DE60216428T2

DE60216428T2 - Verfahren zur verbesserung der antibiotikum-produktion in einem bakterium durch das einführen von mutationen, die antibiotikum-resistenz verleihen

Info

Publication number: DE60216428T2
Application number: DE60216428T
Authority: DE
Inventors: Kozo Tsukuba-shi OCHI; Haifeng Hu; Motohiro Osaka-shi HINO; Akihiko Osaka-shi FUJIE; Hideyuki Osaka-shi MURAMATSU
Original assignee: NAT FOOD RES INST TSUKUBA; National Food Research Institute; Astellas Pharma Inc
Current assignee: NAT FOOD RES INST TSUKUBA; National Food Research Institute; Astellas Pharma Inc
Priority date: 2001-03-30
Filing date: 2002-03-29
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2022-03-30
Also published as: WO2002079453A3; KR20030088472A; DE60216428D1; JP2004537978A; CA2443208A1; US20040175778A1; AU2002241329A1; ES2275843T3; EP1373497B1; JP4419165B2; US7314719B2; CN1553954A; CA2443208C; WO2002079453A2; ATE346916T1; EP1373497A2

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Produktivität eines Antibiotikums in einem Bakterium durch Einführen einer Wirkstoffresistenz in das Bakterium. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung die Verbesserung des Antibiotikums durch Einführen von kombinierten wirkstoffresistenten Mutationen auf das Bakterium.
TECHNISCHER HINTERGRUND
„Sekundäre Metaboliten" wurde ursprünglich von Pflanzenphysiologen zur Klassifizierung von botanischen Wirkstoffen (z. B. Farbstoffen, Duftstoffen und Arzneistoffen) ohne offensichtliche Funktion in den Pflanzen verwendet, die sie bildeten. Er umfasst nun eine heterogene Gruppe von Verbindungen, normalerweise mit relativ niedriger Molekularmasse, die hauptsächlich, aber nicht ausschließlich, von Organismen ohne Nervensystem produziert werden (d. h. Bakterien, Pilzen und Pflanzen). Der Begriff sekundärer Metabolismus wurde von Mikrobiologen in den 1960ern entwickelt, wobei das Hauptaugenmerk auf Antibiotika und anderen bioaktiven mikrobiellen Produkten lag (Bently, R. et al., Annu. Rev. Microbiol. (1999) 53: 411–446).
Es ist gut bekannt, dass Mitglieder der Gattung Streptomyces eine große Vielzahl Antibiotika und weitere Klassen von biologisch wirksamen sekundären Metaboliten produzieren. Die Gattung Streptomyces gehört zur Ordnung Actinomycetales. Im Allgemeinen bedeutet die Ordnung Actinomycetales Actinomyceten. Actinomyceten bilden über 60 % der bekannten sekundären Metaboliten, die von Mikroorganismen produziert werden, und von diesen werden fast 80 % von Mitgliedern von der Gattung Streptomyces hergestellt, wobei andere Gattungen zahlenmäßig hinterher hinken (Kieser, T. et al., Practical Streptomyces Genetics (2000): 10–11).
Die meisten klinisch angewendeten Antibiotika wurden zunächst aus den Metaboliten von Mikroben isoliert, einschließlich Bakterien, Pilze und Actinomyceten, wobei Streptomyces als die effektivsten Produzenten bekannt sind. Die genetische Rekombination und Manipulation in Streptomyces wurde etabliert von D.A. Hopwood und seinen Mitarbeitern (Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces, a laboratory manual, 1985). Bishert wurde die Behandlung mit Mutagenen und das Screenen der resultierenden Klone wiederholt und als Verfahren zur Verbesserung von Antibiotika produzierenden Streptomyces angewendet, und lieferte gute Ergebnisse. Dieses Verfahren hat jedoch einige nachteilige Eigenschaften wie Arbeitsaufwand, Zeitaufwand, hohe Kosten, schlechte Reproduzierbarkeit und niedrige Frequenz, usw. Die gegenwärtigen angestrebten Verfahren zur Verbesserung von Stämmen sind genetische Rekombination und Manipulation, die eine wichtige Technik in der Stammverbesserung darstellen, wie Protoplastenfusion, Strukturgenamplifikation, Klonen von regulatorischen Genen und Resistenzgenen (Ikeda et al., Actinomycetologica 1991, 5: 86–99). Offensichtlich erfordern diese Verfahren eine bessere Kenntnis der Biochemie und Genetik der Antibiotikabildung.
Wie oben beschrieben wurden einige Verfahren zur Verbesserung von Stämmen erfunden und in der Fermentationsindustrie angewendet. Es ist bekannt, dass die Produktivität von Actinorhodin in Streptomyces coelicolor verbessert werden kann, indem in diese Streptomycin-Resistenz eingeführt wird (Protein, Nucleic Acid, Enzyme, Band 44, Nr. 13, Seite 1967–1974 (1999); Kagaku to Seibutsu, Band 37, Nr. 11, Seite 731–737 (1999)). Es wurde jedoch bisher noch kein Bericht betreffend effektivere Verfahren zur Erhöhung der Produktivität der sekundären Metaboliten abgegeben.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Erhöhung der Produktivität des sekundären Metaboliten durch einen Mikroorganismus in einer arbeitssparenden, zeitsparenden, hocheffizienten und semi-rationellen Weise, die anwendbar ist für die Stämme ohne über mehr Wissen über beispielsweise die Antibiotika-Biochemie und -Genetik.
Um die oben beschriebene Aufgabe zu lösen haben die Erfinder umfangreiche Studien durchgeführt und die folgenden unerwarteten neuen Befunde erhalten. D. h., die Actinorhodin-Produktivität in Streptomyces coelicolor kann verbessert werden, indem eine Resistenz gegen zwei oder mehr Antibiotika eingeführt wird wie: Streptomycin, Geneticin, Gentamicin und Rifampicin. Jedes Antibiotikum besitzt die Fähigkeit, die Produktivität durch Induzieren der jeweiligen Mutationen zu erhöhen. Durch Verwendung einer Streptomycin-resistenten Mutante als Ausgangsstamm kann die Produktivität an Actinorhodin weiter durch Einführung einer weiteren Antibiotika-Resistenz Mutation wie: Geniticin-Resistenz, Gentamicin-Resistenz oder Rifampicin-Resistenz-Mutation erhöht werden, was bedeutet, dass doppelte Mutationen (Streptomycin und Geniticin, Strepotymicin und Gentamicin, Streptomycin und Rifampicin, komibinierte Resistenzmutationen) kontinuierlich die Produktivität an Actinorhodin erhöhen können. Schließlich konnte durch Einführung der Rifampicin-Resistenz-Mutation in die doppelten (Streptomycin und Gentamycin) Mutanten die Produktivität noch weiter erhöht werden. Es wurde bestätigt, dass durch eine kombinierte Einführung von drei Antibiotika-Resistenz-Mutationen die Produktivität an Actinorhodin in Streptomyces coelicolor kontinuierlich schrittweise erhöht werden konnte und ein hohes Produktionsniveau erreichen konnte.
Die vorliegende Erfindung wurde basierend auf den oben beschriebenen neuen Befunden gemacht.
Daher stellt die vorliegende Erfindung bereit:

(1) Ein Verfahren zur Erhöhung der Produktivität eines Antibiotikums in einem Bakterium durch Einführen einer Resistenz gegen zwei oder mehr Antibiotika in das Bakterium.
(2) Verfahren zur Herstellung eines Bakteriums mit einer erhöhten Produktivität für ein Antibiotikum, welches die Schritte umfasst: Einführen einer Resistenz gegen zwei oder mehr Antibiotika in dieses Bakterium durch Kultivieren davon in ein Medium, welches die Antibiotika enthält, wobei die Konzentration der Antibiotika größer ist als die MIC der Antibiotika gegen das ursprüngliche Bakterium, und Isolieren von Kolonien, die in dem Medium wachsen können.
(3) Verfahren wie in den obigen Punkten (1) oder (2) beschrieben, wobei das Bakterium zu der Gattung gehört, die ausgewählt wird aus der aus Streptomyces, Bacillus und Pseudomonas bestehenden Gruppe.
(4) Verfahren wie in den obigen Punkten (1) oder (2) beschrieben, wobei das Bakterium ausgewählt wird aus der aus Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Streptomyces antibioticus, Streptomyces chattanoogensis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus und Pseudomonas pyrrocinia bestehenden Gruppe.
(5) Verfahren wie in den obigen Punkten (1) oder (2) beschrieben, wobei das Antibiotikum ausgewählt wird aus der aus ribosomale Proteineangreifenden Antibiotika, ribosomale RNA angreifenden Antibiotika und RNA-Polymerase angreifenden Antibiotika bestehenden Gruppe.
(6) Verfahren wie in den obigen Punkten (1) oder (2) beschrieben, wobei das Antibiotikum ausgewählt wird aus der aus Streptomycin, Geniticin, Gentamicin und Rifampicin bestehenden Gruppe.
(7) Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums, welche die Schritte umfasst Kultivieren eines Bakteriums mit einer Resistenz gegen mindestens zwei Antibiotika, welches eine erhöhte Produktivität des Antibiotikums verglichen mit dem ursprünglichen Bakterium aufweist, in einem Medium, Bildung und Akkumulation eines Antibiotikums, und Isolieren des Antibiotikums daraus.
(8) Verfahren wie im obigen Punkt (7) beschrieben, wobei das Bakterium zu der Art gehört, die ausgewählt wird aus der aus Streptomyces, Bacillus und Pseudomonas bestehenden Gruppe.
(9) Verfahren wie im obigen Punkt (7) beschrieben, wobei das Bakterium ausgewählt wird aus der aus Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Streptomyces antibioticus, Streptomyces chattanoogensis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus und Pseudomonas pyrrocinia bestehenden Gruppe.
(10) Verfahren wie im obigen Punkt (7) beschrieben, wobei das Antibiotikum ausgewählt wird aus der aus ribosomale Proteine angreifenden Antibiotika, ribosomale RNA angreifenden Antibiotika und RNA-Polymerase angreifenden Antibiotika.
(11) Verfahren wie im obigen Punkt (7) beschrieben, wobei das Antibiotikum ausgewählt aus der aus Streptomycin, Geniticin, Gentamycin und Rifampicin bestehenden Gruppe.
(16) Ebenfalls offenbart wird ein Mikroorganismus mit einer erhöhten Produktivität am sekundären Metaboliten verglichen mit dem ursprünglichen Stamm davon, welcher nach den obigen Verfahren aus Punkt (1) oder (2) hergestellt wird.
(17) Der oben in (16) beschriebene Mikroorganismus, wobei der Mikroorganismus ein Bakterium ist.
(18) Der im obigen Punkt (16) beschriebene Mikroorganismus, wobei der Mikroorganismus zu der Gattung gehört, die ausgewählt wird aus der aus Streptomyces, Bacillus und Pseudomonas bestehenden Gruppe.
(19) Der Mikroorganismus wie im obigen Punkt (16) beschrieben, wobei der Mikroorganismus ausgewählt wird aus der aus Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Streptomyces antibioticus, Streptomyces chattanoogensis, Bacillus subtllis, Bacillus cereus und Pseudomonas pyrrocinia bestehenden Gruppe.
(20) Ein Verfahren zur Erhöhung der Produktivität an einem sekundären Metaboliten in einem Mikroorganismus, indem eine Resistenz gegen ein einzelnes Antibiotikum mit Ausnahme von Streptomycin auf diesen Mikroorganismus übertragen wird, ist ebenfalls beschrieben.

Zusätzlich ist ein Verfahren zur Induktion der Biosynthese eines weiteren Antibiotikums in Mikroorganismen beschrieben, indem eine Einzel- oder mehrfache Wirkstoffresistenz-Mutation eingeführt wird und eine neue Möglichkeit zum Auffinden neuer Antibiotika bereit gestellt wird.
Diese Erfindung wird unter Bezug auf die folgenden Zeichnungen beschrieben:
1 ist ein Graph, der die Strategie zur Konstruktion von kombinierten WirkstoffresistenzMutanten angibt. Drei Arten einzelner Mutanten und Doppelmutanten und eine Art Dreifachmutanten wurden konstruiert wie gezeigt.
2 ist eine Fotographie, die die Fähigkeit zur Bildung von Luft-Mycelen und Actinorhodin in Streptomyces coelicolor Wild-Typ und Mutantenstämmen angibt. Sporen wurden auf R4 und R3-Agarplatten angeimpft und bei 30°C während 6 Tagen inkubiert.
3 ist ein Graph, der die Aminosäureänderungen in den β-Untereinheiten von RNA-Polymerase in Rifampicin-resistenten Mutanten angibt. Die Cluster I und II stellen die zuvor bekannten Resistenz-bestimmenden Regionen dar. Die Nummerierung beginnt von der Ausgangsaminosäure (Met) des offenen Leserahmens. Die Mutationspositionen werden durch Pfeile und Zahlen angegeben, und einzelne Großbuchstaben bezeichnen die in dieser Untersuchung gefundenen veränderten Aminosäuren. Schattierte Bereiche zeigen die Substitutionen, die in unserer Studie aufgefunden wurden.
4 ist ein Graph, der den Vergleich der Actinorhodin-Bildung zwischen Medien R3 (☐) und R4 (∎) angibt. Actinorhodin wurde nach 6 Tagen Inkubation bestimmt.
5 ist ein Graph, der die Actinorhodinbildung in den Medien R4 und R3 angibt. Symbole: ∎, 1147 (Wild-Typ); ☐, S-1 (str);
SG-1 (str-gen), O; SGR-1 (str-gen-rif).
6 ist ein Graph, der die Wirkung von Hefeextrakt, Casaminosäuren und KH₂PO₄ auf die Bildung von Actinorhodin angibt. Stämme wurden während 6 Tagen in R4-Medium gezüchtet, versetzt mit verschiedenen Konzentrationen von Hefeextrakt, Casaminosäuren oder KH₂PO₄. Symbole: ∎, 1147 (Wild-Typ); ☐, S-1 (str);
SG-1 (str-gen), O; SGR-1 (str-gen-rif).
7 ist ein Graph, der die erhöhte Produktivität von Actinorhodin in kombiniert resistenten Mutanten zeigt. Die Kulturen wurden während 7 Tagen in GYM-, R3- oder R4-Flüssigmedium gezüchtet. Die Stämme S-1, SG-1 und SGR-1 wurden jeweils als Einzel-, Doppel- und Dreifachmutanten verwendet.
8 ist ein Graph, der die chemische Struktur von Actinorhodin zeigt, das von Streptomyces coelicolor gebildet wird.
9 ist eine Fotographie, die die potentiellen neuen antibakteriellen Mittel angibt, die in den Mutanten des bestimmten Streptomyces-Stamms Nr. 618824 durch Einführung von Wirkstoffresistenzmutationen gebildet werden.
10 ist ein Graph, der die Strukturen von vier Antibiotika angibt, die zur Einführung der Resistenz verwendet werden, einschließlich Gentamicin, Geniticin, Streptomycin und Rifampicin.
Das erfindungsgemäß verwendete Bakterium ist nicht besonders beschränkt, solange die Produktivität des Antibiotikums erhöht werden kann, indem das Bakterium gegen zwei oder mehr Antibiotika resistent gemacht wird. Es ist bevorzugt, Bodenbakterien zu verwenden, die landwirtschaftlich und/oder medizinisch nützliche Antibiotika produzieren. Bevorzugt sind Actinomyceten. Beispiele für diejenigen, die zu Actinomyceten gehören, können beispielhaft angegeben werden als Gattung Streptomyces, Gattung Bacillus, Gattung Pseudomonas, usw. Bevorzugter ist die Gattung Streptomyces. Spezifische nicht beschränkende illustrative Beispiele für die Bakterien schließen Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Streptomyces antibioticus, Streptomyces chattanoogensis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus und Pseudomonas pyrrocinia ein.
Das Bakterium kann aus der Natur durch bekannte Verfahren isoliert werden oder aus Kultursammlungen verfügbar sein wie ATCC. Das Bakterium kann ein beliebiger von wilden Stämmen, Mutantenstämmen, Zellfusionsstämmen, transduzierten Stämmen oder rekombinanten Stämmen sein, die mit Hilfe von rekombinanten DNA-Techniken konstruiert werden, und kann ein beliebiger von denen sein, die in der Fermentationsindustrie als Produzenten für in der Landwirtschaft und/oder Medizin verwendete Antibiotika eingesetzt wurden.
Das Antibiotikum ist nicht speziell beschränkt, solange seine Produktivität erhöht werden kann, indem das Bakterium gegen ein oder mehr Antibiotika resistent gemacht werden kann. Bevorzugte Antibiotika schließen landwirtschaftlich und/oder medizinisch nützliche Antibiotika ein (beispielsweise Actinomycin aus Streptomyces antibioticus 3720, Fredericamycin aus Streptomyces chattanoogensis ISP5002, FR900493 aus Bacillus cereus 2045 und Pyrrolnitrin aus Pseudomonas pyrrocinia 2327, usw.).
Das erfindungsgemäß zur Einführung einer Mutation in den Mikroorganismus verwendete Antibiotikum ist nicht besonders beschränkt, solange der Mikroorganismus, der gegen das Antibiotikum resistent gemacht wird, den sekundären Metaboliten bilden kann. Das bevorzugte Antibiotikum schließt sogenannte an Ribosomen angreifende Antibiotika einschließlich an ribosomalem Protein angreifende Antibiotika (z. B. das ribosomale S12 Protein angreifende Antibiotika) und ribosomale RNA-angreifende Antibiotika und RNA-Polymerase angreifende Antibiotika ein.
Um die Produktivität eines Antibiotikums in einem Bakterium zu erhöhen wird das Bakterium resistent gegen zwei oder mehr Antibiotika gemacht. Besonders bevorzugt ist eine Resistenz gegen zwei oder drei Antibiotika bei einem Bakterium und am bevorzugtesten ist eine Resistenz gegen drei Antibiotika bei einem Bakterium.
Die bevorzugte Kombination von Antibiotika zur Erzeugung der Resistenz ist (1) zwei verschiedene Aminoglycosid-Antibiotika, (2) ein Aminoglycosid-Antibiotikum und ein Ansamycin-Antibiotikum, und (3) zwei verschiedene Aminoglycosid-Antibiotika und ein Ansamycin-Antibiotikum.
Spezifische nicht beschränkende Beispiele für das Antibiotikum schließen Antibiotika der Aminoglycosid-Klasse ein, wie Streptomycin, Geniticin und Gentamicin und Antibiotika der Ansamycin-Klasse, wie Rifampicin.
Das Verfahren zur Erzeugung des Antibiotika-resistenten Mutantenbakteriums aus dem ursprünglichen Bakterium ist nicht besonders beschränkt. Bevorzugt wird ein ursprüngliches Bakterium in einem das Antibiotikum enthaltenden Medium kultiviert, und die spontan Antibiotika-resistenten Mutanten können durch Isolieren von Kolonien erhalten werden, die auf dem Antibiotkum wachsen können. Alternativ kann ein Bakterium einer üblichen Mutationsbehandlung unterzogen werden, wie Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen oder chemische Behandlung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder alpetriger Säure, und Antibiotika-resistente Mutanten können erhalten werden durch Isolieren von Kolonien, die auf dem Antibiotikum wachsen können. In diesem Schritt wird die Konzentration des Antibiotikums in einem Medium bevorzugt so kontrolliert, dass sie höher ist als die MIC für den ursprünglichen Mikroorganismus.
Bevorzugt ist die Konzentration der Antibiotika zweimal oder mehr, bevorzugter fünfmal oder mehr, am meisten bevorzugt zehnmal oder mehr höher als die MIC (minimale Hemmkonzentration) für den ursprünglichen Mikroorganismus. Beispielsweise ist für den Fall, dass Streptomycin als Antibiotikum verwendet wird, die bevorzugte Konzentration 5- bis 100-fach höher als die MIC gegen den ursprünglichen Mikroorganismus. Und für den Fall, dass Rifampicin als Antibiotikum verwendet wird, ist dessen bevorzugte Konzentration 5 bis 40 mal höher als die MIC gegen den ursprünglichen Mikroorganismus. Für den Fall, dass Gentamicin als Antibiotikum verwendet wird, ist dessen bevorzugte Konzentration zweimal höher als die MIC gegen den ursprünglichen Mikroorganismus.
Dieser Schritt kann weiter wiederholt werden, um ein multi- (zwei- oder mehrfach) resistentes Bakterium zu erhalten, das gegen zwei oder mehr Antibiotika resistent ist.
Dann wird eine Mutante, die das angestrebte Antibiotikum in erhöhter Menge produzieren kann, auf geeignete Weise selektiert. Beispielsweise kann sie selektiert werden durch eine analytische Methode (z. B. DSC, HPLC (DAD), LC-MS, optische Dichte, usw.), biologische Assay-Methoden (z. B. Assay der Aktivitäten von Enzymen wie Acylase, Demethylase, Deaminase, usw.; Assay von Aktivitäten biologisch aktiver Substanzen wie antibakterielle, Antipilz-, Antikrebs-Aktivität, usw.) usw. Beispielsweise wird die Menge an Actinorhodin durch Messen der optischen Dichte der überstehenden Flüssigkeit bei 633 nm bestimmt.
Wenn das mehrfach resistente Bakterium verwendet wird, kann der Schritt der Auswahl des Stamms mit einer erhöhten Produktivität des sekundären Metaboliten nach Erhalt des mehrfach resistenten Bakteriums oder nach mindestens einem Schritt der Einführung der Mutation durchgeführt werden.
Unter Verwendung rekombinanten DNA-Techniken kann ein Stamm mit verbesserter Produktivität an einem Antibiotikum von Interesse durch Transformieren eines Wirts mit einem rekombinanten Plasmid erhalten werden, welches ein Gen für die Biosynthese des Antibiotikums enthält.
In den oben beschriebenen Schritten kann das Kultivieren des Bakteriums durch Verwendung einer allgemein angewendeten Kulturmethode durchgeführt werden.
Das Medium kann entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches Medium sein, solange es geeignete Mengen notwendiger Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischer Substanzen, Aminosäuren, Vitamine und/oder Spurenmengen von Nährstoffsubstanzen enthält. Sie sind in verschiedenen Veröffentlichungen gezeigt, wie Hosoya, Y. et al., Antimicrob. Agents Chemoter. (1998) 42: 2041–2047; Kieser, T. et al., Practical Streptomyces Geneetics (2000): 406–415; und Medieninformationen, die für Bakterien im ATCC Medien-Handbuch aufgelistet sind.
Beispiele für die Kohlenstoffquelle schließen Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Sucrose, Maltose, Mannose, Glycerin, Stärke, Stärkehydrolysat und Molasse, Polyalkohole und verschiedene organische Säuren, wie Brenzweinsäure, Fumarsäure, Milchsäure und Essigsäure ein.
Beispiele für die Stickstoffquelle schließen Ammoniak oder verschiedene anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumacetat, Harnstoff und weitere Stickstoff-haltige Substanzen und Stickstoff-haltige organische Substanzen, wie Pepton, NZ-Amin, Fleischextrakt, Hefeextrakt, in Wasser eingeweichter Mais, Kaseinhydrolysat und Fischmehl oder ein verdautes Produkt davon ein.
Beispiele für die anorganische Substanz schließen Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Eisensulfat, Mangansulfat und Calciumcarbonat ein.
Aminosäuren und Vitamine können zu dem Medium gegeben werden, falls erforderlich.
Das Bakterium kann unter aeroben Bedingungen, wie Schüttelkultur oder Belüftungsrührkultur kultiviert werden. Im Allgemeinen wird das Kultivieren bei einer Temperatur von bevorzugt 20 bis 40°C durchgeführt. Es ist wünschenswert, den pH des Mediums ungefähr um den Neutralpunkt zu halten. Das Kultivieren wird im Allgemeinen während einer Zeit von 1 bis 7 Tagen durchgeführt.
Das gebildete und im Bakterium und/oder Kulturmedium akkumulierte Antibiotikum kann beispielsweise durch das folgende Verfahren isoliert werden. Die Zellen werden nach Ende der Kultur entfernt, oder die Zellen werden zerstört, und die resultierende Mischung wird zentrifugiert, um die zerstörten Zellen zu entfernen. Dann wird das gewünschte Antibiotikum mit einem bekannten Verfahren isoliert, das geeignet ist, die Isolierung des gewünschten Antibiotikums zu isolieren, wie Konzentrations-Kristallisations-Verfahren, Aktivkohle-Behandlungs-Verfahren und/oder Ionenaustauschharz-Verfahren.
Die vorliegende Erfindung wird weiter beschrieben, indem Streptomyces-Stämme als illustratives Beispiel verwendet werden. Die vorliegende Erfindung sollte jedoch nicht so verstanden werden, dass sie darauf beschränkt ist.
Die zur Gattung Streptomyces gehörenden Stämme werden im Folgenden als Beispiele für die Bakterien der vorliegenden Erfindung erläutert, die in zwei Gruppen aufgeteilt werden können: der Wildtyp-Stamm und Wirkstoff resistente Mutanten von Streptomyces coelicolor und nicht identifizierte Streptomyces sp., die aus Boden isoliert werden und normalerweise keine Antibiotika produzieren. Vier Arten Antibiotika, die als Gentamicin, Geniticin, Streptomycin und Rifampicin benannt werden, werden im Folgenden als Beispiele für den Wirkstoff erläutert.
Streptomyces coelicolor ist ein hervorragender Modellstamm, um die Antibiotikabildung und weitere Prozesse zu studieren; er ist die genetisch am intensivsten untersuchte Streptomyces-Art und bildet vier chemisch verschiedene Antibiotika, deren Biosynthese-Gene isoliert wurden: das blau pigmentierte Polyketid Actinorhodin, Undecylprodigiosin, Methylenomycin und das Calcium-abhängige Antibiotikum. Von diesen ist Actinorhodin ein repräsentativer sekundärer Metabolit und besitzt einen typischen Polyketid-Biosyntheseweg.
Eigenschaften von Actinorhodin: feine rote Nadeln aus Dioxan, Zersetzung 270°C, Absorptionsmaximum (Dioxan): 560, 523 nm.
Löslich in Piperidin, Tetrayhdrofuran, Dioxan, Phenol; etwas löslich in Alkohol, Essigsäure, Aceton.
Praktisch unlöslich in wässriger Säure; löslich in wässrigem Alkali mit heller blauer Farbe.
Eigenschaften der Wirkstoffe:
Gentamicin:
Zusammensetzung: dieser Antibiotikakomplex besteht aus drei Komponenten: GentamycinC₁, GentamycinC₂ und GentamycinC_1a. Wie in 10 gezeigt, besitzen sie ähnliche Strukturen.
Wirkungsmechanismus: wirken auf ribosomale 16S RNA- oder andere ribosomale Proteine (L6-Protein oder weitere unbekannte Proteine), was in einer Inhibierung der Proteinsynthese im Ribosom resultiert.

Klasse: gehört zu den Aminoglycosid-Antibiotika.

Geniticin:

Zusammensetzung: eine Komponente, Struktur wie in 10 gezeigt.
Wirkungsmechanismus: inhibiert die Proteinsynthese durch Einwirken auf 16S ribosomale RNA- oder unbekannte Proteine.
Klasse: gehört zu den Aminoglycosid-Antibiotika.

Streptomycin:

Zusammensetzung: eine Komponente und Struktur wie in 10 gezeigt, welche einen großen Unterschied verglichen mit Gentamycin und Geniticin zeigt.
Wirkungsmechanismus: inhibiert die Proteinsynthese durch Wirkung auf das ribosomale S12-Protein- und/oder 16S-RNA.
Klasse: gehört zu den Aminoglycosid-Antibiotika.

Rifampicin:

Zusammensetzung: eine Komponente und Struktur wie in 10 gezeigt.
Wirkungsmechanismus: inhibiert RNA-Synthese durch Wirken auf die β-Untereinheit von RNA-Polymerase.
Klasse: gehört zu den Ansamycin-Antibiotika.

Als Beispiel für eine bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung kann die Actinorhodin-Produktivität in Streptomcyes coelicolor erhöht werden, indem jeweils Antibiotika-Resistenz-Mutationen in den Stamm mit hoher Frequenz von 5–10 % von Streptomycin-resistenten, Gentamicin-resistenten oder Rifampicin-resistenten Isolaten eingeführt werden. Die meisten Mutanten sind stabil und können wachsen und normal Luft-Mycele wie der Wildtyp-Stamm bilden. Darüber hinaus kann durch Einführen einer weiteren Antibiotika-Resistenz-Mutation in eine einzelne Mutante die Actinorhodin-Produktivität weiter um das 1,8-2,2-fache erhöht werden. Selbstverständlich kann sich der Grad des Anstiegs zwischen den Mutanten unterscheiden. Schließlich kann die dritte Mutation in doppelte Mutanten eingeführt werden, was zu dreifachen Mutanten führt. Die Überproduktion von Actinorhodin in den Dreifach-Mutanten wird dann getestet. Diese Antibiotika besitzen unterschiedliche Wirkungspositionen, so dass ihre Funktionen additiv sind und miteinander für die kontinuierliche Verbesserung der Antibiotikaproduzenten kombiniert werden können, wie in 2, 4, 5 und 7 gezeigt. Die Mutationsanalysen zeigten, dass die meisten Rifampicin-resistenten Mutanten eine Punktmutation am rpoB-Gen bildeten, das für die β-Untereinheit von RNA-Polymerase kodiert, was zu hohen Resistenzspiegeln gegen Rifampicin führte; einige Streptomycin-resistente Mutanten mit hohem Resistenzgrad gegen Streptomycin zeigten eine Punktmutation im rpsL-Gen, welches für das ribosomale S12-Protein kodiert, aber keine Mutation in diesem Gen bei niedrig resistenten Mutanten; alle Gentamicin- oder Geniticin-resistenten Mutanten zeigten keine Mutation im rpsL-Gen, und ihre Mutationen können vielleicht in einem unbekannten Gen existieren. Obwohl einige Mutationspositionen bisher noch nicht bestimmt wurden, sollten solche Mutation in bestimmten Genen existieren, da die in dieser Erfindung verwendeten Antibiotika dafür bekannt sind, dass sie an bestimmten Zielpunkten im Ribosom wirken.
Statistische Mutagenese und Selektion wird als Annäherungsklasse oder nicht rekombinantes Stammverbesserungsverfahren bezeichnet. Verbesserte Mutanten werden normalerweise durch Screenen einen großen Population mutierter Organismen identifiziert, da der Mutanten-Phänotyp nicht leicht erkennbar sein kann und die gewünschten Mutationen in extrem niedriger Frequenz auftreten. Obwohl diese Annäherung den Vorteil hat, einfach und zuverlässig zu sein, ist das statistische Screenen zeitaufwendig und teuer.
Darüber hinaus besitzt das Screenen statistischer Mutationen unter Verwendung von Mutagenen keine bestimmten Zielorte und zeigt eine relativ große Unbestimmtheit. Im Gegensatz dazu verwendet das in dieser Erfindung verwendete Verfahren einige Antibiotika, die Protein- oder Nukleinsäuresynthese inhibieren als Screening-Mittel, die vollständig unterscheidbar sind von traditionellen Mutagenen wie Bestrahlung, Chemikalien (Basen-Analoga, Deaminierungsmittel, Alkylierungsmittel oder interkalierende Mittel, usw.) und biologische Mittel (Phagen, Plasmide oder DNA-Transposons, usw.). Darüber hinaus kann das in dieser Erfindung beschriebene Verfahren eine hohe Frequenz der gewünschten Mutation bilden, so dass die Selektion positiver Mutanten nicht viel Zeit und Arbeit erfordert.
Mehrfach-Wirkstoff-resistente Bakterien, die erfindungsgemäß erhalten werden, können als heterologe Wirte zum Exprimieren fremder Gene verwendet werden, die für landwirtschaftlich und/oder medizinisch nützliche Antibiotika kodieren.
Zusätzlich zur Manipulation von Bakterien durch Mutation bieten die Techniken der genetischen Rekombination eine weitere rationelle Methode zur Verbesserung von Stämmen. Sie kann verwendet werden, um geschwindigkeitslimitierende Schritte des Biosynthesewegs durch Erhöhung beispielsweise der Gendosierung oder durch Veränderung eines Regulierungsmechanismus zu entfernen. Offensichtlich erfordert dies sehr viel Kenntnis der Antibiotikaproduktions-Biochemie und -Genetik wie Streptomyces coelicolor und E. coli. Von den meisten neuen Antibiotika-Produzenten fehlt jedoch dieses Wissen, so dass dieses Verfahren für die meisten Stämme nicht anwendbar ist. Darüber hinaus ist dieses Verfahren teuer und komplex. Im Gegensatz dazu erfordert das in dieser Erfindung beschriebene Verfahren nicht viel Wissen der Biochemie und Genetik von Stämmen und ist einfach und nicht teuer. Dieses neue Verfahren kann für die meisten Bakterien einschließlich n oder andere Bakterien verwendet werden, insbesondere für die aus der Natur isolierten Wildtyp-Stämme.
Zusätzlich zur Verbesserung der Produktivität der Stämme kann das in dieser Erfindung beschriebene Verfahren verwendet werden, um bestimmte stumme Antibiotika-Biosynthese-Gene durch Einführung von Wirkstoff-Resistenz-Mutationen zu aktivieren. Die Erfinder isolierten eine Anzahl von Streptomyces sp. aus Böden, die keine antibakterielle Aktivität zeigen, und selektierten dann die Antibiotika-resistenten Mutanten mit einer Fähigkeit zur Bildung antibakterieller Aktivität. Die Erfinder fanden, dass etwa 50 % der aus Böden isolierten Stämme aktiviert werden können, so dass sie Antibiotika bilden, wie in 9 und Tabelle 3 gezeigt. Unterdessen ist die Antibiotika-Synthese in Mutanten mediumabhängig, wie in 9 gezeigt. Daher ist es wichtig, verschiedene unterschiedliche Arten von Medien zu verwenden, um die Produktivität der antibakteriellen Mittel zu untersuchen.
BEISPIELE
Beispiele für die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden beschrieben. Diese sollten so verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.
BEISPIEL 1
Vorratssporen von Streptomyces coelicolor Wildtyp-Stamm wurden auf GYM-Agar ausgestrichen, enthaltend 0,4 % Glucose, 0,4 % Hefeextrakt, 1% Malzextrakt, 0,1% Pepton (NZ-Amin, Typ A), 0,2 % NaCl und 2 Agar (vor der Zugabe von Agar wurde der pH auf 7,31 eingestellt). Das Medium wurde mit einer üblichen Methode sterilisiert (121 °C, 15 min). Dann wurden die Agarplatten während 10–14 Tagen bei 30°C zur Sporulation inkubiert. Steriles destilliertes Wasser (5 ml) wurde zu jeder Platte gegeben, und die Oberfläche vorsichtig abgekratzt, um die Sporen freizusetzen. Die Suspensionen wurden durch Zentrifugation isoliert und zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Vor der Verwendung zum Animpfen wurden die Sporen während 10 min. in einem Ultraschallbad dispergiert. Die Konzentration an Sporen wurde auf etwa 2 × 10⁹ Sporen pro ml eingestellt.
Die spontanen Streptomycin-, Gentamicin- oder Rifampicin-resistenten Mutanten von S.coelicolor wurden erhalten, als die Kolonien, die innerhalb von 7 Tagen bei 30°C nach dem Ausstreichen der Sporen (oder Zellen) auf GYM-Agar (Zusammensetzung genauso wie der obige GYM-Agar), enthalten 5 μg Streptomycin pro ml oder 1,0 μg Gentamicin pro ml oder 200 μg Rifampicin pro ml, wuchsen (das Wachstum der Elternstämme wurde vollständig mit 1 μg Streptomycin pro ml, 0,1 μg Gentamicin pro ml oder 10 μg Rifampicin pro ml inhibiert). Die einzelnen auf Screening-Platten gewachsenen Kolonien wurden selektiert und auf R4-Agar, enthaltend 1 % Glucose, 0,1 % Hefeextrakt, 0,001 Casaminosäuren, 0,3 % Prolin, 1 % MgCl₂·6H₂O, 0,4 % CaCl₂·2H₂O, 0,002 % K₂SO₄, 0,56 % TES [N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure], 0,2 % Spurenelementelösung (wie beschrieben für R2YE-Medium) und 2 % Agar (vor der Zugabe von Agar auf pH 7,2 eingestellt) angeimpft. Die R4-Platten wurden bei 30°C während 6 Tagen inkubiert, und die Menge des gebildeten blauen Pigments Actinorhodin wurde beioWildtyp-Stamm und Mutanten verglichen, und die Überproduzenten wurden innerhalb der Mutanten ausgewählt. Dann wurden die Mutanten, die Actinorhodin überproduzierten, in 25 ml Teströhrchen in R4-Flüssigmedium angeimpft (Zusammensetzung ist dieselbe wie der R4-Agar, aber kein Agar), enthaltend 5 ml Medium, auf einem Orbitalschüttler bei 30°C, 350 Upm. Nach Inkubation während 6 Tagen wurden 1 ml Kulturproben entnommen und der pH auf 8,0 eingestellt. Nach Zentrifugieren bei 1100 g während 5 min. wurde die Actinorhodin-Bildung in den überstehenden Flüssigkeiten durch Messung der optischen Dichte der überstehenden Flüssigkeiten bei 633 nm in einem Assay bestimmt. Die höchste erreichte Produktivität erreichte das 1,6-fache für Gentamicin-resistente Mutanten, das 1,8-fache für Streptomycin-resistente Mutanten und 3,0-fache für Rifampicin-resistente Mutanten. Die Frequenzen für solche starken Produzenten waren 5 %, 6 bzw. 10 % (siehe Tabelle 1 und 7).
Mutationsanalysen der Mutanten wurden durch das unten beschriebene Verfahren durchgeführt. Das rpsL-Genfragment der Str-resistenten Mutante wurde durch PCR unter Verwendung einer genomischen DNA der Mutante als Templat und eines synthetischen Oligonukleotid-Primers P1 (forward: 5'-ATTCGGCACACAGAAAC) und P2 (reverse: 5'-AGAGGAGAACCGTAGAC), die auf der Basis der Sequenz von S. lividans (DDBJ Zugangsnummer: D83746) aufgebaut waren erhalten. Die PCR wurde durch Befolgen der Herstelleranweisungen und unter Verwendung von Taq-Polymerase (Takara ex Taq) durchgeführt. Ein thermischer Cycler Perkin-Elmer Cetus wurde verwendet, und die Bedingungen waren 5 min Inkubation bei 96°C, gefolgt von 30 Zyklen bei 96°C während 0,3 min, 55°C während 0,2 min und 72°C während 0,5 min, schließlich bei 72°C während 10 min. Die PCR-Produkte wurden direkt durch das Dideoxy-Kettenterminierungsverfahren unter Verwendung des Bigdye-Terminators Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) sequenziert. Die Sequenzdaten wurden mit dem GENETIX-Programm analysiert (Software Development Co., Tokio, Japan).
Das partielle rpoB-Genfragment der Rif-resistenten Mutante wurde durch PCR unter Verwendung der genomischen DNA einer Mutante als Templat und eines syntetischen Oligonukleotid-Primers P3 (forward: 5'-GGCCGCTACAAGGTGAACAAGAAG) und P4 (reverse: 5'-CGATGACGAAGCGGTCCTCC) durchgeführt, die auf der Basis der Sequenz von S. coelicolor M145 entworfen wurden. Die PCR-Methode und die DNA-Sequenzierung sind dieselben wie beim rpsL-Gen. Die rpsL-Gene von 3 Gentamicin-resistenten Mutanten und 3 Streptomycin-resistenten Mutanten wurden sequenziert und mit denen des Wildtyp-Stamms Streptomyces coelicolor verglichen. Die partiellen rpoB-Gene von 3 Rifampicin-resistenten Mutanten wurden sequenziert und mit denen des Wildtyp-Stammes Streptomyces coelicolor verglichen. 3 Rifampicin-resistente Mutanten zeigten eine Punktmutation in diesem Bereich des rpoB-Gens; lediglich eine Streoptomycin-resistente Mutante besaß eine Punktmutation im rpsL-Gen; alle Gentamicin-resistenten Mutanten zeigten keine Mutation im rpsL-Gen (siehe Tabelle 2).
BEISPIEL 2
Die Sporenlösung des Stamms S-1 (Streptomycin-resistente Mutante) wurde durch dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 hergestellt.
Die spontanten Geniticin-, Gentamicin- oder Rifampicin-resistenten Mutanten von S-1 wurden als Kolonien erhalten, die auf GYM-Agar, enthaltend 2,5 μg Geniticin pro ml oder 2,5 μg Gentamicin pro ml oder 200 μg Rifampicin pro ml wuchsen (das Wachstum des S-1.-Stamms wurde vollständig durch 0,5 μg Geniticin pro ml, 0,5 μg Gentamicin pro ml oder 10 μg Rifampicin pro ml inhibiert). Die Acinorhodin-Produktivität der Mutanten wurde unter Verwendung von R4-Agarplatten und R4-Flüssigmedium untersucht.
Die höchste nachgewiesene Produktivität erreichte das 1,7-fache für Geniticin-resistente Mutanten, das 2,2-fache für Gentamicin-resistente Mutanten und das 2,5-fache für Rifampicin-resistente Mutanten. Die Frequenzen dieser starken Produzenten waren 13 %, 14 % bzw. 18 (siehe Tabelle 1 und 7).
Mutationsanalysen der Mutanten wurden durch das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren durchgeführt. Alle drei Antibiotika-resistenten Mutanten, die hier erhalten wurden, hatten die Mutation im rpsL-Gen von S-1, es wurde aber keine zusätzliche Mutation im rpsL-Gen gefunden. Sieben Rifampicin-resistente Mutanten zeigten eine Punktmutation im rpoB-Gen (siehe Tabelle 2).
BEISPIEL 3
Die Sporenlösungen der SG-1 und SG-2-Stämme (Gentamicin- und Streptomycin-resistente doppelte Mutanten) wurden mit demselben Verfahren wie in Beispiel 1 hergestellt.
Die spontanten Rifampicin-resistenten Mutanten von SG-1 und SG-2-Stämmen wurden als Kolonien erhalten, die während 7 Tagen bei 30°C auf GYM-Agar wuchsen, der 200 μg Rifampicin pro ml enthielt (das Wachstum von SG-1 und SG-2-Stämmen wurde vollständig durch 10 μg Rifampicin pro ml inhibiert),.
Die Actinorhodin-Produktivität der Mutanten wurde unter Verwendung von R4-Agarplatten und R4-Flüssigmedium untersucht.
Die höchste nachgewiesene Produktivität erreichte das 3,4-fache für Rifampicin-resistente Mutanten des SG-1-Stamms und das 3,6-fache für Rifampicin-resistente Mutanten des SG-2-Stamms. Die Frequenzen solcher starken Produzenten waren 10 % bzw. 15 % (siehe Tabelle 1 und 7).
Mutationsanalysen wurden durch das in Beispiel 1 beschrieben Verfahren durchgeführt. Es wurde gefunden, dass 5 Rifampicin-resistente Mutanten eine Punktmutation im rpoB-Gen aufwiesen, aber eine Mutante hatte keine Mutation in dieser Region (siehe Tabelle 2). Tabelle 1 Screening und Antibiotika-Produktivität Wirkstoff-resistenter Mutanten

a, d: OD der überstehenden Flüssigkeit wurde bei 633 nm nach 6 Tagen Kultivieren bei 30°C unter Verwendung eines 25 ml-Teströhrchens, enthaltend 5 ml R4-Medium bestimmt. Alle Messungen wurden dreifach durchgeführt, und der Mittelwert wurde angegeben.
b: bestimmt nach 2 Tagen Inkubation auf GYM-Agar.
c: Mutanten, die mehr Antibiotikum als der Ausgangsstamm produzierten. Die Zahlen in Klammern sind die Anzahl der Mutanten, die mehr Antibiotikum produzierten/Anzahl der getesteten Mutanten.

a, b Nummerierung beginnt beim Startcodon (GTG oder ATG) des offenen Leserahmens.
c: Bestimmt nach 4 Tagen Kultivieren auf GYM-Agar.
d: STR, GEN, RIF und GNE bedeuten Streptomycin, Gentamycin, Rifampicin bzw. Geniticin.
e: -, Wildtyp-rpsL-Gen
f: Mutationen wurden im rpsL- oder rpoB-Gen nicht nachgewiesen.

BEISPIEL 4
Die zeitlichen Verläufe der Actinorhodin-Biosynthese wurden unter Verwendung von Streptomyces coelicolor Wildtyp-Stamm, S-1 (einer Streptomycin-resistenten Mutante), SG-1 (einer Gentamicin- und Streptomycin-resistenten doppelten Mutante) und SGR-1 (einer Gentamicin-, Streptomycin- und Rifampicin-resistenten dreifachen Mutante) durchgeführt. Ein Erlenmeyer-Kolben mit 500 ml Kapazität, enthaltend 150 ml R4- oder R3-Medium, wurde mit Sporenlösungen angeimpft, dann bei 30°C in einem Orbitalschüttler bei 200 Upm während der angegebenen Zeit inkubiert. Die Zusammensetzung des R4-Flüssigmediums war dieselbe wie in Beispiel 1. Das R3-Flüssigmedium war dasselbe wie R4, erhielt jedoch eine erhöhte Menge (0,5 %) Hefeextrakt und zusätzliches KH₂PO₄ (0,005 %). Nach 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden, 96 Stunden, 120 Stunden, 144 Stunden oder 168 Stunden Inkubation im R4-Medium (nach 36 Stunden, 60 Stunden, 84 Stunden, 108 Stunden, 132 Stunden, 156 Stunden, 180 Stunden Inkubation beim R3-Medium) wurden 1 ml Kulturproben entnommen und der pH auf 8,0 eingestellt. Nach Zentrifugieren bei 1100 g während 5 min wurde die Actinorhodin-Bildung durch Messung der optischen Dichte der überstehenden Flüssigkeiten bei 633 nm bestimmt. Die Ergebnisse, wie in 5 gezeigt, dieser einfachen, doppelten und dreifachen Mutanten, zeigten in hierarchischer Reihenfolge einen deutlichen Anstieg der Actinorhodin-Biosynthese.
BEISPIEL 5
Die Effekte der Nährstoffquellen auf die Actinorhodin-Bildung wurden untersucht, indem die in Beispiel 4 beschriebenen Stämme und Verfahren untersucht wurden, R4-Flüssigmedium wurde als Basismedium verwendet, welches mit verschiedenen Mengen Hefeextrakt, Casaminosäuren bzw. KH₂PO₄ angereichert wurde. Der Actinorhodin-Assay war derselbe wie in Beispiel 4 beschrieben. Wie in 6 gezeigt, resultierte der Zusatz von Hefeextrakt in einer deutlichen Verschlechterung der Actinorhodin-Produktivität. Dieses Ergebnis war in der Dreifachmutante weniger ausgeprägt. Anders als Hefeextrakt waren Casaminosäuren wirksam zu Erhöhung der Actinorhodinproduktion in der einfachen, doppelten oder dreifachen Mutante, jedoch nicht im Wildtyp-Stamm, was die Effizienz dieser Wirkstoff-resistenten Mutationen zeigt. KH₂PO₄ hatte im Wesentlichen keine Wirkung auf die Actinorhodin-Produktivität.
BEISPIEL 6
Die aus Böden isolierten unidentifizierten Streptomyces wurden zur Herstellung von Sporenlösungen auf GYM-Agar angeimpft, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Screening von Streptomycin-, Gentamicin- der Rifampicin-resistenten Mutanten erfolgte wie in Beispiel 2 beschrieben. Die resistenten Mutanten wurden auf GYM-Agar, R4-Agar und SYM-Agar angeimpft und bei 30°C während 6 Tagen inkubiert. Die Zusammensetzung des GYM-Agars und R4-Agars war dieselbe wie in Beipiel 1 beschrieben. SYM-Agar enthielt 1 % lösliche Stärke, 0,2 Hefeextrakt, 0,5 % Glukose und 2 % Agar (vor der Zugabe von Agar wurde der pH auf 7,3 eingestellt).
Die Agarplättchenmethode (agar plug method) wurde zum Nachweis der Produktivität eines Antibiotikums in Mutanten durch Messung des Ausmaßes der Wachstumsinhibierung (Durchmesser der inhibitorischen Bereiche) der Testorganismen verwendet (E. coli K12, S. aureus 209P, B. subtilis 6633 oder Candida albicans).
Die Ergebnisse des Screenings sind in 9 und Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3 Ergebnisse des Screenings für die Stämme von Nr. 101 bis 200
BEISPIEL 7
Eine Gentamicin-resistente Mutante und eine Rifampicin- und Gentamicin-resistente Mutante von Bacillus cereus Nr. 2045 wurden auf die gleiche Weise wie in den Beispielen 1, 2 oder 3 hergestellt. Diese Mutanten wurden in Bouillon-Medium für 10 Stunden vorkultiviert. Zellen (0,1 ml) wurden in 5 ml Herstellungsmedium angeimpft, bestehend aus (pro Liter) 20 g Polypepton, 20 g in Wasser eingeweichtem Mais und 5 g NaCl (mit NaOH auf pH 7,5 eingestellt), während 2 Tagen bei 30°C. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. TABELLE 4 Screening-Ergebnisse und Charakteristika der Mutanten

*1 gen bedeutet resistent gegen Gentamicin, gen-rif bedeutet resistent gegen Gentamicin und Rifampicin
*2 GEN bedeutet Gentamicin und RIF bedeutet Rifampicin
*3 WB2045 ist eine Substanz mit antimikrobieller Wirkung, welche von Bacillus cereus Nr. 2045 (=FERM BP-1791) gebildet wird (USP 4,950,605).
*4 Die antibakterielle Wirkung von WB2045 gegen Bacillus subtllis 6633-Stämme wurde durch ein übliches Papierscheibendiffusions-Assay (Toyo Roshi; dicker Typ 9 mm Φ) auf einer Agarplatte unter Verwendung von 1,7 × NG-Medium durchgeführt [Medium, entwickelt für die Antibiotikaherstellung durch Bacillus subtllis, enthaltend (pro Liter) 17 g Nährlösung (Difco), 17 g Glucose, 3,4 g NaCl, 8,5 mg CuSO₄·5H₂O, 12,75 mg FeSO₄·7H₂O, 6,12 mg MnSO₄·5H₂O, 25,5 mg CaCl₂·2H₂O und 15,3 mg ZnSO₄·7H₂O (mit NaOH auf pH 7,2 eingestellt)], während 48 Stunden bei 30°C.

BEISPIEL 8
Eine Rifampicin-resistente Mutante und eine Streptomycin- und Rifampicin-resistente Mutante von Streptomyces lividans 66 wurde auf die gleiche Weise wie in Beispielen 1, 2 oder 3 gebildet, und die Actinorhodinbildung wurde beurteilt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. TABELLE 5 Screening-Ergebnisse und Eigenschaften der Mutanten

*1 rif oder rif-str, resistent gegen Rifampicin oder resistent gegen Rifampicin und Streptomycin; RIF, Rifampicin; STR, Streptomycin
*2 Actinorhodin (Act)-Bildung wurde bestimmt durch Assay der OD-Werte bei 633 nm bei den überstehenden Flüssigkeiten der Flüssigkulturen in R4-Meidum nach Kultivieren während 5 Tagen bei 30°C.

GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erhöhung der Produktivität des Antibiotikums durch ein Bakterium in arbeitssparender, zeitsparender, hocheffizienter und semirationaler Weise bereit, das anwendbar ist für die Stämme ohne mehr Wissen über beispielsweise die Antibiotika-Biochemie und -Genetik. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Erzeugung eines Bakteriums, welches eine erhöhte Produktivität eines Antibiotikums aufweist, welches die Schritte umfasst: Erzeugen einer Resistenz gegen zwei oder mehr Antibiotika in diesem Bakterium durch Kultivieren in einem Medium, welches die Antibiotika enthält, wobei die Konzentration dieser Antibiotika höher ist als die minimale Hemmkonzentration dieser Antibiotika gegen das ursprüngliche Bakterium, und Isolieren von Kolonien, die in dem Medium wachsen können.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Bakterium zu der Gattung gehört, die ausgewählt wird aus der aus der Gattung Streptomyces, der Gattung Bacillus und der Gattung Pseudomonas bestehenden Gruppe.
Verfahren wie in Anspruch 1 oder 2 beansprucht, wobei das Bakterium aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus Stroptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Streptomyces antobioticus, Streptomyces chattanoogensis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus und Pseudomonas pyrrocinia.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Antibiotika ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus an ribosomalem Proteinangreifenden Antibiotika, an ribosomaler RNA angreifenden Antibiotika und an RNA-Polymerase angreifenden Antibiotika besteht.
Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Antibiotika ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus Streptomycin, Geneticin, Gentamicin und Rifampicin besteht.
Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums, welche die Schritte des Verfahrens nach Anspruch 1, Kultivieren des so erhaltenen mutierten Bakteriums in einem Medium, Bildung und Akkumulieren des Antibiotikums und Isolieren des Antibiotikums daraus umfasst.
Verfahren wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei das Bakterium zu der Gattung gehört, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus der Gattung Streptomyces, der Gattung Bacillus und der Gattung Pseudomonas besteht.
Verfahren wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei das Bakterium aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus Stroptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Streptomoyces antibioticus, Streptomyces chattanoogensis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus und Pseudomonas pyrrocinia.
Verfahren wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei die zur Herstellung des mutierten-Bakteriums verwendeten Antibiotika ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus an ribosomalem Protein angreifenden Antibiotika, an ribosomale RNA angreifenden Antibiotika und an RNA-Polymerase angreifenden Antibiotika besteht.
Verfahren wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei die Antibiotika ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus Streptomycin, Geneticin, Gentamicin und Rifampicin besteht.