DE60220168T2

DE60220168T2 - Verfahren zur identifizierung von hiv rt-dimerisation-inhibitoren

Info

Publication number: DE60220168T2
Application number: DE60220168T
Authority: DE
Inventors: Nicolas Pittsburgh SLUIS-CREMER; Michael Pittsburgh PARNIAK; Alex Laval PELLETIER
Original assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Current assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Priority date: 2001-07-27
Filing date: 2002-07-26
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2022-07-27
Also published as: JP4409287B2; JP2004535832A; EP1415006A2; AU2002355761A1; WO2003012127A2; CA2450871A1; DK1415006T3; DE60220168D1; US20030087379A1; WO2003012127A3; ES2284893T3; US6811970B2; CA2450871C; EP1415006B1; ATE362550T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Test zum Messen des Vorgangs der Dimerisierung von HIV-1-reverser Transkriptase (RT). Die Erfindung betrifft insbesondere ein neues Verfahren, das sich zur Anpassung dieses Vorgangs an ein Screening mit hohem Durchsatz eignet.
Hintergrund der Erfindung
Reverse Transkriptase (RT) des humanen Immunschwächevirus vom Typ 1 (HIV-1) spielt eine Schlüsselrolle bei der Replikation von HIV durch Umwandlung von einzelsträngiger genomischer RNA in doppelsträngige provirale DNA und stellt eines der Hauptziele für die Entwicklung einer AIDS-Therapie dar. Die meisten Inhibitoren von RT, die in den vergangenen Jahren beschrieben wurden, zielen unabhängig davon, ob es sich um Nucleosid-Analoge oder um Nichtnucleosid-Inhibitoren handelt, auf die Polymerase-Aktivität von RT ab, sind aber mit einigen Einschränkungen verbunden, wozu die Toxizität und das Auftreten von resistenten Stämmen gehören.
Die biologisch relevante und aktive Form von HIV-RT, die in infektiösen Virionen auftritt, ist ein Heterodimeres, das zwei Polypeptide, nämlich p66 und p51, enthält. Das letztgenannte Produkt entsteht aus dem erstgenannten Produkt durch proteolytische Spaltung der C-terminalen Domäne während der viralen Reifung. Die beiden Untereinheiten der 66- und 51 kDa-Form sind in einem Verhältnis von 1:1 vorhanden. Diese heterodimere RT wird in einem zweistufigen Dimerisierungsprozess gebildet, dessen Kinetik die rasche Assoziation der beiden Untereinheiten zu einem unreifen Dimeren umfasst, wonach sich eine langsame Konformationsänderung unter Bildung der vollständig aktiven Form anschließt (p66 + p51 → p66/p51 unreif → p66/p51 aktiv; Divita et al., J. Mol. Biol., Bd. 245 (1995), S. 508-521, 12, 13).
Die DNA-Polymerase- und RNase H-Aktivitäten von HIV-1-RT sind von der dimeren Struktur des Enzyms abhängig (Restle et al., J. Mol. Biol. Chem., Bd. 265 (1990), S. 8986-8988; Restle et al., FEBS Letters, Bd. 300 (1992), S. 97-100). Da die Dimerisierung dieser Untereinheiten für die enzymatische Aktivität erforderlich ist, könnte eine Störung der Dimerisierung von HIV-1-RT ein geeignetes Ziel für die Entwicklung von anti-HIV-Verbindungen darstellen. Ein Beispiel: synthetische Peptide aus der Daumendomäne der p51-Untereinheit von RT hemmen den "Reifungsprozess" (Morris et al., Biochemistry, Bd. 38 (1999), S. 15097-15103). Verbindungen, die die Bildung und/oder Stabilität des RT-Dimeren hemmen, könnten daher eine neuartige Klasse von antiviralen Verbindungen bilden.
Mehrere Veröffentlichungen beschreiben Assoziations-Dissoziations-Tests zum Messen der Kinetik des p51-p66-Dimerisierungsvorgangs (Cabodevilla et al., Eur. J. Biochem., Bd. 268 (2001), S. 1163-1172; Morris et al., J. Biol. Chem., Bd. 274 (35) (1999), S. 24941-24946; Divita et al., Biochemistry, Bd. 34 (1995), S. 16337-16346; Divita et al., J. Biol. Chem., Bd. 269 (18) (1994), S. 13080-13083; Divita et al., FEBS Letters, Bd. 324 (2) (1993), S. 153-158; Becerra et al., Biochemistry, Bd. 30 (1991), S. 11707-11719). Dabei wird durchweg die Dimerisierung gemessen durch: Größenausschluss-HPLC; Messen der RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität der Probe; Immunopräzipitation; oder Überwachung der intrinsischen Fluoreszenzemission des Proteins. Keine dieser Veröffentlichungen beschreibt einen Bindungstest, der sich für das HTS-Format eignet.
Tachedjian et al., PNAS, Bd. 97 (12) (2000), S. 6334-6339, beschreiben ein Hefe-2-Hybridsystem zur Untersuchung des Assoziations-Dissoziations-Vorgangs der RT-Dimerisierung. Jedoch ist dieses System nicht leicht einem Test mit hohem Durchsatz zur Bestimmung einer großen Anzahl von potentiellen Inhibitoren zugänglich.
Howard et al., J. Biol. Chem., Bd. 266 (34) (1991), S. 23003-23009, schlagen ein Testsystem zur Überwachung therapeutischer Mittel vor, das durch eine Verhinderung der Dimerbildung wirkt. Auch diese Veröffentlichung beschreibt keinen Bindungstest, der für ein Screening mit hohem Durchsatz ausgestaltet werden kann und sich für die Identifizierung von potentiellen Inhibitoren der Heterodimerisierung eignet.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen Test mit hohem Durchsatz bereit, der sich zum Testen einer großen Anzahl von Verbindungen auf ihre Aktivität gegen die Dimerisierung von HIV-RT eignet. Das allgemeine Prinzip des erfindungsgemäßen Tests beinhaltet die Dissoziation eines p66/p66-RT-Homodimeren (in geeigneter Weise mit einem nachweisbaren Rest markiert und/oder affinitätsmarkiert) in Gegenwart von limitierenden Konzentrationen eines Dissoziationsmittels (d. h. eines Denaturierungsmittels, wie Harnstoff), das Kontaktieren mit der p51-RT-Untereinheit und das Inkubieren des Gemisches in Gegenwart von überschüssigem, von Denaturierungsmittel freiem (oder mit einem verringerten Gehalt an Denaturierungsmittel) Puffer, um die Reassoziation der RT-Untereinheiten zu ermöglichen, wonach etwaiges rekonstituiertes p51/p66-RT-Heterodimeres aufgrund von Affinität abgefangen wird. Nach Waschen zur Entfernung von ungebundenem Material wird die Menge des affinitätsassoziierten Materials bestimmt, indem man die Konzentration eines nachweisbaren Restes misst (oder alternativ indem man die rekonstituierte RT-Polymerase-Aktivität misst, wobei in diesem Fall die p66-Untereinheit nicht notwendigerweise einer Markierung bedarf), wobei der Wert proportional zur Menge des markierten p66/p51-RT-Heterodimeren ist, das durch Affinität gebunden ist. Dieser Test wird in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung durchgeführt, wobei eine Modulation (Abnahme/Zunahme) der Bindung der p66-Monomeruntereinheit an die p51-Untereinheit in Gegenwart der Testverbindung im Vergleich zur Kontrolle ein Anzeichen dafür darstellt, dass es sich bei der Testverbindung um einen Modulator der RT-Dimerisierung handelt.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Messen der Heterodimerisierung von HIV-RT bereitgestellt, das die folgenden Stufen umfasst:

a) Bereitstellen einer ersten Lösung, die p66-Untereinheit-Homodimere in Gegenwart eines Dissoziationsmittels umfasst;
b) Kontaktieren der ersten Lösung mit p51-RT-Untereinheiten und Inkubieren in Gegenwart eines Reassoziationspuffers, um die Assoziation eines Komplexes von p66/p51-RT-Untereinheiten zu ermöglichen, wobei eine der Untereinheiten eine Affinitätsmarkierung umfasst und die andere der Untereinheiten eine detektierbare Markierung umfasst;
c) Kontaktieren des Inkubationsgemisches von Stufe b) mit einem Affinitätsmedium unter Bedingungen, die es dem p66/p51-Komplex ermöglichen, an das Affinitätsmedium zu binden; und
d) Bestimmen der Menge des gebildeten Komplexes durch Messen der Konzentration der an das Affinitätsmedium gebundenen detektierbaren Markierung (oder durch Messen der rekonstituierten RT-Polymerase-Aktivität).

Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die zur Modulation der HIV-RT-Heterodimerisierung befähigt sind, bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
das Ausführen der vorstehenden Stufen a) bis d) in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung; und

e) das Vergleichen der Testverbindungsprobe mit einer Kontrollprobe, in der diese Verbindung fehlt, wobei die Bildung des modulierten p66/p51-Komplexes in der Testverbindungsprobe ein Anzeichen für die Fähigkeit dieser Verbindung zur Modulation der Heterodimerisierung ist.

Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die zur Störung der HIV-RT-Heterodimerisierung befähigt sind, bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
das Durchführen der vorstehenden Stufen a) bis d) in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung; und

e) das Vergleichen der Testverbindungsprobe mit einer Kontrollprobe, in der diese Verbindung fehlt, wobei eine verringerte Bildung des p66/p51-Komplexes in der Testverbindungsprobe ein Anzeichen für die Fähigkeit dieser Verbindung zur Hemmung der Heterodimerisierung ist.

Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die zur Verstärkung der HIV-RT-Heterodimerisierung befähigt sind, bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
das Durchführen der vorstehenden Stufen a) bis d) in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung; und

e) das Vergleichen der Testverbindungsprobe mit einer Kontrollprobe, in der diese Verbindung fehlt, wobei die erhöhte Bildung des p66/p51-Komplexes in der Testverbindungsprobe ein Anzeichen für die Fähigkeit dieser Verbindung zur Verstärkung der Heterodimerisierung ist.

Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Messung der Homodimerisierung von HIV-RT bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

a) Bereitstellen einer ersten Lösung, die erste p66-Untereinheit-Homodimere in Gegenwart eines Dissoziationsmittels umfasst;
b) Kontaktieren der ersten Lösung mit zweiten p66-Untereinheit-Homodimeren in Gegenwart eines Dissoziationsmittels und inkubieren in Gegenwart eines Reassoziationspuffers, um die Assoziation eines RT-Komplexes von p66/p66-RT-Untereinheiten zu ermöglichen, wobei eine der Untereinheiten eine Affinitätsmarkierung umfasst und die andere der Untereinheiten eine detektierbare Markierung umfasst;
c) Kontaktieren des Inkubationsgemisches von Stufe b) mit einem Affinitätsmedium unter Bedingungen, die es dem p66/p66-Komplex ermöglichen, an das Affinitätsmedium zu binden; und
d) Bestimmen der Menge des gebildeten Komplexes durch Messen der Konzentration der an das Affinitätsmedium gebundenen detektierbaren Markierung (oder durch Messen der rekonstituierten RT-Polymerase-Aktivität).

Gemäß einem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die zur Modulation der HIV-RT-Homodimerisation befähigt sind, bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
das Durchführen der vorstehenden Stufen a) bis d) in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung; und

e) das Vergleichen der Testverbindungsprobe mit einer Kontrollprobe, in der diese Verbindung fehlt, wobei die Bildung des modulierten p66/p66-Komplexes in der Testverbindungsprobe ein Anzeichen für die Fähigkeit dieser Verbindung zur Modulation der Homodimerisierung ist.

Gemäß einem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die zur Störung der HIV-RT-Homodimerisierung befähigt sind, bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
das Durchführen der vorstehenden Stufen a) bis d) in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung; und

e) das Vergleichen der Testverbindungsprobe mit einer Kontrollprobe, in der diese Verbindung fehlt, wobei eine verringerte Bildung des p66/p66-Komplexes in der Testverbindungsprobe ein Anzeichen für die Fähigkeit dieser Verbindung zur Hemmung der Homodimerisierung ist.

Gemäß einem achten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die zur Verstärkung der HIV-RT-Homodimerisierung befähigt sind, bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
das Durchführen der vorstehenden Stufen a) bis d) in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung; und

e) das Vergleichen der Testverbindungsprobe mit einer Kontrollprobe, in der diese Verbindung fehlt, wobei die erhöhte Bildung des p66/p66-Komplexes in der Testverbindungsprobe ein Anzeichen für die Fähigkeit dieser Verbindung zur Verstärkung der Homodimerisierung ist.

Gemäß einem neunten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Kit zum Testen von Verbindungen, die potentiell die HIV-RT-Heterodimerisierung modulieren, bereitgestellt, wobei das Kit eine Mehrzahl von affinitätsmarkierten p66-Untereinheit-Homodimeren, eine Mehrzahl von markierten p51-RT-Untereinheiten, ein Dissoziationsmittel, einen Reassoziationspuffer und ein Affinitätsmedium umfasst.
Gemäß einem zehnten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Kit zum Testen von Verbindungen, die potentiell die HIV-RT-Homodimerisierung modulieren, bereitgestellt, wobei das Kit eine Mehrzahl von affinitätsmarkierten p66-Untereinheit-Homodimeren, eine Mehrzahl von markierten p66-RT-Untereinheiten, ein Dissoziationsmittel, einen Reassoziationspuffer und ein Affinitätsmedium umfasst.
Weitere Ziele, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich beim Studium der folgenden, nichtbeschränkenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, wobei diese Ausführungen beispielhaft sind und nicht als eine Beschränkung des Schutzumfangs der Erfindung anzusehen sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Im Anschluss an die vorstehende allgemeine Beschreibung wird auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen, in denen eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dargestellt ist.
1 erläutert den Einfluss der Harnstoffkonzentration auf die Struktur des HIV-1-p66/p66-RT-Proteins. Das Feld A erläutert die Veränderung der maximalen Wellenlänge der intrinsischen Protein-Fluoreszenzemission als Funktion der Harnstoffkonzentration. Die Zunahme des F350/335-Verhältnisses zeigt eine erhöhte Exposition von normalerweise "verborgenen" Tryptophanresten mit wässrigem Lösungsmittel. Das Feld B erläutert die Ergebnisse von Zirkulardichroismus-Analysen. Die Zunahme der molaren Elliptizität bei 222 nm stellt ein Maß für den Verlust an sekundärer RT-Struktur dar. Das Feld C zeigt die Veränderung der 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure (ANS)-Bindung an RT, die mit der Unversehrtheit der Untereinheit des RT-Dimeren korreliert.
2 erläutert den Dimerisierungszustand der p66-Untereinheit als Funktion der Harnstoffkonzentration bei Bestimmung durch Größenausschluss-Chromatographie.
3 erläutert die Optimierung der Harnstoffkonzentration zur Verwendung im TRF-Test (zeitlich aufgelöster Fluoreszenztest) zur Bildung des HIV-1-RT-p66/p51-Heterodimeren.
4 erläutert das spezifische TRF-Signal als eine Funktion der Zeit im Anschluss an eine Verdünnung von mit Harnstoff denaturierter Hisox-p51-RT-Untereinheit und Eu-NI-Iodacetamidochelat-markierter p66-RT-Untereinheit in "Untereinheitsassoziationspuffer" mit einem Gehalt an 100 mM MgCl₂. Die Einzelheiten sind in den Beispielen beschrieben.
5 erläutert das Testkonzept (Feld A) und die Hemmung der HIV-1-RT-Dimerisierung durch TSAO-m³T und anderen NNRTIs (Feld B) bei Messung durch TRF.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Definitionen
Wenn nichts anderes angegeben ist, haben sämtliche technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die hier verwendet werden, die gleichen Bedeutungen, wie sie üblicherweise dem Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet geläufig sind.
Die hier verwendeten Ausdrücke "Markierung", "detektierbare Markierung" oder "detektierbarer Marker" beziehen sich auf beliebige Gruppen, die mit p66 oder p51 verknüpft sein können, um entweder direkt oder indirekt die Erkennung der Untereinheit zu ermöglichen, so dass sie nachgewiesen, gemessen und quantitativ bestimmt werden kann. Zu Beispielen für derartige "Markierungen" gehören (ohne Beschränkung hierauf) fluoreszierende Markierungen, chemilumineszierende Markierungen, kolorimetrische Markierungen, enzymatische Marker, radioaktive Isotope und Affinitätsmarkierungen, wie Biotin. Derartige Markierungen werden gemäß bekannten Verfahren an p66 oder p51 angebracht. Eine Markierung oder mehrfache Markierungen gemäß der Erfindung können in einer beliebigen Position in p66 oder p51 eingeführt werden. Beispielsweise kann die Markierung entweder am C- oder am N-Terminus oder innerhalb der Hauptkette des Proteins eingeführt werden.
Der hier verwendete Ausdruck "Affinitätsmarkierung" bezieht sich auf eine Markierung, die spezifisch von einem komplementären Affinitätsliganden eingefangen wird. Zu Beispielen für Paare von Affinitätsmarkierung/Affinitätsligand gehören (ohne Beschränkung hierauf) Maltose-Bindungsprotein (MBP)/Maltose; Glutathion S-transferase (GST)/Giutathion; Streptavidin-Markierung/Streptavidin oder Neutravidin; oder Histidin (His)/Metall. Das als Affinitätsligand verwendete Metall kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Kobalt, Zink, Kupfer, Eisen und Nickel besteht (Wong et al., Separation and Purification Methods, Bd. 20(1) (1991), S. 49-106). Die erfindungsgemäße Affinitätsmarkierung kann an einer beliebigen Position von p66 oder p51 eingeführt werden, beispielsweise kann die Markierung entweder am C- oder am N-Terminus oder innerhalb der Hauptkette des Proteins angebracht werden, wobei es vorzugsweise am N-Terminus des Proteins angebracht wird. Vorzugsweise handelt es sich beim gewählten Metall um Nickel. Der Affinitätsligand kann in fester Phase dargereicht werden, z. B. in Form von Perlen, Vertiefungen von Mikroplatten oder Säulen, um die Trennung durch Affinitätschromatographie zu erleichtern. Derartige Affinitätsmarkierungen können nach bekannten Verfahren auf rekombinantem Wege in p66 oder p51 eingeführt werden.
Die Ausdrücke "Monomeres" und "monomeres" p66 oder "monomere" Untereinheit beziehen sich auf eine einzelne Untereinheit von dimerem p66. Die monomere Untereinheit kann eine genaue Kopie der natürlich auftretenden monomeren Untereinheit darstellen oder es kann sich entweder um ein biologisch aktives Analoges oder um ein biologisch inaktives Analoges (negative Dominante) handeln.
Der hier verwendete Ausdruck "Untereinheit" bedeutet bei Bezugnahme auf p66 oder p51 einen oder zwei Bestandteile von homodimerem RT (p66/p66) oder von heterodimerem RT (p66/p51).
Der hier verwendete Ausdruck "Homodimeres" bezieht sich auf ein dimeres Molekül, wobei beide Untereinheiten gleich sind, z. B. p66/p66.
Der hier verwendete Ausdruck "Homodimerisierung" bezieht sich auf den Vorgang, durch den gleiche Untereinheiten nämlich p66, dimerisieren.
Der hier verwendete Ausdruck "Heterodimeres" bezieht sich auf ein dimeres Molekül, bei dem die beiden Untereinheitsbestandteile verschieden sind, z. B. p66 und p51.
Der hier verwendete Ausdruck "Heterodimerisierung" bezieht sich auf den Vorgang, durch den zwei verschiedene Untereinheiten, nämlich p66 und p51, dimerisieren.
Der hier verwendete Ausdruck "Dissoziationsmittel" bezieht sich auf eine Substanz, die dazu befähigt ist, die Dissoziation eines Komplexes aus mehreren Bestandteilen in seine einzelnen Untereinheiten zu bewirken.
Der Ausdruck "Reassoziationspuffer" bezieht sich auf einen Puffer, der die Assoziation von einzelnen Untereinheiten zu einem Multikomponentenkomplex begünstigt.
Der hier verwendete Ausdruck "denaturierungsfrei" bezieht sich auf Bedingungen, bei denen das Dissoziationsmittel nicht mehr in Mengen vorhanden ist, die zur Verhinderung der Assoziation des Großteils der Untereinheiten ausreichen.
Der hier verwendete Ausdruck "Affinitätsmedium" bezieht sich auf einen festen Träger, wie Vertiefungen von Mikroplatten, Perlen oder Säulen, die mit einem Affinitätsliganden beschichtet sind, der sich zum Abfangen einer Affinitätsmarkierung eignet.
Bevorzugte Ausführungsformen
sGemäß einem ersten bevorzugten Aspekt der ersten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Messen der Heterodimerisierung von HIV-RT bereitgestellt, wobei vorzugsweise die erste Lösung in Stufe a) einen Puffer umfasst, der aus Tris-HCl, HEPES oder Bis-Tris ausgewählt ist. Insbesondere handelt es sich beim Puffer um Tris-HCl in einer Konzentration von 0 mM bis 50 mM. Ganz besonders handelt es sich beim Puffer um Tris-HCl in einer Konzentration von 25 mM.
Vorzugsweise umfasst die erste Lösung in Stufe a) ferner ein Salz, das aus Na₂SO₄ oder MgCl₂ ausgewählt ist. Insbesondere handelt es sich beim Salz um MgCl₂ in einer Konzentration von 0 mM bis 100 mM.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der ersten Ausführungsform von Stufe a) wird das Dissoziationsmittel aus Harnstoff, Guanidinium-HCl oder Acetonitril ausgewählt. Insbesondere handelt es sich beim Dissoziationsmittel um Harnstoff in einer Konzentration von 1 bis 3,5 M.
Vorzugsweise handelt es sich beim Reassoziationspuffer in Stufe b) um den gleichen Puffer wie er zur Dissoziation der p66/p66-Untereinheiten verwendet wird, der aber vorzugsweise frei von Denaturierungsmittel ist. Insbesondere ist der Reassoziationspuffer in einer im Verhältnis zum Denaturierungspuffer überschüssigen Menge vorhanden, um das Dissoziationsmittel in ausreichendem Maße zu verdünnen, um eine Reassoziation von p66- und p51-Untereinheiten zu ermöglichen. Insbesondere wird der Reassoziationspuffer in einem 10-fachen Überschuss zum Dissoziationspuffer zugegeben.
Vorzugsweise umfasst der Reassoziationspuffer in Stufe b) ferner ein Salz, das aus Na₂SO₄ oder MgCl₂ ausgewählt ist. Insbesondere handelt es sich beim Salz um Na₂SO₄ in einer Konzentration von 0 mM bis 100 mM. Ganz besonders handelt es sich beim Salz um Na₂SO₄ in einer Konzentration von 50 mM.
Vorzugsweise ist das p51 in Stufe b) affinitätsmarkiert oder weist eine nachweisbare Markierung auf. Insbesondere ist das p51 in Stufe b) affinitätsmarkiert.
Vorzugsweise weist das p66 in Stufe b) eine nachweisbare Markierung auf oder ist affinitätsmarkiert. Insbesondere weist das p66 in Stufe b) eine nachweisbare Markierung auf.
Vorzugsweise wird die Affinitätsmarkierung in Stufe b) aus der Gruppe ausgewählt, die aus einer Hexahistidin-Markierung, FLAG, T7, HA, GST oder Biotin besteht. Insbesondere handelt es sich bei der Affinitätsmarkierung um Hexahistidin.
Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt der ersten Ausführungsform in Stufe b) ist die nachweisbare Markierung aus der Gruppe ausgewählt, die aus folgenden Bestandteilen besteht: eine fluoreszierende Markierung (z. B. Fluorescein, Oregon-Grün, Rhodamin, Texas-Rot, Phycoerythrin oder Eu³⁺), ein radioaktives Atom (wie ³H oder ¹²⁵I), eine chemilumineszierende Markierung (wie Luciferase), ein nachweisbarer Antikörper, der spezifisch für p66 oder spezifisch für eine an p66 angebrachte Markierung ist (vorzugsweise wird die Markierung an p66 aus der Gruppe ausgewählt, die aus einer Hexahistidin-Markierung, FLAG, T7, HA, GST oder Biotin besteht) und ein enzymatischer Marker (z. B. β- Galactosidase oder Meerrettich-peroxidase). Insbesondere handelt es sich bei der Markierung um eine fluoreszierende Markierung, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Fluorescein, Oregon-Grün, Rhodamin, Texas-Rot, Phycoerythrin und Eu³⁺). Insbesondere handelt es sich bei der fluoreszierenden Markierung um Eu³⁺ Vorzugsweise wird die nachweisbare Markierung in Stufe b) an einen Cysteinrest addiert, der auf rekombinantem Wege anstelle eines Prolinrestes am N-Terminus von p66 angebracht wird.
Die nachweisbare Markierung wird durch geeignete Mittel gemessen, z. B. mit einem Fluorimeter, einem Radioaktivitätszählgerät, einem Kolorimeter oder einem Chemiluminometer, wie es für den Fachmann leicht ersichtlich ist.
Bei einem weiteren bevorzugten Aspekt der ersten Ausführungsform handelt es sich in Stufe c) beim Affinitätsmedium um eine feste Phase, z. B. um Vertiefungen von Mikroplatten oder Perlen, die mit einem Affinitätsliganden beschichtet sind, der sich zum Abfangen der Affinitätsmarkierung eignet. Insbesondere sind die Vertiefungen der Mikroplatte mit einem Rezeptor beschichtet, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ni²⁺, anti-Markierungs-Antikörpern, Glutathion oder Streptavidin besteht. Insbesondere sind die Vertiefungen der Mikroplatte mit Ni²⁺ markiert und vorzugsweise handelt es sich bei der Affinitätsmarkierung um eine Histidinmarkierung. Für den Fachmann sind geeignete Kombinationen von Affinitätsmarkierung und Affinitätsliganden ersichtlich.
Bei einem bevorzugten Aspekt der ersten Ausführungsform umfasst die Stufe d) ferner eine Waschstufe, um ungebundenes Material zu entfernen, wobei die Menge an mit der Markierung assoziiertem Affinitätsmedium auf geeignete Weise gemessen wird (oder wobei die Polymerase-Aktivität der rekonstituierten RT gemessen wird), wobei am Affinitätsmedium gebundenes Material proportional zur Menge an markiertem p51/p66-RT-Heterodimeren ist.
Wie für den Fachmann leicht ersichtlich ist, kann die Abfolge der Ereignisse beim Test, der zur Inkubation des p66-Monomeren und des p51 führt, unter Erzielung des gleichen Ergebnisses modifiziert werden. Beispielsweise kann die p51-RT-Untereinheit an einer festen Phase immobilisiert werden, bevor sie mit der p66-Untereinheit inkubiert wird. Gleichermaßen kann die Verdünnung des Puffers, der die Assoziation der Untereinheit fördert, zum gleichen Zeitpunkt wie das Vermischen der p66- und p51-Untereinheiten stattfinden oder sie kann erfolgen, nachdem die p66-Lösung in Kontakt mit p51 gebracht worden ist.
Gleichermaßen kann der Kontakt der Testverbindung in einer unterschiedlichen Reihenfolge vorgenommen werden, ohne dass das Testprinzip beeinträchtigt wird. Beispielsweise kann die Testverbindung zur Lösung des p66-Homodimeren gegeben werden, bevor die Zugabe des Dissoziationsmittels erfolgt; bevor das Vermischen mit der p51-Untereinheit erfolgt; bevor die Verdünnung mit dem Reassoziationspuffer erfolgt; oder gleichzeitig mit der Verdünnung mit dem Reassoziationspuffer.
Beispiele
Materialien und Methoden
1. RT-Expressionsplasmide
Das Gen für die 51 kDa-Untereinheit von HIV-1-RT (HXB2-Stamm) wurde in das prokaryontische pBAD-HisB-Expressionssystem (Invitrogen) zwischen die XhoI- und HindIII-Restriktionsstellen kloniert, wodurch man pBAD-HisRT51 erhielt. Dieses Konstrukt ermöglicht die durch Arabinose induzierbare Expression der p51-Untereinheit von RT als ein N-terminales Polyhistidin (oxHis)-Fusionsprotein im Anschluss an eine Transformation eines geeigneten bakteriellen Stammes (z. B. E. coli JM109).
Um für die spezifische Markierung der 66 kDa-RT-Untereinheit mit Reagenzien, die einen fluorimetrischen Nachweis ermöglichen, zu sorgen, wurde eine positionsgerichtete Mutagenese unter Verwendung des Quick Change^R-positionsgerichteten Mutagenese-Kits (Stratagene) zur Bildung von P2C/C38S/C280S-RT durchgeführt. Dadurch wurden die beiden Cys-Reste von WT (Wildtyp)-RT (C38, C280) beseitigt und ein einziger Cys-Rest nahe des N-Terminus der Untereinheit wurde inseriert.
Die Gene für den WT und die P2C/C38S/C280S (SEQ ID NO: 1)-66 kDa-Untereinheit von HIV-1-RT wurden in den prokaryontischen pKK223-3-Expressionsvektor (Amersham Pharmacia Biotech) zwischen die EcoRI- und HindIII-Restriktionsstellen kloniert, wodurch man pKK-RT66-WT bzw. pKK-RT66-P2C erhielt. Diese Vektoren sorgen für die IPTG-abhängige Expression der nicht-HIS-markierten 66 kDa-RT-Untereinheit.
2. Reagenzien für den TRF-Test der RT-Dimerbildung
Delfia-Eu-N1-Iodacetamido-Chelat und Eu³⁺-Standard, Delfia Enhancement Solution und Delfia-Waschkonzentrat wurden von der Fa. Perkin Elmer bezogen.
Ultrareiner Harnstoff, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan und Wasser wurden von der Fa. Fluka bezogen. Magnesiumchlorid (SigmaUltra) und Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) wurden von der Fa. Sigma bezogen.
Ni-NTA-HisSorb-Platten mit 96 Vertiefungen (weiß) wurden von den Firmen Qiagen oder Pierce bezogen. Fluoreszenzmessungen wurden mit einem SpectraMAX GeminiXS-Mikroplatten-Fluorimeter (Molecular Devices) durchgeführt.
3. Expression und Reinigung des RT-p51-Untereinheit-Monomeren und des RT-p66/p66-Homodimeren
E. coli JM109, das mit pBAD-HisRT51 transformiert war, wurde bei 37 °C in "Terrific broth" bis zur mittleren logarithmischen Phase (0D₆₀₀ von 0,5) gezüchtet. Die Expression von p51-RT wurde sodann durch Zusatz von 1% Arabinose induziert. Nach weiterer 3-stündiger Inkubation wurden Zellen durch Zentrifugation geerntet und unter Verwendung des BugBuster^R-Proteinextraktionsreagenz (Novagen) lysiert. Die p51-RT wurde aus dem Lysat durch Ni²⁺-NTA-Affinitätschromatographie unter Verwendung von His-Bind Resin (Novagen) gereinigt. Sowohl die Lysis als auch die Extraktion wurden gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Nach Flution aus Ni²⁺-NTA-Harz wurde p51-RT einem Pufferaustausch in 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5, 4 °C) mit einem Gehalt an 60 mM MgCl₂ und 50% Glycerin durch zwei Passagen über eine NAP^R25-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) unterzogen. Die endgültige Proteinprobe wurde in Aliquotmengen bei –80°C aufbewahrt. Gereinigte p51-RT kommt vorwiegend als ein Monomeres vor.
Die Expression von WT- und mutanter p66-RT wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG zu 1 Liter von etwa bis zur mittleren logarithmischen Phase transformierten E. coli-JM109-Zellen (gezüchtet in "Terrific broth" bei 37 °C) induziert. Nach Zugabe von IPTG wurde die Züchtung der Bakterien bei 32 °C für weitere 5 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet. Die Reinigung der p66-RT wurde gemäß Literaturangaben durchgeführt (Fletcher et al, "Single step purification of HIV-1 recombinant wild type and mutant reverse transcriptase", Protein Expression & Purification, Bd. 7 (1996), S. 27-32). Gereinigte p66-RT liegt vorwiegend als ein Homodimeres vor.
4. Alkylierung von P2C/C38S/C280S-p66/p66-RT mit dem Eu³⁺-N1-Iodacetamido-Chelat
Gereinigte P2C/C38S/C280S-p66/p66-RT wurde bei Raumtemperatur in etwa 20 μM (~2,5 mg/ml) in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,9, 20 °C) mit einem Gehalt an 100 mM NaCl und 1 mM TCEP-HCl (Tris-(2-carboxyethyl)-phosphinhydrochlorid (Pierce)) eingeengt. Eine Aliquotmenge von Eu-N1-Iodacetamido-Chelat-Protein-Modifikationsreagenz (hergestellt als eine 5 mM Vorratslösung in DMSO) wurde zugesetzt, um einen etwa 20-fach molaren Überschuss relativ zur p66-Untereinheit-Konzentration zu erreichen. Man ließ die Alkylierungsreaktion 6 Stunden bei Raumtemperatur ablaufen. Alternativ kann die Umsetzung über Nacht bei 4 °C durchgeführt werden. Nach Beendigung der Umsetzung wurde überschüssiges DTT zugesetzt, um nicht-umgesetztes Eu-N1-Iodacetamido-Chelat zu verbrauchen. Die alkylierte p66/p66-RT wurde vom DTT-Reagenz- Konjugat durch zwei Passagen über eine NAP^R 25-Säule, die mit einem 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,5, 20 °C) mit einem Gehalt an 60 mM MgCl₂ und 50% Glycerin äquilibriert worden war, abgetrennt. Die Stöchiometrie der Markierung lag im allgemeinen zwischen 0,7 und 1 mol Eu-N1-Iodacetamid pro mol p66-RT-Untereinheit (d. h. 1,5-2 mol/mol p66/p66-RT-Homodimeres).
Die kinetische Charakterisierung der mutanten und der chemisch modifizierten RT-Proteine zeigte, dass die P2C/C38S/C280S-p66/p66-RT eine vergleichbare RNA-abhängige, spezifische DNA-Polymerase (RDDP)-Aktivität des WT-p66/p66-homodimeren Enzyms aufwies (Daten nicht aufgeführt). Die P2C/C38S/C280S-p66/p66-RT, die chemisch mit dem Eu-N1-Iodacetamido-Chelat alkyliert worden ist, behält etwa 80% der RDDP-Aktivität des unmodifizierten Proteins (Tabelle 1). Ferner ist die modifizierte RT gleichermaßen empfindlich gegenüber einer Hemmung durch TSAOe³T (Tabelle 2) wie die unmodifizierte P2C/C38S/C280S-p66/p66-Mutante, die ihrerseits die gleiche Empfindlichkeit wie WT-p66/p66-RT aufweist (Daten nicht aufgeführt). Somit scheinen die genetischen und chemischen Manipulationen von RT, die zur Herstellung von Reagenzien für den Dimerisierungstest erforderlich sind, nur einen geringen Einfluss auf die Reaktion des Enzyms innerhalb der Parameter des Testverfahrens auszuüben. Tabelle 1 Spezifische RNA-abhängige DNA-Polymerase (RDDP)- und DNA-abhängige DNA-Polymerase (DDDP)-Aktivität von P2C/C38S/C280S-p66/p66-RT

Polymerase-Substrat % Aktivität relativ zu unmarkiertem p66/p66

Eu³⁺-markiertes p66/p66

Poly rC:dG 80

Poly rA:dT 77

Poly dC:dG 73

Tabelle 2 Hemmung von P2C/C38S/C280S-p66/p66-RT durch HIV-RT-Inhibitoren

Inhibitor IC₅₀ (μM)

unmarkiertes p66/p66 Eu³⁺-markiertes p66/p66

Nevirapin 1 1

TSAOe3T 3 3
5. Mikroplattentest zur Überwachung der p66-p51-RT-Dimerisierung
Das allgemeine Prinzip des Tests beinhaltet das Vermischen von Hisox-p51 mit fluorophormarkierter p66-RT in Lösung unter anschließendem Festphasen-Abfangen des erhaltenen His6x-p51/fluorophormarkiertem p66-RT-Heterodimeren an Ni²⁺-NTA-Mikroplatten. Nach Waschen zur Entfernung von ungebundenem Material wurde die Menge an mit der Mikroplatte assoziierter Fluoreszenz mit einem geeigneten Fluoreszenz-Plattenlesegerät gemessen. Altemativ kann die Polymerase-Aktivität der rekonstituierten RT durch Verwendung eines fluoreszierenden RNA-DNA-Interkalators, wie PicoGreen^R, bestimmt werden.
Während gereinigte, rekombinante p51-RT als ein Monomeres vorliegt, ist gereinigte p66-RT vorwiegend dimer. Da die Assoziationsenergie der Untereinheit des p66/p66-RT-Homodimeren nur geringfügig kleiner als die des p51/p66-RT-Heterodimeren ist, wäre die Bildung des Heterodimeren im Anschluss an ein einfaches Vermischen von p51- und p66/p66-RT zu langsam, um in zweckmäßiger Weise einen Test mit hohem Durchsatz zu ermöglichen. Demzufolge wurde eine Untersuchung angestellt, um den optimalen Typ und die optimale Konzentration des Denaturierungsmittels zu bestimmen, die zur Erzielung der Dissoziation des p66/p66-Homodimeren ohne erheblichen Einfluss auf die sekundäre Proteinstruktur notwendig ist. Es wurde festgestellt, dass Harnstoff ein gegenüber Guanidiniumchlorid überlegenes Denaturierungsmittel darstellt. Der Einfluss der Harnstoffkonzentration auf die p66/p66-Dissoziation und auf die Proteindenaturierung (Veränderung der sekundären Proteinstruktur) ist in 1 dargestellt. Eine Optimierung der Harnstoffkonzentration in Bezug auf eine Maximierung des TRF-Signals im Dimerisierungstestsystem ist in 3 dargestellt.
Eine Harnstoffkonzentration von 1-3,5 M wurde als optimal festgestellt, und zwar auf der Grundlage einer Vielzahl von Daten, darunter die in den 1, 2 und 3 dargestellten Daten. Es gibt eine große Anzahl von Tryptophanresten an der Untereinheitsgrenzfläche von HIV-1-RT. Diese sind im wesentlichen "verborgen" und fluoreszieren daher bei etwa 335 nm, wenn RT bei Wellenlängen von 280-295 nm angeregt wird. Wie aus 1A ersichtlich ist, unterliegen diese Reste mit steigenden Harnstoffkonzentrationen einer zunehmenden Lösungsmittelexposition, wie sich durch die Rotverschiebung von λ_max ^em auf 350 nm zeigt. Bei 3,5 M Harnstoff ist diese Rotverschiebung etwa halbmaximal. Gleichzeitig hat jedoch diese Konzentration von Harnstoff nur einen geringen Einfluss auf die molare Elliptizität von RT (1B), was zeigt, dass die sekundäre Proteinstruktur nicht signifikant verändert wird (d. h. es ist keine signifikante "Denaturierung" des Proteins eingetreten). Dies lässt darauf schließen, dass die erhöhte Lösungsmittelbelastung der Protein-Tryptophanreste sich vorwiegend aus einer Dissoziation der RT-Untereinheiten ergibt. Die Veränderungen in Bezug auf die ANS-Bindung an RT als eine Funktion der Harnstoffkonzentration (1C) stimmen mit dieser Interpretation überein.
2 zeigt die Veränderung des Dimerisierungszustands von p66/p66-RT als Funktion des Harnstoffes, bestimmt durch Größenausschlusschromatographie. Dabei erscheint die Dissoziation des Homodimeren bei 2 M Harnstoff im Wesentlichen vollständig und es findet offensichtlich eine zunehmende Denaturierung/Aggregation des p66-Monomeren statt, da sich der Peak mit steigenden Harnstoffkonzentrationen langsam zu höheren Molekulargewichten verschiebt. 3 zeigt das beim zeitlich aufgelösten RT-Untereinheits-Reassoziationstest erhaltene Signal, wenn markiertes RT-p66/p66-Homodimeres und His-markiertes p51-Monomeres in Harnstoffkonzentrationen von 0 bis 6 M inkubiert wurden, bevor das Gemisch auf die mit Nickel beschichteten Mikroplatten aufgesetzt wurde. Somit wurde eine Harnstoffkonzentration von 1-3,5 M als Konzentrationsbereich gewählt, der vermutlich den höchsten Grad der Reassoziation bei einem geringstmöglichen schädlichen Einfluss auf die sekundäre RT-Struktur ergibt.

Weitere Experimente zeigen, dass eher die Verwendung von 50 mM Na₂SO₄ als von 100 mM MgCl₂ im Renaturierungspuffer in signifikanter Weise das TRF-spezifische Signal gegenüber dem Hintergrund beim Test verstärkt (Tabelle 3). Tabelle 3 Signal/Rausch-Verhältnis beim RT-Dimerisierungstest als Funktion der Salzzusammensetzung des Renaturierungspuffers

Markierung an p66-RT	Salz	Signal/Rausch-Verhältnis
Tetramethylrhodamin	100 mM MgCl₂	2,0
Oregon-Grün	100 mM MgCl₂	3,2
Eu-N1-Iodacetamid (TRF)	100 mM MgCl₂	6,5
Eu-N1-Iodacetamid (TRF)	50 mM Na₂SO₄	10,8

6. Antivirale Aktivität von RT-Untereinheitsunterbrechern und RT-Untereinheitsassoziationsinhibitoren
Testverfahren
Das Konzept des Tests ist in 5A dargestellt. In einem Gesamtvolumen von 20 μl bleiben 100 pmol gereinigte Hisox-p51-RT-Untereinheit und 200 pmol Eu-N1-Iodacetamido-Chelat-markierte p66-RT-Untereinheit (d. h. 100 pmol RT-p66/p66-Homodimeres) mit Harnstoff vermischt (hergestellt in 25 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 20 °C, mit einem Gehalt an 100 mM MgCl₂), wodurch sich eine Endkonzentration von 3, 5 M Harnstoff ergibt. Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Lösung wird in 200 μl einer Lösung der Verbindung von Interesse mit 10 μM (in 25 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 20 °C, mit einem Gehalt an 50 mM Na₂SO₄), die in einer Vertiefung einer Ni-NTA-HiSorb-Platte mit 96 Vertiefungen enthalten ist, verdünnt.
Die Verdünnungsstufe ergibt eine 10-fache Verdünnung zur Verringerung der Harnstoffkonzentration von 3,5 M auf 0,35 M, wodurch die Bildung des RT-p66/p51-Heterodimeren ermöglicht wird. Man lässt die Dimerbildung 6 Stunden ablaufen. Anschließend werden die Platten 3-mal mit Delfia-Waschpuffer mit einem Gehalt an 200 μM DTPA gewaschen. Nach dem Waschen wird jede Vertiefung mit 200 μl Delfia-Verstärkungslösung versetzt, wonach 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wird. Fluoreszenzmessungen werden unter Verwendung eines Molecular Devices SpectraMAX-GeminiXS-1nstruments unter Verwendung von Anregungs-, Emissions- und Ausschlusswellenlängen von 335 nm, 615 nm bzw. 530 nm vorgenommen. Unter Anwendung dieses Formats verringert TSAOm³T das Signal im erfindungsgemäßen Test (5B). TSAOm³T ist ein Mitglied der TSAO-Familie, von dem angenommen wird, dass es die RT-Dimerisierung in ähnlichem Ausmaß wie TSAOe³T hemmt. Ferner sind Nevirapin und Efavirenz zwei Nichtnucleosid-Inhibitoren der reversen Transkriptase, die das Enzym nicht über eine RT-Dimerisierung hemmen. Tatsächlich wird berichtet, dass diese beiden NNRT-Inhibitoren chemische Verstärker der Dimerisierung der HIV-1-RT sind, was eine Hemmung der Polymerase-Aktivität durch nachteilige Konformationsänderungen bewirkt (Tachedjian et al., PNAS, (2001), S. 7188-7193). In diesem speziellen Testformat ergibt das prozentuale Signal relativ zur Kontrolle, das in 5B dargestellt ist, eine Stütze dieser Hypothese und trägt zur Eignung des vorstehenden Tests zum Identifizieren von Inhibitoren/Verstärkern des HIV-RT-Dimerisierungsvorgangs bei.
Alternativ kann die Polymerase-Aktivität der rekonstituierten, reversen p66/p51-Transkriptase gemessen werden. Bei diesem Format werden die erforderlichen Substrate (Templat-Primer, Nucleotid, Magnesiumchlorid) in einem geeigneten Puffer (Tris, pH-Wert 7,8, mit einem Gehalt an DTT, GSH & Chaps) direkt in die Vertiefungen gegeben, woran sich eine 1-stündige Dimerisierungsstufe und eine 1-stündige Inkubation anschließen, wonach das Ausmaß der Polymerisation durch Zugabe eines fluoreszierenden RNA/DNA-Interkalators bestimmt wird. Nachstehend wird ein Beispiel aufgeführt: Das Homodimere p66/p66 (10-20 pmol) wird in Gegenwart von HIS-p51 (25-50 pmol) in 1 M Harnstoff (hergestellt in 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, mit einem Gehalt an 250 mM NaCl) in einem Endvolumen von 10 μl 1 Stunde inkubiert, um die Dissoziation des Homodimeren zu ermöglichen. Anschließend wird eine anfängliche 5-fache Verdünnung (Endvolumen 50 μl) in Reassoziationspuffer (50 mM Tris-acetat, pH-Wert 8,0, 500 mM NaCl, 0,05% Tween-20, 0,01% BSA) mit einer Testverbindung im Assoziationspuffer 1 bis 2 Stunden durchgeführt, um die Bildung des Heterodimeren durch Verringerung der Harnstoffkonzentration auf 200 mM zu ermöglichen. Die letzte Stufe besteht im Abfangen der rekonstituierten His-markierten Heterodimeren, indem man die Probe in die Vertiefungen einer Nickelplatte mit einem Gehalt an 100 μl Reassoziationspuffer überträgt und 1 Stunde inkubiert. Nach 3 Waschzyklen wird ein Polymerase-Testcocktail zugegeben und die Umsetzung wird 1 bis 2 Stunden bei 37 °C durchgeführt, bevor die elongierten RNA/DNA-Produkte mit dem fluoreszierenden Interkalator PicoGreen^R nachgewiesen werden.
7. Alternatives Testformat
Die biologisch relevante und aktive Form von HIV-RT, die in infektiösen Virionen auftritt, ist ein Heterodimeres mit einem Gehalt an den zwei Polypeptiden p66 und p51. Das letztgenannte Produkt leitet sich vom erstgenannten durch proteolytische Spaltung seiner C-terminalen Domäne durch HIV-Protease während der viralen Reifung ab. Die beiden Untereinheiten mit 66 und 51 kDa sind in einem Verhältnis von 1:1 vorhanden. Es wird angenommen, dass diese heterodimere RT in einem zweistufigen Dimerisierungsvorgang gebildet wird, dessen Kinetik die rasche Assoziation der p66- und p51-Untereinheiten zu einem unreifen Dimeren beinhaltet, woran sich eine langsame Konformationsänderung anschließt, die zur vollständig aktiven Form führt (p66 + p51 → p66/p51 (unreif) → p66/p51 (aktiv): Divita et al., J. Mol. Biol., Bd. 245 (1995), S. 508-521, 12, 13).
Jedoch lassen neuere Hinweise auch auf einen alternativen Mechanismus für die Bildung von RT schließen, der zunächst die Homodimerisierung der p66-Untereinheiten zu einem p66/p66-Homodimeren beinhaltet, wonach sich die HIV-Protease-Spaltung zum p66/p51-Heterodimeren anschließt (mündlicher Vortrag, Retrovirus 2001, Cold Spring Harbor, NY, 26. Mai 2001). Zu diesem Zeitpunkt ist unklar, welcher Mechanismus während der viralen Replikation vorherrscht. Screeningtests, die zur Prüfung der einzelnen Wege konzipiert sind, können neue therapeutische Wege eröffnen. Es stellt daher einen weiteren Aspekt der Erfindung dar, Verbindungen zu prüfen, die potentiell die Homodimerisierung von p66-Untereinheiten stören. Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zum Messen der Heterodimerisierung von HIV-RT, umfassend die folgenden Stufen: a) Bereitstellen einer ersten Lösung, die p66-Untereinheit-Homodimere in Gegenwart eines Dissoziationsmittels umfasst; b) Kontaktieren der ersten Lösung mit p51-RT-Untereinheiten und Inkubieren in Gegenwart eines Reassoziationspuffers, um die Assoziation eines rekonstituierten RT-Komplexes von p66/p51-RT-Untereinheiten zu ermöglichen, wobei eine der Untereinheiten eine Affinitätsmarkierung umfasst und die andere der Untereinheiten eine detektierbare Markierung umfasst; c) Kontaktieren des Inkubationsgemisches von Stufe b) mit einem Affinitätsmedium unter Bedingungen, die es dem p66/p51-Komplex ermöglichen, an das Affinitätsmedium zu binden; und d) Bestimmen der Menge des gebildeten Komplexes durch Messen der Konzentration der an das Affinitätsmedium gebundenen detektierbaren Markierung.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Stufe d) die Menge des Komplexes durch Messen der Polymerase-Aktivität des rekonstituierten RT-Komplexes bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Lösung in Stufe a) einen Puffer umfasst, der aus Tris-HCl, HEPES oder bis -Tris ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich beim Puffer um Tris-HCl in einer Konzentration von 0 mM bis 50 mM handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Lösung in Stufe a) ferner ein Salz umfasst, das aus Na₂SO₄ oder MgCl₂ ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem Salz um MgCl₂ in einer Konzentration von 0 mM bis 100 mM handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Stufe a) das Dissoziationsmittel aus Harnstoff, Guanidinium-HCl oder Acetonitril ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich beim Dissoziationsmittel um Harnstoff in einer Konzentration von 1 bis 3,5 M handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich beim Reassoziationspuffer in Stufe b) um den gleichen Puffer handelt, der zur Dissoziation der p66/p66-Untereinheiten verwendet wird, wobei der Reassoziationspuffer frei von Denaturierungsmittel ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Reassoziationspuffer in einer überschüssigen Menge im Verhältnis zum Denaturierungspuffer vorliegt, um das Dissoziationsmittel in ausreichendem Maße zu verdünnen, um eine Reassoziation von p66- und p51-Untereinheiten zu ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Reassoziationspuffer in einem 10-fachen Überschuss zum Dissoziationspuffer zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Reassoziationspuffer in Stufe b) ein Salz umfasst, das aus Na₂SO₄ oder MgCl₂ ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich beim Salz um Na₂SO₄ in einer Konzentration von 0 mM bis 100 mM handelt.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei es sich beim Salz um Na₂SO₄ in einer Konzentration von 50 mM handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das p51 in Stufe b) affinitätsmarkiert ist oder eine detektierbare Markierung aufweist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das p51 in Stufe b) affinitätsmarkiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das p66 in Stufe b) eine detektierbare Markierung aufweist oder affinitätsmarkiert ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das p66 in Stufe b) eine detektierbare Markierung aufweist.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 17, wobei die Affinitätsmarkierung in Stufe b) aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Hexahistidin-Markierung, FLAG, T7, HA, GST und Biotin besteht.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei es sich bei der Affinitätsmarkierung um Hexahistidin handelt.
Verfahren nach den Ansprüchen 15 oder 17, wobei die detektierbare Markierung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer fluoreszierenden Markierung, einem radioaktiven Atom, einer chemilumineszierenden Markierung, einem detektierbaren Antikörper, der spezifisch für p66 oder spezifisch für eine an p66 gebundene Markierung ist, und einem enzymatischen Marker besteht.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei es sich bei der detektierbaren Markierung um eine fluoreszierende Markierung handelt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fluorescein, Oregon-Grün, Rhodamin, Texas-Rot, Phycoerythrin und Eu³⁺ besteht.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei es sich bei der fluoreszierenden Markierung um Eu³⁺ handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die detektierbare Markierung in Stufe b) an einen Cysteinrest addiert wird, der in rekombinanter Weise anstelle eines Prolinrestes am N-Terminus von p66 eingeführt worden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Affinitätsmedium in Stufe c) etwaiges rekonstituiertes, markiertes p66/Markierung-p51/RT-Heterodimeres abfängt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich in Stufe c) beim Affinitätsmedium um eine feste Phase handelt, die mit einem Rezeptor beschichtet ist, der zum Abfangen der Affinitätsmarkierung geeignet ist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die feste Phase mit einem Rezeptor beschichtet ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Ni²⁺, anti-Markierung-Antikörper, Glutathion und Streptavidin besteht.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die feste Phase mit Ni²⁺ beschichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei es sich bei der Affinitätsmarkierung um Histidin handelt.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei es sich bei der festen Phase um eine Mikroplatte handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Stufe d) ferner die Stufe des Waschens zum Entfernen von ungebundenem Material umfasst, wobei die Menge an mit Affinitätsmedium assoziierter Markierung in geeigneter Weise gemessen wird (oder die Polymerase-Aktivität des rekonstituierten RT gemessen wird), wobei das an das Affinitätsmedium gebundene Material proportional zur Menge an markiertem p51/p66-RT-Heterodimeren ist.
Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die zur Modulation der HIV-RT-Heterodimerisierung befähigt sind, umfassend: das Ausführen der Stufen a) bis d) nach Anspruch 1 in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung; und e) das Vergleichen der Testverbindungsprobe mit einer Kontrollprobe, in der diese Verbindung fehlt, wobei die Bildung des modulierten p66/p51-Komplexes in der Testverbindungsprobe ein Anzeichen für die Fähigkeit dieser Verbindung zur Modulation der Heterodimerisierung ist.
Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die zur Störung der HIV-RT-Heterodimerisierung befähigt sind, umfassend: das Durchführen der Stufen a) bis d) nach Anspruch 1 in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung; und e) das Vergleichen der Testverbindungsprobe mit einer Kontrollprobe, in der diese Verbindung fehlt, wobei eine verringerte Bildung des p66/p51-Komplexes in der Testverbindungsprobe ein Anzeichen für die Fähigkeit dieser Verbindung zur Hemmung der Heterodimerisierung ist.
Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die zur Verstärkung der HIV-RT-Heterodimerisierung befähigt sind, umfassend: das Durchführen der Stufen a) bis d) nach Anspruch 1 in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung; und e) das Vergleichen der Testverbindungsprobe mit einer Kontrollprobe, in der diese Verbindung fehlt, wobei die erhöhte Bildung des p66/p51-Komplexes in der Testverbindungsprobe ein Anzeichen für die Fähigkeit dieser Verbindung zur Verstärkung der Heterodimerisierung ist.
Verfahren zur Messung der Homodimerisierung von HIV-RT, das die folgenden Stufen umfasst: a) Bereitstellen einer ersten Lösung, die erste p66-Untereinheit-Homodimere in Gegenwart eines Dissoziationsmittels umfasst; b) Kontaktieren der ersten Lösung mit zweiten p66-Untereinheit-Homodimeren in Gegenwart eines Dissoziationsmittels und Inkubieren in Gegenwart eines Reassozationspuffers, um die Assoziation eines rekonstituierten RT-Komplexes von p66/p66-RT-Untereinheiten zu ermöglichen, wobei eine der Untereinheiten eine Affinitätsmarkierung umfasst und die andere der Untereinheiten eine detektierbare Markierung umfasst; c) Kontaktieren des Inkubationsgemisches von Stufe b) mit einem Affinitätsmedium unter Bedingungen, die es dem p66/p66-Komplex ermöglichen, an das Affinitätsmedium zu binden; und d) Bestimmen der Menge des gebildeten Komplexes durch Messen der Konzentration der an das Affinitätsmedium gebundenen detektierbaren Markierung (oder durch Messen der rekonstituierten RT-Polymerase-Aktivität).
Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die zur Modulation der HIV-RT-Homodimerisation befähigt sind, umfassend: das Durchführen der Stufen a) bis d) nach Anspruch 35 in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung; und e) das Vergleichen der Testverbindungsprobe mit einer Kontrollprobe, in der diese Verbindung fehlt, wobei die Bildung des modulierten p66/p66-Komplexes in der Testverbindungsprobe ein Anzeichen für die Fähigkeit dieser Verbindung zur Modulation der Homodimerisierung ist.
Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die zur Störung der HIV-RT-Homodimerisierung befähigt sind, umfassend: das Durchführen der Stufen a) bis d) nach Anspruch 35 in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung; und e) das Vergleichen der Testverbindungsprobe mit einer Kontrollprobe, in der diese Verbindung fehlt, wobei eine verringerte Bildung des p66/p66-Komplexes in der Testverbindungsprobe ein Anzeichen für die Fähigkeit dieser Verbindung zur Hemmung der Homodimerisierung ist.
Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die zur Verstärkung der HIV-RT-Homodimerisierung befähigt sind, umfassend: das Durchführen der Stufen a) bis d) nach Anspruch 35 in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung; und e) das Vergleichen der Testverbindungsprobe mit einer Kontrollprobe, in der diese Verbindung fehlt, wobei die erhöhte Bildung des p66/p66-Komplexes in der Testverbindungsprobe ein Anzeichen für die Fähigkeit dieser Verbindung zur Verstärkung der Homodimerisierung ist.
Kit zum Testen von Verbindungen, die potentiell die HIV-RT-Heterodimerisierung modulieren, wobei das Kit eine Mehrzahl von affinitätsmarkierten p66-Untereinheit-Homodimeren, eine Mehrzahl von markierten p51-RT-Untereinheiten, ein Dissoziationsmittel, einen Reassoziationspuffer und ein Affinitätsmedium umfasst.
Kit zum Testen von Verbindungen, die potentiell die HIV-RT-Homodimerisierung modulieren, wobei das Kit eine Mehrzahl von affinitätsmarkierten p66-Untereinheit-Homodimeren, eine Mehrzahl von markierten p66-RT-Untereinheiten, ein Dissoziationsmittel, einen Reassoziationspuffer und ein Affinitätsmedium umfasst.