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DE602004002888T2 - Vorrichtung und Verfahren zum Sanieren und Entsalzen von biologischen Proben - Google Patents

Vorrichtung und Verfahren zum Sanieren und Entsalzen von biologischen Proben Download PDF

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DE602004002888T2
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Becton Dickinson and Co
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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Vorrichtungen zur Verarbeitung von biologischen und chemischen Proben.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Es gibt herkömmliche Techniken zur Durchführung einer massenspektrometrischen Analyse von großen Molekülen unter Verwendung von MALDI-Platten (MALDI = matrix-assisted laser desorption and ionization). Typischerweise werden mit diesen Techniken flüssige Lösungen (einschließlich z.B. Peptid, Protein und energieabsorbierender Matrix) anfangs in vordefinierte Zielstellen auf einer MALDI-Platte eingeführt. Da der Durchmesser der Zielstellen im Allgemeinen klein und häufig dicht gepackt ist, werden kleine (z.B. 1-5 μl) Tröpfchen der flüssigen Lösungen auf die Zielstellen der Platte gebracht, um eine richtige Platzierung der Probe zu erreichen und um eine Probenüberlappung zwischen Zielstellen zu vermeiden. Sobald die flüssigen Proben deponiert sind, werden sie eingedampft, wobei Matrixkristall-Konglomerate enthaltende Analytenmoleküle (z.B. Peptide und Proteine), die auf den Zielstellen zurückbleiben, günstige Eigenschaften für das MALDI-Verfahren und die massenspektrometrische Analyse haben. Wenn größere Konglomeratproben gewünscht werden, wird die serielle Platzierung von flüssigen Proben und Eindampfung verwendet, um iterativ ein Konglomerat aufzubauen.
  • Vor der Platzierung auf der MALDI-Platte wird die flüssige Lösung typischerweise gereinigt und entsalzt. Diese Reinigung und Entsalzung wird im Stand der Technik mit Säulen, Pipettenspitzen oder Multinapf-Filterplatten, die mit C18- Medium oder anderen chromatographischen Medien gepackt sind, erreicht. Beispiele für Säulen, die mit C18-Medium gepackt sind, sind Pierce PepCleanTM C18 Spin Columns und 3M EmporeTM Extraction Disk Cartridge. Beispiele für Pipettenspitzen, die mit C18-Medium gepackt sind, sind Millipore ZipTip® Pipette Tips und Varian OMIX Pipette Tips C18. Beispiele für Multinapf-Filterplatten, die mit C18-Medium gepackt sind, sind Millipore Zip Plate Micro-SPE Plate und 3M EmporeTM 96-Well Extraction Disk and Plate.
  • Für illustrative Zwecke umfasst ein häufiges Verfahren zur Reinigung und Entsalzung von Proben in Form von flüssigen Lösungen unter Verwendung einer der oben genannten Vorrichtungen das anfängliche Benetzen des C18-Mediums mit einem Puffer, der ein organisches Lösungsmittel, wie Methanol oder Acetonitril, enthält, und danach das Äquilibrieren des C18-Mediums mit einem Äquilibrierungspuffer. Dann werden die in Form von flüssigen Lösungen vorliegenden Proben durch das C18-Medium fließen gelassen; es wird erwartet, dass Peptide und Proteine der Probe während dieses Schritts in dem C18-Medium zurückgehalten werden. Danach wird das C18-Medium mit einem Waschpuffer gewaschen, und wiederum wird erwartet, dass die Peptide und Proteine während dieses Schritts in dem Medium zurückgehalten werden. Schließlich wird ein Fließelutionspuffer durch das C18-Medium geleitet, der die Peptide und Proteine von dem Medium dissoziiert, und es wird erwartet, dass die Peptide und Proteine in diesem Schritt mit dem Elutionspuffer herausfließen.
  • US 2002/0034827 beschreibt ein Verfahren zur Reinigung einer Probe, wie es oben erklärt ist.
  • Ein erheblicher Teil der Peptide und Proteine in der Probenlösung kann in den Vorrichtungen des Standes der Technik durch das C18-Medium oder die anderen chromatographischen Medien fließen, ohne an das C18- oder die anderen Medien zu binden. Als Ergebnis kann die Ausbeute der Peptide und Proteine schlecht sein, insbesondere wenn die Probenkonzentration gering ist.
  • Kurzbeschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Probenverarbeitungstechnik zum Reinigen einer biologischen oder chemischen Probe bereit. Die Erfindung ist besonders gut für die Vorbereitung einer Probe für die Massenspektrometrie geeignet, wie die Vorbereitung einer Probe für die Verwendung mit einer MALDI-Platte. Das Verfahren soll bei einem Artikel durchgeführt werden, der wenigstens einen Schacht aufweist, bei dem die Oberfläche des Schachts wenigstens partiell hydrophob und/oder mit biospezifischen Liganden modifiziert ist. Mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Probenlösung zu dem Schacht gegeben, wobei die Lösung zwei Arten von gelösten Stoffen enthält: einen ersten Typ von gelösten Stoffen (wie Peptiden und Proteinen), die durch hydrophobe Wechselwirkungen oder durch Wechselwirkungen mit den auf der Schachtoberfläche immobilisierten biospezifischen Liganden fest an die Schachtoberfläche binden können, und einen zweiten Typ von gelösten Stoffen (wie Salzen oder Kontaminanten in Form kleiner Moleküle), die nicht fest an die Schachtoberfläche binden können. Sobald sie hinzugefügt wurde, wird die Probenlösung in dem Napf getrocknet und scheidet dabei alle gelösten Stoffe auf der Schachtoberfläche ab. Ein Puffer, der den ersten Typ von gelösten Stoffen nicht von der Schachtoberfläche dissoziieren kann, aber den zweiten Typ von gelösten Stoffen von der Schachtoberfläche dissoziieren kann, wird in den Schacht gegeben. In der Folge wird der zweite Typ von gelösten Stoffen im ersten Puffer gelöst, während der erste Typ von gelösten Stoffen an die Schachtoberfläche gebunden bleibt. Der erste Puffer, der jetzt den zweiten Typ von gelösten Stoffen enthält, wird aus dem Schacht entfernt und hinterlässt den ersten Typ von gelösten Stoffen an die Schachtoberfläche gebunden zurück. Der erste Puffer kann immer wieder hinzugefügt und wieder entfernt werden, um den zweiten Typ von gelösten Stoffen maximal zu entfernen. Danach wird ein zweiter Puffer, der den ersten Typ von gelösten Stoffen von der Schachtoberfläche dissoziieren kann, in den Schacht gegeben. Der erste Typ von gelösten Stoffen wird im zweiten Puffer gelöst, so dass man eine gereinigte Lösung des ersten Typs von gelösten Stoffen erhält. Gegebenenfalls kann der zweite Puffer eindampfen gelassen werden, um dadurch seine Konzentration zu erhöhen.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in einer Säule, Pipette oder Multinapfplatte praktiziert werden, wobei die gereinigte Lösung später auf eine Zielplatte oder andere gewünschte Analysevorrichtung aufgebracht wird. Außerdem kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung mit einer Zielträgerplatte praktiziert werden, die lösbar an einer Zielvorrichtung, wie einer MALDI-Platte, befestigt werden kann. Mit einer Zielträgerplatte kann die flüssige Probe in der Zielträgerplatte und auf der Vorrichtung gereinigt und dann eingedampft werden, damit ein Konglomerat direkt auf der Zielplatte entstehen kann, ohne dass eine Übertragung der flüssigen Probe erforderlich ist.
  • Diese und andere Merkmale der Erfindung werden durch ein Studium der folgenden ausführlichen Beschreibung und der Begleitzeichnungen besser verständlich.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist ein Schema einer Multinapfplatte, die mit der vorliegenden Erfindung verwendbar ist.
  • Die 2(a)-(f) zeigen das Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie es in einer Multinapfplatte durchgeführt wird.
  • Die 3(a) und (b) zeigen schematisch eine Zielträgerplatte und eine Zielvorrichtung, die mit der vorliegenden Erfindung verwendbar sind.
  • Die 4 bis 7 zeigen verschiedene Zielträgerplatten- und Zielvorrichtungszusammenstellungen, wobei 5 eine vergrößerte Ansicht von Ausschnitt 5 in 4 ist.
  • Die 8(a) bis (j) zeigen das Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie es in einer Zielträgerplatte und Zielvorrichtung durchgeführt wird.
  • Die 9 bis 15 zeigen verschiedene Massenspektren.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Bereitgestellt wird hier ein neues Verfahren zum Reinigen einer biologischen oder chemischen Probe. Das Verfahren ist besonders gut zur Vorbereitung von flüssigen Proben für die Massenspektroskopie, wie die Vorbereitung einer Probe für die Verwendung mit einer MALDI-Platte, geeignet. Wie im Folgenden beschrieben wird, kann das Verfahren entfernt von der Vorrichtung, mit der man die Probe analysieren möchte, oder in direktem Kontakt damit durchgeführt werden.
  • In den 1 und 2(a)-(f) ist eine Multinapfplatte 11 gezeigt, die einen oder mehrere dort definierte Schächte 12 aufweist, wie in der Technik bekannt ist. Wenigstens einer der Schächte 12 ist mit einer Oberfläche ausgebildet, die hydrophob und/oder mit biospezifischen Liganden modifiziert ist (wie Matrices für immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) für phosphorylierte Peptide/Proteine oder mit Polyhistidin fusionierte Peptide/Proteine, Biotinaffinitätsmatrices für biotinylierte Peptide/Proteine und Thiol-Disulfid-Austauschchromatographiematrices für mit Glutathion-S-Transferase (GST) fusionierte Peptide/Proteine). Man sollte sich darüber im Klaren sein, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch mit anderen Strukturen als einer Multinapfplatte praktiziert werden kann, einschließlich unter anderem einer Zielträgerplatte (wie sie im Folgenden beschrieben ist), einer Säule und einer Pipette. Mit jeder Struktur möchte man einen Schacht innerhalb der Vorrichtung bereitstellen, wobei eine Oberfläche, die mit der flüssigen Probe in Kontakt kommt, hydrophob und/oder mit biospezifischen Liganden modifiziert ist. Es braucht nicht die gesamte Schachtoberfläche hydrophob und/oder mit biospezifischen Liganden modifiziert zu sein. Die Schachtoberfläche kann inhärent hydrophob sein oder so behandelt sein, dass sie hydrophob ist (z.B. durch Beschichtung mit Alkylsilanen oder hydrophoben Polymeren).
  • Wie in den 2(a)-(f) gezeigt ist, beinhaltet die vorliegende Erfindung aufeinanderfolgende Schritte zum Reinigen einer flüssigen Probe. Die flüssige Probe kann eine bekannte flüssige Probe sein, die bei der Vorbereitung von Analyten für das MALDI-Verfahren oder andere massenspektrometrische Verfahren verwendet wird (wie flüssige Proben, die Trypsin-Verdauungsprodukte enthalten). Insbesondere ist man mit dem Verfahren bestrebt, Salze und andere Kontaminanten aus einer Probenlösung zu entfernen, während Peptide und Proteine auf dem höchstmöglichen Niveau darin gehalten werden. Wir beziehen uns nun auf 2(a); eine flüssige Probelösung 14 wird in einen oder mehrere Schächte 12 eingeführt. Die Lösung 14 enthält zwei Typen von gelösten Stoffen, die mit den Bezugszeichen 15 und 16 bezeichnet sind (die schwarzen ausgefüllten Kreise stehen für den ersten Typ von gelösten Stoffen 15, während die leeren Dreiecke für den zweiten Typ von gelösten Stoffen 16 stehen). Der erste Typ von gelösten Stoffen 15 kann durch hydrophobe Wechselwirkungen oder durch Wechselwirkungen mit den auf den Schachtoberflächen immobilisierten biospezifischen Liganden fest an die Oberflächen der Schächte 12 binden. Der erste Typ von gelösten Stoffen 15 kann Peptide und Proteine beinhalten. Es sollte angemerkt werden, dass Peptide und Proteine, wenn sie sich in wässrigen Lösungen in der Nähe einer hydrophoben Oberfläche befinden, auf der hydrophoben Oberfläche adsorbiert werden. Der zweite Typ von gelösten Stoffen 16 kann nicht fest an die Schachtoberflächen binden, und es kann sich dabei um Salze oder Kontaminanten in Form kleiner Moleküle handeln.
  • Sobald die Lösung abgesetzt ist, wird die Lösung 14 eingedampft oder eingetrocknet, wobei die auf den Schachtoberflächen abgeschiedenen gelösten Stoffe 15 und 16 zurückbleiben, wie in 2(b) gezeigt ist. Danach wird ein erster Puffer 17, der den ersten Typ von gelösten Stoffen 15 nicht von den Schachtoberflächen dissoziieren kann, aber den zweiten Typ von gelösten Stoffen 16 von den Schachtoberflächen dissoziieren kann, zu den Schächten 12 gegeben ( 2(c)). Der erste Puffer 17 besteht vorzugsweise in erster Linie aus Wasser. Wie in 2(c) gezeigt ist, löst sich der zweite Typ von gelösten Stoffen 16 im ersten Puffer 17, während der erste Typ von gelösten Stoffen 15 an die Schachtoberflächen gebunden bleibt. Wir beziehen uns nun auf 2(d); der erste Puffer 17, der den zweiten Typ von gelösten Stoffen 16 enthält, wird aus den Schächten 12 entfernt, wobei der erste Typ von gelösten Stoffen 15 an die Schachtoberflächen gebunden bleibt. Der erste Puffer 17 kann immer wieder hinzugefügt und wieder entfernt werden, um den zweiten Typ von gelösten Stoffen 16 maximal zu entfernen. Danach wird ein zweiter Puffer 18 in die Schächte 12 gegeben. Der zweite Puffer 18 kann den ersten Typ von gelösten Stoffen 15 von den Schachtoberflächen dissoziieren. Vorzugsweise enthält der zweite Puffer 18 ein organisches Lösungsmittel, wie Acetonitril oder Methanol, und besonders bevorzugt handelt es sich in erster Linie um Acetonitril. Außerdem kann der zweite Puffer 18 eine energieabsorbierende Matrix enthalten, wie α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure, 3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure oder 2,5-Dihydroxybenzoesäure. Mit dem zweiten Puffer 18 wird der erste Typ von gelösten Stoffen 15 im zweiten Puffer 18 gelöst, was eine gereinigte Lösung des ersten Typs von gelösten Stoffen 15 ergibt (2(e)). Wie in 2(f) gezeigt ist, kann gegebenenfalls eine höhere Konzentration des ersten Typs von gelösten Stoffen 15 erhalten werden, indem man den zweiten Puffer 18 eindampfen lässt.
  • Wie oben beschrieben, kann die vorliegende Anmeldung mit verschiedenen Vorrichtungen verwendet werden, die einen oder mehrere der Schächte 12 definieren. Die Schächte 12 können ganz durch eine einzige Komponente (z.B. eine Multinapfplatte) oder durch eine Kombination von zwei oder mehr Komponenten, wie eine an einer Zielvorrichtung befestigte Zielträgerplatte, definiert sein. Wir beziehen uns nun auf die 3(a)-(b); gezeigt ist eine Zielträgerplatte 21 mit einer oder mehreren Säulen 22, die sich zwischen einer oberen und einer unteren Fläche 30 und 31 und durch diese hindurch erstrecken. Die Zielträgerplatte 21 kann lösbar an einer Zielvorrichtung 23, wie einer MALDI-Platte oder anderen Massenspektrometrieplatte mit einer oder mehreren Sammelstellen (z.B. einer SELDI-Platte (SELDI = surface enhanced laser desorption/ionization) oder einer DIOS-Platte (DIOS = desorption/ionization on porous silicon)) befestigt werden. Die Säulen 22 und die Zielvorrichtung 23 definieren zusammen fluidhaltige Schächte. Vorzugsweise besteht die Zielträgerplatte 21 aus einem elastomeren Material, das lösbar an der Zielvorrichtung 23 befestigt werden kann. Vorzugsweise umfasst das elastomere Material ein Siliciumpolymer und besonders bevorzugt Polydimethylsiloxan (PDMS). Mit einem elastomeren Material sorgen die van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen den Oberflächenmolekülen der Zielträgerplatte 21 und der Zielvorrich tung 23 für eine lösbare Befestigung. Die Zielträgerplatte 21 kann zur Befestigung auf die Zielvorrichtung 23 gedrückt und durch Abziehen wieder davon entfernt werden. Weiterhin ist bevorzugt, dass der Grundkörper der Zielträgerplatte 21 ganz aus dem elastomeren Material und besonders bevorzugt ganz aus PDMS besteht. Die elastomere und die hydrophobe Natur von PDMS ermöglichen die Ausbildung einer festen Bindung zwischen der Zielträgerplatte 21 und der Zielvorrichtung 23. Wenn die Zielträgerplatte 21 nur zum Teil aus dem elastomeren Material besteht, können die übrigen Teile aus starrem Kunststoff oder einem anderen Material bestehen, das den Wänden der Säulen 22 günstige Eigenschaften verleiht. Die Befestigung ist vorzugsweise von ausreichender Integrität, um eine Kreuzkontaminierung zwischen den Säulen 22 entlang der Grenzfläche zwischen der Zielträgerplatte 21 und der Zielvorrichtung 23 zu verhindern. Gegebenenfalls können die Wände der Säulen 22 mit biospezifischen Liganden modifiziert sein.
  • Es können auch andere Formen der Zielträgerplatte 21 verwendet werden, die eine lösbare Befestigung an der Zielvorrichtung 23 ermöglichen. Die Zielträgerplatte 21 kann auf einen Klebstoff, eine elastomere Dichtung und/oder eine lösbare mechanische Befestigung zurückgreifen, um eine lösbare Befestigung zwischen der Zielträgerplatte 21 und der Zielvorrichtung 23 zu ermöglichen. In 4 und 5 ist eine mechanische Befestigung offenbart, wobei ein mechanisches Verschlusselement 38 vorhanden sein kann, das ausgehend von der unteren Fläche 37 hervorragen kann, so dass es wenigstens teilweise an die Zielvorrichtung 23 angrenzt. Das Verschlusselement 38 umfasst ein aufrechtstehendes Trägerelement 40 und ein Querelement 42. Das aufrechtstehende Trägerelement 40 und das Querelement 42 sind so ausgebildet, dass sich ein Teil der Zielvorrichtung 23 zwischen einer Angriffsfläche 44, die auf dem Querelement 42 definiert ist, und der unteren Fläche 37 befindet. Das Querelement 42 kann auch ein sich nach hinten erstreckendes hervorragendes Element 46 umfassen. Die Zielvorrichtung 23 kann in eine lösbare Befestigung eingerastet werden, wobei das Verschlusselement 38 ausweicht und in die in 4 und 5 gezeigte Position zurückkehrt. Die Entfernung der Zielvorrichtung kann durch Verschiebung des hervorragenden Elements 46 nach hinten erreicht werden, was dazu führt, dass eine Kraft auf das aufrechtstehende Trägerelement 40 ausgeübt wird, das Verschlusselement 38 ausweicht und die Angriffsfläche 44 sich von der Zielvorrichtung 23 löst. Wie man sich denken kann, wird die Größe der Haltekraft, die auf die Zielvorrichtung 23 ausgeübt wird, sowie die Schwierigkeit der Befestigung und Entfernung der Zielvorrichtung 23 eine Funktion der Festigkeit des Verschlusselements 38 und des Ausmaßes, in dem das Verschlusselement 38 an die Zielvorrichtung 23 angrenzt, sein.
  • Wie in 6 gezeigt ist, kann ein Kleber 48 verwendet werden, um die Zielvorrichtung 23 lösbar an der Zielträgerplatte 21 zu befestigen. Jeder geeignete Kleber kann verwendet werden, der eine Ablösung der Zielträgerplatte 21 ermöglicht und dennoch für eine ausreichende Haltekraft an der Zielträgerplatte 21 sorgt, um die Herstellung von Sammelstellen 34 zu ermöglichen.
  • Wie in 7 gezeigt ist, kann eine elastomere Dichtung 50 zwischen die Zielvorrichtung 23 und die Zielträgerplatte 21 gebracht werden, um für eine lösbare Befestigung dazwischen zu sorgen. In derselben Weise, wie es oben für den Grundkörper der Zielträgerplatte 21 beschrieben ist, der aus einem elastomeren Material besteht, sorgt die elastomere Dichtung 50 für eine lösbare Haftung. Diese Haftung kann durch van-der-Waals-Wechselwirkungen erreicht werden. Vorzugsweise umfasst das elastomere Material der Dichtung 50 ein Siliciumpolymer und besonders bevorzugt Polydimethylsiloxan (PDMS). Das elastomere Material kann auch mit anderen Polymeren dotiert sein, um seine physikalischen Eigenschaften einzustellen. Weiterhin ist bevorzugt, dass die elastomere Dichtung 50 ganz aus PDMS besteht. Öffnungen 52 sollen in der Dichtung 50 gebildet sein, wie es erforderlich ist, um die geplanten Sammelstellen 34 zu exponieren. Vorzugsweise haben die Öffnungen 52 jeweils einen Durchmesser, der größer oder gleich dem Durchmesser der offenen unteren Enden der Säulen 22 ist.
  • Wie der Fachmann verstehen wird, ist es unabhängig von der Art und Weise, wie die lösbare Befestigung erreicht wird, erwünscht, dass für eine ausreichende Abdichtung entlang der Grenzfläche zwischen der Zielträgerplatte 21 und der Zielvorrichtung 23 gesorgt ist, um eine Kreuzkontaminierung zwischen irgendwelchen flüssigen Proben, die in den Säulen 22 enthalten sind, zu verhindern. Die Abdichtung sollte wenigstens fluiddicht sein. Außerdem muss die Höhe der Festigkeit der lösbaren Befestigung im Hinblick auf alle Verarbeitungsschritte betrachtet werden, denen die Zusammenstellung unterzogen werden soll. Kleber und elastomere Abdichtung ergeben im Allgemeinen eine schwächere Haltekraft als eine mechanische Befestigung und können für flüssige Proben mit einem kleineren Volumen und/oder für leichtere Zielvorrichtungen verwendet werden, während eine mechanische Befestigung für größere flüssige Proben und/oder für schwerere Zielvorrichtungen verwendet werden kann. Dies gilt insbesondere, wenn die Zusammenstellung zentrifugiert oder in anderer Weise zusammen transportiert werden soll, wobei die lösbare Befestigung aufrechterhalten wird. Andererseits sollte die Zielvorrichtung 23 ohne Beschädigung ablösbar sein. Die verschiedenen Formen der lösbaren Befestigung können in verschiedenen Kombinationen verwendet werden (zum Beispiel kann ein Kleber in Kombination mit einer mechanischen Befestigung verwendet werden).
  • Vorzugsweise besteht die Zielträgerplatte 21 ganz aus PDMS. PDMS ist inhärent hydrophob, und daher werden auch die Wände der Säulen 22 inhärent hydrophob sein, wenn die Zielträgerplatte 21 ganz aus PDMS besteht.
  • In den 8(a)-(j) ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit der Verwendung der Kombination von Zielträgerplatte 21/Zielvorrichtung 23 gezeigt. Am Anfang, wie in den 8(a) und (b) gezeigt, ist die Zielträgerplatte 21 an der Zielvorrichtung 23 befestigt. Danach wird eine flüssige Probenlösung 24 (wie eine Lösung, die tryptische Verdauungsprodukte enthält) in die Säulen 22 gegeben (8(c)), die zwei Typen von gelösten Stoffen 25 und 26 umfasst: der erste Typ von gelösten Stoffen 25 (durch ausgefüllte Kreise dargestellt) kann durch hydrophobe Wechselwirkungen oder durch Wechselwirkungen mit den auf den Säulenoberflächen immobilisierten biospezifischen Liganden (z.B. Peptiden und Proteinen) fest an die Säulenoberflächen binden, während der zweite Typ von gelösten Stoffen 26 (durch leere Dreiecke dargestellt) nicht fest an die Säulenoberflächen binden kann, z.B. Salze oder Kontami nanten in Form kleiner Moleküle. Nach dem Trocknen oder Eindampfen der Probenlösung 24 (8(d)) werden die gelösten Stoffe 25 und 26 auf den Säulenoberflächen und möglicherweise in einem gewissen Ausmaß auch auf der Zielvorrichtung 23 abgeschieden. Wegen adsorptiver Anziehung wird der erste Typ von gelösten Stoffen 25 leichter auf den Wänden der Säulen 22 abgeschieden als auf der Oberfläche oder Sammelstelle 34 der Zielvorrichtung 23. Dann wird ein erster Puffer 27 hinzugefügt, der den ersten Typ von gelösten Stoffen 25 nicht von den Oberflächen der Säulen 22 dissoziieren kann, aber den zweiten Typ von gelösten Stoffen 26 von den Säulenoberflächen dissoziieren kann. Als Ergebnis wird der zweite Typ von gelösten Stoffen 26 im ersten Puffer 27 gelöst, während der erste Typ von gelösten Stoffen 25 an die Säulenoberflächen gebunden bleibt (8(e)). Der erste Puffer 24, der den gelösten zweiten Typ von gelösten Stoffen 26 enthält, wird aus den Säulen 22 entfernt, wobei der erste Typ von gelösten Stoffen 25 an die Säulenoberflächen gebunden zurückbleibt (8(f)). Die Schritte des Hinzufügens und Entfernens des ersten Puffers 27 können wiederholt durchgeführt werden, um den zweiten Typ von gelösten Stoffen 26 maximal zu entfernen. Anschließend wird ein zweiter Puffer 28, wie er in 8(g) gezeigt ist, zu den Säulen 22 gegeben; er kann den ersten Typ von gelösten Stoffen 25 von den Säulenoberflächen dissoziieren. Als Ergebnis wird der erste Typ von gelösten Stoffen 25 im zweiten Puffer 28 gelöst, wodurch man eine gereinigte Lösung des ersten Typs von gelösten Stoffen 25 erhält. Der zweite Puffer 28 kann eingedampft werden, um die Konzentration der resultierenden Flüssigkeit zu erhöhen (8(h)). Eine vollständige Verdampfung des zweiten Puffers 28 führt zur Abscheidung des ersten Typs von gelösten Stoffen 25 auf der Zielvorrichtung 23 innerhalb der Bereiche auf dem Boden der jeweiligen Säulen 22 (8(i)). Die Abscheidungsstellen fallen mit den Sammelstellen 34 auf der Zielvorrichtung 23 zusammen. Für Analysezwecke wird die Zielträgerplatte 21 von der Zielvorrichtung 23 entfernt, zum Beispiel durch Abziehen (8(j)). Der abgeschiedene erste Typ von gelösten Stoffen 25 bildet Probenflecke, die in der weiteren Analyse, wie Massenspektrometrie, z.B. MALDI-Massenspektrometrieanalyse, verwendet werden können.
  • Wie bei dem oben beschriebenen Verfahren besteht der erste Puffer vorzugsweise in erster Linie aus Wasser, und der zweite Puffer 28 enthält ein organisches Lösungsmittel, wie Acetonitril oder Methanol, und besonders bevorzugt in erster Linie Acetonitril. Außerdem kann der zweite Puffer 28 eine energieabsorbierende Matrix enthalten, wie α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure, 3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure oder 2,5-Dihydroxybenzoesäure.
  • Mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können reinere Proben erhalten werden als im Stand der Technik, was zu einer besseren Analyse führt. Die 9-12 zeigen einen Vergleich zwischen denselben Probenlösungen, die unter Verwendung von Pipettenspitzen mit C18-Medium verarbeitet wurden, und solchen, die mit dem oben in Verbindung mit 8 beschriebenen Verfahren verarbeitet wurden. Die 9(a), 10(a), 11(a) und 12(a) sind Massenspektren, die von Probenlösungen erhalten wurden, die durch Pipettenspitzen mit C18-Medium vorbereitet wurden, während die 9(b), 10(b), 11(b) und 12(b) unter Verwendung des mit 8 der vorliegenden Anmeldung verbundenen Verfahrens vorbereitet wurden. Die Massenspektren von 9 wurden für eine Probenlösung (50 μl) erhalten, die 100 nM Peptidstandards enthielt; die Massenspektren von 10 wurden für eine Probenlösung (50 μl) erhalten, die 50 nM Peptidstandards enthielt; die Massenspektren von 11 wurden für eine Probenlösung (50 μl) erhalten, die 20 nM Peptidstandards enthielt; und die Massenspektren von 12 wurden für eine Probenlösung (50 μl) erhalten, die 10 nM Peptidstandards enthielt. Die Pfeile unter der x-Achse in den Massenspektren zeigen jeweils die erwarteten Peakpositionen der sechs Standardpeptide an (Human-Bradykinin-Fragment 1-7, MW = 757,4; Human-Angiotensin II, MW = 1046,5; synthetisches Peptid P14R, MW = 1533,9; Human-ACTH-Fragment 18-39, MW = 2465,2; Rinderinsulin, oxidierte B-Kette, MW = 3494,7; Rinderinsulin, MW = 5734,5), während ein "X" darauf hinweist, dass sich in dem Spektrum ein passender Peak befindet. Es muss darauf hingewiesen werden, dass einige der Peaks im niedermolekularen Bereich von der MALDI-Matrix α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) beigetragen werden. Wie man feststellen wird, wurden durch die vorliegende Erfindung mehr passende Peaks nachgewiesen als mit den herkömmlichen Spitzen mit C18-Medium.
  • Die 13-15 zeigen einen ähnlichen Vergleich, wobei 13(a), 14(a) und 15(a) unter Verwendung von Pipettenspitzen mit C18-Medium erhalten wurden, während die 13(b), 14(b) und 15(b) unter Verwendung der vorliegenden Erfindung erhalten wurden. Die Massenspektren in 13 wurden für eine Probenlösung (50 μl) erhalten, die 50 nM Trypsin-Verdauungsprodukt von Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, die Massenspektren in 14 wurden für eine Probenlösung (50 μl) erhalten, die 20 nM BSA-Trypsin-Verdauungsprodukt enthielt, und die Massenspektren in 15 wurden für eine Probenlösung (50 μl) erhalten, die 10 nM BSA-Trypsin-Verdauungsprodukt enthielt. Wie man aus den 13-15 erkennt, wurden durch die vorliegende Erfindung mehr Peptidpeaks aus dem BSA-Trypsin-Verdauungsprodukt aufgelöst als mit herkömmlichen Spitzen mit C18-Medium, was eine bessere Ausbeute an Peptiden aus dem Reinigungsverfahren anzeigt.
  • In der vorliegenden Erfindung können verschiedene Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden. Solche Änderungen und Modifikationen sollen in den Umfang der Erfindung fallen, wie er in den folgenden Ansprüchen dargelegt ist.

Claims (17)

  1. Verfahren zum Reinigen einer biologischen oder chemischen Probe, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Bereitstellen eines Artikels, der einen Schacht mit einer Oberfläche aufweist, die wenigstens teilweise hydrophob und/oder mit biospezifischen Liganden modifiziert ist; Bringen einer flüssigen Probe in den Schacht; Eindampfen der flüssigen Probe, wobei eine erste Klasse von gelösten Stoffen in der Probe fest an die Oberfläche bindet und eine zweite Klasse von gelösten Stoffen in der Probe nicht fest an die Oberfläche bindet; Bringen eines ersten Puffers in den Schacht, wobei der erste Puffer die zweite Klasse von gelösten Stoffen von der Oberfläche dissoziiert; Entfernen des ersten Puffers und der dissoziierten zweiten Klasse von gelösten Stoffen aus dem Schacht; und Bringen eines zweiten Puffers in den Schacht, nachdem der erste Puffer entfernt wurde, wobei der zweite Puffer die erste Klasse von gelösten Stoffen von der Oberfläche dissoziiert.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Artikel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Multinapfplatte, einer Säule und einer Pipette besteht.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Artikel eine Zielträgerplatte umfasst, die voneinander beabstandete obere und untere Flächen, wenigstens eine Säule, die sich zwischen und durch die obere und die untere Fläche erstreckt, und eine lösbar an der Zielträgerplatte befestigte Zielvorrichtung aufweist, wobei die Zielvorrichtung wenigstens eine Sammelstelle aufweist, wobei sich die Säule passgenau mit der Sammelstelle deckt, wobei die Säule und die Sammelstelle gemeinsam den Schacht definieren.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Zielvorrichtung lösbar an der Zielträgerplatte befestigt ist.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei wenigstens die untere Fläche der Zielträgerplatte wenigstens teilweise, vorzugsweise vollständig, aus einem elastomeren Material gebildet ist, das lösbar an der Zielvorrichtung haftet.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Artikel wenigstens teilweise, vorzugsweise vollständig, aus einem elastomeren Material gebildet ist.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Zielträgerplatte wenigstens teilweise, vorzugsweise vollständig, aus dem elastomeren Material gebildet ist.
  8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5, 6 und 7, wobei das elastomere Material ein Siliciumpolymer, vorzugsweise Polydimethylsiloxan, umfasst.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Zielvorrichtung eine Massenspektrometrieplatte ist.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die flüssige Probe Trypsin-Verdauungsprodukte umfasst.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die erste Klasse von gelösten Stoffen Peptide oder Proteine umfasst.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die zweite Klasse von gelösten Stoffen Salze oder Kontaminanten in Form kleiner Moleküle umfasst.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der erste Puffer Wasser umfasst.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der zweite Puffer ein organisches Lösungsmittel oder eine energieabsorbierende Matrix umfasst.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Oberfläche eine Beschichtung ist, die eine oder mehrere Verbindungen enthält, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Alkylsilanen und hydrophoben Polymeren besteht.
  16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der Artikel, der einen Schacht mit einer Oberfläche aufweist, wenigstens teilweise mit biospezifischen Liganden modifiziert ist.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei es sich bei den biospezifischen Liganden um eine oder mehrere Verbindungen handeln kann, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus immobilisierten Metallionen-Affinitätschromatographie(IMAC)-Matrices für phosphorylierte Peptide/Proteine oder mit Polyhistidin fusionierte Peptide/Proteine, Biotinaffinitätsmatrices für biotinylierte Peptide/Proteine und Thiol-Disulfid-Austauschchromatographiematrices für mit Glutathion-S-Transferase (GST) fusionierte Peptide/Proteine besteht.
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