DE602004005072T2

DE602004005072T2 - Erythropoetin-lösungsformulierung

Info

Publication number: DE602004005072T2
Application number: DE602004005072T
Authority: DE
Inventors: Stefan Arnold; Okke Franssen; Albert Mekking
Original assignee: Biogenerix GmbH
Current assignee: Ratiopharm GmbH
Priority date: 2003-12-01
Filing date: 2004-12-01
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2024-12-02
Also published as: AU2004294289A1; RU2006123317A; PT1689437E; BRPI0416679A; ZA200602340B; EP1537876A1; BRPI0416679B8; BRPI0416679B1; US20070128231A1; DK1689437T3; AU2004294289B2; WO2005053745A1; US7468351B2; ES2280057T3; RU2362581C2; HRP20070062T3; PL1689437T3; ATE355081T1; CA2545880A1; EP1689437A1

Description

Erythropoietin (nachstehend abgekürzt als EPO) ist ein Glykoprotein-Hormon, das die Differenzierung und Proliferation von Erythrozyten-Vorläuferzellen fördert. Erythrozyten sind im Blut während einer bestimmten Zeitspanne vorhanden. Beim Menschen werden nach einer durchschnittlichen Lebensdauer von 120 Tagen die roten Blutkörperchen zerstört und aus dem Körper ausgeschieden. Andererseits werden die roten Blutkörperchen ständig vom Knochenmark gebildet, so dass die Gesamtzahl der Erythrozyten im Normalzustand bleibt. Besonders Patienten, die unter Nierenkrankheiten leiden, haben nicht genügend Erythrozyten im Blut. Erythropoietin spielt eine zentrale Rolle bei der Bildung von Erythrozyten und wird deshalb häufig bei der Behandlung anämischer Patienten eingesetzt. Besonders Patienten unter Dialysebehandlung erhalten ständig EPO.
Um den Markt mit einem stabilen EPO-Präparat zu versorgen, wird von der Struktur des Arzneimittels verlangt, dass chemische Veränderungen, wie Hydrolyse, Disulfid-Austauschreaktionen oder physikalische Veränderungen, wie Denaturierung, Aggregation oder Adsorption, die häufig bei EPO-Formulierungen auftreten, so weit als möglich unterdrückt werden. Da EPO ein glykosiliertes Polypeptid ist, wurde es zur Stabilisierung häufig lyophilisiert. Die Lyophilisierung erhöht aber die Herstellungskosten und das lyophilisierte Arzneimittel muss unmittelbar, bevor es dem Patienten appliziert wird, gelöst werden, um eine wässrige Lösung herzustellen. Das ist zusätzliche Arbeit für die Ärzte und es kann zu Problemen führen, wenn die Feststoffe nicht sicher und vollständig in der wässrigen Lösung gelöst sind.
Es gab verschiedene Ansätze die Stabilitätsprobleme zu vermeiden. Produkte, die auf dem Markt waren, enthielten Humanserumalbumin oder gereinigte Gelatine, die üblicherweise als Stabilisator verwendet wird. Weil es aber nahezu unmöglich ist, jegliches Risiko einer möglichen viralen oder durch TSE (übertragbare spongiforme Encephalopathie) bedingten Kontamination auszuschließen, wurden diese Stabilisatoren ersetzt.
EP-A 909 564 von Chugai schlägt ein Erythropoietin-Lösungspräparat vor, das eine Aminosäure als Stabilisierungsagens enthält. WO 00/61169 offenbart pharmazeutische Zusammensetzungen von Erythropoietin, die frei von humanen Blutserumprodukten sind und mit einer Aminosäure und einem Sorbitan-mono-9-octadecenoat-poly(oxy-1,2-ethandiyl)-Derivat stabilisiert werden.
Es wurde aber festgestellt, dass die wohlbekannten Formulierungen immer noch dazu neigen, Aggregate zu bilden. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein kann die Bildung von Aggregaten durch die Struktur von EPO erklärt werden. Die wohlbekannte Sequenz von EPO enthält vier Cysteinreste. Zwischen cys⁷–cys¹⁶¹ und cys²⁹–cys³³ sind zwei Disulfidbrücken. Es wird angenommen, dass es wegen Oxidations-Reduktionsprozessen, besonders nach längerer Lagerung in wässriger Lösung, zur Umlagerung der Disulfidbrücken kommen kann, was zu Aggregaten führt, die nicht gelöst werden können. Das kann zu unerwünschten immunologischen Nebenwirkungen führen. Kürzlich wurde über solche Nebenwirkungen bei einigen Patienten mit chronischer renaler Anämie berichtet, die mit Erythropoietin (Eprex^®, epoetin alfa) behandelt wurden. Während der Behandlung entwickelten diese Patienten Erythroblastopenie (PRCA), eine schwerwiegende immunologische Nebenwirkung, die zu transfusionsabhängiger Anämie führt (Casadevall 2002 „Antibodies against rHuEPO: native and recombinant." Nephrol Dial Transplant 17 Suppl 5: 42–7; Casadevall, Nataf et al. 2002 „Pure red-cell aplasia and antierythropoietin antibodies in patients treated with recombinant erythroporetin." N Engl J Med 346(7): 469–75). Es ist sehr wahrscheinlich, dass dieser nachteilige Effekt durch die pharmazeutische Formulierung von Eprex^® ausgelöst wurde (Schellekens 2003 „Relationship between biopharmaceutical immunogenicity of epoetin alfa and pure red cell aplasia." Curr Med Res Opin 19(5): 433–4).
Deshalb ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Erythropoietin-Lösungsformulierung zur Verfügung zu stellen, die stabil ist und bei der die Bildung von Aggregaten sogar bei höheren Temperaturen wesentlich verringert oder völlig verhindert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb eine stabile pharmazeutische Formulierung von Erythropoietin wie in den Ansprüchen definiert.
Die stabile Lösung von Erythropoietin enthält eine pharmazeutische Menge an Erythropoietin. Die Menge an Erythropoietin liegt in einem Bereich von etwa 1.000 IU/ml bis zu 40.000 IU/ml. Abhängig von den Bedürfnissen der Kliniker sind bevorzugte Konzentrationen 2.000 IU/ml, 5.000 IU/ml und 10.000 IU/ml für intravenöse (iv) und ebenso für subkutane (sc) Injektionen. Der in der vorliegenden Erfindung benutzte Begriff „Erythropoietin" beinhaltet sowohl solche Proteine, die die biologische Aktivität von humanem Erythropoietin haben, als auch Erythropoietin-Analoga, Erythropoietin-Isoformen, Erythropoietin-Mimetika, Erythropoietin-Fragmente, Hybrid-Erythropoietin-Proteine oder Fusionsproteine. Das Glykosidierungsmuster von Erythropoietin hat eine starke Auswirkung und kann deshalb die Einheiten beeinflussen, die eine bestimmte Menge von Erythropoietin hat.
Das Puffermittel, das in der vorliegenden Lösung verwendet wird, ist ein Natriumphosphatpuffer. Der Puffer wird eingesetzt um einen pH-Wert im Bereich von etwa 5,9 bis etwa 6,8 aufrechtzuerhalten, bevorzugt zwischen 6,2 und 6,6 und am meisten bevorzugt zwischen 6,4 und 6,5. Der pH-Wert kann mit einer entsprechenden Base eingestellt werden. Im Phosphatpuffersystem der vorliegenden Erfindung wird zu diesem Zweck entweder NaOH oder Phosphorsäure verwendet. Es ist auch möglich, KOH an Stelle von NaOH zu verwenden. Die Menge an Puffermittel, die in der pharmazeutischen Formulierung vorliegt, liegt in einem Bereich von etwa 5mM bis etwa 50mM, vorzugsweise zwischen etwa 10mM und etwa 30mM.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Erythropoietinlösung durch Zugabe von entweder NaCl oder Tris-(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) oder vorzugsweise von Beiden, stabilisiert werden kann. Der Begriff „Tris" deckt alle Formen dieser Verbindung, wie Tris-Base oder Tris-HCl ab. Lösungen, die in den Körper eines Patienten injiziert werden, haben vorzugsweise eine geeignete Osmolarität. Das kann durch Zugabe von Natriumchlorid erreicht werden. Im Laufe der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass die Zugabe von NaCl zum Phosphatpuffer die Bildung von Aggregaten wesentlich reduziert. NaCl wird in einer Menge zwischen etwa 20 und etwa 150 mM zugegeben, wobei ein Bereich zwischen 30 und 120 mM bevorzugt ist, am meisten bevorzugt ist ein Bereich zwischen 50 bis 100 mM.
Der Stabilisierungseffekt kann auch durch Zugabe von Tris-(hydroxymethyl)aminomethan in einer Menge zwischen etwa 10 und etwa 150 mM erreicht werden, wobei ein Bereich zwischen etwa 40 und etwa 100 mM bevorzugt ist. Tris-(hydroxymethyl)aminomethan ist als Puffersystem für pharmazeutische Proteinformulierungen im Stand der Technik (z.B. WO 03/072060) anerkannt. Normalerweise wird es in einem pH-Bereich zwischen 7 und 9 verwendet. Bei pH-Werten zwischen 5,9 und 6,8 zeigt Tris-(hydroxymethyl)aminomethan keine oder nur ganz geringe Puffereigenschaften. Der überraschende Stabilisierungseffekt von Tris-(hydroxymethyl)aminomethan korreliert deshalb nicht mit seinen Puffereigenschaften.
Der Stabilisierungseffekt kann entweder durch Zugabe von Natriumchlorid oder Tris-(hydroxymethyl)aminomethan erreicht werden. Der Stabilisierungseffekt wird aber wesentlich verbessert durch gemeinsame Zugabe von beiden Stabilisierungssubstanzen, und zwar NaCl und Tris, zur Lösung.
Darüber hinaus enthält die Erythropoietinlösung vorzugsweise auch ein nichtionisches Tensid, bevorzugt Polysorbat. Polysorbate sind die Polykondensationsprodukte aus Sorbitanestern und Polyethylenglykol. Die Fettsäurereste der Sorbitanester, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind ausschließlich aus Pflanzen gewonnen, nicht aus Tieren. Das ist wichtig, um die Sicherheit der Erythropoietinlösung zu verbessern. Darüber hinaus ist es wichtig, dass der gemäß der Europäischen Pharmacopöe (Ph Eur), Abschnitt 2.5.5, festgelegte Peroxidgehalt unter 1,00 μMol/g liegt, vorzugsweise unter 0,5 μMol/g. Das entspricht einem Peroxidgehalt zwischen 0,01 bis 1 μM, vorzugsweise unter 0,5 μM als Konzentration in der endgültigen pharmazeutischen Zusammensetzung. Die Polysorbate sind kommerziell zum Beispiel unter dem Handelsnamen Tween^® 20, beziehungsweise Tween^® 80 erhältlich.
Es muss festgehalten werden, dass die Erythropoietinlösungsformulierung gemäß der vorliegenden Erfindung keine Produkte enthält, die aus Humanblut, insbesondere aus Humanserumalbumin gewonnen wurden. Darüber hinaus enthält die Formulierung keine Aminosäuren als Stabilisatoren. Vorzugsweise enthält die Lösung auch keinen Harnstoff. Die Formulierung der vorliegenden Erfindung enthält auch keine Aminosäuren, die als Stabilisatoren bei anderen Formulierungen zugegeben werden.
Die Erythropoietinlösungen werden für Injektionen verwendet. Die Formulierungen sind deshalb vorzugsweise Injektionslösungen, die für intravenöse und subkutane Injektionen hergestellt werden. Abhängig von der spezifischen Nutzung kann die Formulierung auch die herkömmlichen Zusatzstoffe für diese Injektionslösungen enthalten.
Weiterhin wird die Erfindung durch die folgenden Beispiele erläutert:
Beispiel 1
Herstellung von Erythropoietinlösungen
EPO-Lösungen als Arzneimittel-Bulkware wurden mit verschiedenen Lösungen auf 100 μg/ml verdünnt, um die Formulierungen zu erhalten, die in den nachstehenden Tabellen 1 und 2 aufgeführt sind.
Tabelle 1 zeigt eine Formulierung, die nach dem Stand der Technik hergestellt wurde. Diese Formulierung enthält Glycin als Stabilisator und der pH-Wert dieser Formulierung gemäß dem Stand der Technik liegt zwischen 6,6 und 7,2.

PB bedeutet Phosphatpuffer

Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden weitere Formulierungen hergestellt. Die Formulierungen unterscheiden sich in Hinblick auf den Gehalt an NaCl und Tris. Die Formulierungen sind in der nachstehenden Tabelle 2 aufgeführt.
Nach der Herstellung wurden die Lösungen filtriert (PALL Gelman, Acrodisc, 0,2 μm, Supor Membran, nicht pyrogen, steril) und in 2ml Glasampullen Typ I (1ml Volumen) abgefüllt. Am Filter wurde keine Absorption von EPO beobachtet. Die verpfropften (unter Verwendung von Stopfen aus Flurotec silikonisiertem Butylkautschuk mit 13 mm, Daiichi) und verkapselten Ampullen wurden unter ICH-Bedingungen (ICH = International Conference on Harmonization of Technical Requirements of Pharmaceuticals for Human Use) bei 40 + 3°C/80% Luftfeuchtigkeit bis zu acht Wochen gelagert.
Um vergleichbare Formulierungen zu erhalten, wurde Tween 20, beziehungsweise Tween 80 in den Formulierungen verwendet. Alle verwendeten Tween-Präparate hatten einen niedrigen Peroxid-Anfangsgehalt.
Beispiel 2
Bestimmung von Aggregaten
Der Grad der Aggregation wurde mit Hochdruck-Grössenausschluss-Chromatographie (HP-SEC) gemessen. Durch Verwendung der HP-SEC-Technologie ist es möglich, exakt die Menge des monomeren EPO zu bestimmen. Dimere und Multimere eluieren bei anderen Peaks. Für die Messung wurde ein TSK G3000 SWXL, 5 μm, 300 × 7,8 mm verwendet. Die mobile Phase war ein Puffer aus 150 mM NaCl, 10 mM NaH₂PO₄ × 2 H₂O, mit einem pH-Wert von 7,2. Die Fläche unter den Peaks wurde berechnet und die Menge an monomerem EPO wurde über eine Zeitspanne bis zu acht Wochen gemessen. Die Proben wurden bei 40°C gelagert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt.

SD bedeutet Standardabweichung

Tabelle 3
Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, dass durch Ersetzen der Aminosäure Glycin durch NaCl und/oder Tris eine erhebliche Reduzierung der Aggregatbildung erreicht wurde. Die Ergebnisse von Versuch 3 werden in den 1 bis 4 gezeigt. Alle Versuche wurden in Phosphatpuffer (PB) ausgeführt.
In 1 wird die Bildung von Aggregaten im Zeitverlauf (bis zu sechs Wochen) gezeigt. Die meisten Aggregate wurden in einer Formulierung gefunden, in der Glycin als Stabilisator verwendet wurde (Stand der Technik). Dies wurde verglichen mit Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung, worin entweder NaCl oder 70 mM Tris und NaCl enthalten waren.
2 zeigt in einem größeren Maßstab den Einfluss der Zugabe von 70 mM Tris und 0,03% Tween zusätzlich zu NaCl.
3 zeigt den Einfluss der Menge an Tris in Formulierungen, die auch NaCl und Tween 20 enthalten. Es ist ersichtlich, dass gute Ergebnisse innerhalb eines Bereichs zwischen 20 mM Tris und 140 mM Tris erzielt werden können, wobei die besten Ergebnisse mit etwa 70 mM Tris erzielt wurden.
4 zeigt einen Vergleich zwischen der Formulierung, die aus dem Stand der Technik bekannt ist, und Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung. Die geringste Bildung von Aggregaten wurde bei etwa 70 mM Tris, NaCl, und 0,03% Tween 20 bei einem pH-Wert von 6,5 beobachtet.

Claims

Stabile pharmazeutische Formulierung von Erythropoietin, die Tris-(hydroxymethyl)aminomethan als Stabilisator enthält, wobei die Formulierung keine Aminosäuren oder Humanserumalbumin enthält.
Stabile pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1 enthaltend: a) einen Natriumphosphatpuffer als pH Puffermittel, b) Tris-(hydroxymethyl)aminomethan in einer Menge von 10 bis 200 mM als Stabilisator, c) eine pharmazeutische Menge an Erythropoietin.
Formulierung nach Anspruch 2, die NaCl in einer Menge von 20 bis 150 mM enthält.
Formulierung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Menge an NaCl im Bereich von 50 bis 100 mM liegt.
Formulierung nach Anspruch 1 bis 4, die eine wässrige Formulierung ist.
Formulierung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das pH-Puffermittel die Formel Na_xH_yPO₄ hat, wobei x 1 oder 2 ist und y 1 oder 2 ist und die Summe aus x und y 3 ist, wobei das pH-Puffermittel in der pharmazeutischen Formulierung in einem Bereich zwischen 5 mM und 50 mM enthalten ist.
Formulierung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der pH-Wert zwischen 5,9 und 6,8 liegt, vorzugsweise zwischen 6,2 und 6,6.
Formulierung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Tris-(hydroxymethyl)aminomethan in einer Menge von 20 bis 100 mM enthalten ist.
Formulierung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die auch ein nichtionisches Tensid in einer Menge zwischen 0,005 und 0,1% G/V enthält.
Formulierung nach Anspruch 9, wobei das nichtionische Tensid ein Polysorbat, vorzugsweise Tween 20 oder Tween 80 ist.
Formulierung nach Anspruch 10, wobei das Polysorbat nicht aus Material hergestellt wird, das aus Tieren gewonnen wurde, und wobei der Gehalt an Peroxid niedriger als 1,00 μmol/g ist.
Formulierung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die zusätzlich Ethylendiamintetraessigsäure in einer Menge von 0,1 bis 0,5 mM enthält.