DE602004002275T2

DE602004002275T2 - Verfahren zur herstellung rekombinanterpolyklonaler proteine

Info

Publication number: DE602004002275T2
Application number: DE602004002275T
Authority: DE
Inventors: S. John HAURUM; C. Finn WIBERG; W. Vincent COLJEE; Jacqueline Chestnut Hill SHARON; Chiou-Ying Yang
Original assignee: Symphogen AS
Current assignee: Symphogen AS
Priority date: 2003-01-07
Filing date: 2004-01-07
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2024-01-08
Also published as: DE602004002275D1; JP2010268806A; ATE338816T1; SI1583830T1; CA2512647C; EP1583830B1; HK1078896A1; JP2006515520A; CA2512647A1; AU2004203727B2; ES2273202T3; AU2004203727C1; EA200501101A1; JP4589914B2; US20090136498A1; BRPI0406678A; MXPA05006724A; IL169101A; KR101024443B1; EP1762617A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bildet die Basis einer Technologieplattform zum Herstellen rekombinanter polyklonaler Proteine, wie Proteine aus der Immunglobulin-Superfamilie, zum Beispiel lösliche oder membrangebundene Formen von B- oder T-Zellrezeptoren, die als eine neue Klasse von therapeutischen Mitteln bei der Behandlung, Linderung oder Vorbeugung verschiedener Infektionen, entzündlicher Erkrankungen, Transplantatabstoßung, Krebs und Allergien verwendet werden soll.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Für eine Anzahl infektiöser Erkrankungen und Krebsarten fehlen wirksame Therapien. Monoklonale Antikörper waren nicht allgemein erfolgreich gegen diese Ziele, teilweise aufgrund der Variabilität der komplexen Ziele und adaptiver Mutationen von Zielproteinen, die ein Umgehen der monoklonalen Antikörpererkennung bei der Immunabwehr (immune escape) verursachen. Polyklonale Antikörper sind andererseits befähigt, eine Vielzahl von dynamischen Zielen, z.B. von Viren oder Krebszellen, zu erfassen (target). Auch besteht bei polyklonalen Antikörpern die höchste Wahrscheinlichkeit für das Aufrechterhalten der Aktivität bei dem Ereignis der antigenen Mutation.
Verschiedene kommerziell erhältliche therapeutische Mittel auf Basis polyklonaler Antikörper sind vorhanden, einschließlich: 1) normales Human-Immunglobulin, isoliert aus dem Blut normaler menschlicher Spender; 2) Human-Hyperimmun-Immunglobulin, das aus dem Blut von einzelnen menschlichen Spendern stammt, die Antikörper gegen ein spezielles Krankheitsziel (disease target) tragen, z.B. ein Virus, dem sie zuvor entweder durch Infektion oder durch Impfung begegnet sind; und 3) Tier-Hyperimmun-Immunglobulin, isoliert aus dem Blut immunisierter Tiere.
Immunglobulin, das aus Humanblut aufgereinigt wurde, zeigte sich wirksam gegen Infektionen mit Hepatitis B-Virus, Respiratory-Syncytical-Virus, Cytomegalovirus und Herpesviren, Tollwutvirus, gegen Botulinustoxin, sowie in der Neugeborenen-Rhesus D-Prophylaxe. Immunglobulin, das aus dem Blut von Kaninchen aufgereinigt wurde, die mit Human-T-Zellen immunisiert wurden, wird verwendet, um eine T-Zell-Immunosuppression bei der Behandlung oder Vorbeugung einer Transplantatabstoßung (z.B. Thymoglobulin) zu ermöglichen. Normales Human-Immunglobulin wurde verwendet, um das Immunsystem immungeschwächter Patienten zu stärken, sowie in der Therapie verschiedener Autoimmunstörungen.
Gleichwohl wurde eine weit verbreitete Immunglobulinverwendung aufgrund der eingeschränkten Versorgung mit Donorblut-Rohmaterial, Problemen mit Charge-zu-Charge-Änderungen und veränderlicher Sicherheit beschränkt. Insbesondere vom Tier stammende Immunglobuline sehen sich mit den gleichen Problemen der Immunogenität konfrontiert, die in den 1980ern und 1990ern bei vom Tier stammenden monoklonalen Antikörpern beobachtet wurden. Schließlich bleibt wie bei anderen Blutprodukten das Risiko der Übertragung von Infektionserregern bzw. infektiösen Substanzen, wie HIV, Herpes- oder Hepatitisviren oder Prionen. Demgemäß ist, während Kliniker erkennen, dass polyklonale Antikörper in einigen Situationen ein bevorzugtes therapeutisches Mittel sind, ihre Verwendung sehr beschränkt.
Neue Ansätze, Human-Immunglobuline zu erzeugen, kamen mit den Techniken für transgene Tiere auf. Transgene Mäuse, die Human-Immunglobulin-Loci tragen, wurden erzeugt (US-Patent Nr. 6,111,166). Diese Mäuse produzieren vollständig Human-Immunglobuline, und Antikörper gegen ein spezielles Ziel können durch übliche Immunisierungstechniken erzeugt werden. Jedoch sind größere Antikörperausbeuten aufgrund der relativ kleinen Größe der Mäuse eingeschränkt. Größere Tiere wurden auch mit Human-Immunglobulin-Genen transgen gemacht, z.B. Kühe, Schafe, Kaninchen und Hühner (Kuroiwa, Y. et al., Nature Biotechnology; 2002; 20: 889-893). Jedoch ist die Herstellung polyklonaler Antikörper für eine Therapie aus dem Blut solcher Tiere nicht ohne Komplikationen. Erstens können die Immunphysiologien des Tiers und der Menschen beachtliche Unterschiede aufweisen, die einen Unterschied in dem resultierenden Immunrepertoire, der funktionellen Neuordnung bzw. dem funktionellen Rearrangement (functional rearrangement) und der Diversität der Antikörperreaktion verursachen. Zweitens könnte die mitotische Instabilität der eingeführten Immunglobulin-Loci die Langzeitproduktion von Antikörpern beeinflussen. Drittens ist es eine technische Herausforderung, die Tier-eigenen Immunglobulin-Loci zu deletieren, sodass z.B. die Tier-Antikörperproduktion nicht die Produktion von Human-Antikörpern überschreiten wird. Viertens begleitet das Risiko der Übertragung von Infektionserregern bzw. infektiösen Substanzen, wie Viren, Prionen oder anderen Pathogenen, die Verabreichung von Human-Antikörpern, die in Tieren produziert wurden.
Demgemäß besteht ein Bedarf für Herstellungstechnologien zum Produzieren rekombinanter polyklonaler Proteine, wie Antikörpern, in ausreichend großen Mengen und mit minimalen Charge-zu-Charge-Änderungen für sichere klinische Verwendungen. Effiziente Verfahren zum Herstellen homogener rekombinanter Proteine unter Verwendung eukaryotischer (insbe sondere Säuger-) Expressionszelllinien wurden für die Herstellung einer Vielzahl von Proteinen, einschließlich monoklonaler Antikörper, Interleukine, Interferone, Tumornekrosefaktor, der Gerinnungsfaktoren VII, VIII und IX, entwickelt. Viele dieser Techniken basieren auf Transfektion und dem zufälligen Einbau des Gens von Interesse in das Genom der Expressionszelllinie, gefolgt von Auswählen bzw. Selektion, Vervielfältigung und Charakterisierung eines Expressionsklons mit hoher Produktion (high-producer expression clone) und Vermehrung dieses Klons als eine Master-Expressionszelllinie.
Die Expression eines insertierten fremden Gens kann durch "Positionseffekte" der umgebenden genomischen DNA beeinflusst werden. In vielen Fällen wird das Gen an Stellen insertiert, an denen die Positionseffekte stark genug sind, um die Synthese des Produkts des eingeführten Gens zu inhibieren. Weiterhin ist die Expression aufgrund von Silencing-Mechanismen (d.h. Methylierung), aufgezwungen durch die umgebende chromosomale Wirts-DNA, oft instabil.
Systeme, die die Integration und die Expression eines Gens von Interesse in Säugerzellen an einer spezifischen Stelle im Genom ermöglichen, wurden für die Expression einer Zusammensetzung aus homogenen rekombinanten Proteinen (US-Patente mit den Nummern 4,959,317 und 5,654,182; WO 98/41645, WO 01/07572) entwickelt. WO 98/41645 beschreibt den ortsspezifischen Einbau für die Produktion einer Säugerzelllinie, die z.B. Antikörper sezerniert. Jedoch ist diese Expression monoklonal, und es gibt keinen Hinweis darauf, das Transfektionen mit einer Vektorbibliothek durchgeführt werden könnten. Noch gibt es irgendwelche Vorschläge, wie die ursprüngliche Diversität, die durch spezifische V_H-V_L-Kombinationen in einer Bibliothek erzeugt wurden, aufrechtzuerhalten ist.
OFFENBARUNG DES BEITRAGS
Die vorliegende Erfindung stellt Lösungen zum Erzeugen einer Herstellungszelllinie für die Expression und Produktion eines rekombinanten polyklonalen Proteins bereit, wobei ein signifikantes Überwiegen (bias) zwischen den einzelnen Mitgliedern, die das polyklonale Protein darstellen, vermieden wird.
Weiterhin setzt die vorliegende Erfindung keine Tiere in der Herstellung des polyklonalen Proteins ein, wodurch die ethischen und klinischen Schwierigkeiten, die mit solchen Ansätzen verbunden sind, vermieden werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Produzieren einer rekombinanten polyklonalen Herstellungszelllinie zur Herstellung eines rekombinanten polyklonalen Proteins, oft ausgewählt aus der Immunglobulin-Superfamilie, bereit. Besonders die Produktion polyklonaler Antikörper, polyklonaler T-Zellrezeptoren oder polyklonaler Fragmente davon ist von Interesse. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die gewerbliche bzw. großtechnische Herstellung eines rekombinanten polyklonalen Proteins für die Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen. Eine wichtige Eigenschaft der Erfindung ist, dass während der Herstellungsverfahren eine überwiegende (biased) Expression der einzelnen Moleküle, die das polyklonale Protein darstellen, auf einem nicht signifikanten Level gehalten wird, wobei eine ungewünschte Charge-zu-Charge-Änderung minimiert wird.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten polyklonalen Proteins von Interesse, wobei das polyklonale Protein bestimmte Mitglieder umfasst (oder daraus besteht), die ein spezielles Antigen binden, wobei das Verfahren umfasst: a) Bereitstellen einer Sammlung von Zellen, umfassend eine Bibliothek von varianten Nukleinsäuresequenzen, wobei jede der Nukleinsäuresequenzen ein bestimmtes Mitglied des polyklonalen Proteins codiert und wobei jede der Nukleinsäuresequenzen an der gleichen einzelnen Stelle des Genoms jeder einzelnen bzw. individuellen Zelle in der Sammlung von Zellen integriert wird, b) Kultivieren der Sammlung von Zellen unter Bedingungen, die die Expression des polyklonalen Proteins ermöglichen bzw. erleichtern und c) Gewinnen des exprimierten polyklonalen Proteins aus der Zellkultur, Zellfraktion oder dem Zellkulturmedium.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen einer Sammlung von Zellen, geeignet als eine rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie, wobei das Verfahren umfasst: a) Bereitstellen einer Vektorbibliothek, umfassend eine Population von varianten Nucleinsäuresequenzen, wobei jeder der Vektoren 1) eine Einzelkopie einer bestimmten Nucleinsäuresequenz, die für ein bestimmtes Mitglied eines polyklonalen Proteins codiert, das bestimmte Mitglieder umfasst (oder daraus besteht), die ein spezielles Antigen binden, und 2) eine oder mehrere Rekombinase-Erkennungssequenzen umfasst, b) Einführen der Vektorbibliothek in eine Wirtszelllinie, wobei das Genom jeder einzelnen Zelle der Wirtszelllinie Rekombinase-Erkennungssequenzen, die zu denjenigen des Vektors passen, an einer einzelnen spezifischen Stelle in ihrem Genom umfasst, c) Sicherstellen des Vorhandenseins von einer oder mehreren Rekombinasen in den Zellen, so dass die varianten Nucleinsäuresequenzen aus Schritt (a) ortsspezifisch in die Zellen der Wirtszelllinie integriert werden, wobei die eine oder mehreren Rekombinasen entweder i) durch die Zellen, in die die Nucleinsäuresequenz eingeführt ist, exprimiert wird/werden, ii) wirksam durch die Vektoren aus Schritt a codiert wird/werden, iii) durch Expression von einem zweiten Vektor bereitgestellt wird/werden oder iv) der Zelle als Protein bereitgestellt wird/werden, und d) Auswählen bzw. Selektieren von Zellen, die eine integrierte Kopie aus der Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen umfassen.
Bei beiden Verfahren der Erfindung wird verstanden werden, dass das polyklonale Protein normalerweise eines ist, das nicht natürlich mit den Zellen assoziiert ist, in denen die Expression bewirkt wird.
Die vorliegende Erfindung beschreibt einige Verfahren, durch die eine Bibliothek von varianten Nucleinsäuresequenzen in eine Wirtszelllinie eingeführt werden kann, um eine Sammlung von Zellen, geeignet als polyklonale Herstellungszelllinie, zu erzeugen. Diese Verfahren schließen Massentransfektion (bulk transfection) einer Sammlung von Zellen mit der Bibliothek, Semi-Massentransfektion (semi-bulk transfection) von Aliquots der Zellen mit Fraktionen der Bibliothek oder einzelne bzw. individuelle Transfektion ein, wobei Wirtszellen mit einzelnen Mitgliedern der Bibliothek transfiziert werden, gefolgt vom Poolen der Klone, die bei Auswählen bzw. bei Selektion erzeugt wurden. Vorzugsweise setzt die vorliegende Erfindung Säugerzellen (Zelllinien oder Zelltypen) als Wirtszelllinie ein.
In einem Aspekt der Erfindung werden die einzelnen Mitglieder eines polyklonalen Proteins von Paaren unabhängiger Genabschnitte codiert. Polyklonale Proteine, bei denen einzelne Mitglieder aus zwei Polypeptidketten bestehen, schließen lösliche oder membrangebundene Formen von Antikörpern und T-Zellrezeptoren ein. In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung codiert ein Paar von Genabschnitten für einen variablen Bereich einer schweren Kette und einer leichten Kette eines Antikörpers oder für einen variablen Bereich einer Alphakette und einer Betakette eines T-Zellrezeptors oder für einen variablen Bereich einer Gammakette und einer Deltakette eines T-Zellrezeptors.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie bereit, die eine Sammlung von Zellen umfasst, transfiziert mit einer Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen, wobei jede Zelle in der Sammlung mit einem Mitglied der Bibliothek transfiziert ist und in der Lage ist, dieses zu exprimieren, welches für ein bestimmtes Mitglied eines polyklonalen Proteins codiert, das ein spezielles Antigen bindet, und welches an der gleichen, einzelnen Stelle in dem Genom der einzelnen Zellen in der Sammlung lokalisiert ist, wobei die Nucleinsäuresequenz nicht natürlich mit der Zelle in der Sammlung assoziiert ist. Die Zelllinie stammt vorzugsweise von einer Säugerzelllinie, wie Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (Chinese hamster ovary cells) (CHO-Zellen), COS-Zellen, BHK-Zellen, Myelomzellen (z.B. Sp2/0-Zellen, NS0), YB2/0, NIH 3T3, Fibroblasten oder immortalisierte Hu manzellen, wie HeLa-Zellen, HEK 293-Zellen oder PER.C6. Jedoch können auch eukaryotische Nicht-Säugerzellen oder prokaryotische Zellen, wie Pflanzenzellen, Insektenzellen, Hefezellen, Bakterien, Pilze etc. verwendet werden.
Ebenfalls durch die vorliegende Erfindung umfasst ist eine Bibliothek von Vektoren für ortsspezifische Integration, umfassend eine Population von natürlich auftretenden varianten Nucleinsäuresequenzen, wobei jeder der Vektoren 1) eine Kopie einer bestimmten Nucleinsäuresequenz, die für ein bestimmtes Mitglied eines polyklonalen Proteins codiert, das ein spezielles Antigen bindet, und 2) eine oder mehrere Rekombinase-Erkennungssequenzen umfasst.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend, als einen aktiven Inhaltsstoff, einen rekombinanten polyklonalen Antikörper (oder ein Fragment davon) oder einen polyklonalen T-Zellrezeptor (oder ein Fragment davon), die vorzugsweise durch die Verfahren der Erfindung erhalten wurden. Das rekombinante polyklonale Protein der Zusammensetzung ist spezifisch für oder reaktiv gegen ein vorbestimmtes Krankheitsziel. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können für die Behandlung, Linderung oder Vorbeugung von Krankheiten, wie Krebs, Infektionen, entzündliche Erkrankungen, Allergien, Asthma und andere Atemwegserkrankungen, Autoimmunkrankheiten, immunologische Fehlfunktionen, cardiovaskuläre Erkrankungen, Krankheiten im zentralen Nervensystem, Stoffwechsel- und endokrine Krankheiten, Transplantatabstoßung oder ungewollte Schwangerschaft, in einem Säuger, wie einem Menschen, einem Haustier oder einem Streichel- bzw. Haustier, verwendet werden.
Definitionen
Mit "Protein" oder "Polypeptid" ist eine beliebige Kette von Aminosäuren gemeint, ungeachtet der Länge oder einer posttranslationalen Modifikation. Proteine können als Monomere oder Multimere vorhanden sein, die zwei oder mehr zusammengesetzte Polypeptidketten, Fragmente von Proteinen, Polypeptide, Oligopeptide oder Peptide umfassen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "polyklonales Protein" oder "Polyklonalität" auf eine Proteinzusammensetzung, die verschiedene, aber homologe Proteinmoleküle umfasst, vorzugsweise ausgewählt aus der Immunglobulin-Superfamilie. Somit ist jedes Proteinmolekül homolog zu den anderen Molekülen der Zusammensetzung, enthält aber auch einen oder mehrere Abschnitte von variabler Polypeptidsequenz, der/die durch die Unterschiede in der Aminosäuresequenz zwischen den einzelnen Mitgliedern des polyklonalen Proteins gekennzeichnet ist/sind. Bekannte Beispiele solcher polyklonaler Proteine schließen Antikörper oder Immunglobulinmoleküle, T-Zellrezeptoren und B-Zellrezeptoren ein. Ein polyklonales Protein kann aus einer definierten Untergruppe (subset) von Proteinmolekülen bestehen, die durch ein gemeinsames Merkmal, wie die geteilte Bindungsaktivität gegenüber einem gewünschten Ziel, z.B. im Fall eines polyklonalen Antikörpers gegen das gewünschte Zielartigen, definiert ist.
Der Begriff "polyklonales Protein von Interesse" deckt eine definierte polyklonales-Protein-Untergruppe ab, die ein gemeinsames Merkmal, wie die Bindungsaktivität oder -spezifität gegen das Zielartigen teilen, wobei das Antigen eines oder mehrere von z.B. separaten Proteinen, Mikroorganismen, Parasiten, Zelltypen, Allergenen oder Kohlenhydratmolekülen oder allen anderen Strukturen, Molekülen oder Substanzen, die das Ziel der spezifischen Antikörperbindung sein können, oder Gemischen der Antigene sein kann.
Die Begriffe "ein Mitglied einer rekombinanten polyklonalen Proteinzusammensetzung" oder "ein Mitglied eines rekombinanten polyklonalen Proteins" bezeichnen ein Proteinmolekül einer Proteinzusammensetzung, die verschiedene, aber homologe Proteinmoleküle umfasst, wobei jedes Proteinmolekül homolog zu den anderen Molekülen der Zusammensetzung ist, aber auch einen oder mehrere Abschnitte von variabler Polypeptidsequenz enthält, der/die durch die Unterschiede in der Aminosäuresequenz zwischen den einzelnen Mitgliedern des polyklonalen Proteins gekennzeichnet ist/sind.
Die Begriffe "variable Polypeptidsequenz" und "variabler Bereich" werden austauschbar verwendet.
Der Begriff "ein bestimmtes Mitglied eines rekombinanten polyklonalen Proteins" bezeichnet ein Proteinmolekül einer Proteinzusammensetzung, die verschiedene, aber homologe Proteinmoleküle umfasst, wobei jedes Proteinmolekül homolog zu den anderen Molekülen der Zusammensetzung ist, aber auch einen oder mehrere Abschnitte von variabler Polypeptidsequenz enthält, der/die durch die Unterschiede in der Aminosäuresequenz zwischen den einzelnen Mitgliedern des polyklonalen Proteins gekennzeichnet ist/sind.
Der Begriff "Antikörper" beschreibt eine funktionelle Serumskomponente und wird oft entweder als Sammlung von Molekülen (Antikörper oder Immunglobulin) oder als ein Molekül (das Antikörpermolekül oder Immunglobulinmolekül) bezeichnet. Ein Antikörpermolekül ist in der Lage, an eine spezifische artigere Determinante (das Antigen oder das artigere Epitop) zu binden oder mit ihr zu reagieren, was wiederum zur Induktion von immunologischen Effektormechanismen führen kann. Ein einzelnes bzw. individuelles Antikörpermolekül wird gewöhnlich als monospezifisch betrachtet, und eine Zusammensetzung aus Antikörpermolekülen kann monoklonal (d.h. bestehend aus identischen Antikörpermolekülen) oder polyklonal (d.h. beste hend aus verschiedenen Antikörpermolekülen, die mit gleichen oder verschiedenen Epitopen auf dem gleichen Antigen oder sogar auf bestimmten verschiedenen Antigenen reagieren) sein. Jedes Antikörpermolekül hat eine einzigartige Struktur, die es befähigt, spezifisch an sein zugehöriges Antigen zu binden, und alle natürlichen Antikörpermoleküle haben die gleiche Gesamtbasisstruktur von zwei identischen leichten Ketten und zwei identischen schweren Ketten. Antikörper sind in ihrer Gesamtheit auch als Immunglobuline bekannt. Die Begriffe Antikörper (antibody) oder Antikörper (antibodies), wie hierin verwendet, sollen chimäre und Einzelkettenantikörper, sowie Bindungsfragmente von Antikörpern, wie Fab, Fv-Fragmente oder scFv-Fragmente, sowie multimere Formen, wie dimere IgA-Moleküle oder pentavalentes IgM, einschließen.
Der Begriff "polyklonaler Antikörper" beschreibt eine Zusammensetzung verschiedener Antikörpermoleküle, die in der Lage ist, an mehrere verschiedene spezifische antigene Determinanten auf dem gleichen oder auf verschiedenen Antigenen zu binden oder mit ihnen zu reagieren. Üblicherweise wird angenommen, dass die Variabilität eines polyklonalen Antikörpers in den so genannten variablen Regionen des polyklonalen Antikörpers lokalisiert ist. Jedoch kann im Kontext der vorliegenden Erfindung Polyklonalität auch so verstanden werden, dass sie die Unterschiede zwischen den einzelnen Antikörpermolekülen beschreibt, die sich in so genannten konstanten Regionen befinden, z.B. wie im Fall der Gemische aus Antikörpern, die zwei oder mehr Antikörperisotypen, wie die Human-Isotypen IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 und IgA2 oder die Maus-Isotypen IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 und IgA enthalten.
Ein "rekombinanter polyklonaler Antikörper von Interesse" beschreibt eine definierte rekombinante polyklonale Antikörperuntergruppe, die durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, an ein gewünschtes Ziel oder einen gewünschten Satz von Zielen zu binden, wobei die Ziele z.B. ein separates Protein, ein Mikroorganismus, ein Parasit, eine Zelle, ein Allergen oder ein Kohlenhydratmolekül oder eine andere Struktur, ein anderes Molekül oder eine andere Substanz sind, die das Ziel der spezifischen Antikörperbindung sein können, oder Gemische davon sind.
Der Begriff "Immunglobulin" wird als Sammelbezeichnung des Gemisches von Antikörpern, die in Blut oder Serum gefunden werden, verwendet, kann aber auch verwendet werden, um ein Gemisch von Antikörpern, die aus anderen Quellen stammen, zu bezeichnen.
Der Begriff "Immunglobulinmolekül" bezeichnet ein einzelnes Antikörpermolekül, z.B. als ein Teil eines Immunglobulins oder Teil jeder polyklonalen oder monoklonalen Antikörperzusammensetzung.
Wenn angegeben wird, dass ein Mitglied eines polyklonalen Proteins an ein Antigen bindet, ist hierin eine Bindung mit einer Bindungskonstante, die unter 1 mM, vorzugsweise unter 100 nM, sogar noch stärker bevorzugt unter 10 nM, ist, gemeint.
Der Begriff "eine Bibliothek aus varianten Nucleinsäuremolekülen von Interesse" wird verwendet, um die Sammlung von Nucleinsäuremolekülen zu beschreiben, die in ihrer Gesamtheit für ein "rekombinantes polyklonales Protein von Interesse" codieren. Wenn sie zur Transfektion verwendet wird, ist die Bibliothek aus varianten Nucleinsäuremolekülen von Interesse in einer Bibliothek von Expressionsvektoren enthalten. Eine solche Bibliothek hat typischerweise mindestens 3, 5, 10, 20, 50, 1000, 10⁴, 10⁵ oder 10⁶ bestimmte bzw. verschiedene Mitglieder.
Wie hierin verwendet, sollen die Begriffe "eine Kopie einer bestimmten Nucleinsäuresequenz von Interesse" nicht wörtlich als ein einzelner Abschnitt von Nucleinsäuren genommen werden, die zu einem einzelnen Genabschnitt gehören, sondern vielmehr als eine Kopie aller Genabschnitte, die erforderlich sind, um alle Untereinheiten eines Moleküls des Proteins von Interesse herzustellen, und die in einem Nucleinsäuremolekül, wie z.B. ein Vektor, zusammengesetzt sind. Einige Beispiele, in denen üblicherweise mehr als ein Genabschnitt erforderlich ist, um zu einem vollständigen Moleküls eines Proteins von Interesse zu führen, schließen B-Zellrezeptoren, Antikörper und Fragmente von Antikörpern, wie Fab's und variable Domänen, oder T-Zellrezeptoren ein. Wenn sie in die Zelle eingeführt werden, befinden sich die Genabschnitte, die zusammen für das vollständig zusammengesetzte Protein von Interesse codieren, in demselben Vektor, wobei sie somit miteinander in einer Nucleinsäuresequenz verbunden sind, möglicherweise als separate Transkriptionselemente unter der Kontrolle verschiedener Promotoren.
Der Begriff "ein Gen von Interesse", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die aus einem oder mehreren Genabschnitten (genomische oder cDNA) aufgebaut ist, die für ein Mitglied eines Proteins von Interesse codieren. Die Pluralform "Gene von Interesse" bezieht sich auf eine Bibliothek von Nucleinsäuresequenzen, die für ein polyklonales Protein von Interesse codieren. Der Begriff "GOI" wird als eine Abkürzung für (ein) Gen(e) von Interesse (gene(s) of interest) verwendet.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Vektor" auf ein Nucleinsäuremolekül, in das eine Nucleinsäuresequenz für den Transport zwischen verschiedenen genetischen Umgebungen und/oder zur Expression in einer Wirtszelle insertiert werden kann. Ein Vektor, der in der Lage ist, sich an einem zuvor bestimmten, spezifischen Locus in dem Genom in das Genom einer Wirtszelle zu integrieren, wird hierin "ein Vektor für ortsspezifische Integration" genannt. Wenn der Vektor regulatorische Elemente für die Transkription der Nucleinsäuresequenz, die in den Vektor insertiert ist (zumindest ein geeigneter Promotor), trägt, wird der Vektor hierin "ein Expressionsvektor" genannt. Wenn der Expressionsvektor in der Lage ist, sich an einem zuvor bestimmten, spezifischen Locus in das Genom der Wirtszelle zu integrieren, kann der Expressionsvektor "ein Expressionsvektor für ortsspezifische Integration" genannt werden. Wenn die Nucleinsäure, die in die oben aufgezeigten Vektoren insertiert ist, für ein Protein von Interesse, wie hierin definiert, codiert, werden die folgenden Begriffe verwendet: "Vektor von Interesse", "Vektor von Interesse für ortsspezifische Integration", "Expressionsvektor von Interesse" und "Expressionsvektor von Interesse für ortsspezifische Integration". Der Begriff "ein Isotypcodierender Vektor" bezieht sich auf einen Vektor, der Nucleinsäuresequenzen trägt, die für einen Antikörperisotyp codieren. In der vorliegenden Beschreibung werden die Begriffe "Phagemid-Vektor" und "Phagen-Vektor" austauschbar verwendet. Die Begriffe "Plasmid" und "Vektor" werden austauschbar verwendet. Die Erfindung soll solche anderen Formen von Vektoren einschließen, die äquivalenten Funktionen dienen, z.B. Plasmide, Phagemide und Virusgenome, oder alle anderen Nucleinsäuremoleküle, die in der Lage sind, die Produktion eines gewünschten Proteins in einem geeigneten Wirt zu steuern.
Der Begriff "jedes Mitglied der Bibliothek von Vektoren von Interesse" wird verwendet, um einzelne Vektormoleküle mit einer bestimmten Nucleinsäuresequenz zu beschreiben, die aus einer Bibliothek von Vektoren von Interesse stammen, wobei die Nucleinsäuresequenz für ein Mitglied des rekombinanten polyklonalen Proteins von Interesse codiert.
Der Begriff "Massentransfer" wird verwendet, um den Transfer bzw. die Übertragung von Nucleinsäuresequenzen von Interesse von einer Population von Vektoren auf eine andere Population von Vektoren zu beschreiben, wobei dieses für jede DNA simultan durchgeführt wird, ohne auf eine Isolierung der einzelnen DNAs von Interesse zurückzugreifen. Solche Populationen von Vektoren können Bibliotheken sein, die z.B. variable Regionen bzw. Bereiche, Promotoren, Leit- bzw. Signal- oder Verstärkerelemente von Interesse enthalten. Diese Sequenzen können dann ohne vorherige Isolierung aus z.B. einem Phagenvektor in einen Säugerexpressionsvektor versetzt werden. Insbesondere für Antikörpersequenzen stellt diese Technik sicher, dass die Diversität der Verknüpfung zwischen V_H und V_L (linkage between V_H and V_L diversity) nicht verloren geht, während die Bibliotheken aus z.B. einem Selektionsvektor (z.B. ein Phagen-Display-Vektor) in einen Säugerexpressionsvektor versetzt werden. Hierdurch wird die ursprüngliche Paarung von V_H und V_L aufrechterhalten.
Der Begriff "Transfektion" wird hierin als breiter Begriff für das Einführen fremder DNA in eine Zelle verwendet. Der Begriff ist auch dazu gedacht, andere funktionelle äquivalente Verfahren zum Einführen fremder DNA in eine Zelle, wie z.B. Transformation, Infektion, Transduktion oder Fusion einer Donorzelle und einer Akzeptorzelle, abzudecken.
Der Begriff "Auswählen" bzw. "Selektion" wird verwendet, um ein Verfahren zu beschreiben, in dem Zellen ein bestimmtes Merkmal erworben haben, das die Isolierung von Zellen ermöglicht, die dieses Merkmal nicht erworben haben. Solche Merkmale können die Resistenz gegen ein zytotoxisches Mittel oder die Produktion eines essenziellen Nährstoffs, Enzyms oder einer Farbe sein.
Die Begriffe "selektierbares Markergen", "Selektionsmarkergen", "Selektionsgen" und "Markergen" werden verwendet, um ein Gen zu beschreiben, das für einen selektierbaren Marker (z.B. ein Gen, das Resistenz gegen einen beliebigen zytotoxischen Wirkstoff, wie bestimmte Antibiotika verleiht, ein Gen, das in der Lage ist, einen essenziellen Nährstoff zu produzieren, der im Wachstumsmedium verringert werden kann, ein Gen, das für ein Enzym codiert, welches analysierbare Metaboliten produziert, oder ein Gen, das für ein gefärbtes Protein codiert, welches z.B. mittels FACS herausgesucht werden kann) codiert, der zusammen mit dem/den Gen(en) von Interesse in die Zellen co-eingeführt wird.
Der Begriff "rekombinantes Protein" wird verwendet, um ein Protein zu beschreiben, das von einer Zelllinie exprimiert wird, die mit einem Expressionsvektor transfiziert ist, welcher die codierende Sequenz des Proteins umfasst.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "funktionell verknüpft" auf einen Abschnitt, der mit einem anderen Abschnitt verknüpft ist, wenn er in einer funktionellen Beziehung mit dem anderen Abschnitt platziert ist. Z.B. ist DNA, die für eine Signalsequenz codiert, funktionell mit DNA verknüpft, die für ein Polypeptid codiert, wenn sie als Leader exprimiert wird, der an dem Transfer des Polypeptids zum endoplasmatischen Reticulum beteiligt ist. Auch ein Promotor oder Verstärker ist funktionell mit einer codierenden Sequenz verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz stimuliert.
Der Begriff "eine Mehrheit der einzelnen Zellen" bezieht sich auf einen Prozentsatz der Zellen, wie mehr als 80%, vorzugsweise mehr als 85%, stärker bevorzugt 90%, 95% oder sogar 99% oder höher.
Wie hierin verwendet, soll der Begriff "Genom" nicht wörtlich als das normale Gegenstück (normal complement) der Chromosomen, die in einer Zelle vorhanden sind, genommen werden, sondern auch als extrachromosomale Elemente, die in eine Zelle eingeführt und darin behalten werden können. Solche extrachromosomalen Elemente können Minichromosome, YACs (yeast artificial chromosomes) (künstliche Hefechromosome), MACs (mouse artificial chromosomes) (künstliche Mäusechromosome) oder HACs (human artficial chromosomes) (künstliche Humanchromosome) einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Der Begriff "Promotor" betrifft einen Bereich der DNA, der am Binden der RNA-Polymerase beteiligt ist, um die Transkription zu initiieren.
Der Begriff "Kopf-an-Kopf-Promotoren" (head-to-head promoters) betrifft ein Promotorpaar, das in enger Nachbarschaft platziert ist, so dass die Transkription zweier Genfragmente, die durch die Promotoren gesteuert wird, in entgegen gesetzter Richtung auftritt. Ein Kopf-an-Kopf-Promotor kann auch mit einem Stuffer, der aus irrelevanten Nucleinsäuren zusammengesetzt ist, zwischen den zwei Promotoren konstruiert werden. Ein solches Stuffer-Fragment kann leicht mehr als 500 Nucleotide enthalten.
Ein "Antibiotikaresistenzgen" ist ein Gen, das für ein Protein codiert, das die hemmende oder toxische Wirkung, die ein Antibiotikum auf eine Zelle hat, überwinden kann, wobei das Überleben und die fortgesetzte Vermehrung der Zellen in Gegenwart des Antibiotikums sichergestellt wird.
Der Begriff "interne Ribosomen-Eintrittsstelle" oder "IRES" beschreibt eine Struktur, die von der normalen 5'-Cap-Struktur an einer mRNA verschieden ist. Beide Strukturen können durch ein Ribosom erkannt werden, um das Suchen nach einem AUG-Codon zu initiieren, um die Translation zu initiieren. Unter Verwendung einer Promotorsequenz und zweier initiierender AUGs kann eine erste und eine zweite Polypeptidsequenz aus einer einzelnen mRNA translatiert werden. Um die Co-Translation einer ersten und einer zweiten Polynucleotidsequenz aus einer einzelnen bi-cistronischen mRNA zu ermöglichen, können somit die erste und die zweite Polynucleotidsequenz über eine Linkersequenz, einschließlich einer IRES-Sequenz, die die Translation der Polynucleotidsequenz stromabwärts der IRES-Sequenz ermöglicht, transkriptionell fusioniert sein (transcriptionally fused). In diesem Fall wird ein transkribiertes bicistronisches RNA-Molekül sowohl von dem 5'-Ende mit Cap (capped 5' end) als auch von der internen IRES-Sequenz des bi-cistronischen RNA-Moleküls translatiert werden, um dadurch sowohl das erste als auch das zweite Polypeptid zu produzieren.
Der Begriff "induzierbare Expression" wird verwendet, um eine Expression zu beschreiben, die die Wechselwirkung eines Induktormoleküls oder die Freisetzung eines Co-Repressormoleküls und eines regulatorischen Proteins benötigt, damit die Expression stattfindet.
Der Begriff "konstitutive Expression" betrifft eine Expression, die üblicherweise nicht induzierbar ist.
Der Begriff "Rekombinase" betrifft ein Enzym, das die Rekombination zwischen zwei oder mehreren Rekombinationsstellen katalysiert. In der vorliegenden Erfindung verwendbare Rekombinasen katalysieren die Rekombination an spezifischen Rekombinationsstellen, die spezifische Nucleinsäuresequenzen sind, die durch eine spezielle Rekombinase erkannt werden.
Der Begriff "Umordnung" bzw. "Scrambling" beschreibt Situationen, in denen zwei oder mehr verschiedene Mitglieder eines polyklonalen Proteins, die aus zwei verschiedenen Polypeptidketten bestehen, z.B. aus der Immunglobulin-Superfamilie, von einer einzelnen Zelle exprimiert werden. Diese Situation kann entstehen, wenn die einzelne Zelle mehr als ein Paar von Genabschnitten in das Genom integriert hat, wobei jedes Paar von Genabschnitten für ein unterschiedliches Mitglied des polyklonalen Proteins codiert. In solchen Situationen können unbeabsichtigte Kombinationen der Polypeptidketten, die von den Genabschnitten exprimiert werden, hergestellt werden. Diese unbeabsichtigten Kombinationen der Polypeptidketten könnten keine therapeutische Wirkung haben.
Der Begriff "V_H-V_L-Ketten-Scrambling" ist ein Beispiel des oben definierten Scramblings. In diesem Beispiel stellen die V_H- und V_L-codierenden Genabschnitte ein Paar von Genabschnitten dar. Das Scrambling tritt auf, wenn unbeabsichtigte Kombinationen von V_H- und V_L-Polypeptiden von einer Zelle produziert werden, in der zwei verschiedene V_H- und V_L-codierende Genabschnittspaare in die gleiche Zelle integriert sind. Es ist nicht wahrscheinlich, das ein solches ungeordnetes (scrambled) Antikörpermolekül die ursprüngliche Spezifität aufrechterhält, und es könnte somit keinen therapeutischen Effekt haben.
Der Begriff "rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie" bezieht sich auf eine Population von proteinexprimierenden Zellen, die mit einer Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen von Interesse transfiziert ist, so dass die einzelnen Zellen, die zusammen die rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie darstellen, nur eine Kopie einer bestimmten Nucleinsäuresequenz von Interesse tragen, die für ein Mitglied des rekombinanten polyklonalen Proteins von Interesse codiert, und dass jede Kopie an der gleichen Stelle des Genoms jeder Zelle integriert ist. Die Zellen, die die rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie darstellen, werden aufgrund ihrer Fähigkeit ausgewählt, die integrierte Kopie der bestimmten Nucleinsäuresequenz von Interesse zu behalten, z.B. durch Antibiotikumselektion. Zellen, die eine solche Herstellungszelllinie darstellen können, können z.B. Bakterien, Pilze, eukaryotische Zellen, wie Hefe, Insektenzellen oder Säugerzellen, insbesondere immortale Säugerzelllinien, wie CHO-Zellen, COS-Zellen, BHK-Zellen, Myelomzellen (z.B. Sp2/0-Zellen, NS0), NIH 3T3, YB2/0 und immortalisierte Humanzellen, wie HeLa-Zellen, HEK-293-Zellen oder PER.C6, sein.
Der Begriff "aktive Stelle" bzw. "hot spot", wie in "Hotspot-Zelllinie", bezieht sich auf einen zuvor etablierten Locus des Genoms der Zelle, der ausgewählt wurde wegen einer oder erzeugt wurde für eine und gekennzeichnet ist durch eine hocheffiziente Transkription einer integrierten Nucleinsäuresequenz von Interesse bei Integration des Expressionsvektors an dieser Stelle.
Der Begriff "überwiegen" bzw. "überwiegend" (bias) wird verwendet, um das Phänomen während der Produktion von rekombinantem polyklonalen Protein zu bezeichnen, bei dem sich die Zusammensetzung eines polyklonalen Vektors, einer polyklonalen Zelllinie oder eines polyklonalen Proteins im Verlauf der Zeit aufgrund zufälliger genetischer Mutationen, aufgrund von Unterschieden in Vermehrungs- bzw. Proliferationskinetik zwischen einzelnen Zellen, von Unterschieden in Expressionsleveln zwischen verschiedenen Expressionskonstruktsequenzen oder von Unterschieden in der Klonierungseffizienz von DNA verändert.
Der Begriff "RFLP" bezieht sich auf "Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus", ein Verfahren, wodurch das Gelmigrationsmuster von Nucleinsäuremolekülfragmenten nach der Spaltung mit Restriktionsenzymen analysiert wird.
Der Begriff "HDS" bezieht sich auf ein Screeningverfahren mit hoher Dichte, in dem viele einzelne Moleküle parallel auf Membranen getestet werden, so dass große Anzahlen von Testverbindungen simultan auf eine gegebene Aktivität hin durchmustert werden können.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "TagMan PCR" auf einen PCR-Assay, der auf dem TagMan-System basiert, das durch Holland, P.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280 (1991) beschrieben wurde.
Der Begriff "5'-UTR" bezieht sich auf einen 5'-untranslatierten Bereich der mRNA.
Der Begriff "Pfu-PCR" bezieht sich auf eine PCR-Reaktion, die unter Verwendung einer Pfu-DNA-Polymerase (isoliert aus Pyrococcus furiosus) durchgeführt wurde, die verwendet wird, weil sie die höchste Zuverlässigkeit unter den bekannten thermostabilen Polymerasen hat.
Abkürzungen: "CMV" = (Human-)Cytomegalo-Virus. "MSPSV" = myeloproliferatives Sarkom-Virus. "AdMLP" = später Adenovirus-Hauptpromotor (Adenovirus Major Late Promoter). SV40 poly A = Affenvirus (Simian Virus) 40 Poly A-Signalsequenz. GFP = grüne Fluoreszenzproteine. PVDF = Polyvinylidendifluorid. TcR = T-Zellrezeptor. ELISA = enzymgekop pelte Immunadsorptionsbestimmung (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). LTR = lange terminale Wiederholung (Long Terminal Repeat).
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Schematische Darstellung eines "Kopf-an-Kopf-Promotor"-Expressionsvektors, umfassend die folgenden Elemente: Amp pro = ein Promotor, der die Expression des Ampicillin-Resistenzgens ermöglicht. Amp = ein Ampicillin-Resistenzgen. pUC-Ursprung = ein pUC-Ursprung der Replikation. Restriktionsenzymschnittstellen: NotI und EcoRI. Promotor A/Promotor B = Kopf-an-Kopf-Promotorkassette, einschließlich Leit- bzw. Signalsequenzen (z.B. CMV/MPSV). V Heavy = Sequenz, die für die variable schwere Kette (heavy chain) eines GOI codiert. C Heavy Chain = Sequenzen, die für die konstante schwere Kette (heavy chain) (z.B. die Sequenzen für die konstante schwere Kette von Maus-IgG1 oder -IgG2B) codieren. R-B-Globin-pA = Kaninchen-β-Globin-Poly-A-Sequenz. bGH-polyA = Rinderwachstumshormon-poly-A-Sequenz. V Kappa = Sequenz, die für das variable Kappa eines GOI codiert. C Kappa chain = Sequenz, die für die konstante Kappa-Kette (kappa chain) codiert. FRT-Stelle = eine FRT-Rekombinationsstelle. Hygromycin = Gen für Hygromycin-Resistenz. SV40 poly A = poly-A-Signalsequenz.
2: Schematische Darstellung eines Expressionsvektors für uni-direktionale Expression, umfassend die folgenden Elemente: Amp pro = ein Promotor, der die Expression des Ampicillin-Resistenzgens ermöglicht. Amp = ein Ampicillin-Resistenzgen. pUC ori = ein pUC-Replikationsursprung. Promotor A = Säugerpromotor, einschließlich Leit- bzw. Signalsequenzen (z.B. AdMLP). V Heavy = Sequenz, die für die variable schwere Kette eines GOI codiert. C Heavy Chain = Sequenzen, die für die konstante schwere Kette (z.B. die Sequenzen für die schwere Kette von Maus-IgG1) codieren. hGH poly A = Human-Wachstumshormon-poly-A-Sequenz. bGH-polyA = Rinderwachstumshormon-poly-A-Sequenz. V Kappa = Sequenz, die für die variable leichte Kappa-Kette eines GOI codiert. C Kappa = Sequenz, die für die konstante Kappa-Kette codiert. FRT = eine FRT-Rekombinationsstelle. Hygromycin = Gen für Hygromycin-Resistenz. SV40 poly A = poly-A-Signalsequenz. Die Sequenzen von hGH, poly A und Promotor A könnten durch eine IRES-Struktur ersetzt sein.
3: Fließschema, das die Erzeugung einer rekombinanten polyklonalen Herstellungszelllinie und die Produktion eines rekombinanten polyklonalen Proteins umreißt. 1) veranschaulicht eine Massentransfektionsstrategie (bulk transfection strategy); 2) veranschaulicht eine Semi-Massentransfektionsstrategie (semi-bulk transfection strategy); und 3) veranschaulicht eine Einzel-Transfektionsstrategie. A) veranschaulicht die Bibliothek aus Vektoren (waagerechte Linien), die Pfeilspitzen veranschaulichen die Gruppierung der Vektoren. In Strategie 1 sind die Vektoren in Masse gruppiert (in bulk), in Strategie 2 sind sie in kleineren Fraktionen (Semi-Masse) (semi-bulk) gruppiert, wohingegen sie in Strategie 3 getrennt voneinander (einzeln) gehalten werden. B) veranschaulicht die Transfektion, wobei die Anzahl der Röhrchen von der Gruppierung der Vektoren abhängt, die die Bibliothek darstellen. C) veranschaulicht das Auswählen bzw. die Selektion von Zellen, die ortsspezifisch in das Wirtszellgenom eine GOI integriert haben, D) veranschaulicht die Erzeugung eines polyklonalen GOI-Bibliotheksbestandes, wobei die ausgewählten bzw. selektierten Zellen, die die integrierte Bibliothek darstellen, in einem Gefrierschrank gelagert werden. Es ist freigestellt, die einzelnen Klone aufzubewahren oder die Klone zu poolen. E) veranschaulicht den Beginn der Herstellungsphase, wobei die Klone aus der Stammlösung bzw. dem Bestand aufgetaut werden (entweder einzeln, aus kleineren Fraktionen oder aus einem Pool) und für das Wachstum in Suspension adaptiert werden. Die Adaption an serumfreie Medien kann nach der Auswahl- bzw. Selektionsstufe oder bei dieser Stufe durchgeführt werden. F) veranschaulicht die Stufe in der Produktion, in der die polyklonale Zelllinie vermehrt wird, um einen größeren Bioreaktor zu beimpfen (intermediäre Beimpfungsschritte sind eine Möglichkeit, obwohl nicht veranschaulicht). In Strategie 2 und 3 ist dies die Stufe, in der der Bestand an polyklonalen Zellklonen nicht länger als einzelne Klone oder Semi-Massenfraktionen (semi-bulk fractions) gehalten wird, sondern zu einer Sammlung von Zellen vereinigt wird, die eine rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie bilden. G) veranschaulicht die abschließende Produktion, die aus der Bioreaktorherstellung erhalten wird. Auf die Produktionsphase folgend wird die polyklonale Proteinzusammensetzung zur Aufreinigung und Charakterisierung des Produkts geerntet.
4: Fließdiagramm, das die Erzeugung eines Säugerexpressionsvektors veranschaulicht.
(A). Eine schematische Darstellung eines Phagemid-Vektors, pSymvc10, der eine Sequenz trägt, die für ein Mitglied des GOI codiert. P tac und P lacZ = bakterielle Kopf-an-Kopf-Promotorkassette. V kappa = Sequenz, die für eine variable leichte Kappa-Kette eines GOI codiert. C Kappa chain = Sequenz, die für die konstante leichte Maus-Kappa-Kette codiert. V Heavy = Sequenz, die für die variable schwere Kette eines GOI codiert. C Heavy Chain = Sequenz, die für die CH1-Domäne der konstanten schweren Kette codiert. Restriktionsenzymschnittstellen: EcoRI, NotI, SacI und XhoI. cpIII = Phagen-Protein III. Amp pro = ein Promotor, der die Expression des Ampicillin-Resistenzgens ermöglicht. Amp = ein Ampicillin-Resistenzgen. pUC Ori = ein pUC-Replikationsursprung.
Schritt 1: Durch Restriktionsverdau mit SacI und XhoI kann die bakterielle Promotorkassette aus pSymvc10 ausgeschnitten werden und durch Ligation durch eine Säugerpromotorkassette (B), die ebenfalls durch Restriktionsverdau mit SacI und XhoI hergestellt wurde, ersetzt werden.
(C) Schematische Darstellung eines Phagemid-Vektors, pSymvc12, der Sequenzen aus dem GOI trägt, nach Promotoraustausch mit einer Säuger-Kopf-an-Kopf-Promotorkassette. Promotor A/Promotor B = Kopf-an-Kopf-Promotorkassette der Wahl (z.B. CMV/MPSV). V kappa = Sequenz, die für eine variable leichte Kappa-Kette eins GOI codiert. C Kappa chain = Sequenz, die für die konstante Maus-Kappa-Kette codiert. V Heavy = Sequenz, die für die variable schwere Kette eines GOI codiert. C Heavy Chain = Sequenz, die für die CH1-Domäne der konstanten schweren Kette codiert. Restriktionsenzymschnittstellen: NotI, SacI, XhoI und EcoRI. cpIII = Phagen-Protein III. Amp pro = ein Promotor, der die Expression des Ampicillin-Resistenzgens ermöglicht. Amp = ein Ampicillin-Resistenzgen. pUC Ori = ein pUC-Replikationsursprung.
Schritt 2: Durch Restriktionsverdau von pSymvc12 mit EcoRI und NotI kann ein Nucleinsäurefragment, das das gesamte Kappa, die Promotorkassette und V Heavy enthält, aus pSymvc12 ausgeschnitten werden und in einen Isotyp-codierenden Vektor, z.B. pSymvc20, ligiert werden, der ebenfalls durch Restriktionsverdau mit EcoRI und NotI hergestellt wurde, wodurch der Säugerexpressionsvektor pSymvc21 (E) erzeugt wird.
(E) Schematische Darstellung eines Säugerexpressionsvektors, pSymvc21, mit variablen schweren und Kappa-Bereichen aus dem GOI, zur Antikörperexpression. Dieser Säugerexpressionsvektor umfasst die folgenden Elemente: Amp pro = ein Promotor, der die Expression des Ampicillin-Resistenzgens ermöglicht. Amp = ein Ampicillin-Resistenzgen. pUC Ori = ein pUC-Replikationsursprung. Restriktionsenzymschnittstellen: NotI und EcoRI. Promotor A/Promotor B = Kopf-an-Kopf-Promotorkassette der Wahl (z.B. CMV/MPSV). V kappa = V-Kappa-Sequenz, die für eine variable leichte Kappa-Kette eines GOI codiert. C Kappa chain = Sequenz, die für die konstante leichte Säuger-Kappa-Kette codiert (z.B. eine konstante Maus-Kappa-Kette). V Heavy = V-Heavy-Sequenz, die für die variable schwere Kette eines GOI codiert. C Heavy Chain = Sequenzen, die für eine konstante schwere Säuger-Kette codieren (z.B. die Sequenzen für die konstante schwere Kette von Maus-IgG1 oder -IgG2B). R-B-Globin-pA = eine Kaninchen-β-Globin-Poly-A-Sequenz. bGH-polyA = Rinderwachstumshormon-poly-A-Sequenz. FRT-Stelle = eine FRT-Rekombinationsstelle. Hygromycin = Gen für Hygromycin-Resistenz. SV40 poly A = SV40-poly-A-Sequenz. Natürlich kann die Reihenfolge der Schritte 1 und 2 umgekehrt werden, so dass ein Fragment aus pSymvc10, das das gesamte Kappa, die bakterielle Promotorkassette und V heavy enthält, aus pSymvc10 unter Anwendung eines Eco-RI- und NotI-Restriktionsverdaus ausgeschnitten werden kann, welches dann in einen Isotypcodierenden Vektor, z.B. pSymvc20, ligiert wird. Der Promotoraustausch kann dann auf pSymvc20 durch Restriktionsverdau unter Verwendung von SacI und XhoI und Ligation mit einem SacI + XhoI-verdauten Säugerpromotorkassettenfragment, z.B. wie in 4B, durchgeführt werden.
5: Histrogramm, das die Genotypenverteilung in TG1-Zellen, die mit Plasmidpräparation 1 transformiert wurden, zeigt. Ein 223-228 bezieht sich auf Vektoren mit bakteriellen Promotoren, die entsprechend für Anti-β₂-Mikroglobulin (anti-B2M), anti-alkalisches Phosphat (anti-alkaline phosphate) (Anti-AP), Anti-Ovalbumin (Anti-OVA), Anti-Faktor VIII (Anti-FVIII), Anti-Lysozym (Anti-LYS), Anti-Haptoglobin (Anti-HAP) codieren. Ein 223-228 sind Vektoren des pSymvc10-Typs. Die Anzahl der einzelnen Genotypen, die dem Fragmentmuster ähneln, bestimmt durch RFLP, entspricht der Anzahl der einzelnen Kolonien an der Gesamtanzahl der überimpften bzw. gepickten Kolonien.
6: Histrogramm, das die Genotypenverteilung in TG1-Zellen, die mit Plasmidpräparation 2 transformiert wurden, zeigt. Ein 229-234 bezieht sich auf Vektoren mit Säugerpromotoren (CMV/MPSV), die entsprechend für Anti-β₂-Mikroglobulin (anti-B2M), anti-alkalisches Phosphat (Anti-AP), Anti-Ovalbumin (Anti-OVA), Anti-Faktor VIII (Anti-FVIII), Anti-Lysozym (Anti-LYS), Anti-Haptoglobin (Anti-HAP) codieren. Ein 229-234 sind Vektoren des pSymvc12-Typs. Die Anzahl der Klone stellt die beobachtete Anzahl von Klonen dar, die dem Sequenzmuster, bestimmt durch RFLP, dieses Ein-Typs (eine vollständige Sequenzanalyse wurde nicht durchgeführt) ähneln.
7: Histrogramm, das die Genotypenverteilung in TG1-Zellen, die mit Plasmidpräparation 3 transformiert wurden, zeigt. Ein 235-240 bezieht sich auf einen Maus-IgG1-Säugerexpressionsvektor (einschließlich eines Kaninchen-β-Globin-poly-A-Signals) und codiert entsprechend für Anti-β₂-Mikroglobulin (anti-B2M), anti-alkalisches Phosphat (Anti-AP), Anti-Ovalbumin (Anti-OVA), Anti-Faktor VIII (Anti-FVIII), Anti-Lysozym (Anti-LYS), Anti-Haptoglobin (Anti-HAP). Ein 235-240 sind Vektoren des pSymvc21-Typs. Die Anzahl der Klone stellt die beobachtete Anzahl von Klonen dar, die dem Sequenzmuster, bestimmt durch RFLP, dieses Ein-Typs (eine vollständige Sequenzanalyse wurde nicht durchgeführt) ähneln.
8: Histrogramm, das die Genotypenverteilung in TG1-Zellen, die mit der Plasmidpräparation mit doppeltem Verdau/Ligation (Massentransfer in den Säugerexpressionsvek tor ohne DNA-Vervielfältigung in E. coli nach dem Plasmidpräparation-1-Schritt) transformiert wurden, zeigt.
9: Histrogramme, die die Genotypenverteilung in CHO-Flp-In-Zellen, die mit einem Gemisch aus Säugerexpressionsvektoren, die für die sechs Gene von Interesse am A) Tag 16 und B) Tag 34 nach der Transfektion codieren, zeigen.
10: Antigen-spezifischer ELISA der Überstände, die von den CHO-Flp-In-Zellen 34 Tage nach Massentransfektion mit einem Gemisch von Expressionsvektoren, die für die sechs Gene von Interesse codieren, stammten.
11: Anti-Kappa-Beschichtungs-ELISA (anti-kappa coat ELISA) der Überstände, die aus Reservoiren bzw. Pools von CHO-Flp-In-Zellen 34 Tage nach Transfektion entweder mit einem Einzelexpressionsvektor, der für ein Gen von Interesse codiert, oder mit einem Gemisch von Expressionsvektoren, die für die sechs Gene von Interesse codieren, stammten.
12: Quantitativer antigen-spezifischer ELISA der Überstände, die von den CHO-Flp-In-Klon 019 am Tag 17, 31, 45, 59 und 73 nach Massentransfektion mit einem Gemisch von Expressionsvektoren, die für die sechs Gene von Interesse codieren, stammten. A, B und C stellen drei verschiedene Transfektionsversuche dar.
13: Antigen-spezifischer ELISA der Überstände, die von CHO-Flp-In-Zellkulturen am Tag 8, 17, 30, 45, 57, 72 und 85 nach Mischen der CHO-Flp-In-Zelllinien, die einzelne Mitglieder der Mini-Sechs-Bibliothek (mini six library) exprimieren, stammten. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung aus drei unabhängigen Versuchen gezeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das rekombinante polyklonale Proteinexpressionssystem
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur gleich bleibenden bzw. einheitlichen Herstellung rekombinanter polyklonaler Proteine bereit, die vorzugsweise aus der Immunglobulin-Superfamilie ausgewählt sind, einer Familie von Proteinen mit Immunglobulin-artigen Domänen. Die meisten der Mitglieder sind an Zelloberflächenerkennungsereignissen beteiligt. Die Sequenzhomologie deutet darauf hin, dass Antikörper, T-Zellrezeptoren, MHC-Moleküle, einige Zelladhäsionsmoleküle und Cytokinrezeptoren eine enge Homologie teilen. Insbesondere Mitglieder dieser Familie, die variable Bereiche enthalten, sind zur Erzeugung rekombinanter polyklonaler Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet. Solche Mitglieder schließen Antikörper, membrangebundene Antikörper (B-Zellrezeptoren), Fab-Fragmente, Fv-Fragmente, Einzelketten-Fv(scFv)-Fragmente, T-Zellrezeptoren (TcRs), lösliche TcRs, TcR-Fragmente der variablen Domäne, TcR-Fragmente der variablen Domäne, die durch einen Polypeptidlinker verknüpft sind, oder andere Antikörper oder von TcR stammende Fragmente ein. Insbesondere wird in Erwägung gezogen, dass die vorliegende Erfindung die Möglichkeit zur Herstellung in großem Maßstab und zur Produktion einer neuen Klasse von therapeutischen Mitteln, die rekombinante therapeutische polyklonale Antikörper oder TcRs umfassen, eröffnen wird.
Einer der Hauptvorteile des Herstellungsverfahrens der vorliegenden Erfindung ist, dass alle Mitglieder, die das rekombinante polyklonale Protein darstellen, in zwischen einem und näherungsweise zehn Bioreaktoren oder Äquivalenten davon hergestellt werden können. Weiterhin kann die rekombinante polyklonale Proteinzusammensetzung als eine einzelne Präparation aus dem Reaktor aufgereinigt werden, ohne dass die einzelnen Mitglieder, die das rekombinante polyklonale Protein darstellen, während des Verfahrens getrennt werden müssen. Im Unterschied dazu wäre, wenn jemand eine rekombinante polyklonale Antikörperzusammensetzung durch Mischen gereinigter monoklonaler Antikörper (wie z.B. in WO 91/16074 vorgeschlagen) imitieren wollte, die getrennte Herstellung jedes einzelnen Antikörpers, der in der Zusammensetzung eingeschlossen sein sollte, in einem Bioreaktor erforderlich, und höchstwahrscheinlich würden die Antikörper auch einzeln aufgereinigt. Eine solche Herstellung einer monoklonalen Mischung wäre sehr kostspielig und zeitintensiv und raumbrauchend, im Vergleich zu dem Verfahren der Herstellung eines rekombinanten polyklonalen Antikörpers oder anderer polyklonaler Proteine, wie hierin beschrieben. Somit würde das Verfahren, wie in WO 91/16074 beschrieben, naturgemäß in einer praktischen Begrenzung der Anzahl monoklonaler Antikörper, die in ein solches Gemisch eingeschlossen werden könnten, höchstwahrscheinlich unter 10, resultieren, wohingegen die Technologie, wie hierin beschrieben, allgemein einen polyklonalen Antikörper mit so vielen einzelnen Mitgliedern wie gewünscht herstellen kann.
Um eine vorhersagbare Expression eines rekombinanten polyklonalen Proteins aus einer rekombinanten polyklonalen Herstellungszelllinie zu erhalten, sollten die regulatorischen Eigenschaften der Genomintegrationsstelle vernünftigerweise gut verstanden sein.
Konventionelle Transfektions- und rekombinante Proteinexpressionstechniken, die eine zufällige Integration verwenden, sind zur Herstellung eines rekombinanten polyklonalen Proteins nicht zweckmäßig, da die zufällige Beschaffenheit des Verfahrens dazu führen wird, dass die Anzahl und die Positionen der integrierten Nucleinsäuresequenzen von Zelle zu Zelle variieren. Somit ist es wahrscheinlich, wenn ein rekombinantes polyklonales Protein mittels solcher traditioneller Protokolle hergestellt wird, dass dies zu einer heterogenen Zellkultur mit variablen Expressionsraten der einzelnen Mitglieder des polyklonalen Proteins und genetischer Instabilität aufgrund von Positionseffekten der integrierten DNA führt. Dies wird höchstwahrschein lich zu einer unausgewogenen Expression der Mitglieder, die das polyklonale Protein darstellen, führen.
Die Einführung in eine zuvor bestimmte Genomstelle ist somit zweckmäßig, dies kann im Prinzip durch homologe Rekombination erreicht werden. Jedoch ist die homologe Rekombination infolge der Dominanz illegitimer Rekombinationsereignisse sehr ineffizient.
In dem Fall, dass das polyklonale Protein ein Antikörper oder ein T-Zellrezeptor (TcR) ist, ergibt sich darüber hinaus ein anderes Problem bei der Verwendung konventioneller Transfektionsprotokolle, die zu zufälliger Integration führen. Antikörper und TcRs werden von Paaren unabhängiger Genabschnitte codiert, den für die leichte und die schwere Kette codierenden Sequenzen bei Antikörpern und den für die Alpha- und Beta-Kette oder Delta- und Gamma-Kette codierenden Sequenzen bei TcR. Die Polypeptidprodukte dieser Genabschnitte werden während des intrazellulären Prozessierens des Antikörpermoleküls oder TcRs kovalent verknüpft. Konventionelle Transfektionstechnologie, die in zufälliger Integration resultiert, führt zu der Einführung mehrerer Kopien verschiedener schwerer und leichter Ketten oder Alpha- und Beta-Ketten in der gleichen Zelle, was in zufälligen Kombinationen schwerer und leichter Ketten resultiert, dem so genannten V_H-V_L-Ketten-Scrambling oder Alpha-Beta-Ketten-Scrambling. Als Konsequenz verschlechtert dies die Leistung der exprimierten Antikörper oder TcRs, was einen Verlust von Affinität und/oder Spezifität, das mögliche Auftreten neuer Spezifitäten und/oder reduzierter spezifischer Aktivität verursacht.
Um diese Probleme zu umgehen, verwendet das Expressionssystem der vorliegenden Erfindung ortsspezifische Integration in das Genom der einzelnen Wirtszellen. Das System der vorliegenden Erfindung stellt sicher, dass eine Bibliothek von Vektoren von Interesse, umfassend die varianten Nucleinsäuresequenzen von Interesse, an einem zuvor charakterisierten chromosomalen Ort durch eine Rekombinase-vermittelte Kassettenaustauschvorgehensweise insertiert werden kann, wodurch eine Zelllinie erzeugt wird, in der die einzelnen Zellen ein einzelnes bestimmtes Mitglied des rekombinanten polyklonalen Proteins von Interesse exprimieren. Wie unten beschrieben, könnten Mehrfachintegrationen in einigen der Zellen auftreten, die die rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie darstellen. Es wird jedoch nicht davon ausgegangen, dass dies ein Problem aufwirft, solange eine Mehrheit der einzelnen Zellen ein einzelnes bestimmtes Mitglied des rekombinanten polyklonalen Proteins exprimiert.
Rekombinasen wie Cre-, Flp-, Beta-Rekombinase, Gin, Pin, PinB, PinD, R/RS, Lambda-Integrase oder Phage ΦC31-Integrase können verwendet werden. Geeignete Rekombinasen für Integration in den chromosomalen Ort können entweder (i) durch Expression aus dem zell eigenen Genom, in das die Nucleinsäuresequenz eingeführt ist, (ii) dadurch, dass sie funktionell durch die Nucleinsäuresequenz, die in die Zelle insertiert ist, codiert werden, (iii) durch Expression von einem zweiten Nucleinsäuremolekül, oder (iv) als ein Protein bereitgestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die variante Nucleinsäuresequenz, die in dem Vektor von Interesse enthalten ist, in einen Locus integriert, der eine Transkription und eine Expression der Nucleinsäuresequenz von Interesse auf hohem Level, ein so genannter "Hotspot", vermittelt.
Die verwendete Wirtszelllinie ist vorzugsweise eine Säugerzelllinie, umfassend jene, die typischerweise zur biopharmazeutischen Proteinexpression verwendet werden, z.B. CHO-Zellen, COS-Zellen, BHK-Zellen, Myelomzellen (z.B. Sp2/0-Zellen, NS0), YB2/0, NIH 3T3 und immortalisierte Humanzellen, wie HeLa-Zellen, HEK 293-Zellen oder PER.C6. In der vorliegenden Erfindung wurden CHO-Zellen verwendet. Jedoch wäre eine Person mit gewöhnlichen Kenntnissen auf diesem Fachgebiet leicht in der Lage, CHO-Zellen durch andere Säugerzellen, wie beschrieben, zu ersetzen oder sogar andere Zelltypen einzusetzen, einschließlich Pflanzenzellen, Hefezellen, Insektenzellen, Pilzen und Bakterien. Somit ist nicht beabsichtigt, dass die Auswahl des Zelltyps für die Erfindung einschränkend ist. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Säugerzellen, die einen zuvor charakterisierten Hotspot enthalten, und hohe Expressionslevel des rekombinanten polyklonalen Proteins von Interesse vermitteln, zur Herstellung verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind variante Nucleinsäuresequenzen von Interesse in einer ortsspezifischen Weise integriert, wobei die gleiche chromosomale Integrationsstelle in den Wirtszellen verwendet wird. Ein solcher Einbau an einer einzelnen spezifischen Stelle minimiert Positionseffekte, die anderenfalls bei zufälliger Integration oder Integration an mehreren Stellen in einem Genom beobachtet werden. Insbesondere wenn polyklonale Proteine exprimiert werden, die aus mehr als einer Polypeptidkette aufgebaut sind, ist es weiterhin relevant, eine einzelne Stelle zu haben, bei der die ortsspezifische Integration in das Genom auftritt. Dies beruht auf der Tatsache, dass es, wenn eine einzelne Zelle mehr als einen integralen Bestandteil exprimiert, wahrscheinlich ist, dass Scrambling zwischen den Untereinheiten auftritt.
In einem ortsspezifischen Integrationssystem exprimieren die einzelnen Wirtszellen die gleiche Gesamtproteinstruktur, abgesehen von den Unterschieden, die in den variablen Bereichen des rekombinanten polyklonalen Proteins von Interesse, z.B. dem Antigenbindungsbereich von Antikörpern oder TcR, beobachtet werden. Daher sollte eine Mehrheit der Zellen innerhalb eines solchen Pools von Zellen gleiche bzw. ähnliche Merkmale hinsichtlich der Produktivität und genetischen Stabilität aufweisen, und daher bietet diese Technologie die Möglichkeit einer kontrollierten Herstellung eines rekombinanten polyklonalen Proteins, z.B. eines rekombinanten polyklonalen Antikörpers oder von TcR.
Das rekombinante polyklonale Protein der vorliegenden Erfindung soll eine Proteinzusammensetzung abdecken, die verschiedene, aber homologe Proteinmoleküle umfasst, die naturgemäß variabel sind, was bedeutet, dass in bevorzugten Ausführungsformen die Bibliothek aus varianten Nucleinsäuren eine natürlich auftretende Diversität umfasst. Somit ist jedes Proteinmolekül homolog zu den anderen Molekülen der Zusammensetzung, aber es enthält auch einen oder mehrere Abschnitte von variabler Polypeptidsequenz, der bzw. die durch Unterschiede in der Aminsosäuresequenz zwischen den einzelnen Mitgliedern des polyklonalen Proteins gekennzeichnet ist bzw. sind. Diese Unterschiede in der Aminsosäuresequenz/den Aminsosäuresequenzen, die die variable Polypeptidsequenz darstellt/darstellen, könnten so klein sein wie eine Aminosäure. Vorzugsweise machen die Unterschiede in der Aminsosäuresequenz mehr als eine Aminosäure aus.
Gewöhnlich wird davon ausgegangen, dass die natürliche Variabilität eines polyklonalen Antikörpers oder TcR in den so genannten variablen Bereichen bzw. Regionen oder V-Bereichen der Polypeptidketten lokalisiert ist.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfassen einzelne Mitglieder in einem polyklonalen Protein variable Bereiche, die näherungsweise zwischen 80 und 120 Aminosäuren lang sind. Die variablen Bereiche können hypervariable Domänen enthalten, z.B. komplementbestimmende Bereiche (complementarity determining regions) (CDR).
Bei natürlichen vorkommenden TcR gibt es vier CDR in jedem variablen Bereich. Bei natürlichen vorkommenden Antikörpern gibt es drei CDR in der schweren Kette und drei CDR in der leichten Kette.
In einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung enthalten die variablen Bereiche der einzelnen Mitglieder eines polyklonalen Proteins mindestens eine hypervariable Domäne, die zwischen 1 und 26 Aminosäuren lang ist, vorzugsweise zwischen 4 und 16 Aminosäuren lang ist. Diese hypervariable Domäne kann einem CDR3-Bereich entsprechen. Bei Antikörpern bildet jeder variable Bereich vorzugsweise drei hypervariable Domänen. Diese können CDR1, CDR2 und CDR3 entsprechen. Bei TcR bildet jeder variable Bereich vorzugsweise vier hypervariable Domänen. Diese können CDR1, CDR2, CDR3 und CDR4 entsprechen. Die hypervari ablen Domänen könnten allein die variablen Sequenzen innerhalb eines variablen Bereichs eines rekombinanten polyklonalen Proteins der vorliegenden Erfindung bilden.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung kann Variabilität in der Polypeptidsequenz (die Polyklonalität) auch so verstanden werden, dass Unterschiede zwischen den einzelnen Antikörpermolekülen beschrieben werden, die sich in so genannten konstanten Bereichen oder C-Bereichen der Antikörperpolypeptidketten befinden, z.B. wie in dem Fall von Gemischen aus Antikörpern, die zwei oder mehr verschiedene Antikörperisotypen enthalten, wie die Human-Isotypen IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 und IgA2 oder die Mausisotypen IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 und IgA. Somit kann ein rekombinanter polyklonaler Antikörper Antikörpermoleküle umfassen, die durch Sequenzunterschiede zwischen den einzelnen Antikörpermolekülen in dem variablen Bereich (V-Bereich) oder in dem konstanten Bereich (C-Bereich) oder in beiden gekennzeichnet sind.
Um variante Nucleinsäuresequenzen bereitzustellen, die für Proteine codieren, die ein spezielles Antigen binden, kann eine Anzahl von Verfahren eingesetzt werden, die im Fachgebiet bekannt sind. Typischerweise wird die Erfindung von der Anwendung einer Screening-Vorgehensweise profitieren, die die Identifizierung und/oder Isolierung von Nucleinsäuren ermöglicht, die für das Protein codieren, das ein spezielles Antigen bindet. Einige dieser Verfahren schließen einen so genannten Biopanning-Schritt ein, der aus Technologien wie dem Phagen-Display (Kang, A.S. et al. 1991, Proc Natl Acad Sci USA 88, 4363-4366), Ribosomen-Display (Schaffitzel, C. et al. 1999, J. Immunol. Methods 231, 119-135), DNA-Display (Cull, M.G. et al. 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89, 1865-1869), RNA-Peptid-Display (Roberts, R.W., Szostak, J.W., 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94, 12297-12302), kovalentem Display (covalent display) (WO 98/37186), Bakterienoberflächen-Display (Fuchs, P. et al. 1991, Biotechnology 9, 1369-1372), Hefeoberflächen-Display (Boder, E.T., Wittrup, K.D., 1997, Nat Biotechnol 15, 553-557) und eukaryotischen Virus-Display (Grabherr, R., Ernst, W., 2001, Comb. Chem. High Throughput. Screen. 4, 185-192) bekannt ist, Verfahren, die alle im Fachgebiet bekannt sind und die alle interessante Hilfsmittel bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung sind. FACS und Magnetperlen-Sortieren sind ebenfalls für Anreicherungs(panning)-Zwecke unter Verwendung von markiertem Antigen anwendbar. Immunodetektionsassays, wie ELISA (Dreher, M.L. et al. 1991, J. Immunol. Methods 139, 197-205) und ELISPOT (Czerkinsky, C.C. et al. 1983, J. Immunol. Methods 65, 109-21) können ebenfalls entweder folgend auf einen Biopanning-Schritt oder alleine verwendet werden.
Eine Zusammensetzung eines rekombinanten polyklonalen Proteins von Interesse umfasst eine definierte Untergruppe von Proteinen, die durch ein gemeinsames Merkmal, wie die gemeinsame Bindungsaktivität gegenüber einem gewünschten Ziel, z.B. im Fall polyklonaler Antikörper gegen das gewünschte Zielantigen, definiert wurden. Typischerweise hat eine. polyklonale Proteinzusammensetzung mindestens 3, 4, 5, 10, 20,50, 100, 1000, 10⁴, 10⁵ oder 10⁶ bestimmte unterschiedliche Mitglieder. Die Anzahl der bestimmten Mitglieder, die in der polyklonalen Proteinzusammensetzung benötigt werden, wird von der Komplexität des Ziels abhängen. Im Fall von Antikörpern wird die Komplexität des Antigens/der Antigene, auf das/die abgezielt wird, die Anzahl der bestimmten unterschiedlichen Mitglieder beeinflussen, die in der polyklonalen Antikörperzusammensetzung erforderlich sind. Bei kleinen oder nicht sehr komplexen Zielen, z.B. ein kleines Protein, wird eine polyklonale Antikörperzusammensetzung, die zwischen 3 und 100 bestimmte unterschiedliche Mitglieder umfasst, ausreichend sein, und es ist bevorzugt, dass die Anzahl der Varianten 90 oder sogar 80 oder 70 nicht überschreitet. In vielen Fällen wird die Anzahl der bestimmten Varianten 60 oder 50 nicht überschreiten, und es ist bevorzugt, dass die Anzahl der Varianten in dem Bereich zwischen und 5 und 40 ist, wie zwischen 5 und 30. Bei komplexeren Zielen, z.B. Viren mit komplexen oder austauschbaren Oberflächenproteinen oder solchen, die mehrere Virus-Subtypen umfassen, wird eine polyklonale Antikörperzusammensetzung, die zwischen 20 und 500 bestimmte unterschiedliche Mitglieder umfasst, ausreichend sein. Sehr komplexe Ziele, bei denen das Antigen viele verschiedene Moleküle umfasst, können eine polyklonale Antikörperzusammensetzung, die zwischen 50 und 10.000 bestimmte unterschiedliche Mitglieder umfasst, erfordern.
Bei Säugern gibt es mehrere bekannte Beispiele natürlich vorkommender polyklonaler Proteine, die entweder frei im Blut zirkulieren, wie Antikörper oder Immunglobulinmoleküle, oder die auf Zelloberflächen, wie T-Zellrezeptoren und B-Zellrezeptoren, vorhanden sind. Die Diversität dieser natürlich vorkommenden polyklonalen Proteine wird bei einigen Säugern durch genetische Rekombination von Genen erreicht, die für variable Bereiche dieser Proteine codieren. Weiterhin ist bekannt, dass Antikörper ihre Diversität durch somatische Mutation erhöhen. Die vorliegende Erfindung kann diese natürlichen Diversitäten ausnützen, indem die Sequenzen, die für die Diversität verantwortlich sind (z.B. die variablen Domänen oder CDR-Bereiche von Immunglobulinmolekülen oder TcR) isoliert werden und indem aus ihnen eine Bibliothek erzeugt wird. Bei Proteinen, die von zwei unabhängigen Genabschnitten codiert werden, z.B. die variable schwere Kette und die variable leichte Kette eines Antikörpers, die TcRα-Kette und -β-Kette oder die TcRδ-Kette und -γ-Kette, wird jeder Vektor in der Bibliothek ein Paar dieser für einen variablen Bereich codierenden Sequenzen darstellen. Die Erzeugung von Bibliotheken aus Paaren von für einen variablen Bereich codierenden Sequenzen ist im Fachgebiet gut bekannt.
Bibliotheken, die natürlich auftretende Diversitäten umfassen, sind z.B. kombinatorische Bibliotheken (Zufallspaarung der für den variablen Bereich codierenden Sequenzen) sowie Bibliotheken mit verwandten Paaren (Paare von für einen variablen Bereich codierenden Sequenzen, die aus der gleichen Zelle stammen). Weitere Bibliotheken, die aus isolierten CDR-Genfragmenten erzeugt wurden, die in einen geeigneten Rahmen bzw. ein geeignetes System eingeschlossen sind (z.B. Soderlind, E. et al., 2000. Nat. Biotechnol. 18, 852-856), wie ein variabler Bereich eines Antikörpers oder eines TcR, sind mit der vorliegenden Erfindung anwendbar. Die Bibliotheken werden vorzugsweise durchmustert, um Unterbibliotheken (sub-libraries) (Bibliotheken von Interesse) mit einer gewünschten Spezifität zu erhalten.
Proteindiversitäten können auch auf künstlichem Wege hergestellt werden, z.B. synthetisch oder durch Mutation. Mutationen können entweder zufällige oder Punktmutationen einer Nucleinsäuresequenz sein, die für ein einzelnes Protein codiert, wodurch eine polyklonale Population des Einzelproteins erzeugt wird. Ein anderes Beispiel des Erzeugens künstlicher Antikörperbibliotheken wird in EP 0 859 841 beschrieben, ein Verfahren, das auf dem Erzeugen einer Bibliothek aus unterschiedlichen Gerüstregionen (variable region frameworks) basiert, die mit einer anderen Bibliothek aus CDR kombiniert werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das rekombinante polyklonale Protein ein rekombinanter polyklonaler Antikörper oder ein rekombinantes polyklonales Antikörperfragment.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das rekombinante polyklonale Protein ein rekombinanter polyklonaler TcR oder ein rekombinantes polyklonales TcR-Fragment.
Zusätzlich zu der Diversität, die durch die genetische und somatische Rekombination in den so genannten variablen Bereichen erzielt wird, gibt es verschiedene Isotypen der Immunglobuline, die durch die schwere Kette definiert werden. Die Hauptisotypen sind IgM, IgG, IgA, IgD und IgE.
Ein rekombinantes polyklonales Protein der vorliegenden Erfindung kann daher auch aus den verschiedenen Isotypen oder stärker bevorzugt aus verschiedenen Unterklassen bestehen. Polyklonalität von Immunglobulinen kann in dem konstanten Teil oder in der variablen Domäne des Immunglobulinmoleküls oder sowohl in dem konstanten Teil als auch in der variablen Domäne auftreten.
Polyklonalität in der so genannten konstanten Region, insbesondere der schweren Kette von Antikörpern, ist hinsichtlich einer therapeutischen Anwendung von Antikörpern von Interesse. Die verschiedenen Immunglobulinisotypen haben verschiedene biologische Funktionen (zusammengefasst in Tabelle 1), wobei es wünschenswert sein könnte, diese zu kombinieren, wenn Antikörper zur Behandlung eingesetzt werden, weil verschiedene Isotypen von Immunglobulin in verschiedene Aspekte der natürlichen Immunantworten einbezogen sein können (Canfield und Morrison 1991, J. Exp. Med. 173, 1483-91; Kumpel et al. 2002, Transfus. Clin. Biol. 9, 45-53; Stirnadel et al. 2000, Epidemiol. Infect. 124, 153-162).
Tabelle 1: Biologische Funktionen der Human-Immunglobulinisotypen
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie, die eine Sammlung von Zellen umfasst, transfiziert mit einer Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen, wobei jede Zelle in der Sammlung mit einem Mitglied der Bibliothek transfiziert ist und in der Lage ist, dieses zu exprimieren, welches ein bestimmtes Mitglied eines polyklonalen Proteins codiert, das an ein spezielles Antigen bindet und das an der gleichen einzelnen Stelle in dem Genom einzelner Zellen in der Sammlung lokalisiert ist, wobei die Nucleinsäuresequenz nicht natürlich mit der Zelle in der Sammlung assoziiert ist.
In einer zusätzlichen Ausführungsform der obigen Ausführungsform stammen die varianten Nucleinsäuresequenzen, die für das polyklonale Protein (vorzugsweise aus der Im munglobulin-Superfamilie) codieren, alle aus natürlich vorkommenden Sequenzen, z.B. aus einem Donor isoliert.
Zusammensetzung von Zellen, die variante Nucleinsäuren, die an einer einzelnen spezifischen Stelle im Genom innerhalb jeder Zelle lokalisiert sind, wurden in WO 02/44361 beschrieben. Dieses Dokument offenbart die Verwendung von Zellen, um Moleküle zu identifizieren, die gewünschte Eigenschaften haben, aber das Literaturzitat behandelt nicht die Bereitstellung eines Produktionssystems oder die Bereitstellung eines polyklonalen Proteins, das durch die spezifische Bindung an ein Antigen gekennzeichnet ist.
Klonale Diversität
Eines der Merkmale eines polyklonalen Proteins ist, dass es aus einer Anzahl von einzelnen Proteinmolekülen besteht, wobei jedes Proteinmolekül homolog zu den anderen Molekülen des polyklonalen Proteins ist, aber ebenso eine Variabilität hat, die durch Unterschiede in der Aminosäuresequenz zwischen den einzelnen Mitgliedern des polyklonalen Proteins gekennzeichnet ist. Vorzugsweise sind die Unterschiede auf bestimmte Bereiche der Gesamtstruktur des polyklonalen Proteins beschränkt. Solche Bereiche sind z.B. der variable Bereich eines Antikörpers oder TcR, und sie sind möglicherweise weiterhin auf die CDR-Bereiche in diesen Bereichen beschränkt. Diese Variabilität kann auch als Diversität beschrieben werden, die sowohl auf Nucleinsäureebene als auch auf der funktionellen Ebene des Proteins, z.B. Spezifitäts- und Affinitätsunterschiede gegenüber einem Ziel, identifiziert werden kann.
Die klonale Diversität der Zelllinie kann durch RFLP (oder Sequenzieren von (RT)-PCR-Produkten) an isolierten Klonen aus einem Pool von Zellen, die ein rekombinantes polyklonales Protein exprimieren, analysiert werden. Die Diversität kann auch durch Funktionstests (z.B. ELISA) an dem rekombinanten polyklonalen Protein, das durch die Zelllinie hergestellt wurde, analysiert werden.
Eine klonale Tendenz (d.h. eine graduelle Veränderung in dem Gehalt der einzelnen Antikörper, die den polyklonalen Antikörper darstellen), wenn sie existiert, kann durch Vergleichen der klonalen Diversität der anfänglichen Bibliothek, die zur Transfektion verwendet wurde, mit der Diversität, die in dem Pool von Zellen (Zelllinie), die das rekombinante polyklonale Protein exprimieren, festgestellt wurde, bestimmt werden.
Die klonale Diversität eines polyklonalen Proteins, das von einer Zelllinie exprimiert wurde, kann als die Zielabdeckung durch das polyklonale Protein bewertet werden. In diesem Fall wird eine ausreichende Diversität als erreicht angesehen, wenn näherungsweise 25 bis 100% der gewünschten Zielmoleküle durch das polyklonale Protein gebunden werden. Z.B. im Fall eines polyklonalen Antikörpers stellt das Binden des Antikörpers an mindestens 25% der nicht-identischen Epitope auf der Oberfläche des Zielantigens eine ausreichende Diversität in der Zusammensetzung dar. Vorzugsweise ist die klonale Diversität durch Zielabdeckung mindestens 50% und sogar noch stärker bevorzugt mindestens 75%. Bei Antikörpern könnte eine solche Zielabdeckung z.B. durch Epitop-Kartierung bewertet werden.
Alternativ kann die klonale Diversität als die Verteilung einzelner Mitglieder der polyklonalen Zusammensetzung beurteilt werden. Diese Verteilung kann als die Gesamtzahl der verschiedenen einzelnen Mitglieder in der finalen polyklonalen Proteinzusammensetzung, verglichen mit der Anzahl der verschiedenen codierenden Sequenzen, die ursprünglich in die Zelllinie während der Transfektion eingeführt wurden, bewertet werden. In diesem Fall wird eine ausreichende Diversität als erreicht angesehen, wenn mindestens 50%, und vorzugsweise mindestens 75%, der codierenden Sequenzen, die ursprünglich in der Transfektion verwendet wurden, als unterschiedliche einzelne Mitglieder des finalen polyklonalen Proteins identifiziert werden können.
Die Verteilung der einzelnen Mitglieder der polyklonalen Zusammensetzung kann auch hinsichtlich der wechselseitigen (mutual) Verteilung zwischen den einzelnen Mitgliedern bewertet werden. In diesem Fall wird eine ausreichende klonale Diversität als erreicht angesehen, wenn kein einzelnes Mitglied der Zusammensetzung mehr als 75% der Gesamtanzahl der einzelnen Mitglieder in der finalen polyklonalen Proteinzusammensetzung ausmacht. Vorzugsweise überschreitet kein einzelnes Mitglied mehr als 50%, sogar noch stärker bevorzugt 25% und am stärksten bevorzugt 10% der Gesamtanzahl der einzelnen Mitglieder in der finalen polyklonalen Zusammensetzung. Die Bewertung der klonalen Diversität, basierend auf der Verteilung der einzelnen Mitglieder in der polyklonalen Zusammensetzung, kann mittels RFLP-Analyse, Sequenzanalyse und Proteinanalyse, wie die später beschriebenen Ansätze zur Charakterisierung einer polyklonalen Zusammensetzung, durchgeführt werden.
Die klonale Diversität kann als ein Ergebnis einer klonalen Tendenz (bias), die sich a) während des Klonierungsverfahrens, b) als ein Ergebnis von Unterschieden in der Zellproliferation bzw. -vermehrung, oder c) durch Scrambling mehrerer integraler Bestandteile ergeben kann, verringert werden. Wenn sich solche Tendenzen ergeben, kann jede dieser Quellen eines Verlustes klonaler Diversität leicht durch geringfügige Modifikationen der hierin beschriebenen Verfahren beseitigt werden.
Um die Bildung einer solchen Tendenz einzuschränken, die beim Klonierender variablen Domänen in die geeigneten Vektoren eingeführt wird, kann der Transfer der Gene von Inte resse aus einem Vektor in einen anderen in einer solchen Weise gestaltet werden, dass die Klonierungstendenz beschränkt wird. Massentransfertechniken und eine sorgfältige Auswahl des E. coli-Stammes, der für die Vervielfältigung verwendet wird, kann die Klonierungstendenz verringern. Eine andere Möglichkeit ist es, einen einzelnen Transfer jedes Polynucleotids, das für ein einzelnes Mitglied des polyklonalen Proteins codiert, zwischen Vektoren der Erfindung durchzuführen.
Es ist möglich, dass Unterschiede in den Zellproliferationsraten bzw. -vermehrungsraten der einzelnen Zellen in der Zelllinie über eine verlängerte Zeitdauer eine Tendenz in die rekombinante polyklonale Proteinexpression einbringen könnten, wobei die Anwesenheit einiger Mitglieder des rekombinanten polyklonalen Proteins, das durch die Zelllinie exprimiert wird, erhöht oder verringert wird. Ein Grund für solche Unterschiede in den Proliferations- bzw. Vermehrungsraten könnte sein, dass die Population von Zellen, die die Ausgangszelllinie darstellt, die für die Anfangstransfektion verwendet wird, heterogen ist. Es ist bekannt, dass sich einzelne Zellen in einer Zelllinie über eine verlängerte Zeitdauer unterschiedlich entwickeln. Um ein homogeneres Ausgangsmaterial sicherzustellen, kann eine Subklonierung der Zelllinie vor der Transfektion mit der Bibliothek von Interesse durchgeführt werden, wobei eine limitierende Verdünnung bzw. eine Vereinzelung durch Verdünnung (limiting dilution) der Zelllinie bis auf den Einzelzelllevel eingesetzt wird und indem jede einzelne Zelle zu einer neuen Population von Zellen wachsen gelassen wird (so genannte zelluläre Subklonierung durch limitierende Verdünnung). Eine oder mehrere dieser Populationen von Zellen wird bzw. werden, basierend auf ihren Proliferations- bzw. Vermehrungs- und Expressionseigenschaften als Ausgangsmaterial ausgewählt.
Weiterhin könnte der Selektionsdruck, der verwendet wird, um sicherzustellen, dass nur Zellen, die ortsspezifisch integrale Bestandteile aufgenommen haben, überleben werden, die Proliferations- bzw. Vermehrungsraten einzelner Zellen innerhalb einer polyklonalen Zelllinie beeinflussen. Dies könnte auf der Bevorzugung von Zellen beruhen, die bestimmte genetische Veränderungen durchmachen, um sich an den Selektionsdruck anzupassen. Somit könnte die Auswahl des Selektionsmarkers ebenfalls die proliferations- bzw. vermehrungsraten-induzierte Neigung beeinflussen. Falls dies auftritt, sollten verschiedene Selektionsmarker getestet werden. In Fällen, in denen die Selektion bzw. Auswahl auf einer Substanz basiert, die toxisch für die Zellen ist, sollte die optimale Konzentration sorgfältig ermittelt werden, sowie, ob die Selektion während der gesamten Produktionsdauer erforderlich ist oder nur in der Anfangsphase.
Ein zusätzlicher Ansatz, um eine gut definierte Zellpopulation sicherzustellen, ist es, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) nach den Transfektions- und Selektionsvorgehensweisen zu verwenden. Fluoreszenzmarkierte Antikörper können verwendet werden, um hochproduktive Zellen, die aus einem Pool von Zellen stammen, transfiziert mit IgG-Konstrukten, anzureichern (Brezinsky et al. J. 2003, Immunol. Methods 277, 141-155). Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um Zellen zu sortieren, die ähnliche Immunglobulinlevel exprimieren, wodurch eine hinsichtlich der Produktivität homogene Zellpopulation erzeugt wird. In gleicher Weise können durch Verwendung einer Markierung mit dem Fluoreszenzfarbstoff 5,6-Carboxylfluoresceindiacetatsuccinimidylester (CFSE) Zellen, die ähnliche Proliferations- bzw. Vermehrungsraten zeigen, mittels FACS-Verfahren ausgewählt werden.
Sogar wenn sich eine proliferations- bzw. vermehrungsraten-induzierte Tendenz entwickelt, muss der Verlust oder die Überrepräsentation einzelner Mitglieder in Abhängigkeit von den Diversitätsanforderungen des finalen rekombinanten polyklonalen Proteinprodukts und der Stabilität der Diversität über die Zeit nicht notwendigerweise kritisch sein.
Bei ortsspezifischen einzelnen integralen Bestandteilen werden sich die Zellen nur in der Sequenz der variablen Bereiche der Antikörper, die exprimiert werden sollen, unterscheiden. Daher werden die verschiedenen Zelleffekte, die durch Variation von Integrationsstelle und gen-regulatorischen Elementen eingeführt wurden, eliminiert und haben minimale Auswirkungen auf die Zellproliferations- bzw. Zellvermehrungsrate. Weder bei Scrambling noch bei Mehrfachintegrationen ist es wahrscheinlich, dass Probleme bei der Proliferations- bzw. Vermehrungsrate der Herstellungszelllinie verursacht werden, da diese seltene Ereignisse sind. Zufällige Integrationen treten allgemein mit einer Effizienz von näherungsweise 10^–5 auf, wohingegen eine ortsspezifische Integration mit einer Effizienz von näherungsweise 10^–3 auftritt. Wenn Mehrfachintegrationen unerwarteter Weise ein Problem aufwerfen sollten, besteht eine Alternative darin, die Transfektion mit der Bibliothek aus Vektoren von Interesse zu wiederholen, weil die Wahrscheinlichkeit, dass das Ereignis erneut auftritt, wie oben beschrieben, sehr gering ist. Zusätzliche Alternativen sind in Beispiel 3 unten beschrieben.
Ein anderes Verfahren zum Kontrollieren unerwünschter klonaler Tendenz ist es, die Transfektion mit der gesamten Bibliothek aus Vektoren von Interesse in mehreren Unter-Pools (sub-pools) durchzuführen oder den Zell-Pool zu einem frühen Zeitpunkt nach der Transfektion in Unter-Pools aufzuteilen. An diesem Punkt sollte die Tendenz noch nicht signifikant geworden sein, und es sollte statistisch möglich sein, Unter-Pools zu erzielen, denen Klone mit einem unerwünschten Proliferations- bzw. Vermehrungsvorteil fehlen. Der resultierende Ausschluss unerwünschter Klone muss in Übereinstimmung mit den Erfordernissen der Diversität in dem finalen rekombinanten polyklonalen Proteinprodukt sein. Unter Berücksichtigung der Statistik stellt eine Massentransfektion einer großen Anzahl von Zellen ebenfalls einen Weg dar, um eine ungewünschte klonale Tendenz zu umgehen. Bei diesem Ansatz wird eine Wirtszelllinie in Masse (in bulk) mit der Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen transfiziert. Eine solche Bibliothek stellt viele Kopien jedes bestimmten Mitglieds der Bibliothek dar. Diese Kopien sollten vorzugsweise in eine große Anzahl von Wirtszellen integriert werden. Vorzugsweise werden mindestens 100, 1000, 10.000 oder 100.000 einzelne Zellen mit Kopien bestimmter Mitglieder der Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen transfiziert. Somit sollten sich, wenn eine Bibliothek aus bestimmten varianten Nucleinsäuresequenzen aus 1000 bestimmten Mitgliedern zusammengesetzt ist, die jedes in 1000 einzelne Zellen integriert werden, 10⁶ Klone, die ein ortsspezifisch integriertes GOI enthalten, aus der Transfektion ergeben. Auf diese Weise sollte die Gauskurve der einzelnen Zellverdopplungsgeschwindigkeiten die allgemeine Population nur in sehr geringen Ausmaßen beeinflussen. Dies wird die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass die klonale Zusammensetzung über die Zeit konstant bleibt, sogar wenn ein geringer Prozentsatz der Herstellungszellen abweichende Wachstums- und/oder Expressionseigenschaften aufweisen sollte.
Alternativ kann die Bibliothek aus Vektoren von Interesse in Fraktionen aufgespalten werden, die näherungsweise 5 bis 50 einzelne Vektoren der Bibliothek enthalten. Vorzugsweise stellt eine Fraktion der Bibliothek 10 bis 15 einzelne Vektoren dar. Jede Fraktion wird dann in ein Aliquot von Zellen transfiziert. Die einzelne Aliquote von Zellen können dann eine Zeitlang überwacht werden, um zu sehen, ob sich in einem von ihnen eine klonale Tendenz entwickelt. Wenn dies geschieht, können solche Aliquots von Zellen herausgenommen werden, bevor die Sammlung von Zellen durch Vereinigung der verbleibenden Aliquots von Zellen wiederhergestellt wird. Gegebenenfalls werden die Aliquots von Zellen während der Produktion getrennt gehalten, und die polyklonale Antikörperzusammensetzung wird durch Kombinieren der Produkte jedes Aliquots anstelle der Aliquots von Zellen vor der Produktion zusammengesetzt. Es wird erwartet, dass die Anzahl von Reservoiren bzw. Pools, die gehandhabt werden können, zwischen 5 und 10 sein wird (siehe frühere Beschreibung von monoklonalen Antikörpern).
Alternativ kann ein Hochdurchsatzverfahren implementiert werden, in dem Zellen unter Vektoren und Zellen, die auf einzelnen Klonen aus der ursprünglichen Bibliothek aus Vektoren von Interesse basieren, getrennt transfiziert werden. Dies kann jede mögliche Tendenz zu einer Sequenz während der Transfektion und Integration eliminieren. Gegebenenfalls können die einzelnen Transfektanten genotypisiert werden, und ein vollständig verschiedener Pool von Zellen kann direkt vor der Produktion oder früher, falls geeignet, zusammengesetzt werden. Alternativ kann die einzelne Transfektion einer großen Zahl von Zellen, die viele Klone mit dem gleichen bestimmten Mitglied der Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen erzeugt, die gleichen statistischen Vorteile hervorbringen, die für die Massentransfektion beschrieben wurden, wenn die einzeln transfizierten Zellen vor der Herstellung des polyklonalen Proteins gepoolt werden.
Die Wirtszelle
Eine geeignete Wirtszelle umfasst in einem Bereich ihres Genoms eine oder mehrere geeignete Rekombinationsstellen, d.h. Nucleinsäuresequenzen, die durch ein oder mehrere Rekombinaseenzyme erkennbar sind. Um integrale Bestandteile (d.h. Zellen mit einer integrierten Kopie der Nucleinsäuresequenz von Interesse in einer Integrationsstelle) auswählen zu können, ist die Rekombinationsstelle funktionell mit einem ersten Selektionsgen (z.B. einem Antibiotikaresistenzgen) verknüpft, das 3' zur Rekombinationsstelle gelegen ist. Weiterhin können ein schwacher Promotor (z.B. ein verkürzter früher SV40-Promotor (SV40 early promoter)) und ein Transkriptionsstartcodon 5' zu der Rekombinationsstelle gelegen sein, die einen integralen Teil des resistenzmarker-codierenden Bereich darstellt. Somit initiiert das Transkriptionsstartcodon den Beginn der Transkription des Selektionsgens in der Wirtszelle vor der Transfektion mit der Bibliothek aus Expressionsvektoren, die für das polyklonale Protein codieren.
Wirtszellen zur ortsspezifischen Integration, wie oben beschrieben, können aus jeder Zelle erzeugt werden, die DNA in ihre Chromosomen integrieren kann oder extrachromosomale Elemente, wie Minichromosomen, YACs (künstliche Hefechromosomen), MACs (künstliche Mäusechromosomen) oder HACs (künstliche Human-Chromosomen) in sich behalten kann. MACs und HACs werden im Detail in WO 97/40183 beschrieben. Vorzugsweise werden Säugerzellen, wie CHO-Zellen, COS-Zellen, BHK-Zellen, Myelom-Zellen (z.B. Sp2/0 oder NS0-Zellen), Fibroblasten, wie NIH 3T3, und immortalisierte Humanzellen, wie HeLa-Zellen, HEK 293-Zellen oder PER.C6, verwendet. Jedoch können auch eukaryotische Nicht-Säugerzellen oder prokaryotische Zellen, wie Pflanzenzellen, Insektenzellen, Hefezellen, Pilze, E. coli etc., eingesetzt werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Zelllinie, die als Ausgangsmaterial verwendet werden soll, subkloniert, indem eine so genannte limitierende Verdünnung der Zelllinie bis zu einem Einzelzelllevel durchgeführt wird, gefolgt von Wachsenlassen jeder Einzelzelle bis zu einer neuen Population von Zellen vor der Transfektion mit der Bibliothek aus Vektoren von Interesse. Eine solche Subklonierung kann auch später in dem Verfahren des Auswählens bzw. Selektierens der richtigen Zelllinie durchgeführt werden, falls gewünscht.
Die Wirtszellen zur ortsspezifischen Integration können durch Transfektion mit einem zufällig integrierenden Plasmid erhalten werden, das einen schwachen Promotor (z.B. einen verkürzten frühen SV40-Promotor), ein Transkriptionsstartcodon, eine Rekombinationsstelle umfasst, die 3' zu dem Startcodon gelegen ist. Vorzugsweise umfasst das integrierende Plasmid auch ein Markergen, das an ein erstes Selektionsgen gekoppelt ist. Ein Beispiel eines solchen integrierenden Plasmids ist pFRT/LacZeo2 von Invitrogen (Carlsbad, CA). Das Markergen kann verwendet werden, um die relative Stärke der Expression an dem Ort im Genom, der zum Insertieren einer Nucleinsäuresequenz von Interesse verwendet wird, zu bewerten. Ein Markergen (z.B. Beta-Galactosidase (LacZ), grünes Fluoreszenzprotein (GFP) oder ein Zelloberflächenmarker) kann mit dem ersten Selektionsgen in einer Genfusion verknüpft sein oder transkriptionell über eine IRES (interne Ribosomen-Eintrittsstelle) verknüpft sein, so dass Co-Expression des ersten Selektionsgens und der Markergens auftritt. Die Verwendung eines Selektionsgens, das einen Überlebensdruck auf die Zellen ausübt (z.B. Wirkstoffresistenz oder Nährstoffabreicherung), kombiniert mit einem Marker, der die Bewertung der relativen Expressionslevel von Zelllinie zu Zelllinie erlaubt, ist ein effizientes Verfahren, um Zellen mit hoher Produktion zu gewährleisten, die das integrierte Plasmid innerhalb des Genoms behalten. Zellen mit der Rekombinationssequenz, die an einem Punkt mit besonders aktiver Transkription insertiert ist, werden zu starker Expression des Markergens, z.B. GFP oder LacZ, führen. Zellen mit starker Expression können durch fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren (FACS) ausgewählt werden und kloniert werden. An diesem Punkt sollte auch analysiert werden, ob der integrale Bestandteil ein einzelner integraler Bestandteil ist. Dies kann mittels Real-Time-PCR und Southern-Blotting durchgeführt werden.
Ein weiteres Verfahren zur Bewertung der relativen Expressionslevel von Zellen, die mit einem integrierenden Plasmid transfiziert sind, ist es, einen zusätzlichen Integrations-Ausschneide-Schritt bei den wie oben beschrieben erzeugten Zellen durchzuführen. Dieser Pool ausgewählter bzw. selektierter Zellen kann wieder mit einem Plasmid, das für eine Rekombinase codiert, die der Rekombinationsstelle des integrierenden Plasmids entspricht, und einem zweiten Plasmid, das einen zweiten Selektionsmarker ohne ein Startcodon enthält, transfiziert werden, wobei dessen codierendem Bereich eine Rekombinationssequenz vorausgeht, die gleichermaßen dem ersten integrierenden Plasmid entspricht. Dieses zweite Plasmid enthält auch die codierende Sequenz für ein Fluoreszenzmarkerprotein (z.B. GFP (oder äquivalente fluoreszente Proteine)), das durch einen Säugerpromotor gesteuert wird. Die Rekombinase vermittelt die Integration dieses Plasmids in das Wirtszellgenom, wo eine ähnliche Rekombinationssequenz zuvor durch das integrierende Plasmid insertiert wurde. Zellen mit der Rekombinationssequenz, die an einem Punkt mit besonders aktiver Transkription insertiert ist, werden zu einer starken Expression des Fluoreszenzproteins führen. Zellen mit starker Expression werden durch fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren (FACS) selektiert und werden kloniert. Klone mit gleich bleibend starker Expression, die eine Kopie des insertierten Plasmids enthalten, werden mit der Rekombinase transfiziert und durch den ersten Selektionsmarker ausgewählt, wobei Zellen identifiziert werden, bei denen die zweite Plasmidsequenz durch die Rekombinase entfernt wurde, was dazu führt, dass der erste Selektionsmarker wieder arbeitet. Diese Zellen enthalten noch immer die erste Rekombinationssequenz, die an einem Hotspot der Transkription insertiert ist, und können nun zur Expression der Gene von Interesse verwendet werden.
Zelllinien, die eine starke Expression des Markergens bei Integration einer einzelnen Kopie des Plasmids erreichen, werden zur Transfektion mit den Genen von Interesse verwendet. Die Rekombinationsstelle in der Wirtszelle ist vorzugsweise in einem Gen oder einem Bereich einer besonders aktiven Expression lokalisiert, d.h. in einem so genannten Hotspot.
Der Vektor für ortsspezifische Integration
Ein geeigneter Vektor umfasst eine geeignete Rekombinationsstelle, die mit einem geeigneten Selektionsgen verknüpft ist, das von dem Selektionsgen verschieden ist, das für die Konstruktion der Wirtszelle verwendet wird. Geeignete Selektionsgene zur Verwendung in der Säugerzellexpression schließen Gene, die eine Nährstoffselektion (nutritional selection) ermöglichen, wie das Thymidinkinase-Gen (TK), Glutaminsynthetase-Gen (GS), Tryptophansynthase-Gen (trpB) oder Histidinoldehydrogenase-Gen (hisD), ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Weitere Selektionsmarker sind Antimetabolit-Resistenzgene, die Wirkstoffresistenz verleihen, wie das Dihydrofolatreduktase-Gen (dhfr), nach dem mit einem Hypoxanthin- und Thymidin-Mangelmedium selektiert werden kann und nachdem weiterhin mit Methotrexat selektiert werden kann, das Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Gen (gpt), nach dem mit Mycophenolsäure Methotrexat selektiert werden kann, das Neomycinphosphotransferase-Gen (neo), nach dem mit G418 in einer eukaryothischen Zelle und Neomycin oder Kanamycin in prokaryotischen Zellen selektiert werden kann, das Hygromycin B-Phosphotransferase(hyg, hph, hpt)-Gen, nach dem mit Hygromycin selektiert werden kann, das Puromycin-N-Acetyltransferase-Gen (pac), nach dem mit Puromycin selektiert werden kann, oder das Blasticidin S-Deaminase- Gen (Bsd), das mit Blasticidin selektiert werden kann. Schließlich können auch Gene, die für Proteine codieren, die ein Sortieren, z.B. durch Durchlusszytometrie, ermöglichen, als Selektionsmarker verwendet werden, wie das grüne Fluoreszenzprotein (GFP), der Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor (NGFR) oder andere Membranproteine, oder beta-Galactosidase (LacZ).
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung geht dem selektierbaren Gen weder ein Promotor voraus, noch ist dieses mit einem translationsinitiierenden Codon ausgerüstet. Der Promotor und das ATG-Codon werden an der ausgewählten ortsspezifischen Rekombinationsstelle bereitgestellt. Wenn dieser Vektor an einem anderen Ort als der ausgewählten Rekombinationsstelle in das Genom der Wirtszelle integriert wird, kann aufgrund des Fehlens von Promotor und Startcodon keine Expression dieses zweiten Selektionsgens auftreten. Wenn eine Integration an der ausgewählten Rekombinationsstelle in das Genom der Wirtszelle auftritt, wird das zweite Selektionsgen exprimiert, und die Expression des ersten Selektionsgens geht verloren.
Die Integration kann z.B. durchgeführt werden, indem eine so genannte FRT-Stelle (5'-gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc-3' (SEQ ID NO 1) und Varianten davon) in dem Genom und auf dem Vektor zur ortsspezifischen Integration zusammen mit der Flp-Rekombinase oder Mutanten davon aus Saccharomyces cerevisiae verwendet wird. Jedoch können andere Rekombinase-Systeme genauso gut verwendet werden, einschließlich jener der Cre-Rekombinase und einer Vielzahl von lox-Stellen, wie loxP aus dem Bakteriophagen P1 oder Varianten oder Mutanten davon, z.B. lox66, lox71, lox76, lox75, lox43, lox44 und lox511 (C. Gorman und C. Bullock, Curr. Opinion in Biotechnology 2000, 11: 455-460), oder indem Phagen-Integrase ΦC31 oder Lambda-Integrase verwendet wird, die eine Rekombination zwischen der attP-Stelle und der attB-Stelle durchführt (A.C. Groth et al. PNAS 2000, 97: 5995-6000). Weitere Rekombinase-Systeme, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden könnten, sind, aber sind nicht darauf beschränkt, das β-Rekombinase-Six-System aus dem Bakterienplasmid pSM19035, das Gin-Gix-System aus dem Bakteriophagen Mu oder das R-RS-System aus Zygosaccharomyces rouxii.
Eine weitere Variante zu dem ortsspezifischen Rekombinationssystem ist es, nicht-homologe Rekombinationsstellen zu verwenden. In einem solchen System werden zwei nicht identische Rekombinationsstellen in das Wirtsgenom zur Erzeugung spezifischer Zielstellen eingeführt. Rekombinationsstellen, die jenen entsprechen, die die Zielstelle flankieren, flankieren auch das Konstrukt, das das Gen von Interesse enthält. Ein solches System wurde in der WO-Schrift 99/25854 beschrieben, die hierdurch in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme einge schlossen ist. Es wurde gezeigt, dass die Verwendung nicht-homologer Rekombinationsstellen das Ausschneiden des GOI aus dem Chromosom unterdrückt. Die nicht identischen Rekombinationsstellen können aus jeder der oben beschriebenen Rekombinationsstellen aufgebaut sein, solange die zugehörigen Rekombinasen bereitgestellt werden. Z.B. könnten nicht identische Rekombinationsstellen aus einer FRT-Stelle und einer Mutanten-FRT-Stelle, wobei eine Flp-Rekombinase zur Integration eingesetzt wird, oder aus einer FRT-Stelle und einer loxP-Stelle bestehen, wobei Flp und Cre-Rekombinasen zur Integration eingesetzt werden.
Weiterhin wurde ein System, das zwei verschiedene FRT-Stellen verwendet, in Verhoeyen et al., Hum. Gene Ther. 2001 12, 933-44 beschrieben. In diesem Ansatz wird das integrierende Plasmid durch retrovirale Infektion in die Zellen transferiert. Das Plasmid besteht aus einer Kombination eines Reportergens und eines ersten Selektionsmarkergens sowie den retroviralen Elementen, die für die Infektion benötigt werden. Das retrovirale 3'LTR enthält zwei verschiedene FRT-Stellen. Ein nicht-funktionelles zweites Selektionsmarkergen, dem ein Promotor und das translationsinitiierende Codon fehlt, ist 3' zu diesen Stellen lokalisiert. Während des Prozesses der retroviralen Infektion wird die 3'LTR-Sequenz zu dem 5'LTR kopiert. Dieses resultiert in der Flankierung des Reportergens und des ersten Selektionsmarkergens durch zwei verschiedene FRT-Stellen auf jeder Seite. Die Sequenz zwischen den äußeren FRT-Stellen kann gegen ein GOI unter Kontrolle eines starken Promotors ausgetauscht werden. Die Kassette, die das GOI enthält, wird durch den gleichen Satz von FRT-Stellen flankiert. Die Reaktion wird durch die Flp-Rekombinase katalysiert. In dem transfizierten Austauschplasmid sind ein IRES-Element und ein translationsinitiierendes Codon weiter stromabwärts von dem GOI lokalisiert. Nach Ersetzen der integrierten Kassette wird das nicht-funktionelle Selektionsmarkergen, das in der 3'LTR-Sequenz außerhalb der FRT-Stellen lokalisiert ist, durch das translationsinitiierende Codon aktiviert, das durch die das GOI darstellende Kassette bereitgestellt wird. Der Austauschzustand kann weiter angereichert werden, wenn ein negativer Selektionsmarker (z.B. Thymidinkinase) in dem integrierenden Sektor vorhanden ist.
Der integrierende Vektor kann auch durch Standardtransfektion in die Wirtszellen transferiert werden. In diesem Fall wird die integrierende Kassette durch ein FRT an dem 5'-Ende und eine verschiedene FRT'-Stelle an dem 3'-Ende flankiert. Das zweite Resistenzmarkergen mit fehlendem ATG ist weiter stromabwärts von der 3'-FRT'-Stelle positioniert. Der Austausch gegen ein GOI läuft, wie für das retrovirale System beschrieben, ab.
Ein anderes System, das das Ausschneiden des GOI nach seiner ortsspezifischen Integration in das Chromosom verhindert, ist die ΦC31-Integrase, die ebenfalls oben erwähnt wurde.
Dieses System wurde genauestens in den Patentanmeldungen WO 01/07572 und WO 02/08409 beschrieben.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst der Vektor für die ortsspezifische Integration des Gens von Interesse weiterhin DNA, die für ein Mitglied des rekombinanten polyklonalen Proteins von Interesse codiert, der gegebenenfalls ihr eigener Säuger-Promotor vorausgeht, der die Expression des Proteins steuert. Wenn ein Mitglied des rekombinanten polyklonalen Proteins von Interesse mehr als eine Proteinkette umfasst, z.B. wenn das Mitglied ein Antikörper oder T-Zellrezeptor ist, kann der DNA, die für die Ketten des Proteins codiert, ihr eigener Säugerpromotor vorausgehen, der hohe Expressionslevel (bidirektional oder unidirektional, siehe 1 bzw. 2) von jeder der Ketten einregelt. Bei einer bidirektionalen Expression kann eine Kopf-an-Kopf-Promotorkonfiguration in dem Expressionsvektor verwendet werden, und für eine unidirektionale Expression können zwei Promotoren oder ein Promotor, kombiniert mit z.B. einer IRES-Sequenz, für die Expression verwendet werden. Geeignete Kopf-an-Kopf-Promotorkonfigurationen sind z.B., sind aber nicht darauf beschränkt, der AdMLP-Promotor zusammen mit dem Maus-Metallothionein-1-Promotor in beiden Orientierungen, der AdMLP-Promotor zusammen mit dem Elongationsfaktor-1-Promotor (elongation factor-1 promoter) in beiden Orientierungen oder der CMV-Promotor zusammen mit dem MPSV-Promotor in beiden Orientierungen.
Eine Nucleinsäuresequenz, die für eine funktionelle Leit- bzw. Signalsequenz codiert, kann in den Expressionsvektor eingeschlossen sein, um das Genprodukt zu dem endoplasmatischen Reticulum oder einem speziellen Ort innerhalb der Zelle, wie einer Organelle, zu leiten. Ein starkes Polyadenylierungssignal kann 3' von der proteincodierenden DNA-Sequenz gelegen sein. Das Polyadenylierungssignal stellt den Abbruch sicher, und die Polyadenylierung des entstehenden RNA-Transkripts steht mit der Nachrichtenstabilität (message stability) in Zusammenhang. Die DNA, die für ein Mitglied des rekombinanten polyklonalen Proteins von Interesse codiert, kann z.B. sowohl für die schweren als auch die leichten Ketten eines Antikörpers oder Antikörperfragments codieren, wobei jeder Gensequenz ggf. ihre eigenen Säuger-Promotorelemente vorausgehen und/oder ihnen starke Poly A-Signale folgen, welche einen hohen Expressionslevel jeder der zwei Ketten einregeln.
Der Expressionsvektor zur ortsspezifischen Integration kann zusätzliche transkriptionsregulierende Elemente, wie Verstärker bzw. Enhancer oder UCOE (ubiquitäre chromatinöffnende Elemente) (ubiquitous chromatin opening elements), für eine erhöhte Expression an der Stelle der Integration tragen. Verstärker sind Nucleinsäuresequenzen, die spezifisch mit zellulä ren Proteinen Wechselwirken, die an der Transkription beteiligt sind. Die UCOE öffnen Chromatin oder halten Chromatin in einem offenen Zustand und ermöglichen bzw. erleichtern eine reproduzierbare Expression eines funktionell verknüpften Gens (detaillierter in WO 00/05393 beschrieben). Wenn eines oder mehrere der oben beschriebenen regulatorischen Elemente in das Chromosom einer Wirtszelle integriert wird/werden, werden sie als heterologe regulatorische Elemente bezeichnet.
Etablieren eines Expressionssystems für Proteine mit hohem Expressionslevel
Verfahren zum Einführen einer Nucleinsäuresequenz in eine Zelle sind im Stand der Technik bekannt. Diese Verfahren schließen typischerweise die Verwendung eines DNA-Vektors ein, um die Sequenz von Interesse in die Zelle, das Genom oder ein extrachromosomales Element einzuführen. Die Transfektion von Zellen kann durch eine Anzahl von Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, erzielt werden, einschließlich Calciumphosphatpräzipitation, Elektroporation, Mikroinjektion, Liposomenfusion, RBC-Ghost-Fusion, Protoplastenfusion und dergleichen.
Für die Transfektion einer Wirtszelllinie wird eine Bibliothek aus Vektoren von Interesse, wobei jeder Vektor nur eine Kopie einer Nucleinsäuresequenz umfasst, die für ein Mitglied eines rekombinanten polyklonalen Proteins von Interesse codiert, verwendet. Diese Bibliothek aus Expressionsvektoren von Interesse codiert in ihrer Gesamtheit für das rekombinante polyklonale Protein von Interesse. Geeignete Vektoren für die ortsspezifische Integration wurden in dem vorausgehenden Abschnitt beschrieben. Die einzelnen Vektoren, die die Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen von Interesse darstellen, können entweder zusammen in eine einzelne Zusammensetzung gemischt werden, oder die einzelnen Vektoren, die für jedes Bibliotheksmitglied codieren, können in getrennten Zusammensetzungen oder in Gemischen von näherungsweise 5 bis 50 einzelnen Vektoren der Bibliothek in einer Zusammensetzung gehalten werden.
Die Erzeugung einer rekombinanten polyklonalen Herstellungszelllinie und die Produktion eines rekombinanten polyklonalen Proteins aus einer solchen Zelllinie kann durch einige verschiedene Transfektions- und Herstellungsstrategien erreicht werden. Diese Strategien sind in 3 umrissen. Ein Weg besteht darin, zur Transfektion einer Wirtszelllinie eine Bibliothek von Vektoren zu verwenden, die in eine einzelne Zusammensetzung zusammengemischt sind. Dieses Verfahren wird Massentransfektion (bulk transfection) oder Transfektion in Masse (transfection in bulk) genannt. Allgemein werden der zuvor beschriebene Vektor- und Wirtszellaufbau sicherstellen, dass eine polyklonale Zelllinie bei geeigneter Auswahl bzw. Selektion erhalten werden wird. In einer solchen Zelllinie hat eine Mehrheit der einzelnen Zellen eine Kopie eines Nucleinsäuremoleküls, das für ein bestimmtes Mitglied eines rekombinanten polyklonalen Proteins codiert, aus einer Bibliothek aus Nucleinsäuresequenzen von Interesse in das Genom integriert. Die einzelne Kopie der Nucleinsäuresequenz ist an einer einzelnen spezifischen Stelle des Genoms jeder Zelle in der Sammlung von Zellen integriert, wodurch eine polyklonale Zelllinie erzeugt wird, die aus einzelnen Zellen besteht, die einzelne Mitglieder des polyklonalen Proteins von Interesse exprimieren. Ein tiefgefrorener Bestand bzw. eine tiefgefrorene Stammkultur der polyklonalen Zelllinie wird vor Beginn der Herstellung des rekombinanten polyklonalen Proteins erzeugt.
Ein anderer Weg besteht darin, zur Transfektion eine Bibliothek von Vektoren zu verwenden, die in Fraktionen aufgeteilt ist, welche näherungsweise 5 bis 50 einzelne Vektoren der Bibliothek in einer Zusammensetzung enthalten. Vorzugsweise besteht eine Fraktion der Bibliothek aus 10 bis 20 einzelnen Vektoren. Jede Zusammensetzung wird dann in ein Aliquot von Wirtszellen transfiziert. Dieses Verfahren wird Semi-Massentransfektion (semi-bulk transfection) genannt. Die Anzahl transfizierter Aliquots wird von der Größe der Bibliothek und der Anzahl der einzelnen Vektoren in jeder Fraktion abhängen. Wenn die Bibliothek z.B. aus 100 bestimmten varianten Mitgliedern besteht, die in Fraktionen aufgeteilt sind, die 20 bestimmte variante Mitglieder in einer Zusammensetzung enthalten, müssten 5 Aliquots von Wirtszellen mit einer Bibliothekszusammensetzung transfiziert werden, die eine bestimmte Fraktion der Originalbibliothek enthält. Die Aliquots von Wirtszellen werden für ortsspezifische Integration ausgewählt. Vorzugsweise werden die bestimmten Aliquots getrennt ausgewählt. Jedoch können sie auch vor der Auswahl bzw. Selektion vereinigt bzw. gepoolt werden. Die Aliquots können hinsichtlich ihrer klonalen Diversität analysiert werden, und nur diejenigen mit ausreichender Diversität werden verwendet werden, um eine polyklonale GOI-Bibliotheksstammkultur bzw. einen polyklonalen GOI-Bibliotheksbestand zu erzeugen. Um die gewünschte polyklonale Zelllinie zur Herstellung zu erhalten, können die Aliquots vor dem Erzeugen des Gefrierbestands bzw. der Gefrierstammkultur vermischt werden, unmittelbar nachdem sie aus dem Bestand bzw. der Stammkultur wiedergewonnen wurden oder nach einer kurzen Proliferations- bzw. Vermehrungs- und Anpassungszeit. Gegebenenfalls werden die Aliquots von Zellen während der ganzen Produktion getrennt gehalten, und die polyklonale Proteinzusammensetzung wird durch Kombinieren der Produkte jedes Aliquots anstelle der Aliquots von Zellen vor der Produktion zusammengesetzt.
Ein dritter Weg ist ein Hochdurchsatzverfahren, in dem Wirtszellen getrennt unter Verwendung einzelner Vektoren, die die Bibliothek vor Interesse darstellen, transfiziert werden. Dieses Verfahren wird Einzeltransfektion genannt. Die einzeltransfizierten Wirtszellen werden vorzugsweise getrennt für eine ortsspezifische Integration ausgewählt. Sie können jedoch auch vor der Auswahl bzw. Selektion gepoolt werden. Die einzelnen Zellklone, die bei der Auswahl bzw. Selektion erzeugt wurden, können hinsichtlich der Proliferations- bzw. Vermehrungszeit und dem Integrationsmuster analysiert werden, und vorzugsweise werden jene mit ähnlichen Wachstumsraten und einer einzelnen ortsspezifischen Integration verwendet, um eine polyklonale GOI-Bibliotheksstammkultur bzw. einen polyklonalen GOI-Bibliotheksbestand zu erzeugen. Die einzelnen Zellklone können vor der Erzeugung der Stammkultur bzw. des Bestandes gemischt werden, um die gewünschte polyklonale Zelllinie zu erhalten, unmittelbar nachdem sie aus der Stammkultur wiedergewonnen wurden oder nach einer kurzen Proliferations- bzw. Vermehrungs- und Anpassungszeit.
Dieser Ansatz kann jede mögliche verbleibende Tendenz zu einer Sequenz während der Transfektion, Integration und Auswahl bzw. Selektion eliminieren. Alternativ werden die einzeln transfizierten Wirtszellen gemischt, bevor die Auswahl bzw. Selektion durchgeführt wird, dies wird die Kontrolle der Tendenz zu einer Sequenz infolge der Transfektion ermöglichen.
Ein gemeinsames Merkmal bei den Herstellungsstrategien, die oben umrissen sind, ist, dass alle einzelnen Mitglieder, die das rekombinante polyklonale Protein darstellen, in einem Bioreaktor oder einer begrenzten Anzahl von Bioreaktoren, mit ungefähr 10 als dem Maximum, hergestellt werden können. Der einzige Unterschied ist die Stufe, bei der jemand entscheidet, die Sammlung von Zellen zu erzeugen, die die rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie herstellt.
Die Wirtszelllinie, die für die Expression und Produktion eines rekombinanten polyklonalen Proteins von Interesse verwendet werden soll, hat ein oder mehr Nucleinsäuremoleküle, das/die durch ein Rekombinaseenzym/durch Rekombinaseenzyme erkennbar ist/sind (z.B. zuvor hergestellte Zellen, die eine FRT-Stelle an einem vorher festgelegten Ort in dem Genom haben, wie z.B. in US 5,677,177 beschrieben).
Der Vektor zur ortsspezifischen Integration wird vorzugsweise in einem zuvor definierten genomischen Locus integriert, der einen hohen Expressionslevel vermittelt, ein so genannter Hotspot.
Wenn die Expressionslevel erhöht werden müssen, kann eine Genvervielfältigung unter Verwendung einer Selektion nach einem DHFR-Gen oder einem Glutaminsynthetase(GS)-Gen durchgeführt werden. Dies erfordert die Verwendung von Vektoren, die einen solchen Selektionsmarker umfassen.
Für die Herstellung eines polyklonalen Proteins, wobei jedes Proteinmitglied aus mehr als zwei Polypeptidketten besteht, könnte die Kombination der Ketten von Wichtigkeit für die Affinität, Spezifität und Aktivität des Proteins, welches sie bilden, sein. Dies wird z.B. bei Antikörpern und TcRs beobachtet. Zum Beispiel ist bekannt, dass die Kombination der variablen schweren Kette eines Antikörpers und der variablen leichten Kette eines Antikörpers die Affinität und Spezifität eines Antikörpers, der aus den Ketten gebildet wird, beeinflusst. Somit ist es wünschenswert, wenn eine Bibliothek aus Antikörper-codierenden Sequenzen aufgrund ihrer Fähigkeit, Antikörper mit Affinität zu einem bestimmten Ziel zu produzieren, ausgewählt wurde, sicherzustellen, dass die Kombination der variablen schweren Kette und der variablen leichten Kette in dem Endprodukt diesem entspricht. Aus diesem Grund werden die Polypeptidketten, die ein einzelnes Mitglied des polyklonalen Proteins darstellen, in dem gleichen zur Integration verwendeten Vektor platziert, wodurch sichergestellt wird, dass sie während des gesamten Verfahrens zusammengehalten werden.
Die folgende Beschreibung ist ein Beispiel, wie eine rekombinante polyklonale antikörper-exprimierende Zelllinie erhalten wird, wobei das Scrambling der Ketten minimal ist, falls überhaupt vorhanden.
Eine universelle Promotorkassette zur konstitutiven Expression mit zwei Promotoren, die in entgegengesetzter Transkriptionsrichtung platziert wurden, wie eine Kopf-an-Kopf-Konstruktion, umgeben von der variablen schweren Kette, und die gesamte leichte Kappa-Kette wurden konstruiert, was den Transfer des gesamten Konstrukts in einen Vektor zur ortsspezifischen Integration ermöglicht, wobei der Vektor eine FRT-Stelle und ein Hygromycin-Resistenzgen und die konstante Region der schweren Kette umfasst. Es wird in Erwägung gezogen, dass eine Promotorkassette zur induzierbaren Expression ebenfalls verwendet werden kann. Darüber hinaus können die Promotoren Ende-an-Ende (tail-to-tail), was in einer Transkription in entgegengesetzter Richtung resultieren wird, oder Ende-an-Kopf (tail-to-head) für unidirektionale Transkription platziert sein. CHO-Flp-In-Zellen (Invitrogen, Carlsbad, CA), die stabil das lacZ-Zeocin-Fusionsgen exprimieren, wurden für den Versuch verwendet, dass die Zellen resistent gegen das Antibiotikum Zeocin macht. Die Zellen wurden in einem zeocin-haltigen Medium gehalten. Die Zellen wurden in Masse mit der Bibliothek aus Vektoren zur ortsspezifischen Integration, die für den polyklonalen Antikörper codieren, und einem unterschiedlichen Selektionsmarker (Hygromycin-Phosphotransferase) zusammen mit einem Plas mid, das die Flp-Rekombinase exprimiert, transfiziert. Ein induzierbarer Promotor kann ebenfalls zur Kontrolle der Expression verwendet werden. Nach der Transfektion wurden die Zellen in Gegenwart von Hygromycin kultiviert. Zellen, die gegen Hygromycin resistent waren, wurden nachfolgend in verschiedenen Kultursystemen, wie konventionelle kleine Kulturkolben, mehrschichtige Zellfabriken von Nunc (Nunc multilayer cell factories), kleine Bioreaktoren mit hoher Ausbeute (MiniPerm, INTEGRA-CELLLine) und Rührkolben (spinner flasks) bis hin zu Hohlfaser- und Bioreaktoren, wachsen gelassen. Die Zellen wurden unter Verwendung von ELISA auf Antikörperproduktion hin überprüft. Polyklonale Zelllinien wurden aufgrund ihrer Lebensfähigkeit bei Wachstum in Suspension in serumfreiem Medium ohne Selektionsdruck bei verlängerten Zeitdauern ausgewählt. Stammkulturen bzw. Bestände von Zelllinien wurden in Gegenwart von Hygromycin wachsen gelassen.
Bewertung der Erhaltung der Polyklonalität in dem Expressionssystem
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es häufig wichtig, sicherzustellen, dass die Polyklonalität in dem Expressionssystem nicht schwerwiegend während der Produktion verändert wird, so dass es möglich ist, die Produktion zu stoppen, wenn die Polyklonalität tatsächlich verändert wird. Dies wird gemäß der Erfindung durch Überwachen der relativen Expressionslevel der varianten Nucleinsäuresequenzen durchgeführt. Die Expressionslevel können z.B. auf mRNA-Ebene unter Verwendung von z.B. RFLP-Analyse, Arrays oder Real-Time-PCR oder auf der Proteinebene unter Verwendung von z.B. zweidimensionaler Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Massenspektrometrie oder verschiedenen chromatographischen Techniken durchgeführt werden. Mit diesen Techniken wird es möglich sein, einen Basislinienwert für eine Anzahl all der einzelnen Expressionslevel zu etablieren und dann während der Produktion Proben aus der Kultur zu entnehmen, um zu beurteilen, ob sich die Expressionslevel verändert haben (sowohl gesamt als auch relativ). Bei der normalen Anwendung der Erfindung kann ein Wertebereich, der die Basislinienwerte umgibt, etabliert werden und, wenn festgestellt wird, dass die relativen Expressionslevel außerhalb der Bereiche liegen, dann wird die Produktion abgebrochen.
Um in der Lage zu sein, die Stabilität und Reproduzierbarkeit des Expressionssystems zu bewerten, wurden Vektoren, die für sechs bestimmte Fab-Fragmente (die Mini-Six-Bibliothek) mit Reaktivität gegen Hühner-Ovalbumin (OVA), alkalische Phosphatase (AP) vom Rind, Human-β₂-Mikroglobulin (β₂m), Human-Haptoglobin (HAP), Human-Faktor VIII (FVIII) und Hühnereiweiß-Lysozym (LYS) codieren, hergestellt. Die verschiedenen Fab-Fragment-codierenden Sequenzen sind nicht identisch und weisen daher verschiedene RFLP- Muster auf, wobei RFLP zum Analysieren der Genotyp-Zusammensetzung verwendet werden kann.
Die Mini-Six-Bibliothek wurde in CHO-Flp-In-Zellen durch Transfektion unter Verwendung eines Expressionsvektors mit einer Kopf-an-Kopf-Promotorkassette eingeführt. Die CHO-Flp-In-Zellen wurden entweder in Masse mit einem Gemisch aus Expressionsvektoren von Interesse, die für die sechs bestimmten Antikörper codieren, transfiziert, was in einer polyklonalen Zelllinie, die die sechs Antikörper in bekannter Kombination exprimiert, resultierte, oder die Zellen wurden einzeln mit einem Mitglied der Expressionsbibliothek von Interesse transfiziert, gefolgt von Mischen der transfizierten Zellen, was eine rekombinante polyklonale Antikörper-Expressionszelllinie, die die sechs Antikörper in bekannter Kombination exprimiert, erzeugt. In dieser Weise war es möglich, zu testen, ob die Transfektion der Säugerzellen auftritt, ohne dass eine Tendenz zu einem oder mehreren einzelnen Klonen der rekombinanten polyklonalen Antikörper-Expressionszelllinie erzeugt wird. Darüber hinaus war es möglich, auf eine Tendenz bei der Proliferation bzw. Vermehrung und auf eine Tendenz, die durch die Aufreinigung der polyklonalen Zusammensetzung von Antikörpern verursacht wird, zu prüfen.
Etablierung einer rekombinanten polyklonalen Anti-Ovalbumin-Antikörper-Herstellungszelllinie
Ovalbumin-bindende Phagen-Klone wurden unter Verwendung von Phagendisplay und ELISA zum Identifizieren der relevanten Klone ausgewählt. Zwei Versuchsanordnungen wurden zum Identifizieren von Antikörpern von den Ovalbumin-bindenden Klonen verwendet, d.h. ELISA-Platten, die mit Ovalbumin beschichtet waren, oder ein Screeningverfahren mit hoher Dichte (high density screening method) (HDS), das auf der Immobilisierung von Ovalbumin auf PVDF-Membranen basiert. Auf diese Weise wurde eine Gruppe von Antikörpern erhalten, von denen manche auf der ELISA-Platte immobilisiertes Ovalbumin erkennen und andere auf der PVDF-Membran immobilisiertes Ovalbumin erkennen.
Die ausgewählten Ovalbumin-bindenden Phagen-Klone können ihre DNA-Sequenzen für die variable schwere und Kappa-Kette an Säugerpromotoren gebunden haben und in einen Vektor des pSymvc20-Typs (4D) zur Antikörperexpression transferiert haben, wodurch eine Sammlung von Klonen des pSymvc21-Typs (4E) erzeugt wird. Die CHO-Flp-In-Zellen werden entweder in Masse mit einem Gemisch der pSymvc21-Klone transfiziert oder die Zellen werden einzeln mit einem pSymvc21-Antikörper-exprimierenden Plasmid transfiziert, gefolgt von Mischen der transfizierten Zellen, die die anderen Ovalbumin-bindenden Antikörper exprimieren. Die Vorgehensweise des Erzeugens einer polyklonalen Anti-Ovalbumin- Antikörper produzierenden Zelllinie kann durch DNA-Sequenzierung, TagMan-PCR und RFLP-Analyse der einzelnen Antikörper-exprimierenden Zellen, sowie durch ELISA, 2-dimensionale(2D)-Flüssigchromatographie (LC) und Massenspektrometrie (MS) der produzierten Antikörpermischung überwacht werden.
Kultivierung von Zellen und Herstellung eines rekombinanten polyklonalen Antikörpers
Die wie oben beschrieben hergestellte polyklonale Zelllinie wird in geeigneten Medien unter geeigneten Bedingungen zur Expression des polyklonalen Proteins von Interesse, das durch die varianten Nucleinsäuresequenzen, die in das Genom der Zellen insertiert sind, codiert wird, wachsen gelassen. Die Zellkultivierung kann in mehreren Schritten durchgeführt werden. Ein erster Schritt ist, die polyklonale Zelllinie hinsichtlich ortsspezifischer integraler Bestandteile auszuwählen. Wenn Säugerzellen verwendet werden, dann werden die ausgewählten Zellen vorzugsweise an das Wachstum in Suspension sowie an serumfreie Bedingungen angepasst. Dies kann in ein oder zwei Schritten und mit oder ohne Selektionsdruck durchgeführt werden. Wenn die polyklonale Zelllinie an geeignete Bedingungen angepasst ist, kann mit der Maßstabsvergrößerung (scaling up) begonnen werden. An diesem Punkt kann eine Arbeitszellenstammkultur eingefroren werden. Vorzugsweise werden Bioreaktoren mit 30 bis 100 Litern verwendet, aber kleinere oder größere Bioreaktoren können eingesetzt werden. Die geeignete Herstellungszeit und die Auswahl der Bioreaktorgröße sind abhängig von der gewünschten Proteinausbeute aus der Charge und den Expressionsleveln aus der Zelllinie. Die Zeiten können von ein paar Tagen bis zu drei Monaten variieren. Das exprimierte rekombinante polyklonale Protein wird aus den Zellen oder dem Überstand isoliert. Das rekombinante Protein wird gemäß den Vorgehensweisen, die einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, aufgereinigt und charakterisiert. Beispiele von Aufreinigungs- und Charakterisierungsvorgehensweisen sind unten aufgelistet.
Aufreinigung eines rekombinanten polyklonalen Proteins aus dem Kulturüberstand
Die Isolierung spezieller Proteine aus Kulturüberständen ist unter Verwendung verschiedener chromatographischer Techniken möglich, die Unterschiede in den physikochemischen Eigenschaften von Proteinen verwenden, z.B. Unterschiede im Molekulargewicht, in der Nettoladung, der Hydrophobie oder der Affinität gegenüber einem speziellen Liganden oder einem speziellen Protein. Proteine können somit gemäß dem Molekulargewicht unter Verwendung von Gelfiltrationschromatographie oder gemäß der Nettoladung unter Verwendung von Ionenaustausch(Kation/Anion)-Chromatographie oder alternativ unter Verwendung von Chromatofokussierung getrennt werden. In ähnlicher Weise können Proteine nach der Hyd rophobie unter Verwendung von hydrophober Interaktionschromatographie oder durch Affinitätschromatographie, welche die Unterschiede in der Affinität gegenüber einem speziellen immobilisierten Liganden oder Protein ausnützt, getrennt werden. Die Trennung komplexer Proteingemische kann somit durch aufeinanderfolgende Kombination verschiedener chromatographischer Prinzipien erzielt werden. Ein Proteingemisch kann somit anfänglich gemäß z.B. der Nettoladung unter Verwendung von Ionenaustauschchrumatographie aufgetrennt werden, und Proteine mit ähnlicher Nettoladung können nachfolgend gemäß dem Molekulargewicht unter Verwendung von Gelfiltrationschromatographie oder nach der Hydrophobie unter Verwendung von hydrophober Interaktionschromatographie in Gegenwart einer hohen Konzentration eines ausgewählten Salzes getrennt werden.
Affinitätschromatographie, kombiniert mit nachfolgenden Aufreinigungsschritten, wie Ionenaustauschchromatographie, hydrophober Interaktionschromatographie und Gelfiltration, wurde häufig zur Aufreinigung von IgG (polyklonal sowie monoklonal) und TcR aus verschiedenen Quellen, z.B. Ascitesflüssigkeit, Zellkulturüberständen und Serum verwendet. Affinitätsaufreinigung, bei der die Trennung auf einer reversiblen Wechselwirkung zwischen dem/den Protein/Proteinen und einem spezifischen Liganden, der an eine chromatographische Matrix gekoppelt ist, basiert, ist ein einfaches und schnelles Verfahren, das hohe Selektivität, gewöhnlich hohe Kapazität und eine Aufkonzentration in einem kleineren Volumen bietet. Protein A und Protein G, zwei bakterielle Zelloberflächenproteine, haben eine hohe Affinität für den F_C-Bereich und wurden in einer immobilisierten Form für viele Routineanwendungen, einschließlich der Aufreinigung von polyklonalem IgG und seinen Unterklassen aus verschiedenen Spezies und der Absorption und Aufreinigung von Immunkomplexen, verwendet.
Auf die Affinitätschromatographie können chromatographische Aufarbeitungsschritte (downstream chromatography steps), z.B. Anionenaustausch- und/oder hydrophobe Interaktionschromatographie, durchgeführt werden, um die Wirtszellenproteine, ausgewaschenes bzw. ausgeblutetes Protein A und DNA zu entfernen.
Gelfiltration, als ein letzter Aufreinigungsschritt, kann verwendet werden, um kontaminierende Moleküle, wie Dimere und andere Aggregate, zu entfernen und die Probe in einen Lagenpuffer zu übertragen. Abhängig von der Quelle und den Expressionsbedingungen kann es notwendig sein, einen zusätzlichen Aufreinigungsschritt einzuschließen, um den erforderlichen Antikörperreinheitsgrad zu erreichen. Hydrophobe Interaktionschromatographie oder Anionenaustauscherchromatographie werden somit häufig in Kombination mit Protein A- und Gelfiltra tionschromatographie verwendet, um Antikörper zur therapeutischen Verwendung aufzureinigen.
Um andere Antikörperklassen zu reinigen, müssen alternative Affinitätschromatographiemedien verwendet werden, da die Proteine A und G IgA und IgM nicht binden. Eine Immunoaffinitätsaufreinigung kann verwendet werden (monoklonale Anti-IgA- oder Anti-IgM-Antikörper, die an eine Festphase gekoppelt sind), oder alternativ können mehrstufige Aufreinigungsstrategien, einschließlich Ionenaustausch und hydrophober Interaktion, eingesetzt werden.
Strukturcharakterisierung
Die Strukturcharakterisierung polyklonaler Proteine, wie Antikörper und TcRs, erfordert eine hohe Auflösung aufgrund der Komplexität des Gemisches (klonale Diversität und Glycosylierung). Traditionelle Ansätze, wie Gelfiltration, Interaktionschromatographie oder Elektrophorese können eine nicht ausreichende Auflösung haben, um zwischen den einzelnen Antikörper zu differenzieren. Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE) wurde zur Darstellung komplexer Proteingemische verwendet, gefolgt von Massenspektrometrie (MS) oder Flüssigchromatographie (LC)-MS (z.B. Proteomik). 2D-PAGE, die die Trennung auf der Basis der Ladung eines Proteins und seiner Masse kombiniert, erwies sich als zweckmäßig zum Differenzieren zwischen polyklonalem, oligoklonalem und monoklonalem Immunglobulin in Serumproben. Jedoch hat dieses Verfahren einige Einschränkungen. Chromatographische Techniken, insbesondere Kapillarchromatographie und LC, gekoppelt mit Elektrospray-Ionisierungs-MS, werden zunehmend bei der Analyse komplexer Peptidgemische eingesetzt. LC-MS wurde zur Charakterisierung monoklonaler Antikörper und kürzlich auch zur Darstellung der leichten Ketten polyklonaler Antikörper verwendet. Die Analyse sehr komplexer Proben erfordert mehr Auflösungsvermögen des chromatographischen Systems, das durch Trennung in zwei Dimensionen (oder mehr) erhalten werden kann. Ein solcher Ansatz könnte auf Ionenaustausch in der ersten Dimension und Umkehrphasenchromatographie (oder hydrophober Wechselwirkung) in der zweiten Dimension, ggf. gekoppelt an MS, basieren.
Funktionelle Charakterisierung
Ein polyklonales Protein kann z.B. funktionell durch Vergleichbarkeitsstudien mit polyklonalen Proteinen mit Spezifität gegenüber dem gleichen Ziel oder einer ähnlichen Aktivität charakterisiert werden. Solche Studien können in vitro sowie in vivo durchgeführt werden.
Eine funktionelle Charakterisierung eines polyklonalen Antikörpers in vitro könnte z.B. Immunpräzipitation sein, die eine hochspezifische Technik zur analytischen Trennung von Ziel antigenen aus Rohzelllysaten ist. Durch Kombinieren von Immunpräzipitation mit anderen Techniken, wie SDS-PAGE, gefolgt von Proteinfärbung (Coomassie-Blau, Silberfärbung oder Biotinmarkierung) und/oder Immunblotting, ist es möglich, z.B. Antigene zu detektieren und zu quantifizieren und somit einige der funktionellen Eigenschaften der Antikörper zu bewerten. Obwohl dieses Verfahren weder eine Bestimmung der Anzahl der Antikörpermoleküle noch ihrer Bindungsaffinitäten zulässt, stellt es eine Visualisierung der Zielproteine und somit der Spezifität bereit. Dieses Verfahren kann gleichermaßen verwendet werden, um mögliche Unterschiede der Antikörper gegenüber Antigenen (die Vollständigkeit der klonalen Diversität) während des Expressionsprozesses zu überwachen.
Eine funktionelle Charakterisierung eines polyklonalen Antikörpers in vivo könnten z.B. Infektionsstudien sein. Ein Versuchstier, wie eine Maus, kann z.B. mit einem speziellen Virus infiziert werden, gegen den ein polyklonaler Antikörper entwickelt wurde. Der Grad, bis zu dem die Infektion gehemmt bzw. verhindert werden kann, zeigt die Funktionalität des polyklonalen Antikörpers an.
Therapeutische Zusammensetzungen
In einer Ausführungsform der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein rekombinantes polyklonales Protein, ausgewählt aus der Immunglobulin-Superfamilie, als ihr aktiver Inhaltsstoff zur Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit bei einem Säuger bestimmt, wie eine Krankheit, ausgewählt aus Krebs, Infektionen, entzündlichen Erkrankungen, Allergien, Asthma und anderen Atemwegserkrankungen, Autoimmunkrankheiten, immunologischen Fehlfunktionen, cardiovaskulären Erkrankungen, Krankheiten im zentralen Nervensystem, Stoffwechsel- und endokrinen Krankheiten, Transplantatabstoßung und ungewollter Schwangerschaft. Der Säuger ist vorzugsweise ein Mensch, ein Haustier oder ein Streichel- bzw. Haustier.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung einen rekombinanten polyklonalen Antikörper oder ein rekombinantes polyklonales Antikörperfragment als den aktiven Inhaltsstoff und ein pharmazeutisch annehmbares Excipiens.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung einen rekombinanten polyklonalen T-Zellrezeptor oder ein rekombinantes polyklonales T-Zellrezeptorfragment als den aktiven Inhaltsstoff und ein pharmazeutisch annehmbares Excipiens.
Zur Behandlung oder Vorbeugung von Infektionen umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung ein rekombinantes polyklonales Protein von Interesse, das in der Lage ist, mit einem infektiösen Mikroorganismus zu reagieren bzw. an ihn zu binden, wie ein Mikroorganismus, ausgewählt aus Bakterien, Mykobakterien, Virus, Mykoplasma, Rickettsia, Spirochäten, Protozoen, Pilzen, Helminthen und Ektoparasiten.
Rekombinante polyklonale Human-Proteine können in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel, Träger oder Excipiens in einer Einheitsdosierungsform verabreicht werden. Konventionelle pharmazeutische Praktiken können eingesetzt werden, um geeignete Formulierungen oder Zusammensetzungen zum Verabreichen der Verbindungen an Patienten, die an einer Krankheit leiden, z.B. verursacht durch übermäßige Zellproliferation, bereitzustellen. Die Verabreichung kann beginnen, bevor der Patient symptomatisch ist. Jeder geeignete Verabreichungsweg kann verwendet werden, z.B. kann die Verabreichung parenteral, intravenös, intraarteriell, subkutan, intramuskulär, intrakranial, intraorbital, ophthalmisch, intraventrikulär, intracapsular, intraspinal, intrazisternal, introperitoneal, intranasal, als Aerosol, als Suppositorium oder eine orale Verabreichung sein. Zum Beispiel können die therapeutischen Formulierungen in Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen sein; für eine orale Verabreichung können die Formulierungen in Form von Tabletten oder Kapseln, Kaugummi, Pasten, sein, Zusammensetzungen, die für die Applikation auf die Haut geeignet sind, können in Form von Cremen, Salben, Lotionen, Gelen, Pflastern oder anderen sein, Zusammensetzungen, die zur Applikation auf die Vaginal- oder Urogenitalschleimhaut geeignet sind, können in Form von Scheidenzäpfchen (vagitories), Gelen oder anderen sein., und für intranasale Formulierungen können sie in Form von Pulvern, Nasentropfen oder Aerosolen sein.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden in einer Weise hergestellt, die per se bekannt ist, z.B. mittels konventioneller Lösungs-, Lyophilisierungs-, Misch-, Granulierungs- oder Konfektionierungsverfahren. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können gemäß der konventionellen pharmazeutischen Praxis formuliert werden (siehe z.B. in Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20. Ausg.), Herausg. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA und Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Herausg. J. Swarbrick and J.C. Boylan, 1988-1999, Marcel Decker, New York, NY).
Lösungen des aktiven Inhaltsstoffs und auch Suspensionen und insbesondere isotonische wässrige Lösungen oder Suspensionen werden bevorzugt verwendet, wenn es möglich ist, z.B. im Fall lyophilisierter Zusammensetzungen, die den aktiven Inhaltsstoff allein oder zusammen mit einem Träger, z.B. Mannit, umfassen, da solche Lösungen oder Suspensionen vor der Verwendung hergestellt werden sollen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können sterilisiert werden und/oder Excipientien, z.B. Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Netz- und/oder Emulgiermittel, Solubilisierungsmittel, Salze zum Regulieren des osmotischen Drucks und/oder Puffer, umfassen und werden in einer Weise hergestellt, die per se bekannt ist, z.B. mittels konventioneller Lösungs- oder Lyophilisierungsverfahren. Die Lösungen oder Suspensionen können viskositätserhöhende Substanzen, wie Natriumcarboxymethylzellulose, Carboxymethylzellulose, Dextran, Polyvinylpyrrolidon oder Gelatine, umfassen.
Die Injektionszusammensetzungen werden in üblicher Weise unter sterilen Bedingungen hergestellt; das gleiche gilt auch für das Einfüllen der Zusammensetzungen in Ampullen oder Glasfläschchen und das Versiegeln der Behälter.
Pharmazeutische Zusammensetzungen für eine orale Verabreichung können erhalten werden, indem der aktive Inhaltsstoff mit festen Trägern kombiniert wird, falls gewünscht, indem ein resultierendes Gemisch granuliert wird und indem das Gemisch, falls gewünscht oder erforderlich, nach der Zugabe geeigneter Excipientien, zu Tabletten, Drageekernen oder Kapseln verarbeitet wird. Es ist auch möglich, dass sie in Kunststoffträger eingearbeitet werden, die es ermöglichen, dass die aktiven Inhaltsstoffe in abgemessenen Mengen diffundieren oder freigesetzt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen von näherungsweise 1 % bis näherungsweise 95%, vorzugsweise von näherungsweise 20% bis näherungsweise 90%, an aktivem Inhaltsstoff. Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können z.B. in Einheitsdosisform, wie in der Form von Ampullen, Glasfläschchen, Suppositorien, Dragees, Tabletten oder Kapseln sein.
Die Formulierungen können an menschliche Patienten in therapeutisch wirksamen Mengen (z.B. Mengen, die einen pathologischen Zustand verhindern, beseitigen oder verringern) verabreicht werden, um eine Therapie für eine Krankheit oder einen Zustand zur Verfügung zu stellen. Die bevorzugte Dosierung des therapeutischen Mittels, das verabreicht werden soll, hängt wahrscheinlich von solchen Variablen wie dem Typ und dem Ausmaß der Störung, dem allgemeinen Gesundheitszustand des speziellen Patienten, der Formulierung der Zusammensetzungsexcipientien und seinem Verabreichungsweg ab.
Falls gewünscht, kann die Behandlung mit rekombinanten polyklonalen Human-Antikörpern mit traditionelleren Therapien kombiniert werden. Zum Beispiel bei der Behand- lung von Krebs könnten solche Kombinationstherapien die Form von Chirurgie oder Verabreichung von chemotherapeutischen Mitteln oder anderen Antikrebsmitteln annehmen.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung ein rekombinantes polyklonales Protein von Interesse, das in der Lage ist, mit einem infektiösen Mikroorganismus zu reagieren bzw. an ihn zu binden, wie ein Mikroorganismus, ausgewählt aus Bakterien, Mykobakterien, Virus, Mykoplasma, Rickettsia, Spirochäten, Protozoen, Pilzen, Helminthen und Ektoparasiten.
Therapeutische Verwendungen der Zusammensetzungen gemäß der Erfindung
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können zur Behandlung, Linderung oder Vorbeugung einer Krankheit bei einem Säuger verwendet werden. Krankheiten, die mit den vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzungen behandelt werden können, schließen Krebs, Infektionen, entzündliche Erkrankungen, Allergien, Asthma und andere Atemwegserkrankungen, Autoimmunkrankheiten, cardiovaskuläre Erkrankungen, Krankheiten im zentralen Nervensystem, Stoffwechsel- und endokrine Krankheiten, Transplantatabstoßung und ungewollte Schwangerschaft ein.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Krankheitsbehandlung, -linderung oder -prophylaxe bei einem Tier, wobei eine wirksame Menge des rekombinanten polyklonalen Antikörpers oder Antikörperfragments verabreicht wird. In einem weiteren Aspekt wird eine wirksame Menge des rekombinanten polyklonalen T-Zellrezeptors oder T-Zellrezeptorfragments verabreicht.
In einem zusätzlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung dient die Verwendung eines rekombinanten polyklonalen Antikörpers oder eines rekombinanten polyklonalen T-Zellrezeptors oder von Fragmenten von Antikörpern oder T-Zellrezeptoren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Krankheiten, ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Krebs, einer Infektion, einer entzündlichen Erkrankung, einer Allergie, Asthma oder einer Atemwegserkrankung, immunologischen Fehlfunktionen, einer Autoimmunkrankheit, einer cardiovaskulären Erkrankung, einer Krankheit im zentralen Nervensystem, einer Stoffwechselkrankheit, einer endokrinen Krankheit, Transplantatabstoßung und ungewollter Schwangerschaft.
Diagnostische Verwendung und Verwendung zur Detektion in der Umwelt
Eine andere Ausführungsform der Erfindung richtet sich auf diagnostische Kits und Kits zur Verwendung bei der Detektion in der Umwelt sowie auf Verfahren zum Verwenden dieser Kits. Kits gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen ein rekombinantes polyklonales Protein, das gemäß der Erfindung hergestellt wurde, wobei das Protein mit einer detektierbaren Markierung markiert sein kann oder für eine Detektion ohne Markierung nicht markiert sein kann. Falls es markiert ist, kann das vorliegende rekombinante polyklonale Protein zu einer Probe hinzugefügt werden, von der angenommen wird, dass sie das Zielmolekül enthält, und das Vorhandensein oder die Abwesenheit der Markierung zeigt das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Zielmoleküls an. Die zu testende Probe kann eine Probe einer Körperflüssigkeit, wie Blut, Serum, Plasma, Rückenmarksflüssigkeit, Lymphe oder Urin, oder eine Nicht-Säuger-Probe, wie eine Probe aus einer Quelle aus der Umwelt, bei der angenommen wird, dass sie eine Kontaminante enthält, sein. Nicht-Säuger-Proben können Wasser, Luft oder kontaminierte Erde sein. Eine Detektion ohne Markierung umfasst die Messung der Brechungsveränderung in einem BIAcore bei Bindung, wobei das rekombinante polyklonale Protein verwendet wird, um die Zielmoleküle zu binden bzw. einzufangen.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele beschreiben, wie rekombinante polyklonale Antikörper exprimiert werden und in einer Zelllinie mit hoher Produktion produziert werden, in die (ein) Gen(e)/Vektor(en) von Interesse durch ortsspezifische Integration in eine zuvor charakterisierte chromosomale "Hotspot"-Stelle insertiert wurde(n).
In den Beispielen wurden CHO-Zellen als Wirtszelle eingesetzt. Die Vorteile davon schließen die Verfügbarkeit eines geeigneten Wachstumsmediums, ihre Fähigkeit, effizient bis zu einer hohen Dichte in Kultur zu wachsen, und ihre Fähigkeit, Säuger-Proteine, wie Antikörper, in einer biologisch aktiven Form zu exprimieren, ein.
Im Allgemeinen werden die Transformation von E. coli und die Transfektion von Säuger-Zellen gemäß der Aufgabe der Erfindung gemäß konventionellen Verfahren durchgeführt. Um das Verständnis der Erfindung zu verbessern, werden die Konstruktion beispielhafter Vektoren und ihre Verwendung beim Herstellen einer rekombinanten polyklonalen Herstellungszelllinie zur rekombinanten polyklonalen Proteinexpression in den Beispielen unten beschrieben.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, sollten aber nicht so gesehen werden, dass sie den Rahmen der Erfindung einschränken.
BEISPIEL 1
Ortsspezifische Integration versus zufällige Integration
Für den folgenden Transfektionsversuch wurden die CHO-Flp-In-Zellen (Invitrogen, Carlsbad, CA) verwendet. Die Effizienz des Systems wurde unter Verwendung von sekretierter alkalischer Phosphatase vom Mensch (human secreted alkaline phosphatase) (SEAP) als einem Reportergen getestet. Zwei Plasmidkonstrukte wurden hergestellt:

1. SEAP, insertiert in pcDNA3.1hygro+ (Invitrogen, Carlsbad, CA) (für zufällige Integration)
2. SEAP, insertiert in pcDNAS/FRT (Invitrogen, Carlsbad, CA) (für ortsspezifische Integration).

Die zwei Plasmidkonstrukte waren hinsichtlich der regulatorischen Elemente, d.h. Promotor, Polyadenylierung etc. sehr ähnlich, was es möglich macht, die Plasmide zum Vergleichen der zufälligen Integration mit der ortsspezifischen Integration zu verwenden.
CHO-Flp-In-Zellen wurden mit dem Plasmidkonstrukt 1 allein oder mit dem Plasmidkonstrukt 2 zusammen mit dem Rekombinase-codierenden Plasmid pOG44, gemäß der von Invitrogen beschriebenen Vorgehensweise, transfiziert. Die Transfektanten wurden unter Verwendung von Hygromycin selektiert, und die Produktion von SEAP aus Pools von Transfektanten wurde gemessen.
Zellen, die mittels ortsspezifischer Integration transfiziert worden waren, produzierten näherungsweise sechsmal mehr SEAP als Zellen, die mittels zufälliger Integration transfiziert worden waren, was die Effizienz des Systems und der Zelllinie belegt.
BEISPIEL 2
Aufbau und Herstellung eines Expressionsvektors zur ortsspezifischen Integration in eine Wirtszelle
Ein Expressionsvektor, der für eine ortsspezifische Integration in einen chromosomalen Hotspot-Bereich einer Wirtszelle geeignet ist, kann unter Umfassen der folgenden DNA-Elemente zusammengesetzt sein:

a) eine FRT-Rekombinationsstelle, verknüpft mit dem Hygromycin-Resistenzgen,
b) ein pUC-Replikationsursprung,
c) ein Ampicillin-Resistenzgen (bla),
d) ein bla-Promotor, der die Expression des Ampicillin(bla)-Resistenzgens ermöglicht,
e) Gen/Gene, die für ein Protein von Interesse codieren (GOIs),
f) Promotor/Promotoren, die die Expression des GOI ermöglichen, und
g) ggf. zusätzliche Transkriptions- oder Translations-regulatorische Elemente, wie Verstärker bzw. Enhancer oder UCOEs für eine erhöhte Expression an der Integrationsstelle, oder ein IRES.

Um ein besseres Verständnis der Konstruktion des Expressionsvektors zur Verfügung zu stellen, wird jedes der Elemente detaillierter beschrieben:

a) Eine FRT-Rekombinationsstelle, die mit dem Hygromycin-Resistenzgen verknüpft ist, für eine Flp-Rekombinase-vermittelte Integration und Auswahl bzw. Selektion einer Zelllinie mit einer Mehrheit an einzelnen integralen Bestandteilen wurde verwendet. Dem Hygromycin-Gen geht weder ein Promotor voraus, noch war es mit einem transkriptionsinitiierenden Codon ausgerüstet, aber ein Polyadenylierungssignal war 3' an das Gen angefügt. Die verwendete FRT-Stelle war 5'-gaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc-3' (SEQ ID NO 1).
b) Ein pUC-Replikationsursprung wurde eingeschlossen, um eine Replikation mit hoher Kopienanzahl in einer E. coli-Wirtszelle zu gestatten.
c) Ein Ampicillin(bla)-Resistenzgen (β-Lactamase), das die Selektion von E. coli-Transformanten ermöglicht, war eingeschlossen.
d) Ein bla-Promotor ermöglichte die Expression des Ampicillin(bla)-Resistenzgens in E. coli.
e) Ein GOI, das für ein Protein von Interesse codiert, z.B. ein rekombinantes polyklonales Protein, ein rekombinanter polyklonaler Antikörper, die schweren und leichten Ketten eines Antikörpers sowie Nucleinsäuresequenzen, die für alles oder für einen Teil sowohl der konstanten Region als auch der variablen Region eines Antikörpermoleküls codieren, und ggf. alles oder ein Teil einer regulatorischen Nucleinsäuresequenz, die die Expression eines Antikörpermoleküls steuert, waren eingeschlossen.

Immunglobulin-Loci für schwere Ketten können die ganze oder einen Teil der V-, D-, J- und der Umschalt- bzw. Switch-Region (einschließlich dazwischen liegender bzw. Intervening-Sequenzen, auch als Introns bekannt) und flankierende Sequenzen, die mit dem Gen der konstanten Region der speziellen schweren Kette verbunden sind oder ihm benachbart sind, einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt, und sie können Bereiche einschließen, die innerhalb oder stromabwärts der konstanten Region (einschließlich Introns) lokalisiert sind.
Immunglobulin-Loci für die leichten Ketten können die V- und J-Regionen, die sie stromaufwärts flankierenden Sequenzen und Intervening-Sequenzen (Introns), die mit dem Gen der konstanten Region der leichten Kette verbunden sind oder ihm benachbart sind, einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt, und sie können Bereiche einschließen, die innerhalb oder stromabwärts der konstanten Region (einschließlich Introns) lokalisiert sind.
Zur Modifikation der gesamten Region oder eines Teils einer konstanten Region eines Antikörpers können die modifizierenden Sequenzen der Erfindung eine konstante Region eines Antikörpers mit einer speziellen Effektorfunktion, einer speziellen Klasse und/oder einem speziellen Ursprung (z.B. die konstanten Regionen von IgG, IgA, IgM, IgD oder IgE von Human-Immunglobulinen oder von anderen Spezies) oder einen Teil einer konstanten Region, der die Aktivität oder die Eigenschaften der konstanten Region des Antikörpers modifiziert, sowie Gene, die für andere Moleküle codieren, die einem modifizierten Antikörpermolekül eine neue Funktion verleihen, z.B. ein Enzym, Toxin und dgl., einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Das/die Gen/Gene, die für ein Protein von Interesse codieren, können funktionell mit Nucleotidsequenzen verknüpft sein, die für funktionelle Leit- bzw. Signalsequenzen codieren, die das Genprodukt in den Sekretionsweg lenken.
Weiterhin kann es 3' zu dem GOI, das für das Protein von Interesse codiert, z.B. wie ein polyklonaler Antikörper, umfassend schwere und leichte Ketten, starke Polyadenylierungssignale geben. Die Verwendung des Maus-Isotypen IgG 1 in den folgenden Beispielen dient veranschaulichenden Zwecken und ist nicht dazu gedacht, den Rahmen der Erfindung einzuschränken.

f) Promotoren, die die Expression des GOI ermöglichen, werden bereitgestellt. Daher wird eine Kassette, umfassend Promotor- und Verstärkerelemente, für die Expression beschrieben. In dem Expressionsvektor können jedem der Antikörpergene ihre eigenen Säuger-Promotorelemente vorausgehen, die einen hohen Expressionslevel jeder der zwei Ketten einregeln, ob nun eine unidirektionale, bidirektionale oder eine Ende-an-Ende-Orientierung der Transkriptionskassetten verwendet wird.

Bei einer bidirektionalen Orientierung der Expression kann eine Kopf-an-Kopf-Promotorkonfiguration verwendet werden (die Konstruktion eines solchen Systems ist im Detail in US-Patent Nr. 5,789,208 beschrieben). In einem unidirektionalen Expressionssystem können auch zwei Promotoren oder ein Promotor, kombiniert mit z.B. einer IRES-Sequenz, zur Expression verwendet werden.
Zur Konstruktion von Kopf-an-Kopf-Promotoren wird eine Pfu-PCR-Vervielfältigung der Promotoren einzeln durchgeführt. Der 5'-Primer wird an der äußersten 5'-Basis des Promotors beginnen, der 3'-Ende-Primer wird eine einzelne Restriktionsschnittstelle, wie eine XbaI-Stelle, einschließen. Auf die PCR-Vervielfältigung folgend können die Fragmente auf einem Agarose-Gel getrennt werden und unter Verwendung von QiaQuick-Säulen (Qiagen) aus dem Gel isoliert werden. Darauf folgt ein XbaI-Restriktionsverdau, eine Hitzeinaktivierung bei 65°C für 20 Minuten und eine Säulen-Reinigung der Fragmente unter Verwendung von QiaQuick.
Die Fragmente werden dann gemischt und zusammen unter Verwendung von E. coli-Ligase (New England Biolabs (NEB)), einem Enzym, das vorzugsweise klebrige Enden ligiert, ligiert. Das Ligationsgemisch wird mittels PCR mit den 5'-Primern jedes Promotors vervielfältigt, um das vollständige Kopf-an-Kopf-Promotor(Promotor A/Promotor B)-Fragment zu erhalten. Dieses Fragment wird mit T4-Polynucleotid-Kinase (PNK) (NEB) einer Kinasebehandlung unterzogen (kinased), das Enzym wird bei 65°C für 20 Minuten hitzeinaktiviert und das Fragment wird unter Verwendung von T4-Ligase (NEB) in den Vektor von Interesse (mittels PCR vervielfältigtes pSymvc10 (siehe 4)-Fragment, bei dem sich die zur Vervielfältigung verwendeten Primer an jeder Seite des Promotorbereichs anlagern bzw. hybridisieren, wobei alles außer dem Promotor vervielfältigt wird) ligiert (stumpfes Ende).
1 und 2 zeigen Expressionsvektoren, umfassend Promotoren für bidirektional bzw. unidirektional. Diese Promotoren sollen die Promotorauswahl in der Erfindung veranschaulichen, aber nicht einschränken.

g) Der Expressionsvektor kann zusätzliche transkriptions- und/oder translationsregulatorische Elemente, wie Verstärker und/oder UCOEs für eine gesteigerte Expression an der Integrationsstelle und/oder IRES tragen.

BEISPIEL 3
Beurteilung der Erhaltung der Polyklonalität in dem entwickelten Herstellungssystem
Um in der Lage zu sein, die Stabilität und die Reproduzierbarkeit des Herstellungssystems zu beurteilen, wurde eine Zelllinie, die eine polyklonale Zusammensetzung bestimmter Antikörper in bekannter Kombination exprimiert, hergestellt. Die polyklonale Antikörperzusammensetzung wurde die Mini-Six-Zusammensetzung genannt. Die Bibliothek aus Nucleinsäuresequenzen, die für die Mini-Six-Zusammensetzung codiert, wurde die Mini-Six-Bibliothek genannt.
(a) Klonursprung
Die folgenden Sequenzen, die für Fab-Fragmente (die Gene von Interesse) mit Reaktivität gegen die Antigene 1-6 codieren, wurden in diesem Beispiel verwendet:

1. Ovalbumin (OVA). Die Fab-codierenden Fragmente wurden aus einer Maus-Anti-OVA-Phagen-Display-Bibliothek ausgewählt.
2. Alkalische Phosphatase (AP). Die Fab-codierenden Fragmente wurden aus einer Maus-Anti-AP-Phagen-Display-Bibliothek ausgewählt.
3. β₂-Mikroglobulin (β₂m). Die Fab-codierenden Fragmente wurden aus dem Hybridom BBM.1 kloniert (freundlicherweise von Dr. L. Ø. Pedersen, Dänemark zur Verfügung gestellt), das gegen β₂m erzeugt wurde.
4. Human-Haptoglobin (HAP). Fab-codierenden Fragmente wurden aus einer Maus-Anti-Human-Haptoglobin-Phagen-Display-Bibliothek ausgewählt.
5. Faktor VIII (FVIII). Der parenterale monoklonale Antikörper dieses Fab-Fragments war ein FVIII F25-monoklonaler Antikörper (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Novo Nordisk, Dänemark). Die DNA, die für die V_H- und die vollständigen schweren Kappa-Ketten dieses Fab-Fragments codiert, wurde in ein Phagemid subkloniert, gefolgt von Insertion der prokaryotischen Promotorkassette in das Konstrukt.
6. Hühnereiweißlysozym (LYS). Dieses Konstrukt wurde aus dem D 1.3 scFv-Klon (Boulot, G. et al., J. Mol. Biol., 213(4) (1990) 617-619) durch PCR-Vervielfältigung von V_H- und V_K-Fragmenten und Klonieren in ein Phagemid erzeugt.

Die Phagemid-Klone waren entweder in Glycerinstammkulturen eines transformierten Escherichia coli-Stammes TG1 (bei –80°C gehalten) oder als Phagemid-DNA-Präparationen vorhanden.
(b) RFLP-Analyse und DNA-Sequenzierung der Mini-Six-Bibliothek.
Die Nucleotidsequenzen, die für die schweren Ketten der Fab-Fragmente codieren, wurden mittels RFLP wie folgt analysiert. Die Bandenmuster, die nach Verbau der mittels PCR erzeugten Fragmente mit dem NlaIII- und dem HinfI-Enzym erhalten wurden, wurden untersucht. Die verschiedenen Fab-Fragment-codierenden Sequenzen wiesen sehr unterschiedliche und leicht unterscheidbare Muster auf. Die Nucleotidsequenzen, die für die V_H- und V_L-Fragmente codieren, wurden sequenziert und Sequenzen, die dem RFLP-Muster entsprachen, wurden gefunden. Darüber hinaus codierten die Nucleotidsequenzen für offene Leseraster und translatierten in gut definierte Polypeptide.
(c) ELISA-Analyse der Mini-Six-Zusammensetzung
Die Fab-Fragmente, die von den Klonen exprimiert wurden, wurden unter Verwendung von ELISA analysiert, in denen alle Fab-Fragmente auf Reaktivität mit allen Antigenen hin analysiert wurden. Die Fab-Expression wurde unter Verwendung eines Anti-Kappa-ELISA überwacht. Alle Fab-Fragmente wurden doppelt in dem ELISA getestet. Alle Klone exprimierten Fab-Fragmente, und die Fab-Fragmente reagierten spezifisch mit ihrem relevanten Antigen. Keine Hintergrundprobleme wurden in den ELISA-Analysen festgestellt.
Die sechs Phagemid-Klone sind in Glycerinstammkulturen eines einzeln transformierten Escherichia coli-Stammes TG1 vorhanden, die in den Modellsystem zur Beimpfung, wie unten beschrieben, verwendet wurden.
(d) Aufbau eines polyklonalen Modellsystems mit sechs bestimmten Antikörpern in bekannter Kombination.
Die sechs ausgewählten Fab-exprimierenden Klone (Klone, die Fab-Fragmente von Anti-OVA, Anti-AP, Anti-β₂m, Anti-HAP, Anti-FVIII und Anti-LYS exprimieren) wurden charakterisiert, indem die Reaktivität der exprimierten Fab-Fragmente gegen die relevanten Antigene getestet wurde. Diese Klone bildeten einen Teil eines polyklonalen Modellsystems zum Testen der Expression und Produktion von sechs bestimmten Antikörpern in einer bekannten Kombination (die Mini-Six-Zusammensetzung). Alle Fab-Fragmente-codierenden Nucleotidsequenzen (die Mini-Six-Bibliothek) wurden in einen Phagemid-Vektor (veranschaulicht durch pSymvc10, 4A) transferiert.
(d.1) Einzelner Transfer der GOIs aus dem Phagemid-Vektor in einen Vektor für Säuger-Expression
Der Transfer von Genen von Interesse (die Mini-Six-Bibliothek) aus einem Phagemid-Vektor in einen Vektor für Säuger-Expression wurde in diesem Beispiel mittels einer Zwei-Schritt-Vorgehensweise durchgeführt. Der erste Schritt bestand darin, die prokaryotischen Promotoren durch eine Säuger-Promotorkassette in einer Kopf-an-Kopf-Orientierung zu ersetzen. Auf diesen Schritt folgte das Transferieren des variablen Bereichs des GOIs, der Promotorkassette und des konstanten Kappa in den Expressionsvektor, wie im Detail unten beschrieben und in 4 veranschaulicht.
Die Kopf-an-Kopf-Promotorkassette (Promotor A/Promotor B) wurde in den Phagemid-Vektor für jeden Klon unter Verwendung eines SacI/XhoI-Verdaus, gefolgt von einer Ligation, was in einem Austausch von Promotoren von bakteriell zu Säuger resultierte, insertiert. Ein EcoRI- und NotI-Verdau wurde dann verwendet, um die variable schwere Kette, die Kopf-an-Kopf-Promotorkassette (Promotor A/Promotor B) und die vollständige Kappa-Kette (EcoRI/NotI-Fragment) aus dem Phagemid-Vektor in den Expressionsvektor zu versetzen.
Ein Beispiel des einzelnen Transfers eines jeden Klons ist mit dem Fließschema in 4 gegeben. Diese Figur zeigt Plasmid pSymvc10, in dem die schwere (Kette)- und die Kappacodierenden Sequenzen von Interesse (z.B. gc032 OVA) in dem Phagemid-Vektor vorhanden sind, in den das Kopf-an-Kopf-Säuger-Promotorkassettenkonstrukt ligiert wurde, um die bakte riellen Promotoren zu ersetzen, wobei ein SacI/XhoI-Fragment-Transfer verwendet wurde, was pSymvc10 erzeugte.
Aus diesem Konstrukt wurde die die variable schwere Kette-codierende Sequenz einschließlich der Promotorkassette und der gesamten Kappa-Kette-codierenden Sequenz in den Säuger-Isotyp-codierenden Vektor (pSymvc20) mittels eines NotI/EcoRI-Transfers transferiert. Der resultierende Vektor (pSymvc21) exprimierte den Maus-Antikörper von Interesse (z.B. Anti-OVA-IgG1-Antikörper).
Die variable schwere Kette-codierende Sequenz, die Säuger-Promotorkassette und die gesamte die Kappa-Kette codierende Sequenz aus jedem der sechs Klone wurde einzeln mittels eines NotI/EcoRI-Transfers transferiert, was in dem Säuger-Expressionsvektor pSymvc21 resultierte, der jede der von dem GOI codierten Antikörpersequenzen als Maus-IgGl-Antikörper exprimiert.
Die sechs einzelnen pSymvc21-Klone, die die sechs GOIs enthalten, wurden als TG1-Glycerinstammkulturen aufbewahrt.
Zur Transfektion in CHO-Flp-In-Zellen wurden die TG1-Stammkulturen einzeln vermehrt, und nach einer OD₆₀₀-Normalisierung bezüglich der Zahl der E. coli-Zellen wurden die sechs Kulturen gemischt und zur Plasmidpräparation verwendet. Diese Plasmidpräparation, umfassend die sechs GOIs (die Mini-Six-Bibliothek) wurde zur Massentransfektion von Säuger-Zellen zur rekombinanten polyklonalen Proteinexpression verwendet.
(d.2) Massentransfer der GOIs aus Phagemid-Vektoren in Vektoren zur Säuger-Expression
Die GOIs (die Mini-Six-Bibliothek) (hier die EcoRI/NotI-Fragmente), die in Phagemid-Vektoren lokalisiert waren und für sechs bestimmte Fab-Fragmente (Anti-OVA, Anti-AP, Anti-β₂m, Anti-HAP, Anti-FVIII und Anti-LYS) codierten, wurden in Masse als ein Gemisch der sechs Vektorkonstrukte in Vektoren zur Säuger-Expression transferiert, was in einem Gemisch sechs bestimmter Expressionsvektoren resultierte.
Die experimentelle Vorgehensweise betreffend den Massentransfer folgte der Vorgehensweise, die in (d.1) beschrieben wurde, mit der Ausnahme, dass sie in Masse durchgeführt wurde, d.h. alle sechs GOIs (codierend für die variablen schweren Ketten, einschließlich der Kopf-an-Kopf-Promotorkassette und der vollständigen Kappa-Ketten) wurden gleichzeitig als ein Gemisch aus sechs Phagemid-Vektoren transferiert.
Plasmidpräparationen der Mini-Six-Bibliothek
Plasmidpräparation 1 bezieht sich auf eine Plasmidpräparation eines Gemisches der sechs Phagemid-Vektoren (mit den Antikörper-codierenden Sequenzen, die in dem Vektor pSymvc10 enthalten sind).
Plasmidpräparation 2 bezieht sich auf eine Plasmidpräparation aus sechs Phagemid-Vektoren mit den codierenden Sequenzen, die in dem Vektor pSymvc12 nach dem Massentransferschritt 1 (siehe 4c) enthalten sind, der in dem Austausch der prokaryotischen Promotoren durch die Säuger-Promotorkassettenkonstrukte resultierte.
Plasmidpräparation 3 bezieht sich auf eine Plasmidpräparation nach dem Massentransferschritt 2 (siehe 4d), der den Austausch der variablen schweren Kette, der Kopf-an-Kopf-Promotorkassette und der vollständigen Kappa-Kette aus dem pSymvc12 in den Säuger-Expressionsvektor (pSymvc21) ermöglicht und somit die Expression der sechs ausgewählten Antikörper als Maus-IgG1-Antikörper in voller Länge ermöglicht.
Genotypisierung von TG1-Zellen, die mit Plasmidpräparationen transformiert wurden, die im Massentransfer verwendet wurden
TG1-Zellen wurden mit der Mini-Six-Bibliothek in Masse mittels Elektroporation transformiert, und nach einer Übernacht-Inkubation auf 2xYT (Sigma Y 2627)-Platten wurden Einzelkolonien gepickt bzw. überimpft. In jedem Versuch wurden 180 Kolonien überimpft und in 96-Well-Formaten in flüssigem 2xYT-Medium vier Stunden lang inkubiert. Aliquots der Kulturen wurden mit Wasser verdünnt, denaturiert und als Matrize in der PCR verwendet. In allen Versuchen wurde die variable schwere Kette vervielfältigt. Primersequenzen für die Phagemid-Vektoren (pSymvc10-Typ) waren:
5'-GCATTGACAGGAGGTTGAGGC-3' (SEQ ID NO 2) und
5'-GCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTC-3' (SEQ ID NO 3)
Primer für Vektoren mit Säuger-Promotorkassette waren (pSymvc12-Typ):
5'-GCATTGACAGGAGGTTGAGGC-3' (SEQ ID NO 4) und
5'-GTGTCCACTCTGAGGTTCAG-3' (SEQ ID NO 5)
Primer für pSymvc21-Konstrukte waren:
5'-CAAATAGCCCTTGACCAGGC-3' (SEQ ID NO 6) und
5'-GTGTCCACTCTGAGGTTCAG-3' (SEQ ID NO 7)
Alle PCR-Produkte wurden sowohl mit NlaIII als auch HinfI verdaut, um eine zweifelsfreie Genotypisierung sicherzustellen. Die Verdaufragmente wurden mittels Agarose-Gelektrophorese analysiert und die Banden wurden mittels EtBr-Färben visualisiert. Die Anzahl einzelner Genotypen, denen die Fragmentmuster, die mittels RFLP bestimmt wurden, ähneln, entspricht der Anzahl einzelner Kolonien, die jeden der sechs Antikörper unter der Gesamtzahl überimpfter Kolonien darstellt.
(d.2a) Massentransfer aus dem Phagemid-Vektor zu einem Säuger-Vektor nach DNA-Vervielfältigung in E. coli-Zellen (Zwei-Schritt-Vervielfältigungsverfahren)
Die Plasmidpräparation 1 wurde aus jedem der sechs der E. coli-TG1-Glycerinstammkulturen hergestellt, die einen der sechs Phagemid-Vektoren, die die Mini-Six-Bibliothek darstellen, enthielten. Die Stammkulturen wurden einzeln vermehrt, und nach einer OD₆₀₀-Normalisierung bezüglich der Anzahl an E. coli wurden die sechs Kulturen in gleichen Mengen gemischt und zur Plasmidpräparation verwendet, was in Plasmidpräparation 1 resultierte. Die Genotyp-Verteilung der sechs Phagemid-Vektoren in Plasmidpräparation 1 wurde durch Transformation in elektrokompetente TG1-Zellen und nachfolgende RFLP-Analyse getestet. Die Verteilung der verschiedenen Genotypen in TG1-Zellen ist in 5 gezeigt.
Die Plasmidpräparation 1, umfassend den polyklonalen Phagemid-Vektor, der ein gleiches Gemisch der sechs ausgewählten Fab-Fragment-Genotypen exprimiert, wurde mit SacI/XhoI verdaut. Dann wurde die Kopf-an-Kopf-Promotorkassette (CMV-Promotor/MPSV-Promotor) durch Ligation insertiert. Die Genotyp-Verteilung der Vektoren nach dem Promotoraustausch in dem Vektor wurde in TG1-Zellen nach "transformation mit DNA aus dem Ligationsschritt (6) getestet.
Die Zellen wurden ausplattiert und auf großen (245 mm × 245 mm) 2xYT-Agarplatten wachsen gelassen, und die Plasmidpräparation 2 wurde hergestellt, um den Phagemid-Vektor zu erzeugen, der nun die Kopf-an-Kopf-Promotorkassette enthielt (pSymvc12).
Aus der Plasmidpräparation 2 wurde die für die variable schwere Kette codierende Sequenz, einschließlich der Promotorkassette und der vollständigen Kappa-Ketten-Sequenz, aus dem Phagemid-Vektor mittels eines NotI/EcoRI-Verdaus ausgeschnitten und in einen Vektor (pSymvc20) transferiert, der bereits die Domänen der konstanten Region von Maus-IgGl enthielt. Dies resultierte in einer Sammlung von pSymvc21-Vektoren, die die variable Region der sechs ausgewählten Antikörperklone als Maus-IgG1-Antikörper in voller Länge exprimiert.
Der Promotortransfer kann alternativ in dem Säugervektor durchgeführt werden, der für einen Isotyp codiert, wobei die Reihenfolge des Restriktionsverdaus umgekehrt wird, beginnend mit NotI/EcoRI für den Transfer der DNA von Interesse in den Säuger-Vektor und dann SacI/XhoI-Restriktionsverdaufragmentierung zur Insertion der Promotorregion.
Die Verteilung von Genotypen nach Transferieren der für die variable schwere Kette codierenden Sequenz, der Promotorkassette und der gesamten für die Kappa-Kette codierenden Sequenz in den Expressionsvektor wurde durch Transformieren von TG1-Zellen mit DNA aus dem zweiten Ligationsschritt (7) getestet. Zellen wurden auf große (245 mm × 245 mm) 2xYT-Agarplatten ausplattiert, und Plasmidpräparation 3 wurde hergestellt (pSymvc21), in welchen der variable Bereich der sechs Klone in dem Kontext eines Maus-IgG1-Antikörpergerüsts exprimiert werden.
Die Plasmidpräparation 3 kann zur Massentransfektion von Säuger-Zellen verwendet werden, um eine rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie für rekombinante polyklonale Antikörperexpression zu erzeugen.
Die Ergebnisse des Massentransfers aus dem Phagemid-Vektor in einen Isotypcodierenden Säuger-Vektor nach DNA-Vervielfältigung in E. coli-Zellen zeigten, dass es möglich war, eine ausgeglichene Verteilung der sechs Vektorkonstrukte zu erhalten, nachdem sie einzeln vermehrt und gemischt wurden (Plasmidpräparation 1, 5). Die sechs Konstrukte nach Austausch der Promotorkassette (Plasmidpräparation 2, 6) sowie nach Insertion in einen Maus-IgG1-Isotyp-codierenden Vektor (Plasmidpräparation 3, 7) waren alle in vergleichbaren Ausmaßen detektierbar.
(d.2b) Massentransfer aus einem Phagemid-Vektor in einen Vektor zur Säuger-Expression ohne DNA-Vervielfältigung in E. coli nach dem Plasmidpräparation 1-Schritt (Ein-Schritt-Vervielfältigungsverfahren)
DNA aus der Plasmidpräparation 1 (hier wurden 25 μg verwendet), umfassend den polyklonalen Phagemid-Vektor (pSymvc10), der ein gleiches Gemisch der sechs ausgewählten Fab-Fragment-Genotypen exprimiert, wurde mit SacI/XhoI zum Austausch von Promotoren verdaut. Das SacI/XhoI-Vektorfragment wurde aufgereinigt und mit der Kopf-an-Kopf-Promotorkassette (CMV-Promotor/MPSV-Promotor) ligiert. Nach dem Austausch von Promotoren ohne Durchführen jeglicher Vervielfältigung wurde der Vektor mit der CMV/MPSV-Promotorkassette mit NotI/EcoRI verdaut, um den gesamten Bereich mit der für die variable schwere Kette codierenden Sequenz, einschließlich der Promotorkassette und der gesamten für die Kappa-Kette codierenden Sequenz, aus dem Phagemid-Vektor für einen Massentransfer in einen Vektor für Säuger-Expression auszuschneiden. Nach Ligieren des NotI/EcoRI-Fragments, das für die variable schwere Kette codiert, der Promotorkassette und der Kappa-Kette in einen Maus-IgG1-codierenden Vektor (pSymvc20) wurde ein Expressionsvektor, der den variablen Bereich der sechs ausgewählten Klone in dem Kontext von Maus-IgG1-Antikörpern der vollen Länge exprimiert, erhalten. Die Zusammensetzung dieses Expressionsvektors ist in 1 veranschaulicht.
Nach dem Massentransfer, der in dem Promotoraustausch in dem Vektor resultierte, und Transfer der Nucleotidsequenzen, die für die variable schwere Kette codieren, der Promotorkassette und der vollständigen Kappa-Kette in einen Vektor für Säuger-Expression wurde die Verteilung der Genotypen durch Transformation von TG1-Zellen mit Plasmid aus dem zweiten Ligationsschritt getestet. Zellen wurden auf große (245 mm × 245 mm) 2xYT-Agarplatten ausplattiert, und eine Plasmidpräparation dieser Doppel-Verdau/Ligations-Plasmidpräparation wurde hergestellt (Vektor pSymvc21, in dem der variable Bereich der sechs Klone in dem Kontext von Maus-IgG1-Antikörpern exprimiert wird, entsprechend der Plasmidpräparation 3 aus d.2a). Die Genotyp-Verteilung in TG1-Zellen nach Transformation mit der Plasmidpräparation aus dem Ein-Schritt-Vervielfältigungsverfahren ist in 8 gezeigt.
Das Ein-Schritt-Vervielfältigungsverfahren könnte etwas Scrambling zwischen den schweren und den leichten Ketten aus den sechs Fab-codierenden Sequenzen einführen, resultierend aus der Erzeugung unerwünschter Ligationsprodukte, die normalerweise während der Vervielfältigung in E. coli ausgelassen werden. Wenn jedoch ein solches Scrambling auftritt, kann ein Screening-Schritt eingeührt werden, um sicherzustellen, dass eine ausreichende klonale Diversität aufrechterhalten wird.
(d.2c) Direkte Transfektion von Säugerzellen, folgend auf den Promotoraustausch
Das Produkt der Plasmidpräparationen aus der Mini-Six-Bibliothek entweder des Zwei-Schritt-Vervielfältigungsverfahrens oder des Ein-Schritt-Vervielfältigungsverfahrens kann direkt verwendet werden, um Säugerzellen in Masse für eine rekombinante polyklonale Antikörperexpression zu transfizieren.
(d.3) Testen der transfizierten Säugerzellen
Die bekannte Antikörperkombination des polyklonalen Mini-Six-Modellsystems kann verwendet werden, um zu testen und sicherzustellen, ob bzw. dass der Massentransfer und die Transfektion in Säugerzellen in einer Weise auftreten, die die klonale Diversität aufrechterhält und ohne dass eine Tendenz in die Zusammensetzung der verschiedenen Antikörpersequenzgenotypen während der Transfektion und der nachfolgenden Kultivierung eingebracht wird. Die Verfahren, mittels derer die Genotyp-Zusammensetzung während des gesamten Verfahrens des Massentransfers, der Massentransfektion und der Säugerexpression hindurch überwacht wird, können folgende umfassen:

– DNA-Sequenzierung isolierter Klone,
– RFLP-Analyse einzelner Klone,
– ELISA des hergestellten Antikörpergemischs,
– Massenspektrometrie des hergestellten Antikörpergemischs,
– Tagman-PCR der relativen Zusammensetzung der genomischen Sequenzen und der mRNA, die die verschiedenen schweren und leichten Ketten exprimieren.

Abweichungen in der genomischen Zusammensetzung, die während des Transfektionsprozesses eingeführt wurden, sollten sie auftreten, könnten durch zufällige Integration oder mehrfache integrale Bestandteile verursacht sein. Wie in der detaillierten Beschreibung beschrieben, ist es nicht wahrscheinlich, dass dies Probleme verursacht, wenn eine Wirtszelllinie verwendet wird, die zuvor für ortsspezifische Integration entworfen wurde. Jedoch kann dies auf einer Vielzahl von Wegen kontrolliert werden. Eine Auswahl bzw. Selektion gegen Integration in einem zufälligen genomischen Ort (ein anderer Ort als der ortsspezifische Ort) kann durchgeführt werden, indem sehr geringe DNA-Mengen verwendet werden, z.B. 1 μg/10 Zellen, wenn eine Transfektion mit Lipofectamin durchgeführt wird, oder 0,2 μg/10 Zellen, wenn eine Transfektion mittels Elektroporation durchgeführt wird. Die DNA, die integriert werden soll, kann auch in überspiralisierter Form bereitgestellt werden; eine Form, von der bekannt ist, dass sie für zufällige Integration unvorteilhaft ist.
Einzel- oder Mehrfachintegrationen außerhalb der zuvor konstruierten bzw. entworfenen Zielstelle werden durch negative Auswahl bzw. Selektion elminiert, weil der Selektionsmarker in dem Genom ohne einen Promotor oder ein Startcodon vorhanden ist. Somit überleben Empfänger dieser zufälligen Integrationsereignisse das Selektionsverfahren nicht.
Transformanten mit Mehrfachintegrationen, bei denen eines der Rekombinationsereignisse an der Zielstelle auftritt, überleben das Selektionsverfahren; jedoch ist die Wahrscheinlichkeit dieses Typs von mehrfachen Integrationen extrem gering. Dieses Ereignis würde daher zu einem minimalen Scrambling des polyklonalen Proteins führen. Weil es 100 bis 1000 andere Klone geben würde, die für das gleiche rekombinante polyklonale Protein codieren, wäre, sogar wenn die ektopische Expression hoch ist, der Scrambling-Effekt weiterhin weniger als etwa 1 %, wenn Mehrfachintegrationen aufträten. Wie bereits zuvor erwähnt, kann die Wahrscheinlichkeit der ektopischen Integration verringert werden, indem die DNA-Menge, die in dem Verfahren verwendet wird, verringert wird.
Das am wenigsten wahrscheinliche Ereignis ist eine Mehrfachtandemintegration an der Zielstelle. Bei Verwendung des hier beschriebenen Flp-Rekumbinase-Systems wird dieser Ereignistyp sehr selten sein, weil die Ausschneideaktivität aus dem Chromosom signifikant höher als die Integrationsaktivität ist. Sollte jedoch Tandemintegration mit einer nicht annehmbar ho hen Frequenz auftreten, kann das Flp-System gegen eines ausgetauscht werden, in dem nur das Insertieren einer einzelnen Kopie möglich ist (siehe z.B. WO 99/25854).
(e) Expression der sechs bestimmten Antikörper in bekannter Kombination in Säugerzellen
Um unterschiedliche bzw. variable Proliferations- bzw. Vermehrungsraten zu minimieren, ist es allgemein bevorzugt, jedes spezielle GOI (in diesem Fall jedes einzelne Mitglied der Mini-Six-Bibliothek) in mindestens 100, vorzugsweise 1000 und am stärksten bevorzugt in 10.000 Zellen zu integrieren. Bei einer polyklonalen Zelllinie, die eine große Anzahl einzelner Zellen enthält, die das gleiche GOI (für alle GOIs) exprimieren, wird statistisch erwartet, dass sie weniger durch Unterschiede in den Proliferations- bzw. Vermehrungsraten einzelner Zellen beeinflusst wird und eine verringerte Möglichkeit einer Tendenz in der finalen polyklonalen Proteinzusammensetzung aufweist.
Weiterhin kann es ein Vorteil sein, eine homogene Wirtszelllinie zur Expression sicherzustellen. Dies kann durch Subklonierung der Wirtszelllinie vor der Transfektion erreicht werden. Dieses Verfahren ist in dem Abschnitt bezüglich der klonalen Diversität beschrieben.
Bei polyklonalen Bibliotheken, in denen eine weitere Tendenzkontrolle wünschenswert ist, kann die finale Zusammensetzung des polyklonalen Proteinprodukts kontrolliert werden, indem ein induzierbares Transkriptionskontrollelement in die Expressionsvektorplattform eingeführt wird. Geeignete induzierbare Kontrollelemente schließen z.B. BD Tet on/off (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) und GeneSwitch (Invitrogen, Carlsbad, CA) ein. Diese Transkriptionsschalter können zu einem geeigneten Zeitpunkt induziert werden (z.B. wenn der Pool von Zellen vollständig erweitert ist, um jegliche Proliferations- bzw. Vermehrungstendenz infolge einer Variation in der Genexpression oder dem Proteinprodukt zu minimieren. Der vorliegende Versuch wurde nicht mit solchen Kontrollelementen durchgeführt.
Nach dem Transferieren der sechs ausgewählten GOI aus dem Phagemid-Vektor in die Säuger-Expressionsvektoren, entweder einzeln, wie in (d.1) beschrieben, oder durch Massentransfer, wie in (d.2) beschrieben, wurden die Säuger-Expressionsvektoren zur Transfektion in einen Hotspot in einer CHO-Flp-In-Zelllinie verwendet, indem ortsspezifische Integration zur Expression der sechs bestimmten Antikörper, wie unten beschrieben, verwendet wurde.
Bei den einzeln transferierten GOI (d.1) wurde Plasmid-DNA einzeln vermehrt und zur Einzeltransfektion in CHO-Flp-In-Zellen verwendet, oder die TG1-Stammkulturen wurden einzeln vermehrt und nach einer OD₆₀₀-Normalisierung bezüglich der Anzahl von E. coli-Zellen, wurden die sechs Kulturen gemischt und zur Plasmidpräparation verwendet. Diese Plasmidprä paration, die die sechs Gene von Interesse enthält, wurde zur Massentransfektion von Säugerzellen zur rekombinanten polyklonalen Antikörperexpression verwendet.
Bei den Massen-transferierten GOI (d.2a oder d.2b) wurde Plasmid-DNA entweder in CHO-Flp-In-Zellen transfiziert oder vervielfältigt und aufgereinigt (Plasmidpräparation 3) gemäß der in (d.2a oder d.2b) beschriebenen Vorgehensweise, und dann zur Massentransfektion verwendet.
(e.1) Zellkultur
Die CHO-Flp-In-Wirtszelllinie (Invitrogen, Carlsbad, CA) wurde in Ham's-F-12-Medium mit Zugabe von Glutamin (2 mM) und FCS (10%) und 100 μg/ml Zeocin (Invitrogen, Carlsbad, CA) gehalten. Zur Subkultivierung wurden die Zellen mittels Trypsin abgelöst und gemäß den Anweisungen des Herstellers aufgeteilt. Die Zellen wurden bei 5% CO₂, 37°C wachsen gelassen. Das Medium und die Mediumszusätze stammten von Gibco.
Die Zelllinie exprimierte stabil das lacZ-Zeocin-Fusionsgen, was die Zellen resistent gegen das Antibiotikum Zeocin macht, eine Resistenz, die bei ortsspezifischer Integration eines fremden Gens verloren geht. Die Zellen enthalten eine einzelne Kopie der Flp-Rekombinationszielstelle (Flp recombination target site) (FRT)-Stelle) und sind somit bereit, als Wirtszelllinie für eine ortsspezifische Integration. durch Verwendung des Flp-In-Systems (Invitrogen, Carlsbad, CA) verwendet zu werden.
(e.2) Transfektion von CHO-Zellen
Gewebekulturplatten mit 6 Wells wurden mit 4,0 × 10⁵ CHO-Flp-In-Zellen/Wells beimpft und O/N bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Die Transfektion dieser Zellen wurde durchgeführt, wobei verschiedene Transfektionsverfahren unter Verwendung von FuGENE^TM6 (Roche), Lipofectine^TM, Lipofectamin^TM oder Lipofectamin 2000^TM (Gibco) gemäß den Anweisungen des Herstellers getestet wurden. In diesem Beispiel wurde Lipofectamin 2000^TM als Transfektionsreagens verwendet. Kurz gesagt, wurden exponentiell wachsende CHO-Flp-In-Zellen am Tag vor der Transfektion ausgebracht, wie oben beschrieben, und O/N bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Wells mit einer 85-95%-igen Konfluenz der Zellen wurden für die Co-Transfektion verwendet.
Zwei Röhrchen mit den folgenden Inhalten wurden hergestellt:
Röhrchen 1: 0,5 μg eines einzelnen Expressionsvektors mit GOI, beschrieben in (d.1) (z.B. pSymvc21 mit OVA) + 4,5 μg mp040 (eine Maxipräparation von pOG44) (ein Plasmid, das Rekombinase Flp exprimiert) wurden zu 250 μl Optimem (1,5 ml Eppendorf-Röhrchen) gegeben.
Röhrchen 2: 7,5 μl Lipofectamin 2000^TM wurden zu 250 μl Optimem (1,5 ml Eppendorf-Röhrchen) zugegeben und bei Raumtemperatur (RT) 5 Minuten lang inkubiert.
Der Inhalt von Röhrchen 2 wurde in Röhrchen 1 überführt, gefolgt von Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten.
Die DNA-Lipofectamin-Komplexe wurden in die Wells mit Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers überführt.
Nach 24 Stunden wurden die Zellen mittels Trypsin abgelöst, aufgeteilt (1:3) und auf einen T-25-Kolben und 100 mm-Petrischalen verteilt und in einem frischen Medium, Nutrient Mixture F-12 Ham + 10% FCS + 2 mM L-Glutamin, mit 900 μg Hygromycin B/ml als Selektionsdruck kultiviert.
(e.3) Selektion ortsspezifischer integraler Bestandteile und Subkultivierung der transfizierten Zellen
Die Zellen wurden unter Hygromycin B-Selektionsdruck für zwei oder drei Wochen kultiviert, in dieser Zeit wurden die Zellen alle 2 bis 4 Tage mit neuem Medium versehen (refreshed), das die gleiche Konzentration an Selektionsmittel enthielt. Der überlebende Pool von Zellen in dem T-25-Kolben und in den Petrischalen wurde mittels Trypsin abgelöst, aufgeteilt (1:6) und auf T-Kolben für eine weitere Vermehrung unter dem oben genannten Selektionsdruck verteilt. Einige einzelne Klone wurden (unter Verwendung so genannter Klonierungszylinder) aus den Petrischalen überimpft, welche die Transfektanten enthielten, die gemäß dem in (d.1) beschriebenen Verfahren erzeugt wurden, und sie wurden in neue Wells zur Vermehrung und Verwendung in Expressionslevelstudien überführt.
Jeder Pool von Zellen oder einzelnen Klonen, der gegen die Schwellenwertkonzentration von Hygromycin B resistent war, wurde nachfolgend bis zur Konfluenz in 6-Well-Platten wachsen gelassen, erneut in Petrischalen ausplattiert, in T-25-, T-80- und T-175-Kolben in ihrem entsprechenden Medium plus Hygromycin B ausgebracht. Wenn exponentiell wachsende Zellen 80% Konfluenz in T80-Gewebekulturflaschen erreichten, wurden Vials jeder Zelllinie tiefgefroren und in einem Flüssigstickstoff-N₂(L)-Gefrierschrank gelagert.
Zur Transfektion mit einem Gemisch von Plasmiden, die die sechs Gene von Interesse (die Mini-Six-Bibliothek) enthielten, wurden die sechs einzelnen Kulturen bei OD₆₀₀ bezüglich der Anzahlen von E. coli normalisiert, gemischt und für eine polyklonale Plasmidpräparation verwendet, die die sechs Gene von Interesse enthielt. Eine Transfektionsvorgehensweise unter Verwendung von 7,5 mal so viel des Reagenses und von Zellen, wie oben beschrieben, wurde durchgeführt, wobei eine rekombinante polyklonale Zelllinie produziert wurde, die ein Gemisch der sechs bestimmten Antikörper exprimiert.
Die sechs Zelllinien, die die einzelnen Mitglieder der ausgewählten Antikörper exprimieren, und die Zelllinie, die das Gemisch der sechs bestimmten Antikörper exprimiert, wurden während Kultivierung und Vermehrung auf Antikörperproduktion mittels eines Antigenspezifischen ELISA getestet.
(f) Überwachen der Zusammensetzung einer polyklonalen Zelllinie, die sechs bestimmte Antikörper einer bekannten Kombination exprimiert
Durch Erzeugen eines Gemischs aus sechs ausgewählten Genen von Interesse, die in Expressionsvektoren lokalisiert sind, gefolgt von Massentransfektion und ortsspezifischer Integration in CHO-Flp-In-Zellen, wurde eine polyklonale Zelllinie, die sechs bestimmte Antikörper exprimiert, erzeugt.
Die Zelllinie wurde 34 Tage lang beobachtet (followed), in denen die Genotyp-Verteilung, die Antikörperexpression und die Proliferations- bzw. Vermehrungsraten beobachtet wurden (followed). Die Ergebnisse sind unten beschrieben.
(f.1) Genotyp-Verteilung der sechs ausgewählten Gene von Interesse in CHO-Flp-In-Zellen, die mit der Plasmidpräparation aus dem OD₆₀₀-normalisierten Gemisch von Zellen transfiziert waren.
Die polyklonale CHO-Flp-In-Zelllinie wurde mit Trypsin behandelt (trypsinized), und die Zellsuspension wurde auf 10 Zellen/ml verdünnt. Danach wurden 200 μl in jedes Well von insgesamt zehn 96-Well-Platten überführt. Ungefähr 10 Tage später wurden Wells mit Einzelkolonien mittels Mikroskopie identifiziert. Wells mit Einzelkolonien wurden 1× in PBS gewaschen, und es wurden 50 μl Wasser hinzugefügt. Die Platten wurden bei 80°C 10 Minuten lang inkubiert, und die Lysate wurden in andere 96-Well-Platten überführt. 10 μl des Lysats wurden in einer 25 μl-OneStep-RT-PCR (Qiagen) mit den folgenden Primern verwendet:
5'-CAAATAGCCCTTGACCAGGC-3' (SEQ ID NO 6) und
5'-GTGTCCACTCTGAGGTTCAG-3' (SEQ ID NO 7)
Bei 10 μl von RT-PCR-Gemischen in 15 μl-Reaktionsansätzen, die bei 37°C für 2 Stunden inkubiert wurden, wurde RFLP unter Verwendung von HinfI und NlaIII durchgeführt. Die Verdaufragmente wurden unter Verwendung von Agarose-Gelelekrophorese, gefolgt von EtBr-Färben des Gels, visualisiert. Die Genotyp-Verteilung der Zellen, die Anti-OVA, Anti-AP, Anti-β₂m, Anti-HAP, Anti-FVIII und Anti-LYS produzierten, wurde über die Zeit verfolgt (Tage 16 und 34 nach Transfektion), siehe 9.
(f.2) ELISA von Proben, die aus CHO-Flp-In-Zellen stammten, die mit der Plasmidpräparation aus dem OD₆₀₀-normalisierten Gemisch von E. coli (d.1) transfiziert waren
Die polyklonale CHO-Flp-In-Zelllinie (e.3) wurde mit Trypsin behandelt (trypsinized), und 3 × 10⁶ Zellen wurden in T-75-Kolben in F-12 HAM + 10% FCS + 2 mM L-Glutamin und 900 μg Hygromycin ausgebracht. Das Medium wurde jeden Tag gewechselt, und am Tag 3 wurden die Überstände für ELISA ausgewählt. Die Antigene (β2-Mikroglobulin (freundlicherweise von der Universität von Kopenhagen zur Verfügung gestellt), alkalische Phosphatase (Sigma), Ovalbumin (Sigma), Faktor VIII (freundlicherweise von Novo Nordisk, Dänemark, zur Verfügung gestellt), Hühnereiweißlysozym (Sigma) und Haptoglobin (Sigma)) wurden in 50 mM Carbonatpuffer auf 10 μg/ml verdünnt. ELISA-Platten wurden mit Antigen (50 μl in jedes Well) beschichtet und O/N bei 4°C inkubiert. Die Wells wurden viermal mit Waschpuffer (1 × PBS/0,05% Tween 20) gewaschen und für 1 Stunde mit 2% Magermilchpulver in Waschpuffer (100 μl in jedes Well) geblockt. 50 μl-Proben wurden zu den Wells hinzugefügt, und die Platten wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden 4× gewaschen, und Sekundärantikörper (Ziege-Anti-Maus-IgG/HRP-Konjugat (Sigma)) wurden für eine Stunde hinzugefügt, gefolgt von 4× waschen. Der ELISA wurde mit TMB-Substrat (50 μl in jedes Well, DAKO S 1600) 5 Minuten lang entwickelt, und die Reaktionen wurden durch Zugabe von 50 μl 1 M H₂SO₄ abgestoppt. Die Platten wurden unmittelbar danach bei 450 nm abgelesen. Daten, die die Expression aller sechs Antikörper von Interesse in Lysaten zeigen, die vom Tag 34 nach der Transfektion mit dem Gemisch aus Expressionsvektoren, die für die sechs Gene von Interesse codieren, stammen, sind in 10 gezeigt. Es sollte angemerkt werden, dass, da die Daten, die in 10 dargestellt sind, aus sechs verschiedenen Antigen-spezifischen ELISA-Assays stammen, die OD450-Ablesungen in Bezug auf die Antikörpermenge nicht direkt vergleichbar sind.
Die Antikörperexpressionslevel wurden weiterhin mittels Anti-Kappa-Beschichtungs-ELISA (anti-kappa coat ELISA) in Pools von CHO-Flp-In-Zellen analysiert, die mit jedem einzelnen GOI oder dem Gemisch der sechs GOI transfiziert waren. Das Ergebnis ist in den 11 gezeigt. Dies zeigt, dass die Antikörperexpressionslevel unter den einzeln transfizierten Zelllinien (z.B. eine Zelllinie, transfiziert mit einem Anti-β₂m-codierenden Vektor, exprimiert eine vergleichbare Menge des Antikörpers, verglichen mit einer Zelllinie, transfiziert mit einem Vektor, der für einen Anti-AP-Antikörper codiert) vergleichbar sind. Der Begriff Pools von CHO-Flp-In-Zellen, transfiziert mit einem einzelnen GOI, wird hier verwendet, weil die einzel nen Zelllinien nicht aus Einzelklonen, sondern aus Pools von Klonen, wie in e.3 beschrieben, stammen.
(g) Schlussfolgerungen aus dem Versuch
Zuerst zeigten diese Beurteilungen (Tests) der Erhaltung der Polyklonalität in dem Herstellungssystem, dass Massentransfer der sechs ausgewählten Gene von Interesse aus der Mini-Six-Bibliothek (codierend für Anti-OVA, Anti-AP, Anti-β₂m, Anti-HAP, Anti-FVIII und Anti-LYS) aus Phagemid-Vektoren in Säuger-Expressionsvektoren ohne Einführung einer Selektions- oder Proliferations- bzw. Vermehrungstendenz (7) möglich war, wodurch letzten Endes vergleichbare Häufigkeiten der sechs ausgewählten Gene von Interesse erhalten wurden.
Zweitens resultierte die Massentransfektion von CHO-Flp-In-Zellen mit einem Gemisch der Konstrukte, die die sechs ausgewählten Gene von Interesse enthielten, ebenfalls in einer vergleichbaren Verteilung der Konstrukte in isolierten Säugerzellen. Die Genotyp-Verteilungen der sechs ausgewählten Gene von Interesse über der Zeit (Tag 16 und 34 nach Transfektion) waren ebenfalls ähnlich (9), was darauf hindeutet, dass das Expressionssystem bis zum Tag 34 die ursprüngliche, gleiche Verteilung der sechs Genotypen ohne Einführung einer Proliferations- bzw. Vermehrungstendenz aufrechterhielt.
Drittens zeigten die Zellen, die in Masse mit dem Gemisch aus sechs Genen von Interesse transfiziert waren, eine Expression aller sechs Antikörper, wie mittels Antigen-spezifischem ELISA an Überständen aus Zellen 34 Tage nach Transfektion (10) untersucht wurde. Die ELISA-Ergebnisse für die verschiedenen Antigene sind bezüglich der Antikörpermengen aufgrund der unterschiedlichen Bindungsaffinitäten nicht direkt vergleichbar.
Jedoch zeigte ein Capture-ELISA, basierend auf einem Beschichten mit Ziege-Anti-Maus-Kappa-Ketten-Antikörper, der mit Überständen aus a) den sechs einzeln transfizierten CHO-Flp-In-Zelllinien, die unter Verwendung der Vektorpräparation, wie in (d.1) beschrieben, erzeugt worden waren, und b) mit Überständen der polyklonalen Zelllinie, die ein Gemisch der sechs ausgewählten Gene von Interesse exprimiert, durchgeführt wurde, vergleichbare Antikörperexpressionslevel aus den sechs Genotypen.
Zusammenfassend wurde gezeigt, dass es machbar ist, ein polyklonales GOI in Masse aus einem Phagemid-Vektor in einen Säuger-Expressionsvektor zu transferieren. Dies wurde früher durch Sharon (US 5,789,208) beschrieben. Darüber hinaus konnte ein Gemisch aus Säuger-Expressionskonstrukten in Säugerzellen in Masse transfiziert werden und mit einer vergleichbaren Häufigkeit mindestens bis zu Tag 34 nach der Transfektion darin gehalten werden.
BEISPIEL 3A
Beurteilung der Erhaltung der Polyklonalität in Zellkulturen, die mittels Massentransfektion eines Subklons aus der CHO-Flp-In-Zelllinie mit der Mini-Six-Bibliothek erzeugt wurden.
(a) Subklonierung der "ursprünglichen" CHO-Flp-In-Zelllinie
Die ursprüngliche CHO-Flp-In-Zelllinie (Invitrogen) wurde kultiviert, wie beschrieben (Beispiel 3, Abschnitt e.1). Nach Trypsinbehandlung der Zellen wurden diese gezählt und mit einer Zelle pro Well in eine 96-Well-Kulturplatte ausgebracht. Ungefähr 14 Tage später wurden 20 Wells mit Einzelkolonien identifiziert, und die Zellen wurden mit Trypsin behandelt und in 24-Well-Platten überführt. Einer der Subklone, CHO-Flp-In-Klon 019, wurde für weitere Untersuchungen nach der Charakterisierung des Wachstumsverhaltens sowie der Expressionslevel ausgewählt.
(b) Massentransfektion und Auswahl bzw. Selektion von CHO-Flp-In-Klon 019-Zellen
Die Transfektion wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt, und die Auswahl bzw. Selektion der CHO-Flp-In-Klon 019-Zellen wurde wesentlich, wie beschrieben (Beispiel 3, Abschnitt e.2 und e.3) durchgeführt, mit der Ausnahme, dass ein Neomycin-Selektionsmarker den Hygromycin-Marker in pSymvc21 (4.e) ersetzte. Als Konsequenz wurde Geniticin (450 μg/ml) anstelle von Hygromycin B während der Selektion und Kultivierung der Zellen verwendet.
(c) ELISA von Proben, die aus CHO-Flp-In-Klon 019-Zellen erhalten wurden, die in Masse mit der Mini-Six-Bibliothek transfiziert wurden
Die Zellen wurden für 73 Tage nach der Transfektion kultiviert, und Proben für ELISA wurden am Tag 17, 31, 45, 59 und 73 genommen. Ein quantitativer ELISA (unter Verwendung einzeln aufgereinigter Mini-Six-Antikörper als Standards) wurde, wie beschrieben (Beispiel 3, Abschnitt f.2), durchgeführt. Die Ergebnisse aus drei unabhängigen Transfektionen sind in 12 gezeigt. Verschiedene Expressionsprofile zwischen verschiedenen Transfektionen wurden beobachtet. Jedoch waren alle sechs Antikörper in allen Experimenten bis zu Tag 59 detektierbar.
(d) Schlussfolgerung aus dem Versuch
Versuche mit dem Neomycin-Selektionssystem an CHO-Flp-In-Klon 019-Zellen zeigten relativ konservierte Expressionsprofile der einzelnen Chargen für zwei Monate nach der Massentransfektion (12). Eine solche Stabilitätsdauer ist ausreichend für Herstellungszwecke. Die beobachtete Charge-zu-Charge-Änderung kann bewältigt werden, indem eine große Gefrierstammkultur der einzelnen Charge vor der Produktion erzeugt und aufbewahrt wird.
BEISPIEL 3B
Beurteilung der Erhaltung der Polyklonalität in Zellkulturen, die durch Mischen einzeln transfizierter CHO-Flp-In-Zellen nach Auswahl bzw. Selektion erzeugt wurden.
(a) Einzelne Transfektion und Auswahl bzw. Selektion von CHO-Flp-In-Zellen
Die experimentellen Vorgehensweisen zur Erzeugung der sechs Zelllinien, die die einzelnen Mitglieder der Mini-Six-Bibliothek exprimieren, wurde zuvor beschrieben (Beispiel 3, Abschnitt e.3). Die sechs Zelllinien, die die einzelnen Mitglieder der Mini-Six-Bibliothek exprimieren, wurden unmittelbar nach der Auswahl bzw. Selektion in gleichen Anzahlen (5 × 10⁵ jeder Zelllinie) gemischt, und die gemischte Zellpopulation wurde 85 Tage lang kultiviert. Drei getrennte Gemische wurden aus den einzelnen Zelllinien hergestellt.
(b) ELISA der Proben, die aus den in (a) erzeugten polyklonalen Zellkulturen erhalten wurden
Alle 14 Tage wurden Proben genommen, und die Zusammensetzung der Antikörper, die von der Mini-Six-Bibliothek exprimiert wurde, wurde mittels ELISA, wie beschrieben (Beispiel 3, Abschnitt f.2) bestimmt. Der ELISA wurde am Tag 8, 17, 30, 45, 57, 72 und 85 nach dem Mischen durchgeführt. Die Ergebnisse (Mittelwert + Standardabweichung eines dreifach durchgeführten Versuchs) sind in 13 gezeigt. Alle sechs Antikörper waren 85 Tage nach dem Mischen detektierbar. Wie bereits zuvor erwähnt (Beispiel 3, Abschnitt f.2), waren die Ablesungen für verschiedene Antikörper nicht direkt vergleichbar, aber die Daten, die in 13 dargestellt sind, zeigen relativ stabile Expressionsprofile bis mindestens Tag 45 nach dem Mischen, nachdem eine allgemeine Abnahme der Produktivität beobachtet wird. Darüber hinaus zeigte ein Vergleich der Ergebnisse, die von drei unterschiedlichen Gemischen erhalten wurden, ähnliche Expressionsprofile der Mini-Six-Antikörper über die Zeit, was darauf hindeutet, dass die Ergebnisse reproduzierbar waren.
(c) Schlussfolgerung aus den Versuchen
Die polyklonalen Zellkulturen, die aus Gemischen von Zellen, die einzeln mit bestimmten Mitgliedern der Mini-Six-Bibliothek transfiziert worden waren, zusammengesetzt waren, zeigten einen Erhalt der Zusammensetzung (composition preservation) bis mindestens Tag 45 nach dem Mischen. Ein Erhalt der Zusammensetzung für 45 Tage wird in den meisten Fällen eine ausreichende Zeit für Herstellungszwecke sein. Darüber hinaus ergaben die dreifach durchgeführten Versuche ähnliche Ergebnisse, wodurch angedeutet wird, dass das Mischen von Zellen, die einzeln mit verschiedenen Konstrukten transfiziert wurden, in gemischten Zellkulturen mit geringer Charge-zu-Charge-Änderung resultiert.
BEISPIEL 4
Etablieren einer rekombinanten polyklonalen Anti-Ovalbumin-Antikörper-Herstellungszelllinie
(a) Expression einer polyklonalen Anti-Ovalbumin-Antikörperzusammensetzung
Eine Sammlung aus vollständig charakterisierten Ovalbumin-bindenden Phagen-Klonen wurde wie folgt identifiziert. Vier acht Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden i.p. und s.c. mit 50 μg OVA in vollständigem Freundschem Adjuvans immunisiert, und es wurde mit OVA in unvollständigem Freundschem Adjuvans an den Tagen 21 und 42 nach der Immunisierung am Tag 0 verstärkt, und es wurde bestätigt, dass alle Tiere Seren aufwiesen, die gegen OVA gerichtet waren, wie durch einen Antigen-spezifischen ELISA gemessen wurde. Die Milzen wurden von den am besten reagierenden Mäusen an den Tagen 31 und 52 entnommen (harvested). Fab-aufweisende (displaying) Phagemid-Bibliotheken wurden aus Milz-RNA unter Verwendung des Phagemid-Vektors (Symvc10), wie zuvor beschrieben, erzeugt. Die resultierenden Bibliotheken enthielten näherungsweise 10⁶ unabhängige Klone. Die Auswahl bzw. Selektion dieser Bibliotheken wurde durchgeführt, indem 5 × 10¹¹ Fab-aufweisende Phagemide mit OVA, beschichtet auf NUNC-Immunoröhrchen (NUNC immunotubes), zur Reaktion gebracht wurden, gefolgt von Waschen und Säureelution der bindenden Phagen. Da die Eluate aus der ersten Runde des Pannings einen signifikanten Anteil an OVA-Bindern enthielten, wurden die Eluate aus der ersten und der zweiten Runde des Pannings auf OVA-bindende Phagen-Klone hin durchmustert.
Anfänglich wurden OVA-reaktive Phagen-Klone mittels ELISA identifiziert. Kurz gesagt, wurden ELISA-Platten mit OVA beschichtet und mit den Phagen-displayed Fabs zur Reaktion gebracht, gefolgt von einem HRP-konjugierten Sekundärantikörper. Für Negativkontrollen wurden irrelevante Antigene (BSA) oder irrelevante Phagen-displayed Fabs (Anti-AP) verwendet.
Zusätzlich wurde ein HDS-Verfahren, basierend auf OVA-Immobilisierung an PVDF-Membranen, etabliert. Diese zwei Verfahren resultierten in der Identifizierung getrennter Untermengen von Klonen, d.h. von einigen Klonen, die OVA in einem Versuchsaufbau und nicht in dem anderen und umgekehrt erkannten. Für Fab-aufweisende Phagen-Klone, die mit OVA entweder durch ELISA oder HDS reagierten, wurde die Nucleotidsequenz, die für die variable Domäne von V_H codiert, durch DNA-Sequenzierung bestimmt, und die genetische Diversität wurde durch phylogenetische Analyse unter Verwendung des Vector NTI-Softwarepakets be stimmt. Die resultierenden Gruppen schließen 127 OVA-bindende Klone ein, wobei die Nucleotidsequenzen des variablen Teils von V_H für alle davon ermittelt wurden.
Fab-Fragmente, die durch die 127 OVA-bindenden Klone exprimiert wurden, haben alle die Fähigkeit, Ovalbumin entweder in nativer oder denaturierter Form zu binden. Aus diesem Satz identifizierten wir ungefähr 30 verschiedene Klone, die in einem Phagemid-Vektor enthalten waren, z.B. pSymvc10, der für Massentransfer und Säuger-Expression verwendet werden sollte. Diese Antikörper werden entweder in Form von Maus-IgA-, -IgG2A- oder -IgG2B-Antikörpern exprimiert. Weil wir die DNA-Sequenzen dieser Antikörper-produzierenden Klone vollständig charakterisiert haben, sind wir in der Lage, die Verteilung der Genotypen während der gesamten Massentransfer- und Säuger-Expressionsvorgehensweise unter Verwendung der gleichen Verfahren, wie sie für das Modellsystem mit den sechs bestimmten Antikörpern, wie in Beispiel 3 beschrieben, verwendet wurden, zu überwachen.
(b) Massentransfer der OVA-spezifischen Antikörpersequenzen in einen Vektor für Säuger-Expression
Der Transfer von Genen von Interesse aus einem Phagemid-Vektor in einen Expressionsvektor ist eine Zwei-Schritt-Vorgehensweise (veranschaulicht in 4), wobei der erste Schritt ein Austausch von Promotoren durch die Promotorkassette mit Kopf-an-Kopf-Orientierung der ausgewählten Säuger-Promotoren ist, darauf folgt das Transferieren des variablen Bereichs der Gene von Interesse und der Promotorkassette in einen Expressionsvektor. Die Kopf-an-Kopf-Promotorkassette (Promotor A/Promotor B) kann in den Phagemid-Vektor jedes Klons unter Verwendung eines SacI/XhoI-Verdaus, gefolgt von einer Ligation, was in einem Austausch von Promotoren von einem bakteriellen zu einem Säuger-Promotor (pSymvc12) resultiert, insertiert werden.
Ein EcoRI- und NotI-Verdau versetzt dann die Sequenzen, die für die variable schwere Kette codieren, die Kopf-an-Kopf-Promotorkassette (Promotor A/Promotor B) und die vollständige Kappa-Kette aus dem Phagemid-Vektor (pSymvc12) in einen Isotyp-codierenden Vektor, pSymvc20. Der pSymvc20-Vektor kann jedes NotI/EcoRI-Fragment aus dem Phagemid-Vektor aufnehmen. Dieses Fragment würde die Sequenz, die für die variable schwere Kette codiert, transferieren, die mit den Sequenzen der konstanten schweren Kette in pSymvc20 sowie der gesamten Sequenz, die für die Kappa-Kette codiert, die mit der bGH-Poly A-Sequenz verbunden werden soll, verbunden werden soll. Dieser Massentransfer resultiert in Expressionsvektoren, wie in 1 gezeigt, die die variablen schweren Bereiche und die gesamten Kappa-Ketten als Maus-IgG2B-Antikörper nach dem Massentransfer exprimieren.
Der Vektor, pSymvc20, kann die konstanten Regionen der schweren Kette der IgA-, IgG2A-, IgG2B-, IgE- oder IgG1-Gene der Maus enthalten und ist somit in der Lage, jeden der relevanten Maus-Immunglobulinisotypen der Wahl zu exprimieren.
(c) Expression eines rekombinanten polyklonalen Anti-Ovalbumin-Antikörpers
Durch Massentransfer werden die Sequenzen, die für den variablen Bereich der schweren Kette codieren, die Promotoren und die gesamte Kappa-Kette aus einer Phagen-Vektorbibliothek in Isotyp-codierende Vektoren versetzt, was in einer polyklonalen Säuger-Expressionsvektorzusammensetzung resultiert. Darauf folgen die Transfektion und die ortsspezifische Integration in eine CHO-Flp-In-Zelllinie, wobei eine rekombinante polyklonale Antikörper-Herstellungszelllinie erzeugt wird. Die zuletzt genannte Zelllinie wird erzeugt, indem auf die Gene von Interesse, die für jedes Mitglied des rekombinanten polyklonalen Proteins codieren, in dem gleichen spezifischen Ort in dem Genom jeder transfizierten Zelle abgezielt wird (targeting) und indem zur gleichen Zeit nur eine Kopie des Expressionskonstruktes, das die Nucleinsäuresequenz enthält, in jede transfizierte Zelle integriert wird.
Die Zellauswahl- bzw. -selektionsvorgehensweise ist die gleiche wie in Beispiel 3 (e.1-e.3) beschrieben.
(d) Überwachen der Zusammensetzungsstabilität
Um sicherzustellen, dass der Massentransfer und die Transfektion in Säugerzellen ohne Einführung einer merkbaren Tendenz hinsichtlich Klonierung, Expression und Diversität zwischen den einzelnen Klonen stattfindet, kann das Verfahren des Massentransfers und der Säuger-Expression mit den folgenden Verfahren überwacht werden:

1) Analyse der Generationszeit der Pools von Zellen aus jedem transfizierten Konstrukt,
2) Analyse des Expressionslevels der Pools von Zellen aus jedem transfizierten Konstrukt,
3) Analyse mittels RFLP an Einzelzellen,
4) ELISA der produzierten Antikörpermischung,
5) Massenspektrometrie der produzierten Antikörpermischung,
6) Analyse mittels Tagman-PCR (real-time PCR) an einer definierten Chargengröße unter Verwendung von V-Bereich-spezifischen Primern, um die Verhältnisse der einzelnen unterschiedlichen Klone zu ermitteln, oder
7) Analyse der Charge über die Zeit, kultiviert mit und ohne Selektionsdruck (Hygromycin); diese kann für die folgenden Parameter durchgeführt werden: a) klonale Verteilung, b) Proteinexpressionslevel (Menge und Verteilung), c) genomische Stabilität, d) Auswirkungen der Anpassung an serumfreies Medium.

(e) Herstellung einer rekombinanten polyklonalen Anti-Ovalbumin-Antikörperzusammensetzung
Die rekombinante polyklonale Antikörper-produzierende CHO-Flp-In-Zelllinie wird in verschiedenen Kultursystemen wachsen gelassen, einschließlich konventioneller kleiner Kulturkolben, mehrschichtiger Zellfabriken von Nunc (Nunc multilayer cell factories) und kleiner Bioreaktoren mit hoher Ausbeute (MiniPerm, INTEGRA-CELLine). Weiterhin werden die Zelllinien an eine serumfreie Suspension zur nachfolgenden Kultivierung in Rührer-Kolben (spinner flasks), Hohlfasern und Bioreaktoren angepasst.
Die verwendeten Medien, um die ausgewählten Zelllinien wachsen zu lassen, sind serumfrei, proteinfrei oder chemisch definierte Medien, wie vom Hersteller empfohlen (Invitrogen, B&D, Hyclone).
Die Überstände der anhaftenden Zellen oder Zellen in Suspension, die ohne Selektion (Hygromycin) kultiviert werden, werden gesammelt. Die gesammelten Überstände werden analysiert und charakterisiert, wie beschrieben (3f). Die Produktionsausbeuten, Funktionalität und Qualität der hergestellten Antikörper werden während und nach dem Wachstum der Zellen unter Fed Batch- oder Perfusionsbedingungen geprüft. Zellen in Suspension werden zum Beimpfen größerer Rührer-Kolben (spinner flasks) oder Bioreaktoren verwendet.
Der polyklonale Antikörper aus den gesammelten Überständen wird zur späteren Verwendung in Tieruntersuchungen aufgereinigt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Erzeugen einer Sammlung von Zellen, geeignet als rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie, wobei das Verfahren umfasst: a) Bereitstellen einer Vektorbibliothek, umfassend eine Population von varianten Nucleinsäuresequenzen, wobei jeder der Vektoren 1) eine Einzelkopie einer bestimmten Nucleinsäuresequenz, die für ein bestimmtes Mitglied eines polyklonalen Proteins kodiert, das bestimmte Mitglieder umfasst, die ein spezielles Antigen binden und 2) eine oder mehrere Rekombinase-Erkennungssequenzen umfasst, b) Einführen der Vektorbibliothek in eine Wirtszelllinie, wobei das Genom jeder einzelnen Zelle der Wirtszelllinie Rekombinase-Erkennungssequenzen, die zu denjenigen des Vektors passen, an einer einzelnen spezifischen Stelle in ihrem Genom umfasst, c) Sicherstellen des Vorhandenseins von einer oder mehreren Rekombinasen in den Zellen, so dass die varianten Nucleinsäuresequenzen aus Schritt (a) ortsspezifisch in die Zellen der Wirtszelllinie integriert werden, wobei die eine oder mehreren Rekombinasen entweder i) durch die Zellen, in die die Nucleinsäuresequenz eingeführt ist, exprimiert wird/werden oder ii) wirksam durch die Vektoren aus Schritt a kodiert wird/werden, iii) durch Expression von einem zweiten Vektor bereitgestellt wird/werden oder iv) der Zelle als Protein bereitgestellt wird/werden, und d) Auswählen bzw. Selektieren von Zellen, die eine integrierte Kopie aus der Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das polyklonale Protein nicht natürlich mit der Sammlung von Zellen assoziiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das polyklonale Protein ein polyklonaler Antikörper oder ein polyklonales Antikörperfragment ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das polyklonale Protein ein polyklonaler T-Zellrezeptor oder ein polyklonales T-Zellrezeptorfragment ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vektorbibliothek durch Massentransfektion („bulk transfection") einer Sammlung der Wirtszellen mit der Vektorbibliothek in die Wirtzelllinie eingeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-4, wobei die Vektorbibliothek in die Wirtszelllinie über eine Semi-Massentransfektion („semi-bulk transfection") von Aliquots der Wirtszellen mit Fraktionen, die 5 bis 50 einzelne Vektoren der Vektorbibliothek umfassen, eingeführt wird und die Zellen gepoolt werden, um vor oder nachfolgend auf den Selektionsschritt (d) eine Sammlung von Zellen, geeignet als rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie, zu bilden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-4, wobei die Vektorbibliothek zur ortsspezifischen Integration in die Wirtszelllinie eingeführt wird, indem die Wirtszellen getrennt mit einzelnen Mitgliedern der Vektorbibliothek transfiziert werden und die Zellen gepoolt werden, um vor oder nachfolgend auf den Selektionsschritt (d) eine Sammlung von Zellen, geeignet als rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie, zu bilden.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Population von varianten Nucleinsäuren in Schritt (a) mit Hilfe einer Screening-Vorgehensweise, die eine Identifikation und/oder eine Isolierung von Nucleinsäuren ermöglicht, die für Protein kodieren, welche das spezielle Antigen binden, isoliert oder identifiziert wird/werden.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Screening-Vorgehensweise einen Biopanning-Schritt und/oder einen Immunodetektionsassay einschließt.
Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei die Screening-Vorgehensweise ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Phagen-Display, Ribosomen-Display, DNA-Display, RNA-Peptid-Display, kovalentem Display (covalent display), Bakterienoberflächen-Display, Hefeoberflächen-Display, eukaryotisches Virus-Display, ELISA und ELISPOT.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen mindestens 3 variante Nucleinsäuresequenzen umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei einzelne Mitglieder der Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen in einen einzelnen zuvor definierten genomischen Locus einzelner Zellen in der Sammlung von Zellen, wobei der Locus in der Lage ist, eine Überexpression jedes Mitglieds des rekombinanten polyklonalen Proteins zu vermitteln, integriert werden.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jede bestimmte Nucleinsäuresequenz ein Paar von Genabschnitten umfasst, die für ein Mitglied eines polyklonalen Proteins kodieren, das aus zwei verschiedenen Polypeptidketten besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das Paar von Genabschnitten eine für einen variablen Bereich einer schweren Kette eines Antikörpers kodierende Sequenz und eine für einen variablen Bereich einer leichten Kette eines Antikörpers kodierende Sequenz umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das Paar von Genabschnitten eine für einen variablen Bereich einer T-Zell-Rezeptor-alpha-Kette kodierende Sequenz und eine für einen variablen Bereich einer T-Zell-Rezeptor-beta-Kette kodierende Sequenz umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das Paar von Genabschnitten eine für einen variablen Bereich einer T-Zell-Rezeptor-gamma-Kette kodierende Sequenz und eine für einen variablen Bereich einer T-Zell-Rezeptor-delta-Kette kodierende Sequenz umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen eine natürlich vorkommende Diversität umfasst, die innerhalb der varianten Nucleinsäuresequenzen lokalisiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die natürlich auftretende Diversität in den CDR-Bereichen lokalisiert ist, die in den varianten Nucleinsäuresequenzen vorhanden sind.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sammlung von Zellen von einer Säuger-Zelllinie oder einem -Zelltyp abgeleitet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die Säuger-Zelllinie ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters („Chinese Hamster ovary cells") (CHO-Zellen), COS-Zellen, BHK-Zellen, YB2/0, NIH 3T3, Myelomzellen, Fibroblasten, HeLa, HEK 293, PER.C6 und Zelllinien, die davon abgeleitet sind.
Verfahren zur Herstellung eines polyklonalen Proteins, wobei das polyklonale Protein bestimmte Mitglieder umfasst, die ein spezielles Antigen binden, wobei das Verfahren umfasst: a) Bereitstellen einer Sammlung von Zellen, die eine Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen umfasst, wobei jede der Nucleinsäuresequenzen für ein bestimmtes Mitglied des polyklonalen Proteins kodiert und wobei jede der Nucleinsäuresequenzen an der gleichen, einzelnen Stelle des Genoms der einzelnen Zelle in der Sammlung von Zellen integriert wird; b) Kultivieren der Sammlung von Zellen unter Bedingungen, die die Expression des polyklonalen Proteins ermöglichen bzw. erleichtern; und c) Gewinnen des rekombinanten exprimierten polyklonalen Proteins aus den Zellkulturzellen oder den Zellkulturüberständen.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Sammlung von Zellen in Schritt (a) gemäß dem Verfahren von einem der Ansprüche 1-20 erzeugt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 21 oder 22, wobei das polyklonale Protein nicht natürlich mit der Sammlung von Zellen assoziiert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21-23, wobei die Bibliothek aus varianten Nucleinsäuren in Schritt (a) in einem früheren Schritt mit Hilfe einer Screening-Vorgehensweise, die eine Identifikation und/oder eine Isolierung von Nucleinsäuren ermöglicht, die für Protein kodieren, welche das spezielle Antigen binden, isoliert oder identifiziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei die Screening-Vorgehensweise einen Biopanning-Schritt und/oder einen Immunodetektionsassay einschließt.
Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, wobei die Screening-Vorgehensweise ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Phagen-Display, Ribosomen-Display, DNA-Display, RNA-Peptid-Display, kovalentem Display (covalent display), Bakterienoberflächen-Display, Hefeoberflächen-Display, eukaryotisches Virus-Display, ELISA und ELISPOT.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21-26, wobei das polyklonale Protein ein polyklonaler Antikörper oder ein polyklonales Antikörperfragment ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21-26, wobei das polyklonale Protein ein polyklonaler T-Zell-Rezeptor oder ein polyklonales T-Zell-Rezeptorfragment ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21-28, wobei die relativen Expressionslevel der varianten Nucleinsäuresequenzen überwacht werden.
Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei die Expressionslevel auf mRNA-Ebene und/oder Proteinebene überwacht werden.
Verfahren gemäß Anspruch 29 oder 30, wobei das Kultivieren in Schritt (b) spätestens beendet wird, wenn die relativen Expressionslevel außerhalb des vorher festgelegten Bereiches sind.
Rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie, umfassend eine Sammlung von Zellen, transfiziert mit einer Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen, wobei jede Zelle in der Sammlung mit einem Mitglied der Bibliothek transfiziert ist und in der Lage ist, dieses zu exprimieren, welches für ein bestimmtes Mitglied eines polyklonalen Proteins kodiert, das ein spezielles Antigen bindet, und welches an der gleichen, einzelnen Stelle in dem Genom der einzelnen Zellen in der Sammlung lokalisiert ist, wobei die Nucleinsäuresequenz nicht natürlich mit der Zelle in der Sammlung assoziiert ist.
Rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie gemäß Anspruch 32, wobei die Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen für einen polyklonalen Antikörper oder ein polyklonales Antikörperfragment mit einer natürlich auftretenden Diversität zwischen den einzelnen Mitgliedern des polyklonalen Antikörpers oder der polyklonalen Antikörperfragmente kodiert.
Rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie gemäß Anspruch 32, wobei die Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen für einen polyklonalen T-Zell-Rezeptor oder ein polyklonales T-Zell-Rezeptorfragment mit einer natürlich auftretenden Diversität zwischen den einzelnen Mitgliedern des polyklonalen T-Zell-Rezeptors oder des polyklonalen T-Zell-Rezeptorfragments kodiert.
Rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie gemäß einem der Ansprüche 32-34, wobei die Sammlung von Zellen von einer Säuger-Zelllinie oder einem -Zelltyp abgeleitet ist.
Rekombinante polyklonale Herstellungszelllinie gemäß Anspruch 35, wobei die Säuger-Zelllinie ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters („Chinese Hamster ovary cells") (CHO-Zellen), COS-Zellen, BHK-Zellen, YB2/0, NIH 3T3, Myelomzellen, Fibroblasten, HeLa, HEK 293, PER.C6 und Zelllinien, die davon abgeleitet sind.
Vektorbibliothek für eine ortsspezifische Integration, umfassend eine Population von natürlich auftretenden varianten Nucleinsäuresequenzen, wobei jeder der Vektoren 1) eine Kopie einer bestimmten Nucleinsäuresequenz, die für ein bestimmtes Mitglied eines polyklonalen Proteins kodiert, das ein spezielles Antigen bindet und 2) eine oder mehrere Rekombinase-Erkennungssequenzen umfasst.
Bibliothek gemäß Anspruch 37, wobei die Population von natürlich auftretenden varianten Nucleinsäuresequenzen für einen polyklonalen Antikörper oder ein polyklonales Antikörperfragment kodiert.
Bibliothek gemäß Anspruch 37, wobei die Population von natürlich auftretenden varianten Nucleinsäuresequenzen für einen polyklonalen T-Zell-Rezeptor (oder) ein polyklonales T-Zell-Rezeptorfragment kodiert.
Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 37-39, wobei jedes Mitglied der Vektorbibliothek weiterhin eine für eine Rekombinase kodierende Nucleinsäuresequenz umfasst.
Sammlung von Zellen, umfassend eine Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen, wobei jede der Nucleinsäuresequenzen für ein bestimmtes Mitglied eines polyklonalen Proteins kodiert, umfassend bestimmte Mitglieder, die ein spezielles Antigen binden, wobei jede der Nucleinsäuresequenzen an der gleichen einzelnen Stelle des Genoms jeder einzelnen Zelle in der Sammlung von Zellen integriert ist und wobei die Nucleinsäuresequenz nicht natürlich mit der Zelle in der Sammlung assoziiert ist.
Sammlung von Zellen gemäß Anspruch 41, wobei die Bibliothek aus varianten Nucleinsäuresequenzen eine Bibliothek gemäß einem der Ansprüche 37-40 ist.
Sammlung von Zellen gemäß Anspruch 41 oder 42, wobei mindestens 50 % der kodierenden Sequenzen, die ursprünglich in der Bibliothek vorhanden sind, als unterschiedliche einzelne Mitglieder des endgültigen polyklonalen Proteins, das von der Sammlung von Zellen exprimiert wird, identifiziert werden können.
Polyklonalen Antikörper exprimierende Zelllinie, die mit einer Bibliothek von Paaren von V_H- und V_L-Genabschnitten transfiziert ist, wobei jede Zelle in der Zelllinie mit V_H- und V_L-Genpaar der Bibliothek transfiziert ist und in der Lage ist, dieses zu exprimieren, welches für ein bestimmtes Mitglied eines polyklonalen Antikörpers kodiert, der ein spezielles Antigen bindet, und welches an der gleichen einzelnen Stelle in dem Genom von einzelnen Zellen in der Zelllinie lokalisiert ist, wobei die Nucleinsäuresequenz nicht natürlich mit der Zelle in der Sammlung assoziiert ist.
Zelllinie gemäß Anspruch 44, wobei die Bibliothek aus Paaren von V_H- und V_L-Genabschnitten eine Bibliothek gemäß Anspruch 38 ist.