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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich Allgemein auf Verfahren und Vorrichtungen
zur Amplifizierung von Nucleinsäuresequenzen.
Sie bezieht sich insbesondere auf Verfahren und Vorrichtungen, die
thermische Konvektion nutzen, wobei Temperatur-kontrollierte Amplifikationsverfahren
einschließlich
der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), und verwandte Verfahren ausgeführt werden
können,
um Zielnucleinsäuresequenzen
von genetischen Proben, die DNA oder RNA enthalten, zu amplifizieren.
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Stand der
Technik
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Nucleinsäuresequenz-Amplifikations-Technik
hat eine breite Anwendung in Biowissenschaft, Gentechnik und medizinischer
Wissenschaft für
Forschung und Entwicklung und diagnostische Zwecke. Insbesondere
wird die Nucleinsäuresequenz-Amplifikations-Technik,
die PCR nutzt (hiernach bezeichnet als „PCR-Amplifikations-Technik"), meist in großem Umfang
genutzt. Einzelheiten der PCR-Amplifikations-Technik sind in US-Patent
Nrn. 4,863,202, 4,683,195, 4,800,159 und 4,965,188 offenbart.
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Zum
Beispiel bezieht sich
US
5 270 183 A auf ein PCR-Verfahren, das die Injektion eines
Reaktionsgemisches in einen Strom von Trägerfluid einschließt, wobei
das Trägerfluid
dann eine Vielzahl von Temperaturzonen passiert, in denen die Polymerase-Kettenreaktionen
stattfinden.
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WO
97/48818 A offenbart außerdem
eine Vorrichtung für
thermisches Cycling einer DNA-Probe, umfassend (i) einen Träger; (ii)
eine Heizeinheit-Anordnung, die an besagten Träger montiert ist, wobei die
Anordnung erste und zweite Heizelemente, die erste beziehungsweise
zweite Heizkammern definieren, hat, wobei die Kammern angepasst
sind, ein Kapillarröhrchen,
das sich durch die zwei Heizkammern erstreckt, aufzunehmen und zu
kontaktieren; (iii) Mittel zum Aufrechterhalten der Temperaturen
der ersten und zweiten Kammer der Heizeinheit-Anordnung für die gewählte erste und zweite erhöhte Temperatur;
und (iv) Mittel, um die Probe in dem Röhrchen sukzessive zwischen
den zwei Kammern zu bewegen.
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US 5 919 622 A beschreibt
darüber
hinaus ein System für
die Temperatureinstellungsbehandlung von Flüssigkeiten, besonders während der
Isolation und Amplifikation von Nucleinsäuren mit einem wiederverwendbaren
Thermostatelement und einem Einweg-Heizelement, welches die Durchführung der
Probenaufbereitung und Amplifikation in einem einzelnen Gefäß erleichtert.
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Verschiedene
Vorrichtungen und Verfahren, die automatisierte PCR-Amplifikationsverfahren
einbauen, sind entwickelt und genutzt worden für schnelle und effiziente Amplifikation
einer Vielzahl genetischer Proben. Das grundlegende Arbeitsprinzip
einer solchen Technik ist wie folgt:
Bei der kommerzialisierten
PCR-Amplifikations-Technik wird eine Probe vorbereitet, so dass
sie eine zu amplifizierende Matrizen-DNA, ein Paar Oligonucleotidprimer,
die zu einer spezifischen Sequenz jedes Einzelstranges der Matrizen-DNA
komplementär
sind, eine thermostabile DNA-Polymerase und Desoxynucleotidtriphosphate
(dNTP) enthält.
Ein spezifisches Stück
der Nucleinsäuresequenz
der Matrizen-DNA wird dann durch Wiederholen eines Temperaturzyklus,
der sequentiell die Temperatur der Probe verändert, amplifiziert. Typischerweise
besteht der Temperaturzyklus aus drei oder zwei Temperaturschritten
und die Amplifikationsprozesse während
des Temperaturzyklus ereignen sich auf die folgende Art.
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Der
erste Schritt ist ein Denaturierungsschritt, bei dem die Probe auf
eine hohe Temperatur erhitzt wird und doppelsträngige DNAs zu einzelsträngigen DNAs
aufgetrennt werden. Der zweite Schritt ist der Anlagerungsschritt,
bei dem die Probe auf eine niedrige Temperatur gekühlt wird
und die einzelsträngigen
DNAs, gebildet im ersten Schritt, an die Primer, teilweise doppelsträngige DNA-Primerkomplexe
ausbildend, binden. Der letzte Schritt ist der Polymerisationsschritt,
bei dem die Probe bei einer geeigneten Temperatur gehalten wird und
die Primer in den DNA-Primerkomplexen durch die Funktion der DNA-Polymerase
verlängert
werden, wobei neue einzelsträngige
DNAs, die zu jeder der Matrizen-DNA-Stränge komplementär sind,
gebildet werden. Die Zielnucleinsäuresequenzen, die durch die
Sequenzen der beiden Primer ausgewählt werden, werden während jedes
Zyklus, bestehend aus den obigen drei Schritten, repliziert. Typischerweise
können
mehrere Millionen oder eine größere Zahl
von Kopien der Zielnucleinsäuresequenzen
durch Wiederholen der Temperaturzyklen für ungefähr 20- bis 40-mal erzeugt werden.
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Die
Temperatur des Denaturierungsschrittes ist typischerweise 90 bis
94°C. Die
Temperatur des Anlagerungsschrittes ist entsprechend kontrolliert
in Übereinstimmung
mit den Schmelztemperaturen (Tm) der verwendeten
Primer und sie liegt typischerweise im Bereich von 35 bis 65°C. Es ist
typisch, die Temperatur des Polymerisationsschrittes auf 72°C zu setzen
und einen dreistufigen Temperaturzyklus zu verwenden, da die am
häufigsten
verwendete Taq-DNA-Polymerase
(eine thermostabile DNA-Polymerase, extrahiert aus Thermus aquaticus),
die optimale Aktivität
bei dieser Temperatur hat. Ein zweistufiger Temperaturzyklus, bei dem
die Polymerisationstemperatur auf die gleiche wie die Anlagerungstemperatur
bzw. Aufschmelztemperatur gesetzt ist, kann auch verwendet werden,
da die Taq-DNA-Polymerase einen weiten Temperaturbereich der Polymeraseaktivität hat.
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Bei
dem am meisten verwendeten Verfahren wird ein Reaktionsgefäß, das die
Probe enthält,
mit einem festen Metallblock von hoher thermischer Leitfähigkeit
in Kontakt gebracht und die Temperatur des festen Metallblocks wird
verändert,
indem er mit Heiz- und Kühlvorrichtung
kombiniert wird, um das gewünschte
Temperatur-Cycling der Probe zu erreichen. Die kommerziellen Produkte,
die sich diesen Typ von Verfahren zu eigen machen, verwenden oft
einen vergoldeten Silberblock, der eine sehr hohe thermische Leitfähigkeit
hat, und/oder die Peltier-Kühlmethode,
um schnelle Temperaturänderung
zu erreichen. Kürzlich
sind Verfahren, die ein Fluid, wie Gas oder Flüssigkeit, als Wärmequelle
anstelle des festen Metallblocks verwenden, entwickelt worden, um
schnelle Temperaturänderung
zu erreichen, und Produkte, die solche Verfahren verwenden, sind kommerzialisiert
worden. Bei diesem Typ von Verfahren wird ein Fluid, erhitzt auf
eine geeignete Temperatur, um das Reaktionsgefäß zirkuliert auf eine Weise,
dass ein effizienter thermischer Kontakt zwischen der Fluid-Wärmequelle
und dem Reaktionsgefäß, das die
Probe enthält,
bereitgestellt werden kann.
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Andere
Typen von Verfahren sind auch entwickelt worden, um ein schnelles
Temperatur-Cycling zu erreichen. Weitere Beispiele schließen ein
Verfahren, bei dem das Reaktionsgefäß, das die Probe enthält, oder die
Probe selbst sequentiell mit mehreren Wärmequellen, jede bei einer
spezifischen Temperatur, kontaktiert wird, ein Verfahren, bei dem
die Probe unmittelbar mit Infrarotstrahlung erhitzt wird, etc.,
ein.
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Die
früheren
Nucleinsäuresequenz-Amplifikationsvorrichtungen
haben eine Reihe von Nachteilen, da sie funktionieren, indem die
Temperatur der gesamten Probe entsprechend des drei- oder zweistufigen
Temperaturzyklus verändert
wird.
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Erstens,
die früheren
Nucleinsäuresequenz-Amplifikationsvorrichtungen
des Typs des Temperatur-Cyclings sind komplex in ihrer Gestalt,
da Prozesse zur Änderung
der Probentemperatur notwendig sind. Um solche Temperaturänderungsprozesse
durchzuführen,
benötigt
das Verfahren, das einen festen Metallblock oder ein Fluid als eine
Wärmequelle
einschließt,
ein Mittel zur schnellen und gleichmäßigen Kontrolle und Änderung
der Temperatur der Wärmequelle
und ebenso ein Mittel zur Kontrolle des Zeitintervalls der Temperaturänderung.
Ebenso benötigt
das Verfahren, bei dem das Reaktionsgefäß oder die Probe sequentiell
mit mehreren Wärmequellen,
jede bei einer spezifischen Temperatur, in Kontakt gebracht wird,
ein Mittel zur schnellen und präzisen
Beförderung
des Reaktionsgefäßes oder
der Probe und auch ein Mittel zur Kontrolle der Beförderungszeit
und des Intervalls.
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Zweitens,
es ist schwierig, die früheren
Nucleinsäuresequenz-Amplifikationsvorrichtungen
in eine komplexe Vorrichtung oder ein miniaturisiertes Gerät zu integrieren,
und zwar wegen ihrer komplizierten Bauart. In letzter Zeit sind
miniaturisierte komplexe Vorrichtungen im Biotechnologiebereich
in der Entwicklung. Zum Beispiel ist Lab-on-a-chip entwickelt worden
durch Integration von Kanälen
für Probenpassage,
Ventilen, Druckmessern, Reaktionsgefäßen, Detektionseinheiten, etc.
als eine einzelne Einheit auf einer Glas-, Silikon- oder Polymerplatte
unter Verwendung von Photolithographie. Es wird erwartet, dass solche
miniaturisierte komplexe Vorrichtungen breite Anwendungen bei mehreren
Forschungszwecken und medizinischen Zwecken haben werden. Im Falle,
dass eine Nucleinsäuresequenz-Amplifikationsvorrichtung
in einen solchen miniaturisierten Chip integriert werden muss, hat
das frühere
Verfahren einen Nachteil bei der Miniaturisierung, weil es eine
komplexe Bauform zur Ermöglichung
der Temperaturänderungsprozesse
benötigt.
Außerdem
ist es schwierig, die früheren
Vorrichtungen in eine komplexe Apparatur zu integrieren, in welcher
schnelle Temperaturänderung
nicht erwünscht
ist.
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Drittens,
die früheren
Nucleinsäuresequenz-Amplifikationsvorrichtungen
können
nur thermostabile DNA-Polymerasen, wie Taq-DNA-Polymerase, verwenden.
Dies ist bedingt, weil die früheren
Vorrichtungen den Prozess des Erhitzens der gesamten Probe auf eine
hohe Temperatur aufweisen.
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Schließlich weisen
die früheren
Nucleinsäuresequenz-Amplifikationsvorrichtungen
eine Grenze bei der Reduzierung der PCR-Reaktionszeit auf. Da die
früheren
Vorrichtungen die Prozesse zur Änderung
der Temperatur der gesamten Probe benötigen, muss die PCR-Reaktionszeit mindestens
mehr Zeit brauchen als die Zeit, die für die Temperaturänderung
benötigt
wird.
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Offenbarung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung wurde erfunden, um die obigen Probleme zu
lösen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Nucleinsäuresequenz-Amplifikationsverfahren
und Vorrichtungen dafür,
die auf thermischer Konvektion beruhen, bereitzustellen. Das neue
Verfahren und die Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung
erreichen eine Amplifikation von Nucleinsäuresequenzen durch Bildung
einer Vielzahl von spezifischen Regionen, die unterschiedliche Temperaturen
innerhalb der Probe aufweisen und dadurch natürliche thermische Konvektion
der Probe verursachen, die als Ergebnis von dem Temperaturgradienten zwischen
den unterschiedlichen Regionen auftritt.
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Es
ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
und Vorrichtungen dafür
bereitzustellen, die einfacher in ihrer Bauart sind und die keine
komplexen Komponenten, wie ein Mittel zur Änderung der Temperatur auf
eine kontrollierte Art und Weise und ein Mittel zur Kontrolle des
Zeitintervalls der Temperaturänderung,
wie sie in den früheren
Verfahren und Vorrichtungen zum Temperatur-Cycling erforderlich
sind, erfordern.
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Deshalb
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Nucleinsäuresequenz-Amplifikationsverfahren
und Vorrichtungen dafür
bereitzustellen, die einfacher sind als die des Standes der Technik,
so dass sie ohne Weiteres miniaturisiert und somit in komplexe miniaturisierte
Vorrichtungen, wie Lab-on-a-chip, integriert werden können.
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Es
ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Nucleinsäuresequenz-Amplifikationsverfahren
und Vorrichtungen dafür
bereitzustellen, die auf der thermischen Konvektion basieren, bei
welcher nicht nur die thermostabilen DNA-Polymerasen, sondern auch
nicht-thermostabile DNA-Polymerasen verwendet werden können.
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Es
ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein effizienteres
Nucleinsäuresequenz-Amplifikationsverfahren
und Vorrichtungen dafür
bereitzustellen, die nicht die Temperaturänderungsprozesse erfordern,
die im Stand der Technik benötigt
werden.
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Weitere
Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden jenen, die in dem Fachgebiet
erfahren sind, durch die folgende detaillierte Beschreibung, Ansprüche und
Zeichnungen klar werden.
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Um
die obigen Aufgaben zu lösen,
stellt die vorliegende Erfindung ein neues Nucleinsäuresequenz-Amplifikationsverfahren
und Vorrichtungen dafür,
basierend auf dem neuartigen Funktionsprinzip des Typs thermische
Konvektion, nachfolgend beschrieben, bereit.
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Um
die obige Aufgabe zu lösen,
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation
einer Nucleinsäuresequenz,
das PCR verwendet, bereit, wobei das Verfahren umfasst:
einen
Schritt des Einspritzens einer Probe, die eine Matrizen-DNA, die
zu amplifizierende Ziel-Nucleinsäuresequenzen
hat, DNA-Polymerase, Desoxyadenosintriphosphate, Desoxycytidintriphosphat,
Desoxyguanosintriphosphat, Desoxythymidintriphosphat und mindestens
zwei Oligonucleotidprimer, die komplementär zu dem 3'-Terminus jeder der Ziel-Nucleinsäuresequenzen
sind, enthält,
in ein Reaktionsgefäß; und
einen
Schritt des Aufrechterhaltens einer spezifischen räumlichen
Temperaturverteilung in der Probe durch thermisches Kontaktieren
einer Mehrzahl von Wärmequellen,
die spezifischen Regionen der Probe Wärme zuführen oder entziehen, so dass
eine Region der Probe relativ hoher Temperatur in niedrigerer Höhe als eine Region
relativ niedriger Temperatur lokalisiert ist,
wobei die spezifische
räumliche
Temperaturverteilung spezifische räumliche Regionen umfasst, die
jeweils eine Temperaturbedingung erfüllen, die geeignet ist für (i) einen
Denaturierungsschritt, in dem doppelsträngige DNAs zu einzelsträngigen DNAs
getrennt werden, (ii) einen Anlagerungsschritt, in dem die im dem
Denaturierungsschritt gebildeten einzelsträngigen DNAs mit den Primer
hybridisieren, um DNA-Primer-Komplexe zu bilden, oder (iii) einen
Polymerisationsschritt, in dem die Primer in den DNA-Primer-Komplexen
durch die Polymerisationsreaktion verlängert werden,
und wobei
die spezifische räumliche
Temperaturverteilung eine Temperaturverteilung ist, die Umwälzung der Probe
durch thermische Konvektion induziert, so dass die Denaturierungs-,
Anlagerungs- bzw. Aufschmelz- und Polymerisationsschritte sequentiell
und wiederholt innerhalb der Probe auftreten.
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Um
die obigen Aufgaben zu lösen,
stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur Amplifikation einer
Nucleinsäuresequenz,
die PCR verwendet, bereit, wobei die Vorrichtungen umfasst:
eine
Mehrzahl von Wärmequellen,
die einer Mehrzahl von spezifischen Regionen einer in einem Reaktionsgefäß enthaltenen
Probe Wärme
zuführen
oder entziehen können,
wobei
die Wärmequellen
angeordnet sind, um eine spezifische räumliche Temperaturverteilung
in der Probe aufrechtzuerhalten, so dass eine Region relativ hoher Temperatur
in niedrigerer Höhe
als eine Region relativ niedriger Temperatur lokalisiert ist,
wobei
die spezifische räumliche
Temperaturverteilung spezifische räumliche Regionen umfasst, die
jeweils eine Temperaturbedingung erfüllen, die geeignet ist für (i) einen
Denaturierungsschritt, in dem doppelsträngige DNAs zu einzelsträngigen DNAs
getrennt werden, (ii) einen Anlagerungsschritt, in dem die im Denaturierungsschritt
gebildeten einzelsträngigen
DNAs mit den Primer hybridisieren, um DNA-Primer-Komplexe zu bilden, oder
(iii) einen Polymerisationsschritt, in dem die Primer in den DNA-Primer-Komplexen
durch die Polymerisationsreaktion verlängert werden, umfasst,
und
wobei die spezifische räumliche
Temperaturverteilung eine Temperaturverteilung ist, die Umwälzung der Probe
durch thermische Konvektion induziert, so dass die Denaturierungs-,
Anlagerungs- und Polymerisationsschritte sequentiell und wiederholt
innerhalb jeder Probe erfolgen.
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In
der vorliegenden Erfindung sind räumliche Regionen innerhalb
des Reaktionsgefäßes, das
die Probe enthält,
erzeugt, in welchen Regionen die Denaturierungs-, Anlagerungs- bzw. Aufschmelz-
und Polymerisationsschritte sequentiell und wiederholt erfolgen
können.
Um dies zu erreichen, sind eine Vielzahl von Wärmequellen kombiniert, um Hitze
zuzuführen
zu oder Hitze abzuführen
von den spezifischen Regionen der Probe, und außerdem ist eine Region relativ
hoher Temperatur in niedrigerer Höhe als eine Region relativ
niedriger Temperatur lokalisiert. Dies führt zu einer Erzeugung einer
natürlichen
thermischen Konvektion als Ergebnis des Temperaturgradienten zwischen
den spezifischen Regionen, dabei Umwälzung der Probe zwischen den Temperaturregionen
herbeiführend,
somit können
die Denaturierungs-, Anlagerungs- und
Polymerisationsschritte sequentiell und wiederholt erfolgen, was
zu einer Amplifikation von Nucleinsäuresequenzen führt.
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Wie
beschrieben, basieren die Nucleinsäuresequenz-Amplifikationsvorrichtungen
der vorliegenden Erfindung auf dem Verfahren der thermischen Konvektion
und sie haben die folgenden Merkmale in ihrer Bauart. Erstens benötigt die
Vorrichtung der vorliegenden Erfindung eine Mehrzahl von Wärmequellen,
die eine Mehrzahl von spezifischen Temperaturregionen in der Probe
innerhalb des Reaktionsgefäßes bei
den gewählten
Temperaturen aufrechterhalten können.
Zweitens sollte eine Region relativ hoher Temperatur niedriger in der
Höhe positioniert
sein als eine Region relativ niedriger Temperatur, um Umwälzung der
Probe zwischen den spezifischen Temperaturregionen über thermische
Konvektion zu induzieren. Etwas spezieller, die Probe in der Region
hoher Temperatur hat eine geringere Dichte als die in der Region
niedriger Temperatur. Somit wird Auftrieb erzeugt und dieser veranlasst
die Probe, sich von der Region hoher Temperatur in der niedrigeren Position
zu der Region niedriger Temperatur in der höheren Position zu bewegen,
wobei die Schwerkraft die Probe dazu veranlasst, sich in die entgegen
gesetzte Richtung zu bewegen. Eine natürliche thermische Konvektion
ist somit durch den Tempe raturunterschied erzeugt, was zu einer
Umwälzung
der Probe zwischen den spezifischen Temperaturregionen führt. Schließlich sollten
die Temperaturen der spezifischen Temperaturregionen derart gewählt werden,
dass räumliche
Regionen, in denen die Denaturierungs-, Anlagerungs- bzw. Aufschmelz-
und Polymerisationsschritte in jeder Region erfolgen können, in
der Probe gebildet werden können. und
auch die drei Schritte sequentiell und wiederholt durch thermische
Konvektion induzierte Umwälzung
der Probe zwischen den spezifischen Temperaturregionen bei einer
angemessenen Geschwindigkeit durchgeführt werden können.
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Die
oben beschriebenen Aufgaben, Merkmale und Vorteile werden durch
die folgende detaillierte Beschreibung offensichtlich, die in Verbindung
mit den angefügten
Zeichnungen zur Verfügung
gestellt wird. Beim Beschreiben der vorliegenden Erfindung wird
eine detaillierte Erläuterung
des relevanten Stands der Technik weggelassen, wenn sie die Punkte
der vorliegenden Erfindung unnötig
mehrdeutig machen kann.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
eine schematische Darstellung des Funktionsprinzips des Verfahrens
zur Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz,
das auf thermischer Konvektion basiert.
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2a und 2b zeigen
schematische Darstellungen der Fälle,
die mehr als drei spezifische Temperaturregionen in der Probe aufweisen.
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3a und 3b zeigen
eine Querschnittsdarstellung bzw. eine perspektivische Darstellung
der Vorrichtung zur Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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4 zeigt
die Temperaturverteilung der Probe bei verschiedenen Höhen in dem
Reaktionsgefäß.
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5 ist
eine Photographie des Elektrophoreseergebnisses, das die Ergebnisse
von Beispiel 1 bei unterschiedlichen Reaktionszeiten darstellt.
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6 ist
eine Photographie des Elektrophoreseergebnisses, das die Ergebnisse
von Beispiel 2 für
jedes der Primerpaare darstellt
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7 ist
eine Photographie des Elektrophoreseergebnisses, das die Ergebnisse
von Beispiel 3 bei unterschiedlichen Reaktionszeiten darstellt.
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Erklärung der
Bezugszeichen der wichtigen Teile in den Zeichnungen:
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- 1,1'
- Region
hoher Temperatur
- 2,2'
- Region
niedriger Temperatur
- 3,
4, 3',4'
- Wärmequelle
- 5
- Konvektionsregion
- 6
- Reaktionsgefäß
- 101
- Erster
Leitungsblock
- 102
- Zweiter
Leitungsblock
- 103
- Reaktionsgefäß
- 104
- Heizvorrichtung
- 105
- Einlass
von Temperaturkontrollfluid
- 106
- Auslass
von Temperaturkontrollfluid
- 107
- Isolator
- 112,
117
- Durchgangsloch
- 111
- Öffnung
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Beste Art
zur Durchführung
der Erfindung
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Nachfolgend
sind die bevorzugten Ausführungsformen
entsprechend der vorliegenden Erfindung detailliert unter Bezugnahme
auf die beigefügten
Zeichnungen erklärt.
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1 zeigt
ein schematisches Schaubild des Funktionsprinzips des Nucleinsäuresequenz-Amplifikationsverfahrens,
das auf thermische Konvektion beruht. Die in 1 gezeigte
Ausführungsform
zeigt beispielhaft den Fall, in dem ein gerades Rohr mit seinem
einen Ende geschlossen als Reaktionsgefäß verwendet wird und zwei spezifische
Temperaturregionen 1 und 2 erzeugt werden. Wie
jedoch in den Ausführungsformen,
die in 2 dargestellt sind, gezeigt
ist, können
Reaktionsgefäße, die
modifizierte Formen haben, genutzt werden und drei oder mehr spezifische
Temperaturregionen können
erzeugt werden. Es sollte den Fachleuten ersichtlich sein, dass
verschiedene Modifikationen einschließlich dieser wie oben beschrieben,
die auf dem thermischen Konvektions-Funktionsprinzip des Nucleinsäuresequenz-Amplifikationsverfahrens
entsprechend der vorliegenden Erfindung beruhen, in Betracht gezogen
werden können.
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In
einer Ausführungsform,
wie in 1 gezeigt, ist das Reaktionsgefäß in thermischem
Kontakt mit zwei Wärmequellen 3 und 4,
die Hitze zuführen
zu oder Hitze entfernen von den spezifischen Regionen 1 und 2 in
der Probe, direkt oder indirekt durch die Wand des Reaktionsgefäßes, wobei
eine räumliche
Temperaturverteilung in der Probe erzeugt wird. Die somit gebildete
Temperaturverteilung erlaubt drei Schritte, die Denaturierungs-,
Anlagerungs- und Polymerisationsschritte, die zum Stattfinden der
PCR erforderlich sind. Unter den zwei Regionen 1 und 2 mit
unterschiedlichen Temperaturen ist die Region 1 relativ
hoher Temperatur in niedrigerer Höhe als die Region 2 relativ
niedriger Temperatur positioniert. Der Temperaturunterschied erzeugt einen
Dichteunterschied in der Probe. Der Auftrieb, der auf die Probe
niedriger Dichte in der Region 1 hoher Temperatur wirkt,
und die Schwerkraft, die auf die Probe hoher Dichte in der Region 2 niedriger
Temperatur wirkt, erzeugen eine thermische Konvektion der Probe.
Somit zirkuliert die Probe natürlich
zwischen den unterschiedlichen räumlichen
Regionen, in denen jeweils die Denaturierungs-, Anlagerungs- bzw.
Aufschmelz- und Polymerisationsschritte erfolgen können. Diese
Bauart macht, dass die drei PCR-Schritte sequentiell und wiederholt
erfolgen, um dabei Amplifikation von DNA-Nucleinsäuresequenzen
durch den PCR-Prozess
zu erreichen. Eine detailliertere Arbeitsweise ist nachstehend beispielhaft
beschrieben.
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Die
Region 1 hoher Temperatur, die in einem niedrigeren Bereich
der Probe lokalisiert ist, kann z.B. bei einer Temperatur zwischen
90 bis 94°C,
bei welcher Temperatur doppelsträngige
DNAs in einzelsträngige DNAs
getrennt werden können,
gehalten werden. Solch eine Einstellung bewirkt, dass der Denaturierungsschritt
vorwiegend in der Region 1 erfolgt. Die Region 2 niedriger
Temperatur kann bei der Anlagerungstemperatur zwischen 35 bis 65°C gehalten
werden, so dass sich die DNAs, die in der Region hoher Temperatur
in niedrigerem Bereich denaturierten, zu der Region niedrigerer
Temperatur im oberen Bereich durch thermische Konvektion bewegen,
und infolgedessen die einzelsträngigen
DNAs an die Primer, die komplementär zu den einzelsträngigen DNAs
sind, anlagern können
und DNA-Primer-Komplexe
bilden. Bei dieser Einstellung kann, wenn Taq-DNA-Polymerase, die
für ihre
optimale Aktivität
bei 72°C
und für
einen breiten Temperaturbereich der Aktivität sogar bis niedriger Temperatur
bekannt ist, für
die Polymerisation verwendet wird, der Polymerisationsschritt, wo
die DNA-Polymerase an den DNA-Primer-Komplex bindet und der Primer
verlängert
wird, in der Region 2 niedriger Temperatur und im oberen
Bereich der Konvektionsregion 5 erfolgen. Folglich erfolgt der
Denaturierungsschritt erst in der Region 1 hoher Temperatur
und die denaturierten DNAs bewegen sich durch thermische Konvektion
zu der Region 2 niedriger Temperatur. Der Anlagerungsschritt
erfolgt folglich in der Region niedriger Temperatur in der Gegenwart
der Primer. Der Polymerisationsschritt erfolgt schließlich in Gegenwart
der DNA-Polymerase
während
der Zeitspanne, in der die im Anlagerungsschritt gebildeten DNA-Primer-Komplexe durch thermische
Konvektion durch die Region 2 niedriger Temperatur und
die Konvektionsregion 5 wandern. Folglich können die
Denaturierungs-, Anlagerungs- und Polymerisationsschritte sequentiell
und wiederholt erfolgen, wobei auf diese Weise die Zielsequenzen
der Proben-DNA effizient amplifiziert werden.
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In
anderen Ausführungsformen,
wie in 2 gezeigt, ist beabsichtigt,
dass drei spezifische Regionen des Reaktionsgefäßes mit einer Vielzahl von
Wärmequellen
in thermischem Kontakt stehen. 2a zeigt
eine schematische Darstellung, die eine Ausführungsform veranschaulicht,
in der eine Vielzahl von Wärmequellen 3, 3' und 4 angeordnet
sind, um zwei Regionen 1 und 1' hoher Temperatur und eine Region 2 niedriger
Temperatur zu bilden. 2b zeigt eine schematische Darstellung,
die eine andere Ausführungsform
veranschaulicht, in der eine Vielzahl von Wärmequellen 3, 4 und 4' angeordnet
sind, um eine Region 1 hoher Temperatur und zwei Regionen 2 und 2' niedriger Temperatur
zu bilden. Die Vielzahl der hierin verwendeten Wärmequellen kann für jede Temperaturregion
separat angeordnet sein oder eine gleiche Wärmequelle kann für mehr als
eine Temperaturregion verwendet werden. In der Ausführungsform,
die in 2a veranschaulicht ist, sollte,
wenn die zwei Regionen 1 und 1' hoher Temperatur für die Denaturierungs-
bzw. Polymerisationsschritte entworfen sind, jede Region mit einer
Wärmequelle,
die die Temperatur von der Region aufrechterhalten kann, die für jeden
Schritt geeignet ist, in Kontakt stehen. In der Ausführungsform,
die in 2b veranschaulicht ist, ist
es, wenn beide der zwei Regionen 2 und 2' niedriger Temperatur
für den
Anlagerungsschritt konzipiert sind, vorzuziehen, eine Wärmequelle
als Ersatz der zwei Wärmequellen 4 und 4' zu verwenden.
Außerdem
zeigt 2b, dass es entsprechend der
vorliegenden Erfindung möglich
ist, ein Reaktionsgefäß zu konstruieren, das
einen separaten Probeneinlass und -auslass hat.
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Um
die Effizienz der vorliegenden Erfindung zu verbessern, ist es wichtig,
die Geschwindigkeit der thermischen Konvektion zu kontrollieren,
so dass die Reaktion bei jedem Schritt ausreichend erfolgen kann und
gleichzeitig die gesamte Reaktionszeit reduziert werden kann. Dies
kann erreicht werden durch (a) Kontrolle des Temperaturgradienten
zwischen den spezifischen Temperaturregionen, (b) Kontrolle des
Durchmessers des Reaktionsgefäßes oder
(c) Änderung
des Materials des Reaktionsgefäßes. Wenn
der Temperaturgradient kontrolliert wird, um die Geschwindigkeit
der thermischen Konvektion einzustellen, ist es am zweckmäßigsten,
die Temperatur zwischen den spezifischen Temperaturregionen zu variieren.
Dies hat jedoch eine Grenze, da jede der spezifischen Temperaturregionen
ihre eigene Funktion für
die PCR, die von der Temperatur abhängig ist, hat. Folglich kann
der Abstand zwischen der Region hoher Temperatur (1 und 1') und der Region
niedriger Temperatur (2 und 2') variiert werden, um den gleichen
Effekt zu erhalten. Zum Beispiel wird der Temperaturgradient kleiner,
ebenso wie der Abstand zwischen den zwei Temperaturregionen größer wird, wenn
die Temperaturdifferenz die gleiche bleibt und somit die Geschwindigkeit
der thermischen Konvektion reduziert wird. Da die Adhäsionskraft
zwischen der Wand des Reaktionsgefäßes und der Probe ein Faktor
ist, der die thermische Konvektion inhibiert, kann die Geschwindigkeit
der thermischen Konvektion durch die Einstellung des Durchmessers
des Reaktionsgefäßes kontrolliert
werden. Wie das Verhältnis
von der Oberfläche des
Reaktionsgefäßes, das
in Kontakt mit der Probe ist, relativ zu dem Volumen der Probe größer wird,
nimmt die Adhäsionskraft
zu und die Geschwindigkeit der thermischen Konvektion ab. Folglich
kann die Geschwindigkeit der thermischen Konvektion durch Einstellung
des Durchmessers des Reaktionsgefäßes kontrolliert werden, wodurch
die Oberfläche
des Reaktionsgefäßes, die
mit der Probe in Kontakt steht, kontrolliert wird. Die Adhäsionskraft
zwischen der Probe und der Wand des Reaktionsgefäßes hat auch eine enge Beziehung zu
dem Material des Reaktionsgefäßes. Weil
der PCR-Prozess normalerweise in wässriger Lösung durchgeführt wird,
verursachen hydrophobe Materialien, wie Polyethylen und Polypropylen,
die eine schwächere
Adhäsionskraft
mit Wasser haben, höhere
Geschwindigkeiten der Konvektion verglichen mit hydrophilen Materialien
wie Glas. Daher kann die Effizienz der vorliegenden Erfindung ferner
durch Gestaltung des Reaktionsgefäßes, das für die PCR-Reaktionskinetik geeignet ist, basierend
auf den oben beschriebenen Grundsätzen, verbessert werden.
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3 zeigt ein Querschnittsbild (3a)
und eine perspektivische Ansicht (3b) der
Vorrichtung zur Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz, entsprechend einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung. Der in 3 gezeigte
Vorrichtung umfasst eine Vielzahl von Wärmequellen, als Mittel zur
Aufrechterhaltung der Temperatur, welche eine Heizeinheit, eine
Kühleinheit
oder eine Kombination von Heizeinheit und Kühleinheit einschließen. Vorzugsweise
kann ein Isoliermittel zwischen den Wärmequellen enthalten sein,
um die Wärmequellen
thermisch zu isolieren. In dieser bestimmten Ausführungsform
umfasst die Vorrichtung eine erste und zweite Wärmequelle, die in thermischem
Kontakt mit spezifischen Regionen der Probe stehen. Die erste Wärmequelle
besteht aus einem ersten wärmeleitfähigen Block 101 und
einer elektrischen Heizeinheit 104, die dem ersten wärmeleitfähigen Block
Wärme zuführt. Der
erste wärmeleitfähige Block
ist in thermischem Kontakt mit einem niedrigeren Bereich des Reaktionsgefäßes, um
eine Region hoher Temperatur in einem niedrigeren Bereich der Probe
zu bilden. Die zweite Wärmequelle
umfasst einen zweiten wärmeleitfähigen Block 102 bzw.
ein Umwälz-Wasserbad,
das Wasser einer bestimmten Temperatur durch das Innere des zweiten
wärmeleitfähigen Blocks
umwälzt,
um die Temperatur des zweiten wärmeleitfähigen Blocks
bei einer geeigneten Temperatur aufrechtzuerhalten. Der zweite wärmeleitfähige Block 102 ist
mit einem oberen Bereich des Reaktionsgefäßes in thermischem Kontakt,
um eine Region niedrigerer Temperatur in einem oberen Bereich der
Probe zu bilden. Der zweite thermische Leitungsblock 102 umfasst
einen Einlass 105, durch den Wasser aus dem Wasserbad einfließt, einen
Auslass 106, durch den das Wasser ausfließt, und
einen Fluidzirkulationskanal für
die Umwälzung
des Wassers innerhalb des zweiten wärmeleitfähigen Blocks. Obwohl der Fluidumwälzkanal
in dem zweiten wärmeleitfähigen Block
nicht in 3 dargestellt ist, kann die
auf dem Fachgebiet erfahrene Person verstehen, dass der Fluidumwälzungskanal
konzipiert ist, um Wärme
gleichmäßig zu dem
zweiten wärmeleitfähigen Block 102 zu
transferieren. Als Material wurde für die wärmeleitfähigen Blöcke 101 und 102 Kupfer
ausgewählt,
das eine hohe thermische Leitfähigkeit
hat, und ein Isolator 107 ist zwischen den zwei Blöcken eingefügt, um direkten
Wärmetransfer
zu verhindern. Die ersten und zweiten wärmeleitfähigen Blöcke 101 und 102 haben
Aufnahmeöffnungen
zur Einführung
der Reaktionsgefäße. Die
Aufnahmeöffnung
umfasst eine Öffnung 111 mit
einem geschlossenen Ende nahe des ersten wärmeleitfähigen Blocks 101, ein
Durchgangsloch 112 in dem zweiten wärmeleitfähigen Block und ein weiteres
Durchgangsloch 117 in dem Isolator.
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In
den später
beschriebenen Beispielen 1, 2 und 3 wird die Region hoher Temperatur
in einem niedrigeren Bereich der Probe bei 94°C durch Kontrolle der elektrischen
Heizeinheit 104 und die Region niedriger Temperatur in
dem oberen Bereich der Probe bei 45°C durch Kontrolle der Temperatur
des Wassers in dem Umwälz-Wasserbad
gehalten.
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Die
vorliegende Erfindung ist nicht auf die Nucleinsäuresequenz-Amplifikationsvorrichtung,
die in 3 gezeigt ist, beschränkt. Die
folgenden Modifikationen sind möglich.
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Erstens
können
die Strukturen der wärmeleitfähigen Blöcke 101 und 102 modifiziert
werden. Zum Beispiel kann der erste wärmeleitfähige Block 101 mit
einem niedrigeren Bereich des Reaktionsgefäß kontaktiert werden und der
zweite wärmeleitfähige Block 102 mit
einem höheren
Bereich des Reaktionsgefäßes, während ein
dazwischen liegender Bereich des Reaktionsgefäßes mit Luft oder einem dritten
wärmeleitfähigen Block kontaktiert
werden kann. Außerdem
können,
unterschiedlich von der Ausführungsform,
die in 3 gezeigt ist, bei der Wärme von
den Blöcken
zu den spezifischen Regionen der Probe durch die Wand des Reaktionsgefäßes transferiert
wird, die wärmeleitfähigen Blöcke in unmittelbarem
Kontakt mit der Probe stehen.
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Zweitens
kann das Material der wärmeleitfähigen Blöcke modifiziert
werden. In der Ausführungsform, die
in 3 gezeigt ist, werden die wärmeleitfähigen Blöcke 101 und 102,
die aus Kupfer gemacht sind, verwendet, aber das Material ist nicht
auf Kupfer beschränkt.
Nahezu jedes Material, das Wärme
zu dem Reaktionsgefäß transferieren
kann, kann verwendet werden. Zum Beispiel kann ein anderer wärmeleitfähiger Feststoff
oder ein wärmeleitfähiges Fluid,
wie Flüssigkeit
oder Gas, anstelle der wärmeleitfähigen Blöcke, die
oben verwendet werden, verwendet werden. In manchem Beispiel können Infrarotstrahlung
oder andere Mittel als Ergänzung
für einige
oder alle der wärmeleitfähigen Blöcke 101 und 102 verwendet
werden.
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Drittens
sind die Mittel zur Aufrechterhaltung der Temperaturen der ersten
und zweiten wärmeleitfähigen Blöcke nicht
auf ein Umwälz-Wasserbad
oder eine elektrische Heizeinheit beschränkt. Nahezu jede Einheit, die
Hitze zuführen
zu, Hitze abführen
von der Probe kann, kann verwendet werden.
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Viertens
kann nahezu jedes Mittel, wie Feststoff, Flüssigkeit oder Gas, als Ersatz
für den
Isolator 107, der in 3 gezeigt
ist, verwendet werden, soweit es geeignet ist, Wärmetransfer zwischen den leitenden
Materialien zu isolieren. Es ist auch möglich, einen Aufbau zu verwenden,
der keinen Isolator einschließt.
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Wenn
schließlich
ein modifiziertes Reaktionsgefäß (zum Beispiel
diese, die in 2a oder 2b gezeigt
sind) anstelle des Reaktionsgefäßes, das
in 1 dargestellt ist, zur Erleichterung der thermischen
Konvektion verwendet wird, kann man eine Vielzahl von Wärmequellen,
die wärmeleitfähigen Blöcke und
ihre Modifikationen, die, basierend auf dem Prinzip der folgenden
Erfindung, geeignet modifiziert sind, verwenden.
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Der
erste, zweite und dritte oben beschriebene Fall sind Beispiele,
in denen ein Teil der Wärmequellen, insbesondere
der wärmeleitfähige Block,
modifiziert ist. Wie hierin verwendet, bezieht sich die Wärmequelle auf
jedes Mittel, das zur Aufrechterhaltung der Temperatur der Probe
bei einem spezifischen Wert verwendet werden kann. Deshalb kann
zusätzlich
zu den oben beschriebenen Modifikationsbeispielen der Wärmequellen jede
Einrichtung als Wärmequelle
in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, soweit sie zum Halten
einer spezifischen Region der Probe bei einer gewählten Temperatur
verwendet werden kann. Die vorliegende Erfindung schließt nahezu
jede Vorrichtung ein, die eine Funktion zum Halten spezifischer
Regionen der Probe bei gewählten
Temperaturen hat. Das ist, weil die vorliegende Erfindung nicht
durch eine besondere Bauart der Wärmequellen charakterisiert
ist, sondern durch die spezielle Anordnung der Wärmequellen, die dazu bestimmt
sind, eine spezifische Temperaturverteilung innerhalb der Probe
zu erzeugen, die es ermöglicht,
dass der PCR-Prozess sequentiell und wiederholt erfolgt.
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Detailliertere
Konzepte der oben beschriebenen Modifikationsbeispiele können, abhängig von
der Entwicklung von Industrietechnologien, variiert werden. Daher
sind detaillierte Erklärungen
ausgelassen.
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4 zeigt
eine Temperaturverteilung, die in verschiedenen Höhen ab dem
Boden des Reaktionsgefäßes gemessen
wurden, was das Prinzip des PCR-Prozesses, basierend auf thermischer
Konvektion, veranschaulicht. Die thermische Konvektion ist ein Phänomen, bei
dem eine Bewegung eines Fluids durch einen Dichteunterschied, der
durch Unterschiede in der Temperatur erzeugt ist, induziert wird.
Diese Art von Konvektion ist auf eine natürliche Konvektion zurückzuführen, die
sich von einer erzwungenen Konvektion, wo ein Fluid durch eine Pumpe
oder einen Propeller zur Bewegung gezwungen wird, unterscheidet.
Der Begriff Konvektion, wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet
wird, bezieht sich immer auf natürliche
Konvektion. Damit eine natürliche
Konvektion in dem Reaktionsgefäß auftritt,
sollte ein niedrigerer Teil der Probe in dem Reaktionsgefäß eine höhere Temperatur
haben als ein oberer Teil.
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Wie
in 4 gesehen werden kann, wird, wenn der erste wärmeleitfähige Block 101 in
Kontakt mit einem niedrigeren Bereich des Reaktionsgefäßes bei
96°C gehalten
wird, und der zweite wärmeleitfähige Block 102 in
Kontakt mit einem oberen Bereich bei 45°C gehalten wird, die Region
hoher Temperatur (die Region mit der Temperatur höher als
oder gleich 90°C
in 4), die Region niedriger Temperatur (die Region
mit der Temperatur nahe 50°C)
und die Konvektionsregion (die Region, die einen Temperaturgradienten
aufweist) gebildet. Die Probe wird dem Denaturierungsschritt in
der Region hoher Temperatur unterzogen. Die denaturierte Probe bewegt
sich dann zu der Region niedriger Temperatur mitten durch die Konvektionsregion,
in welcher die Probe dem Anlagerungsschritt unterzogen wird. Während des
Aufenthalts in der Region niedriger Temperatur und der Bewegung
zurück
durch die Konvektionsregion aus der Region niedriger Temperatur
wird die Probe dem Polymerisationsschritt unterzogen. Thermische
Konvektion verursacht eine sequentielle und wiederholte Umwälzung der
Probe durch die drei Regionen, dabei zu Amplifikation von Nucleinsäuresequenzen
durch PCR führend.
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7 zeigt
die Ergebnisse, die durch DNA-Polymerase, die auf der festen Oberfläche immobilisiert ist,
erhalten wurden. Der Begriff „immobilisierte
DNA-Polymerase",
wie er hierin verwendet wird, meint eine DNA-Polymerase, die auf
einem festen Träger
immobilisiert ist, wobei ihre Polymeraseaktivität erhalten bleibt. Verschiedene
Verfahren können
verwendet werden, um die immobilisierte DNA-Polymerase zu präparieren, aber
es sollte eine immobilisierte DNA-Polymerase bereitgestellt werden,
die eine ausreichend hohe Polymeraseaktivität hat, so dass sie eine Detektion
von Nucleinsäuresequenzen,
die durch PCR der Matrizen-DNAs amplifiziert wurden, ermöglicht.
Die immobilisierte DNA-Polymerase, die in den Beispielen der vorliegenden Erfindung
verwendet wurde, wurde präpariert,
um eine hohe Polymeraseaktivität
unter Verwendung eines Verfahrens, bei dem die aktive Stelle der
DNA-Polymerase durch ein DNA-Substrat maskiert war und auf einer Au-Oberfläche durch
covalente Bindung immobilisiert war, zu erhalten. Das detaillierte
Vorgehen des Immobilisierungsverfahrens ist in dem Beispiel beschrieben.
Die Polymeraseaktivität
des durch dieses Verfahren präparierten
immobilisierten Enzyms war hoch genug (ungefähr 60 bis 80% im Vergleich
zu der in der Lösungsphase-DNA-Polymerase),
um sie zur PCR zu verwenden. Die immobilisierte DNA-Polymerase,
die mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist jedoch
nicht auf solche beschränkt,
die durch das Verfahren, das in dem Beispiel der vorliegenden Erfindung
verwendet wurde, präpariert
wurden, sondern schließt
solche ein, die durch andere Verfahren präpariert wurden.
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In
dem Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz des Typs der thermischen
Konvektion entsprechend zu der vorliegenden Erfindung können DNA-Polymerasen,
die nicht thermostabil sind, wie Klenow-Fragment und T7-DNA-Polymerase,
zusätzlich
zu den thermostabilen Polymerasen, wie Taq-DNA-Polymerase, verwendet
werden. Dies ist durch die folgende Tatsache bedingt. Aufgrund der
Merkmale der vorliegenden Erfindung ändert sich die Temperatur der
gesamten Probe nicht wiederholt von einer hohen Temperatur zu einer
niedrigen Temperatur oder umgekehrt, sondern die spezifischen Regionen
in der Probe werden bei konstanten Temperaturen gehalten. Zum Beispiel
kann ein oberer Teil der Probe bei einer niedrigen Temperatur gehalten
werden, wohingegen ein niedrigerer Teil der Probe bei einer hohen
Temperatur gehalten werden kann. Es ist möglich, DNA-Polymerase, die
nicht thermostabil ist, zu verwenden, durch Lokalisierung der immobilisierten
DNA-Polymerase in der Region niedriger Temperatur oder in dem oberen
Bereich der Konvektionsregion nahe der Region niedriger Temperatur.
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Die
unten beschriebenen Beispiele 1, 2 und 3 bestätigen, dass die Aufgaben der
vorliegenden Erfindung unter Verwendung einer Vorrichtung zur Amplifikation
einer Nucleinsäuresequenz
der vorliegenden Erfindung gelöst
werden können.
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Beispiel 1.
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1. Verfahren
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1.1. Reaktionsgefäß
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Ein
Glasröhrchen
mit einem geschlossenen Ende wurde als Reaktionsgefäß verwendet.
Das Glasröhrchen
hat eine Länge
von 55 ∼ 60
mm, einen Innendurchmesser von 2 mm, einen Außendurchmesser von 8 mm und
eine Dicke von 3 mm am bodenseitigen geschlossenen Ende. Die innere
Wand des Glasröhrchens war
mit Polytetrafluorethylen unter Verwendung eines Beschichtungsmaterials
vom Spraytyp beschichtet worden und thermisch gehärtet.
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1.2. Probe
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pBluescript
II KS(+) wurde als Matrizen-DNA verwendet. Die in der PCR verwendete
Probe enthielt 40 ng der Matrizen-DNA, jeweils 40 pmol T3-Primer
(5'-ATTAACCCTCACTAAAG-3')(SEQ ID NO: 1) und
T7-Primer (5'-AATACGACTCACTATAG-3')(SEQ ID NO: 2),
4 nmol dNTP, 1 pmol (5 U) Tag-DNA-Polymerase und 250 nmol MgCl2 in 100 μl
10 mM Tris-Puffer mit pH 8,3, der 50 mM KCl enthält.
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1.3. Reaktionstemperatur
und Reaktionszeit
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Erstens,
der erste wärmeleitfähige Block 101 wurde
mit einer elektrischen Heizeinheit geheizt und bei 96°C gehalten
und der zweite wärmeleitfähige Block 102 wurde
bei 45°C
unter Verwendung eines Umwälz-Wasserbades
gehalten. Die oben vorbereitete Probe wurde in das Reaktionsgefäß eingespritzt
und das Reaktionsgefäß wurde
dann in die Aufnahmeöffnung 111, 117 und 112 eingesetzt.
Die Probe wurde für
eine geeignete Zeit reagieren gelassen. Während der Reaktion wurde das
Reaktionsgefäß mit ungefähr 1,2 atm durch
Zuführung
von Stickstoffgas unter Druck gesetzt, um ein Sieden der Probenlösung zu
verhindern.
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1.4. Messung der Temperaturverteilung
in der Probe
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Die
Temperatur in jeder Region der Probe wurde unter den obigen Reaktionsbedingungen
gemessen. Die Spitze des Doppeltherinoelements wurde alle 2,5 mm
von dem Boden des Reaktionsgefäßes platziert
und die Temperatur wurde gemessen und nach ausreichender Zeit aufgezeichnet.
Ein Beispiel der Temperaturverteilung der Probe in dem Reaktionsgefäß ist in 4 gezeigt.
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2. Ergebnisse
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Erstens,
die gemessene Temperatur in jeder Region der Probe in dem Reaktionsgefäß unter
den obigen Reaktionsbedingungen (siehe 4) bestätigte, dass
eine Region hoher Temperatur oberhalb 90°C für Denaturierung, eine Temperatur
niedriger Temperatur um die 50°C
für Anlagerung
und eine Konvektionsregion, die einen Temperaturgradienten aufweist,
für Induktion
der thermalen Konvektion, gebildet wurden. Es wurde erwartet, dass
Polymerisation in der Region niedriger Temperatur und dem oberen
Bereich der Konvektionsregion auftritt.
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Nachdem
die Probe für
eine gegebene Reaktionszeit unter den obigen Reaktionsbedingungen
inkubiert worden war, wurde das Reaktionsgefäß herausgenommen und gekühlt. Die
Reaktionsprodukte wurden durch Elektrophorese unter Verwendung eines
1,0% Agarosegels analysiert. 5 ist eine
Photographie der Elektrophoreseergebnisse, die bei den Reaktionszeiten
bis zu 4 Stunden für
Zeitintervalle von je 30 min erhalten wurden. Das Reaktionsprodukt
ist eine 164 Basenpaare-doppelsträngige DNA. Wie in 5 gesehen
werden kann, erreicht die PCR-Reaktion eine Sättigung vor 90 min.
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Beispiel 2.
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1. Verfahren
-
Zusätzlich zu
de T3/T7-Primerpaar wurden auch KS/U-, KS/Pvu II- und KS/Nae I-Primerpaare in den Experimenten
untersucht. Die Reaktionszeit wurde auf 150 min gesetzt und die
anderen Reaktionsbedingungen waren die gleichen wie in Beispiel
1. Die Sequenzen der T3- und
T7-Primer wurden in Beispiel 1 beschrieben und die Sequenzen der
anderen Primer sind angegeben wie folgt:
- KS-Primer: 5'-CGAGGTCGACGGTATCG-3' (SEQ ID NO: 3)
- U-Primer: 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' (SEQ ID NO: 4)
- Pvu II-Primer: 5'-TGGCGAAAGGGGGATGT-3' (SEQ ID NO: 5)
- Nae I-Primer: 5'-GGCGAACGTGGCGAGAA-3' (SEQ ID NO: 6)
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2. Ergebnisse
-
Wie
in Beispiel 1 wurden die Reaktionsprodukte durch Elektrophorese
analysiert.
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6 ist
eine Photographie der Elektrophoreseergebnisse von Beispiel 2, wo
die Bahnen 1, 2, 3 und 4 die
Ergebnisse sind, die mit den Primerpaaren T3/T7, KS/U, KS/Pvu II
bzw. KS/Nae I erhalten wurden. Es kann gesehen werden, dass die
vier Primerpaare doppelsträngige
DNAs mit richtigen Größen von
entsprechend 164 bp, 144 bp, 213 bp bzw. 413 bp produzierten.
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Beispiel 3.
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1. Verfahren
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Anstelle
der Zugabe von Taq-DNA-Polymerase zu der Probe wurde Taq-DNA-Polymerase auf der Oberfläche eines
Au-Drahtes immobilisiert und sie wurde in der Region niedriger Temperatur
lokalisiert. Die anderen experimentellen Bedingungen waren die gleichen
wie in Beispiel 1.
-
Das
Verfahren, das zur Immobilisierung der DNA-Polymerase verwendet
wurde, ist nachstehend beschrieben.
-
Die
65 Basen-Einzelstrang-DNA und der KS-Primer, die nachstehend gezeigt
sind, wurden im Molverhältnis
1:1 in einem pH 8,3-Phosphatpuffer gemischt. Die erhaltene Lösung wurde
bei 94°C
für 10
min inkubiert und dann langsam unter 35°C abgekühlt. Während dieses Vorganges lagerten
sich die 65 Basen-Einzelstrang-DNA und der KS-Primer aneinander,
um eine teilweise doppelsträngige
DNA zu bilden. Dann wurde eine angemessene Molzahl von Taq-DNA-Polymerase (Ampli
Taq Gold), bezogen von Perkin Elmer (USA) zu dieser Lösung zugegeben
und die resultierende Mischung wurde in einem Trockenbad bei 72°C für 10 min
inkubiert. Dann wurde die Mischung zu einem Trockenbad mit 50°C überführt und
für 20
min inkubiert, um die Präparation
einer maskierten DNA-Polymerase, bei welcher die teilweise doppelsträngige DNA
an die aktive Stelle der DNA-Polymerase gebunden ist, abzuschließen.
- KS-Primer:
5'-CGAGGTCGACGGTATCG-3' (SEQ ID NO: 1)
- 65-mer:
3'-CCAGCTGCCATAGCTATTTTCTTTTCTTTCTTAAGTTCTTTTCTTTTCCTAGGTGAT-CAAGATCT-5' (SEQ ID NO: 7)
-
Um
eine maximale Menge von immobilisierter DNA-Polymerase von 0,26
pmol zu haben, wurde ein Au-Draht, der äußeren äußeren Durchmesser von 0,1 mm
und eine Länge
von 4,7 cm hat, präpariert
und verwendet, nachdem er zu einer Spule, die einen äußeren Durchmesser
von 1,5 mm und eine Länge
von ungefähr 4
mm hat, verarbeitet worden war. Um die Sauberkeit der Oberfläche des
Au-Drahtes sicherzustellen, wurde er mit Piranha-Lösung für 10 ∼ 15 Minuten
bei 60 ∼ 70°C gewaschen
und mit deionisiertem Wasser und nachfolgend mit absolutem Alkohol
kurz vor der Verwendung gespült.
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Um
Reaktionsgruppen für
die Immobilisierung auf der Au-Oberfläche einzuführen, wurde eine Molekularschicht
von Thiolmolekülen
auf der Au-Oberfläche
unter Verwendung der Au-S-Bindungs-Bildungsreaktion, gebildet, d.h.
unter Verwendung der Thiolat-Bildungsreaktion zwischen einem Linkermolekül, das eine
Thiolgruppe besitzt, und Au, um ein Trägermaterial herzustellen. In
dieser Reaktion wurde eine gemischte Lösung, die zwei Arten von Thiolmolekülen, die
eine Immobilisierungsreaktionsgruppe und eine nicht-reaktive Gruppe
aufweisen, ent hält,
verwendet. Die Molfraktion des Thiolmoleküls, das die Immobilisierungsreaktionsgruppe
aufweist, bezogen auf die Gesamt-Mole der zwei Thiolmoleküle, wurde
als 5% ausgewählt.
Um eine Carboxyl-Immobilisierungsreaktionsgruppe einzuführen, wurde
12-Mercaptododecansäure,
die eine relativ lange Alkylkette aufweist, als Linkermolekül verwendet.
Als ein Thiolmolekül,
das eine nicht-reaktive Gruppe aufweist, wurde 6-Mercapto-1-hexanol
oder 1-Heptanthiol als ein Matrixmolekül verwendet. Die Carboxyl-Immobilisierungsreaktionsgruppe
wurde auf die Oberfläche
des Au-Drahtes eingeführt,
indem er in 100 μl
einer 2 mM-gemischten Thiollösung
in Ethanol für
2 Stunden bei Raumtemperatur gelegt wurde und mit absolutem Ethanol
gewaschen wurde.
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Der
Au-Draht, an dem die Carboxyl-Immobilisierungsreaktionsgruppen eingeführt worden
waren, wurde in 120 μl
einer Ethanollösung,
die 10 mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und
5 mM N-Hydroxysuccinimid (NHS) enthält, für 2 Stunden bei Raumtemperatur
gelegt. Die Carboxylgruppe wurde durch Reaktion mit NHS in der Gegenwart
von EDC aktiviert und bildete somit NHS-Ester.
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Nach
der Aktivierung der Carboxylgruppen der Thiol-Monoschicht wurde
der Au-Draht in
die Enzymlösung,
die DNA-Polymerase mit maskierter aktiver Stelle enthält, überführt. In
diesem Schritt reagierte das aktivierte Carboxyl (NHS-Ester) der
Thiol-Monoschicht mit dem primären
Amin des Proteins, wobei eine Amidbindung (-CO-NH-) ausgebildet
wurde. Als Ergebnis davon wurde die Taq-DNA-Polymerase auf dem Trägermaterial
immobilisiert.
-
2. Ergebnisse
-
Wie
in Beispiel 1 wurden die Reaktionsprodukte durch Elektrophorese
analysiert. 7 ist eine Photographie der
Elektrophoreseergebnisse, die bei den Reaktionszeiten bis zu 4 Stunden
für Zeitintervalle
mit je 30 min erhalten wurden. Wie in 7 gesehen
werden kann, erreicht die PCR-Reaktion eine Sättigung vor 150 Minuten.
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Aus
den Ergebnissen der Beispiele 1, 2 und 3 können folgende Punkte gesehen
werden.
-
Erstens,
die erfindungsgemäße Vorrichtung
zur Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz,
die auf der thermischen Konvektion beruht, arbeitet effizient.
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Zweitens
wurde bestätigt,
dass der PCR-Prozess durch Lokalisierung der auf einer festen Oberfläche immobilisierten
DNA-Polymerase in der Region niedriger Temperatur oder in dem oberen
Bereich der Konvektionsregion unter Verwendung der Vorrichtung zur
Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz,
die auf der thermischen Konvektion entsprechend der vorliegenden
Erfindung beruht, ausgeführt
werden kann. Es wurde somit bestätigt,
dass DNA-Polymerasen, die bei hoher Temperatur nicht stabil sind,
auch verwendet werden können.
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Es
sollte den Fachleuten offensichtlich sein, dass die vorliegende,
oben beschriebene Erfindung nicht auf die obigen Ausführungsformen
und die angefügten
Zeichnungen beschränkt
ist.
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Folglich
sind die obigen Ausführungsformen
und Modifikationen nur zur Illustration und sollten nicht für die vorliegende
Erfindung als beschränkend
interpretiert werden. Der tatsächliche
Rahmen der vorliegenden Erfindung sollte durch die folgenden Ansprüche bestimmt
werden und wird in keiner Weise durch die Patentbeschreibung beschränkt.
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Wie
oben beschrieben, werden in der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl
spezifischer Regionen der Probe bei spezifischen Temperaturen gehalten,
und thermische Konvektion zwischen den spezifischen Regionen veranlasst
die Probe, innerhalb des Reaktionsgefäßes zu zirkulieren. Somit können die
Denaturierungs-, Anlagerungs- und Polymerisationsschritte sequentiell
und wiederholt ausgeführt
werden. Folglich können
die folgenden Effekte vermerkt werden.
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Erstens,
die Vorrichtung zur Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz kann mit einer einfachen
Zusammensetzung entwickelt werden. Die vorliegende Erfindung erfordert
keinen Prozess zur Änderung
der Temperatur der Probe. Somit kann die Bauart entsprechend der
vorliegenden Erfindung einfacher gemacht werden, weil komplexe Bausteine,
die in den früheren
Vorrichtungen zur Änderung
und Kontrolle der Probentemperatur enthalten sind, nicht erforderlich
sind.
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Zweitens
kann die Vorrichtung entsprechend der vorliegenden Erfindung einfach
miniaturisiert oder in eine komplexe Vorrichtung, wie Lab-on-a-chip,
integriert werden, um den PCR-Nucleinsäuresequenz-Amplifikationsprozess
auszuführen.
Sie kann auch in Vorrichtungen, in welchen eine Temperaturänderung
nicht erwünscht
ist, integriert werden.
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Drittens
können
die DNA-Polymerasen, die nicht thermostabil sind, auch verwendet
werden. Denn immobilisierte DNA-Polymerasen können in der vorliegenden Erfindung
durch ihre Lokalisierung in einer spezifischen Region innerhalb
des Reaktionsgefäßes, welche
Region bei einer für
die Polymeraseaktivität
geeigneten Temperatur gehalten wird, verwendet werden. Entsprechend
der vorliegenden Erfindung kann, wenn eine immobilisierte DNA-Polymerase
verwendet wird, eine PCR mit der immobilisierten DNA-Polymerase,
die bei der Temperatur, bei der die Polymerase aktiv ist, gehalten
wird, ausgeführt
werden. Somit können
entsprechend der vorliegenden Erfindung Enzyme, die ihre optimalen
Aktivitäten
bei niedriger Temperatur haben, wie Klenow-Fragment oder T7-DNA-Polymerase,
auch für
den PCR-Prozess verwendet werden.
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Schließlich kann
die Reaktionszeit für
die PCR verringert werden. In der vorliegenden Erfindung gibt es
keine Notwendigkeit, die Temperatur der gesamten Probe zu ändern. Somit
kann die Zeit, die für
die Änderung
und Kontrolle der Temperatur der gesamten Probe benötigt wird,
eingespart werden. Sequence
Listing