DE60216613T2

DE60216613T2 - Bioimpfungszusammensetzung enthaltend bakterien der arten b.subtilis oder b.lentimorbus von kuhmilch

Info

Publication number: DE60216613T2
Application number: DE2002616613
Authority: DE
Inventors: Ch. S. National Botanical Research I NAUTIYAL; Sangeeta National Botanical Research MEHTA; H. B. National Botanical Research In SINGH; P. National Botanical Research Inst. PUSHPANGADAN
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2001-09-04
Filing date: 2002-07-04
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2022-07-05
Also published as: ZA200302288B; US7097830B2; CN1479577A; PT1423011E; WO2003020038A1; DE60216613D1; EP1423011A1; EP1423011B1; US20030211119A1; DK1423011T3; BRPI0205800B1; US20060094107A1; BR0205800A; ATE347265T1; AU2002345299B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine synergistische Zusammensetzung, die sich als Bioinoculans eignet, wobei die Zusammensetzung bakterielle Stämme mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-30486, NRRLB-30487 und NRRL-B-30488, einzeln oder in sämtlichen möglichen Kombinationen, und gegebenenfalls einen Träger umfasst, wobei jeder der Stämme eine das Pflanzenwachstum fördernde Aktivität, eine Aktivität zur Bekämpfung von phytopathogenen Pilzen, das Vermögen, abiotische Stressbedingungen auszuhalten und das Vermögen zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen aufweist. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Zusammensetzung sowie ein Verfahren zur Isolierung dieser bakteriellen Stämme aus der "Sahiwal"-Kuh.
Technischer Hintergrund
Die Welt der Mikroben stellt einen Mikrokosmos dar, dessen Aktivitäten von zentraler Bedeutung für die Biosphäre sind. Mikrobielle Produkte tragen zu einem gesunden Zustand der Umgebung, von Pflanzen, der Menschen und des Bodens bei. Es gibt eine auffallende Vielfalt von Mikroorganismen bezüglich ihrer ökologischen und physiologischen Spezialisierung. Sie haben die Fähigkeit entwickelt, in fast allen Nischen zu überleben und zu gedeihen, unabhängig davon, wie unwirtlich ihre Lebensräume sind. Mikroorganismen bilden auch Assoziationen mit anderen Mikroben und mit anderen Pflanzen und Tieren. Sie können Pathogene, Parasiten, Symbionten, Kommensale und Saprophyten darstellen, so dass ihr ökologischer Einfluss sich auf sämtliche trophischen Bereiche des Lebens und die gesamte Skala von möglichen Ökosystemen auswirkt. Mikroben haben sich als eine außerordentlich reiche Quelle für neue Produkte erwiesen und alles spricht dafür, dass dies auch in der Zukunft der Fall sein wird. Somit ist die Erforschung der Biodiversität von neuen Mikroorganismen, die von ökologischer Bedeutung oder von wirtschaftlichem Wert sind, wichtig. Aufgrund dieser Tatsache wurden Mikrobiologen veranlasst, die Suche nach neuen wertvollen Mikroben aus Quellen, die nicht charakterisiert sind, fortzusetzen.
Gemäß der Hindu-Mythologie sowie gemäß der traditionellen indischen medizinischen Praxis (sowohl die klassischen Systeme, wie Ayurveda und Siddha, als auch die mündlichen Überlieferungen der ländlichen Bevölkerung) hat Kuhmilch verjüngende und die Gesundheit erhaltende und fördernde Eigenschaften und gilt somit als das beste Vitalisierungsmittel (Caraka-Samhita, Hrsg.-Übersetzer P. Sharma, Chaukhambha Orientalia, Varanasi, Indien, Bd. 1 (1981), S. 213; P. Pushpangadan, Ethnobiology in India: A status report, Ministry of Environment and Forests, Government of India, New Delhi (1999); P. Pushpangadan, All India Coordinated research project on ethnobiology: Final technical report 1982-1998, Ministry of Environment and Forests, Government of India, New Delhi (1998)).
Milch lässt sich als das normale Sekret der Brustdrüse von Säugetieren definieren. Milch ist bei der Sekretion durch die Drüse von Säugetieren frei von Mikroorganismen. Jedoch wandern Mikroorganismen, die in Verbindung mit den Zitzen stehen, im Zitzenkanal nach oben und gelangen in das Innere des Euters (J. C. Olsen und G. Mocquot. Milk and milk products. In: International commission on microbiological specifications for foods. Microbial ecology of foods. Food commodities. Bd. 2, New York: Academic Press (1980), S. 470-486). Dies führt dazu, dass Milch selbst bei aseptischer Entnahme Mikroorganismen enthält, zumeist Bakterien. Bakterien in aseptisch entnommener Milch sind üblicherweise in ihrer Anzahl beschränkt und umfassen hauptsächlich Mikrokokken, Lactokokken, Staphylokokken, Streptokokken und Bacillus (F. L. Bryan, Journal of Food Protection, Bd. 46 (1983), S. 637-649; R. A. Ledford. Raw milk and fluid milk products. In: Applied dairy microbiology. Hrsg. E. H. Marth und J. L. Steele, New York, Marcel Dekker, Inc. (1998), S. 55-64). Wagner Bettiol (Crop Protection, Bd. 18 (1999), S. 489-492) berichtete über die Verwendung von Kuhmilch zur Bekämpfung von pulvrigem Mehltau an in Gewächshäusern gezüchteten Zucchinifrüchten.
Seit mehr als 40 Jahren weiß man, dass Milch für zahlreiche der in Milch vorkommenden Bakterien ein relativ ungünstiges Medium darstellt, so dass Milch offensichtlich ausgeprägte selektive Eigenschaften besitzt (T. Gibson und Y. A. Abd-El-Malek, Canadian Journal of Microbiology, Bd. 3 (1957), S. 203-213). Somit muss die bakterielle Flora, die in die Zitzen und/oder das Euter gelangt ist, unter diesen suboptimalen Bedingungen die Fähigkeit zum Überleben und zur Vermehrung besitzen. Somit betreffen die in der vorliegenden Anmeldung enthaltenen Ausführungen über Milch die bakterielle Flora, die in den Zitzen und/oder im Euter vorhanden sind und in aseptisch entnommene Milch gelangen. Unsere Arbeiten wurden im Rahmen einer Suche nach neuen Mikroben in ökologischen Nischen, die bisher nicht charakterisiert worden sind, durchgeführt.
Eine Verbesserung der Fruchtbarkeit des Bodens stellt eine der häufigsten Maßnahmen zur Erhöhung der landwirtschaftlichen und forstwirtschaftlichen Produktion dar. Wir haben aus Kuhmilch Bakterien isoliert, die für Pflanzen nützlich sind. Die Inokulation von Saatgut oder Erdreich mit nützlichen Mikroorganismen zur Erzielung besserer Ergebnisse bei der Pflanzenzucht wird seit einer Reihe von Jahren praktiziert. Es wurden verschiedene Mechanismen identifiziert, die für eine derartige, das Pflanzenwachstum fördernde Wirkung verantwortlich sind. Beispielsweise fördern bestimmte Mikroorganismen indirekt das Pflanzenwachstum, indem sie das Wachstum von schädlichen Mikroorganismen hemmen; oder sie verstärken direkt das Pflanzenwachstum, indem sie Wachstumshormone produzieren; und/oder indem sie die Aufnahme von Nährstoffen durch die Pflanzen unterstützen, z. B. von Phosphor (P) (C. S. Nautiyal et al., FEMS Microbiology Letters, Bd. 182 (2000), S. 291-296).
Jedoch besteht ein Hauptfaktor beim mangelnden Erfolg der Vermarktung von Bioinoculantien in der Inkonsistenz der Ergebnisse von Feldtests, da deren Einrichtung und Durchführung stark durch Umweltfaktoren beeinflusst werden, insbesondere unter den im Erdreich auftretenden Stressbedingungen, z. B. Salz, pH-Wert und Temperatur (C. S. Nautiyal et al., FEMS Microbiology Letters, Bd. 182 (2000), S. 291-296). Daher ist es erstrebenswert, stresstolerante Bakterienstämme als Bioinoculantien bereitzustellen (C. S. Nautiyal, Biocontrol of plant diseases for agricultural sustainability. In: Biocontrol potential and its exploitation in sustainable agriculture, Bd. 1, Hrsg. R. K. Upahyay, K. G. Mukerji und B. P. Chamola, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York (2000), S. 9-23). Zu das Pflanzenwachstum fördernden Mikroorganismen gehören (ohne Beschränkung hierauf) Rhizobium, Pseudomonas, Azospirillum und Bacillus und dergl. (A. K. Saxena et. al., Bacterial Biocontrol agents and their role in plant disease management. In: Biocontrol potential and its exploitation in sustainable agriculture, Bd. 1, Hrsg. R. K. Upadhyay, K. G. Mukerji und B. P. Chamola, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York (2000), S. 25-37).
Die Eignung von B. subtilis als Quelle für Antagonisten des pflanzenpathogenen Pilzes Sclerotium rolfsii ist bekannt (P. Broadbent et al., Australian Journal of Biological Sciences, Bd. 24 (1971), S. 975). Baker et al. (Phytopathology, Bd. 73 (1983), S. 1148-1152) berichten ebenfalls über die Verwendung von B. subtilis als biologisches Bekämpfungsmittel von fungalen Pflanzenpathogenen. Pusey et al. (Plant Disease, Bd. 72 (1988), S. 622-626) und P. L. Pusey (US-Patent 5 047 239) beschreiben die Bekämpfung von Rostkrankheiten an geernteten Früchten unter Verwendung von B. subtilis. S. D. Heins et al. (US-Patent 6 103 228) beschreiben Verfahren zum Schützen oder Behandeln von Pflanzen bei fungalen und bakteriellen Infektionen und bei Befall mit Mais-Rootworm unter Verwendung von B. subtilis. EP-0 276 132 beschreibt die B. subtilis-Stämme NCIB 12375, NCIB 12376 und NCIB 12616 mit antimikrobieller Aktivität. WO-00149875 beschreibt die B. subtilis-Stämme FERM BP-1738 und FERM BP-1739 und WO-98/21964 beschreibt den B. subtilis-Stamm ATCC 55614, wobei alle drei Stämme für die Behandlung von Pflanzen gegen fungale und bakterielle Infektionen vorgeschlagen werden. US-6 060 051 beschreibt den B. subtilis-Stamm NRRL B21661 mit insektizider, antifungaler und antibakterieller Aktivität.
B. lentimorbus ist der Verursacher der "milky desease" bei japanischen Käfer- und verwandten Skarabäus-Larven (K. E. Rippere et al., International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 48 (1998), S. 395-402) und wird daher für die biologische Bekämpfung von Larven bestimmter Insekten verwendet (R. E. Gordon et al., The genus Bacillus, Agriculture handbook Nr. 427, United States Department of Agriculture, U. S. Government Printing Office, Washington D. C. (1973)). US-2 258 319 berichtet über die Verwendung des resistenten Stadiums von B. lentimorbus- oder B. popilliae-Bakterien bei der Behandlung einer derartigen Milchkrankheit bei Insektenlarven. B. lentimorbus wird auch zur Erhöhung der Fischproduktion verwendet (W. T. Logan et al., US-Patent 5 746 155) sowie zur Behandlung von Junggeflügel (W. T. Logan et al., US-Patent 6 017 525).
Üblicherweise verwendete Träger zur Vermehrung von Bakterien für gewerbliche Inoculantien sind Vermiculit, Aktivkohle, Caboxymethylcellulose, Torf, Perlit, Polyvinylpyrrolidon und Talcum. Pressschlamm, ein "Abfallprodukt", das bei der Zuckerherstellung anfällt, wird ebenfalls als Träger für Azotobacter chrococcum und Rhizobium japonicum verwendet (K. S. Jauhri, Indian Journal Agriculture Research, Bd. 24 (1990), S. 189-197). Pressschlamm beeinflusst wie beliebige andere organische Düngemittel die physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften von Böden. Er trägt auch dazu bei, die gegen Wasser stabilen Aggregate in Böden zu vermehren. Er kann zusammen mit gebrauchten Waschflüssigkeiten von Destillerien kompostiert und als im Vergleich zu Pressschlamm allein besseres organisches Düngemittel verwendet werden (D. P. Yadav, Recycling of sugar factory press mud in agriculture. In: Recycling of crop, animal, human, and industrial wastes in agriculture, Hrsg. H. L. S. Tandon, Fertilizer development and consultation organization, New Delhi (1995), S. 91-108). Die landwirtschaftliche und umweltbezogene Industrie würde daher klare Vorteile aus einem einfachen, billigeren Verfahren zur Herstellung von mikrobiellen Inoculantien für Pflanzen, Saatgut und Erdreich ziehen.
Obgleich die Arbeiten über die Mikrobiologie der Milch sich bisher mit psychrotrophen Bakterien befasst haben, und zwar aufgrund ihrer Bedeutung in Milch- und Molkereiprodukten (M. A. Cousin, Journal of food protection, Bd. 45 (1982), S. 172-207; R. A. Ledford, Raw milk and fluid milk products. In: Applied dairy microbiology, Hrsg. E. H. Martha und J. L. Steele, New York, Marcel Dekker, Inc. (1998), S. 55-64), wurde bisher kein bakterieller Stamm in Kuhmilch gefunden, der die Fähigkeit besitzt, phytopathogene Pilze zu bekämpfen, das Pflanzenwachstum zu fördern, Toleranz gegen abiotische Belastungen zu erreichen und Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen zu solubilisieren.
Indien ist eines der wenigen Länder in der Welt, die in reichem Maße zum internationalen Livestock-Genpool und zur Verbesserung der Tierpopulation in der Welt beigetragen haben. Rinder und Büffel leisten einen Beitrag von nahezu 15% des Bruttonationaleinkommens. Das Land besitzt 23% der Rinderpopulation der Welt. Rind ist ein allgemeiner Ausdruck für domestizierte pflanzenfressende Säugetiere, die zur Gattung Bos, Familie Bovidae, gehören. Moderne Rinder werden in zwei Spezies eingeteilt: B. taurus, ein Rind, das aus Europa stammt und die meisten modernen Zuchtformen von Rindern für die Milch- und Fleischerzeugung umfasst, und B. indicus, ein Rind, das aus Indien stammt und das durch einen Höcker und den Widerrist gekennzeichnet ist. Das letztgenannte Rind ist heutzutage in Afrika und Asien weit verbreitet, wobei es in geringerer Zahl nach Nordamerika (vorwiegend in die südlichen USA) und Mittelamerika importiert worden ist.
Bei Milchrindern handelt es sich um Rassen, die vorwiegend zur Milcherzeugung entwickelt worden sind. In Nordamerika handelt es sich bei den Hauptrassen für Milchrinder um die Holstein-Friesische Rasse, Ayrashire-, Brown-, Swiss- und Jersey-Rassen. Unter den hauptsächlichen Milchrassen von B. indicus finden sich in Indien hauptsächlich die Gir-, Hariana-, Red Sindhi-, Tharparker und Sahiwal-Rasse. Sahiwal stellt mit Abstand die beste Rasse des Subkontinents dar. Es handelt sich um eine vergleichsweise schwere Rasse mit einem symmetrischen Körper und einer losen Haut im Vergleich zu Red Sindhi, mit der sie eine starke Ähnlichkeit aufweist. Die Tiere sind üblicherweise lang und fleischig und schwerer gebaut. Ihre Farbe ist rotstichig graubraun oder blassrot, gelegentlich mit weißen Flecken durchsetzt. In Indien werden zahlreiche Herden dieser Rassen gehalten. Die Milchausbeute beträgt 1 400 bis 2 500 kg. Die Vererbbarkeit dieses Merkmals beträgt 0,2 bis 0,3. Die Kühe kalben erstmals im Alter von 37 bis 48 Monaten, wobei sie im Abstand von 430 bis 580 Tagen kalben. Sahiwal ist eine der populärsten Rassen des Subkontinents. Sie wurde nach Sri Lanka, Kenia und zahlreiche Länder in Lateinamerika und Westindien exportiert, wo eine neue Rasse mit der Bezeichnung Jamaica Hope aus Sahiwal- und Jersey-Kreuzungen entwickelt wurde (P. N. Bhat, Handbook of Animal Husbandry, Directorate of Publication and Information on Agriculture, Krishi Anusandhan Bhawan, Pusa, New Delhi (1997)). Bisher gibt es keine klaren Hinweise dafür, dass irgendwelche Bakterien, die aus Kühen isoliert werden, als biologische Bekämpfungsmittel geeignet sein könnten, und sicherlich gibt es keine Hinweise auf eine direkte, durch Bakterien vermittelte Stimulation des Pflanzenwachstums an sich. Ein Bakterienstamm, der zur Förderung des Pflanzenwachstums, zur Erzielung von Toleranz gegen abiotischen Stress und zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen befähigt ist, könnte nach seiner Isolierung unmittelbar beispielsweise in Böden, die von Phytopathogenen betroffen sind, eine schlechte Verfügbarkeit von Nährstoffen, wie Phosphor, aufweisen und die Umweltbelastungen und dergl. ausgesetzt sind, verwendet werden. Bisher wurde aber noch nicht über eine derartige angestrebte Verbesserung bei der Pflanzenzüchtung und auch nicht über ein Verfahren zur Auswahl eines derartigen bakteriellen Stammes berichtet. Wir haben durch direkten Vergleich an einer Vielzahl von Pflanzentypen festgestellt, dass die besondere Kombination von ausgewählten bakteriellen Stämmen in Bezug auf die Förderung des Wachstums und die Gesundheit von Pflanzen wirksam ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue, aus Kühen isolierte Stämme von Bakterien, die die Fähigkeit zur Bekämpfung von phytopathogenen Pilzen, zur Förderung des Pflanzenwachstums, zur Erzielung von Toleranz gegen abiotische Belastungen und zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen besitzen. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Auswählen dieser Stämme.
Aufgaben der vorliegenden Erfindung
Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Isolierung von bakteriellen Stämmen aus Kühen, die sich als Bioinoculantien eignen.
Eine weitere Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Isolierung von bakteriellen Stämmen mit einer das Pflanzenwachstum fördernden Aktivität aus Sahiwal-Kühen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Isolierung von bakteriellen Stämmen aus Sahiwal-Kühen, die eine pflanzenwuchsfördernde Aktivität von mindestens 5% des Trockengewichts aufweisen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Isolierung von bakteriellen Stämmen aus Sahiwal-Kühen, die eine pflanzenwuchsfördernde Wirkung in Bezug auf eine geringere Sämlingssterblichkeit, eine bessere Sämlingskeimung, die Pflanzenhöhe, die Anzahl der Schoten und das Samentrockengewicht aufweisen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Isolierung von bakteriellen Stämmen aus Sahiwal-Kühen mit einer Bekämpfungswirkung gegen phytopathogene Pilze.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Isolierung von bakteriellen Stämmen aus Sahiwal-Kühen mit der Fähigkeit zur Solubilisierung von Phosphat.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Isolierung von bakteriellen Stämmen aus Sahiwal-Kühen mit der Fähigkeit zur Erzielung von Toleranz gegen abiotische Stresszustände.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Isolierung von bakteriellen Stämmen aus Sahiwal-Kühen mit Toleranz gegen 4-8% Salz.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Isolierung von bakteriellen Stämmen aus Sahiwal-Kühen mit Toleranz gegen einen pH-Wert von 4-10.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Isolierung von bakteriellen Stämmen aus Sahiwal-Kühen mit Toleranz gegen Temperaturen von 50-60°C.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Entwicklung einer synergistischen Zubereitung, die drei Stämme, die aus Sahiwal-Kühen isoliert worden sind, umfasst, wobei die Zusammensetzung Eigenschaften besitzt, die die Bekämpfung von phytopathogenen Pilzen, die Förderung des Pflanzenwachstums, Toleranz gegen abiotische Stressbelastungen, Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stresszuständen und die Erzeugung von antifungalen Metaboliten umfasst.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Entwicklung einer Zubereitung, die drei aus Sahiwal-Kühen isolierte Stämme umfasst, wobei sich die Zubereitung als Bioinoculans eignet und die Stämme unter verschiedenen Lager-, Gewächshaus- oder Feldbedingungen eine maximale Lebensfähigkeit aufweisen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Entwicklung einer Zubereitung, die die drei isolierten Stämme aus Sahiwal-Kühen mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-30486, NRRL B-30487 und NRRL-B-30488 umfasst, wobei die Zubereitung in flüssiger oder trockener Form auf Saatgut, Pflanzen und Erdreich angewandt werden kann.
Zusammenfassende Darstellung der vorliegenden Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine synergistische Zusammensetzung, die sich als Bioinoculans eignet, wobei die Zusammensetzung bakterielle Stämme mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-30486, NRRL B-30487 und NRRL-B-30488 einzeln oder in sämtlichen möglichen Kombinationen und gegebenenfalls einen Träger umfasst, wobei die Stämme jeweils eine pflanzenwuchsfördernde Aktivität, eine Aktivität zur Bekämpfung von phytopathogenen Pilzen, die Fähigkeit zur Toleranz gegenüber abiotischen Stressbedingungen und die Fähigkeit zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen aufweisen. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Zusammensetzung sowie ein Verfahren zum Isolieren von bakteriellen Stämmen aus Sahiwal-Kühen.
Ausführliche Beschreibung der vorliegenden Erfindung
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung eine synergistische Zusammensetzung, die sich als Bioinoculans eignet, wobei die Zusammensetzung bakterielle Stämme mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-30486, NRRL B-30487 und NRRL-B-30488 einzeln oder in sämtlichen möglichen Kombinationen und gegebenenfalls einen Träger umfasst, wobei jeder der Stämme eine pflanzenwuchsfördernde Aktivität, eine Aktivität zur Bekämpfung von phytopathogenen Pilzen, die Fähigkeit zur Toleranz gegenüber abiotischen Stressbedingungen und die Fähigkeit zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen aufweist. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Zusammensetzung und ferner ein Verfahren zum Isolieren von bakteriellen Stämmen aus Sahiwal-Kühen.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einer synergistischen Zusammensetzung, die sich als Bioinoculans eignet, wobei die Zusammensetzung bakterielle Stämme mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-30486, NRRL B-30487 und NRRL-B 30488 einzeln oder in sämtlichen möglichen Kombinationen und gegebenenfalls einen Träger umfasst.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung gehören die Stämme NRRL B-30486 und NRRL B-30488 zur Gruppe Bacillus lentimorbus.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gehört der Stamm NRRL B-30487 zur Gruppe Bacillus subtilis.

Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt der Stamm NRRL B-30486 die nachstehend angegebenen Eigenschaften:

Eigenschaften	NRRL B-30486
Gestalt	Stäbchen
Größe
Breite, μm	1,5-2,0
Länge, μm	3,0-6,0
Gram-Reaktion	+
Katalase-Reaktion	–
Anaerobes Wachstum	+
Voges-Proskauer-Reaktion	–
pH-Wert in V-P-Brühe	5,5
Säure aus
D-Glucose	+
L-Arabinose	–
D-Xylose	–
D-Mannit	–
Gas aus Glucose	+
Hydrolyse von
Casein	–
Gelatine	–
Stärke	–
Verwertung von Citrat	–
Nitrat zu Nitrit	–

Indol-Bildung	–
Wachstum bei pH-Wert in Nährbrühe
6,8	+
5,7	+
Wachstum in NaCl
2%	+
5%	+
7%	+
10%	+
Wachstum bei
30°C	+
40°C	+
50°C	+
55°C	+
65°C	–

Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist der Stamm NRRL B-30487 die nachstehend angegebenen Eigenschaften auf:

Eigenschaften	NRRL B-30487
Gestalt	oval
Größe
Breite, μm	2,5
Gram-Reaktion	+
Katalase-Reaktion	+
Anaerobes Wachstum	–
Voges-Proskauer-Reaktion	+
pH-Wert in V-P-Brühe	5,8
Säure aus
D-Glucose	+
L-Arabinose	+
D-Xylose	+
D-Mannit	+
Gas aus Glucose	–
Hydrolyse von
Casein	+
Gelatine	+
Stärke	+
Verwertung von Citrat	+
Nitrat zu Nitrit	+

Indol-Bildung	–
Wachstum bei pH-Wert in Nährbrühe
6,8	+
5,7	+
Wachstum in NaCl
2%	+
5%	+
7%	–
10%	–
Wachstum bei
30°C	+
40°C	+
50°C	+
55°C	+
65°C	–

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist der Stamm NRRL B-30488 die nachstehend angegebenen Eigenschaften auf:

Eigenschaften	NRRL B-30488
Gestalt	Stäbchen
Größe
Breite, μm	1,5-2,0
Länge, μm	5,0-10,0
Gram-Reaktion	+
Katalase-Reaktion	–
Anaerobes Wachstum	+
Voges-Proskauer-Reaktion	–
pH-Wert in V-P-Brühe	5,2
Säure aus
D-Glucose	+
L-Arabinose	–
D-Xylose	–
D-Mannit	–
Gas aus Glucose	+
Hydrolyse von
Casein	–
Gelatine	–
Stärke	–

Verwertung von Citrat	–
Nitrat zu Nitrit	–
Indol-Bildung	–
Wachstum bei pH-Wert in Nährbrühe
6,8	+
5,7	+
Wachstum in NaCl
2%	+
5%	+
7%	+
10%	+
Wachstum bei
30°C	+
40°C	+
50°C	+
55°C	+
65°C	–

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Träger aus einer Gruppe ausgewählt, die Vermiculit, Aktivkohle, ein Gemisch von fermentiertem Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken mit gebrauchter Waschflüssigkeit von Destillerien und Carbonisierungsschlamm von Zuckerfabriken umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt das Verhältnis der drei Stämme etwa 1:1:1.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt die Gesamtkonzentration der Stämme 4-10 KBE/g Träger und vorzugsweise 6-8 KBE/g (cfu/g) Träger.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt die Konzentration eines jeden Stammes 4-10 KBE/g Träger und vorzugsweise 7-8 KBE/g (cfu/g) Träger.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt die Generationszeit der Stämme 55-65 Minuten bei 30°C.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kolonisieren die Stämme Pflanzenwurzeln.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung überleben die Stämme jede Saison der Pflanze.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung überleben die Stämme mindestens 2/3 Jahre in der Zusammensetzung.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein in vitro-Verfahren zum Isolieren bakterieller Stämme mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-30486, NRRL B-30487 und NRRL-B 30488 aus der Milch der "Sahiwal"-Kuh bereitgestellt, wobei die Stämme Eigenschaften aufweisen, die das Kontrollieren von phytopathogenen Pilzen, die Förderung des Pflanzenwachstums, Toleranz gegen abiotische Stressfaktoren, Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stresszuständen und Erzeugung von antimykotischen Metaboliten umfassen, wobei das Verfahren das Gewinnen von Milch der "Sahiwal"-Kuh, umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Milch auf einem Kulturmedium ausgestrichen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Kultur etwa 1-3 Tage bei Temperaturen von 25-35°C inkubiert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden sämtliche morphologisch unterschiedlichen Bakterien aus der Kultur ausgewählt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die in der vorhergehenden Stufe ausgewählten Stämme, die phytopathogene Pilze unterdrücken, indem sie eine Hemmzone von mindestens 2 mm bei einer Inkubation bei 30-35°C und vorzugsweise 28°C für eine Zeitspanne von 20-35 Tagen und vorzugsweise von 27 Tagen zeigen, einem Screening unterworfen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die in der vorhergehenden Stufe ausgewählten Stämme einem Screening auf das Pflanzenwachstum fördernde Bakterien, die eine mindestens 5%ige Zunahme des Pflanzentrockengewichts zeigen, durch Züchten von Pflanzen in Gegenwart von ausgewählten Bakterien bei einer Bakterienkonzentratiön von etwa log 6 bis 10 KBE/Samen oder etwa log 6 bis 8 KBE/g Erdreich unterworfen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die in der vorhergehenden Stufe ausgewählten Stämme einem Screening bei 4-8% Salzstresstoleranz für die weitere Selektion unterworfen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die in der vorhergehenden Stufe ausgewählten Stämme einem Screening beim pH-Wert 4-10 auf Stresstoleranz für die weitere Selektion unterworfen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die in der vorhergehenden Stufe ausgewählten Stämme bei 50-60°C einem Screening auf Temperaturstresstoleranz für die weitere Selektion unterworfen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die in der vorhergehenden Stufe ausgewählten Stämme einem Screening auf die Fähigkeit zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen bei hohen Werten in Bezug auf Salzgehalt, pH-Wert und Temperatur zur weiteren Selektion unterworfen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die erwünschten drei Bakterienstämme isoliert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Pflanze für die wachstumsfördernde Aktivität aus der Gruppe Zea mays, Abelmoschus esculentus, Luffa cylindrica, Lycopersicon esculentum, Abelmoschus esculentus und Cucumis sativus ausgewählt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich beim Kulturmedium um Nähragar, wobei das Medium Rindfleischextrakt (2-10 g), Pepton (5-15 g), Natriumchlorid (2-10 g), Agar (10-20 g) und destilliertes Wasser (etwa 1,0 Liter) bei einem pH-Wert von 7,0-7,4 umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die pH-Toleranz bei 30°C getestet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt die Erdreichfeuchtigkeit 15-30% und vorzugsweise 20%.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich beim Salz vorzugsweise um NaCl.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Stämme auf Nährlösungsmedium (NB-Medium) gezüchtet, das aus Rindfleischextrakt (0,5%), Pepton (1%), NaCl (0,5%) und destilliertem Wasser besteht, wobei der pH-Wert des Mediums 7,2 beträgt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der pathogene Pilz aus einer Gruppe ausgewählt, die F. moniliforme, C. falcatum, F. oxysporum f. sp. ciceri, R. solani, Pythium sp., Phoma sorghii, Sclerotium rolfsii, Alternaria solani, Curvularia lunata, Sclerotinia sclerotiorum und Aspergillus niger umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt die Konzentration der Stämme im Bereich von 4-10 KBE/ml.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nimmt die Phosphatsolubilisierung bei einer kombinierten Erhöhung von Temperatur, Salz und pH-Wert um etwa 428% zu.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nimmt die Phosphatsolubilisierung bei Erhöhung der Salzkonzentration um etwa 160% zu.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nimmt die Phosphatsolubilisierung bei pH-Erhöhung um etwa 130% zu.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Stämme auf hohe pH-Stresstoleranz bei einem pH-Wert von vorzugsweise 9 ausgewählt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Stämme auf Temperaturstresstoleranz bei 55°C ausgewählt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Bakterien ausgewählt, die die günstigsten Ergebnisse in Bezug auf eine geringere Sämlingsmortalität und eine bessere Sämlingskeimung, Pflanzenhöhe, Anzahl von Schoten und Samentrockengewicht zeigen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung steigt die den Pflanzenwuchs fördernde Aktivität um 3-400%.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt die Pilzkonzentration 4-7 Sporen/ml Kulturmedium.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die abiotischen Stressbedingungen für die Solubilisierung von Phosphat aus einer Gruppe von Bedingungen ausgewählt, die einen hohen pH-Wert im Bereich von 7-9, hohe Temperaturen im Bereich von 30-45°C und eine Salzkonzentration im Bereich von 0,1-4% umfassen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer den Pflanzenwuchs fördernden Zubereitung, die bakterielle Stämme mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-30486, NRRL B-30487 und NRRL-B 30488 einzeln oder in sämtlichen möglichen Kombinationen und einen Träger umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Bakterien in einer Kultur in individueller Weise bis zu einer Konzentration von etwa log 8 bis 11 KBE/ml und vorzugsweise log 9 bis 10 KBE/ml, gegebenenfalls gefolgt von einem Vermischen der Kulturen in einem gleichen Verhältnis im Fall der Herstellung einer Kombination, gezüchtet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Kultur mit Wasser im Verhältnis von 1:50 bis 1:150 und vorzugsweise von 1:100 verdünnt, wobei etwa log 8-9 KBE/ml Bakterien enthalten sind.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden etwa 1-3 Liter der Kultur/Tonne frisch homogenisiertem Träger und vorzugsweise 2 Liter der Kultur/Tonne frisch homogenisiertem Träger versprüht und vermischt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Schwaden mindestens zweimal täglich für etwa 2 Tage aufgerührt, um die Temperatur der Schwaden auf 70-75°C zu erhöhen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird gebrauchte Waschflüssigkeit oder Wasser in die aufgerührten Schwaden für etwa 40 Tage gesprüht, um einen Feuchtigkeitsgrad von etwa 55-65% aufrechtzuerhalten.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Schwaden für weitere 3-5 Tage aufgerührt, um nunmehr die Feuchtigkeit und die Temperatur des fermentierten Produkts auf etwa 30% bzw. 40-45°C zu verringern.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das gebrauchsfertige, das Pflanzenwachstum fördernde Bioinoculans abgepackt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Träger aus der Gruppe ausgewählt, die frisch sulfinierten Pressschlamm und Carbonisierungspressschlamm umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich beim Kulturmedium um NB-Medium.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Gemisch manuell oder unter Verwendung eines "Aero-Tillers" homogenisiert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt die Zubereitung unter variierten Lagerungs- oder Gewächshaus- oder Feldbedingungen eine maximale Lebensfähigkeit.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt das Verhältnis der Stämme etwa 1:1:1.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Zubereitung auf Pflanzen, Samen und Erdreich angewendet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verwendung einer den Pflanzenwuchs fördernden Zubereitung bereitgestellt, die bakterielle Stämme mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-30486, NRRL B-30487 und NRRL-B 30488 einzeln oder in sämtlichen möglichen Kombinationen und einen Träger umfasst, wobei das Verfahren die Stufe des Auftragens des Bioinoculans in flüssiger oder trockener Form auf Samen, Pflanzen und Erdreich umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Bioinoculans ferner Gummen oder Zucker zur Verbesserung der Haftung.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegen die Stämme im Verhältnis von 1:1:1 vor.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Zubereitung unter variierten Lagerungs- oder Gewächshaus- oder Feldbedingungen eine maximale Lebensfähigkeit auf.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Träger aus einer Gruppe ausgewählt, die frisch sulfinierten Pressschlamm und Carbonisierungspressschlamm umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Pflanzen der Varietät auf die Förderung von Pflanzenwachstum auf dem Feld in Gegenwart von Bakterien in einer Konzentration von etwa log 7-9 KBE/Samen oder etwa log 6-8 KBE/g Erdreich getestet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Zubereitung allein oder in Kombination mit anderen Chemikalien, die für das Wachstum und das Überleben von Bakterien unschädlich sind, verwendet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Chemikalien aus einer Gruppe ausgewählt, die Pestizide, Düngemittel, Nematizide und Herbizide umfasst, wobei gegebenenfalls eine Kalk-Pelletisierung vorgenommen wird, um die Schwere der Wirkung dieser Materialien zu begrenzen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die sich als Bioinoculans eignet, bereitgestellt, wobei die Zusammensetzung einen oder mehrere der neuen Bakterienstämme mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-30486, NRRL B-30487 und NRRL-B 30488 und einen Träger umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die bakteriellen Stämme in einem Wachstumsmedium bis zur logarithmischen Phase gezüchtet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Kultur mit Wasser im Verhältnis 1:10 bis 1:100 000 und vorzugsweise von 1:100 verdünnt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die verdünnte Kultur mit einem inerten pulverisierten Träger vermischt, wobei der Feuchtigkeitsgehalt des Gemisches 20-40% und vorzugsweise etwa 30%, bezogen auf eine feuchte Basis, beträgt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Gemisch für mindestens etwa 2 Tage inkubiert, wobei im Gemisch ein konstanter Feuchtigkeitsgehalt aufrechterhalten wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Bakterienzahl im Gemisch auf einen Bereich von etwa log 4-10 KBE/g Träger erhöht.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Überlebensrate der Bakterien über einen Zeitraum von mindestens 1 Jahr in der Zusammensetzung überwacht, wobei die Bakterienstämme vorzugsweise in einem Bereich von etwa log 7 bis 9 KBE/g Träger vorhanden sind und eine lange Überlebensdauer der Mikroorganismen als Inokulat zeigen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Träger aus einer Gruppe ausgewählt, die Vermiculit, Aktivkohle, ein Gemisch aus fermentiertem Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken und gebrauchter Waschflüssigkeit von Destillerien, sowie Carbonisierungsschlamm von Zuckerfabriken, Reisspelzen, Carboxymethylcellulose, Torf, Perlit, Talcum und Polyvinylpyrrolidon umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Träger vorzugsweise aus einer Gruppe ausgewählt, die Vermiculit, Aktivkohle und fermentierten Pressschlamm umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt die Bakterienzahl vorzugsweise etwa log 8 KBE/g Träger.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Pflanzen für die Wachstumsförderung aus einer Gruppe ausgewählt, die Kichererbsen, A. esculentus und C. sativus und Z. mays und Triticum aestivum und Glycine max und Pisum sativum und Impatiens balsamina umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt das Verhältnis der Stämme im Falle einer Kombination etwa 1:1:1.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich beim Wachstumsmedium um NB-Medium.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Bakterien individuell bis zu einer Konzentration von etwa log 9 bis 10 KBE/ml gezüchtet, wonach das Vermischen der Kulturen im Verhältnis von etwa 1:1:1 erfolgt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Kultur mit Wasser vorzugsweise im Verhältnis von 1:10 mit einem Gehalt an etwa log 8-9 KBE/ml verdünnt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Feuchtigkeit des Produkts mit Schwaden reguliert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat die Anmelderin ein neues Verfahren zum Screening von Bakterien zur Auswahl von solchen Bakterienstämmen aufgefunden, die die Fähigkeit besitzen, phytopathogene Pilze zu bekämpfen, das Pflanzenwachstum zu fördern, Toleranz gegenüber abiotischen Belastungen zu erreichen und Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen zu solubilisieren. Bei Verwendung als Bioinoculantien besitzen die nach unserem Verfahren erhaltenen neuen Bakterien die Fähigkeit zur Bekämpfung von phytopathogenen Pilzen und zur Förderung des Pflanzenwachstums unter Feldbedingungen.
Die Anmelderin hat ferner drei neue Stämme von Bacillus aufgefunden, die bei einzelner Verwendung oder bei Verwendung in Form eines neuartigen Gemisches von Bestandteilen, das einen besonderen Synergismus ergibt, die Fähigkeit besitzen, phytopathogene Pilze unter Feldbedingungen zu bekämpfen, das Pflanzenwachstum unter Feldbedingungen zu fördern, Toleranz gegen abiotische Stressbelastungen zu erreichen und Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen zu solubilisieren.
Das Screening-Verfahren umfasst folgendes:

1. Isolieren von Stämmen von Bakterien aus Milch und Auswählen der Bakterien mit Potential zur Unterdrückung des Wachstums der phytopathogenen Pilze Colletotrichum falcatum, Sclerotium rolfsii, Alternaria solani, Penicillium sp., Pythium aphanidermatum, Phytophthora palmivora, Curvularia lunata, Sclerotinia sclerotiorum und Aspergillus niger unter in vitro-Bedingungen auf Nähragarplatten (NA) auf folgende Weise: Ausstreichen von 1 bis 4 einzelnen Bakterienkolonien rings um den Rand einer Petri-Schale mit 90 mm Durchmesser und 2-tägige Inkubation bei 28°C; Übertragen eines Agar-Pfropfen-Inokulums der Pilze (5 mm-Quadrat) auf die Mitte der Platte in individueller Weise von einer Platte mit einer Quelle der zu testenden Pilze auf NA für 2 bis 7 Tage; und Auswählen der bakteriellen Stämme mit biologischer Kontrollwirkung zur Hemmung des Pilzwachstums.
2. Screening von in Stufe 1 ausgewählten Bakterien im Gewächshaus (mit Potential zur Unterdrückung des Wachstums von pathogenen Pilzen unter in vitro-Bedingungen) auf ihre das Pflanzenwachstum fördernde Wirkung in folgender Weise: Züchten von Maispflanzen in Gegenwart von in Stufe 1 ausgewählten Bakterien im Gewächshaus in einer Konzentration von etwa log 8 KBE/Sämling in nicht-sterilem Erdreich; Züchten von Kontroll-Maispflanzen auf die vorstehend angegebene Weise ohne Zusatz der Bakterien; und Auswählen von Bakterienstämmen mit das Pflanzenwachstum fördernder Wirkung, die die behandelten Pflanzen veranlassen, ein höheres Trockengewicht zu entwickeln.
3. Screening von in Stufe 2 ausgewählten Bakterien als Pflanzenwuchs-Promotoren in Bezug auf abiotische Stress-Toleranz (Salz, pH-Wert und Temperatur) unter in vitro-Bedingungen auf folgende Weise: Auswählen von stresstoleranten Bakterien aus den in Stufe 2 ausgewählten Stämmen, die eine Toleranz gegen 6% Salz (NaCl), einen pH-Wert von 5-9 und eine Temperatur von 55°C aufweisen.
4. Charakterisieren von in Stufe 3 in Bezug auf abiotischen Stress ausgewählten Bakterien bezüglich ihrer Fähigkeit zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen (Salz, pH-Wert und Temperatur) auf folgende Weise: quantitative Bestimmung der Phosphat-Solubilisierung in Brühe unter Verwendung des National Botanical Research Institute-Phosphat-Wachstumsmediums (NBRIP); Ermitteln des Einflusses von Salz (NaCl), des pH-Werts und der Temperatur auf die Solubilisierung von Phosphat durch Züchten der Stämme auf NBRIP mit einem Gehalt an verschiedenen Mengen an NaCl (Gew./Vol.), einem pH-Wert und einer Temperatur gemäß den gemachten Angaben; Inokulieren von NBRIP-Medium mit dem Bakterienstamm mit etwa log 9 KBE/ml; und Autoklavisieren von als Kontrolle dienendem, nicht-inokuliertem Medium.
5. Screening von in Stufe 3 ausgewählten Bakterien in Bezug auf die Überlebenstoleranz in Trägern zur Ermittlung ihres gewerblichen Werts als Bioinoculans auf folgende Weise: Züchten der Bakterien in einem Wachstumsmedium; Zugeben von Zellen in der logarithmischen Phase zu verschiedenen Trägern, insbesondere Vermiculit, Aktivkohle und fermentiertem Pressschlamm; anschließend Auftragen des Inokulums auf Sämlinge (z. B. durch Herstellen einer Aufschlämmung mit einem Gehalt an dem Träger/Bakterien-Gemisch und Gummen oder Zuckern zur Verbesserung der Haftung) oder durch direktes Aufbringen auf Erdreich oder durch Eintropfen von Träger/Bakterien-Suspensionen in Pflanzfurchen oder durch Vermischen mit anderem Pflanzmaterial; Verwenden der Zubereitung, die eine maximale Lebensfähigkeit zeigt (unter verschiedenen Lager- oder Gewächshaus- oder Feldbedingungen) für Pflanzen, Sämlinge und Erdreich.
6. Feldversuch an in Stufe 3 ausgewählten, in Bezug auf abiotischen Stress toleranten Bakterien zur Ermittlung der Fähigkeit zur Bekämpfung von Pflanzenpathogenen, insbesondere Pilzen, wie Fusarium oxysporum f. sp. ciceri, d. h. zur Verringerung des Auftretens oder der Schwere der Krankheit an auf dem Feld wachsenden Kichererbsen oder auf die Fähigkeit zur Bekämpfung von Pflanzenpathogenen, insbesondere Pilzen, wie Fusarium moniliforme und Colletotrichum falcatum, an auf dem Feld wachsendem Zuckerrohr, unter Verwendung von verschiedenen Trägern, wie Vermiculit.
7. Feldversuch mit in Stufe 3 in Bezug auf abiotischen Stress ausgewählten Bakterien zur Ermittlung der Fähigkeit zur Förderung des Pflanzenwachstums an auf dem Feld gezüchteten Pflanzen, wie Zuckerrohr, unter Verwendung verschiedener Träger, wie Vermiculit und fermentierter Pressschlamm.

Die nach dem vorstehenden Verfahren ausgewählten Bakterienstämme besitzen die Fähigkeit zur Bekämpfung von phytopathogenen Pilzen, zur Förderung des Pflanzenwachstums, zur Erzielung von Toleranz gegen abiotischen Stress und zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen.
Gemäß diesem Befund besteht eine Aufgabe der Erfindung in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Auswahl von solchen Stämmen, die die Fähigkeit zur Bekämpfung von phytopathogenen Pilzen, zur Förderung des Pflanzenwachstums, zur Erzielung von Toleranz gegen abiotischen Stress und zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen besitzen, wobei man die auf diese Weise ausgewählten Bakterienstämme verwendet.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Maßnahmen zum Screening von Bakterien, um solche Bakterien auszuwählen, die die Fähigkeit zur Bekämpfung von phytopathogenen Pilzen und zur Förderung des Pflanzenwachstums unter Feldbedingen besitzen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung neuer Stämme von B. lentimorbus und B. subtilis, die die Fähigkeit zur Bekämpfung von phytopathogenen Pilzen, zur Förderung des Pflanzenwachstums, zur Erzielung von Toleranz gegen abiotischen Stress und zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen besitzen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von geeigneten Trägern für Bakterienstämme, insbesondere für neue Stämme von B. lentimorbus und B. subtilis, die in Stufe 3 in Bezug auf das Überleben in verschiedenen Trägern ausgewählt worden sind, für die gewerbliche Herstellung eines Bioinoculans für Pflanzen, Saatgut und Erdreich.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von neuen Stämmen von B. lentimorbus und B. subtilis, die die Fähigkeit zur Bekämpfung von phytopathogenen Pilzen unter Feldbedingungen besitzen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von neuen Stämmen von B. lentimorbus und B. subtilis, die die Fähigkeit zur Förderung des Pflanzenwachstums unter Feldbedingungen besitzen.
Weitere Ziele und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass die ausführliche Beschreibung und die speziellen Beispiele zwar bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung wiedergeben, jedoch nur der Erläuterung dienen, da verschiedene Abänderungen und Modifikationen innerhalb des Erfindungsgedankens und des Schutzumfangs der Erfindung sich für den Fachmann aus dieser ausführlichen Beschreibung ergeben.
In der Beschreibung wird der Ausdruck "Bakterien aus Milch" zur Bezeichnung von Bakterien verwendet, die in auf aseptischem Wege gemolkene Milch gelangt sind, indem sie in die Zitzen und/oder das Euter eingedrungen sind und dort unter suboptimalen Bedingungen überleben und sich vermehren. Somit gehören die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Bakterien zur bakteriellen Flora, die in den Zitzen und/oder im Euter vorhanden sind und zu einer nicht charakterisierten ökologischen Nische gehören.
Es wurde festgestellt, dass der prozentuale Anteil an Bakterienstämmen, die eine biologische Bekämpfungswirkung gegen phytopathogene Pilze zeigen, in der Milch der Sahiwal-Kuh am größten war, gefolgt von humaner Milch, der Milch der Holstein-Kuh und der Büffel-Milch. In Bezug auf diesen Parameter war die Milch der Sahiwal-Kuh der humanen Milch, der Milch der Holstein-Kuh und der Büffel-Milch überlegen.
Ausgedehnte Auswahlverfahren aus einer großen Anzahl von Bakterienstämmen, die aus humaner Milch, Milch der Sahiwal-Kuh, Milch der Holstein-Kuh und Büffel-Milch gewonnen worden sind, haben gezeigt, dass einige dieser Stämme (wie nachstehend beschrieben) die Fähigkeit zur Stimulierung des Pflanzenwachstums besitzen.
Daher besteht ein Aspekt der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zum Screening von wertvollen Bakterien aus humaner Milch, Milch der Sahiwal-Kuh, Milch der Holstein-Kuh und Büffel-Milch sowie in der Anwendung der Bakterien zur Förderung des Pflanzenwachstums.
Zunächst werden die Bakterien durch übliche Verfahren isoliert, wie sie beispielsweise von Eklund und Lankford, Laboratory manual for general microbiology (Prentice-Hall, Inc., USA, (1967), S. 21-27) beschrieben worden sind. Beispielsweise werden serielle Verdünnungen der Milchproben hergestellt. Diese Verdünnungen können auf verschiedene allgemeine Medien ausgestrichen werden. Zu Beispielen für allgemeine Medien, die sich zur Vermehrung einer Vielzahl von Bakterien eignen, gehören NA und dergl. Anschließend werden die NA-Platten 1 bis 3 Tage bei einer für bakterielles Wachstum geeigneten Temperatur, im allgemeinen bei etwa 25 bis 35°C, inkubiert. Die bevorzugte Inkubationstemperatur für die Platten beträgt 30°C.
Anschließend werden einzelne Stämme der Bakterien einem ersten Screening zur Auswahl von solchen Bakterien unterworfen, die das Potential zur Unterdrückung von phytopathogenen Pilzen unter in vitro-Bedingungen gemäß Literaturangaben besitzen (C. S. Nautiyal, Current Microbiology, Bd. 35 (1997), S. 52-58). Bakterielle Kolonien auf NA-Platten wurden rings um den Rand herum einer Petri-Schale mit einem Durchmesser von 90 mm ausgestrichen und die Platten wurden 1 bis 2 Tage bei 25-35°C inkubiert. Ein Agar-Pfropfen-Inokulum der zu testenden Pilze (5 mm-Quadrat) wurde sodann auf die Mitte der Platte in individueller Weise aus einer Quellenplatte der Pilze übertragen. Nach 5- bis 7-tägiger Inkubation ließen sich im Fall von Bakterienstämmen mit biologischer Bekämpfungswirkung leicht Hemmzonen feststellen.
Die Wahl der Inkubationszeit der bakteriellen Kolonien auf den Platten vor der Belastung mit den zu testenden pathogenen Pilzen und die Wahl der späteren Inkubationszeit bis zur Beobachtung der Hemmzone hängt von der Wachstumsgeschwindigkeit der zu testenden pathogenen Pilze ab. Wenn es sich beispielsweise um rascher wachsende Pilze, wie Rhizoctonia, handelt, ist es bevorzugt, die bakteriellen Kolonien auf NA-Platten rings um den Rand einer Petri-Schale mit einem Durchmesser von 90 mm mindestens 2 Tage vor Übertragung eines Agar-Pfropfen-Inokulums der zu testenden Pilze auf die Mitte der Platte auszustreichen. Wenn es sich dagegen um langsamer wachsende Pilze, z. B. Fusarium, handelt, ist es bevorzugt, ein Agar-Pfropfen-Inokulum der zu testenden Pilze auf die Mitte der Platte zu übertragen und die Platten 2 bis 3 Tage zu inkubieren, um den Pilzen eine ausreichende Zeit zum Wachstum zu geben, bevor die bakteriellen Kolonien auf NA-Platten rings um den Rand der Petri-Schale herum ausgestrichen werden.
In der vorstehenden Stufe isolierte Bakterienstämme werden einem Screening unterworfen, um solche Stämme auszuwählen, die in einer bestimmten Konzentration das Pflanzenwachstum unter Gewächshausbedingungen gemäß Literaturangaben fördern (C. S. Nautiyal, Current Microbiology, Bd. 34, (1997), S. 12-17). Bei diesem Test werden sterilisierte Maissamen in nicht-sterilisiertem Erdreich gezüchtet und mit den bakteriellen Stämmen in individueller Weise in einer Konzentration von log 6-10 KBE/Samen inokuliert. Die bevorzugte Konzentration des Inokulums beträgt log 8 KBE/Samen. Schalen (35 × 35 cm) mit 16 (4 × 4) Plätzen pro Schale (jeder Raum wies eine Breite von 7 cm und eine Tiefe von 10 cm auf, wobei ein Abstand von 1 cm zwischen den Räumen eingehalten wurde), haben sich als eine zweckmäßige Größe zur Züchtung von Mais und anderen Pflanzen für den Gewächshaustest erwiesen. Jeder Platz wurde in einer Höhe von 8 cm mit nicht-sterilisiertem Erdreich gefüllt. Obgleich auch sterilisiertes Erdreich oder ein anderes Trägermaterial für Pflanzenwachstum, wie Vermiculit, anstelle von nicht-sterilem Erdreich verwendet werden kann, ist es bevorzugt, im Gewächshaustest nicht-steriles Erdreich von dem Feld zu verwenden, auf dem die Bakterien freigesetzt werden sollen.
Vor dem Pflanzen der Samen wird Leitungswasser in jedes Loch gegeben, um die Feuchtigkeit des Bodens auf 15 bis 30% einzustellen. Vorzugsweise beträgt die Bodenfeuchtigkeit 20%. Vier mit Bakterien behandelte Samen wurden pro Vertiefung eingesetzt. Das Experiment im Gewächshaus wurde in vier verschiedenen Sätzen mit jeweils 16 Maissämlingen für nicht mit Bakterien behandelte Samen (Kontrolle) und für mit Bakterien behandelte Samen (Behandlungsgruppe) durchgeführt. In jedem Satz wurden die Daten von Sämlingen mit einem Alter von 21 Tagen in Bezug auf das durchschnittliche Trockengewicht von 16 Pflanzen aufgezeichnet. Damit ein bakterieller Stamm als Pflanzenwuchsförderer in Betracht kommt, müssen die mit den Bakterien behandelten Samen ein mindestens 10% höheres durchschnittliches Trockengewicht als die nicht mit Bakterien behandelten Vergleichspflanzen aufweisen.
Die auf diese Weise ausgewählten bakteriellen Stämme wurden ferner auf abiotische Stresstoleranz geprüft, indem sie zunächst einem Screening auf ihre Fähigkeit zum Wachstum in Nährbrühe (NB) mit einem Gehalt an 6% Salz (NaCl; pH-Wert 7 und eine Temperatur von 30°C) über Nacht (14-16 Stunden) auf einem gekühlten Inkubator-Schüttler (New Brunswick Scientific, USA, Innova Modell 4230) bei 180 U/min unterworfen. Die gegenüber 6% Salz toleranten Stämme wurden beim pH-Wert 9 (6% NaCl und eine Temperatur von 30°C) gezüchtet. Schließlich wurden die gegenüber 6% Salz und pH-Wert 9 toleranten Stämme bei einer Temperatur von 55°C gezüchtet. Lebensfähige Zellen wurden gezählt, indem Proben zu verschiedenen Zeitpunkten in Gegenwart oder Abwesenheit von Stressbelastung (gemäß den Angaben) ausgezählt wurden. Serielle Verdünnungen der einzelnen Proben wurden auf NA-Platten aufgetragen (25 μl) und im Dreifachversuch gemäß Literaturangaben bei 30°C inkubiert (C. S. Nautiyal et al., FEMS Microbiology Letters, Bd. 182 (2000), S. 291-296). Lebensfähige Zellen wurden nach 2-3 Tagen gezählt.
Die 3 gegenüber abiotischem Stress (Salz, pH-Wert und Temperatur) toleranten Stämme, die gemäß den vorstehenden Angaben ausgewählt worden waren, wurden ferner auf ihre Fähigkeit zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen einem Screening unterworfen. Eine quantitative Bestimmung der Solubilisierung von Phosphat in Brühe wurde unter Verwendung des Phosphat-Wachstumsmediums des National Botanical Research Institute (NBRIP) gemäß Literaturangaben durchgeführt (C. S. Nautiyal, FEMS Microbiology Letters, Bd. 170 (1999), S. 265-270).
Der Einfluss von Salz (NaCl), pH-Wert und Temperatur auf die Solubilisierung von Phosphat wurde durch Züchtung auf NBRIP in Gegenwart von NaCl sowie beim angegebenen pH-Wert und der angegebenen Temperatur gemäß dem Verfahren von Fiske und Subbarow (C. H. Fiske und Y. Subbarow, Journal of Biological Chemistry, Bd. 66 (1925), S. 375-400) getestet.
Die vorliegenden Stämme Bacillus lentimorbus NBRI0725, Bacillus subtilis NBRI1205 und Bacillus lentimorbus NBRI3009 weisen die in Tabelle 1 aufgeführten taxonomischen Eigenschaften auf, verglichen mit den herkömmlichen Stämmen B. lentimorbus und B. subtilis. Vergleich von biochemischen und physikalischen Eigenschaften von B. lentimorbus NBRI0725 (Erfindung), B. lentimorbus NBRI3009 (Erfindung), B. lentimorbus (Vergleich), B. subtilis NBRI1205 (Erfindung) und B. subtilis (Vergleich)

*Gemäß Beschreibung in R. E. Gordon et al., The genus Bacillus, Agriculture handbook Nr. 427, United States Department of Agriculture, U. S. Government Printing Office, Washington D. C. (1973); ND = Keine Daten verfügbar.

Die 3 Stämme B. lentimorbus NBRI0725, B. subtilis NBRI1205 und B. lentimorbus NBRI3009, die aus der Sahiwal-Kuh nach dem vorstehend beschriebenen Screening-Verfahren ausgewählt worden sind, weisen die Fähigkeit zur Bekämpfung von phytopathogenen Pilzen, zur Förderung des Pflanzenwachstums, zur Erzielung von Toleranz gegen abiotische Stressbelastungen und zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen auf. B. lentimorbus NBRI0725, B. subtilis NBRI1205 und B. lentimorbus NBRI3009 wurden gemäß dem Budapester Vertrag vom 5. Juli 2001 bei der ARS Patent Culture Collection, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, hinterlegt. Die bakteriellen Stämme B. lentimorbus NBRI0725, B. subtilis NBRI1205 und B. lentimorbus NBRI3009 erhielten die folgenden NRRL-Hinterlegungsnummern: B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 bzw. B. lentimorbus NRRL B-30488.
Zusätzlich zu den vorerwähnten übrigen Eigenschaften umfassen die unerwarteten und überraschenden Merkmale dieser spezifischen B. lentimorbus- und B. subtilis-Stämme die folgenden Charakteristika. Sämtliche drei Stämme wurden aus der Milch der Sahiwal-Kuh isoliert. Die Stämme weisen in Kultur eine rasche Generationszeit (55-65 Minuten bei 30°C) auf. In Reinkultur hemmen die Stämme das Wachstum zahlreicher pathogener Pilze von Pflanzen. Die Stämme sind zur Kolonisierung von Pflanzenwurzeln befähigt. Diese Bakterien verringern Pflanzenkrankheiten im Erdreich sowohl unter Gewächshaus- als auch unter Feldbedingungen. Die erfindungsgemäßen Stämme sind zur Förderung des Wachstums von Pflanzen in Erdreich sowohl unter Gewächshaus- als auch unter Feldbedingungen befähigt. Außerdem überleben die Stämme im Erdreich während der gesamten Wachstumssaison der Pflanze.
Die vorliegenden Bacillus-Stämme zeigen Toleranz gegen abiotische Stressbelastungen, wie 6% Salz (NaCl), pH-Werte von 5-9 und eine Temperatur von 55°C.
Die vorliegenden Bacillus-Stämme besitzen die Fähigkeit zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen, z. B. 0-4% Salz (NaCl), pH-Wert 7-9 und eine Temperatur von 30-45°C. Die Aktivität der Stämme in Bezug auf die Solubilisierung von Phosphat wird in Gegenwart von hohen Salzkonzentrationen, bei einem hohen pH-Wert und bei einer hohen Temperatur induziert.
Es fällt unter den Umfang der Erfindung, einen beliebigen Typ von Bakterien mit der Fähigkeit zur Bekämpfung von phytopathogenen Pilzen, zur Förderung des Pflanzenwachstums, zur Erzielung von Toleranz gegen abiotische Stressbelastungen und zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen zu isolieren, wobei jedoch Bacillus die Bakterien der Wahl darstellen, da sie folgende Eigenschaften aufweisen: (1) sie lassen sich leicht isolieren, züchten und identifizieren; (2) sie stellen ein natürlich auftretendes Isolat oder Stämme dar, die zu ihrer Wirksamkeit keiner gentechnischen Manipulation bedürfen; (3) sie sind in Bezug auf den Nährstoffbedarf vielseitig und zur Verwertung einer großen Anzahl von organischen Substraten befähigt, unter Einschluss von Wurzelexsudaten; (4) sie unterdrücken einen oder mehrere pathogene Pilze; (5) sie weisen ein Stadium in ihrem Lebenszyklus auf, indem sie gegenüber drastischen Umweltbedingungen resistent sind; (6) sie zeigen Toleranz gegen abiotische Stressbelastungen (hoher Salzgehalt, hoher pH-Wert und hohe Temperatur); (7) sie sind zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen (hoher Salzgehalt, hoher pH-Wert und hohe Temperatur) befähigt; (8) sie kolonisieren die Rhizosphäre des Wurzelsystems der Wirtspflanze(n) für die gesamte Wachstumssaison auf dem Feld; (9) sie erhöhen die Ausbeute der Wirtspflanze(n) unter Feldbedingungen; und (10) sie lassen sich relativ leicht für gewerbliche Zwecke entwickeln.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten und zur Förderung des Wachstums von Pflanzen in Erdreich sowohl unter Gewächshaus- als auch unter Feldbedingungen. Die drei Bakterienstämme mit den Bezeichnungen B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 sind bei diesem Verfahren besonders bevorzugt. Ein Inoculans des betreffenden Stammes wird so verwendet, dass die Kolonisierung im Bereich von etwa log 4-10 kolonienbildenden Einheiten/g Wurzel (KBE/g) und vorzugsweise im Bereich von log 6-8 KBE/g erfolgt. Ein Gemisch der 3 Stämme (Kombination) mit den Bezeichnungen B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 im Verhältnis von 1:1:1, bestehend aus jeweils etwa log 6-10 KBE/ml und vorzugsweise jeweils log 7-8 KBE/ml wird bei diesem Verfahren besonders bevorzugt. Das Inokulum kann direkt auf die Samen oder Pflanzen aufgebracht werden, kann im Erdreich vor dem Pflanzen vorhanden sein oder es kann auf die Pflanzen oder die Bodenoberfläche oder in Pflanzenfurchen, wo die Pflanzung bereits erfolgt ist, durch Verteilen, Zerstäuben oder dergl. ausgebracht werden.
Samen können behandelt werden, indem man sie mit einer Zusammensetzung mit einem Gehalt an den vorliegenden Bakterien unter Eintauchen in eine diese Bakterien enthaltende Flüssigkeit beschichtet, indem man sie mit der Flüssigkeit besprüht oder indem man ein anderes bekanntes Verfahren zum Aufbringen von Bakterien auf Samen anwendet.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung können Kulturen von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 individuell in Melassen gezüchtet werden, die mit Wasser im Verhältnis von 1:1 bis 1:10 verdünnt sind. Eine Verdünnung von 1:5 wird bei diesem Verfahren besonders bevorzugt. Die bakteriellen Stämme können individuell oder als eine Kombination im Verhältnis von 1:1:1 verwendet werden, die jeweils aus etwa log 6-11 KBE/ml besteht, wobei bei diesem Verfahren ein Wert von log 8-9 KBE/ml besonders bevorzugt wird. Die auf diese Weise erhaltene Kombination kann ferner mit Wasser im Verhältnis von 1:10 bis 1:10 000 verdünnt werden. Jedoch wird eine Verdünnung von 1:100 bei diesem Verfahren besonders bevorzugt.
Das Züchten der Bakterien in Melassen macht das Verfahren wirtschaftlich sehr wertvoll. Auf diese Weise gezüchtete Bakterien können ferner zur Behandlung von Samen verwendet werden, indem man sie mit einer die vorliegenden Bakterien enthaltenden Zusammensetzung durch Eintauchen in eine diese Bakterien enthaltende Flüssigkeit beschichtet, indem man sie mit der Flüssigkeit besprüht oder indem man sie einem anderen bekannten Verfahren zum Aufbringen von Bakterien auf Samen unterwirft.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung kann das erfindungsgemäße Verfahren mit einer beliebigen Art von Bakterien oder anderen Mikroorganismen angewandt werden, die zum Überleben unter abiotischen Stressbedingungen (z. B. Toleranz gegen Salz, pH-Wert und Temperatur) befähigt sind. Von besonderem Interesse sind Bakterien, die biozide Eigenschaften, z. B. biofungizide, pestizide und andere entsprechende Eigenschaften, aufweisen, das Pflanzenwachstum fördern und Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen solubilisieren (z. B. bei hohem Salzgehalt, hohem pH-Wert und hoher Temperatur), und die zum Überleben im Erdreich in Gegenwart der Pflanzen befähigt sind.
Die Träger, die zum Dispergieren der vorliegenden Stämme verwendet werden können, umfassen alle Träger, die üblicherweise für die Inokulation von Nutzpflanzen verwendet werden. Hierzu gehören Träger, wie Reiskleie, Carboxymethylcellulose, Torf, Perlit, Polyvinylpyrrolidon und Talcum. Die Bakterien liegen in derartigen Zusammensetzungen in einer Konzentration von etwa log 4-10 KBE/g Träger vor. Träger, wie Vermiculit, Aktivkohle oder fermentierter Pressschlamm, sind bei diesem Verfahren besonders bevorzugt. Die Bakterien werden in Brühe bis zur erforderlichen Menge gezüchtet und sodann mit dem Träger zum gewünschten Inokulum vermischt, wonach die Härtung des Gemisches durch bekannte Verfahren erfolgt.
Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung kann der optimale Träger von den verwendeten Bakterien abhängen. Beliebige der vorstehenden Zusammensetzungen, Flüssigkeiten, Pulver, Torfprodukte, Erdreich, Vermiculit, Aktivkohle, fermentierter Pressschlamm und dergl. können Nährstoffe darin enthalten, oder es kann ein geeignetes Trägermedium, wie Wasser, Öle oder Feststoffe, z. B. Pulver, Torf, Erdreich, Vermiculit, Aktivkohle, fermentierter Pressschlamm und beliebige andere Trägermittel, vorliegen. Jedoch werden, wie in den nachstehenden Beispielen belegt, Vermiculit, Aktivkohle und fermentierter Pressschlamm bevorzugt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem die auf diese Weise hergestellte synergistische Zusammensetzung der Erfindung in einer aus dem Stand der Technik bekannten Art und Weise verwendet werden kann, wozu eine Vorbehandlung von Erdreich oder Samen oder von vorgekeimten Pflanzenwurzeln allein oder in Kombination mit anderen Chemikalien, die für das Wachstum und das Überleben von Bakterien unschädlich sind, z. B. das Pflanzenwachstum fördernde Verbindungen, Pestizide, Düngemittel, Nematizide, Herbizide mit oder ohne Kalkpelletisierung, um die Schwere des Einflusses dieser Materialien zu begrenzen, gehören. Jedoch werden, wie durch die nachstehenden Beispiele belegt, verträgliche Pestizide bevorzugt.
Die nachstehenden Beispiele stellen keine Beschränkung dar und ermöglichen ein besseres Verständnis der Erfindung.
Beispiel 1
Isolierung von Bakterienstämmen aus Milch
50 bakterielle Vertreter der vorherrschenden, morphologisch unterschiedlichen Kolonien, die auf den Platten vorhanden waren, wurden von jeweils 3 individuellen Milchproben von gesunden Frauen, von einheimischen Kühen (Sahiwal), von fremdländischen Kühen (Holstein-Friesische Rasse) und von Büffeln ausgewählt. Somit wurden insgesamt 600 Bakterienstämme für den weiteren Screening-Vorgang gewonnen. Humane Milch wurde von drei Müttern mit Stillkindern im Alter von 6 bis 12 Wochen gewonnen. Milch von reinrassigen einheimischen Sahiwal-Kühen # 12, # 217 und # 249 wurde von der Gajaria-Farm, Department of Animal Husbandry, Government of Uttar Pradesh, Lucknow, gewonnen. Milch von Kühen der fremden Holstein-Friesischen Rasse (15/16) # 154, # 412 und # 667 wurde von der Indian Military Farm, Central Command Headquarters, Indian Army, Lucknow, erhalten. Milchproben von Büffeln wurden von einer lokalen gewerblichen Milchfarm bezogen. Die Milch wurde nach der Entnahme in sterilen Behältern gesammelt, wobei auf eine Hygiene der Zitzen und des Entnahmepersonals geachtet wurde. Die Milchproben wurden am Morgen aus dem mittleren Milchstrom aus der Zitze direkt in den sterilen Behälter ohne jeglichen Kontakt gegeben und während des Transports in einem eisgekühlten Behälter aufbewahrt. Serienverdünnungen der Milchproben wurden sodann innerhalb von 2 Stunden nach dem Gewinnen auf Nähragar (NA)-Platten (Rindfleischextrakt 5,0 g, Pepton 10,0 g, Natriumchlorid 5,0 g, Agar 15 g, destilliertes Wasser 1 000 ml, pH-Wert 7,2) ausgestrichen.
Reine Isolate der einzelnen Stämme wurden von Bakterien, die repräsentativ für die vorherrschenden, morphologisch verschiedenen Kolonien auf den Platten waren, willkürlich ausgewählt und durch Subkultur einzelner Stämme an NA-Platten gereinigt. Man erhielt reine Kulturen. Die einzelnen Isolate wurden bei –25°C in einer wässrigen, 30%igen Glycerinlösung aufbewahrt.
Die Gesamtbakterienzahlen von drei individuellen Milchproben, die von gesunden Frauen, Sahiwal-Kühen und Holstein-Kühen erhalten worden waren, betrugen log 3 KBE/ml, verglichen mit dem um eine logarithmische Einheit höheren Wert von log 4 KBE/ml von Büffelmilch (Tabelle 2).
Tabelle 2
Beispiel 2
Screening von Bakterienstämmen unter in vitro-Bedingungen auf die Fähigkeit zur Unterdrückung von pathogenen Pilzen und Bakterien
Die gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 erhaltenen 600 Bakterienstämme wurden einem Screening auf ihre Fähigkeit zur Hemmung des Wachstums von Colletotrichum falcatum, Sclerotium rolfsii, Alternaria solani, Penicillium sp., Pythium aphanidermatum, Phytophthora palmivora, Curvularia lunata, Sclerotinia sclerotiorum und Aspergillus niger unter in vitro-Bedingungen auf folgende Weise unterzogen: vier einzelne bakterielle Kolonien auf NA-Platten wurden rings um den Rand einer Petri-Schale mit 90 mm Durchmesser ausgestrichen und die Platten wurden 2 Tage bei 28°C inkubiert. Ein Agar-Pfropfen-Inokulum der zu testenden Pilze (5 mm-Quadrat) wurde sodann auf die Mitte der Platte jeweils einzeln von einer Quellenplatte der Pilze übertragen. Nach 5- bis 7-tägiger Inkubation ließen sich leicht Hemmzonen im Fall von bakteriellen Stämmen mit einer Biokontrollwirkung feststellen, da das Pilzwachstum um die Ausstrichstelle herum gehemmt war. Dagegen wurde im Fall von bakteriellen Stämmen ohne Biokontrollwirkung das Pilzwachstum um die Ausstrichstelle nicht gehemmt und die Pilze wuchsen zum Plattenrand hin (Tabelle 3). Stämme, die eine Hemmzone von mindestens 2 mm zeigten, wurden als positiv ausgewählt und für die weiteren Arbeiten herangezogen.
Tabelle 3
Es wurde festgestellt, dass der prozentuale Anteil von Bakterienstämmen mit Biokontrollwirkung gegen phytopathogene Pilze bei der Sahiwal-Kuh am größten war, gefolgt von humaner Milch, Holstein-Kuh und Büffel. In Bezug auf diesen Parameter ist die Milch der Sahiwal-Kuh der humanen Milch, der Holstein-Milch und der Büffelmilch überlegen (Tabelle 2). Stämme, die eine Hemmzone von mindestens 2 mm zeigten, wurden als positiv ausgewählt und für die weiteren Arbeiten herangezogen.
Von 600 in vitro getesteten Stämmen wurde nur bei 150 festgestellt, dass sie gemäß den vorstehenden Kriterien eine Biokontrollwirkung besitzen.
Beispiel 3
Screening von Bakterienstämmen auf die Fähigkeit zur Förderung des Pflanzenwachstums im Gewächshaus
Die 150 Bakterienstämme, die pathogene Pilze in vivo unterdrückten, wurden im Gewächshaus einem Screening unterworfen, indem mit Bakterien behandelte Maissamen in nicht-sterilem Erdreich gezüchtet wurden und die behandelten Maispflanzen mit Kontrollmaispflanzen, die ohne bakterielle Behandlung gezüchtet worden waren, verglichen wurden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Screening von Bakterienstämmen auf ihre Fähigkeit zur Förderung des Pflanzenwachstums im Gewächshaus wird unter spezieller Bezugnahme auf Mais als Pflanze beschrieben. Dies soll jedoch nicht bedeuten, dass das Verfahren zum Screening von Bakterienstämmen auf ihre Fähigkeit zur Förderung des Pflanzenwachstums im Gewächshaus auf diese Pflanze beschränkt ist, vielmehr können beliebige geeignete andere Pflanzen verwendet werden.
Nicht-steriler Feldboden aus der Farm des National Botanical Research Institute, Lucknow, wurde zur Bewertung des das Pflanzenwachstum fördernden Potentials der 150 Stämme im Gewächshaus verwendet.
Bakterielles Inokulum für Maissamen wurde hergestellt, indem eine 48 Stunden gezüchtete Kultur von Platten mit 10 ml einer Lösung von 0,85% Kochsalz in Wasser abgeschabt wurde. Maissamen wurden an der Oberfläche durch mäßiges Schütteln (80 U/min bei 28°C mit einer Schüttelvorrichtung) mit 70% Ethanol (5 Minuten), 20% Chlorox-Bleiche (10 Minuten) und durch anschließendes 3-maliges Spülen in sterilem Wasser sterilisiert. Nach der Oberflächensterilisation wurden die Samen 4 Stunden bei 28°C auf einer Schüttelvorrichtung mit 100 U/min in der bakteriellen Suspension eingeweicht. Kontrollsamen (nicht mit Bakterien behandelt) wurden in einer 0,85% Lösung von Kochsalz in Wasser, mit dem nicht-inokulierte Platten abgewaschen worden waren, eingeweicht. Der Grad des Bakterienbesatzes der Samen wurde durch Bewegen von 4 Samen einer jeden Behandlung und durch Ausstreichen nach serieller Verdünnung auf einer NA-Platte bestimmt. Die durchschnittlichen KBE-Werte/Samen wurden bestimmt, indem die KBE/g-Werte der drei Populationen in drei Wiederholungsversuchen pro Behandlung nach 48-stündiger Inkubation der Platten bei 28°C gemittelt wurden. Samen für Behandlungen, bei denen Gemische der drei Isolate verwendet wurden, wurden inokuliert, indem die gleiche Gesamtzahl an Bakterien für das Inokulum verwendet wurde, wie es für die Behandlungen mit einzelnen Isolaten eingesetzt worden war. Somit wurde ein Drittel der normalen Menge eines jeden Isolats im Gemisch verwendet.
Schalen (35 × 35 cm) mit 16 (4 × 4) Plätzen pro Schale (jeder Raum wies eine Breite von 7 cm und eine Tiefe von 10 cm auf, wobei der Abstand der Räume voneinander 1 cm betrug) wurden zum Züchten von Mais verwendet. Jeder Platz wurde in einer Höhe von 8 cm mit nicht-sterilisiertem Erdreich gefüllt. Leitungswasser (25 ml) wurde vor dem Pflanzen der Samen in jedes Loch gegeben, um das Erdreich auf eine Feuchtigkeit von 20% einzustellen. Vier mit Bakterien behandelte Samen wurden pro Loch zugegeben. Das Experiment im Gewächshaus wurde in vier verschiedenen Ansätzen von jeweils 16 Maissämlingen für die nicht mit Bakterien behandelten Samen (Kontrolle) und die mit Bakterien behandelten Samen (Behandlungsgruppe) durchgeführt. Bei jedem Ansatz wurden die Daten von 21 Tage alten Sämlingen in Bezug auf das Trockengewicht der Pflanzen festgehalten. Damit sich der bakterielle Stamm als Pflanzenwuchsförderer eignet, müssen die mit den Bakterien behandelten Sämlinge im Durchschnitt ein mindestens 10% höheres Trockengewicht als vergleichbare, nicht mit Bakterien behandelte Pflanzen aufweisen.
Von den 150 im Gewächshaustest getesteten Bakterienstämmen wurde bei 50 Stämmen festgestellt, dass sie gemäß den vorstehenden Kriterien eine den Pflanzenwuchs fördernde Wirkung besitzen.
Beispiel 4
Screening von Bakterienstämmen auf abiotische Stresstoleranz
Die Bakterienstämme, die in vitro pathogene Pilze unterdrückten und das Pflanzenwachstum von Mais beim Gewächshaustest durch Züchten von mit Bakterien behandelten Maissamen in nicht-sterilem Erdreich (verglichen mit Kontrollmaispflanzen, die ohne bakterielle Behandlung gezüchtet worden waren) verstärkten, wurden ferner auf folgende Weise einem Screening auf abiotische Stresstoleranz unterworfen: Die Stresstoleranz der Stämme gegen Salz (NaCl), pH-Wert und Temperatur wurde getestet, indem sie auf Nährbrühe (NB; Fleischextrakt 5,0 g, Pepton 10,0 g, Natriumchlorid 5,0 g, destilliertes Wasser 1 000 ml, pH-Wert 7,2) unter verschiedenen Stressbedingungen, z. B. 6% Salz (NaCl), pH-Wert 5-9 und eine Temperatur von 55°C, gezüchtet wurden. Lebensfähige Zellen wurden gezählt, indem zu verschiedenen Zeitpunkten in Gegenwart oder Abwesenheit von Stress, wie angegeben, Proben entnommen wurden. Zunächst wurden sämtliche 50 Stämme einer 6%igen Salzbelastung unterzogen. 15 Stämme von 50 waren zum Wachstum in Gegenwart von 6% Salzbelastung über Nacht (14-16 Stunden) bei 30°C auf einen gekühlten Inkubator/Schüttler bei 180 U/min (New Brunswick Scientific, USA, Innova Modell 4230) befähigt. Die 15 Stämme, die Toleranz gegen 6% Salzbelastung zeigten, waren auch fähig, über Nacht bei einem pH-Stress von 9,0 zu wachsen. Jedoch waren nur 3 Stämme von den 15 Stämmen dazu befähigt, über Nacht bei einem Temperaturstress von 55°C zu wachsen. Serielle Verdünnungen der einzelnen Proben wurden auf NA-Platten aufgesetzt (25 μl) und bei 30°C im Dreifachversuch gemäß Literaturangaben inkubiert (C. S. Nautiyal et al., FEMS Microbiology Letters, Bd. 182 (2000), S. 291-296). Lebensfähige Zellen wurden nach 2-3 Tagen gezählt.
Von den 50 Bakterienstämmen, die beim Stresstoleranztest getestet worden waren, wurden somit die drei Stämme mit NRRL-Nummern B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 als stresstolerante Stämme gemäß den vorstehenden Kriterien bestimmt.
Beispiel 5
Fähigkeit von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen
Die 3 bakteriellen Stämme B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488, die pathogene Pilze in vitro unterdrückten, ein verstärktes Pflanzenwachstum von Mais beim Screening im Gewächshaus durch Züchten von mit Bakterien behandelten Maissamen in nicht-sterilem Erdreich (verglichen mit Kontrollmaispflanzen, die ohne bakterielle Behandlung gezüchtet worden waren) aufwiesen und sich gegenüber abiotischen Stressbelastungen (Salz, pH-Wert und Temperatur) als tolerant erwiesen, wurden ferner einem Screening auf ihre Fähigkeit zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen auf folgende Weise unterworfen: Eine quantitative Ermittlung der Phosphat-Solubilisierung in Brühe wurde unter Verwendung von Erlenmeyer-Kolben (150 ml) mit einem Gehalt an 10 ml Medium, das im Dreifachversuch mit dem Bakterienstamm (100 μl Inokulum mit etwa log 9 KBE/ml) inokuliert worden war, durchgeführt.
Die Werte beziehen sich auf die Menge des durch die Stämme solubilisierten P (μg/ml) bei individueller 3-tägiger Züchtung im Phosphat-Wachstumsmedium des National Botanical Research Institute (NBRIP; Glucose 10 g; Ca₃(PO₄)₂ (Tricalciumphosphat) 5 g; MgCl₂·6H₂O 5 g; MgSO₄·7H₂O 0,25 g; KCl 0,2 g und (NH₄)₂SO₄ 0,1 g (C. S. Nautiyal, FEMS Microbiology Letters, Bd. 170 (1999), S. 265-270) bei 30°C in Gegenwart von 0% Salz (NaCl) beim pH-Wert 7 gezüchtet worden waren. Der Einfluss von Salz (NaCl), pH-Wert und Temperatur auf die Solubilisierung von Phosphat wurde getestet, indem eine Züchtung auf NBRIP in Gegenwart von NaCl (0, 1, 2 und 4%), pH-Wert 7 und 9, und bei einer Temperatur von 30 und 45°C gemäß den Angaben in Tabelle 4 durchgeführt wurde. Autoklavisierte, nicht inokulierte absatzweise Kulturen dienten als negative Kontrollen. Kolben wurden 3 Tage bei 30°C auf einem gekühlten Inkubator/Schüttler (New Brunswick Scientific, USA, Innova Modell 4230) bei 180 U/min inkubiert. Die Stämme wurden durch 10-minüte Zentrifugation mit 10 000 U/min unter Verwendung einer Sorvall RC 5C-Zentrifuge, (Dupont, USA) geerntet. Die Konzentration an Phosphat im Kulturüberstand wurde unter Anwendung des Verfahrens von Fiske und Subbarow bestimmt (C. H. Fiske und Y. Subbarow, Journal of Biological Chemistry, Bd. 66 (1925), S. 375-400).
Tabelle 4
Sämtliche 3 Bakterienstämme, nämlich B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488, zeigten eine variable Induktionsfähigkeit der Phosphat-Solubilisierung unter in vitro-Bedingungen in Gegenwart von hohem Salzgehalt bei einem hohen pH-Wert und bei hoher Temperaturbelastung.
Beispiel 6
Fähigkeit von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter in vitro-Bedingungen zur Unterdrückung von pathogenen Pilzen in Gegenwart oder Abwesenheit von hohen Salzmengen und pH-Belastung
Die 3 Bakterienstämme B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 wurden einem Screening auf ihre Biokontrollwirkung gegen verschiedene pflanzenpathogene Pilze unter in vitro-Bedingungen in Gegenwart oder Abwesenheit von großen Salzmengen und pH-Belastung unterworfen (Tabelle 5). Tabelle 5

NG* = Kein Wachstum von Pilzen; NZ** = Keine Hemmzone

Sämtliche 3 Bakterienstämme B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 zeigten eine variable Biokontrollwirkung gegen verschiedene phytopathogene Pilze unter in vitro-Bedingungen in Gegenwart von großen Salzmengen und/oder von pH-Belastung. Die Stämme zeigten auch eine variable Biokontrollwirkung gegen verschiedene phytopathogene Pilze unter in vitro-Bedingungen in Gegenwart oder Abwesenheit von großen Salzmengen und pH-Belastung. Daher wurde die Möglichkeit der Verwendung einer Kombination sämtlicher 3 Bakterien untersucht.
Beispiel 7
Wechselwirkung von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln oder in Kombination unter in vitro-Bedingungen mit für Kichererbsen phytopathogenen Pilzen
Die Wechselwirkung von F. oxysporum f. sp. ciceri, Rhizoctonia solani, Pythium sp. und S. sclerotiorum mit B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und in Kombination in einem flüssigen Medium wurde in einem doppelten Kulturtest durch Züchtung des Bakteriums/Kombination auf Nährbrühe in Gegenwart und Abwesenheit der Pilze untersucht. Eine Agar-Platte (5 mm Durchmesser) von F. oxysporum f. sp. ciceri, Rhizoctonia solani, Pythium sp. und S. sclerotiorum wurde einzeln in 150 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben mit einem Gehalt an 50 ml Nährbrühe inokuliert.
Eine Suspension von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und als Kombination mit einem Gehalt an log 8,0 KBE/ml wurde inokuliert und die Kolben wurden 7 Tage unter statischen Bedingungen in einem Inkubator/Schüttler bei 30°C inkubiert. Die Kontrollkulturen wurden ohne Bakterien gezüchtet. Die Kombination der 3 Bakterienstämme B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 wurde hergestellt, indem die 3 Kulturen mit etwa log 8,0 KBE/ml im Verhältnis von 1:1:1 hergestellt wurden. Das Myzel-Trockengewicht des in Gegenwart und Abwesenheit von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und als Kombination gezüchteten Pilzes wurde bestimmt, indem das gebrauchte Medium unter Verwendung von Whatman-Filterpapier Nr. 1 filtriert wurde und die Pilzmasse auf dem Filterpapier 3 Tage bei 60°C getrocknet wurde. Die Testergebnisse der Wechselwirkung von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und als Kombination unter in vitro-Bedingungen mit F. oxysporum f. sp. ciceri, Rhizoctonia solani, Pythium sp. und S. sclerotiorum sind in Tabelle 6 aufgeführt.
Tabelle 6
Aus den in Tabelle 6 vorgelegten Ergebnissen ist ersichtlich, dass sämtliche 3 Bakterienstämme B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und in Kombination in wirksamer Weise das Wachstum von F. oxysporum f. sp. ciceri, Rhizoctonia solani, Pythium sp. und S. sclerotiorum unter in vitro-Bedingungen hemmten. Jedoch war die Kombination der Bakterienstämme in Bezug auf die Hemmung des Wachstums der Testpilze am wirksamsten.
Beispiel 8
Überleben von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und als Kombination auf Vermiculit als Träger
Die Bestimmung der Überlebensfähigkeit der 3 Bakterienstämme B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und als Kombination auf Vermiculit als Träger wurde über einen Zeitraum von 12 Monaten bei 10°C gemäß dem folgenden Verfahren durchgeführt. Die 3 Bakterienstämme B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 wurden einzeln in flüssigem Wachstumsmedium NB gezüchtet. Kulturen wurden in 2 Liter fassenden Kolben mit einem Gehalt an 1,5 Liter NB-Medium gezüchtet und 2 Tage auf einem gekühlten Inkubator/Schüttler (New Brunswick Scientific, USA, Innova Modell 4230) mit 180 U/min inkubiert. Nach 2-tägigem Wachstum wurden 300 ml der Kultur zu 1 kg sterilem Vermiculit in einem autoklavisierbaren Kunststoffbeutel gegeben, was zu einer etwa 30%igen Feuchtigkeit des Produkts führte. Die Kombination der 3 Bakterienstämme B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 wurde hergestellt, indem die 3 Kulturen mit etwa log 8,5 KBE/ml im Verhältnis 1:1:1 vermischt wurden. Durch Inkubation der verschlossenen Beutel für 2 Tage bei 30°C ergab sich eine Härtung der Bioinoculans-Zubereitung. Nach der Härtung wurden die verschlossenen Beutel bei 10°C aufbewahrt. Aliquotanteile wurden periodisch zur Durchführung von Messungen der Überlebensfähigkeit entnommen (Tabelle 7). Die Überlebensfähigkeit des Produkts wurde durch das übliche serielle Verdünnungsverfahren auf NA-Platten bestimmt.
Tabelle 7
Wie aus Tabelle 7 ersichtlich ist, ergaben alle 3 Stämme B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und als Kombination gute Überlebensraten während einer Langzeitlagerung in Vermiculit bei 10°C. Nach 12-monatiger Lagerung waren etwa log 8 KBE/g Vermiculit vorhanden. Diese Daten zeigen, dass Vermiculit ein hervorragendes Trägermaterial für die später auf Samen, Pflanzen oder Erdreich zu inokulierenden Stämme darstellt, da kein merklicher Verlust der Zelllebensfähigkeit beobachtet wurde.
Beispiel 9
Biokontrollwirkung von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und als Kombination im Gewächshaus gegen für Kichererbsen phytopathogene Pilze
Die 3 Bakterienstämme B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 wurden einzeln und als Kombination einem Screening im Gewächshaus auf ihre Wirkung gegen für Kichererbsen phytopathogene Pilze unterworfen. Die Züchtung von Pilzen für den Pflanzentest wurde durchgeführt, indem ein 1 000 ml fassender Erlenmeyer-Kolben mit 100 g Mais und 400 g grobem Sand autoklavisiert wurde und die Feuchtigkeit nach dem Autoklavisieren mit sterilem, destilliertem Wasser auf 15% eingestellt wurde. Der Kolben wurde bei 30°C einzeln mit einem Agar-Pfropfen von 10 mm Durchmesser aus einer Nähragar-Kultur von F. oxysporum f. sp. ciceri, R. solani und Pythium sp. im Dunkeln 4 Wochen lang inkubiert. Nach den 4 Wochen wurde das Gemisch an der Luft getrocknet, gemahlen und zur Gewinnung von Teilchen mit einer Größe von 0,5 mm gesiebt. Jedes Inokulum wurde innig mit sterilem Erdreich in einer Menge von 0,15% Inokulum pro Gesamtgewicht des Erdreichs vermischt, wodurch ein fertiges Gemisch von 0,45% Inokulum F. oxysporum f. sp. ciceri, R. solani und Pythium sp. pro Gesamtgewicht Erdreich gemäß Literaturangaben erhalten wurde (C. S. Nautiyal, Current Microbiology, Bd. 35 (1997), S. 52-58).
Das Experiment zur Prüfung der Biokontrollwirkung von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und als Kombination wurde in vier verschiedenen Ansätzen mit jeweils 30 Kichererbsen-Sämlingen mit behandelten und nicht-behandelten Samen (Kontrolle) durchgeführt. Kichererbsen-Samen wurden für das Inokulum mit B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und als Gemisch gemäß den Angaben in Beispiel 3 vorbereitet, mit der Ausnahme, dass Vermiculit gemäß Beispiel 8 als Träger verwendet wurde, anstelle eines direkten Inokulums aus der Petri-Schale. In jedem Ansatz wurden die Daten für das Pflanzenwachstum 5 Monate lang in Bezug auf Keimung des Sämlings, Sämlingsmortalität (abgestorbene Sämlinge, im Höhenwachstum gehemmte Sämlinge, Erschlaffen der Blätter, Wurzelentfärbung), Pflanzenhöhe, Anzahl der Schoten und Samentrockengewicht festgehalten. Die Ergebnisse sind tabellenförmig in der folgenden Tabelle 8 aufgeführt.
Tabelle 8
Aus den in Tabelle 8 vorgelegten Ergebnissen ist ersichtlich, dass inokulierte Pflanzen eine geringere Sämlingssterblichkeit und eine bessere Entwicklung in Bezug auf Sämlingskeimung, Pflanzenhöhe, Anzahl an Schoten und Samentrockengewicht zeigten, verglichen mit der nicht-inokulierten Kontrolle. Unter den inokulierten Pflanzen zeigte die Kombination die besten Ergebnisse in Form einer geringeren Sämlingssterblichkeit und einer besseren Entwicklung in Bezug auf Sämlingskeimung, Pflanzenhöhe, Anzahl an Schoten und Samentrockengewicht.
Beispiel 10
Förderungswirkung des Pflanzenwachstums von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und in Form einer Kombination im Gewächshaus unter Verwendung von Kichererbsen
Das Experiment zur Prüfung der Förderungswirkung des Pflanzenwachstums von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und in Form einer Kombination wurde in vier verschiedenen Ansätzen mit jeweils 30 Kichererbsen-Sämlingen für behandelte und nicht-behandelte Samen (Kontrolle) durchgeführt. Kichererbsen-Sämlinge wurden für die Inokulation mit B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und in Form einer Kombination unter Verwendung von Vermiculit als Träger gemäß den Angaben in Beispiel 9 vorbereitet. In jedem Ansatz wurden die Daten für das Pflanzenwachstum 5 Monate lang in Bezug auf Sämlingskeimung, Pflanzenhöhe, Anzahl der Schoten und Samentrockengewicht festgehalten. Die Ergebnisse sind tabellarisch in Tabelle 9 aufgeführt.
Tabelle 9
Aus den in Tabelle 9 aufgeführten Ergebnissen ist ersichtlich, dass inokulierte Pflanzen eine bessere Beschaffenheit in Bezug auf Sämlingskeimung, Pflanzenhöhe, Anzahl an Schoten und Samentrockengewicht zeigten, verglichen mit einer nicht-inokulierten Kontrolle. Unter den inokulierten Pflanzen zeigte die Kombination die besten Ergebnisse in Bezug auf eine bessere Sämlingskeimung, Pflanzenhöhe, Anzahl an Schoten und Samentrockengewicht.
Beispiel 11
Das Pflanzenwachstum fördernde Aktivität der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 im Gewächshaus bei verschiedenen Pflanzen
Samen wurden gemäß den vorstehenden Angaben in Beispiel 8 vorbereitet und inokuliert, um die das Pflanzenwachstum fördernde Wirkung der Kombination von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 im Gewächshaus an verschiedenen Pflanzen zu testen. Das Experiment im Gewächshaus wurde in vier verschiedenen Ansätzen mit jeweils 16 Sämlingen für nicht mit Bakterien behandelte Samen (Kontrolle) und für mit Bakterien behandelte Samen (Behandlungsgruppe) von Zea mays, Abelmoschus esculentus, Luffa cylindrica, Lycopersicon esculentum und Cucumis sativus durchgeführt. Bei jedem Ansatz wurde das Pflanzentrockengewicht von 21 Tage alten Sämlingen festgehalten. Die Ergebnisse der das Pflanzenwachstum fördernden Wirkung der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 im Gewächshaus an verschiedenen Pflanzen sind in Tabelle 10 aufgeführt.
Tabelle 10
Die Daten in Tabelle 10 zeigen eine unterschiedliche, das Pflanzenwachstum fördernde Wirkung, angegeben als Trockengewicht, bei Zea mays, Abelmoschus esculentus, Luffa cylindrica, Lycopersicon esculentum und Cucumis sativus durch die Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 im Gewächshaus. Wie aus den Ergebnissen ersichtlich ist, war das Trockengewicht der mit Bakterien behandelten Sämlinge um 18-340% höher als das der nicht mit Bakterien behandelten Sämlinge.
Beispiel 12
Feldversuch der Biokontrollwirkung der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 gegen für Kichererbsen phytopathogene Pilze
Die Biokontrollwirkung der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 gegen für Kichererbsen phytopathogene Pilze wurde in Feldversuchen auf den Farmen der Banaras Hindu University, Varanasi; Chandra Shelchar Azad University of Agriculture & Technology, Kanpur; und Indian Agricultural Research Institute, New Delhi, auf Parzellen mit einer übereinstimmenden Vorgeschichte einer schweren Infektion von Kichererbsen der Varietät Radhey durch F. oxysporum f. sp. ciceri getestet. Die Bakterienstämme wurden gemäß den Angaben in Beispiel 8 vermehrt. Bei allen Versuchen wurde die Aussaat im Oktober 2000 durchgeführt. Die Ernte wurde nach 5-monatigem Wachstum im März 2001 durchgeführt. Die Feuchtigkeit des Feldbodens zum Zeitpunkt der Aussaat lag im Bereich von 25-30% und die Kulturpflanzen wurden vollständig mit Regen versorgt. Nach der Aussaat wurden keine mechanischen Kultivationstechniken durchgeführt. Jedes Experiment wurde in einer randomisierten Blockanordnung durchgeführt. 6 Wiederholungsversuche pro Behandlung innerhalb der Blöcke bestanden aus Parzellen mit drei 4 m-Reihen (30 cm Abstand). Nach 10-tägiger Keimung wurden die Sämlinge auf 50 Sämlinge pro Reihe ausgedünnt. Sämtliche Ergebnisse wurden aus den mittleren Reihen gewonnen, wobei die beiden Nachbarreihen als Schutzreihen ausgeschlossen wurden. Dies galt sowohl für die nicht-mit Bakterien behandelten Samen (Kontrolle) als auch für die mit Bakterien behandelten Samen (Behandlungsgruppe) von Kichererbsen mit der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 (log 8 KBE/ml). Bei den Werten handelt es sich um Mittelwerte von 6 Wiederholungsversuchen mit jeweils 10 Pflanzen, während es sich bei den Werten für das Trockengewicht (g) um den Mittelwert von 100 Samen, die willkürlich aus 6 Wiederholungsversuchen mit jeweils 10 Pflanzen ausgewählt wurden, handelt.
Tabelle 11
Aus den Daten von Tabelle 11 ist ersichtlich, dass im Vergleich zur Kontrolle an allen drei Orten die mit der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 behandelten Kichererbsen-Samen ein verbessertes Verhalten der Pflanzen in Bezug auf prozentuale Zunahme des Überlebens der Sämlinge, Pflanzenhöhe, Anzahl an Schoten/Pflanze und Gewicht von 100 Samen sowie Ausbeute/Parzelle zeigten.
Beispiel 13
Überleben von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und in Form einer Kombination auf Aktivkohle als Träger
Die Bestimmung der Überlebensfähigkeit der 3 Bakterienstämme B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und in Form einer Kombination auf Aktivkohle als Träger über einen Zeitraum von 6 Monaten bei 10°C wurde gemäß dem folgenden Verfahren durchgeführt. Die 3 Bakterienstämme B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 wurden einzeln in flüssigem Wachstumsmedium NB gezüchtet. Die Kulturen wurden in 2 Liter fassenden Kolben mit einem Gehalt an 1,5 Liter NB-Medium gezüchtet und 2 Tage bei 30°C auf einem gekühlten Inkubator/Schüttler (New Brunswick Scientific, USA, Innova Modell 4230) bei 180 U/min inkubiert. Nach 2-tägigem Wachstum wurden 600 ml der Kultur zu 1 kg steriler Aktivkohle in einem autoklavisierbaren Kunststoffbeutel gegeben, wodurch sich eine Feuchtigkeit des Produkts von etwa 30% ergab. Die Kombination der 3 Bakterienstämme B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 wurde hergestellt, indem die 3 Kulturen mit etwa log 8,5 KBE/ml im Verhältnis 1:1:1 vermischt wurden. Durch 2-tägige Inkubation der verschlossenen Beutel bei 30°C ergab sich eine Härtung der Bioinoculans-Zubereitung. Nach der Härtung wurden die verschlossenen Beutel bei 10°C aufbewahrt und Aliquotanteile wurden periodisch zur Durchführung von Messungen der Lebensfähigkeit entnommen. Die Lebensfähigkeit des Produkts wurde durch das standardmäßige serielle Verdünnungsverfahren auf NA-Platten bestimmt.
Tabelle 12 zeigt die Überlebensfähigkeit der 3 Bakterienstämme B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und in Form einer Kombination auf Aktivkohle als Träger über einen Zeitraum von 6 Monaten nach der Ernte bei 10°C.
Tabelle 12
Aus Tabelle 12 ist ersichtlich, dass die 3 Stämme B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 einzeln und in Form einer Kombination gute Überlebensraten während einer Langzeitlagerung auf Aktivkohle bei 10°C zeigten. Nach 6-monatiger Lagerung waren etwa log 7 KBE/g vorhanden. Diese Daten zeigen, dass Aktivkohle ein hervorragendes Trägermaterial (obgleich nicht ebenso wirksam wie Vermiculit) für die später auf die Samen, Pflanzen oder Erdreich als Inokulum aufzubringen Stämme darstellt. Jedoch sind die Kosten für Aktivkohle als Trägermaterial im Vergleich zu Vermiculit 8-mal niederer. Daher stellt die kostengünstigere Aktivkohle ein sehr attraktives Trägermaterial für eine gewerbliche Anwendung im Großmaßstab dar.
Beispiel 14
Verwendung von Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken und gebrauchten Waschflüssigkeiten von Destillerien als Träger zur Herstellung einer Kombination von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 im gewerblichen Maßstab
Die folgenden Verfahren wurden durchgeführt, um Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken und gebrauchte Waschflüssigkeiten von Destillerien als Träger zur Herstellung eines Produkts im gewerblichen Maßstab nach Fermentation unter Verwendung einer Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 herzustellen.
Kulturen von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 wurden einzeln in Melassen, die mit Wasser im Verhältnis von 1:5 verdünnt waren, gezüchtet. Die Kulturen wurden in 2 Liter fassenden Kolben mit einem Gehalt an 1,5 Liter Melassen, die mit Wasser im Verhältnis von 1:5 verdünnt waren, gezüchtet und 3 Tage bei 30°C auf einem gekühlten Inkubator/Schüttler (New Brunswick Scientific, USA, Innova Modell 4230) bei 180 U/min inkubiert. Nach 3-tägigem Wachstum wurde eine Kombination der 3 Bakterienstämme B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 durch Vermischen der 3 Kulturen mit etwa log 9 KBE/ml im Verhältnis von 1:1:1 hergestellt. Die auf diese Weise erhaltene Kombination der 3 Bakterienstämme wurde ferner mit Wasser im Verhältnis von 1:10 verdünnt, wodurch sich etwa log 8-9 KBE/ml ergaben. Die Züchtung der Bakterien in Melassen macht das Verfahren vom wirtschaftlichen Standpunkt aus sehr leistungsfähig.
Etwa 300 Tonnen frisch sulfinierter Pressschlamm, der durch Klären von Zuckerrohrsaft mit Kalk und Schwefeldioxid erhalten worden war, wurde auf einem Betonboden in Form von Schwaden mit einer Breite von 2,5 m, einer Höhe von 1,5 m und einer Länge von 150 m ausgebreitet. Der Pressschlamm wurde entweder manuell oder mit Hilfe eines "Aero-Tillers" aufgerührt und homogenisiert und anschließend mit etwa 600 Liter der vorstehend hergestellten Kombination von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488, d. h. 2 Liter Kombination/Tonne Pressschlamm, versetzt und erneut vermischt. Innerhalb von 2-3 Tagen stieg die Temperatur der Schwaden auf 70-75°C. Anschließend wurden die Schwaden 2-mal täglich aufgerührt und gebrauchte Waschflüssigkeit wurde 40 Tage lang täglich aufgesprüht, um eine Feuchtigkeit von 55-65% aufrechtzuerhalten. Nach etwa 40 Sprühvorgängen wurde das Besprühen mit gebrauchter Waschflüssigkeit beendet und die Schwaden wurden regelmäßig alle 3-5 Tage gewendet, um den Feuchtigkeitsgehalt des fermentierten Produkts auf etwa 30% zu senken. Üblicherweise sank die Temperatur der Schwaden nach 45 Tagen auf 40-45°C. Das Produkt in diesem Stadium war vollständig fermentiert und für die Anwendung und Verpackung gebrauchsfertig.
Um die Anwesenheit von Bacillus-Stämmen während des Fermentierungsvorgangs der Schwaden zu überwachen, wurde das spontan gegen Rifampicin resistente (Rif)^R-Stammderivat von B. lentimorbus NRRL B-30488R auf NA-Platten mit einem Gehalt an 100 μg Rifampicin isoliert. Der spontane B. lentimorbus NRRL B-30488R-Stamm, der ein vergleichbares Wachstum wie der Wildtypstamm B. lentimorbus NRRL B-30488 auf der Grundlage der Koloniengröße auf Agarplatten mit einem Gehalt an 100 μg Rifampicin zeigte, wurde für weitere Studien ausgewählt. Agarplatten mit einem Gehalt an 100 μg Rifampicin/ml, d. h. eine Menge, die zur Hemmung des Wachstums von anderen Bakterien in nicht-sterilisiertem Pressschlamm und gebrauchter Waschflüssigkeit ausreicht, wurden zur Gewinnung von B. lentimorbus NRRL B-30488R aus den Schwaden während des Fermentationsvorgangs verwendet. Die Anwesenheit von B. lentimorbus NRRL B-30488R log 8 KBE/g im fermentierten Produkt nach 45 Tagen stellt ein Anzeichen für das Überleben, die Vermehrung und die anhaltende Anwesenheit von B. lentimorbus NRRL B-30488R während des Fermentationsvorgangs dar.
Beispiel 15
Verwendung von Carbonisierungspressschlamm von Zuckerfabriken als Träger zur Herstellung einer Kombination von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 im gewerblichen Maßstab
Die Verfahren zur Fermentation von Carbonisierungspressschlamm von Zuckerfabriken als Träger zur Herstellung im gewerblichen Maßstab unter Verwendung einer Kombination von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 waren die gleichen wie in Beispiel 14, mit der Ausnahme, dass Wasser anstelle der gebrauchten Waschflüssigkeit zur Aufrechterhaltung der Feuchtigkeit während der Fermentation verwendet wurde.
Beispiel 16
Vergleichende Analyse der den Pflanzenwuchs fördernden Wirkung der Kombination von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 im Gewächshaus unter Verwendung von Vermiculit, Aktivkohle, fermentiertem Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken und gebrauchter Waschflüssigkeit von Destillerien sowie von Carbonisierungspressschlamm von Zuckerfabriken als Träger
Gemäß den Angaben in den vorstehenden Beispielen 8, 13, 14 und 15 wurden Samen vorbereitet und mit der Kombination von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 im Gewächshaus unter Verwendung von Vermiculit, Aktivkohle, fermentiertem Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken und gebrauchter Waschflüssigkeit von Destillerien sowie von Carbonisierungspressschlamm von Zuckerfabriken als Trägern inokuliert, um die das Pflanzenwachstum fördernde Wirkung der Kombination von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 im Gewächshaus auf verschiedene Pflanzen zu testen. Das Experiment im Gewächshaus wurde in vier verschiedenen Ansätzen mit jeweils 16 Sämlingen für nicht-mit Bakterien behandelte Samen (Kontrolle) und für mit Bakterien behandelte Samen (Behandlungsgruppe) von A. esculentus, C. sativus, Z. mays, Triticum aestivum, Glycine max, Pisum sativum und Impatiens balsamina durchgeführt. In jedem Ansatz wurden die Daten von Sämlingen im Alter von 21 Tagen in Bezug auf das Trockengewicht der Pflanzen aufgezeichnet. Die Ergebnisse der das Pflanzenwachstum fördernden Wirkung der Kombination von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 im Gewächshaus auf verschiedene Pflanzen unter Verwendung von Vermiculit, Aktivkohle, fermentiertem Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken und gebrauchter Waschflüssigkeit von Destillerien sowie von Carbonisierungspressschlamm von Zuckerfabriken als Träger sind in Tabelle 13 aufgeführt.
Tabelle 13
Die Daten in Tabelle 13 zeigen, dass sich eine variable, den Pflanzenwuchs fördernde Wirkung (angegeben als Trockengewicht) auf verschiedene Pflanzen durch die Kombination von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 im Gewächshaus ergibt. Wie aus den Ergebnisse ersichtlich ist, war das Trockengewicht der mit Bakterien behandelten Sämlinge von A. esculentus, C. sativus, Z. mays, Triticum aestivum, Glycine max, Pisum sativum und Impatiens balsamina um 21-150% höher (verglichen mit nicht mit Bakterien behandelten Sämlingen) und zwar bei Verwendung von Vermiculit, Aktivkohle, fermentiertem Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken und gebrauchter Waschflüssigkeit von Destillerien sowie Carbonisierungspressschlamm von Zuckerfabriken als Träger.
Beispiel 17
Feldversuch der Biokontrollwirkung der Kombination von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 gegen für Zuckerrohr phytopathogene Pilze unter Verwendung von Vermiculit als Träger
Die Parzellengröße betrug bei allen Feldversuchen 9,0 × 3,5 m, wobei jeweils für jede Behandlung vier Reihen im Dreifachversuch herangezogen wurden.
Feldversuche wurden unter Verwendung der Zuckerrohr-Varietät Cos 95255 durchgeführt, indem Zuckerrohr-Sets zum Zeitpunkt des Aussäens direkt auf Vermiculit, der die Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 in einer Sättigung von 20% enthielt, platziert wurden.
Ein Inokulum der beiden Pathogene Fusarium moniliforme und Colletotrichum falcatum, das in flüssigem Medium vermehrt worden war, wurde für einen 2-fachen Kulturtest hergestellt, indem die Pilze einzeln auf NB gezüchtet wurden. Agar-Platten (Durchmesser 5 mm) für F. moniliforme und C. falcatum wurden einzeln in 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben mit einem Gehalt an 100 ml NB inokuliert. Die Kolben wurden 10 Tage unter statischen Bedingungen bei 30°C inkubiert. Das Inokulum wurde mit sterilem Milli Q-Wasser mit einem Gehalt an 0,85 Kochsalz (MQW) auf eine Sporenkonzentration von log 5-6 Sporen/ml verdünnt. Sets wurden 30 Minuten vor dem Pflanzen in das auf diese Weise hergestellte Inokulum von F. moniliforme oder C. falcatum getaucht. Das Inokulum wurde auch zum Tränken der Reihen vor dem Pflanzen von Zuckerrohr verwendet. Ferner wurde das Experiment in einer Parzelle mit Welkekrankheit, in der im vorausgehenden Jahr der Welkebefall eine Höhe von 95% erreicht hatte, durchgeführt.
Der erste Zuckerrohr-Versuch wurde unter Verwendung von Töpfen (9 Zoll Durchmesser) im August 2000 bei Dhampur Sugar Mills Ltd., Rozagaon, Faizabad, unter Verwendung der Kombination durchgeführt. Nach 3 Monaten wurden die in den Töpfen gezogenen Pflanzen auf das Feld ausgepflanzt. Die Anzahl an infizierten Pflanzen, die Pflanzenhöhe, die Anzahl an Schösslingen und der Rohrumfang wurden im August 2001 aufgezeichnet. Die Testergebnisse sind in Tabelle 14 aufgeführt. Tabelle 14

*n.a. = Nicht zutreffend

Die in Tabelle 14 aufgeführten Ergebnisse zeigen klar die wirksame Biokontrolle von Zuckerrohr-Welke und Wurzelröte-Pilzen, die Zunahme der Anzahl an Schösslingen, der Pflanzenhöhe und des Rohrumfangs bei mit der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von Vermiculit als Träger inokulierten Pflanzen, verglichen mit der nicht-inokulierten Kontrolle.
Beispiel 18
Feldversuch bezüglich der das Pflanzenwachstum fördernden Wirkung der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von Vermiculit als Träger auf Zuckerrohr in Rozagaon
Feldversuche unter Verwendung von Zuckerrohr wurden durchgeführt, indem Zuckerrohr-Sets zum Zeitpunkt der Aussaat direkt auf Vermiculit mit einem Gehalt an der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488, die gemäß Beispiel 8 hergestellt worden war, platziert wurden. Der Versuch mit Zuckerrohr wurde im Oktober 2000 bei Dhampur Sugar Mills Ltd., Rozagaon, eingerichtet. Nach 9-monatigem Pflanzenwachstum wurden die Anzahl an Schösslingen, die Pflanzenhöhe, der Umfang, mahlfähiges Zuckerrohr und die Zuckerrohrausbeute im Dezember 2001 festgehalten. Für die Feldversuche wurde die Zuckerrohr-Varietät Cos-95255 bei Dhampur Sugar Mills Ltd., Rozagaon, verwendet. Die Testergebnisse der Feldversuche bezüglich der das Pflanzenwachstum fördernden Aktivität der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von Vermiculit als Träger auf Zuckerrohr sind in Tabelle 15 aufgeführt.
Tabelle 15
Die in Tabelle 15 aufgeführten Ergebnisse zeigen klar die Zunahme an Schösslingen, Pflanzenhöhe, Umfang, mahlfähigem Zuckerrohr und Rohrausbeute von Zuckerrohr, das mit der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von Vermiculit als Träger erzielt wurde, verglichen mit der nicht-inokulierten Kontrolle.
Beispiel 19
Feldversuch bezüglich der das Pflanzenwachstum fördernden Wirkung der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von Vermiculit als Träger auf Zuckerrohr in Dhampur
Feldversuche unter Verwendung von Zuckerrohr wurden durchgeführt, indem Zuckerrohr-Sets zum Zeitpunkt der Aussaat direkt auf Vermiculit mit einem Gehalt an der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488, die gemäß Beispiel 8 hergestellt worden war, platziert wurden. Zuckerrohr-Versuche wurden im November 2000 bei Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur, Bijnour, eingerichtet. Nach 13-monatigem Pflanzenwachstum wurden die Anzahl an Schösslingen, die Pflanzenhöhe und der Umfang des Zuckerrohrs im Dezember 2001 aufgezeichnet. Für die Feldversuche wurde die Zuckerrohr-Varietät Cos-95255 verwendet. Die Testergebnisse der Feldversuche bezüglich der das Pflanzenwachstum fördernden Aktivität der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von Vermiculit als Träger auf Zuckerrohr sind in Tabelle 16 aufgeführt.
Tabelle 16
Die in Tabelle 16 aufgeführten Ergebnisse zeigen klar die Zunahme an Schösslingen, Pflanzenhöhe, Umfang, mahlfähigem Zuckerrohr und Rohrausbeute von Zuckerrohr, das mit der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von Vermiculit als Träger erzielt wurde, verglichen mit der nicht-inokulierten Kontrolle.
Beispiel 20
Feldversuch bezüglich der das Pflanzenwachstum fördernden Wirkung der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von Aktivkohle als Träger auf Zuckerrohr
Feldversuche unter Verwendung von Zuckerrohr wurden durchgeführt, indem Zuckerrohr-Sets zum Zeitpunkt der Aussaat direkt auf Vermiculit mit einem Gehalt an der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488, die gemäß Beispiel 13 hergestellt worden war, platziert wurden. Der Zuckerrohr-Versuch wurde im April 2001 bei Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur, eingerichtet. Nach 10-monatigem Pflanzenwachstum wurden die Anzahl der Schösslinge, die Pflanzenhöhe, der Umfang, mahlfähiges Rohr und die Rohrausbeute des Zuckerrohrs im Dezember 2001 aufgezeichnet. Für die Feldversuche wurde die Zuckerrohr-Varietät Cos-89003 bei Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur, verwendet. Die Testergebnisse der Feldversuche bezüglich der das Pflanzenwachstum fördernden Aktivität der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von Aktivkohle als Träger auf Zuckerrohr sind in Tabelle 17 aufgeführt.
Tabelle 17
Die in Tabelle 17 aufgeführten Ergebnisse zeigen klar die Zunahme an Schösslingen, Pflanzenhöhe, Umfang, mahlfähigem Zuckerrohr und Rohrausbeute von Zuckerrohr, das mit der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30987 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von Aktivkohle als Träger erzielt wurde, verglichen mit der nicht-inokulierten Kontrolle.
Beispiel 21
Feldversuch bezüglich der das Pflanzenwachstum fördernden Wirkung der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von fermentiertem Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken und gebrauchter Waschflüssigkeit von Destillerien als Träger auf Zuckerrohr in Dhampur
Feldversuche unter Verwendung von Zuckerrohr wurden durchgeführt, indem Zuckerrohr-Sets zum Zeitpunkt der Aussaat direkt auf fermentiertem Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken und Waschflüssigkeiten von Destillerien als Träger, der eine Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488, die gemäß Beispiel 14 hergestellt worden war, enthielt, platziert wurde. Der Zuckerrohr-Versuch wurde im Mai 2001 bei Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur, eingerichtet. Nach 10-monatigem Pflanzenwachstum wurden die Anzahl der Schösslinge, die Pflanzenhöhe, der Zuckerrohrumfang, mahlfähiges Rohr und die Rohrausbeute im Dezember 2001 festgehalten. Für die Feldversuche wurde die Zuckerrohr-Varietät Cos-89003 bei Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur, verwendet. Die Testergebnisse der Feldversuche über die das Pflanzenwachstum fördernde Wirkung der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von fermentiertem Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken und gebrauchter Waschflüssigkeit von Destillerien als Träger auf Zuckerrohr sind in Tabelle 18 aufgeführt.
Tabelle 18
Die in Tabelle 18 aufgeführten Ergebnisse zeigen die Zunahme der Anzahl an Schösslingen, Pflanzenhöhe, Rohrumfang, mahlfähigem Rohr und Rohrausbeute bei Inokulation mit der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von fermentiertem Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken und gebrauchten Waschflüssigkeiten als Träger im Vergleich mit einer nicht-inokulierten Kontrolle.
Beispiel 22
Feldversuch bezüglich der das Pflanzenwachstum fördernden Wirkung der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von fermentiertem Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken als Träger auf Zuckerrohr bei Dhampur
Feldversuche unter Verwendung von Zuckerrohr wurden durchgeführt, indem Zuckerrohr-Sets zum Zeitpunkt der Aussaat direkt auf fermentiertem Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken und gebrauchten Waschflüssigkeiten von Destillerien als Träger, der eine Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488, die gemäß Beispiel 14 hergestellt worden war, enthielt, platziert wurde. Der Zuckerrohr-Versuch wurde im Mai 2001 bei Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur, eingerichtet. Nach 10-monatigem Pflanzenwachstum wurden die Anzahl an Schösslingen, die Pflanzenhöhe, der Zuckerrohrumfang, mahlfähiges Zuckerrohr und die Rohrausbeute im Dezember 2001 festgehalten. Für die Feldversuche wurde die Zuckerrohr-Varietät Cos-89003 bei Dhampur Sugar Mills Ltd., Dhampur, verwendet. Die Testergebnisse der Feldversuche über die das Pflanzenwachstum fördernde Wirkung der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von fermentiertem Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken als Träger auf Zuckerrohr sind in Tabelle 19 aufgeführt.
Tabelle 19
Die in Tabelle 19 aufgeführten Ergebnisse zeigen eine Zunahme der Anzahl an Schösslingen, der Pflanzenhöhe, des Rohrumfangs, des mahlfähigen Rohrs und der Rohrausbeute bei Inokulation mit der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von fermentiertem Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken als Träger, verglichen mit einer nicht-inokulierten Kontrolle.
Beispiel 23
Feldversuch bezüglich der das Pflanzenwachstum fördernden Wirkung der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von fermentiertem Carbonisierungspressschlamm von Zuckerfabriken als Träger auf Zuckerrohr bei Rozagaon
Feldversuche wurden unter Verwendung von Zuckerrohr durchgeführt, indem Zuckerrohr-Sets zum Zeitpunkt der Aussaat direkt auf fermentiertem Carbonisierungspressschlamm von Zuckerfabriken als Träger, der die Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488, die gemäß Beispiel 15 hergestellt worden war, enthielt, platziert wurde. Der Zuckerrohr-Versuch wurde im Mai 2001 bei Dhampur Sugar Mills Ltd., Rozagaon, eingerichtet. Nach 8-monatigem Pflanzenwachstum wurden die Anzahl an Schösslingen, die Pflanzenhöhe, der Zuckerrohrumfang, mahlfähiges Zuckerrohr und die Rohrausbeute im Dezember 2001 aufgezeichnet. Für die Feldversuche wurde die Zuckerrohr-Varietät Cos-96258 bei Dhampur Sugar Mills Ltd., Rozagaon, verwendet. Die Ergebnisse der Feldversuche über die das Pflanzenwachstum fördernde Wirkung der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von fermentiertem Carbonisierungspressschlamm von Zuckerfabriken als Träger auf Zuckerrohr sind in Tabelle 20 aufgeführt.
Tabelle 20
Die in Tabelle 20 aufgeführten Ergebnisse zeigen die Zunahme der Anzahl an Schösslingen, der Pflanzenhöhe, des Rohrumfangs, des mahlfähigen Rohrs und der Rohrausbeute bei Inokulation mit der Kombination aus B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 unter Verwendung von fermentiertem Carbonisierungspressschlamm von Zuckerfabriken als Träger, verglichen mit der nicht-inokulierten Kontrolle.
Beispiel 24
Vergleichende Analyse des Einflusses von Pestiziden auf das Wachstum von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488
Die 3 Bakterienstämme B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488 wurden einem Screening zur Bewertung der Wirkung von Pestiziden auf ihr Wachstum in folgender Weise unterzogen. Die Bewertung des Einflusses von Pestiziden auf das Wachstum der bakteriellen Stämme in Brühe wurde unter Verwendung von Erlenmeyer-Kolben (150 ml) mit einem Gehalt an 40 ml Medium, das im Dreifachversuch mit dem bakteriellen Stamm (100 μl Inokulum mit etwa log 6 KBE/ml) inokuliert war, durchgeführt. Der Wert bezieht sich auf die Anzahl an Zellen (log KBE/ml) der Stämme bei 1-tägigem individuellem Wachstum in NB bei 30°C in Gegenwart des Pestizids, als empfohlene Anwendungsdosis. Der Einfluss des Pestizids auf das Wachstum ist in Tabelle 20 dargelegt. Inokulierte absatzweise Kulturen ohne jegliche Pestizide dienten als Kontrolle. Die Kolben wurden 1 Tag bei 30°C auf einem gekühlten Inkubator/Schüttler (New Brunswick Scientific, USA, Innova Modell 4230) bei 180 U/min inkubiert. Tabelle 21

*WP = Benetzbares Pulver; **NG = Kein Wachstum; ***EC = Emulgierendes Konzentrat; ****SL = Lösliche Flüssigkeit

Die in Tabelle 21 aufgeführten Ergebnisse zeigen eine verschiedene Reaktion von Pestiziden auf das Wachstum von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488. Unter den verschiedenen getesteten Pestiziden waren Carbendazim 50% WP, Metalaxyl 8% + Mancozeb 64% WP und Deltamethrin 2,8% EC am verträglichsten mit der Anwendung von B. lentimorbus NRRL B-30486, B. subtilis NRRL B-30487 und B. lentimorbus NRRL B-30488.
Es ist darauf hinzuweisen, dass die vorstehende ausführliche Beschreibung nur der Erläuterung dient und dass Modifikationen und Variationen daran vorgenommen werden können.

Claims

Als Bioinoculans geeignete Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung bakterielle Stämme mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-30486, NRRL B-30487 und NRRL-B-30488 einzeln oder in sämtlichen möglichen Kombinationen und gegebenenfalls einen Träger enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Stämme NRRL B-30486 und NRRL B-30488 zur Gruppe Bacillus lentimorbus gehören.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Stamm NRRL B-30487 zur Gruppe Bacillus subtilis gehört.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Stamm NRRL B-30486 die nachstehend angegebenen Eigenschaften aufweist: Eigenschaften NRRL B-304B6 Gestalt Stäbchen Größe Breite, μm 1,5-2,0 Länge, μm 3,0-6,0 Gram-Reaktion + Katalase-Reaktion – Anaerobes Wachstum + Voges-Proskauer-Reaktion – pH-Wert in V-P-Nährlösung 5,5 Säure aus D-Glucose + L-Arabinose – D-Xylose – D-Mannit – Gas aus Glucose + Hydrolyse von Casein – Gelatine – Stärke –

Verwertung von Citrat – Nitrat zu Nitrit – Indol-Bildung – Wachstum bei pH-Wert in Nährlösung 6,8 + 5,7 + Wachstum in NaCl 2% + 5% + 7% + 10% + Wachstum bei 30°C + 40°C + 50°C + 55°C + 65°C –
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Stamm NRRL B-30487 die nachstehend angegebenen Eigenschaften aufweist: Eigenschaften NRRL B-30487 Gestalt oval Größe Breite, μm 2,5 Gram-Reaktion + Katalase-Reaktion + Anaerobes Wachstum – Voges-Proskauer-Reaktion + pH-Wert in V-P-Nährlösung 5,8 Säure aus D-Glucose + L-Arabinose + D-Xylose + D-Mannit + Gas aus Glucose – Hydrolyse von Casein + Gelatine +

Stärke + Verwertung von Citrat + Nitrat zu Nitrit + Indol-Bildung – Wachstum bei pH-Wert in Nährlösung 6,8 + 5,7 + Wachstum in NaCl 2% + 5% + 7% – 10% – Wachstum bei 30°C + 40°C + 50°C + 55°C + 65°C –
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Stamm NRRL B-30488 die nachstehend angegebenen Eigenschaften aufweist: Eigenschaften NRRL B-30488 Gestalt Stäbchen Größe Breite, μm 1,5-2,0 Länge, μm 5,0-10,0 Gram-Reaktion + Katalase-Reaktion – Anaerobes Wachstum + Voges-Proskauer-Reaktion – pH-Wert in V-P-Nährlösung 5,2 Säure aus D-Glucose + L-Arabinose – D-Xylose – D-Mannit – Gas aus Glucose + Hydrolyse von

Casein – Gelatine – Stärke – Verwertung von Citrat – Nitrat zu Nitrit – Indol-Bildung – Wachstum bei pH-Wert in Nährlösung 6,8 + 5,7 + Wachstum in NaCl 2% + 5% + 7% + 10% + Wachstum bei 30°C + 40°C + 50°C + 55°C + 65°C –
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Träger aus einer Gruppe ausgewählt ist, die Vermiculit, Aktivkohle, ein Gemisch von fermentiertem Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken mit gebrauchter Waschflüssigkeit von Destillerien und Carbonierungspressschlamm von Zuckerfabriken umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Verhältnis der drei Stämme etwa 1:1:1 beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Gesamtkonzentration der Stämme 4-10 KBE/g Träger und vorzugsweise 6-8 KBE/g Träger beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Konzentration der einzelnen Stämme 4-10 KBE/g Träger und vorzugsweise 7-8 KBE/g Träger beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Generationszeit der Stämme 55-65 Minuten bei 30°C beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Stämme Pflanzenwurzeln kolonisieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Stämme jede Saison der Pflanze überleben.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Stämme mindestens zwei/drei Jahre in der Zusammensetzung überleben.
In vitro-Verfahren zum Isolieren bakterieller Stämme der Hinterlegungsnummern NRRL B-30486, NRRL B-30487 und NRRL-B 30488 aus der Milch der "Sahiwal"-Kuh, wobei die Stämme Eigenschaften aufweisen, die das Kontrollieren von phytopathogenen Pilzen, die Förderung des Pflanzenwachstums, Toleranz gegen abiotische Stressfaktoren, Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stresszuständen und Erzeugung von antimykotischen Metaboliten umfassen, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: (a) Gewinnen von Milch der "Sahiwal"-Kuh, (b) Ausstreichen der Milch auf einem Kulturmedium, (c) etwa 1-3-tägiges Inkubieren der Kultur bei Temperaturen von 25-35°C, (d) Auswählen sämtlicher morphologisch unterschiedlicher Bakterien aus der Kultur, (e) Screening von in Stufe (d) ausgewählten Stämmen, die phytopathogene Pilze unterdrücken, indem sie eine Hemmzone von mindestens 2 mm bei einer Inkubation bei 30-35°C und vorzugsweise 28°C für eine Zeitspanne von 20-35 Tagen und vorzugsweise von 27 Tagen zeigen, (f) Screening von in Stufe (e) ausgewählten Stämmen auf das Pflanzenwachstum fördernde Bakterien, die eine mindestens 5%-ige Zunahme des Pflanzentrockengewichts zeigen, durch Züchten von Pflanzen in Gegenwart von ausgewählten Bakterien bei einer Bakterienkonzentration von etwa log 6 bis 10 KBE/Samen oder etwa log 6 bis 8 KBE/g Erdreich, (g) Screening von in Stufe (f) ausgewählten Stämmen bei 4-8% Salzstresstoleranz für die weitere Selektion, (h) Screening von in Stufe (g) ausgewählten Stämmen beim pH-Wert 4-10 auf Stresstoleranz für die weitere Selektion, (i) Screening von in Stufe (h) ausgewählten Stämmen bei 50-60°C auf Temperaturstresstoleranz für die weitere Selektion, (j) Screening von in Stufe (i) ausgewählten Stämmen auf die Fähigkeit zur Solubilisierung von Phosphat unter abiotischen Stressbedingungen bei hohem Salzgehalt, pH-Wert und Temperatur zur weiteren Selektion und (k) Isolieren der erwünschten drei Bakterienstämme.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Pflanze für die wachstumsfördernde Aktivität aus der Gruppe, die Zea mays, Abelmoschus esculentus, Luffa cylindrica, Lycopersicon esculentum, Abelmoschus esculentus und Cucumis sativus umfasst, ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei es sich beim Kulturmedium um Nähragar handelt, wobei das Medium Rindfleischextrakt (2-10 g), Pepton (5-15 g), Natriumchlorid (2-10 g), Agar (10-20 g) und destilliertes Wasser (etwa 1,0 Liter) bei einem pH-Wert von 7,0-7,4 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die pH-Toleranz bei 30°C getestet wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Erdreichfeuchtigkeit 15-30% und vorzugsweise 20% beträgt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei es sich beim Salz vorzugsweise um NaCl handelt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Stämme auf Nährlösungs (NB)-Medium gezüchtet werden, das aus Rindfleischextrakt (0,5 %), Pepton (1%), NaCl (0,5%) und destilliertem Wasser besteht, wobei der pH-Wert des Mediums 7,2 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der pathogene Pilz aus einer Gruppe ausgewählt ist, die F. moniliforme, C. falcatum, F. oxysporum f. sp. Ciceri, R. solani, Pythium sp., Phoma sorghii, Sclerotium rolfsii, Alternaria solani, Curvularia lunata, Sclereotinia sclerotioirum und Aspergillus niger umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Konzentration der Stämme im Bereich von 4-10 KBE/ml liegt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Phosphatsolubilisierung bei einer kombinierten Erhöhung von Temperatur, Salz und pH-Wert um etwa 428% zunimmt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Phosphatsolubilisierung bei Erhöhung der Salzkonzentration um etwa 160% zunimmt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Phosphatsolubilisierung bei pH-Erhöhung um etwa 130% zunimmt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Stämme auf hohe pH-Stresstoleranz bei einem pH-Wert von vorzugsweise 9 ausgewählt werden.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Stämme auf Temperaturstresstoleranz bei 55°C ausgewählt werden.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei Bakterien ausgewählt werden, die die günstigsten Ergebnisse in bezug auf eine geringere Sämlingsmortalität und eine bessere Sämlingskeimung, Pflanzenhöhe, Anzahl von Schoten und Samentrockengewicht zeigen.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die den Pflanzenwuchs fördernde Aktivität um 3-400% steigt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Pilzkonzentration 4-7 Sporen/ml Kulturmedium beträgt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die abiotischen Stressbedingungen für die Solubilisierung von Phosphat aus einer Gruppe von Bedingungen ausgewählt werden, die einen hohen pH-Wert im Bereich von 7-9, hohe Temperaturen im Bereich von 30-45°C und eine Salzkonzentration im Bereich von 0,1-4% umfassen.
Verfahren zur Herstellung einer den Pflanzenwuchs fördernden Zubereitung, umfassend bakterielle Stämme mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-30486, NRRL B-30487 und NRRL-B 30488 einzeln oder in sämtlichen möglichen Kombinationen und einen Träger, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: (a) das Züchten von Bakterien in einer Kultur in individueller Weise mit einer Konzentration von etwa log 8 bis 11 KBE/ml und vorzugsweise log 9 bis 10 KBE/ml, gegebenenfalls gefolgt von einem Vermischen der Kulturen in einem gleichen Verhältnis im Fall der Herstellung einer Kombination, (b) Verdünnen der Kultur mit Wasser im Verhältnis 1:50 bis 1:150 und vorzugsweise von 1:100, wobei etwa log 8-9 KBE/ml Bakterien enthalten sind, (c) das Versprühen von etwa 1-3 Liter der Kultur/Tonne frisch homogenisiertem Träger und vorzugsweise 2 Liter der Kultur/Tonne frisch hergestelltem Träger und das Vermischen, (d) das Aufrühren der Schwaden mindestens zweimal täglich für etwa 2 Tage, um die Temperatur der Schwaden auf 70-75°C zu erhöhen, (e) das Sprühen von gebrauchter Waschflüssigkeit oder von Wasser, in die aufgerührten Schwaden für etwa 40 Tage, um einen Feuchtigkeitsgrad von etwa 55-65°C aufrechtzuerhalten, (f) das weitere Aufrühren der Schwaden für weitere 3-5 Tage, um nunmehr die Feuchtigkeit und die Temperatur des fermentierten Produkts auf etwa 30% bzw. 40-45% zu verringern, und (g) das Abpacken des gebrauchsfertigen, das Pflanzenwachstum fördernden Bioinoculans.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei der Träger aus der Gruppe ausgewählt wird, die frisch sulfinierten Pressschlamm und Carbonisierungspressschlamm umfasst.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei es sich bei der Kultur um ein NB-Medium handelt.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Homogenisierung des Gemisches manuell und unter Verwendung eines "Aero-Tillers" erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Zubereitung unter variierten Lagerungs- oder Gewächshaus- oder Feldbedingungen eine maximale Lebensfähigkeit zeigt.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei das Verhältnis der Stämme etwa 1:1:1 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Zubereitung auf Pflanzen, Samen und Erdreich angewendet wird.
Verfahren zur Verwendung einer den Pflanzenwuchs fördernden Zubereitung, umfassend bakterielle Stämme mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-30486, NRRL B-30487 und NRRL-B 30488 einzeln oder in sämtlichen möglichen Kombinationen und einen Träger, wobei das Verfahren die Stufe des Auftragens des Bioinoculans in flüssiger oder trockener Form auf Samen, Pflanzen und Erdreich umfasst.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei das Bioinoculans ferner Gummi oder Zucker zur Verbesserung der Haftung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Stämme im Verhältnis von 1:1:1 vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Zubereitung unter variierten Lagerungs- oder Gewächshaus- oder Feldbedingungen eine maximale Lebensfähigkeit aufweist.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei der Träger aus einer Gruppe ausgewählt wird, die frisch sulfinierten Pressschlamm und Carbonisierungspressschlamm umfasst.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Pflanzen der Varietät auf die Förderung von Pflanzenwachstum auf dem Feld in Gegenwart von Bakterien in einer Konzentration von etwa log 7-9 KBE/Samen oder etwa log 6-8 KBE/g Erdreich getestet werden.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei eine Zubereitung allein oder in Kombination mit anderen Chemikalien, die für das Wachstum und das Überleben von Bakterien unschädlich sind, verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Chemikalien aus einer Gruppe ausgewählt werden, die Pestizide, Düngemittel, Nematizide und Herbizide umfasst, wobei gegebenenfalls eine Kalk-Pelletisierung vorgenommen wird, um die Schwere der Wirkung dieser Materialien zu begrenzen.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die sich als Bioinoculans eignet, wobei die Zusammensetzung einen oder mehrere der neuen Bakterienstämme mit den Hinterlegungsnummern NRRL B-30486, NRRL B-30487 und NRRL-B 30488 und einen Träger umfasst, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: (a) das Züchten der bakteriellen Stämme in einem Wachstumsmedium bis zur logarithmischen Phase, (b) das Verdünnen der Kultur mit Wasser im Verhältnis 1:10 bis 1:100 000 und vorzugsweise von 1:100, (c) das Vermischen der verdünnten Kulturen mit einem inerten pulverisierten Träger, wobei der Feuchtigkeitsgehalt des Gemisches zwischen 20-40% und vorzugsweise etwa 30%, bezogen auf eine feuchte Basis, beträgt, (d) das Inkubieren des Gemisches für mindestens etwa 2 Tage, wobei im Gemisch ein konstanter Feuchtigkeitsgehalt aufrechterhalten wird, (e) das Erhöhen der Bakterienzahl im Gemisch auf einen Bereich von etwa log 4-10 KBE/g Träger und (f) das Überwachen der Überlebensrate der Bakterien über einen Zeitraum von mindestens 1 Jahr in der Zusammensetzung, wobei die Bakterienstämme vorzugsweise in einem Bereich von etwa log 7 bis 9 KBE/g Träger vorhanden sind und eine lange Überlebensrate der Mikroorganismen als Inokulat zeigen.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei der Träger aus einer Gruppe ausgewählt wird, die Vermiculit, Aktivkohle, ein Gemisch aus fermentiertem Sulfitierungspressschlamm von Zuckerfabriken und gebrauchter Waschflüssigkeit von Destillerien, sowie Carbonisierungspressschlamm von Zuckerfabriken, Reisspelzen, Carboxymethylcellulose, Torf, Perlit, Talkum und Polyvinylpyrrolidon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei die bevorzugten Träger aus einer Gruppe ausgewählt werden, die Vermiculit, Aktivkohle und fermentierten Pressschlamm umfasst.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei die Bakterienzahl vorzugsweise etwa log 8 KBE/g Träger beträgt.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei die Pflanzen für die Wachstumsförderung aus einer Gruppe ausgewählt werden, die Kichererbsen, A. esculentus und C. sativus und Z. mays und Triticum aestivum und Glycine max und Pisum sativum und Impatiens balsamina umfasst.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei das Verhältnis der Stämme im Falle einer Kombination etwa 1:1:1 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei es sich beim Wachstumsmedium um NB-Medium handelt.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei die Bakterien individuell bis zu einer Konzentration von etwa log 9 bis 10 KBE/ml gezüchtet werden, wonach das Vermischen der Kulturen im Verhältnis von etwa 1:1:1 erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei das Verdünnen der Kultur mit Wasser vorzugsweise im Verhältnis von 1:10 mit einem Gehalt an etwa log 8-9 KBE/ml erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei die Feuchtigkeit des Produkts mit Schwaden reguliert wird.