikromolar)
weitervermehrt. Nach der anfänglichen
Etablierung von ES-Zelllinien, die in Gegenwart von PD98059 vermehrt
wurden (6 Tage nach der ersten Dissoziation), wurde die Konzentration
von PD98059 auf 25 mikromolar reduziert, die Konzentration von UO126
wurde auf 4 mikromolar reduziert, und die Zellen wurden weitervermehrt.
Die C57BL/6-Linie Bruce4 (Kontgen et al. (1993), Int. Immunol. 5:
957-964) wurde unter Standardbedingungen bei 37 °C gezüchtet.
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Das
Geschlecht der Zelllinien wurde durch Southern-Blot-Hybridisierung
von genomischer DNA unter Verwendung einer Nachweissonde (pY353)
bestimmt, die für
einen Y-Chromosom-spezifischen Repeat spezifisch war (Bishop C.E.
und Hatat D. (1987), Nucleic Acids Res. 15, 2959-2969).
-
Für die Analyse
des Karyotyps von ES-Zellklonen wurden 4 × 106 Zellen
1 Stunde lang in Gegenwart von 0,2 μg/ml Demicolchicin (Sigma) kultiviert,
trypsinisiert, in einer hypotonischen (0,56%) KCl-Lösung resuspendiert
und 8 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die aufgequollenen
Zellen wurden durch Zentrifugation sedimentiert, in frisch hergestelltem
Fixiermittel (3:1-Gemisch
von Ethanol/Eisessig) resuspendiert und anschließend zweimal in Fixiermittel
gewaschen. Schließlich
wurden die Zellen in 0,5 ml Fixiermittel resuspendiert und auf Objektträger getropft,
die mit Ethanol/Essigsäure
(19/1) vorgereinigt worden waren. Nach Trocknen an der Luft wurden
die Metaphasen- Abstriche
5 Minuten lang in einer 2%igen Lösung
von Giemsa-Farbstoff (Merck) gefärbt,
in Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Die Chromosomen
von 20 geeigneten Metaphasenabstrichen wurden bei 1000facher Vergrößerung und
mit Ölimmersion
gezählt.
-
Diese
Experimente führten
bei ES-Zellen, die unter Standardbedingungen gezüchtet wurden, zu 4 ES-Zelllinien
(2 männliche,
2 weibliche) aus einunddreißig
C57BL/6-Blastocysten (13% Effizienz) und 6 ES-Linien aus siebenundzwanzig
129SvEv/Tac-Blastocysten (22% Effizienz). Bei Kulturen, die in Medien
mit PD 98059 gezüchtet
wurden, resultierten 11 ES-Linien aus achtzehn C57BL/6-Blastocysten (61%
Effizienz), und 9 ES-Linien wurden aus zwölf 129SvEv/Tac-Blastocysten erhalten
(75% Effizienz). Aus Kulturen, die in Medien mit UO126 gezüchtet wurden,
wurden 32 ES-Linien aus vierzig C57BL/6-Blastocysten erhalten (80%
Effizienz). ES-Zelllinien konnten also in Gegenwart der MEK-Inhibitoren PD 98059
oder UO126 in einer fünfmal
so hohen Effizienz abgeleitet werden (Tabelle 1). Weiterhin wurden
12 ES-Zelllinien aus Blastocysten des mutanten Mäusestammes C57BL/6-APCMin erzeugt
(36% Effizienz).
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Tabelle
1: Ableitung von ES-Zelllinien
-
II. Infektion von ingezüchteten
ES-Zellen in tetraploide Blastocysten/Erzeugung von ingezüchteten
ES-Mäusen
-
Die
Erzeugung von Mäusen
durch tetraploide Embryokomplementierung wurde schon früher beschrieben
(Eggan et al. (2001), PNAS 98: 6209-6214). Kurz gesagt, eine Embryokultur
wurde in Mikrotröpfchen
auf Standard-Bakterien-Petri-Schalen
(Falcon) unter Mineralöl
(Sigma) durchgeführt.
Modifizierte CZB-Medien (Chatot
et al., loc. cit.) wurden für
die Embryokultur verwendet, wenn nichts anderes angegeben ist. Hepes-gepuffertes
CZB wurde für
Arbeiten bei Raumtemperatur verwendet. Nach der Verabreichung von
Hormonen wurden superovulierte B6D2F1-Weibchen mit B6D2F1-Männchen gepaart.
Befruchtete Zygoten wurden aus dem Eileiter isoliert, und verbleibende
Kumuluszellen wurden mit Hyluronidase entfernt. Nach Kultur über Nacht
wurden zweizellige Embryos einer Elektrofusion unter Bildung von
einzelligen tetraploiden Embryos unterzogen, wobei man ein CF150-B-Zell-Fusionsinstrument
von BLS (Budapest, Ungarn) gemäß den Anweisungen
des Herstellers verwendete. Embryos, die innerhalb von 1 Stunde
keine Membranfusion erfahren hatten, wurden verworfen. Dann wurden
die Embryos in vitro bis zum Blastocystenstadium kultiviert. Für die Mikroinjektion
wurden 5-6 Blastocysten in einen Tropfen DMEM mit 15% FCS unter
Mineralöl
gegeben. Eine piezomechanische Mikroinjektionspipette mit flacher
Spitze und einem Innendurchmesser von 12-15 μm wurde verwendet, um 15 ES-Zellen
in jede Blastocyste zu injizieren. Nach der Rückgewinnung wurden in jedes
Uterushorn von scheinträchtigen
NMRI-Weibchen, die mit vasektomisierten Männchen gepaart worden waren,
2,5 Tage post coitum zehn injizierte Blastocysten übergeführt. Für eine Ableitung
durch Schnittentbindung wurden die Empfängermuttertiere in E 19,5 getötet, und
die Jungtiere wurden schnell entnommen. Neugeborene, die lebten
und atmeten, wurden zu säugenden
Weibchen gegeben. Drei Tage später
wurden die Würfe
kontrolliert, und Jungtiere, die immer noch lebten, wurden als überlebende
Jungtiere gezählt.
-
Ergebnisse:
Zwei von C57BL/6 abgeleitete ES-Zelllinien (Bruce4 (Koentgen et
al., loc. cit.) und ESAR-B6-8), die unter Standardbedingungen etabliert
und gezüchtet
wurden, waren im Einklang mit der Veröffentlichung sehr ineffizient bezüglich der
Erzeugung von ES-Mäusen
(Tabelle 2; 0,67% atmende Jungtiere, 0% überlebende Jungtiere). Dagegen
erzeugten neue C57BL/6-ES-Linien, die in Gegenwart von PD98059 etabliert
und gezüchtet
wurden, erheblich mehr lebende Jungtiere (Tabelle 2; 2,6% atmende
Jungtiere, 0,57% überlebende
Jungtiere). ES-Zelllinien, die von 129SvEv/Tac-Blastocysten etabliert
und in Gegenwart von PD98059 gezüchtet
wurden, erzeugten bei der tetraploiden Komplementierung ebenfalls
erheblich mehr überlebende
Jungtiere (4,48%) als die drei Linien, die unter Standardbedingungen
gezüchtet
wurden (0,85% überlebende
Jungtiere) (Tabelle 2).
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Tabelle
2: ex-Maus-Erzeugung aus ingezüchteten
Zelllinien
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III. Erzeugung von gentechnisch
veränderten
und mutanten ingezüchteten
ES-Mäusen
-
Um
ingezüchtete
ES-Mäuse
zu erzeugen, die genetische Veränderungen
beherbergen, verfolgten wir zwei verschiedene Strategien. Bei der
ersten Vorschrift wurden ES-Zelllinien, die in Medien mit UO126
(siehe Beispiel I) etabliert und gezüchtet wurden und die die C57BL/6-APCMin-Mutation
beherbergen, in tetraploide Blastocysten injiziert. Diese Injektionen
führten
zu 12 atmenden Jungtie ren (1,9% Effizienz) (Tabelle 3). Bei der zweiten
Vorschrift wurde die C57BL/6-ES-Zelllinie
ESAR-B6-PD.4 durch homologe Rekombination unter Verwendung eines
Gen-Targeting-Vektors in einer vorbestimmten Weise genetisch modifiziert.
Dieser Vektor (Rosa(lacZ) knock-in) führt ein beta-Galactosidase-Reporter-Gen in Verbindung
mit einem selektierbaren Hygromycin-Resistenz-Gen in den endogenen
Rosa26-Locus des ES-Zellgenoms ein (Seibler et al., Nucleic Acids Res.
31, e12, 2003). Dieser Gen-Targeting-Vektor wurde genau gemäß der Beschreibung
(Seibler et al., Nucleic Acids Res. 31, e12, 2003) durch Elektroporation
in ESAR-B6-PD4-Zellen eingeschleust, und Hygromycin-resistente ES-Zell-Kolonien wurden selektiert,
isoliert und weiter expandiert. Die genomische DNA von resistenten
Kolonien wurde isoliert und durch Southern-Blot-Analyse auf das
Auftreten eines homologen Rekombinationsereignisses in einem der
Rosa26-Allele getestet.
Zellen aus einem der rekombinierten ES-Zell-Klone (ESAR-B6-PD.4-R9 A-F2) wurden
in tetraploide Blastocysten injiziert. Diese Injektionen führten zu
4 atmenden Jungtieren (2,47% Effizienz) (Tabelle 3).
-
Tabelle
3: Erzeugung von gentechnisch veränderten und mutanten ingezüchteten
ES-Mäusen
-
IV. Erzeugung von weiblichen
transgenen ES-Mäusen
aus männlichen
ES-Zellen zur beschleunigten Erzeugung von homozygoten Mausmutanten
-
Männliche
ES-Zellen, die genetische Veränderungen
beherbergen, werden in Kulturmedium mit PD098059 vermehrt. In seltenen
Fällen
führen
Zellteilungen zu einer Chromosomen-Fehlverteilung, wobei ES-Zellen
mit einem X0-Genotyp (ES-Zellen, die ein X-, aber kein Y-Chromosom
enthalten) unter den Nachkommen der elterlichen ES-Zellen entstehen.
In einer gegebenen ES-Zellkultur beträgt die Häufigkeit solcher 39X0-Zellen
etwa 1-2%. Diese Zellen werden als reine Klone isoliert, indem man
die Population in geringer Dichte (1000 Zellen/Kulturschale) ausstreicht
und 9 Tage lang weiterkultiviert, bis jede einzelne Zelle eine getrennte
Kolonie von 1 mm Größe (etwa
2000 Zellen) gebildet hat. Unter Verwendung einer Pipettenspitze
werden mehrere Hundert dieser Kolonien herausgesucht und in Näpfe von
96-Napf-Mikrotiterplatten verteilt, die mit 50 Mikroliter Trypsin-Lösung vorgefüllt wurden.
Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten werden die dissoziierten
Zellen von jedem Klon weiter in 96-Napf-Mikrotiterplatten, die mit Mitomycin-C-inaktivierten
embryonalen Feeder-Zellen vorbeschichtet waren, übergeführt und mehrere Tage lang in
ES-Zellkulturmedium, das PD098059 enthält, kultiviert. Nach dieser
Anfangskulturphase werden die Klone jeder Platte aufgeteilt und
auf zwei 96-Napf-Kulturplatten verteilt, von denen eine eine Schicht
von embryonalen Feeder-Zellen enthält, während die andere Platte mit
einer Gelatinelösung
vorbeschichtet ist. Nach einer dreitägigen Expansionsphase wird
das Kulturmedium in der Platte, die die Feeder-Schicht enthält, durch
Gefriermedium ersetzt, und die Platten werden als Gefriergut bei –80 °C aufbewahrt.
Die zweite, gelatinebeschichtete Platte wird weitere zwei Tage lang
kultiviert, bis die ES-Zellen Konfluenz erreichen. Dann wird genomische
DNA aus diesen Klonen isoliert, mit dem Restriktionsenzym EcoRI
abgebaut, durch Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt und durch Kapillarübertragung
auf Nylonmembranen übertragen.
Diese Southern-Blot-Membranen
werden mit der Y-Chromosomen-spezifischen 1,5-kb-DNA-Sonde aus dem
Plasmid pY353 (Bishop C.E. und Hatat D., Molecular cloning and sequence
analysis of a mouse Y chromosome RNA transcript expressed in the
testis, Nucleic Acids Res. 15, 2959-2969 (1987)) hybridisiert. Während die überwiegende
Mehrzahl von Klonen (98-99%) ein starkes Y-Chromosom-spezifisches Signal
aufweist, zeigt eine Minderheit der Klone (1-2%) kein Signal, vermutlich
aufgrund eines spontanen Verlusts des Y-Chromosoms, der im Vorläufer der
Zelle auftrat, die eine Y-negative Kolonie bildete. Die letzteren
Klone werden aus der eingefrorenen Aufbewahrungsplatte zurückgewonnen
und in Kulturmedium, das PD098059 enthält, weiter expandiert. Um zu
bestätigen,
dass diese Klone nur einen Verlust des Y-Chromosoms erlitten, wird
ihr Karyotyp durch Chromosomenzählung
von Giemsa-gefärbten
Metaphasen charakterisiert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
Klone, die eine Mehrzahl von Metaphasen mit 39 Chromosomen aufweisen,
sind als weibliche Zelllinien mit einem 39,X0-Karyotyp definiert. Diese X0-ES-Zellen
werden dann verwendet, um durch Injektion in tetraploide Blastocysten
weibliche transgene ES-Mäuse
zu erzeugen, wie im Folgenden näher
beschrieben ist. Männliche
ES-Mäuse
mit demselben Genotyp wie die X0-ES-Weibchen können aus der parentalen männlichen
ES-Zellpopulation
erzeugt werden, die verwendet wurde, um die seltenen weiblichen
Zellen zu isolieren. Dann wurden männliche ES-Mäuse mit
einem 40XY-Karyotyp und weibliche ES-Mäuse mit einem 39X0-Karyotyp,
aber demselben Genotyp, miteinander gepaart, was zu 25% Nachkommen
führt,
die homozygot bezüglich
der genetischen Veränderung
sind, die in die parentale männliche
ES-Zelllinie eingeführt
wurde. Dieses Verfahren zur Erzeugung von homozygoten ingezüchteten
Mausmutanten beinhaltet nur einen einzigen Zuchtschritt und spart
somit Zeit im Vergleich zu dem Standardverfahren über chimäre Mäuse, das
zwei Zuchtschritte erfordert.