DE602004005947T2

DE602004005947T2 - Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven Octahydro-1H-Indol-2-Carbonsäure

Info

Publication number: DE602004005947T2
Application number: DE602004005947T
Authority: DE
Inventors: Norihiko Suita-shi Hirata
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2003-10-30
Filing date: 2004-10-27
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2024-10-28
Also published as: US20050106690A1; US7439036B2; DE602004005947D1; EP1536017A2; EP1536017B1; EP1536017A3

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein enzymatisches Auftrennungsverfahren zur Herstellung einer optisch aktiven N-geschützten Octahydro-1H-indol-2-carbonsäure, die als Zwischenerbindung zur Herstellung von Pharmazeutika, beispielsweise eines Angiotensin-Converting-Enzyme-Inhibitors oder eines Bradykinin-Antagonisten, verwendbar ist.
Zur Herstellung einer optisch aktiven N-geschützten Octahydro-1H-indol-2-carbonsäure sind (i) Verfahren unter Verwendung optisch aktiver Aminosäuren als Ausgangsmaterial und (ii) Verfahren der optischen Auftrennung von Indolin-2-carbonsäure oder einer Octahydro-1H-indol-2-carbonsäure oder Derivaten derselben, die aus einer Indol-2-carbonsäure als Ausgangsmaterial hergestellt werden, bekannt.
Die Verfahren unter obigem Punkt (i) sind ein Verfahren der Verwendung von einem β-Iodalaninderivat und Adipinsäureanhydrid als Ausgangsmaterialien gemäß der Beschreibung in den Ansprüchen von EP 1323729 (A1) , ein Verfahren der Verwendung von einem Asparaginsäurederivat und 3-Bromcyclohexen als Ausgangsmaterialien gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 des japanischen Patents 2550369 und dergleichen.
Ferner sind die unter obigem Punkt (ii) erläuterten Verfahren ein Verfahren der optischen Auftrennung von Ethyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat, das durch Reduktion von Ethyl-indol-2-carboxylat hergestellt wurde, mit 10-Camphersulfonsäure gemäß der Beschreibung in Herstellungsbeispiel 4 des US-Patent 5015641 , ein Verfahren der optischen Auf trennung von tert-Butyl-octahydro-1H-indol-2-carboxylat mit Weinsäure (S. 997, J. of Medicinal Chemistry, 30 (6), 992–998 (1987)), ein Verfahren der optischen Auftrennung von N-Benzoiloctahydro-1H-indol-2-carbonsäure mit α-Methylbenzylamin gemäß der Offenbarung auf S. 997, J. of Medicinal Chemistry, 30 (6), 992–998 (1987), ein Verfahren der optischen Auftrennung einer Indolin-2-carbonsäure, die aus einer Indol-2-carbonsäure hergestellt wurde, mit α-Methylbenzylamin und der anschließenden Reduktion des aufgetrennten Produkts unter Bildung einer Octahydro-2-indolcarbonsäure gemäß der Offenbarung auf S. 1678, Tetrahedron Letters, 23 (16), 1677–1680 (1982), und dergleichen.
Jedoch weisen die Verfahren unter Verwendung einer optisch aktiven Aminosäure als Ausgangsmaterial unter obigem Punkt

(i) die Probleme auf, dass sie viele Stufen und kostenaufwendige Reaktionsteilnehmer erfordern. Darüber hinaus weisen die optischen Auftrennungsverfahren unter obigem Punkt
(ii) insofern Probleme auf als die Auftrennungseffizienz unzureichend ist und ferner nach der optischen Auftrennung Umkristallisation erforderlich ist.

Ein Verfahren unter Verwendung eines Enzyms zur Herstellung einer optisch aktiven Octahydro-1H-indol-2-carbonsäure oder einer N-geschützten Spezies derselben durch Hydrolyse eines Octahydro-1H-indol-2-carboxylats oder einer N-geschützten Verbindung desselben ist nicht bekannt.
Die EP-A 0 974 670 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven N-substituierten Azetidin-2-carbonsäureverbindung der Formel (2):
durch Inkontaktbringen eines entsprechenden N-substituierten Azetidin-2-carbonsäureesters der Formel (2) mit einem Enzym, das von einem Mikroorganismus, der aus dem Arthrobacter SC-6-98-28-Stamm, Arthrobacter sp. ATCC21908-Stamm, Chromobacterium SC-YM-1-Stamm und einer Mutante derselben ausgewählt ist, stammt. Das Patent beschreibt auch ein Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven Azetidin-2-carbonsäure durch Beseitigen des N-Substituenten eines N-substituierten Azetidin-2-carbonsäureesters der Formel (2).
Die EP-A-0 969 094 offenbart eine Esterase mit hervorragenden thermostabilen Eigenschaften, die für eine Esterhydrolysereaktion, Estersynthesereaktion, Umesterungsreaktion und dergleichen verwendet werden kann, und deren Codierungsgen. Ferner werden Plasmide, die ein derartiges Gen umfassen, und Mikroorganismen, die derartige Plasmide tragen, sowie Verfahren zur Herstellung der thermostabilen Esterase bereitgestellt. Die Esterase kann zur Herstellung von Verbindungen, die für therapeutische Anwendungen oder als Pestizide geeignet sind, verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine optisch aktive N-geschützte Octahydro-1H-indol-2-carbonsäure effizient hergestellt werden.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung einer optisch aktiven N-geschützten Octahydro-1H-indol-2-carbonsäure der Formel (2):
worin R² für eine Schutzgruppe einer Iminogruppe steht und die mit Sternchen (*) bezeichneten Kohlenstoffatome für asymmetrische Kohlenstoffatome stehen,
wobei das Verfahren das Umsetzen eines Gemischs von Enantiomeren von N-geschütztem Octahydro-1H-indol-2-carboxylat der Formel (1):
worin R¹ für eine C1-4-Alkylgruppe steht und R² wie oben definiert ist, mit einem Enzym, das zur asymmetrischen Hydrolyse der -CO₂R¹-Gruppe der Formel (1) fähig ist, umfasst, wobei das Enzym ein Enzym ist, das

i) eine Polypeptidsequenz SEQ ID NO:1 umfasst oder
ii) eine Polypeptidsequenz SEQ ID NO:1, die durch Deletion von 8 C-terminalen Aminosäuren und/oder Substitution der 160. und/oder 189. Aminosäure in SEQ ID NO:1 modifiziert ist, umfasst.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung detailliert angegeben.
Das N-geschützte Octahydro-1H-indol-2-carboxylat der Formel (1) wird zunächst erklärt. Die durch R¹ dargestellte C1-4-Alkylgruppe umfasst beispielsweise eine Methylgruppe, Ethylgruppe, n-Propylgruppe, Isopropylgruppe, n-Butylgruppe, Isobutylgruppe, sek-Butylgruppe und tert-Butylgruppe.
Die durch R² dargestellten Schutzgruppen der Iminogruppe umfassen beispielsweise Alkoxycarbonylgruppen, wie eine tert-Butoxycarbonylgruppe, Arylalkyloxycarbonylgruppen, wie eine Benzyloxycarbonylgruppe, p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe und eine p-Nitrobenzyloxycarbonylgruppe, Allyloxy- und Alkoxycarbonylgruppen, wie eine Allyloxycarbonylgruppe und eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe, Acylgruppen, wie eine Acetylgruppe und eine Benzoylgruppe, substituierte Alkylgruppen, wie eine Benzylgruppe, und dergleichen.
Bevorzugte R²-Gruppen sind eine tert-Butoxycarbonylgruppe, Benzyloxycarbonylgruppe, Acetylgruppe, Benzoylgruppe und Benzylgruppe und noch günstiger ist eine Benzyloxycarbonylgruppe, die ohne weiteres entschützt werden kann, um die geschützten Verbindungen beispielsweise zu Zwischenverbindungen für die Herstellung eines Angiotensin-Converting-Enzyme-Inhibitors oder Bradykinin-Antagonisten zu derivatisieren.
Der aufzutrennende N-geschützte Octahydro-1H-indol-2-carbonsäureester, der im Folgenden auch als "Substrat" bezeichnet wird, kann beispielsweise nach dem Verfahren gemäß der Beschreibung in Journal of Medicinal Chemistry, 30 (6), 992 (1987) durch katalytisches Hydrieren zur Reduktion eines Indol-2-carboxylats und anschließendes Schützen der Iminogruppe des erhaltenen Octahydro-1H-indol-2-carboxylats auf eine bekannte Weise oder eine der Beschreibung in Drug Design and Discovery (1992), 9 (1), 11–28, ähnliche Weise hergestellt werden.
Ein Substrat, das durch ein anderes Verfahren als das oben beschriebene Verfahren hergestellt wurde, kann ebenfalls verwendet werden.
Beispiele für das Substrat umfassen beispielsweise
Methyl-N-tert-butoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Ethyl-N-tert-butoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Propyl-N-tert-butoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isopropyl-N-tert-butoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Butyl-N-tert-butoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isobutyl-N-tert-butoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
sek-Butyl-N-tert-butoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
tert-Butyl-N-tert-butoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Methyl-N-benzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Ethyl-N-benzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Propyl-N-benzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isopropyl-N-benzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Butyl-N-benzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isobutyl-N-benzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
sek-Butyl-N-benzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
tert-Butyl-N-benzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Methyl-N-p-methoxybenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Ethyl-N-p-methoxybenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Propyl-N-p-methoxybenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isopropyl-N-p-methoxybenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Butyl-N-p-methoxybenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isobutyl-N-p-methoxybenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
sek-Butyl-N-p-methoxybenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
tert-Butyl-N-p-methoxybenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Methyl-N-p-nitrobenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Ethyl-N-p-nitrobenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Propyl-N-p-nitrobenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isopropyl-N-p-nitrobenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Butyl-N-p-nitrobenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isobutyl-N-p-nitrobenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
sek-Butyl-N-p-nitrobenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
tert-Butyl-N-p-nitrobenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Methyl-N-allyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Ethyl-N-allyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Propyl-N-allyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isopropyl-N-allyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Butyl-N-allyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isobutyl-N-allyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
sek-Butyl-N-allyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
tert-Butyl-N-allyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Methyl-N-9-fluorenylmethoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Ethyl-N-9-fluorenylmethoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Propyl-N-9-fluorenylmethoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isopropyl-N-9-fluorenylmethoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Butyl-N-9-fluorenylmethoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isobutyl-N-9-fluorenylmethoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
sek-Butyl-N-9-fluorenylmethoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
tert-Butyl-N-9-fluorenylmethoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Methyl-N-acetyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Ethyl-N-acetyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Propyl-N-acetyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isopropyl-N-acetyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Butyl-N-acetyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isobutyl-N-acetyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
sek-Butyl-N-acetyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
tert-Butyl-N-acetyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Methyl-N-benzoyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Ethyl-N-benzoyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Propyl-N-benzoyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isopropyl-N-benzoyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Butyl-N-benzoyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isobutyl-N-benzoyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
sek-Butyl-N-benzoyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
tert-Butyl-N-benzoyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Methyl-N-benzyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Ethyl-N-benzyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Propyl-N-benzyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isopropyl-N-benzyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
n-Butyl-N-benzyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
Isobutyl-N-benzyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
sek-Butyl-N-benzyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat,
tert-Butyl-N-benzyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat, und
dergleichen.
Das Substrat kann ein Gemisch von acht optischen Isomeren sein, wobei das Gemisch typischerweise ein racemisches Gemisch ist, oder es kann ein Gemisch von einem einzigen optischen Isomer und einem Antipoden desselben sein. Bevorzugt ist das Gemisch von einem einzigen optischen Isomer und einem Antipoden desselben.
Stärker bevorzugt ist ein Gemisch aus der Verbindung der Formel (1') und dem Antipoden derselben der Formel (1'')
worin R¹ und R² wie oben definiert sind.
Die Enzyme mit der Fähigkeit zur asymmetrischen Hydrolyse des Substrats unter Bildung einer optisch aktiven N-geschützten Octahydro-1H-indol-2-carbonsäure umfassen beispielsweise eine Hydrolase, die eine Esterase und Lipase umfasst, die von dem Mikroorganismus Chromobacterium SC-YM-1-Stamm (FERM BP-6703) oder einer Mutante desselben stammt.
Die Enzyme können beispielsweise ein Enzym sein, das von einer Mutante stammt, die aus dem im Vorhergehenden genannten Mikroorganismus durch eine Behandlung mit beispielsweise einem Mutationsmittel oder Ultraviolettstrahlung produziert wurde, ein Enzym, das aus einem rekombinanten Mikroorganismus, der durch Einführen des Gens mit Codierung für das vorliegende Enzym transformiert wurde, produziert wurde, und ein mutiertes Enzym, das durch Addition, Substitution oder Deletion von mindestens einer Aminosäure in der Aminosäuresequenz des Enzyms mittels Gentechnik produziert wurde, sein.
Die rekombinanten Mikroorganismen können durch Einführung von Genen mit Codierung für die Enzyme, beispielsweise nach den gentechnischen Verfahren gemäß der Beschreibung in beispielsweise Molecular Cloning, 2. Auflage, Verfasser J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory, veröffentlicht 1989, und dergleichen hergestellt werden.
Genauer gesagt können die Enzyme ähnlich der Beschreibung in der ungeprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 7-163364 hergestellt werden.
Das mutierte Enzym kann durch Gentechnik, beispielsweise nach Olfert Landt et. al (Gene 96, 125–128, 1990) hergestellt werden. Genauer gesagt können die mutierten Enzyme gemäß der Beschreibung in der ungeprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 2000-78988 und 7-213280 hergestellt werden.
Beispiele für das mutierte Enzym, das auf diese Weise hergestellt werden kann, umfassen beispielsweise eine mutierte Esterase, die aus einer Esterase, die von dem Chromobacterium SC-YM-1-Stamm stammte, hergestellt wurde, und spezielle Beispiele hierfür umfassen beispielsweise ein Enzym mit ei ner Aminosäuresubstitution oder Aminosäuresubstitutionen oder einer Deletion oder beiden in der Aminosäure von SEQ ID NO:1. Beispiele für die Substitution oder Substitutionen oder die Deletion oder beide werden durch 160A, 160I, 160L, 160S, 160V, 189A, 189F, 189H, 189I, 189L, 189R, 189S, 189T, 189V, 189Y, 160A189F363term, 160A189H363term, 160A189Y363term, 160S189F363term oder 160S189H363term bezeichnet, wobei die Bezeichnungen bedeuten, dass die 160. und/oder 189. Aminosäure, die in SEQ ID NO:1 Glycin sind, durch die Aminosäure A, I, L, V, F, H, R, S, T oder Y in SEQ ID NO:1 substituiert sind, und 363term bedeutet, dass das Polypeptid an der 363. Position beendet ist und aus der 1. bis 362. Aminosäure in SEQ ID NO:1 besteht. Beispielsweise bedeutet 160A189Y363term ein Enzym, das Alanin an der 160. Position und Tyrosin an der 189. Position anstelle von Glycin in SEQ ID NO:1 und eine Deletion von 8 C-terminalen Aminosäuren in SEQ ID NO:1 aufweist.
Der Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Herstellung des Enzyms kann in bekannter Weise in Flüssigkeit kultiviert werden. Verschiedene Medien, die nach Bedarf Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Substanzen und dergleichen enthalten, können zur Kultivierung der Mikroorganismen verwendet werden.
Beispielsweise umfassen die Kohlenstoffquellen Glucose, Glycerin, eine organische Säure, Honig und dergleichen. Die Stickstoffquellen umfassen ein Pepton, einen Hefeextrakt, Malzextrakt, ein Sojapulver, einen Maiseinweichlinker, ein Baumwollsamenpulver, Trockenhefe, Casamino Acids, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Harnstoff und dergleichen.
Die anorganischen Substanzen umfassen Hydrochloride von Metallen wie Kalium, Natrium, Magnesium, Eisen, Mangan, Cobalt, Zink und dergleichen; Sulfate der oben genannten Metalle; Phosphate der im Vorhergehenden genannten Metalle und dergleichen. Insbesondere umfassen die Salze, die verwendet werden können, Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Magnesiumsulfat, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat, Cobaltchlorid, Zinksulfat, Kaliumphosphat, Natriumphosphat und dergleichen.
Ferner können Triglyceride, wie Olivenöl oder Tributyrin, oder das oben genannte Substrat zu dem Medium gegeben werden, um die Fähigkeit des Mikroorganismus, der zur asymmetrischen Hydrolyse des Esters der Formel (1) fähig ist, zu verstärken.
Die Kultivierung wird günstigerweise in einer aeroben Atmosphäre durchgeführt und bevorzugt ist eine Schüttelkultivierung oder Belüftungsschüttelkultivierung. Die Kultivierungstemperatur beträgt normalerweise etwa 20 bis etwa 40 °C, vorzugsweise etwa 25 bis 35 °C. Der pH-Wert beträgt vorzugsweise etwa 6 bis etwa 8. Die Kultivierungsdauer kann in Abhängigkeit von verschiedenen Bedingungen variieren, sie beträgt jedoch vorzugsweise etwa 1 Tag bis 7 Tage.
Ein Festkörperkultivierungsverfahren kann ebenfalls zur Gewinnung von Mikroorganismenzellen, die das oben beschriebene Substrat asymmetrisch hydrolysieren können, verwendet werden.
Das Enzym kann durch ein geeignetes Verfahren, das üblicherweise bei der Reinigung von Enzymen verwendet wird, gereinigt werden. Beispielsweise werden die kultivierten Zellen der Mikroorganismen zunächst durch eine Ultraschallbehandlung, Dyno-Mill-Behandlung oder French-Press-Behandlung aufgebrochen bzw. zerlegt. Danach kann nach der Entfernung von unlöslichen Materialien aus dem aufgebrochenen Gemisch das gewünschte Enzym durch Zentrifugation oder dergleichen erhalten werden und ferner durch ein geeignetes Reinigungsverfahren, wie Kationenaustauschchroma tographie, Anionenaustauschromatographie, hydrophobe Säulenchromatographie oder Gelfiltrationssäulenchromatographie oder durch eine Kombination derselben, die normalerweise zur Enzymreinigung verwendet wird, weiter gereinigt werden.
Beispiele für den Träger, der für eine derartige Säulenchromatographie verwendet werden kann, umfassen beispielsweise DEAE-Sepharose Fastflow (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech, Inc.), Butyl-Toyopearl 650S (hergestellt von Tosoh Co., Ltd.) und dergleichen.
Das Enzym kann in verschiedenen Formen, beispielsweise als gereinigtes Enzym, rohes Enzym, kultivierte Produkte der das Enzym produzierenden Mikroorganismen, Zellen der Mikroorganismen, behandelte Produkte derselben oder dergleichen, verwendet werden. Die im Vorhergehenden genannten behandelten Produkte stehen für beispielsweise gefriergetrocknete, acetongetrocknete, aufgebrochene, autolysierte, ultraschallbehandelte, extrahierte oder alkalibehandelte Zellen des das Enzym produzierenden Mikroorganismus. Ferner kann das Enzym mit verschiedenen Reinheiten oder Formen, die oben genannt wurden, nach der Immobilisierung, beispielsweise mittels eines bekannten Verfahrens, das die Absorption an anorganischen Trägern, wie Silicagel oder Keramiken, Cellulose oder ein Ionenaustauschharz umfasst, des Polyacrylamidverfahrens, Verfahrens mit einem schwefelhaltigen Polysaccharidgel, wie das Carrageengelverfahren, Alginsäuregelverfahren, Agaragargelverfahren und dergleichen, verwendet werden.
Die Menge des Enzyms, die verwendet werden kann, wird günstigerweise so bestimmt, dass keine Verzögerung der Reaktionsgeschwindigkeit und keine Verringerung der Selektivität bewirkt wird. Beispielsweise wird das gereinigte Enzym oder das rohe Enzym normalerweise in einer Menge von etwa 0,001 bis etwa 2 Gewichtsteilen, vorzugsweise etwa 0,002 bis 0,5 Gewichtsteilen pro ein Gewichtsteil der Menge des Substrats verwendet.
Kultivierte Produkte der Mikroorganismen, Zellen der Mikroorganismen oder behandelte Produkte derselben werden üblicherweise in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 200 Gewichtsteilen und vorzugsweise etwa 0,1 bis 50 Gewichtsteilen pro ein Gewichtsteil der Menge des oben beschriebenen Substrats verwendet.
Wasser kann als wässriger Puffer in der asymmetrischen Hydrolysereaktion zugesetzt werden. Die wässrigen Puffer umfassen beispielsweise wässrige Puffer von Salzen anorganischer Säuren und Beispiele hierfür umfassen beispielsweise wässrige Alkalimetallphosphatlösungen, wie eine wässrige Natriumphosphatlösung oder wässrige Kaliumphosphatlösung, wässrige Puffer von Salzen einer organischen Säure von Alkalimetallacetaten, wie eine wässrige Natriumacetatlösung oder eine wässrige Kaliumacetatlösung und dergleichen.
Die Wassermenge, die verwendet werden kann, liegt normalerweise im Bereich von 0,5 Gewichtsteilen bis 200 Gewichtsteilen pro ein Gewichtsteil des Substrats.
Die asymmetrische Hydrolysereaktion in der vorliegenden Erfindung kann auch in Gegenwart eines organischen Lösemittels, wie eines hydrophoben organischen Lösemittels, hydrophilen organischen Lösemittels oder dergleichen, durchgeführt werden.
Die hydrophoben organischen Lösemittel umfassen beispielsweise aliphatische Ether, wie tert-Butylmethylether oder Diisopropylether; Kohlenwasserstoffe, wie Toluol, Hexan, Cyclohexan, Heptan, Octan oder Isooctan; und dergleichen.
Ferner umfassen die hydrophilen organischen Lösemittel beispielsweise Alkohole, wie tert-Butanol, Methanol, Ethanol, Isopropanol, Isobutanol oder n-Butanol, alicyclische Ether, wie Tetrahydrofuran; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid; Ketone, wie Aceton; Nitrile, wie Acetonitril; Amide, wie N,N-Dimethylformamid, und dergleichen.
Diese hydrophoben organischen Lösemittel und hydrophilen Lösemittel werden jeweils einzeln oder als Gemisch von zwei oder mehreren derselben verwendet. Ein Gemisch aus dem hydrophoben organischen Lösemittel und dem hydrophilen Lösemittel kann ebenfalls verwendet werden.
Das Lösemittel wird vorzugsweise in einer Menge von 200 Gewichtsteilen oder weniger, noch besser 0,1 bis 100 Gewichtsteilen pro ein Gewichtsteil des Substrats verwendet.
Die asymmetrische Hydrolysereaktion wird beispielsweise durch Mischen von Wasser, dem Substrat und dem Enzym oder durch Mischen des organischen Lösemittels, von Wasser, dem Substrat und dem Enzym durchgeführt.
Der pH-Wert des Reaktionssystems wird günstigerweise so eingestellt, dass die asymmetrische Hydrolysereaktion selektiv erfolgt.
Der pH-Wert des Reaktionssystems wird normalerweise im Bereich von etwa 4 bis etwa 10, vorzugsweise von etwa 6 bis etwa 8 durch Zugabe einer Base eingestellt.
Die Basen, die verwendet werden können, umfassen beispielsweise Alkalimetallhydroxide, wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, Alkalimetallcarbonate, wie Natriumcarbonat oder Kaliumcarbonat, Erdalkalimetallcarbonate, wie Calciumcarbonat, Alkalimetallbicarbonate, wie Natriumbicarbonat oder Kaliumbicarbonat; Phosphate, wie Natriumdihydrogenphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumdihydrogen phosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat, organische Basen, wie Triethylamin oder Pyridin, Ammoniak und dergleichen. Die Base kann allein oder in einem Gemisch von zwei oder mehreren derselben verwendet werden. Die Base wird normalerweise als wässrige Lösung zugegeben, sie kann jedoch auch als Gemisch von einem organischen Lösemittel und Wasser zugegeben werden. Das gleiche organische Lösemittel, das in der Reaktion verwendet wird, kann auch für diesen Zweck verwendet werden. Ferner kann die Base als Feststoff oder als Suspension zugegeben werden.
Die Reaktionstemperatur liegt normalerweise im Bereich von etwa 5 bis 65 °C, vorzugsweise von etwa 20 bis 50 °C.
Das Reaktionsgemisch, das die optisch aktive N-geschützte Octahydro-1H-indol-2-carbonsäure der Formel (2), die im Folgenden als asymmetrisch hydrolysierte Carbonsäure oder optisch aktive Carbonsäure bezeichnet wird, und den optisch aktiven N-geschützten Octahydro-1H-indol-2-carbonsäureester, der nicht hydrolysiert wurde, der im Folgenden als verbleibender Ester bzw. verbleibende Ester bezeichnet wird, enthält, wird erhalten.
Die optisch aktive Carbonsäure und der verbleibende Ester werden üblicherweise aus dem Reaktionsgemisch auch von dem Enzym und der Pufferlösung abgetrennt und die optisch aktive Carbonsäure und der verbleibende Ester werden üblicherweise voneinander durch geeignete Nachbehandlungsoperationen, wie Extraktion, Phasentrennung und/oder Verdampfung des Lösemittels und optional Silicagelsäulenchromatographie und dergleichen, getrennt.
Ein organisches Lösemittel, das mit sowohl Wasser als auch dem in der Reaktion verwendeten hydrophoben organischen Lösemittel mischbar ist, wird typischerweise gegebenenfalls durch Destillation vor der Phasentrennung entfernt.
Unlösliche Stoffe, die in dem Reaktionsgemisch vorhanden sein können, wie das Enzym, ein Immobilisierungsträger und dergleichen, können, falls nötig, durch Filtration entfernt werden.
Die Extraktion und Phasentrennung wird typischerweise durch Einstellen des pH-Werts des Reaktionsgemischs mit einer geeigneten Säure oder Base in einem Bereich von etwa 6 bis etwa 12, vorzugsweise etwa 7 bis etwa 10 durchgeführt.
Die Säuren umfassen beispielsweise anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, saure Salze von anorganischen Säuren derselben und Metallen, organische Säuren, wie Essigsäure, Citronensäure und Methansulfonsäure und saure Salze von organischen Säuren derselben und Metallen. Die gleichen Basen, die bei der Einstellung des pH-Werts der Hydrolysereaktion verwendet werden, können ebenfalls verwendet werden. Die Trennung durch Extraktion kann, falls nötig, mehrer Male wiederholt werden.
Der in dem Reaktionsgemisch verbleibende Restester wird üblicherweise mit einem hydrophoben organischen Lösemittel extrahiert, worauf eine Phasentrennung folgt, wobei die abgetrennte Wasserphase, die die asymmetrisch hydrolysierte optisch aktive Carbonsäure enthält, erhalten wird.
Die hydrophoben organischen Lösemittel, die in der obigen Extraktion verwendet werden können, umfassen beispielsweise aliphatische Ether, wie tert-Butylmethylether und Isopropylether; Kohlenwasserstoffe, wie Toluol, Hexan, Cyclohexan, Heptan, Octan oder Isooctan; halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Dichlormethan, Dichlorethan, Chloroform, Chlorbenzol oder o-Dichlorbenzol; und Ester, wie Methylacetat, Ethylacetat oder Butylacetat.
Die Menge des hydrophoben organischen Lösemittels, die verwendet werden kann, ist nicht speziell beschränkt und sie beträgt normalerweise 0,1 bis 200 Gewichtsteile, vorzugsweise etwa 0,2 bis 100 Gewichtsteile pro ein Gewichtsteil des Substrats.
Alternativ kann das hydrophobe organische Lösemittel, das in der asymmetrischen Hydrolysereaktion verwendet wird, auch als Extraktionslösemittel dienen, und das erhaltene Reaktionsgemisch wird ohne Zugabe eines hydrophoben organischen Lösemittels absetzen gelassen und in die organische Phase und Wasserphase getrennt oder es kann eine geeignete Menge des hydrophoben organischen Lösemittels zur Phasentrennung und Extraktion zugegeben werden.
Der verbleibende Ester in der organischen Phase, der von der optisch aktiven Carbonsäure abgetrennt wurde, kann durch Entfernen des organischen Lösemittels der organischen Phase durch Destillation isoliert werden. Der isolierte verbleibende Ester kann ferner durch Säulenchromatographie oder dergleichen, falls nötig, weiter gereinigt werden.
Der auf diese Weise erhaltene verbleibende Ester kann mit einem Alkali weiter hydrolysiert werden, wobei die optisch aktive N-geschützte Octahydro-1H-indol-2-carbonsäure produziert wird, die, falls nötig, durch Säulenchromatographie, Umkristallisation oder dergleichen weiter gereinigt werden kann.
Die durch die asymmetrische Hydrolyse produzierte optisch aktive Carbonsäure ist üblicherweise in der abgetrennten Wasserphase vorhanden und sie wird aus der Wasserphase normalerweise durch Einstellen des pH-Werts der Wasserphase mit einer geeigneten Säure oder Base auf einen Bereich von etwa 1 bis etwa 6, vorzugsweise etwa 2 bis etwa 5, durch Extraktion der optisch aktiven Carbonsäure mit einem hydrophoben organischen Lösemittel, das oben zur Extraktion des nicht umgesetzten Esters verwendet wird, und durch Phasentrennung und typischerweise anschließendes Verdampfen des hydrophoben organischen Lösemittels der organischen Phase, die die optisch aktive Carbonsäure enthält, isoliert, wodurch wasserlösliche Komponenten, wie das Enzym oder der Puffer, entfernt werden. Die gleiche Säure oder Base, die oben beschrieben wurden, kann auch zur Einstellung des pH-Werts verwendet werden.
Die Menge des hydrophoben organischen Lösemittels, die verwendet werden kann, beträgt normalerweise etwa 0,1 bis etwa 200 Gewichtsteile, vorzugsweise etwa 0,2 bis 100 Gewichtsteile pro ein Gewichtsteil des Substrats. Die Extraktion der gewünschten Verbindung und die typischerweise anschließende Phasentrennung können auch, falls nötig, wiederholt werden.
Die isolierte Carbonsäure kann, falls nötig, durch Säulenchromatographie, Umkristallisation oder dergleichen weiter gereinigt werden.
Die optisch aktive N-geschützte Octahydro-1H-indol-2-carbonsäure der Formel (2) umfasst die folgenden Verbindungen:
optisch aktive N-tert-Butoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carbonsäure,
optisch aktive N-Benzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carbonsäure,
optisch aktive N-p-Methoxybenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carbonsäure,
optisch aktive N-p-Nitrobenzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carbonsäure,
optisch aktive N-Aryloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carbonsäure,
optisch aktive N-9-Fluorenylmethoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carbonsäure,
optisch aktive N-Acetyloctahydro-1H-indol-2-carbonsäure,
optisch aktive N-Benzoyloctahydro-1H-indol-2-carbonsäure,
optisch aktive N-Benzyloctahydro-1H-indol-2-carbonsäure,
und dergleichen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Gemisch von N-geschützten (2S,3aS,7aS)- und (2R,3aR,7aR)-Octahydro-1H-indol-2-carboxylatestern asymmetrisch hydrolysiert, wobei die optisch aktive N-geschützte Octahydro-1H-indol-2-carbonsäure der Formel (2) mit (2S,3aS,7aS)-Konfiguration erhalten wird, und spezielle Beispiele hierfür umfassen beispielsweise die optisch aktiven N-geschützten Octahydro-1H-indol-2-carbonsäuren, die oben als Beispiele angegeben wurden, mit den spezifischen N-Schutzgruppen gemäß der obigen Beschreibung und einer (2S,3aS,7aS)-Konfiguration.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das optisch aktive N-geschützte Octahydro-1H-indol-2-carboxylat mit (2R,3aR,7aR)-Konfiguration ebenfalls erhalten werden. Spezielle Beispiele für die optisch aktive N-geschützte Octahydro-1H-indol-2-carbonsäure der Formel (2) mit einer (2R,3aR,7aR)-Konfiguration umfassen beispielsweise diejenigen mit der (2R,3aR,7aR)-Konfiguration anstelle der (2S,3aS,7aS)-Konfiguration in den oben als Beispiele angegebenen speziellen Verbindungen.
Optisch aktive N-geschützte Octahydro-1H-indol-2-carbonsäuren der Formel (2), die in der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, können des Weiteren ohne weiteres in die entsprechende optisch aktive Octahydro-1H-indol-2-carbonsäure durch Entschützen, d. h. Entfernen der durch R² dargestellten Imino-Schutzgruppe, in bekannter Weise oder nach ähnlichen Verfahren gemäß der Offenbarung in Protective Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene, 3. Auflage, Wiley, umgewandelt werden.
Beispiele
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung detailliert unter Bezug auf Beispiele und dergleichen angegeben; jedoch ist die Erfindung in keinster Weise auf diese Beispiele beschränkt.
Referenzbeispiel 1
Herstellung eines Gemischs von Ethyl-(2S,3aS,7aS)-octahydro-1H-indol-2-carboxylat und Ethyl-(2R,3aR,7aR)-octahydro-1H-indol-2-carboxylat.
Zu einer Lösung 65,0 g (343,5 mmol) Ethyl-indol-2-carboxylat in 514 g Ethanol, die in einen Autoklaven eingetragen wurde, wurden 38,3 g konzentrierte Schwefelsäure und dann 5 g 5 % Rhodium-Kohlenstoff (in Form des Trockengewichts) gegeben. Die Atmosphäre in dem verschlossenen Autoklaven wurde durch Stickstoff ersetzt und der Autoklav wurde anschließend mit Wasserstoff mit 0,4 MPa beschickt und die Temperatur wurde auf 60 °C erhöht. Unter Beibehalten eines Drucks von 0,4 MPa im Inneren des Autoklaven wurde die Lösung bei 60 °C 10 h gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde der Katalysator durch Filtration entfernt und dann das Lösemittel durch Destillation entfernt. Der auf diese Weise erhaltene konzentrierte Rückstand wurde zu gekühltem Wasser gegeben und danach wurde das gebildete Gemisch mit einer 10%igen wässrigen Kaliumcarbonatlösung zur Einstellung des pH-Werts des Gemischs auf 7 gemischt. Ferner wurde nach Einstellung der Lösung auf einen pH-Wert von 9 mit einer 10%igen wässrigen Kaliumbicarbonatlösung die Wasserphase mit Diethylether extrahiert. Die auf diese Weise erhaltene organische Phase wurde mit einer 15%igen wässrigen Natriumchloridlösung gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Danach wurde das Magnesiumsulfat durch Filtration entfernt und das Lösemittel in der auf diese Weise erhaltenen Lösung durch Destillation entfernt, wobei 57,2 g eines Gemischs von Ethyl-(2S,3aS,7aS)-octa hydro-1H-indol-2-carboxylat und Ethyl-(2R,3aR,7aR)-octahydro-1H-indol-2-carboxylat erhalten wurden. [56,4 g der gewünschten Verbindungen sind enthalten, 285,8 mmol (Ausbeute 83,2 %)].
Referenzbeispiel 2
Herstellung eines Gemischs von Ethyl-(2S,3aS,7aS)-N-benzyloxycarbonyl-octahydro-1H-indol-2-carboxylat und Ethyl-(2R,3aR,7aR)-N-benzyloxycarbonyl-octahydro-1H-indol-2-carboxylat
In 38,8 g Ethylacetat wurden 15,6 g (78,0 mmol) des Enantiomerengemischs, das in Referenzbeispiel 1 erhalten wurde, gelöst. Zu der gebildeten Lösung wurden 38,8 g Wasser und 15,5 g Kaliumcarbonat gegeben und gemischt. Zu dieser auf 0 °C gekühlten Lösung wurden 15,0 g Benzyloxycarbonylchlorid über 1 h getropft. Nach der Beendigung des Zutropfens wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und dann bei Raumtemperatur 4 h zum Vervollständigen der Reaktion gerührt. Nach der Beendigung der Reaktion wurden zu dem Reaktionsgemisch 40 g Ethylacetat zur Trennung der gebildeten Lösung gegeben. Von der erhaltenen organischen Phase wurde das Lösemittel durch Destillation entfernt, wobei ein öliges Gemisch von Ethyl-(2S,3aS,7aS)-N-benzyloxycarbonyl-octahydro-1H-indol-2-carboxylat und Ethyl-(2R,3aR,7aR)-N-benzyloxycarbonyl-octahydro-1H-indol-2-carboxylat erhalten wurde. Dieses ölige Gemisch wurde unter Verwendung von n-Hexan/Ethylacetat (Eluat eines Volumenverhältnisses von 85:15) durch Silicagelsäulenchromatographie gereinigt, wobei 24,3 g eines Gemischs von Ethyl-(2S,3aS,7aS)-N-benzyloxycarbonyl-octahydro-1H-indol-2-carboxylat und Ethyl-(2R,3aR,7aR)-N-benzyloxycarbonyl-octahydro-1H-indol-2-carboxylat erhalten wurde [Die enthaltenen reinen Verbindungen betrugen 22,8 g, 68,8 mmol (Ausbeute 88,2 %)].
Beispiel 1
Herstellung von (2S,3aS,7aS)-N-Benzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carbonsäure
15,1 g Dikaliumhydrogenphosphat wurden in 1000 g Wasser gelöst und dann wurde zu der gebildeten Lösung Phosphorsäure zur Herstellung eines auf pH 7,0 eingestellten wässrigen Puffers gegeben.
2,5 ml des wässrigen Puffers, 40,7 mg des in Referenzbeispiel 2 erhaltenen Gemischs und 101 mg einer Kultur, die die Esterase 160A189Y363term, die von dem Chromobacterium SC-YM-1-Stamm (dieser Stamm wurde ursprünglich im National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology als Hinterlegung Nr. FERMP-14009 durch den Anmelder am 9. Dezember 1993 und derzeit kontinuierlich als Hinterlegung Nr. FERMBP-6703 unter dem Budapest Treaty hinterlegt) stammte, der nach dem Verfahren gemäß der Beschreibung in der ungeprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 7-213280 enthielt, hergestellt wurde, enthielt, wurden in ein Reaktionsgefäß gegeben und das gebildete Gemisch wurde bei 30 °C 20 h gerührt. Eine Lösung, die durch Zugabe von 2,5 ml Aceton zu der Reaktionslösung hergestellt wurde, wurde nach Rühren mit einem Hochleistungsflüssigchromatogramm (einer Säule CHIRALCEL OJ-RH, 4,6 mmf × 15 cm, 5 mm, erhältlich von Daicel Chemical Industries, Ltd., wurde verwendet) analysiert und die erhaltene (2S,3aS,7aS)-N-Benzyloxycarbonyl-octahydro-1H-indol-2-carbonsäure wurde analysiert und es wurde ermittelt, dass die Ausbeute 48,2 % betrug und der Enantiomerenüberschuss 99,7 % e.e. oder mehr betrug (andere Enantiomere wurden nicht detektiert).
Beispiel 2
Herstellung von (2S,3aS,7aS)-N-Benzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carbonsäure
13,3 g Dikaliumhydrogenphosphat wurden in 1,0 kg Wasser gelöst und zu der gebildeten Lösung wurden 0,4 g Phosphorsäure zur Herstellung eines auf pH 8,0 eingestellten wässrigen Puffers gegeben.
Zu diesem wässrigen Puffer wurden 52,7 g (die 51,2 g reine Verbindung, 154,5 mmol, enthielten) eines racemischen Gemischs, das durch das Verfahren nach Referenzbeispiel 2 erhalten wurde, und 50,7 g einer Kultur, die die Esterase 160A189Y363term, die von dem Chromobacterium SC-YM-1-Stamm stammte, der nach dem Verfahren gemäß der Beschreibung in der ungeprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 7-213280 hergestellt wurde, enthielt, gegeben und dann wurde das erhaltene Gemisch bei 30 °C 30 h gerührt. Während der Reaktion wurden 59,8 g einer 10%igen wässrigen Natriumcarbonatlösung kontinuierlich so zugegeben, dass die Lösung bei pH 8,0 gehalten wurde. Nach der Beendigung der Reaktion wurde die Lösung durch Zugabe von 35%iger Salzsäure auf pH 2,2 eingestellt und zu dieser Lösung wurden 25,4 g Celite und 150 g Ethylacetat gegeben und dann wurde das erhaltene Material 0,5 h gerührt. Nach Abtrennung unlöslicher Materialien durch Filtern der durch Rühren erhaltenen Suspension wurde die auf diese Weise erhaltene Filtratlösung unter Verwendung einer 10%igen wässrigen Natriumhydroxidlösung auf pH 10,5 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wurde in eine Ölphase und eine Wasserphase durch Phasentrennung aufgetrennt.
Zu der auf diese Weise erhaltenen Wasserphase wurden 250 g Ethylacetat gegeben und dann wurde eine Extraktionsoperation durchgeführt und es erfolgte eine Trennung in eine Ölphase und eine Wasserphase.
Die auf diese Weise erhaltenen Ölphasen wurden kombiniert und das erhaltene Öl wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Danach wurde das Lösemittel durch Destillation ent fernt, wobei 27,3 g einer farblosen öligen Substanz erhalten wurden, die Ethyl-(2R,3aR,7aR)-N-benzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat enthielt.
25,8 g (77,7 mmol) Ethyl-N-benzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat waren in dieser öligen Substanz enthalten, weshalb die Ausbeute 50,3 % betrug und der Enantiomerenüberschuss 96,5 % e.e. betrug.
Zu der zuvor von der Ölphase abgetrennten Wasserphase wurden 250 g Ethylacetat gegeben. Dann wurde zu der wässrigen Lösung 35%ige Salzsäure gegeben, um den pH-Wert der Lösung auf 2,0 zu bringen und anschließend wurden die Ölphase und die Wasserphase getrennt.
Zu der auf diese Weise erhaltenen Wasserphase wurden 250 g Ethylacetat gegeben und die Lösung wurde einer Extraktion und anschließend einer Phasentrennung unterzogen. Die auf diese Weise erhaltenen Ölphasen wurden kombiniert und das erhaltene Öl wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Dann wurde das Lösemittel durch Destillation entfernt, wobei 24,6 g eines farblosen amorphen Materials erhalten wurden, das 23,2 g (76,3 mmol) reine (2S,3aS,7aS)-N-Benzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carbonsäure enthielt.
(2S,3aS,7aS)-N-Benzyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carbonsäure wurde in einer Ausbeute von 49,4 % und mit einem Enantiomerenüberschuss von 99,8 % e.e. oder mehr erhalten. Das andere Enantiomer wurde nicht detektiert.
Referenzbeispiel 3
Herstellung eines Gemischs von Ethyl-(2S,3aS,7aS)-N-tert-butoxycarbonyl-octahydro-1H-indol-2-carboxylat und Ethyl-(2R,3aR,7aR)-N-tert-butoxycarbonyl-octahydro-1H-indol-2-carboxylat
Zu einer Lösung von 1,97 g (10,0 mmol) des in Referenzbeispiel 1 erhaltenen Gemischs der Enantiomere und 2,29 g Di-tert-butyldicarbonat in 9,9 g Toluol wurden tropfenweise 1,11 g Triethylamin bei 20 °C über 1 h gegeben und die Lösung wurde mehr als 12 h bei der Temperatur gerührt. Dann wurde die Lösung mit 1%iger Salzsäure, 5%igem Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen. Die abgetrennte Ölphase wurde eingedampft, wobei ein öliges Gemisch von Ethyl-(2S,3aS,7aS)-N-tert-butoxycarbonyl-octahydro-1H-indol-2-carboxylat und Ethyl-(2R,3aR,7aR)-N-tert-butoxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carboxylat erhalten wurde. Dieses Gemisch wurde durch Silicagelsäulenchromatographie unter Verwendung des Elutionsmittels n-Hexan/Ethylacetat (99/1, V/V) gereinigt, wobei 2,77 g eines Gemischs von Ethyl-(2S,3aS,7aS)-N-tert-butoxycarbonyl-octahydro-1H-indol-2-carboxylat und Ethyl-(2R,3aR,7aR)-N-tert-butoxycarbonyl-octahydro-1H-indol-2-carboxylat erhalten wurden. (Ausbeute 93,1 %)
Beispiel 3
Herstellung von (2S,3aS,7aS)-N-tert-butyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carbonsäure
0,29 g Dikaliumhydrogenphosphat wurden in 20,0 g Wasser gelöst und eine Pufferlösung, deren pH-Wert durch Zugabe von Phosphorsäure auf pH 8,0 eingestellt wurde, wurde hergestellt.
Zu diesem wässrigen Puffer wurden 1,00 g (3,36 mmol) des racemischen Gemischs, das durch das Verfahren gemäß Referenzbeispiel 2 erhalten wurde, und 10,0 g einer Kultur, die die Esterase 160A189Y363term, die von dem Chromobacterium SC-YM-1-Stamm stammte, der nach dem Verfahren gemäß der Beschreibung in der ungeprüften veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 7-213280 hergestellt wurde, enthielt, gegeben und dann wurde das erhaltene Gemisch bei 30 °C 40 h gerührt. Während der Reaktion wurden 1,8 g einer 10%igen wässrigen Natriumcarbonatlösung kontinuierlich so zugege ben, dass die Lösung bei einem pH-Wert von 8,0 gehalten wurde. Nach der Beendigung der Reaktion wurde die Lösung durch Zugabe von 10%igem Natriumcarbonat auf pH 10,5 eingestellt. Das abgesetzte Gemisch trennte sich in eine Ölphase und eine Wasserphase und die Wasserphase wurde mit 10 ml Ethylacetat extrahiert, absetzen gelassen und getrennt und die Extraktion wurde erneut wiederholt. Die vereinigte Ölphase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft, wobei 0,42 g einer blassbraunen öligen Substanz erhalten wurden, die (2R,3aR,7aR)-N-tert-Butyloxycarbonyl-octahydro-1H-indol-2-carbonsäure enthielt. Die ölige Substanz enthielt 0,39 g (1,30 mmol) (2R,3aR,7aR)-N-tert-Butyloxycarbonyloctahydro-1H-indol-2-carbonsäure und die Ausbeute betrug 38,7 % und 99,3 % e.e. (Der Enantiomerenüberschuss wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung von zwei Stücken CHIRALCEL OJ-RH, 4,6 mm ∅ × 15 cm, 5 mm, hergestellt von Daicel Company, Limited, ermittelt). Ein weiteres Isomer wurde nicht detektiert.
Zu der zuvor von der Ölphase abgetrennten Wasserphase wurden 30 g Ethylacetat gegeben. Dann wurde 10%ige Salzsäure zu der wässrigen Lösung zum Erreichen eines pH-Werts der Lösung von 2,8 gegeben und anschließend wurden die Ölphase und die Wasserphase getrennt.
Zu der auf diese Weise erhaltenen Wasserphase wurden 30 g Ethylacetat gegeben und die Lösung wurde extrahiert und einer Phasentrennung unterzogen und die Extraktion wurde erneut wiederholt. Die kombinierte Ölphase wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft, wobei 0,46 g einer blassbraunen öligen Substanz erhalten wurden, die 0,41 g (2S,3aS,7aS)-N-tert-Butyloxycarbonyl-octahydro-1H-indol-2-carbonsäure enthielt. (2S,3aS,7aS)-N-tert-Butyloxycarbonyl-octahydro-1H-indol-2-carbonsäure wurde in einer Ausbeute von 45,4 % und 99,5 % e.e. oder mehr erhalten. Das andere Enantiomer wurde nicht detektiert (Der Enantiomerenüberschuss wurde durch Hochleistungsflüssig chromatographie unter Verwendung von zwei Stücken CHIRALCEL OJ-RH, 4,6 mm ∅ × 15 cm, 5 mm, hergestellt von Daicel Company, Limited, ermittelt).
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven N-geschützten Octahydro-1H-indol-2-carbonsäure der Formel (2):
worin R² für eine Schutzgruppe einer Iminogruppe steht und die mit Sternchen (*) bezeichneten Kohlenstoffatome für asymmetrische Kohlenstoffatome stehen, wobei das Verfahren das Umsetzen eines Gemischs von Enantiomeren von N-geschütztem Octahydro-1H-indol-2-carboxylat der Formel (1):
worin R¹ für eine C1-4-Alkylgruppe steht und R² wie oben definiert ist, mit einem Enzym, das zur asymmetrischen Hydrolyse der -CO₂R¹-Gruppe der Formel (1) fähig ist, umfasst, wobei das Enzym ein Enzym ist, das i) eine Polypeptidsequenz SEQ ID NO:1 umfasst oder ii) eine Polypeptidsequenz SEQ ID NO:1, die durch Deletion von 8 C-terminalen Aminosäuren und/oder Substitution der 160. und/oder 189. Aminosäure in SEQ ID NO:1 modifiziert ist, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gemisch von Enantiomeren von N-geschütztem Octahydro-1H-indol-2-carboxylat der Formel (1) ein Gemisch von einem einzigen Enantiomer und einem Antipoden desselben ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das einzige Enantiomer und der Antipode desselben die Verbindung der Formel (1') und die Verbindung der Formel (1'') sind:
worin R¹ und R² wie oben definiert sind.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, das ferner das Isolieren des Antipoden der erhaltenen, asymmetrisch hydrolysierten optisch aktiven N-geschützten Octahydro-1H-indol-2-carbonsäure als Ester und das Hydrolysieren des isolierten, optisch aktiven N-geschützten Octahydro-1H-indol-2-carbonsäureesters unter Bildung der Säureverbindung des Antipoden des Enantiomers der Formel (2) umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Hydrolysieren des N-geschützten Octahydro-1H-indol-2-carboxylats in Gegenwart einer Base durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei R² für eine tert-Butoxycarbonylgruppe, Benzyloxycarbonylgruppe, Acetylgruppe, Benzoylgruppe oder Benzylgruppe steht.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei R² für eine Benzyloxycarbonylgruppe steht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei R¹ für Ethyl steht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das ferner die Stufe des Entschützens der optisch aktiven N-geschützten Octahydro-1H-indol-2-carbonsäure der Formel (2) unter Bildung der entsprechenden, optisch aktiven Octahydro-1H-indol-2-carbonsäure umfasst.