DE602004007813T2

DE602004007813T2 - Folsäure produzierende bifidobacterium bakterienstämme, ihre formulierungen und verwendung

Info

Publication number: DE602004007813T2
Application number: DE602004007813T
Authority: DE
Inventors: Giovanni Mogna; Gian Paolo Strozzi
Original assignee: Anidral SRL
Current assignee: Anidral SRL
Priority date: 2004-08-05
Filing date: 2004-08-05
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2024-08-06
Also published as: ITMI20051509A1; EP1673100B1; WO2006013588A1; EP1673100A1; PL1673100T3; JP4709838B2; ES2290762T3; JP2008509131A; US20090081167A1; BRPI0418986A; DE602004007813D1; CN101039687A; US8168171B2

Description

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Folsäure produzierende Bakterienstämme der Art Bifidobacterium, diese enthaltende pharmazeutische, tierärztliche oder Nahrungsformulierungen sowie deren Verwendung.
Insbesondere betrifft die Erfindung neue Bakterienstämme menschlichen Ursprungs der Art Bifidobacterium, Spezies adolescentis (2), der Art Bifidobacterium, Spezies breve (1) sowie der Art Bifidobacterium, Spezies pseudocatenulatum (2), die am 21. Juli 2004 im Sammlungszentrum DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; Braunsweig-Deutschland) entsprechend dem Budapester Vertrag hintergelegt wurden.
Den oben genannten Stämmen wurden jeweils die folgenden Identifikationscodes zugeordnet:
Bifidobacterium, Spezies adolescentis, DSM-Code 16594;
Bifidobacterium, Spezies adolescentis, DSM-Code 16595;
Bifidobacterium, Spezies breve, DSM-Code 16596;
Bifidobacterium, Spezies pseudocatenulatum, DSM-Code 16597;
Bifidobacterium, Spezies pseudocatenulatum, DSM-Code 16598.
BEREICH DER ERFINDUNG
Folsäure ist ein wichtiges wasserlösliches Vitamin B, das eine Kohlenstoffeinheit aus einem abgebenden Molekül annimmt.
Dank diesem Merkmal ist Folsäure ein zentrales Element bei einer großen Anzahl von Zellprozessen, einschließlich z.B. die Biogenesis von Methylgruppen und die Synthese von Nukleotiden, Vitaminen und vielen Aminosäuren.
Im Körper werden DNA-Replikation, -Reparation und -Methylation wirksamer mit der Zunahme der Folsäureverfügbarkeit.
Für diesen Grund benötigen die Gewebe mit einer hohen Wucherung und Erneuerungsrate, wie Leukozyten, Erythrozyten und Enterozyten, eine hohe Menge von Folsäure oder mindestens eine gute und konstante Verfügbarkeit von Folsäure.
Bei den Menschen wurde der Mangel von Folsäure mit einer hohen Zunahmen von Krebsgefahr assoziiert: z.B. zeigten epidemiologische Forschungen, daß die Gefahr der Verwicklung eines Brustkrebses nach der Menopause bei Frauen mit einer niedrigen Folsäureeinnahme höher ist.
Dagegen verringern hohe Mengen von Folsäure die Gefahr von kolonrektalem Krebs.
Folsäure (mit deren Salzen, die Folgte) spielt u.a. eine wesentliche Rolle für die Zellen, die die kolonrektale Schleimhautmembran bilden, die einem ständigen Prozess von Epithelerneuerung unterworfen sind. Die Rolle der Folsäure bei der Vorbeugung des kolonrektalen Krebses wurde in der Literatur beschrieben (Ref. 1). Es wurde insbesondere gezeigt, daß die Polymorphien der Gene, die für den Stoffwechsel der Methylgruppe verantwortlich sind, mit der Familiengefahr von kolorektalem Krebs assoziiert sind, und daß die Wirkung dieser Gene von der Verfügbarkeit von Folgten verändert wird (Ref. 2).
Daher kann eine niedrige oder verminderte lokale Verfügbarkeit von Folsäure zu DNA-Hypomethylation führen, was z.B. den Auftritt von Kolonkrebs fördert. Außerdem wird die Verfügbarkeit von hohen Mengen von Folsäure für Patienten mit Darm-Entzündungskrankheiten (IBD, inflammatory bowel diseases) empfohlen, da sie zur Regulierung der Zellenwucherung im Kolon und Rektum beiträgt.
Daher ist es sehr wichtig, ein Mittel zu finden, mit dem der Körper mit einer natürlichen, nicht-toxischen und endogen Quelle ausgestattet werden kann, die die notwendige Menge von Folsäure, oder deren Salze, stän dig liefern kann und so eine Alternative zu den konventionellen systemischen Methoden zur Verabreichung von diesem Stoff repräsentiert.
Leider wurde keine Lösung bislang gefunden, um diese Notwendigkeit zu erfüllen.
Es ist gut bekannt, daß das menschliche Kolon von einer komplexen und zahlreichen Mikrobengemeinschaft kolonisiert wird, die mit dem Gast aktiv zusammenwirkt. Die Bakterienkonzentration im Kolon ist ungefähr 10¹¹–10¹² Bakterien pro Gram von Darmgehalt.
Es gibt mindestens 400 Bakterienarten, aber 30–40 Arten allein repräsentieren ungefähr 95–98% der totalen Mikroflora.
Zwischen diesen Hauptarten sind die der Art Bifidobacterium eine der größten mikrobiellen Darmgruppen im Menschen.
Bifidobacterium ist eine bekannte Art für ihre worteilige Aktivität im Körper. Diese Aktivität umfasst z.B. die folgenden Wirkungen: Fähigkeit zur Wiederherstellung der Darmbakterienflora nach einer Therapie mit Antibiotika, Erhaltung eines Gleichgewichts zwischen den verschiedenen mikrobiellen Darmgruppen, Verringerung des Cholesterinspiegels im Serum, Herstellung von Vitaminen, Erleichterung der Laktoseintoleranz und Immunomodulation.
Die Bakterien der Art Bifidobacterium sind daher als Probiotika richtig angesehen und werden als solche geläufig in den pharmazeutischen, tierärztlichen und/oder Nahrungsbereichen verwendet.
Ein Probiotikum wird als eine lebende mikrobielle Ergänzung definiert, deren Aktivität für die Gesundheit der Menschen oder Tiere worteilig ist.
Zur Zeit kennt man keine probiotischen Stämmen, die Folsäure produzieren (Folsäure produzierende Bakterien der Art Lactobacillus und Lactococcus wurden beschrieben aber nicht als Probiotika vorgeschlagen).
Insbesondere kennt man keine probiotischen Bakterien der Art Bifidobacterium, die sich in einem Kulturmedium ganz ohne Folsäure entwickeln und diese in hohen Mengen produzieren.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Unerwartet hat die Anmelderin gefunden, daß Stämme von probiotischen Bakterien menschlichen Ursprungs der Art Bifidobacterium, insbesondere der Art Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium breve und Bifidobacterium pseudocatenulatum, Folsäure produzieren, wie in der Folge und in den beiliegenden Ansprüchen ausführlich beschrieben wird.
Genauer, wie in der Folge und in den beiliegenden Ansprächen ausführlich beschrieben wird, hat die Anmel derin fünf neue Bakterienstämme menschlichen Ursprungs der Art Bifidobacterium isoliert und im DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; Braunsweig-Deutschland) am 21. Juli 2004 hintergelegt. Zwei von diesen fünf neuen Bakterienstämmen gehören der Art Bifidobacterium adolescentis, einer der Art Bifidobacterium breve, und zwei der Art Bifidobacterium pseudocatenulatum. Den benannten Stämmen wurden jeweils die folgenden Identifikationscodes zugeordnet:
DSM 16594;
DSM 16595;
DSM 16596;
DSM 16597;
DSM 16598.
Die benannten Bakterienstämme wurden taxonomisch und technologisch charakterisiert, wie unten beschrieben, und zeigten eine Produktion hoher Mengen von Folsäure. Tatsächlich können die benannten Stämme sich in einem Kulturmedium ohne Folsäure entwickeln.
Insbesondere können die benannten Stämme jeweils die folgenden Mengen von Folsäure produzieren: 56–62, 16–20, 6–9, 14–16 e 14–19 ng/ml Kulturmedium.
Weiter hat man unerwartet bemerkt, daß die Biosynthese von Folsäure durch die Bakterienstämme der Erfindung keinem negativen Regulierungsmechanismus (negativem Feedback) des sich ergebenden Produktes oder irgendeinen anderen Produkten schon im Kulturmedium unterworfen ist.
Um es anders zu sagen, bleibt die Produktion von Folsäure unter physiologischen Bedingungen konstant, unabhängig davon, daß diese in der Umgebung anwesend ist.
Endlich hat man bemerkt, daß pH-Änderungen, die typisch des Kolon-Ökosystems (zwischen ca. 7 und 5 sich ändernde pH-Werten werden abhängig von bestimmten Pathologien oder Diättypen als wahrscheinlich angesehen) sind, die Produktivität der Stämme der vorliegenden Erfindung nicht negativ beeinflussen.
Die Mikroorganismen diesen Typs können daher ihre bekannten probiotischen Merkmale (d.h. worteilig für den Körper) mit einer Fähigkeit zur in situ Folsäure-Produktion (z.B. im Kolon) kombinieren.
Deshalb stellen diese Stämme sich unerwartet als die gewünschte Lösung zum technischen Problem der vorliegenden Erfindung vor, wie es oben erläutert wurde. Tatsächlich repräsentieren die benannten Mikroorganismen eine ideale, natürliche, nicht-toxische und endogene Quelle von Folsäure.
Die Verwendung von geeigneten Formulierungen enthalten die Folsäure produzierenden Bifidobakterien der vor liegenden Erfindung kann daher eine ständige in situ Produktion von Folsäure ermöglichen.
Die probiotischen Bakterien der vorliegenden Erfindung können auf verschiedene Weisen verabreicht werden, abhängig von den Bedürfnissen des Patienten oder Verbrauchers.
Nach einem bevorzugten Aspekt betrifft die vorliegenden Erfindung pharmazeutischen, tierärztlichen und/oder Nahrungsformulierungen umfassend mindestens einen der Bakterienstämme der vorliegenden Erfindung oder ein Gemisch davon.
Besonders bevorzugt sind Formulierungen umfassend mindestens einen der Stämme DSM 16594, DSM 165695, DSM 16596, DSM 16597 und DSM 16598 o irgendeine Kombination davon.
Nach einem weiteren bevorzugten Aspekt können die Stämme der vorliegenden Erfindung ebenfalls in Kombination mit anderen probiotischen Bakterienstämmen mit komplementären Merkmalen, d.h. mit unterschiedlichen intrinsischen Eigenschaften, formuliert werden.
Ein nicht-beschränkendes Beispiel solcher Formulierungen kann dargestellt werden durch mindestens einen der Bakterienstämme der vorliegenden Erfindung in einem geeigneten Gemisch mit einem probiotischen Bakterienstamm mit dem Merkmal, daß er auf der intestinalen Schleimhautmembran stark haftet.
Die Stämme der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in Kombination mit anderen Stämmen formuliert werden, die neben den intrinsischen worteiligen Merkmalen deren Bakterienart andere charakteristischen Merkmale zeigen, die für die Gesundheit des Gastes nützlich sind.
Die benannten Mischformulierungen können zahlreiche probiotische Eigenschaften in eine einzige Formulierung kombinieren, wodurch sie dem Körper eine Vielzahl von Vorteilen sowie sich daraus ergebende potentielle Synergien in einer einzigen Verabreichung anbieten. Gemäß den obigen Bemerkungen scheint es klar, daß der Fachmann viele Kombinationen von probiotischen Bakterien nach seiner Erfahrung gestalten kann. Solche Kombinationen fallen daher auch in den Bereich der vorliegenden Erfindung.
Beispielhaft und nicht-beschränkend können die benannten probiotischen Bakterien u.a. aus der Art Lactobacillus, einschließlich solche Arten wie Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei Subspezies rhamnosus, Lactobacillus casei Subspezies paracasei, Lactobacillus salivarius Subspezies salivarius und Lactobacillus pentosus, oder aus der Art Streptococcus, einschließlich solche Arten wie Streptococcus delbrueckii Subspezies Thermophilus ausgewählt werden.
Zwischen diesen umfassen die besonders bevorzugten Stämme z.B. die folgenden:

– Lactobacillus acidophilus LMG P-21381 (im Belgian Coordinated Collections of Microorganisms – BCCM LMG Collection am 31. Januar 2002 hintergelegt);
– Lactobacillus casei Subspezies paracasei LMG P-21380 (im Belgian Coordinated Collections of Microorganisms – BCCM LMG Collection am 31. Januar 2002 hintergelegt);
– Lactobacillus plantarum LMG P-21021 (im Belgian Coordinated Collections of Microorganisms – BCCM LMG Collection am 16. Oktober 2002 hintergelegt);
– Lactobacillus pentosus LMG P-21019 (im Belgian Coor dinated Collections of Microorganisms – BCCM LMG Col lection am 16. Oktober 2002 hintergelegt);
– Lactobacillus plantarum LMG P-21020 (im Belgian Coordinated Collections of Microorganisms – BCCM LMG Collection am 16. Oktober 2002 hintergelegt);
– Lactobacillus plantarum LMG P-21022 (im Belgian Coordinated Collections of Microorganisms – BCCM LMG Collection am 16. Oktober 2002 hintergelegt);
– Lactobacillus plantarum LMG P-21023 (im Belgian Co ordinated Collections of Microorganisms – BCCM LMG Collection am 16. Oktober 2002 hintergelegt);
– Bifidobacterium lactis LMG P-21384 (im Belgian Coor dinated Collections of Microorganisms – BCCM LMG Col lection am 31. Januar 2002 hintergelegt);
– Streptococcus delbrueckii Subspezies thermophilus DSM 16506 (im DSMZ am 18. Juni 2004 hintergelegt);
– Streptococcus delbrueckii Subspezies thermophilus DSM 16507 (im DSMZ am 18. Juni 2004 hintergelegt);
– Bifidobacterium longum DSM 16603 (im DSMZ am 20. Ju li 2004 hintergelegt);
– Bifidobacterium breve DSM 16604 (im DSMZ am 20. Juli 2004 hintergelegt);
– Lactobacillus casei Subspezies rhamnosus DSM 16605 (im DSMZ am 20. Juli 2004 hintergelegt).

Deshalb werden besonders bevorzugten Mischformulierungen der Erfindung mindestens einen der Bakterienstämme von DSM 16594 bis DSM 16598, oder irgendein Gemisch davon, geeignet formuliert in Kombination mit mindestens einem der oben aufgeführten probiotischen Bakterienstämme, oder irgendeinem Gemisch davon, umfassen. Vorzüglich werden die benannten probiotischen Bakterienstämme aus der Gruppe umfassend:

– Lactobacillus acidophilus LMG P-21381;
– Lactobacillus casei Subspezies paracasei LMG P- 21380;
– Lactobacillus plantarum LMG P-21021;
– Lactobacillus pentosus LMG P-21019;
– Lactobacillus plantarum LMG P-21020;
– Lactobacillus plantarum LMG P-21022;
– Lactobacillus plantarum LMG P-21023;
– Bifidobacterium lactis LMG P-21384;
– Streptococcus delbrueckii Subspezies thermophilus DSM 16506;
– Streptococcus delbrueckii Subspezies thermophilus DSM 16507;
– Bifidobacterium longum DSM 16603;
– Bifidobacterium breve DSM 16604;
– Lactobacillus casei Subspezies rhamnosus DSM 16605,

Die Anzahl und der Typ von Bakterienstämmen, die in die benannten Mischformulierungen kombiniert werden sollten, wird vom Fachmann abhängig von dem Typ und der Schiere der zu behandelnden oder vorzubeugenden Pathologie oder von dem Typ des zu erhaltenden gewünschten Nahrungsprodukt entschieden.
Nach einem weiteren bevorzugten Aspekt können die Bakterienstämme der vorliegenden Erfindung, allein oder in Kombination mit einem anderen und/oder mit anderen probiotischen Bakterienstämmen verwendet, in Kombination mit anderen Stoffen mit prebiotischen Eigenschaften weiter formuliert werden.
Vorzüglich umfassen die benannten Stoffe mit prebiotischen Eigenschaften insbesondere Kohlenhydrate, die vom Menschen nicht verdaut und absorbiert werden und daher ins Kolon ganz unberührt gelangen, worin sie die Entwicklung und Aktivität einer Anzahl von worteiligen mikrobiellen Gruppen, insbesondere Bifidobakterien, selektiv stimulieren.
Besonders bevorzugt zwischen den benannten prebiotischen Kohlenhydraten sind die aus der Gruppe umfassend: Fructo-Oligosacchariden (FOS), insbesondere Inulin, Isomalto-Oligosacchariden, resistente Stärke, Pectin, Galakto-Oligosacchariden (GOS), Arabinogalaktan, Xylo-Oligosacchariden (XOS), Chitosan-Oligosacchariden (COS) und Glucomannan.
Beispielhaft und nicht beschränkend umfassend bevorzugte Formulierungen mindestens einen den Bakterienstämme von DSM 16594 bis DSM 16598, oder irgendein Gemisch davon, geeignet formuliert in Kombination mit mindestens einem Stoff mit prebiotischen Eigenschaften, der z.B. aus den oben aufgeführten Stoffen ausgewählt wird, d.h. Fructo-Oligosacchariden (FOS), insbesondere Inulin, Isomalto-Oligosacchariden, resistenter Stärke, Pectin, Galakto-Oligosacchariden (GOS), Arabinogalaktan, Xylo-Oligosacchariden (XOS), Chitosan-Oligosacchariden (COS) und Glucomannan.
Bevorzugte Formulierungen der Erfindung umfassen ebenfalls mindestens einen der Bakterienstämme von DSM 16594 bis DSM 16598, oder irgendein Gemisch davon, geeignet formuliert in Kombination mit mindestens einem der oben aufgeführten probiotischen Bakterienstämme, oder irgendeinem Gemisch davon, und mit mindestens einem Stoff mit prebiotischen Eigenschaften, der z.B. aus den oben aufgeführten Stoffen ausgewählt wird, d.h. Fructo-Oligosacchariden (FOS), insbesondere Inulin, Isomalto-Oligosacchariden, resistenter Stärke, Pectin, Galakto-Oligosacchariden (GOS), Arabinogalaktan, Xylo-Oligosacchariden (XOS), Chitosan-Oligosacchariden (COS) und Glucomannan.
Bevorzugt werden diese probiotischen Bakterienstämme aus der Gruppe umfassend:

Die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen solche Formulierungen, worin die Stämme der Erfindung in gefriergetrockneter Form vorzüglich verwendet werden.
Die Stämme der Erfindung werden in Kombination mit geeigneten Trägerstoffen, Hilfsstoffen, Aromastoffen, Stabilisatoren und Zusatzstoffen bevorzugt formuliert, wie z.B. Aminosäuren, Vitaminen, Antioxydationsmittel, Enzymen, die bei der Herstellung von pharmazeutischen und/oder Nahrungsvorbereitungen geläufig verwendet werden.
Nur beispielhaft und nicht beschränkend kann man zwischen den besonders bevorzugten Zusatzstoffen Glutamin, Arginin, Superoxid-Dismutase und Glutathion nennen.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung können in oraler Form, mit Suppositorien, oder mit Vaginaltabletten oder – kapseln, als solche oder in Kombina tion mit Nahrungsprodukten wie z.B. Milch, Yoghurt, Milchderivaten oder gegorener Milch verabreicht, zur Behandlung und/oder Prävention von Darm-Entzündungsstörungen (Diarrhöe, Therapie mit Antibiotika, IBD, Prävention von Kolonkrebs), worin eine geeignete Menge von Folsäure verabreicht werden sollte. Wie oben angegeben, können die Formulierungen der vorliegenden Erfindung ebenfalls nach oder bei Therapien mit Antibiotika verabreicht werden, um das Gleichgewicht von nicht-pathogener Darmflora wiederherzustellen.
Besonders bevorzugte Formulierungen sind solche, die in oraler Form, durch Suppositorien oder Vaginalkapseln oder -tabletten verabreicht werden sollten. Typische Formulierungsformen umfassen z.B. Kapseln, orale Lösungen oder Suspensionen, Pulvern in Tütchen oder dergleichen, Tabletten, Suppositorien und Pessaren.
Betreffend der Dosierung wird jede Formulierung in der Regel von 10⁵ bis 10¹¹ Zellen von jedem Bakterienstamm pro Einzeldose enthalten, bevorzugt von 10⁶ bis 10¹¹ Bakterien pro Dose, bevorzugter von 10⁷ bis 10¹⁰ Bakterien pro Dose.
Im allgemeinen kann die Konzentration des Wirkstoffes, oder des Gemisches von Wirkstoffen, von 10⁸ Zellen von Bakterienstamm(-stämmen) pro Gram von Formulierung 10¹¹ Zellen pro Gram betragen; bevorzugt von 10⁹ Zellen pro Gram bis 10¹⁰ Zellen pro Gram von Formulierung. Ein Beispiel von potentiellen Anwendungen der vorliegenden Erfindung, das keineswegs deren Bereich beschränkt, betrifft einen Fall, worin die Stämme der Erfindung einem Erwachsenen unter Therapie mit Antibiotika verabreicht wurden.
Für die ganze Dauer der Therapie mit Antibiotika und für fünf Tage nach deren Ende erhielt der benannte Patient zwei Tütchen pro Tag einer gefriergetrockneter Formulierung von DSM 16594 und DSM 16595 in Kombination mit den probiotischen Stämmen DSM 16506 und LMG P-21380 und mit Glutamin.
Das Gehalt jedes Tütchens, das in der Form einer oralen Suspension in Wasser verabreicht wurde, umfasste ungefähr 10¹⁰ Zellen von jedem Bakterienstamm und als Hilfsstoffen Stärke, Tween, Dispergiermittel, Mandarinenaromastoff, Acesulfam, Saccharin, Ascorbinsäure und Methylparaben.
Die Bakterienstämme der vorliegenden Erfindung zeigten ebenfalls, daß sie zur Verbesserung des Nährwertes von Nahrungsprodukten besonders nützlich ist. Besonders bevorzugte Nahrungsprodukte sind solche, die von Milch herkommen, z.B. Yoghurt und gegorene Milch sowie Snackfüllungen, Eis usw.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
– ISOLIERUNG DER STÄMME
Der Stamm Bifidobacterium adolescentis DSM 16594 wurden aus dem Kot eines Erwachsenen isoliert, der keine Antibiotika oder probiotischen Vorbereitungen in den 3 Monaten vor der Isolierung annahm.
Eine 10%ige Suspension von frischem Kot wurde in einer anaeroben Brühe Wilkins-Chalgren (Oxoid Limited, Basingstoke, Hampshire, England, UK) bei einer Konzentration 0,5 × vorbereitet, d.h. einer 1:1 Verdünnung des erhaltenen Mediums gemäß den Anweisungen auf der Packung.
Serielle Verdünnungen bis 10^–9 wurden aus dem Homogenat vorbereitet (1:10 Verdünnungen, die mit der Verdünnung von 1 ml der vorherigen Verdünnung in 9 ml desselben Mediums erhalten wurden). 0,1 ml Aliquoten der Verdünnungen von 10^–6 bis 10^–9 wurden in einem für Bifidobakterien selektiven Medium, d.h. Agar RB plattiert (Ref. 3).
Die Platten wurden unter anaeroben Bedingungen bei 37°C für 48 Stunden inkubiert.
Alle Vorbereitungen wurden in einer anaeroben Kammer (Gerät: Anaerobic System, Mod. 2028, Forma Scientific Co., Marietta, OH) in der folgenden Atmosphäre: N₂ 85%, CO₂ 10%, H₂ 5%, hergestellt.
Die dem Bakterienstamm DSM 16594 entsprechende Colonie wurde zwischen den Kolonien isoliert, die einen gelben Halo erzeugten, der vom Ansäuerung des Mediums und von der Farbenänderung des Indikators abhängt.
– ZUORDNUNG ZUR ART Bifidobacterium UND ZUR SPEZIES
Bifidobacterium adolescentis
Um DSM 16594 zur Art Bifidobacterium zuzuordnen, wurde eine artspezifischen Amplifikation unter Verwendung von 16S rDNA-direkten Primers Bif164/Bif662 durchgeführt, aus der der korrigierte Amplikon von 523 bp erhalten wurde. Gleichzeitig wurde eine biochemische Prüfung zur Identifizierung des Basisenzyms des Kohlenhydrat-Stoffwechsels in den Bifidobakterien, d.h. Fructose-6-Phosphat Phosphoketolase, durchgeführt. Die Spezies adolescentis wurde durch DNA-DNA Hybridisierung identifiziert, wie in der Schrift Scardovi et al. beschrieben ist (Ref. 4).
– MERKMALE DES STAMMES DSM 16594

Ursprung: Mensch
Alter: 39 Geschlecht: F
Art: Bifidobacterium
Spezies: adolescentis
Morphologie: unregelmäßige Stäbchen, manchmal bifider Form, mit Vorsprüngen und Schwellungen
Folsäureproduktion: von 56 bis 62 ng/ml
Plasmide: nein

Die anderen Bakterienstämme, DSM 16595, DSM 16596, DSM 16597 und DSM 16598, wurden unter Verwendung einer Prozedur isoliert, die ähnlich wie der oben beschrieben ist.
– MERKMALE DES STAMMES DSM 16595

Ursprung: Mensch
Alter: 37 Geschlecht: F
Art: Bifidobacterium
Spezies: adolescentis
Morphologie: unregelmäßige Stäbchen, manchmal bifider Form, mit Vorsprüngen und Schwellungen
Folsäureproduktion: von 16 bis 20 ng/ml
Plasmide: nein

– MERKMALE DES STAMMES DSM 16596

Ursprung: Mensch
Alter: 39 Geschlecht: F
Art: Bifidobacterium
Spezies: breve
Morphologie: kurze, unregelmäßige Stäbchen
Folsäureproduktion: von 6 bis 9 ng/ml
Plasmide: nein

– MERKMALE DES STAMMES DSM 16597

Ursprung: Mensch
Alter: 56 Geschlecht: M
Art: Bifidobacterium
Spezies: pseudocatenulatum
Morphologie: unregelmäßige Stäbchen
Folsäureproduktion: von 14 bis 16 ng/ml
Plasmide: ja, ein von ca. 9 kb

– MERKMALE DES STAMMES DSM 16598

Ursprung: Mensch
Alter: 56 Geschlecht: M
Art: Bifidobacterium
Spezies: pseudocatenulatum
Morphologie: unregelmäßige Stäbchen
Folsäureproduktion: von 14 bis 19 ng/ml
Plasmide: ja, ein von ca. 9 kb

– STAMMENTWICKLUNGSBEDINGUNGEN
Die bevorzugten Bakterienstämme der vorliegenden Erfindung, DSM 16594, DSM 16595, DSM 16596, DSM 16597 und DSM 16598, wurden in Stichkulturen, d.h. Stichkulturen in Agar (10 ml Proben enthaltend 10 ml von 0,9% agarisiertem Medium) oder in flüssigen MRS Kulturen (Bacto Lactobacilli MRS Broth [0881-17] Difco Laboratories, Division of Becton Dickinsons and Company, Sparks, Maryland 21152 USA), zu den Cystein (0,05%) zugesetzt wurde, aufbewahrtet.
Das Medium, das nach den Anweisungen auf der Packung vorbereite wurde, wurde bei 110°C für 30' sterilisiert.
Wenn die Stämme in einer Umgebung ohne Folsäure kultiviert werden, wird ein sogenanntes synthetischem Minimummedium verwendet; es ist mit Nr. 7 identifiziert und hat die unten beschriebenen Zusammensetzung.
Das benannte Medium wird durch Mischen der Komponenten und Lösung in der angegebenen Reihenfolge unter Rühren bei Raumtemperatur vorbereitet.

Das Medium wird jedes Mal frisch hergestellt. MINIMUM-KULTURMEDIUM NR. 7

Glukose Vitamin Assay Casaminoacids	20 g/l
(DIFCO Laboratories, USA [0288-17]	5 g/l
Harnstoff	2 g/l
Cystein	0,5 g/l
Lösung A	700 ml/l
Lösung B	1 ml/l
Lösung C	1 ml/2
Lösung D	5 ml/l

Die Lösungen A, B, C und D haben die folgende Zusammensetzung: Lösung A

(NH₄)₂SO₄ 10 g

Natriumacetat 10 g

Ascorbinsäure 10 g

KH₂PO₄ 1 g

MgSO₄ 0,7 g

NaCl 0,2 g

Tween 80 1 ml
Tween 80 wird in 700 ml von siedendem destilliertem Wasser gelöst; dann werden alle anderen Komponenten in der Reihenfolge zugesetzt. Lösung B

Borsäure 25 mg

CuSO₄ 2 mg

KI 5 mg

FeCl₃ 10 mg

MnSO₄ 20 mg

Natriummolybdat 10 mg

ZnSO₄ 20 mg
Diese Komponenten werden in der Reihenfolge in 50 ml von destilliertem Wasser bei Raumtemperatur gelöst. Lösung C

Biotin 0,2 mg

Kalziumpantotenat 40 mg

Niacin 40 mg

p-Aminobenzoesäure 20 mg

Pyridoxin 40 mg

Riboflavin 20 mg

Thiamin 40 mg
Diese Komponenten werden in 100 ml von destilliertem Wasser bei Raumtemperatur gelöst. Lösung D

FeSO₄ 50 mg
Der Salz wird in 25 ml von destilliertem Wasser gelöst.
Das Medium wird in 10 ml Proben geliefert und bei 100°C für 30' sterilisiert.
– MIKROBIOLOGISCHE PRÜFUNG DER VOM STAMM DSM 16594 PRODUZIERTEN FOLSÄURE
Die Menge von Folsäure, die unter Fermentation vom Stamm DSM 16594 sowie von den anderen Stämmen der Erfindung produziert wurde, wurde durch eine mikrobiologische Prüfung bestimmt.
Die Kulturen, die für die Bestimmung der Folsäureproduktivität verwendet wurden, wurden mindestens 3-mal ins Minimummedium Nr. 7, enthalten kein Folsäure, verpflanzt.
Die Prüfung stützt sich auf eine turbidimetrische Bestimmung der Entwicklung von Enterococcus hirae ATCC 8043, die sich abhängig von der Menge von Folsäure in der Kulturbrühe ändert.
Die Kalibrierkurve zur quantitativen Bestimmung der produzierten Folsäure wird durch eine Kultur von Ente rococcus hirae ATCC 8043, einem Medium Bacto Folic AOAC (Difco, USA [0967-15]) erhalten.
Diesem Medium, das alle zur Entwicklung notwendigen Nährkomponenten aber nicht Folsäure enthält, werden zunehmende Mengen von Folsäure (0, 1, 2, 4, 6 und 8 ng pro Probe enthaltend 10 ml von Kulturbrühe) zugesetzt. Gleichzeitig wird Enterococcus hirae ATCC 8043 in Proben von Medium Bacto Folic AOAC inokuliert, zu dem verschiedene Mengen des Überstandes des Fermentationsbrühe des Stammes DSM 16594 zugesetzt werden.
Wenn alle Proben bei 37°C für 16–18 Stunden inkubiert worden sind, wird ein turbidimetrische Lesen der Proben bei 600 nm durchgeführt und ein linearer Graph auf einer semi-logarithmischen Skala durch Plottierung des Logarithmus der Folsäurekonzentration abhängig von der optischen Dichte der Probe gezeichnet.
Vorbereitung der Standardlösunq (s.s.) von Folsäure bei einer Konzentration von 2 μg/l, d.h. 2 ng/ml 50 mg von Folsäure in ungefähr 30 ml von 0,01 N Natriumhydroxid und 300 ml H₂O lösen. Den pH auf 7,5 mit verdünnter HCl (0,1 N) korrigieren und das Volumen auf 500 ml durch Zusatz von H₂O einstellen. 2 ml der oben beschriebene Lösung zu 50 ml H₂O zusetzen, den pH auf 7,5 korrigieren und das Volumen auf 100 ml durch Zusatz von H₂O bringen (Standardlösung von 2 μg/ml).
1 ml dieser Lösung auf 1 Liter mit H₂O verdünnen, um die Standardlösung von 2 ng/ml (2 μg/l) zu erhalten.
Herstellung von Proben enthalten Bacto-Folsäure Medium
11 g des Anfangspulvers in 100 ml H₂O lösen. Um die Komponenten völlig zu lösen, das Medium für 2–3 Minuten sieden lassen. 5 ml Aliquoten in die Proben liefern, nachdem die Proben mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen wurden. Verschieden Aliquoten des Überstandes der Fermentationsbrühe oder die Standardlösung von Folsäure (2 ng/ml) zusetzen und dann H₂O zusetzen, um das Endvolumen jeder Proben auf 10 ml zu bringen. Bei 121°C für 5' sterilisieren.

ng Folsäure pro Probe 0 1 2 4 6 8 10

ml a.l. 2 ng/ml 0 0,5 1 2 3 4 5

ml Wasser 5 4,5 4 3 2 1 0

μg Folsäure pro 1 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1
4 ml Wasser und 1 ml von Überstand der Fermentationsbrühe, der durch Zentrifugierung und Filtration mit einem 0,22 μ Filter und dann geeignete Verdünnung erhalten wurde, werden zu den anderen 2 Proben zugesetzt.
Eine Probe enthalten keine Folsäure wird als Blindprobe hergestellt; sie wird nicht inokuliert.
Herstellung des Inokulums
Zwei Tage vor der Prüfung wird eine frische Stichkul tur von Enterococcus hirae ATCC 8043 in eine Probe enthalten flüssiges M17 Medium (Bacto M17 Broth, Difco Laboratories, USA [1856-17]) inokuliert. Zur Herstellung der als Inokulum zu verwendenden Kultur wird die Kultur in M17 steril zentrifugiert, der Überstand wird entfernt und die Zellen werden 3-mal mit 9 ml von physiologischer Lösung gewaschen. Der Zellpellet wird wieder in 9 ml von physiologischer Lösung suspendiert und diese Bakteriensuspension wird zu 100 ml von steriler physiologischer Lösung zugesetzt, die in einem Erlenmayer-Flasche enthalten ist. Ein Tropfen dieser Suspension wird in eine Probe von Bacto Folic AOAC Medium zugesetzt, in die ebenfalls 10 ng Folsäure zugesetzt werden, und die Probe wird bei 37°C ohne Rühren inkubiert.
Am Testtag wird die nach der oben beschriebenen Prozedur vorbereitete Kultur zur Herstellung des Testinokulums verwendet: Die Kultur wird steril zentrifugiert, der Überstand wird entfernt und die Zellen werden 3-mal mit 9 ml von physiologischer Lösung gewaschen. Die Zellen werden wieder in 9 ml von physiologischer Lösung suspendiert und 1 ml dieser Bakteriensuspension wird zu 100 ml von steriler physiologischer Lösung zugesetzt, die in einem Erlenmayer-Flasche enthalten ist. Um die Testproben zu inokulieren, wird ein Trop fen dieser Suspension zu allen bei 121°C für 5' sterilisierten Proben zugesetzt.
Die proben werden dann bei 37°C für 16–18 Stunden inkubiert.
– PRODUKTIVITÄT IN REINER KULTUR
Die aus dem Stamm DSM 16594 im Minimummedium Nr. 7 produzierte Folsäure beträgt 56–62 ng/ml.
Die Tests liefern konstante und reproduzierbare Ergebnisse, wenn sie an Kulturen ohne pH-Steuerung und an Kulturen in Bioreaktoren mit konstantem pH-Wert durchgeführt werden.
In der Regel kann der pH-Wert der Stoffe im Kolon viel sich ändern, anhängig von bestimmten Pathologien oder mit der Diät verbundenen Faktoren. Die Folsäureproduktion von DSM 16594 zeigt, konstant zu sein (ca. 57–60 ng/ml) unabhängig vom gemessenen pH-Wert, der sich von 5,5 bis 7,0 ändert.
Man hat auch bemerkt, daß der Stamm DSM 16594 Folsäure produziert, ohne von negativen Feedbacks beeinflusst zu werden, daher in einer Menge, die von der Konzentration von Folsäure im Darmgehalt völlig unabhängig ist. Tatsächlich wurde der Stamm DSM 16594 ebenfalls im Minimummedium Nr. 7 in Anwesenheit von zunehmenden Konzentrationen von Folsäure (0, 1, 2, 5, 10 und 20 ng/ml) kultiviert und man bemerkte, daß der Stamm im mer konstante Mengen von Folsäure (58–61 ng/ml) synthetisiert und absondert, die dann zu den schon im Medium vorliegenden Mengen zugesetzt werden. Dieser Aspekt ist sehr wichtig, da es anzeigt, daß nachdem der Stamm DSM 16594 als Probiotikum eingenommen wird, kann im Kolon eine ständige Produktion auftreten, ein für ein schnelles Erneuerungsstoffwechsel der Enterozyten wesentliches Vitamin. Die metabolische Deregulierung des Stammes DSM 16594, d.h. die Abwesenheit eines Steuermechanismus, der die Biosynthese von Folsäure stoppt, wo ausreichende Mengen davon schon vorliegen, wird dadurch bestätigt, daß die Menge von produzierter Folsäure mindestens 50-mal höher ist als die notwendige Menge zur Gewährleistung einer gesunden Entwicklung der Bakterien, die dieses Vitamin nicht synthetisieren und daher es von Außenquellen erhalten sollten, um sich gut zu entwickeln.
– BEWERTUNG DES BEITRAGS VON DURCH DEN STAMM DSM 16594 IN KOTKULTUREN GELIEFERTEN FOLSÄURE
Zur Bewertung, ob eine tatsächliche Produktion von Folsäure dank des Stammes DSM 16594 in Mischkulturen stattfand, d.h. Kulturen, die die Zusammensetzung der intestinalen Mikroflora simulieren, wurden Kotkulturen hergestellt, d.h. mit verdünnten Kotproben inokulierte Kulturen, die mit dem Stamm DSM 16594 inokuliert oder nicht inokuliert wurden; in den benannten Kulturen wurde die Zunahme von Folsäurekonzentration bestimmt. Die verwendeten Mischkulturen wurden mit verdünnten Kotproben inokuliert, so daß die normale mikrobielle Zusammensetzung des Darmgehaltes simuliert wurde. Das verwendete Kulturmedium enthält 10 ng/ml Folsäure, eine ausreichende Menge zur Gewährleistung der Entwicklung der ganzen inokulierten mikrobiellen Population. Das Medium enthält auch Peptone, Fructo-Oligosacchariden (FOS) als Kohlenstoffquelle.
Die Wahl von FOS hängt davon ab, daß die Einnahme einer probiotischen Bifidobakterie zusammen mit diesem prebiotischen Kohlenhydrat, i.e. das weder verdaut noch absorbiert und daher ins Kolon gelangen kann, wo es durch Bifidobakterien am meisten metabolisiert wird, die Kolonisation des Darmes durch sowohl die probiotische Bifidobakterie als auch die endogenen Bifidobakterien fördert.
– KOTKULTUREN

Die Kotkulturen wurden in einem Medium kultiviert, das nach der oben beschriebenen Prozedur hergestellt wurde und die folgende Zusammensetzung hat:

Raftilose P95 (FOS) (Orafti Group, Tienen, Belgium) Vitamin Assay Casaminoacids	20 g/l
(DIFCO Laboratories, USA [0288-17]	5 g/l
Cystein	0,5 g/l
Folsäure	10 μg/l
Lösung A	700 ml/l
Lösung B	1 ml/l
Lösung C	1 ml/2
Lösung D	5 ml/l
Lösung E	10 ml/l

Lösung A

(NH₄)₂SO₄	10 g
Natriumacetat	10 g
Ascorbinsäure	10 g
KH₂PO₄	1 g
MgSO₄	0,7 g
NaCl	0,2 g
Tween 80	1 ml

Tween 80 wird in 700 ml von siedendem destilliertem Wasser gelöst; dann werden alle anderen Komponenten in der Reihenfolge zugesetzt. Lösung B

Borsäure 25 mg

CuSO₄ 2 mg

KI 5 mg

FeCl₃ 10 mg

MnSO₄ 20 mg

Natriummolybdat 10 mg

ZnSO₄ 20 mg
Diese Komponenten werden in der Reihenfolge in 50 ml von destilliertem Wasser bei Raumtemperatur gelöst. Lösung C

Biotin 0,2 mg

Kalziumpantotenat 40 mg

Niacin 40 mg

p-Aminobenzoesäure 20 mg

Pyridoxin 40 mg

Riboflavin 20 mg

Thiamin 40 mg
Diese Komponenten werden in der Reihenfolge in 100 ml von destilliertem Wasser bei Raumtemperatur gelöst. Lösung D

FeSO₄ 50 mg
Der Salz wird in 25 ml von destilliertem Wasser bei Raumtemperatur gelöst.
Lösung E
50 mg di Hämine (Sigma Aldrich SRL, Via Gallarate, Milano, Italia [H5533]) werden in 5 ml 1 M NaOH gelöst und destilliertes Wasser wird zugesetzt, um das Volumen auf 1 l zu bringen.
Methode
40 ml Aliquoten von Medium werden in 100 cc Flaschen mit einer durchbohrbaren Gummikappe zugesetzt. Die Gummikappen werden mit einer Nadel durchgebohrt und die Flaschen werden in ein Bad mit siedendem Wasser positioniert. Nach 10 Minuten Inkubation bei 100°C wird die Kappe mit einer zweiten Nadel durchgebohrt, durch die Stickstoff in die Flasche für 10 Minuten bei einem Druck von 0,15 bar eingeblasen wird. Nach beendeter Einblasung werden die beiden Nadeln entfernt und die Flaschen werden bei 110°C für 30' sterilisiert.
Herstellung der Inokulums
Eine frische Kotprobe wird in eine anaeroben Kammer (10% H₂, 10% CO₂, 80% N₂) verstellt.
Dann wird eine 10%ige Suspension im oben beschriebenen Medium vorbereitet und mit sterilen Glasperlen mit einem Durchmesser von 3 mm homogeniert.
Aus dieser Suspension wird eine 1:100 Verdünnung in demselben in den Flaschen enthaltenen Medium hergestellt. 0,4 ml dieser Verdünnung werden mit einer Spritze4 in zwei sterile Flaschen enthaltend 40 ml Kulturmedium inokuliert..
Vergleich der Folsäure, die in mit dem Stamm DSM 16594 inokulierten oder nicht inokulierten Kotproben vorliegt
Eine der zwei identischen Proben, die mit der verdünnter Kotprobe inokuliert wurde, wird auch mein 0,4 ml einer Kultur vom Stamm DSM 594 inokuliert, die für 24 Stunden in Minimummedium Nr. 7 sich entwickeln gelassen wurde. Die beiden Kotkulturen, wobei eine davon auch mit dem Stamm DSM 16594 und die andere nicht, werden bei 37°C für 24 Stunden inkubiert.
Folsäureproduktivität in Kotkulturen
Die Folsäurekonzentration in den Kotkulturen, die nicht mit dem Stamm DSM 16594 inokuliert wurden, ändert sich ungefähr von 30 bis 70 ng/ml.
Die entsprechenden Kulturen, die mit dem Stamm DSM 16594 inokuliert wurden, zeigten eine deutende Zunahme der Folsäurekonzentration. Diese Zunahme änderte sich von 30 bis 30 a 50 ng/ml, was daher zu oben angegebenen 30–70 ng/ml zugesetzt wird.
Diese letzte Entdeckung zeigt weiter, daß die Verabreichung des probiotischen Bakterienstammes der vorliegenden Erfindung, d.h. DSM 16594, die Anwesenheit von hohen Mengen Folsäure im Kolon unabhängig von der Gesundheit des Patienten gewährleisten kann.
Deshalb können die Wiederherstellung und die Aufrechterhaltung eines optimalen Gleichgewichtes der intestinalen Bakterienflora gefördert und gewährleistet werden.
Der obige Experimentalteil beschrieb ausführlich die Verwendung eines der besonders bevorzugten Bakterien stämme der vorliegenden Erfindung, d.h. der Stamm DSM 16594.
Identische Tests wurden unter denselben experimentalen Bedingungen und unter Verwendung derselben Mengen von Reagenzien auch an den anderen vier bevorzugten Bakterienstämmen, nämlich DSM 16595, DSM 16596, DSM 16597 und DSM 16598, durchgeführt.
Es wurde gezeigt, daß diese Bakterienstämme Folsäure auf derselben Art und Weise und mit denselben Merkmalen wir der Stamm DSM 16594 produzieren.
Die Produktivität von Bifidobacterium adolescentis DSM 16595, Bifidobacterium breve DSM 16596, Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 16597 und Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 16598 zeigt sich als geringer als die von Bifidobacterium adolescentis DSM 16594. Insbesondere produziert DSM 16595 ca. 30,5%, DSM 16596 ca. 13%, DSM 16597 25,5% und DSM 16598 28% der Menge von durch DSM 16594 produzierten Folsäure.
Auch bei diesen Fällen ist die Menge von produzierten Folsäure (die jeweils ca. 16–20 ng/ml für DSM 16595; 6–9 ng/ml für DSM 16596; 14–16 ng/ml für DSM 16597 und 14–19 ng/ml für DSM 16598 beträgt) deutlich höher (von ca. 14 bis 16 Mal höher für DSM 16595; von 5 bis 7 Mal höher für DSM 16596; von 12 bis 13 Mal höher für DSM 16597 und von 12 bis 15 Mal höher für DSM 16598) ist als die Menge, die zur Gewährleistung einer gesunden Entwicklung anderer Bakterien, die dieses Vitamin für eine optimale Entwicklung benötigen, notwendig ist.
BIBLIOGRAPHIE

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Claims

Bakterienstämme der Art Bifodobacterium, die im DSMZ am 21. Juli 2004 hintergelegt und mit den folgenden Identifikationscodes identifiziert wurden: – Bifidobacterium adolescentis DSM-Code 16594; – Bifidobacterium adolescentis DSM-Code 16595; – Bifidobacterium breve DSM-Code 16596; – Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM-Code 16597; – Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM-Code 16598.
Pharmazeutische, tierärztliche und/oder Nahrungsformulierungen umfassend: den Bakterienstamm Bifidobacterium adolescentis DSM 16594 oder den Bakterienstamm Bifidobacterium adolescentis DSM 16595 oder den Bakterienstamm Bifidobacterium breve DSM 16596 oder den Bakterienstamm Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 16597 oder den Bakterienstamm Bifidobacterium pseudocatenulatum DSM 16598, oder ein Gemisch von zwei oder mehreren Stämmen ausgewählt aus der Gruppe umfassend: DSM 16594, DSM 16595, DSM 16596, DSM 16597 und DSM 16598.
Formulierungen nach Anspruch 2, weiter umfassend einen oder mehrere probiotische Bakterienstämme mit komplementären Merkmale, wobei diese probiotischen Bakterienstämme aus der Gruppe umfassend: – Lactobacillus acidophilus LMG P-21381; – Lactobacillus casei subsp. paracasei LMG P-21380; – Lactobacillus plantarum LMG P-21021; – Lactobacillus pentosus LMG P-21019; – Lactobacillus plantarum LMG P-21020; – Lactobacillus plantarum LMG P-21022; – Lactobacillus plantarum LMG P-21023; – Bifidobacterium lactis LMG P-21384; – Streptococcus delbrueckii subsp. thermophilus DSM 16506; – Streptococcus delbrueckii subsp. thermophilus DSM 16507; – Bifidobacterium longum DSM 16603; – Bifidobacterium breve DSM 16604; – Lactobacillus casei subsp. rhamnosus DSM 16605, ausgewählt sind.
Formulierungen nach Anspruch 2 oder 3, weiter umfassend andere Stoffe mit prebiotischen Merkmalen, wobei diese Stoffe mit prebiotischen Merkmalen aus der Gruppe umfassend: Fructo-Oligosacchariden (FOS), Inulin, Isomalto-Oligosacchariden, resistente Stärke, Pectin, Galakto-Oligosacchariden, Arabinogalaktan, Xylo-Oligosacchariden, Glucomannan und Chitosan-Oligosacchariden, ausgewählt sind.
Formulierungen nach den Ansprüchen 2 bis 4, weiter umfassend Zusatzstoffe, Trägerstoffe, Hilfsstoffe, Aromastoffen und Stabilisatoren, wobei diese Zusatzstoffe aus der Gruppe umfassend: Aminosäuren, Vitamine, Antioxydationzien, Enzyme, bevorzugt Glutamin, Arginin, Superoxid-Dismutase und Glutathion, ausgewählt sind.
Formulierungen nach den Ansprüchen 2 bis 5, wobei der Stamm DSM 16594 oder der Stamm DSM 16595 oder der Stamm DSM 16596 oder der Stamm 16597 oder der Stamm DSM 16598, oder deren Gemisch in gefriergetrockneter Form vorliegen.
Formulierungen nach den Ansprüchen 2 bis 6, in Form von Kapseln, oralen Lösungen oder Suspensionen, Pulver in Tütchen, Tabletten, Suppositorien, Vaginaltabletten, Suppositorien und Pessaren.
Formulierungen nach den Ansprüchen 2 bis 7, enthaltend 10⁵ bis 10¹¹ Zellen jedes Bakterienstammes pro Einzeldosis.
Verwendung der Bakterienstämme nach Anspruch 1 zur Vorbereitung von pharmazeutischen Formulierungen zur Behandlung oder Prävention von Magen-Darm-Störungen, bei den die Verabreichung von Folsäure gewünscht ist.
Verwendung nach Anspruch 9 zur Prävention von kolorektalem Krebs, oder zur Prävention und Behandlung von Darm-Entzündungsstörungen, oder zur Prävention und Behandlung von Vaginalinfektionen und Entzündungsverhältnissen der Vagina, oder zur Wiederherstellung des Gleichgewichts von nicht-pathogener Darmbakterienflora, oder als Probiotika in Nahrungsprodukten, oder zur Vorbereitung von Produkten aus Milch oder deren Denwaten, oder in Kombination mit prebiotischen Stoffen, oder in Kombination mit prebiotischen Stoffen zur Vorbereitung von symbiotischen Nahrungspräparationen.