DE60133730T2

DE60133730T2 - Selektive lineare peptide mit melanocortin-4 rezeptor (mc4-r) agonistischer aktivität

Info

Publication number: DE60133730T2
Application number: DE60133730T
Authority: DE
Inventors: Li Westfield CHEN; Adrian Wai-Hing Glen Rock CHEUNG; Xin-Jie Livingston CHU; Waleed Wayne DANHO; Joseph Nutley SWISTOK; Keith Alan HoHokus YAGALOFF
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2000-04-04
Filing date: 2001-03-27
Publication date: 2009-07-02
Anticipated expiration: 2021-03-28
Also published as: EP1272516B1; US20010056179A1; AU2001250407A1; ES2304128T3; AR034407A1; CA2402416A1; EP1272516A2; JP2003529607A; US20050239711A1; US20080177036A1; JP3938690B2; WO2001074844A2; US6600015B2; US20030229200A1; WO2001074844A3; DE60133730D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Fettsucht wird allgemein als ernstes Gesundheitsproblem der Industrieländer angesehen und hat in den Vereinigten Staaten einen epidemischen Zustand erreicht. Mehr als 50% der U. S.-Bevölkerung wird als übergewichtig angesehen, wobei > 25% als klinisch fettsüchtig und mit einem beträchtlichen Risiko für eine Herzerkrankung, nicht-insulinabhängigen Diabetes mellitus (NIDDM), Hypertonie und bestimmte Krebsarten diagnostiziert werden. Diese Epidemie stellt eine wesentliche Belastung für das Gesundheitssystems dar, da geschätzte Behandlungskosten der Fettsucht von mehr als 70 Milliarden $ jährlich in den U. S. allein erwartet werden. Strategien zur Behandlung von Fettsucht schließen eine Verringerung der Nahrungsaufnahme oder eine Erhöhung des Energieverbrauchs ein.
Es wurde gezeigt, dass ein cyclisches Heptapeptidanalogon des α-melanocytenstimulierenden Hormons (αMSH) mit Melanocortin-4-Rezeptor-(MC4-R)-agonistischer Aktivität eine lang anhaltende Hemmung der Nahrungsaufnahme bei Mäusen bewirkte, wenn es in den dritten Hirnventrikel oder intraperitoneal injiziert wurde. Diese Wirkung war reversibel, wenn es gemeinsam mit einem MC4-R-Antagonisten verabreicht wurde (Fan et al., Nature (1997) 385: 165–168). Daher sind Agonisten der MC4-R-Aktiviät bei der Behandlung oder Vorbeugung von Fettsucht verwendbar.
Es gibt fünf bekannte Melanocortinrezeptoren, basierend auf der Sequenzhomologie, die im Bereich einer 35 bis 60%igen Homologie zwischen Familienmitgliedern liegt (Cone et al., Rec. Prog. Hormone Res. (1996) 51: 287–318), jedoch unterscheiden sich diese Rezeptoren in ihren Funktionen. Der MC1-R ist zum Beispiel ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, der die Pigmentierung als Antwort auf das αMSH, das ein wirksamer Agonist des MC1-R ist, reguliert (Cone et al., ibid.). Der Agonismus des MC1-R-Rezeptors führt zur Stimulierung der Melanocyten, die Eumelanin erzeugt und das Risiko für Hautkrebs erhöht. Der Agonismus des MC1-R kann auch neurologische Wirkungen haben. Die Stimulierung der MC2-R-Aktivität kann zu einem Karzinom von adrenalem Gewebe führen. Die Wirkungen des Agonismus des MC3-R und MC5-R sind noch nicht bekannt. Alle Melanocortinrezeptoren antworten auf die Peptidhormonklasse der melanocytenstimulierenden Hormone (MSH). Diese Peptide sind von Proopiomelanocortin (POMC), einem Prohormon von 131 Aminosäuren, abgeleitet, das zu drei Klassen von Hormonen, den Melanocortinen (α, β und γ), Adrenocorticotropinhormon (ACTH) und verschiedenen Endorphinen (z. B. Lipotropin), verarbeitet wird (Cone et al, ibid.). Wegen ihrer unterschiedlichen Funktionen weist der gleichzeitige Agonismus der Aktivitäten von mehreren Melanocortinrezeptoren die Möglichkeit der Verursachung unerwünschter Nebenwirkungen auf. Daher ist es wünschenswert, dass ein Agonist des MC4-R für den MC4-R selektiver als für einen oder mehrere der anderen Melanocortinrezeptoren ist.
Haskell-Luevano et al. (Peptides (1996) 17(6): 995–1002) offenbaren Peptide, die das Tripeptid (D)Phe-Arg-Trp enthalten und in einem Bioassay der Froschhaut (Rana pipiens) melanotrope (hautverdunkelnde) Aktivität zeigen. Haskell-Luevano et al. (ibid.) offenbaren keine der nachstehend beschriebenen Verbindungen der Formel I, II oder III.
Maria A. Bednarek et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications 261, 209–213 (1999)) offenbaren Analoga von MTII, Lactamderivate von α-Melanotropin, die Agonisten des menschlichen Melanocortin-4-Rezeptors sind.
Roger A. H. Adnan et al. (European Journal of Pharmacology 378 (1999) 249–258) offenbaren Melanocortinrezeptorliganden, die selektive Melanocortin-MC4-Rezeptoragonisten sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Verbindungen, umfassend die folgende Struktur (S1):
wobei R¹, R⁶, R⁷, R⁸, m, n, A und B wie in a) bis d) definiert sind, und wobei die Verbindung ausgewählt ist aus

a) einer Verbindung der Formel:
wobei m gleich 0 oder 1 ist; n gleich 0 oder 1 ist; R¹ ein unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; ein mit Phenyl oder Carboxyl monosubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; unsubstituiertes Phenyl; oder mit Fluor, Chlor oder geradkettigem oder verzweigtem Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen monosubstituiertes Phenyl ist; X
ist, wobei R², R³ und R⁴ unabhängig Wasserstoff oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind, wobei, wenn R³ Alkoxy ist, R² und R⁴ beide Wasserstoff sind; R⁹ Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder unsubstituiertes Phenoxy ist; R¹¹ Cyclohexyl, Cycloheptyl oder ein verzweigtes Alkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen ist; R⁶ Wasserstoff oder Methyl ist; R⁷
ist; Y
ist; und R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist; oder Y
ist; und R⁸ Wasserstoff ist;
b) einer Verbindung der Formel:
wobei m gleich 0 oder 1 ist; n gleich 0 oder 1 ist; R¹ ein unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; ein mit Phenyl oder Carboxyl monosubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; unsubstituiertes Phenyl; oder mit Fluor, Chlor oder geradkettigem oder verzweigtem Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen monosubstituiertes Phenyl ist; R², R³ und R⁴ unabhängig Wasserstoff; ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; Hydroxy; ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; oder Chlor sind, wobei, wenn R³ Alkyl, Hydroxy, Alkoxy oder Chlor ist, R² und R⁴ beide Wasserstoff sind; R⁶ Wasserstoff oder Methyl ist; R7
ist; Y
ist; und R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist; oder Y
ist; und R⁸ Wasserstoff ist;
c) einer Verbindung der Formel:
wobei m gleich 0 oder 1 ist; n gleich 0 oder 1 ist; R¹ ein unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen; ein mit Phenyl oder Carboxyl monosubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; oder unsubstituiertes Phenyl; oder mit Fluor, Chlor oder geradkettigem oder verzweigtem Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen monosubstituiertes Phenyl ist; R⁷
ist; Y
ist; und R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist; oder Y
ist; und R⁸ Wasserstoff ist; R¹⁰ Wasserstoff, Halogen, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder -NR¹²R¹³ ist, wobei R¹² und R¹³ jeweils unabhängig ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen sind oder zusammen -(CH₂)_q- sind, wobei q gleich 3, 4 oder 5 ist; und
d) einer Verbindung der Formel:
wobei R¹ unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen ist; R⁶ Wasserstoff oder Methyl ist; R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist; p gleich 2, 3 oder 4 ist, und R¹⁴
ist, oder p gleich 4 ist, und R¹⁴
ist, oder p gleich 3 ist, und R¹⁴
ist, oder
e)

Diese Erfindung stellt eine Verbindung der Formel:
bereit.
In den Verbindungen der Formel I ist m gleich 0 oder 1. n ist gleich 0 oder 1. R¹ ist ein unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; ein mit Phenyl oder Carboxyl monosubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; unsubstituiertes Phenyl; oder mit Fluor, Chlor oder geradkettigem oder verzweigtem Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen monosubstituiertes Phenyl. X ist
R², R³ und R⁴ sind unabhängig Wasserstoff oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wobei, wenn R³ Alkoxy ist, R² und R⁴ beide Wasserstoff sind. R⁹ ist Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder unsubstituiertes Phenoxy. R¹¹ ist Cyclohexyl, Cycloheptyl oder ein verzweigtes Alkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen. R⁶ ist Wasserstoff oder Methyl. R⁷ ist
Y ist
und R⁸ ist Wasserstoff oder Methyl; oder
Y ist
und R⁸ ist Wasserstoff.
Diese Erfindung stellt eine Verbindung der Formel:
bereit.
In den Verbindungen der Formel II ist m gleich 0 oder 1. n ist gleich 0 oder 1. R¹ ist ein unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen; ein mit Phenyl oder Carboxyl monosubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; oder unsubstituiertes Phenyl; oder mit Fluor, Chlor oder geradkettigem oder verzweigtem Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen monosubstituiertes Phenyl. R⁷ ist
Y ist
und R⁸ ist Wasserstoff oder Methyl; oder
Y ist
und R⁸ ist Wasserstoff.
R¹⁰ ist Wasserstoff, Halogen, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder -NR¹²R¹³, wobei R¹² und R¹³ jeweils unabhängig ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen sind oder zusammen -(CH₂)_q- sind, wobei q gleich 3, 4 oder 5 ist.
Diese Erfindung stellt eine Verbindung der Formel:
bereit.
In den Verbindungen der Formel III ist R¹ unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen. R⁶ ist Wasserstoff oder Methyl. R⁸ ist Wasserstoff oder Methyl. p ist gleich 2, 3 oder 4, und R¹⁴ ist
oder p ist 4, und R¹⁴ ist
oder p ist 3, und R¹⁴ ist
Die Verbindungen der Formeln I, II und III sowie Penta-Adpc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ und Penta-Ape-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ sind Agonisten des MC4-R. Es ist bekannt, dass Agonisten der MC4-R-Aktivität eine Verringerung der Nahrungsaufnahme in einem Mausmodell der menschlichen Fettsucht bewirken. Daher sind die Verbindungen der Formel I bei der Behandlung oder Vorbeugung von Fettsucht verwendbar.
Alle nachstehend beispielhaft angegebenen Verbindungen der Formeln I, II und III sowie Penta-Adpc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ und Penta-Ape-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ wurden in dem in-vitro-Test, der in dem Beispiel A der biologischen Aktivität nachstehend beschrieben wurde, hinsichtlich der MC4-R-Agonistenaktivität und MC1-R-Agonistenaktivität untersucht. Alle untersuchten Verbindungen wiesen hinsichtlich der MC4-R-Agonistenaktivität eine EC₅₀ von weniger als 500 nM auf und alle zeigten eine mindestens 10-fach größere MC4-R-Agonistenaktivität als MC1-R-Agonistenaktivität. Im Gegensatz dazu zeigte die Verbindung Bu-His-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ (Beispiel 30) eine größere MC1-R-Agonistenaktivität als MC4-R-Agonistenaktivität.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung Nomenklatur und Abkürzungen
Die zur Definition der Peptide verwendete Nomenklatur ist die typischerweise in dem Fachgebiet verwendete, wobei die Aminogruppe an dem N-Terminus links erscheint, und die Carboxylgruppe an dem C-Terminus rechts erscheint. Natürliche Aminosäuren bedeutet eine der natürlich vorkommenden Aminosäuren, die in Proteinen gefunden werden, d. h. Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp und His.
Wenn die Aminosäure isomere Formen aufweist, ist es die L-Form der Aminosäure, die dargestellt wird, wenn es nicht anders ausdrücklich angegeben ist.

Die folgenden Abkürzungen oder Symbole werden zur Darstellung der Aminosäuren, Schutzgruppen, Lösungsmittel, Reagenzien und dergleichen verwendet.

Symbol	Bedeutung
β-Ala	beta-Alanin
(2)-Nal	(2)-Naphthylalanin
Atc	2-Aminotetralin-2-carbonsäure
5-BrAtc	5-Brom-2-aminotetralin-2-carbonsäure
5-ClAtc	5-Chlor-2-aminotetralin-2-carbonsäure
5-MeOAtc	5-Methoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure
5-EtOAtc	5-Ethoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure
5-iPrOAtc	5-Isopropoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure
5-MeAtc	5-Methyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure
5-EtAtc	5-Ethyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure
5-iPrAtc	5-Isopropyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure
5-DmaAtc	5-Dimethylamino-2-aminotetralin-2-carbonsäure
Sar	Sarcosin (N-Methylglycin)
Cit	Citrullin
Apc	1-Amino-4-phenylcyclohexan-1-carbonsäure
4-HOApc	1-Amino-4-(4-hydroxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure
4-MeOApc	1-Amino-4-(4-methoxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure
3-MeOApc	1-Amino-4-(4-methoxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure
4-EtOApc	1-Amino-4-(4-ethoxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure
4-iPrOApc	1-Amino-4-(4-isopropoxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure
4-MeApc	1-Amino-4-(4-methylphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure
4-ClApc	1-Amino-4-(4-chlorphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure
Appc	4-Amino-1-phenylpiperidin-4-carbonsäure
2-MeAppc	4-Amino-1-(2-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure
2-iProAppc	4-Amino-1-(2-isopropoxyphenyl)piperidin-4-carbonsäure
3-MeAppc	4-Amino-1-(3-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure
3-MeOAppc	4-Amino-1-(3-methoxyphenyl)piperidin-4-carbonsäure
4-MeAppc	4-Amino-1-(4-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure
4-ClAppc	4-Amino-1-(4-chlorphenyl)piperidin-4-carbonsäure
4-PhOAppc	4-Amino-1-(4-phenoxyphenyl)piperidin-4-carbonsäure
Achc	1-Amino-4-yclohexylcyclohexan-1-carbonsäure
Adpc	1-Amino-4-diphenylcyclohexan-1-carbonsäure
Ape	1-Amino-4-phenylcyclohex-3-en-1-carbonsäure
Abc	1-Amino-4-tert-butylcyclohexan-1-carbonsäure
3-Amb	3-Aminomethylbenzoesäure
4-Amb	4-Aminomethylbenzoesäure
2-Aba	2-Aminobenzoesäure
Bu	Butyl
Penta	Pentyl
Fmoc	9-Fluorenylmethoxycarbonyl
Pmc	2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl
CH₂Cl₂	Methylenchlorid
CH₃CN	Acetonitril
DMF	Dimethylformamid
DIPEA	N,N-Diisopropylethylamin
TFA	Trifluoressigsäure
HOBT	N-Hydroxybenzotriazol
DIC	N,N'-Diisopropylcarbodiimid
BOP	Benzotriazol-1-
	yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat
PyBroP	Bromtrispyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphat
HBTU	2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-
	tetramethyluroniumhexafluorophosphat
FAB-MS	Massenspektrometrie durch Beschuss mit schnellen Atomen
ES-MS	Elektrospray-Massenspektrometrie
NBSC	2-Nitrobenzolsulfonylchlorid
DEAD	N,N-Diethylazodicarboxylat
Ph	Phenyl

Eine Darstellung der subsituierten Aminosäure in Klammern zeigt Analoga der Peptidsequenz.
Eine Derivatisierung der N-terminalen Aminogruppe wird links von der N-terminalen Substitution, abgetrennt durch einen Bindestrich, angezeigt. Das heißt, Ac-His-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ zeigt zum Beispiel ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, in der an dem N-Terminus Wasserstoff durch eine Acetylgruppe ersetzt wurde. Die Suffixe "-OH" und "-NH₂" nach dem Bindestrich oder den Klammern bezeichnen die Formen der freien Säure beziehungsweise des Amids des Polypeptids.
Der Begriff "Alkyl" betrifft gesättigte Kohlenwasserstoffe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, wenn es nicht anders definiert ist. Alkylreste können geradkettig sein, wie z. B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, n-Butyl oder n-Pentyl, oder sie können auch verzweigt sein, wie z. B. i-Propyl oder t-Butyl. Der Begriff "Nieder", z. B. in "Niederalkyl", betrifft Reste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.
Detaillierte Beschreibung der Verbindungen
In den Verbindungen der Formel I ist es allgemein bevorzugt, dass R⁶ und R⁸ beide Wasserstoff sind, n gleich 1 ist, und R⁷ entweder die erste oder die zweite der vorstehend gezeigten Unterstrukturen ist. Verbindungen der Formel IA, IB oder IC, wie nachstehend gezeigt, sind ebenfalls bevorzugt.
Verbindungen der Formel IA werden wie folgt dargestellt:
In den Verbindungen der Formel IA ist m gleich 0 oder 1. n ist gleich 0 oder 1. R¹ ist ein unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; ein mit Phenyl oder Carboxyl monosubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; unsubstituiertes Phenyl; oder mit Fluor, Chlor oder geradkettigem oder verzweigtem Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen monosubstituiertes Phenyl. R², R³ und R⁴ sind unabhängig Wasserstoff; ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; Hydroxy, ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; oder Chlor, wobei, wenn R³ Alkyl, Hydroxy, Alkoxy oder Chlor ist, R² und R⁴ beide Wasserstoff sind. R⁶ ist Wasserstoff oder Methyl. R⁷ ist
Y ist
und R⁸ ist Wasserstoff oder Methyl; oder
Y ist
R⁸ ist Wasserstoff.
In den Verbindungen der Formel IA kann R⁷ entweder eine Tryptophanseitenkette oder eine 1- oder 2-Naphthylgruppe sein. In den Verbindungen der Formel IA, in der R⁷ eine Tryptophanseitenkette, d. h.
ist, kann n entweder 0 oder 1 sein. Beispiele solcher Verbindungen, in denen n gleich 0 ist, schließen Penta-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-NH₂ und Penta-Apc-(D)Phe-Arg-N-methylTrp-NH₂ ein. In den Verbindungen der Formel IA, in der R⁷ eine Tryptophanseitenkette ist, und n gleich 1 ist, kann Y ein geradkettiger oder verzweigter Alkylrest, ausgewählt aus Methylen, Ethylen oder methylsubstituiertem Methylen, d. h.
oder eine der vorstehend gezeigten Aryl-enthaltenden Einheiten sein. In den Verbindungen der Formel IA, in der R⁷ eine Tryptophanseitenkette ist, und n gleich 1 ist, ist Y Methylen, Ethylen oder methylsubstituiertes Methylen, m kann 0 oder 1 sein. Beispiele solcher Verbindungen, in denen m gleich 1 ist, schließen Bu-Carbamoyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Bu-Carbamoyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Ala-NH₂ und Bu-Carbamoyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-β-Ala-NH₂ ein. In den Verbindungen der Formel IA, in der R⁷ eine Tryptophanseitenkette ist, n gleich 1 ist, Y Methylen, Ethylen oder methylsubstituiertes Methylen ist, und m gleich 0 ist, kann der Phenylring der Apc-Gruppe entweder unsubstituiert (d. h. R², R³ und R⁴ sind Wasserstoff) oder substituiert sein. In solchen Verbindungen, in denen der Phenylring der Apc-Gruppe unsubstituiert ist, kann R¹ zum Beispiel ein unsubstituiertes geradkettiges Alkyl, wie in den Verbindungen Penta-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Penta-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Sar-NH₂, Penta-Apc-(D)Phe-Arg-N-methylTrp-Gly-NH₂, Bu-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Ala-NH₂ oder Bu-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-β-Ala-NH₂; oder unsubstituiertes Phenyl, wie in den Verbindungen Phenylacetyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Phenylacetyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Ala-NH₂ oder Phenylacetyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Ala-NH₂, sein. In solchen Verbindungen, in denen der Phenylring der Apc-Gruppe substituiert ist, besteht ein bevorzugtes Substitutionsmuster darin, dass R³ Alkyl, Hydroxy, Alkoxy oder Chlor ist (stärker bevorzugt ist R³ Hydroxy oder Alkoxy), und R² und R⁴ Wasserstoff sind. Beispiele schließen Penta-4-ClApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Penta-4-MeApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Penta-4-HOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Penta-4-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Penta-4-EtOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ und Penta-4-iPrOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ ein. Ein anderes bevorzugtes Substitutionsmuster besteht darin, dass R² Alkoxy ist, R³ Wasserstoff ist, und R⁴ Wasserstoff ist, zum Beispiel in der Verbindung Penta-3-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂. In den Verbindungen der Formel IA, in der R⁷ eine Tryptophanseitenkette ist, und n gleich 1 ist, und Y
ist, kann m gleich 0 oder 1 sein. Beispiele solcher Verbindungen, in denen m gleich 1 ist, schließen Bu-Carbamoyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-2-Aba-NH₂ und Bu-Carbamoyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-3-Amb-NH₂ ein. Beispiele solcher Verbindungen, in denen m gleich 0 ist, schließen Bu-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-2-Aba-NH₂, Phenylacetyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-2-Aba-NH₂, Bu-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-3-Amb-NH₂, Phenylacetyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-3-Amb-NH₂, Bu-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-4-Amb-NH₂ und Phenylacetyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-4-Amb-NH₂ ein.
In den Verbindungen der Formel IA, in der R⁷ 2-Naphthyl, d. h.
ist, ist es bevorzugt, dass R², R³ und R⁴ Wasserstoff sind. Beispiele solcher Verbindungen schließen Penta-Apc-(D)Phe-Arg-N-methyl(2)Nal-NH₂ und Bu-Carbamoyl-Apc-(D)Phe-Arg(2)Nal-Gly-NH₂ ein. In den Verbindungen der Formel IA, in der R⁷ 2-Naphthyl ist, ist es bevorzugt, dass n gleich 1 ist, und m gleich 0 ist. In den Verbindungen der Formel IA, in der R⁷ 2-Naphthyl ist, n gleich 1 ist, und m gleich 0 ist, und Y Methylen, Ethylen oder methylsubstituiertes Methylen ist, kann R¹ zum Beispiel ein unsubstituiertes geradkettiges Alkyl sein. Beispiele solcher Verbindungen schließen Penta-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂, Bu-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂, Ac-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂, Penta-Apc-(D)Phe-Arg-N-methyl(2)Nal-Gly-NH₂, Bu-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Ala-NH₂ und Bu-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-β-Ala-NH₂ ein. In einer anderen Ausführungsform kann R¹ zum Beispiel unsubstituiertes Phenyl oder mit Phenyl oder Carboxyl substituiertes Alkyl sein. Beispiele solcher Verbindungen schließen Benzoyl-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂, 3-Carboxylpropanoyl-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂ und 3-Carboxylpropanoyl-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂ ein. In den Verbindungen der Formel IA, in der R⁷ 2-Naphthyl ist, ist n gleich 1, und ist m gleich 0, und ist Y
Es ist bevorzugt, dass R¹ unsubstituiertes Niederalkyl ist. Beispiele solcher Verbindungen schließen Bu-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-3-Amb-NH₂, Bu-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-2-Aba-NH₂ und Bu-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-4-Amb-NH₂ ein.
Die Verbindungen der Formel IB werden wie folgt dargestellt:
In der Verbindung der Formel IB, ist R¹ ein unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen. R⁷ ist
R¹¹ ist Cyclohexyl oder ein verzweigtes Alkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen. Y ist Methylen, d. h. -CH₂-. Beispiele der Verbindungen der Formel IB schließen Penta-Abc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ und Penta-Achc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ ein.
Die Verbindungen der Formel IC werden wie folgt dargestellt:
In der Verbindung der Formel IC ist R¹ ein unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen. R⁷ ist
Y ist

R⁹ ist Wasserstoff, ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Fluor, Chlor oder unsubstituiertes Phenoxy.
Beispiele der Verbindungen der Formel IC, in der R⁹ Wasserstoff ist, schließen Penta-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ und Penta-Appc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂ ein. Beispiele der Verbindungen der Formel IC, in der R⁹ ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, schließen Penta-2-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Penta-2-iPrAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Penta-3-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ und Penta-4-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ ein. Beispiele der Verbindungen der Formel IC, in der R⁹ ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder unsubstituiertes Phenoxy ist, schließen Penta-3-MeOAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ und Penta-4-PhOAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ ein. Beispiele der Verbindungen der Formel IC, in der R⁹ Chlor ist, schließen Penta-4-ClAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ ein.
In der Verbindung der Formel II ist es allgemein bevorzugt, dass R⁶ und R⁸ Wasserstoff sind. R⁷ kann zum Beispiel eine Tryptophanseitenkette, d. h.
oder 2-Naphthyl sein. Wenn R⁷ eine Tryptophanseitenkette ist, ist es allgemein bevorzugt, dass n gleich 1 ist. In den Verbindungen der Formel II, in der R⁶ und R⁸ Wasserstoff sind; R⁷ eine Tryptophanseitenkette ist, und n gleich 1 ist, sind Verbindungen, in denen Y -CH₂- ist, und m gleich 0 ist, eingeschlossen. Beispiele solcher Verbindungen, in denen R¹⁰ Wasserstoff oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, schließen Bu-Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Penta-5-Me-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Penta-5-Et-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ und Penta-5-iPr-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ ein. Beispiele solcher Verbindungen, in denen R¹⁰ Halogen ist, schließen Penta-5-Br- (D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Penta-5-Br-Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ und Penta-5-Cl-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ ein. Beispiele solcher Verbindungen, in denen R¹⁰ geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, schließen Penta-5-MeO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Penta-5-EtO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ und Penta-5-iPrO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ ein. Beispiele solcher Verbindungen, in denen R¹⁰-NR¹²R¹³ ist, wobei R¹² und R¹³ jeweils Methyl sind, schließen Penta-5-DmaAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ ein.
In den Verbindungen der Formel II, in der R⁶ und R⁸ Wasserstoff sind; R⁷ eine Tryptophanseitenkette ist, und n gleich 1 ist, sind Verbindungen, in denen Y
ist, und R¹⁰ Halogen ist, eingeschlossen. Beispiele solcher Verbindungen schließen Bu-(D,L)-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-Trp-2-Aba-NH₂, Bu-Carbamoyl-(D,L)-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-Trp-2-Aba-NH₂ und Phenylacetyl-(D,L)-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-Trp-2-Aba-NH₂ ein.
In den Verbindungen der Formel II, in der R⁶ und R⁸ Wasserstoff sind; R⁷ 2-Naphthyl, d. h.
ist, ist es allgemein bevorzugt, dass R¹⁰ Halogen ist. Beispiele solcher Verbindungen schließen Penta-(D,L)-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂, 3-Carboxylpropanoyl-(D,L)-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂, Phenylacetyl-(D,L)-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂ und Bu-(D,L)-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-2-Aba-NH₂ ein.
Beispiele der Verbindungen der Formel III schließen Bu-Apc-(D)Phe-phenylhomoArg-Trp-Gly-NH₂, Penta-Apc-(D)Phe-Cit-Trp-Gly-NH₂, Penta-Adpc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ und Penta-Ape-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ ein.
Bevorzugte Verbindungen, wie vorstehend beschrieben, sind die in den Beispielen einzeln beschriebenen.
Besonders bevorzugte Verbindungen, wie vorstehend beschrieben, sind die, ausgewählt aus
Penta-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂,
Penta-4-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂,
Penta-4-EtOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂,
Bu-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-β-Ala-NH₂,
Penta-Apc-(D)Phe-Cit-Trp-Gly-NH₂,
Penta-Abc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂,
Penta-Achc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂,
Penta-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂,
Penta-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ und
Penta-4-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂.
Die Verbindungen, wie vorstehend beschrieben, sind zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, die mit dem Melanocortin-4-Rezeptor im Zusammenhang stehen, wie Fettsucht, verwendbar. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel, umfassend eine Verbindung, wie vorstehend beschrieben, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Hilfsstoff. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verbindungen, wie vorstehend beschrieben, zur Verwendung als therapeutische Wirkstoffe, besonders als therapeutische Wirksstoffe zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, die mit dem Melanocortin-4-Rezeptor im Zusammenhang stehen, wie Fettsucht. Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, die mit dem Melanocortin-4-Rezeptor im Zusammenhang stehen, wie Fettsucht, wobei das Verfahren das Verabreichen einer Verbindung, wie vorstehend definiert, an einen Menschen oder ein Tier umfasst. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Verbindungen, wie vorstehend beschrieben, zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, die mit dem Melanocortin-4-Rezeptor im Zusammenhang stehen, wie Fettsucht. Die Verwendung der Verbindungen, wie vorstehend definiert, zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, die mit dem Melanocortin-4-Rezeptor im Zusammenhang stehen, wie Fettsucht, ist eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Solche Medikamente umfassen eine Verbindung, wie vorstehend beschrieben.
Chemische Synthese
Die Verbindungen dieser Erfindung können durch ein beliebiges bekanntes herkömmliches Verfahren zur Bildung einer Peptidbindung zwischen Aminosäuren leicht hergestellt werden. Solche herkömmlichen Verfahren schließen zum Beispiel ein beliebiges Lösungsphasenverfahren ein, das eine Kondensation zwischen der freien α-Aminogruppe einer Aminosäure oder eines Restes davon, deren/dessen Carboxylgruppe oder andere reaktive Gruppen geschützt sind, und der freien primären Carboxylgruppe einer anderen Aminosäure oder eines Restes davon, deren/dessen Aminogruppe oder andere reaktive Gruppen geschützt sind, ermöglicht.
Die Synthese dieser Verbindungen kann durch ein Verfahren, wobei jede Aminosäure in der gewünschten Sequenz einzeln nach einer anderen Aminoäure oder einem Rest davon zugegeben wird, oder durch ein Verfahren, wobei Peptidfragmente mit der gewünschten Aminosäuresequenz zuerst auf herkömmliche Weise hergestellt und dann kondensiert werden, wobei das gewünschte Peptid bereitgestellt wird, durchgeführt werden.
Solche herkömmlichen Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen der vorliegenden Erfindung schließen zum Beispiel ein beliebiges Verfahren der Festphasenpeptidsynthese ein. In einem solchen Verfahren kann die Synthese der neuen Verbindungen durchgeführt werden, indem die gewünschten Aminosäurereste gemäß den allgemeinen Prinzipien der Festphasenverfahren [Merrifield, R. B., J. Amer. Chem. Soc. 1963, 85, 2149–2154; Barany et al., The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, Bd. 2, Gross, E., und Meienhofer, J., Hrsg., Academic Press 1–284 (1980)] einzeln nacheinander in die wachsende Peptidkette eingebaut werden.
In chemischen Peptidsynthesen ist der Schutz von reaktiven Seitenkettengruppen der verschiedenen Aminosäureeinheiten mit geeigneten Schutzgruppen, der das Auftreten einer chemischen Reaktion an dieser Stelle verhindert, bis die Schutzgruppe endgültig entfernt ist, üblich. In der Regel ist auch der Schutz der α-Aminogruppe einer Aminoäure oder eines Fragments üblich, während diese Einheit an der Carboxylgruppe reagiert, gefolgt von der selektiven Entfernung der α-Aminoschutzgruppe und dem Stattfindenlassen einer anschließenden Reaktion an dieser Stelle. Während nachstehend spezifische Schutzgruppen hinsichtlich des Verfahrens der Festphasensynthese erwähnt werden, sollte angemerkt werden, dass jede Aminosäure durch eine beliebige Schutzgruppe, die herkömmlicherweise für die jeweilige Aminosäure in der Lösungsphasensynthese verwendet wird, geschützt werden kann.
α-Aminogruppen können zum Beispiel mit einer geeigneten Schutzgruppe, ausgewählt aus Schutzgruppen vom Typ des aromatischen Urethans, wie Benzyloxycarbonyl (Z) und substituiertes Benzyloxycarbonyl, wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, p-Biphenylisopropoxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) und p-Methoxybenzyloxycarbonyl (Moz); Schutzgruppen vom Typ des aliphatischen Urethans, wie t-Butyloxycarbonyl (Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl und Allyloxycarbonyl, geschützt werden. Hier ist Fmoc die für den α-Aminoschutz am meisten bevorzugte.
Guanidinogruppen können mit einer geeigneten Schutzgruppe, ausgewählt aus Nitro, p-Toluolsulfonyl (Tos), Z, Pentamethylchromansulfonyl (Pmc), Adamantyloxycarbonyl und Boc, geschützt werden. Pmc ist die für Arginin (Arg) am meisten bevorzugte.
In den Beispielen wurden alle Lösungsmittel, Isopropanol (iPrOH), Methylenchlorid (CH₂Cl₂), Dimethylformamid (DMF) und N-Methylpyrrolidinon (NMP), von Fisher oder Burdick und Jackson käuflich erworben und wurden ohne zusätzliche Destillation verwendet. Trifluoressigsäure wurde von Halocarbon oder Fluka käuflich erworben und ohne weitere Reinigung verwendet. Diisopropylcarbodiimid (DIC) und Diisopropylethylamin (DIPEA) wurden von Fluka oder Aldrich käuflich erworben und ohne weitere Reinigung verwendet. Hydroxybenzotriazol (HOBT), Dimethylsulfid (DMS) und 1,2-Ethandithiol (EDT) wurden von Sigma Chemical Co. käuflich erworben und ohne weitere Reinigung verwendet. Die geschützten Aminosäuren wiesen im Allgemeinen die L-Konfiguration auf und wurden von Bachem, Advanced ChemTech oder Neosystem im Handel erhalten. Die Reinheit dieser Reagenzien wurde vor der Verwendung durch Dünnschichtchromatographie, NMR und den Schmelzpunkt bestätigt. Benzhydrylaminharz (BHA) war ein Copolymer aus Styrol – 1% Divinylbenzol (Siebgröße 100 bis 200 oder 200 bis 400), das von Bachem oder Advanced Chemtech. erhalten wurde. Der Gesamtstickstoffgehalt dieser Harze betrug im Allgemeinen zwischen 0,3 und 1,2 mÄq./g.
Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde auf einem LDC-Apparat, bestehend aus den Pumpen Constametric I und II, einem Lösungsmittelprogrammierer und -mischer Gradient Master und einem variablen UV-Wellenlängendetektor Spectromonitor III, durchgeführt. Die analytische HPLC wurde im Umkehrphasenmodus unter Verwendung von Vydac-C₁₈-Säulen (0,4 × 30 cm) durchgeführt. Die Trennungen durch präparative HPLC wurden auf Vydac-Säulen (2 × 25 cm) durchgeführt.
Die Peptide wurden unter Verwendung einer Festphasensynthese nach den Prinzipien und dem allgemeinen Verfahren, die von Merrifield [J. Amer. Chem. Soc., 1963, 85, 2149] beschrieben wurden, hergestellt, obwohl, wie zuvor erwähnt, eine andere äquivalente chemische Synthese, die in dem Fachgebiet bekannt ist, verwendet werden kann. Die Festphasensynthese wird an dem C-terminalen Ende des Peptids durch Kopplung einer geschützten α-Aminosäure an ein geeignetes Harz begonnen. Ein solches Ausgangsmaterial kann durch Bindung einer α-aminogeschützten Aminosäure durch eine Esterbindung an ein p-Benzyloxybenzylalkohol-(Wang)-Harz oder durch eine Amidbindung zwischen einem Fmoc-Linker, wie p-[(R,S)-α-{1-(9H-fluoren-9-yl)methoxyformamido]-2,4-dimethyloxybenzyl]phenoxyessigsäure (Rink-Linker), und einem Benzhydrylamin-(BHA)-Harz hergestellt werden. Die Herstellung des Hydroxymethylharzes ist in dem Fachgebiet allgemein bekannt. Fmoc-Linker-BHA-Harzträger sind im Handel erhältlich und werden allgemein verwendet, wenn das hergestellte gewünschte Peptid ein unsubstituiertes Amid an dem C-Terminus aufweist.
Im Allgemeinen werden die Aminosäuren oder Mimetika unter Verwendung der Fmoc-geschützten Form der Aminosäure oder des Mimetikums mit 2 bis 5 Äquivalenten der Aminosäure und einem geeigneten Kopplungsreagenz an das Fmoc-Linker-BHA-Harz gekoppelt. Nach den Kopplungen kann das Harz gewaschen und unter Vakuum getrocknet werden. Die Beladung des Harzes mit der Aminosäure kann durch Aminosäureanalyse eines Aliquots des Fmoc-Aminosäureharzes oder durch Bestimmung der Fmoc-Gruppen durch UV-Analyse bestimmt werden. Beliebige nichtumgesetzte Aminogruppen können durch Umsetzung des Harzes mit Essigsäureanhydrid und Diisopropylethylamin in Methylenchlorid geschützt werden.
Die Harze werden durch mehrere repetitive Zyklen geleitet, um die Aminosäuren nacheinander zuzugeben. Die α-Amino-Fmoc-Schutzgruppen werden unter basischen Bedingungen entfernt. Piperidin, Piperazin oder Morpholin (20 bis 40% Vol./Vol.) in DMF kann für diesen Zweck verwendet werden. 40% Piperidin in DMF wird bevorzugt verwendet.
Nach der Entfernung der α-Aminoschutzgruppe werden die nachfolgenden geschützten Aminosäuren in der gewünschten Reihenfolge schrittweise gekoppelt, wobei eine Zwischenverbindung, geschütztes Peptidharz, erhalten wird. Die zur Kopplung der Aminosäuren in der Festphasensynthese der Peptide verwendeten Aktivierungsreagenzien sind in dem Fachgebiet allgemein bekannt. Für solche Synthesen geeignete Reagenzien sind zum Beispiel Benzotriazol-1-yloxytri(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat (BOP), Bromtris-pyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphat (PyBroP), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylcarbodiimid (DIC).
HBTU und DIC sind hier bevorzugt. Andere Aktivierungsmittel, wie von Barany und Merrifield [The Peptides, Bd. 2, J. Meienhofer, Hrsg., Academic Press, 1979, S. 1–284] beschrieben, können verwendet werden. Verschiedene Reagenzien, wie 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT), N-Hydroxysuccinimid (HOSu) und 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin (HOOBT), können zu den Kopplungsgemischen gegeben werden, um die Synthesezyklen zu optimieren. HOBT ist hier bevorzugt.

Die Vorschrift für einen typischen Synthesezyklus ist wie folgt: Vorschrift 1

Schritt	Reagenz	Zeit
1	DMF	2 × 30 sec
2	40% Piperidin/DMF	1 min
3	40% Piperidin/DMF	15 min
4	DMF	2 × 30 sec
5	iPrOH	2 × 30 sec
6	DMF	3 × 30 sec
7	Kopplung	60 min–18 Stunden
8	DMF	2 × 30 sec
9	iPrOH	1 × 30 sec
10	DMF	1 × 30 sec
11	CH₂Cl₂	2 × 30 see

Die Lösungsmittel für alle Waschlösungen und Kopplungen wurden auf Volumina von 10 bis 20 ml/g Harz bemessen. Die Kopplungsreaktionen während der Synthese wurden durch den Ninhydrintest nach Kaiser überwacht, um den Vollendungsgrad zu bestimmen [Kaiser et al., Anal. Biochem. 1970, 34, 595–598]. Eine langsame Reaktionskinetik wurde hinsichtlich Fmoc-Arg (Pmc) und hinsichtlich Kopplungen von sterisch gehinderten Säuren an sekundäre Amine beobachtet. Beliebige unvollständige Kopplungsreaktionen wurden entweder mit frisch hergestellter aktivierter Aminosäure erneut durchgeführt oder durch Behandlung des Peptidharzes mit Essigsäureanhydrid, wie vorstehend beschrieben, beendet. Die vollständig aufgebauten Peptidharze wurden mehrere Stunden im Vakuum getrocknet.
Von jeder Verbindung wurden die Blockierungsgruppen entfernt, und das Peptid wurde durch das folgende Verfahren von dem Harz abgespalten. Im Allgemeinen wurden die Peptidharze bei Raumtemperatur 120 min mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 300 μl Anisol und 9,5 ml Trifluoressigsäure pro Gramm Harz behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert. Die Rohprodukte wurden unter Vakuum getrocknet.
Reinigung der rohen Peptidzubereitungen
Die Reinigung der Rohpeptide wurde durch präparative HPLC durchgeführt. Die Peptide wurden in einem minimalen Volumen von entweder AcOH/H₂O oder 0,1% TFA/H₂O auf die Säulen aufgetragen. Die Gradientenelution wurde im Allgemeinen mit 10% Puffer B begonnen, 10% bis 60% B in 90 Minuten (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) mit einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min. Der UV-Nachweis wurde bei 280 nm durchgeführt. Fraktionen wurden in Intervallen von 1,0 bis 2,5 Minuten aufgenommen und durch analytische HPLC untersucht. Fraktionen, die als hochrein beurteilt wurden, wurden vereinigt und lyophilisiert.
Die Reinheit der Endprodukte wurde durch analytische HPLC auf einer Umkehrphasensäule, wie vorstehend angegeben, überprüft. Die Reinheit aller Produkte wurde als ungefähr 95 bis 99% beurteilt. Alle Endprodukte wurden auch einer Massenspektrometrie durch Beschuss mit schnellen Atomen (FAB-MS) oder einer Elektrospray-Massenspektrometrie (ES-MS) unterzogen. Alle Produkte ergaben die erwarteten Ausgangsionen M+H innerhalb annehmbarer Grenzen.
Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren können die Verbindungen dieser Erfindung gemäß den folgenden Reaktionsschemata hergestellt werden. Schema A
Schema B
Schema C
Schema D
Schema E
Schema F
Schema G
Schema H
Schema H (Fortsetzung)
Schema I
Schema J
Schema K
R², R³ und R⁴ sind wie zuvor beschrieben. Schema L
R¹⁰ ist wie zuvor beschrieben. Schema M
R¹⁰ ist wie zuvor beschrieben. Schema N
R² ist wie zuvor beschrieben.
Die synthetischen Peptide der gegenwärtigen Erfindung werden unter Verwendung eines herkömmlichen Verfahrens der Festphasenpeptidsynthese, die in dem vorhergehenden Abschnitt diskutiert wurde, hergestellt. Jeder Zyklus besteht aus zwei Verfahren, der anfänglichen Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe von dem endständigen Stickstoff in der harzgebundenen Kette, gefolgt von der Acylierung der Aminfunktion mit einer Fmoc-geschützten Aminosäure. Der Zyklus wird im Allgemeinen gemäß den schrittweisen Verfahren, die in der Vorschrift 1 dargestellt sind, durchgeführt. Die Entfernung der Schutzgruppe erfolgt unter Verwendung einer organischen Base, zum Beispiel Piperazin, Morpholin oder Piperidin, bevorzugt Piperidin, in einem geeigneten inerten Lösungsmittel, zum Beispiel N,N-Dimethylformamid (DMF) oder N-Methylpyrrolidon (NMP). Die Kopplungsreaktion kann unter einer der vielen Bedingungen, die für die Bildung der Amidbindung entwickelt wurden, zum Beispiel O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) in Gegenwart einer organischen Base, zum Beispiel Diisopropylethylamin (DIPEA), in einem inerten Lösungsmittel, zum Beispiel DMF, durchgeführt werden. In einer anderen Ausführungsform kann in dem vorliegenden Fall die Amidgruppe unter Verwendung eines Carbodiimids, zum Beispiel Diisopropylcarbodimid (DIC), zusammen mit einem Aktivierungmittel, wie 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT), in einem geeigneten inerten Lösungsmittel, wie DMF, gebildet werden.
In Schema A wird in dem ersten Zyklus von dem durch die Struktur 1 dargestellten Fmoc-Linker-BHA-Harz die Schutzgruppe entfernt, und es wird mit Fmoc-Aminosäuren der Struktur 2 kondensiert, wobei sich die harzgebundenen Verbindungen der Struktur 3 ergeben. Ein zweiter Zyklus baut die Fmoc-Aminosäuren 4 ein, wobei sich die Verbindungen der Struktur 5 (n = 1) ergeben. Die Verbindungen der Struktur 5, in der n = 0, werden durch Eliminierung des ersten Zyklus und durch Kopplung der Fmoc-Aminosäuren der Struktur 4 direkt an das Fmoc-Linker-BHA-Harz, von dem die Schutzgruppe entfernt wurde, hergestellt. In dem dritten Zyklus liefert die Behandlung des harzgebundenen Peptids die Zwischenverbindungen der Struktur 6a, wobei R⁶ Wasserstoff darstellt. Die Zwischenverbindungen der Struktur 6b, wobei R⁶ Methyl darstellt, werden, wie in Schema C gezeigt, hergestellt. Die Verbindungen der Struktur 6a, die durch Behandlung der Verbindungen der Struktur 5, wie in den Schritten 1 bis 5 der Vorschrift 1 vorgeschrieben, hergestellt wurden, werden mit einem Arylsulfonylchlorid, bevorzugt 2-Nitrobenzolsulfonylchlorid, umgesetzt. Die Reaktion wird in Gegenwart eines Protonenakzeptors, zum Beispiel Pyridin, Triethylamin (TEA) oder DIPEA, bevorzugt DIPEA, in einem geeigneten inerten Lösungsmittel, bevorzugt DMF, durchgeführt. Die N-Methylierung der gebildeten Sulfonamidgruppe in den gewaschenen, harzgebundenen Verbindungen der Struktur 19 erfolgte unter Mitsunobu-Bedingungen. Somit werden die Sulfonamide der Struktur 19 mit Methanol in Gegenwart von Diethylazodicarboxylat (DEAD) und Triphenylphosphin unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel umgesetzt. Nachdem die Reaktion beendet ist, wird das harzgebundene N-Methylsulfonamid der Struktur 20 von verbliebenen Reagenzien und Nebenprodukten freigewaschen. Der 2-Nitrobenzolsulfonylrest wird durch Umsetzung von 20 mit 2-Mercaptoethanol und der starken organischen Base 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) in einem geeigneten Lösungsmittel, bevorzugt DMF, entfernt, wobei sich die harzgebundene Zwischenverbindung der Struktur 6b ergibt. Der dritte Zyklus wird durch Kopplung der Verbindungen der beiden Strukturen 6a und 6b mit Fmoc-Arg(Pmc)-OH (7) beendet, wobei sich die harzgebundenen Verbindungen der Struktur 8 ergeben. Zwei zusätzliche Zyklen (Schema B) werden mit den Peptiden der Struktur 8 durchgeführt, wobei die Aminosäure Fmoc-(D)-Phe-OH (9), gefolgt von einem der beiden Aminosäurederivate der Struktur 10 oder 11 nacheinander in das harzgebundene Peptid eingebaut werden, wobei sich die harzgebundenen Polypeptide der Strukturen 12 und 13 ergeben.
Die Entfernung des Fmoc aus den harzgebundenen Polypeptiden 12 wird durch Behandlung von 12 mit Piperidin in DMF durchgeführt, wobei sich unter Verwendung der Reaktionsbedingungen, die in den Schritten 1 bis 5 der Vorschrift 1 dargestellt wurden, die Verbindungen der Struktur 14 ergeben. Das Polypeptid wird dann durch die Reaktion mit einem Acylierungsmittel, wobei die harzgebundenen Amide der Struktur 15 gebildet werden, oder durch die Reaktion mit einem Isocyanat, wobei die Harnstoffe der Struktur 16 gebildet werden, N-geschützt (Schema D). Die Acylierung wird durch eine Vielzahl von Verfahren, die einem Fachmann allgemein bekannt sind, durchgeführt. Unter den verwendeten Verfahren sind:

(i) Reaktion der Verbindungen der Struktur 14 mit einer Carbonsäure R¹-CO₂H in einem geeigneten Lösungsmittel, wie DMF, in Gegenwart von HBTU und einer organischen Base, bevorzugt DIPEA, und
(ii) Reaktion der Verbindungen der Struktur 14 mit einem Carbonsäurechlorid R¹-COCl in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dichlormethan, in Gegenwart einer organischen Base, wie Pyridin, TEA und DIPEA, bevorzugt DIPEA, und
(iii) Reaktion der Verbindungen der Struktur 14 mit einem Carbonsäureanhydrid (R¹-CO₂CO-R¹) in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dichlormethan oder DMF, in Gegenwart einer organischen Base, bevorzugt DIPEA.

Die Reaktion der Verbindungen der Struktur 14 mit einem Isocyanat R¹-NCO wird in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dichlormethan oder DMF, in Gegenwart einer organischen Base, bevorzugt DIPEA, durchgeführt.
Wenn die Acylierungs- und Harnstoffbildungsreaktionen beendet sind, werden die harzgebundenen Produkte 15 und 16 von verbliebenen Reagenzien und Nebenprodukten freigewaschen. Unter Verwendung derselben Bedingungen werden die harzgebundenen Polypeptide der Struktur 13 in die N-acylierten Verbindungen der Struktur 17 und die Harnstoffe der Struktur 18 umgewandelt (Schema E). In Schema F wird die Sequenzierung wie in Schema A durchgeführt, außer dass Fmoc-Glu(allyl)-OH 21 anstelle von Fmoc-Arg(Pmc)-OH (7) in das harzgebundene Polypeptid eingebaut wird, wobei sich die harzgebundenen, N-geschützten Polypeptide der Struktur 22 ergeben. Die Allylgruppe wird durch Behandlung von 22 mit Tributylzinnhydrid, Palladiumchlorid und Triphenylphosphin in einem inerten Lösungsmittel, zum Beispiel DMF, entfernt, wobei sich das harzgebundene Polypeptid der Struktur 23 ergibt. Die Kopplung von 23 mit Boc-Guanidin ergab acylguanidinharzgebundene Verbindungen der Struktur 24. Die Reaktion kann unter Verwendung von Standardreaktionsverfahren der Amidbildung, zum Beispiel in Gegenwart von HBTU und einer organischen Base, bevorzugt DIPEA, in einem geeigneten Lösungsmittel, wie DMF, durchgeführt werden.
In Schema G wird die Sequenzierung wie in Schema A durchgeführt, außer dass entweder Fmoc-PhenylhomoArg-OH 25 oder Fmoc-Citrullin 26 anstelle von Fmoc-Arg(Pmc)-OH (7) in das harzgebundene Polypeptid eingebaut wird, wobei sich die harzgebundenen, N-geschützten Polypeptide der Struktur 27 beziehungsweise 28 ergeben.
Wie in Schema H gezeigt, wird die Abspaltung der verbliebenen Schutzgruppen in den N-geschützten Polypeptiden 15-18, 24, 27 und 28 und die gleichzeitige Abspaltung der Peptide von dem festen Träger unter Verwendung einer starken organischen Säure, bevorzugt Trifluoressigsäure, gegebenenfalls in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels, wie Dichlormethan, und einer Spur (1%) Wasser durchgeführt. Die Reaktion wird geeigneterweise mit oder ohne Vorhandensein eines oder mehrerer Carbokationenfänger, zum Beispiel Ethandithiol, Dimethylsulfid, Triethylsilan und Anisol, durchgeführt. Der feste Träger wird von der Polypeptidspaltungslösung abfiltriert, und dann wird sie mit einem geeigneten Lösungsmittel, bevorzugt Diethylether, verdünnt. Die festen Polypeptide der Strukturen 29-35, die auf diese Art und Weise hergestellt wurden, werden durch Umkehrphasenchromatographie über eine präparative C₁₈-Säule gereinigt. Falls geeignet, werden in den Fällen, in denen eine racemische Fmoc-Aminosäure 11 in das Polypeptid sequenziert wird, die einzelnen Stereoisomere während des Reinigungsverfahrens getrennt. Die Fmoc-Aminosäuren 2, 4, 7, 9, 21, 25 und 26 sowie die Acylierungsmittel und Isocyanate, die zum N-Schutz der Polypeptide verwendet wurden, sind bekannte Verbindungen, die im Handel erhältlich sind.
Die Fmoc-Aminosäuren 10 und 11 werden, wie hier beschrieben, durch Verfahren, die Durchschnittsfachleuten in der Anwendung der organischen Chemie allgemein bekannt sind, hergestellt. In Schema I wird die Herstellung der Fmoc-Aminosäuren aus cyclischen Ketonen dargestellt. Die 4-Phenylcyclohexanone der Formel 36 werden durch Behandlung mit Ammoniumcarbonat und Kaliumcyanid in die Hydantoine der Formel 37 umgewandelt. Die Reaktion wird geeigneterweise in einem wässrigen Ethanolgemisch bei einer Temperatur von 50°C bis 90°C, bevorzugt zwischen 80°C und 90°C, durchgeführt. Die direkte Hydrolyse der Hydantoine zu den Aminosäuren der Struktur 38 erfordert eine längere Behandlung mit einer starken Base, zum Beispiel mit 6 N Natriumhydroxidlösung oder mit Bariumhydroxid, bei Rückflusstemperatur. In einer anderen Ausführungsform können die Verbindungen der Struktur 37 in die Bis-Boc-Derivate der Struktur 39 umgewandelt werden. Die Reaktion wird unter Verwendung von tert-Butyldicarbonat [(BOC)₂O] in einem inerten Lösungsmittel, bevorzugt Tetrahydrofuran (THF), in Gegenwart einer organischen Aminbase, bevorzugt TEA, und eines Katalysators, 4-Dimethylaminopyridin (DMAP), bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur, bevorzugt bei Raumtemperatur, durchgeführt. Die Bis-Boc-Hydantoine der Struktur 39 werden leicht in die Aminosäuren der Struktur 38 umgewandelt. Die Reaktion erfolgt unter Verwendung von 1 N Natriumhydroxid in einem inerten Lösungsmittel, bevorzugt Dimethoxyethan (DME), bei 0 bis 50°C, bevorzugt bei etwa Raumtemperatur. Der Schutz der Aminofunktionalität mit einer Fmoc-Gruppe in einer Verbindung der Struktur 38 wird unter einer Vielzahl von Reaktionsbedingungen durchgeführt, wobei sich 40 ergibt. Die Reaktion kann geeigneterweise durch Behandlung einer Lösung der Aminosäure 38 in einem Gemisch aus THF oder Dioxan, bevorzugt Dioxan, und wässrigem Natriumcarbonat mit 9-Fluorenylmethoxychlorformiat (FmocCl) bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur, bevorzugt bei Raumtemperatur, durchgeführt werden. In einer anderen Ausführungsform wird N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyloxy)succinimid (FmocOSu) zu einer Lösung der Aminosäure 38 in wässrigem Acetonitril, das eine organische, tertiäre Aminbase, bevorzugt TEA, enthält, gegeben. Die Reaktion wird bei 0°C bis Raumtemperatur, bevorzugt bei Raumtemperatur, durchgeführt. In einer anderen Variante des Verfahrens wird bei der Umwandlung von 39 in 38 DME aus dem Hydrolysegemisch abgedampft, und das Reaktionsgemisch wird auf einen pH-Wert von ~11 eingestellt. Die so erhaltene Lösung des Natriumsalzes von 38 wird dann bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur, bevorzugt bei Raumtemperatur, in situ mit FmocOSu oder FmocCl in Dioxan behandelt.
Die Tetralone 41, die N-Aryl-4-ketopiperidine 42 und die Cyclohexanonderivate 43 und 44 werden auf dieselbe Art und Weise in die entsprechenden Fmoc-Aminosäuren der Strukturen 11 und 45-47 umgewandelt.
Die Verbindungen der Struktur 40, wobei R³ ein geradkettiges oder verzweigtes Niederalkoxy darstellt, und R² und R⁴ Wasserstoff sind, wie in der Untergattungsstruktur 49, können durch O-Alkylierung der Verbindung der Struktur 48 hergestellt werden (Schema J). Wenn R¹⁶ eine unverzweigte Niederalkyleinheit darstellt, wird die Alkylierung unter Verwendung eines primären Alkylhalogenids der Struktur R¹⁶X in Gegenwart eines Alkalimetallcarbonats, zum Beispiel Natrium- oder Kaliumcarbonat, durchgeführt. Das Alkylhalogenid kann ein Chlor-, Brom- oder Iodderivat, bevorzugt ein Alkyliodid (X = I), sein. Die Reaktion kann geeigneterweise in einem inerten Lösungsmittel, das S_N2-Verdrängungsreaktionen fördert, zum Beispiel Aceton, 2-Butanon oder N,N-Dimethylformamid, bevorzugt Aceton, bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis zur Rückflusstemperatur der Lösung, bevorzugt der Rückflusstemperatur, durchgeführt werden. Wenn R¹⁶ einen verzweigten Niederalkylrest, z. B. 2-Propyl, darstellt, wird die Alkylierung unter Verwendung eines sekundären Alkylhalogenids der Struktur R¹⁶X in Gegenwart eines Alkalimetallcarbonats, zum Beispiel Kaliumcarbonat, durchgeführt. Das sekundäre Alkylhalogenid ist bevorzugt ein sekundäres Alkyliodid, zum Beispiel 2-Iodpropan (X = I). Die Reaktion kann geeigneterweise in einem inerten Lösungsmittel, bevorzugt N,N-Dimethylformamid, bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis zur Rückflusstemperatur der Lösung, bevorzugt bei etwa 100°C, durchgeführt werden.
Die Verbindungen der Struktur 40 können durch Verfahren, die einem Durchschnittsfachmann in der Anwendung der organischen Chemie allgemein bekannt sind, hergestellt werden. Wie in Schema K dargestellt, führt die Behandlung der Arylhalogenide der Struktur 50 (X' stellt Brom oder Iod dar) mit einem Alkylmetallreagenz, bevorzugt t-Butyllithium, zu einer Transmetallierungsreaktion, wobei sich das entsprechende Aryllithium der Struktur 51 ergibt. Die Reaktion wird geeigneterweise bei –78°C durch die Zugabe einer Lösung des Alkyllithiums zu einer Lösung der Verbindungen der Struktur 50 in einem inerten, wasserfreien Lösungsmittel, wie Diethylether oder Tetrahydrofuran, bevorzugt Tetrahydrofuran, durchgeführt. Das Aryllithium der Struktur 51 wird dann in situ mit einer Lösung des Monoketals von Cyclohexan-1,4-dion (52) in einem geeigneten inerten Lösungsmittel, zum Beispiel Tetrahydrofuran, umgesetzt, während die Reaktionstemperatur unter –60°C, bevorzugt bei etwa –78°C, gehalten wird, wobei sich die Carbinole der Struktur 53 ergeben. Die Verbindungen der Struktur 54 werden durch Dehydratisierung der Carbinole der Struktur 53 erhalten. Die Reaktion wird geeigneterweise unter Verwendung eines Katalysators aus einer starken organischen Säure, bevorzugt p-Toluolsulfonsäure, in einem inerten Lösungsmittel, zum Beispiel Benzol oder Toluol, bevorzugt Benzol, bei der Rückflusstemperatur des Lösungsmittels durchgeführt. Das gebildete Wasser wird mittels eines Dean-Stark-Apparates aus dem Reaktionsgemisch entfernt, um eine Beendigung der Reaktion zu ermöglichen. Die Verbindungen der Struktur 55 werden durch Hydrierung der Olefine der Struktur 54 hergestellt. Die Reaktion wird geeigneterweise unter Verwendung eines Edelmetallkatalysators, zum Beispiel Palladium auf Kohle, in einer Wasserstoffatmosphäre in einem inerten Lösungsmittel, zum Beispiel Ethanol oder Ethylacetat, durchgeführt. Die Hydrierung wird in der Regel bei Raumtemperatur und Wasserstoff mit 40 psi durchgeführt, jedoch, wenn der Arylring in der Struktur 54 eine Gruppe enthält, die für eine Hydrogenolyse anfällig ist, z. B. wenn R², R³ oder R⁴ Chlor darstellt, wird der Reaktionsdruck bei etwa 5 psi gehalten. Die Verbindungen der Struktur 55 können auch direkt aus Carbinolen der Struktur 53 durch reduktive Eliminierung der Hydroxylgruppe erhalten werden. In dieser Reaktion wird eine Lösung der Verbindung der Struktur 53 (R² = R³ =H und R⁴ = OMe) in einem inerten Lösungsmittel, zum Beispiel Dichlormethan, mit einer Lewis-Säure, wie Bortrifluoridetherat, und einem Reduktionsmittel, zum Beispiel Triethylsilan, bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur, bevorzugt bei Raumtemperatur, behandelt. Die Entfernung der Ketalschutzgruppe in den Verbindungen der Struktur 55 ergibt das Keton der Formel 40. Die Reaktion wird geeigneterweise in Aceton oder 2-Butanon, bevorzugt Aceton, unter Säurekatalyse, zum Beispiel 4 N Salzsäure oder p-Toluolsulfonsäure, bei Raumtemperatur bis zur Rückflusstemperatur des Reaktionsgemisches, bevorzugt bei der Rückflusstemperatur, durchgeführt.
Die 5-substituierten β-Tetralone der Struktur 41 sind allgemein bekannte Verbindungen oder, falls sie nicht bekannt sind, können sie durch Verfahren, die einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der organischen Chemie allgemein bekannt sind, hergestellt werden. In dem vorliegenden Fall werden die Verbindungen der Struktur 41 durch zwei Verfahren, die in den Schemata L und M dargestellt sind, hergestellt.
Wie in Schema L gezeigt, wird eine 2-substituierte Hydrozimtsäure der Struktur 56 (R¹⁰ = Brom, Chlor oder ein geradkettiger oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen) in das entsprechende Carbonsäurechlorid der Struktur 57 umgewandelt. Diese Umwandlung kann durch mehrere Verfahren, zum Beispiel durch Behandlung der Hydrozimtsäure mit Oxalylchlorid, gegebenenfalls in Gegenwart einer katalytischen Menge von N,N-Dimethylformamid, in einem inerten Lösungsmittel, wie Benzol oder Dichlormethan, bevorzugt Dichlormethan, durchgeführt werden. Die Reaktion kann geeigneterweise bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur, bevorzugt bei Raumtemperatur, durchgeführt werden. In einer anderen Ausführungsform wird die Verbindung der Struktur 56 mit einem acylchloridbildenden Reagenz, wie Sulfurylchlorid, in einem inerten Lösungsmittel, zum Beispiel Benzol oder Toluol, bevorzugt Toluol, bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und der Rückflusstemperatur der Lösung, bevorzugt bei der Rückflusstemperatur, umgesetzt.
Das Diazoketon der Struktur 58 wird durch Behandlung des so gebildeten Acylhalogenids der Struktur 57 in einem inerten Lösungsmittel, z. B. Dichlormethan, mit einem Überschuss einer frisch hergestellten etherischen Lösung von Diazomethan hergestellt. Die Kombination der Reagenzien wird geeigneterweise bei Eisbadtemperatur durchgeführt, und man lässt die Reaktion dann bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur, bevorzugt bei Raumtemperatur, ablaufen. Die Cyclisierung des Diazoketons der Struktur 58, um das Tetralon der Struktur 41 zu liefern, wird durch Rhodium(II)-acetatdimer in einem inerten Lösungsmittel, z. B. Dichlormethan, gefördert. Die Reaktion wird normalerweise bei Raumtemperatur bis zur Rückflusstemperatur der Lösung, bevorzugt bei der Rückflusstemperatur, durchgeführt.
Die Verbindungen der Struktur 41, wobei R¹⁰ einen geradkettigen oder verzweigten Niederalkoxyrest oder einen Dialkylaminosubstituenten darstellt, werden, wie in Schema M gezeigt, hergestellt. Die Verbindungen der Struktur 60 (R¹⁵ ^' = eine unverzweigte Niederalkyleinheit) werden durch O-Alkylierung des Naphthalindiols der Struktur 59 mit einem primären Alkyliodid oder -bromid, bevorzugt einem -iodid, in Gegenwart einer Base, wie einem Alkalimetallcarbonat, zum Beispiel Natrium- oder Kaliumcarbonat, hergestellt. Die Reaktion kann in einem inerten Lösungsmittel, bevorzugt N,N-Dimethylformamid, bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis 100°C, bevorzugt bei 35°C, durchgeführt werden. Die Verbindungen der Struktur 63 (R¹⁵ ^'' stellt ein verzweigtes Niederalkyl dar) werden in zwei Schritten aus dem 2-Tetralon der Struktur 61 hergestellt. Das Tetralon der Struktur 61 wird in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators, wie Palladiummetall (10% auf Kohlenstoff), in einem geeigneten hochsiedenden Lösungsmittel, wie p-Cymol, dehydriert, wobei sich die aromatisierte Verbindung der Struktur 62 ergibt. Das Naphthol der Struktur 62 wird dann in Gegenwart einer Base, wie einem Alkalimetallcarbonat, bevorzugt Cäsiumcarbonat, mit einem sekundären Alkyliodid O-alkyliert, wobei die Verbindung der Struktur 63 geliefert wird. Die Reaktion kann geeigneterweise in einem inerten Lösungsmittel, bevorzugt N,N-Dimethylformamid, bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis 100°C, bevorzugt bei etwa 40°C, durchgeführt werden. Die Verbindung der Struktur 65 wird durch Alkylierung von 5-Amino-2-naphthol 64 mit Methyliodid in Gegenwart einer Base, wie einem Alkalimetallcarbonat, bevorzugt Kaliumcarbonat, hergestellt. Die Reaktion kann in einem inerten Lösungsmittel, zum Beispiel Aceton oder 2-Butanon, bevorzugt Aceton, bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und der Rückflusstemperatur der Lösung, bevorzugt bei der Rückflusstemperatur, durchgeführt werden.
Die Tetralone der Struktur 41 werden durch Reduktion der Verbindungen der Strukturen 60, 63 und 65 unter lösenden Metallbedingungen, gefolgt von der säurekatalysierten Hydrolyse der intermediären Enolether hergestellt. Die Umwandlung wird geeigneterweise durch die portionsweise Zugabe eines großen Überschusses von Alkalimetall, wie Natrium oder Kalium, bevorzugt Natrium, zu einer siedenden Lösung des Substrats in einem niederen Alkohol, bevorzugt bis das Ausgangsmaterial verbraucht ist, durchgeführt. Die Tetralone der Struktur 41 werden durch Behandlung einer Lösung der isolierten intermediären Enolether mit einem Katalysator aus einer starken Säure, bevorzugt p-Toluolsulfonsäure, erhalten. Die Hydrolyse kann geeigneterweise in einem Gemisch aus einem niederen Alkohol, bevorzugt Ethanol, und Wasser bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und der Rückflusstemperatur der Lösung, bevorzugt bei der Rückflusstemperatur, durchgeführt werden.
Die Verbindungen der Struktur 68 können durch Reaktionen, die als solche bekannt sind, hergestellt werden. Sie können zum Beispiel durch Kopplung eines sekundären Amins der Struktur 66 mit einem Arylbromid oder -iodid, bevorzugt einem Aryliodid der Struktur 67, hergestellt werden (Schema N). Die Kopplungsreaktion wird durch einen Edelmetallkatalysator, bevorzugt Tri(dibenzylidenaceton)dipalladium, in Gegenwart eines chelatbildenden Phosphinliganden, bevorzugt Tri-o-tolylphosphin, und einer sterisch gehinderten Alkoxidbase, wie Natrium-tert-butoxid, katalysiert. Die Reaktion wird geeigneterweise in einer inerten Atmosphäre unter Verwendung eines wasserfreien Lösungsmittels, wie Dioxan oder Toluol, bevorzugt Dioxan, bei einer Temperatur von 60°C bis zur Rückflusstemperatur, bevorzugt bei 90°C, durchgeführt. Die Verbindungen der Struktur 56 und 66 sind allgemein bekannte Verbindungen und können von kommerziellen Quellen erhalten werden. Die Entfernung der Carbonylschutzguppe in Verbindung 67 kann durch eine Vielzahl von Verfahren, die auf dem Gebiet der organischen Chemie allgemein bekannt sind, durchgeführt werden, wobei sich die Verbindungen der Struktur 42 ergeben. Die Entfernung der Schutzgruppe kann zum Beispiel durch Behandlung einer Lösung der Verbindung 68 in einem niedrigsiedenden Keton, wie Aceton oder 2-Butanon, mit einer wässrigen Mineralsäurelösung, zum Beispiel 6 N Salzsäure, erzielt werden. Die Reaktion kann bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis zur Rückflusstemperatur des Gemisches, bevorzugt bei der Rückflusstemperatur, durchgeführt werden.
Die Cyclohexanonderivate der Struktur 63 sind im Handel erhältliche Verbindungen, und das 4,4-Diphenylcyclohexanon (6) durch veröffentlichte Verfahren hergestellt.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen, wie vorstehend beschrieben, wobei das Verfahren Abspalten einer Verbindung, wie vorstehend beschrieben, die an einen festen Träger gebunden ist, von dem festen Träger mit einer Säure umfasst. Solche Verfahren sind vorstehend, z. B. in Schema H, beschrieben und sind, z. B. auch aus der in dieser Beschreibung zitierten Literatur, einem Fachmann auch allgemein bekannt. Die Säure, mit der die vorstehend erwähnte Abspaltung durchgeführt wird, ist bevorzugt Trifluoressigsäure. Die Abspaltung kann in einem Lösungsmittel, wie z. B. Dichlormethan, mit einer gegebenenfalls vorhandenen Spur (etwa 1%) Wasser durchgeführt werden. Die Abspaltung kann mit einem Fänger, wie z. B. Ethanditiol, Dimethylsulfid, Triethylsilan oder Anisol, durchgeführt werden. Geeignete feste Träger sind, z. B. aus der in dieser Beschreibung zitierten Literatur, einem Fachmann allgemein bekannt und sind auch im Handel erhältlich. Die Herstellung der Verbindungen, wie vorstehend definiert, die an einen festen Träger gebunden sind, ist z. B. in den vorstehenden Schemata und in den Beispielen beschrieben. Die Schutzgruppen, z. B. eine Pmc-Gruppe von einer Guanidinoguppe, können gleichzeitig mit der vorstehend erwähnten Abspaltung entfernt werden. Die Erfindung betrifft ferner Verbindungen, wie vorstehend definiert, wenn sie durch ein Verfahren, wie vorstehend definiert, hergestellt wurden.
Die Verbindungen, wie vorstehend beschrieben, können als Medikamente, z. B. in Form von Arzneimittelzubereitungen zur enteralen, parenteralen oder topischen Verabreichung, verwendet werden. Sie können zum Beispiel peroral, z. B. in Form von Tabletten, überzogenen Tabletten, Dragees, Hart- und Weichgelatinekapseln, Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, rektal, z. B. in Form von Suppositorien, parenteral, z. B. in Form von Injektionslösungen oder Infusionslösungen, oder topisch, z. B. in Form von Salben, Cremes oder Ölen, verabreicht werden.
Die Herstellung der Arzneimittelzubereitungen kann auf eine Art und Weise durchgeführt werden, die jedem Fachmann bekannt ist, indem die Verbindungen, wie vorstehend beschrieben, gegebenenfalls in Kombination mit anderen therapeutisch wertvollen Substanzen, zusammen mit geeigneten, nicht-toxischen, inerten, therapeutisch kompatiblen, festen oder flüssigen Trägermaterialien und, falls gewünscht, üblichen pharmazeutischen Hilfsstoffen in eine galenische Verabreichungsform gebracht werden.
Geeignete Trägermaterialien sind nicht nur anorganische Trägermaterialien, sondern auch organische Trägermaterialien. Somit können zum Beispiel Lactose, Maisstärke oder Derivate davon, Talk, Stearinsäure oder ihre Salze als Trägermaterialien für Tabletten, überzogene Tabletten, Dragees und Hartgelatinekapseln verwendet werden. Für Weichgelatinekapseln geeignete Trägermaterialien sind zum Beispiel pflanzliche Öle, Wachse, Fette und halbfeste und flüssige Polyole (abhängig von der Natur des Wirkstoffs sind jedoch im Fall von Weichgelatinekapseln keine Träger erforderlich). Für die Herstellung von Lösungen und Sirupen geeignete Trägermaterialien sind zum Beispiel Wasser, Polyole, Saccharose, Invertzucker und dergleichen. Für Injektionslösungen geeignete Trägermaterialien sind zum Beispiel Wasser, Alkohole, Polyole, Glycerin und pflanzliche Öle. Für Suppositorien geeignete Trägermaterialien sind zum Beispiel natürliche oder gehärtete Öle, Wachse, Fette und halbflüssige oder flüssige Polyole. Für topische Zubereitungen geeignete Trägermaterialien sind Glyceride, halbsynthetische und synthetische Glyceride, gehärtete Öle, flüssige Wachse, flüssige Paraffine, flüssige Fettalkohole, Sterole, Polyethylenglycole und Cellulosederivate.
Übliche Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Netzmittel und Emulgatoren, konsistenzverbessernde Mittel, geschmacksverbessernde Mittel, Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks, Puffersubstanzen, Lösungsvermittler, farbgebende Stoffe und Maskierungsmittel und Antioxidationsmittel kommen als pharmazeutische Hilfsstoffe in Betracht.
Die Dosierung der Verbindungen, wie vorstehend beschrieben, kann abhängig von der zu bekämpfenden Krankheit, dem Alter und dem individuellen Zustand des Patienten und der Verabreichungsart innerhalb breiter Grenzen variieren und wird natürlich den individuellen Anforderungen in jedem besonderen Fall angepasst. Für erwachsene Patienten kommt eine tägliche Dosis von etwa 1 mg bis etwa 1000 mg, besonders etwa 10 mg bis etwa 500 mg, in Betracht. Abhängig von der Dosierung ist die Verabreichung der täglichen Dosierung in mehreren Dosierungseinheiten günstig.
Die Arzneimittelzubereitungen enthalten geeigneterweise etwa 1 bis 500 mg, bevorzugt 5 bis 200 mg, einer Verbindung, wie vorstehend beschrieben.
Diese Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die die hier beschriebene Erfindung veranschaulichen, jedoch nicht einschränken, besser verstanden.
BEISPIEL 1
Herstellung von Fmoc-1-amino-4-phenylcyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-Apc-OH)
Schritt 1:
Ammoniumcarbonat (33 g, 344 mmol, 6 Äq.) und Kaliumcyanid (5,6 g, 86,2 mmol, 1,5 Äq.) wurden zu einer Lösung von 4-Phenylcyclohexanon (10,0 g, 57,5 mmol) in Ethanol (100 ml) und Wasser (33 ml) in einer Glasdruckflasche gegeben. Das Gemisch wurde 24 h auf 80 bis 90°C erwärmt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser (400 ml) gegeben und 30 min kräftig gerührt. Der so erhaltene Niederschlag wurde unter Vakuum abfiltriert, sorgfältig mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich das Hydantoin als ein weißer Feststoff (14,0 g, Ausbeute 100%) ergab. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 8,63 (s, 1H), 7,23-7,36 (m, 4H), 7,15 (m, 1H), 2,50 (m, 1H), 2,10 (m, 1H), 1,85 (d, 1H) und 1,55-1,80 (m, 6H). Schritt 2:
Das Hydantoin (10,0 g) wurde in wässrigem NaOH (6 N, 350 ml) suspendiert und 2 bis 3 Tage auf 130°C erwärmt. Nach der Beendigung der Hydrolyse wurde das Reaktionsgemisch mit konz. HCl bis zu schwach sauer (pH ~6) neutralisiert. Die so erhaltene Aufschlämmung wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich 1-Amino-4-phenylcyclohexancarbonsäure (APC) als ein weißer Feststoff (25 g, Ausbeute > 100%, mit anorganischem Salz verunreinigt) ergab, der direkt für den nächsten Schritt verwendet wurde. Ein kleiner Teil des Rohprodukts wurde durch HPLC gereinigt. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,23-7,35 (m, 2H), 7,10-7,19 (m, 3H), 2,45 (m, 1H), 1,92-2,18 (m, 3H), 1,56-1,78 (m, 4H) und 1,20 (m, 1H); LRMS (Elektrospray) m/e 220 (M+1)⁺, ber. für C₁₃H₁₇NO₂, 219. Schritt 3:
Die rohe APC aus dem letzten Schritt (25 g) wurde mit Fmoc-Cl (13,2 g., 1,25 Äq.) in Dioxan (300 ml) und wässrigem, 10%igem Na₂CO₃ (150 ml) behandelt und über Nacht kräftig gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Dioxan zu entfernen, mit 6 N HCl bis zu schwach sauer (pH 5 bis 6) neutralisiert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab das Rohprodukt, das dann durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc bis CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt wurde, wobei sich reine Fmoc-cis-APC (18,2 g, Gesamtausbeute für zwei Schritte 72%) und Fmoc-trans-APC (2,1 g, 8%) ergaben. Die Struktur der Fmoc-cis-APC wurde durch Einkristallröntgenanalyse ihres Derivats bestätigt. Fmoc-cis-APC, ¹H-NMR (CD₃OD): 7,79 (d, 2H), 7,72 (d, 2H), 7,37 (t, 2H), 7,24-7,32 (m, 4H), 7,14-7,23 (m, 3H), 4,37 (d, 2H), 4,24 (t, 1H), 2,55 (m, 1H), 2,28 (m, 2H), 1,84-1,96 (m, 2H) und 1,64-1,73 (m, 4H).
BEISPIEL 2
Herstellung von Fmoc-1-amino-4-(4-methoxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-4-MeOApc-OH)
Schritt 1:.
Eine Lösung von 4-(4-Hydroxyphenyl)cyclohexanon (5,0 g, 26,3 mmol) in Aceton (100 ml) wurde mit K₂CO₃ (14,5 g, 105 mmol, 4 Äq.) und Iodmethan (4,9 ml, 11,2 g, 78,6 mmol, 3 Äq.) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht auf 65°C erwärmt. Nachdem das Lösungsmittel entfernt war, wurde der Rückstand mit H₂O behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt und mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, wobei sich das spektroskopisch reine 4-(4-Methoxyphenyl)cyclohexanon (5,34 g, 100%) ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,16 (dt, 2H), 6,87 (dt, 2H), 3,78 (s, 3H), 2,99 (tt, 1H), 2,47–2,53 (m, 4H), 2,20 (m, 2H) und 1,83-1,98 (m, 2H); MS (Elektrospray) m/e 205 (M+1)⁺, ber. für C₁₃H₁₆O₂, 204. Schritt 2:
Ammoniumcarbonat (14,5 g, 151 mmol, 8 Äq.) und Kaliumcyanid (2,0 g, 30,7 mmol, 1,6 Äq.) wurden zu einer Lösung des Ketons (3,86 g, 18,9 mmol) in Ethanol (50 ml) und Wasser (15 ml) in einer Glasdruckflasche gegeben. Das Gemisch wurde 24 h auf 80 bis 90°C erwärmt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser (300 ml) gegeben und 30 min kräftig gerührt. Der so erhaltene Niederschlag wurde unter Vakuum abfiltriert, sorgfältig mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich das Hydantoin als ein weißer Feststoff (4,75 g, Ausbeute 91%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 273 (M-H), ber. für C₁₅H₁₈N₂O₃, 274. Schritt 3:
Di-tert-butyldicarbonat (37,2 g, 170,5 mmol, 2,5 Äq.), Triethylamin (10,5 ml, 7,59 g, 75,0 mmol, 1,1 Äq.) und DMAP (460 mg, 3,65 mmol) wurden nacheinander zu einer Suspension des Hydantoin (18,7 g, 68,25 mmol) in trockenem THF (450 ml) gegeben. Etwa 15 Minuten nach der Zugabe verwandelte sich das Reaktionsgemisch in eine klare, gelbe Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wobei sich ein Feststoff ergab, der dann in EtOAc (800 ml) aufgenommen, mit 1 N HCl (3 × 50 ml), gesättigtem, wässrigem Na₂CO₃ (2 × 50 ml) und Salzlösung (2 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das hellgelbe Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 70/30) gereinigt, wobei sich das reine Bis-Boc-Hydantoin als ein weißer Feststoff (27,6 g, 87%) ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,28 (dt, 2H), 6,88 (dt, 2H), 3,79 (s, 3H), 2,14-2,24 (m, 2H), 1,59 (s, 9H) und 1,38 (s, 9H); MS (Elektrospray) m/e 538 (M+MeCN+Na)⁺, ber. für C₂₅H₃₄N₂O₇, 474. Schritt 4:
Das Bis-Boc-Hydantoin (15,08 g, 31,78 mmol) wurde in DME (500 ml) gelöst, wobei sich eine klare Lösung ergab. 1 N NaOH (290 ml, 290 mmol) wurde zu dieser Lösung gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wobei sich ein schwach trübes Gemisch ergab. Eine HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion an. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das DME zu entfernen, und mit Et₂O extrahiert. Die so erhaltene wässrige Schicht, die 1-Amino-4-(4-methoxyphenyl)cyclohexancarbonsäure (4-MeOAPC) enthielt, wurde ohne Reinigung mit 6 N HCl behandelt, um den pH-Wert auf 11 bis 12 einzustellen. DME (300 ml) und eine Lösung von Fmoc-Osu (16,7 g, 49,42 mmol) in DME (200 ml) wurden zu dieser Lösung (~300 ml) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das DME zu entfernen, mit 3 N HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (CH₂Cl₂/MeOH, 98/2 → 90/10) gereinigt, wobei sich das reine Fmoc-4-MeOAPC-Produkt als ein weißer Feststoff (12,4 g, Ausbeute aus Bis-Boc-Hydantoin 83%) ergab. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,88 (d, 2H), 7,76 (d, 2H), 7,40 (t, 2H), 7,30 (t, 2H), 7,11 (d, 2H), 6,85 (d, 2H), 3,71 (s, 3H); MS (Elektrospray) m/e 470 (M-H), ber. für C₂₉H₂₉NO₅, 471.
BEISPIEL 3
Herstellung von Fmoc-1-amino-4-(4-ethoxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-4-EtOApc-OH)
Schritt 1:
Eine Lösung von 4-(4-Hydroxyphenyl)cyclohexanon (5,0 g, 26,3 mmol) in Aceton (100 ml) wurde mit K₂CO₃ (14,5 g, 105 mmol, 4 Äq.) und Iodethan (10,5 ml, 20,5 g, 131 mmol, 5 Äq.) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht auf 65°C erwärmt. Nachdem das Lösungsmittel entfernt war, wurde der Rückstand mit H₂O behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt und mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, wobei sich das spektroskopisch reine 4-(4-Ethoxyphenyl)cyclohexanon (5,74 g, 100%) ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,15 (dt, 2H), 6,86 (dt, 2H), 4,02 (q, 2H), 2,99 (tt, 1H), 2,46-2,54 (m, 4H), 2,16-2,24 (m, 2H), 1,83-2,00 (m, 2H) und 1,41 (t, 3H); MS (Elektrospray) m/e 219 (M+1)⁺, ber. für C₁₄H₁₈O₂, 218. Schritt 2:
Ammoniumcarbonat (14,5 g, 151 mmol, 8 Äq.) und Kaliumcyanid (2,05 g, 31,42 mmol, 1,6 Äq.) wurden zu einer Lösung des Ketons (4,15 g, 19,01 mmol) in Ethanol (50 ml) und Wasser (15 ml) in einer Glasdruckflasche gegeben. Das Gemisch wurde 19 h auf 80 bis 90°C erwärmt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser (300 ml) gegeben und 30 min kräftig gerührt. Der so erhaltene Niederschlag wurde unter Vakuum abfiltriert, sorgfältig mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich das Hydantoin als ein weißer Feststoff (5,17 g, Ausbeute 94%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 287 (M-H), ber. für C₁₆H₂₀N₂O₃, 288. Schritt 3:
Di-tert-butyldicarbonat (7,98 g, 36,60 mmol, 2,5 Äq.), Triethylamin (2,3 ml, 1,63 g, 16,11 mmol, 1,1 Äq.) und DMAP (89,4 mg, 0,73 mmol) wurden nacheinander zu einer Suspension des Hydantoins (4,22 g, 14,65 mmol) in trockenem THF (100 ml) gegeben. Etwa 15 Minuten nach der Zugabe verwandelte sich das Reaktionsgemisch in eine klare, gelbe Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wobei sich ein Feststoff ergab, der dann in EtOAc (300 ml) aufgenommen, mit 1 N HCl (3 × 20 ml), gesättigtem, wässrigem Na₂CO₃ (2 × 20 ml) und Salzlösung (2 × 20 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das hellgelbe Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 70/30) gereinigt, wobei sich das reine Bis-Boc-Hydantoin als ein weißer Feststoff (7,01 g, 98%) ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,27 (dt, 2H), 6,87 (dt, 2H), 4,02 (q, 2H), 1,59 (s, 9H), 1,43 (t, 3H) und 1,38 (s, 9H); MS (Elektrospray) m/e 999 (2M+Na)⁺, ber. für C₂₆H₃₆N₂O₇, 488. Schritt 4:
Das Bis-Boc-Hydantoin (6,58 g, 13,46 mmol) wurde in DME (200 ml) gelöst, wobei sich eine klare Lösung ergab. 1 N NaOH (121 ml, 121 mmol) wurde zu dieser Lösung gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wobei sich ein schwach trübes Gemisch ergab. Eine HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion an. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das DME zu entfernen, und mit Et₂O extrahiert. Die so erhaltene wässrige Schicht, die 1-Amino-4-(4-ethoxyphenyl)cyclohexancarbonsäure (4-EtOAPC) enthielt, wurde ohne Reinigung mit 6 N HCl behandelt, um den pH-Wert auf 11 bis 12 einzustellen. DME (100 ml) und eine Lösung von Fmoc-OSu (6,83 g, 20,24 mmol) in DME (30 ml) wurden zu dieser Lösung (~130 ml) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das DME zu entfernen, mit 3 N HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (CH₂Cl₂/MeOH, 98/2 → 90/10) gereinigt, wobei sich das reine Produkt als ein weißer Feststoff (5,56 g, Ausbeute aus dem Bis- Boc-Hydantoin 85%) ergab. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,88 (d, 2H), 7,74 (d, 2H), 7,40 (td, 2H), 7,30 (td, 2H), 7,11 (d, 2H), 6,84 (d, 2H), 3,97 (q, 2H) und 1,29 (t, 3H); MS (Elektrospray) m/e 484 (M-H), ber. für C₃₀H₃₁NO₅, 485.
BEISPIEL 4
Herstellung von Fmoc-1-amino-4-(4-hydroxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-4-HOApc-OH)
Schritt 1:
Ammoniumcarbonat (6,17 g, 64,2 mmol, 6 Äq.) und Kaliumcyanid (1,07 g, 15,8 mmol, 1,5 Äq.) wurden zu einer Lösung von 4-(4-Hydroxyphenyl)cyclohexanon (2,00 g, 10,52 mmol) in Ethanol (30 ml) und Wasser (10 ml) in einer Glasdruckflasche gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht auf 80 bis 90°C erwärmt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser (200 ml) gegeben und 30 min kräftig gerührt. Der so erhaltene Niederschlag wurde unter Vakuum abfiltriert, sorgfältig mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich das Hydantoin als ein weißer Feststoff (2,56 g, Ausbeute 94%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 261 (M+H)⁺, ber. für C₁₄H₁₆N₂O₃, 260. Schritt 2:
Das Hydantoin (2,10 g, 8,06 mmol) wurde in wässrigem NaOH (6 N, 100 ml) suspendiert und 2 bis 3 Tage auf 130°C erwärmt. Nach der Beendigung der Hydrolyse wurde das Reaktionsgemisch mit konz. HCl bis zu schwach sauer (pH ~6) neutralisiert. Die so erhaltene Aufschlämmung wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich 1-Amino-4-(4-hydroxyphenyl)cyclohexancarbonsäure (4-HOAPC) als ein weißer Feststoff (3,1 g, Ausbeute > 100%, mit anorganischem Salz verunreinigt) ergab. MS (Elektrospray) m/e 236 (M+H)⁺, ber. für C₁₃H₁₇NO₃, 235. Schritt 3:
Die rohe APC aus dem letzten Schritt (3,1 g) wurde mit Fmoc-Cl (2,6 g, 1,25 Äq.) in Dioxan (100 ml) und wässrigem, 10%igem Na₂CO₃ (50 ml) behandelt und über Nacht kräftig gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Dioxan zu entfernen, mit 6 N HCl bis zu schwach sauer (pH 5 bis 6) neutralisiert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab das Rohprodukt, das durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc bis CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt wurde, wobei sich reine Fmoc-4-HOAPC (2,76 g, Gesamtausbeute für zwei Schritte 75%) ergab. ¹H-NMR (CD₃OD): 7,78 (d, 2H), 7,72 (d, 2H), 7,38 (t, 2H), 7,30 (td, 2H), 7,04 (d, 2H), 6,72 (dt, 2H), 4,38 (d, 2H), 4,25 (t, 1H), 2,46 (m, 1H), 2,24-2,34 (m, 2H) und 1,81-1,92 (m, 6H); MS (Elektrospray) m/e 456 (M-H), ber. für C₂₈H₂₇NO₅, 457.
BEISPIEL 5
Herstellung von Fmoc-1-amino-4-(4-isopropoxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-4-iPrOApc-OH)
Schritt 1:
Eine Lösung von 4-(4-Hydroxyphenyl)cyclohexanon (6,0 g, 31,6 mmol) in DMF (90 ml) wurde mit K₂CO₃ (21 g, 158 mmol, 5 Äq.) und 2-Iodpropan (15 ml, 26,8 g, 158 mmol, 5 Äq.) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht auf 100°C erwärmt. Nachdem das Lösungsmittel entfernt war, wurde der Rückstand mit H₂O behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt und mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, wobei sich das spektroskopisch reine 4-(4- Isopropoxyphenyl)cyclohexanon (7,02 g, 95%) ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,14 (dt, 2H), 6,84 (dt, 2H), 4,3 (Septett, 1H), 2,97 (tt, 1H), 2,46-2,52 (m, 4H), 2,16-2,24 (m, 2H), 1,83-1,98 (m, 2H) und 1,33 (d, 6H). Schritt 2:
Ammoniumcarbonat (12,6 g, 131 mmol, 6 Äq.) und Kaliumcyanid (2,14 g, 32,9 mmol, 1,5 Äq.) wurden zu einer Lösung des Ketons (5,1 g, 21,98 mmol) in Ethanol (90 ml) und Wasser (30 ml) in einer Glasdruckflasche gegeben. Das Gemisch wurde 24 h auf 80 bis 90°C erwärmt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser (400 ml) gegeben und 30 min kräftig gerührt. Der so erhaltene Niederschlag wurde unter Vakuum abfiltriert, sorgfältig mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich Hydantoin als ein weißer Feststoff (6,60 g, Ausbeute 99%) ergab. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 10,60 (s, 1H), 8,65 (s, 1H), 7,18 (d, 2H), 6,80 (d, 2H), 4,52 (Septett, 1H), 2,43 (m, 1H), 1,85-2,15 (m, 2H), 1,56-1,80 (m, 6H) und 1,22 (d, 6H); MS (Elektrospray) m/e 301 (M-H), ber. für C₁₇H₂₂N₂O₃, 302. Schritt 3:
Di-tert-butyldicarbonat (10,46 g, 48,0 mmol, 2,5 Äq.), Triethylamin (2,9 ml, 2,13 g, 21,12 mmol, 1,1 Äq.) und DMAP (140 mg, 1,15 mmol) wurden nacheinander zu einer Suspension des Hydantoins (5,8 g, 19,20 mmol) in trockenem THF (180 ml) gegeben. Etwa 15 Minuten nach der Zugabe verwandelte sich das Reaktionsgemisch in eine klare, gelbe Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wobei sich ein Feststoff ergab, der dann in EtOAc (600 ml) aufgenommen, mit 1 N HCl (3 × 40 ml), gesättigtem, wässrigem Na₂CO₃ (2 × 40 ml) und Salzlösung (2 × 40 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das hellgelbe Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 80/20) gereinigt, wobei sich das reine Bis-Boc-Hydantoin als ein weißer Feststoff (9,4 g, 98%) ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,27 (dt, 2H), 6,87 (dt, 2H), 4,02 (q, 2H), 2,98 (t, 1H), 2,26-2,56 (m, 4H), 2,14-2,24 (m, 2H), 1,76-1,86 (m, 2H), 1,59 (s, 9H), 1,43 (t, 3H) und 1,38 (s, 9H); MS (Elektrospray) m/e 999 (2M+Na)⁺, ber. für C₂₆H₃₆N₂O₇, 488. Schritt 4:
Das Bis-Boc-Hydantoin (4,34 g, 8,64 mmol) wurde in DME (100 ml) gelöst, wobei sich eine klare Lösung ergab. 1 N NaOH (78 ml, 78 mmol) wurde zu dieser Lösung gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wobei sich ein ziemlich klares Gemisch ergab. Eine HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion an. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das DME zu entfernen, und mit Et₂O extrahiert. Die so erhaltene wässrige Schicht, die 1-Amino-4-(4-isopropoxyphenyl)cyclohexancarbonsäure (4-iPrOAPC) enthielt, wurde ohne Reinigung mit 6 N HCl behandelt, um den pH-Wert auf 11 bis 12 einzustellen. DME (120 ml) und eine Lösung von Fmoc-OSu (3,49 g, 10,34 mmol, 1,2 Äq.) in DME (20 ml) wurden zu dieser Lösung (~90 ml) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das DME zu entfernen, mit 3 N HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc → CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt, wobei sich das reine Produkt als ein weißer Feststoff (3,23 g, Ausbeute aus Bis-Boc-Hydantoin 75%) ergab. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,76 (d, 2H), 7,60 (d, 2H), 7,39 (t, 2H), 7,31 (t, 2H), 7,08 (d, 2H), 6,84 (d, 2H), 4,24 (m, 1H) und 1,34 (d, 6H); MS (Elektrospray) m/e 498 (M-H), ber. für C₃₁H₃₃NO₅, 499.
BEISPIEL 6
Herstellung von Fmoc-1-amino-4-(4-methylphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-4-MeApc-OH)
Schritt 1:
Eine Lösung von n-BuLi (1,6 M, 31,0 ml, 50 mmol) in Hexan wurde bei –78°C während 20 min zu einer Lösung von 4-Iodtoluol (10,9 g, 50,0 mmol) in trockenem THF (180 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 20 min gerührt, bevor eine Lösung von 1,4-Cyclohexandionmonoethylenketal (6,0 g, 38,46 mmol) in trockenem THF (100 ml) tropfenweise zugegeben wurde. Nach 2-stündigem Rühren bei –78°C wurde das Reaktionsgemisch mit wässrigem NH₄Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, wobei sich das spektroskopisch reine Produkt als ein weißer Feststoff (9,34 g, Ausbeute 98%) ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,41 (m, 2H), 7,16 (d, 2H), 3,98 (m, 4H), 2,34 (s, 3H); MS (EI) m/e 248 (M⁺), ber. für C₁₅H₂₀O₃, 248. Schritt 2:
p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (650 mg) wurde zu einer Lösung des Alkohols (9,10 g, 36,65 mmol) in trockenem Benzol (200 ml) in einem Kolben, der mit einer Dean-Stark-Falle ausgestattet war, gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 3 h auf 100°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde auf RT abgekühlt, mit EtOAc (500 ml) verdünnt und mit wässrigem Na₂CO₃ (50 ml) und Salzlösung (3 × 50 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert, wobei sich das spektroskopisch reine Produkt (8,36 g, Ausbeute 100%) ergab, das ohne Reinigung für den nächsten Schritt verwendet wurde. MS (EI) m/e 230 (M⁺), 190 (M-OCH₂CH₂O), ber. für C₁₅H₁₈O₂, 230. Schritt 3:
Pd/C (5 Gew.-% auf Kohle, 800 mg) wurde zu einer Lösung des Olefins (7,49 g) in EtOAc (180 ml) gegeben, und die Reaktion wurde unter Wasserstoff mit 40 psi 3 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Katalysator wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde konzentriert, wobei sich das spektroskopisch reine Produkt als ein farbloses Öl (7,40 g, Ausbeute 100%) ergab. MS (EI) m/e 232 (M⁺), 188 (M-OCH₂CH₂), ber. für C₁₅H₂₀O₂, 232. Schritt 4:
Eine Lösung des Ketals (6,90 g) in Aceton (140 ml) wurde mit 4 N HCl (60 ml) behandelt und 4 h auf 65°C erwärmt. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und der Rückstand wurde mit EtOAc verdünnt und mit 4 N HCl neutralisiert. Die wässrige Phase wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, getrocknet und konzentriert. Das so erhaltene Rohprodukt (5,57 g, quantitative Ausbeute) wurde ohne Reinigung für den nächsten Schritt verwendet. MS (EI) m/e 188 (M⁺), ber. für C₁₃H₁₆O, 188. Schritt 5:
Ammoniumcarbonat (16,3 g, 169,8 mmol, 6 Äq.) und Kaliumcyanid (3,68 g, 56,5 mmol, 2 Äq.) wurden zu einer Lösung von 4-(4-Methylphenyl)cyclohexanon (5,32 g, 28,3 mmol) in Ethanol (90 ml) und Wasser (30 ml) in einer Glasdruckflasche gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht auf 80 bis 90°C erwärmt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser (400 ml) gegeben und 30 min kräftig gerührt. Der so erhaltene Niederschlag wurde unter Vakuum abfiltriert, sorgfältig mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich das Hydantoin als ein weißer Feststoff (6,3 g, Ausbeute 86%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 517 (2M+H), ber. für C₁₅H₁₈ClN₂O₂, 258. Schritt 6:
Di-tert-butyldicarbonat (12,3 g, 56,4 mmol, 2,5 Äq.), Triethylamin (3,5 ml, 2,5 g, 24,7 mmol, 1,1 Äq.) und DMAP (275 mg, 2,25 mmol) wurden nacheinander zu einer Suspension des Hydantoins (5,82 g, 22,55 mmol) in trockenem THF (250 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch verwandelte sich in eine klare, gelbe Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wobei sich ein Feststoff ergab, der dann in EtOAc (500 ml) aufgenommen, mit 1 N HCl (3 × 50 ml), gesättigtem, wässrigem Na₂CO₃ (2 × 50 ml) und Salzlösung (2 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das hellgelbe Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 70/30) gereinigt, wobei sich das reine Bis-Boc-Hydantoin als ein weißer Feststoff (10,03 g, Ausbeute 100%) ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,26 (d, 2H), 6,87 (d, 2H), 3,00 (m, 1H), 2,32 (s, 3H), 1,59 (s, 9H) und 1,37 (s, 9H). Schritt 7:
Das Bis-Boc-Hydantoin (6,40 g, 13,97 mmol) wurde in DME (200 ml) gelöst, wobei sich eine klare Lösung ergab. 1 N NaOH (120 ml, 120 mmol) wurde zu dieser Lösung gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wobei sich ein schwach trübes Gemisch ergab. Eine HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion an. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das DME zu entfernen, und mit Et₂O extrahiert. Die so erhaltene wässrige Schicht, die 1-Amino-4-(4-methylphenyl)cyclohexancarbonsäure (4-MeAPC) enthielt, wurde ohne Reinigung mit 6 N HCl behandelt, um den pH-Wert auf 11 bis 12 einzustellen. DME (240 ml) und eine Lösung von Fmoc-OSu (5,10 g, 15,13 mmol, 1,1 Äq.) in DME (40 ml) wurden zu dieser Lösung (~140 ml) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das DME zu entfernen, mit 3 N HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (CH₂Cl₂/MeOH, 98/2 → 90/10) gereinigt, wobei sich das reine Produkt als ein weißer Feststoff (4,35 g, Ausbeute aus Bis-Boc-Hydantoin 69%) ergab. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,88 (d, 2H), 7,75 (d, 2H), 7,24-7,43 (m, 4H), 7,02-7,14 (m, 4H), 4,25 (m, 3H), 2,24 (s, 3H).
BEISPIEL 7
Herstellung von Fmoc-1-amino-4-(4-chlorphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-4-ClApc-OH)
Schritt 1:
Eine Lösung von 4-Chlorphenylbromid (7,5 g, 39,2 mmol) in trockenem THF (180 ml) wurde auf –78°C gekühlt und während 20 min tropfenweise mit einer Lösung von n-BuLi (1,6 M, 25 ml, 40 mmol) in Hexan behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 30 min gerührt, bevor eine Lösung von 1,4-Cyclohexandionmonoethylenketal (6,0 g, 38,46 mmol) in trockenem THF (100 ml) tropfenweise zugegeben wurde. Nach 1-stündigem Rühren bei –78°C wurde das Reaktionsgemisch mit wässrigem NH₄Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, wobei sich das spektroskopisch reine Produkt als ein weißer Feststoff (9,40 g, Ausbeute 91%) ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,45 (m 2H), 7,31 (m, 2H), 3,99 (m, 4H), 2,02-2,20 (m, 4H), 1,75-1,82 (m, 2H), 1,66-1,73 (m, 2H), 1,54 (s, 1H); MS (EI) m/e 268 (M⁺), 251 (M-OH), 250 (M-H₂O), ber. für C₁₄H₁₇ClO₃, 268. Schritt 2:
p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (960 mg) wurde zu einer Lösung des Alkohols (6,78 g, 25,30 mmol) in trockenem Benzol (120 ml) in einem Kolben, der mit einer Dean-Stark-Falle ausgestattet war, gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 3 h unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf RT abgekühlt, mit EtOAc (500 ml) verdünnt und mit wässrigem Na₂CO₃ (50 ml) und Salzlösung (3 × 50 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert, wobei sich das spektroskopisch reine Produkt (6,30 g, Ausbeute 100%) ergab, das ohne Reinigung für den nächsten Schritt verwendet wurde. MS (EI) m/e 250 (M⁺), 190 (M-OCH₂CH₂O), ber. für C₁₄H₁₅ClO₂, 250. Schritt 3:
Pd/C (5 Gew.-% auf Kohle, 600 mg) wurde zu einer Lösung des Olefins (6,11 g) in EtOAc (120 ml) gegeben, und die Reaktion wurde unter Wasserstoff mit 5 psi 3 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Katalysator wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde konzentriert, wobei sich das spektroskopisch reine Produkt als ein farbloses Öl (6,10 g, Ausbeute 100%) ergab. MS (EI) m/e 252(M⁺), ber. für C₁₄H₁₇ClO₂, 252. Schritt 4:
Eine Lösung des Ketals (5,81 g, 23,06 mmol) in Aceton (200 ml) wurde mit p- Toluolsulfonsäuremonohydrat (876 mg) behandelt und über Nacht auf 60°C erwärmt. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und der Rückstand wurde in EtOAc aufgenommen, mit wässriger Na₂CO₃-Lösung und Salzlösung gewaschen, getrocknet und konzentriert, wobei sich das Rohprodukt als ein gelbes Öl (5,38 g, Ausbeute > 100%) ergab. Reinigung durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 80/20 → 60/40) stellte das Keton als ein hellgelbes Öl (4,54 g, Ausbeute 95%) bereit. MS (EI) m/e 208 (M⁺), ber. für C₁₂H₁₃ClO₂, 208. Schritt 5:
Ammoniumcarbonat (13,8 g, 144 mmol, 7 Äq.) und Kaliumcyanid (3,56 g, 54,77 mmol, 2,5 Äq.) wurden zu einer Lösung von 4-(4-Chlorphenyl)cyclohexanon (4,26 g, 20,48 mmol) in Ethanol (90 ml) und Wasser (30 ml) in einer Glasdruckflasche gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht auf 80 bis 90°C erwärmt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser (400 ml) gegeben und 30 min kräftig gerührt. Der so erhaltene Niederschlag wurde unter Vakuum abfiltriert, sorgfältig mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich das Hydantoin als ein weißer Feststoff (5,58 g, Ausbeute 98%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 277 (M-H), ber. für C₁₄H₁₅ClN₂O₂, 278. Schritt 6:
Di-tert-butyldicarbonat (10,1 g, 46,3 mmol, 2,5 Äq.), Triethylamin (2,8 ml, 2,07 g, 20,45 mmol, 1,1 Äq.) und DMAP (226 mg, 1,85 mmol) wurden nacheinander zu einer Suspension des Hydantoins (5,15 g, 18,5 mmol) in trockenem THF (250 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch verwandelte sich in eine klare, gelbe Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wobei sich ein Feststoff ergab, der dann in EtOAc (500 ml) aufgenommen, mit 1 N HCl (3 × 50 ml), gesättigtem, wässrigem Na₂CO₃ (2 × 50 ml) und Salzlösung (2 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das hellgelbe Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 70/30) gereinigt, wobei sich das reine Bis-Boc-Hydantoin als ein weißer Feststoff (8,05 g, Ausbeute 91%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 542 (M+Ma+MeCN), ber. für C₂₄H₃₁ClN₂O₆, 478. Schritt 7:
Das Bis-Boc-Hydantoin (6,41 g, 13,97 mmol) wurde in DME (200 ml) gelöst, wobei sich eine klare Lösung ergab. 1 N NaOH (120 ml, 120 mmol) wurde zu dieser Lösung gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wobei sich ein schwach trübes Gemisch ergab. Eine HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion an. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das DME zu entfernen, und mit Et₂O extrahiert. Die so erhaltene wässrige Schicht, die 1-Amino-4-(4-chlorphenyl)cyclohexancarbonsäure (4-ClAPC) enthielt, wurde ohne Reinigung mit 6 N HCl behandelt, um den pH-Wert auf 11 bis 12 einzustellen. DME (240 ml) und eine Lösung von Fmoc-OSu (5,31 g, 15,74 mmol, 1,1 Äq.) in DME (30 ml) wurden zu dieser Lösung (~180 ml) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das DME zu entfernen, mit 3 N HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (CH₂Cl₂/MeOH, 98/2 → 90/10) gereinigt, wobei sich das reine Produkt als ein weißer Feststoff (5,04 g, Ausbeute aus dem Bis-Boc-Hydantoin 76%) ergab. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,88 (d, 2H), 7,74 (d, 2H), 7,19-7,42 (m, 8H), 4,20-4,31 (m, 3H); MS (Elektrospray) m/e 474 (M-H), ber. für C₂₈H₂₆ClNO₄, 475.
BEISPIEL 8
Herstellung von Fmoc-1-amino-4-(3-methoxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-3-MeOApc-OH)
Schritt 1:
Eine Lösung von n-BuLi (1,6 M, 31,0 ml, 50 mmol, 1,3 Äq.) in Hexan wurde bei –78°C während 25 min zu einer Lösung von 3-Iodanisol (11,7 g, 50,0 mmol, 1,3 Äq.) in trockenem THF (180 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 30 min gerührt, bevor eine Lösung von 1,4-Cyclohexandionmonoethylenketal (6,0 g, 38,46 mmol) in trockenem THF (100 ml) tropfenweise zugegeben wurde. Nach 2-stündigem Rühren bei –78°C wurde das Reaktionsgemisch mit wässrigem NH₄Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, wobei sich das spektroskopisch reine Produkt als ein weißer Feststoff (9,34 g, Ausbeute 98%) ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,26 (dd, 1H), 7,06-7,11 (m, 2H), 6,79 (dd, 1H), 3,98 (m, 4H), 3,81 (s, 3H). Schritt 2:
Triethylsilan (10,2 ml, 7,4 g, 63,63 mmol, 3 Äq.) und Bortrifluoridetherat (21,5 ml, 24,1 g, 169,7 mmol, 8 Äq.) wurden unter Stickstoffatmosphäre und Rühren bei Salz-Eis-Badtemperatur nacheinander zu einer Lösung des Alkohols (5,6 g, 21,21 mmol) in trockenem CH₂Cl₂ (200 ml) gegeben. Man ließ das Reaktionsgemisch dann auf Raumtemperatur erwärmen und rührte 3 h, bevor es mit 10%iger, wässriger K₂CO₃-Lösung und H₂O gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert wurde, wobei sich die Desoxidationsverbindung als ein Öl (4,91 g) ergab, das für die direkte Verwendung ausreichend rein war.
Diese rohe Zwischenverbindung wurde in Aceton (130 ml) gelöst und mit 4 N HCl (60 ml) behandelt und 4 h auf 65°C erwärmt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mit EtOAc verdünnt und mit 4 N NaOH-Lösung neutralisiert. Die wässrige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert, und die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, getrocknet und konzentriert. Der so erhaltene Rückstand wurde durch Flashchromatographie auf Silicagel (80/20 → 60/40) gereinigt, wobei sich das Keton (3,67 g, Gesamtausbeute 85%) als ein gelbes Öl ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,25 (dt, 1H), 6,75-6,86 (m, 3H), 3,81 (s, 3H), 3,00 (tt, 1H); MS (EI) m/e 204 (M⁺), ber. für C₁₃H₁₆O₂, 204. Schritt 3:
Ammoniumcarbonat (8,75 g, 91,20 mmol, 6 Äq.) und Kaliumcyanid (1,98 g, 30,40 mmol, 2 Äq.) wurden zu einer Lösung von 4-(3-Methoxyphenyl)cyclohexanon (3,10 g, 15,20 mmol) in Ethanol (60 ml) und Wasser (20 ml) in einer Glasdruckflasche gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht auf 80 bis 90°C erwärmt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser (300 ml) gegeben und 30 min kräftig gerührt. Der so erhaltene Niederschlag wurde unter Vakuum abfiltriert, sorgfältig mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich das Hydantoin als ein weißer Feststoff (4,08 g, Ausbeute 98%) ergab. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,11 (d, 1H), 6,70-6,94 (m, 3H), 3,72 (s, 3H); MS (Elektrospray) m/e 316 (M+MeCN+H), ber. für C₁₅H₁₀N₂O₃, 274. Schritt 4:
Di-tert-butyldicarbonat (10,5 g, 48,16 mmol, 2,5 Äq.), Triethylamin (3,0 ml, 2,17 g, 21,52 mmol, 1,1 Äq.) und DMAP (235 mg, 1,92 mmol) wurden nacheinander zu einer Suspension des Hydantoins (5,29 g, 19,30 mmol) in trockenem THF (250 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch verwandelte sich in eine klare, gelbe Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wobei sich ein Feststoff ergab, der dann in EtOAc (500 ml) aufgenommen, mit 1 N HCl (3 × 50 ml), gesättigtem, wässrigem Na₂CO₃ (2 × 50 ml) und Salzlösung (2 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das hellgelbe Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 80/20 → 60/40) gereinigt, wobei sich das reine Bis-Boc-Hydantoin als ein weißer Feststoff (8,70 g, Ausbeute 95%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 538 (M+MeCN+Na), ber. für C₂₅H₃₄N₂O₇, 474. Schritt 5:
Das Bis-Boc-Hydantoin (2,30 g, 4,84 mmol) wurde in DME (80 ml) gelöst, wobei sich eine klare Lösung ergab. 1 N NaOH (44 ml, 44 mmol) wurde zu dieser Lösung gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wobei sich ein schwach trübes Gemisch ergab. Eine HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion an. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das DME zu entfernen, und mit Et₂O extrahiert. Die so erhaltene wässrige Schicht, die 1-Amino-4-(3-methoxyphenyl)cyclohexancarbonsäure (3-MeOAPC) enthielt, wurde ohne Reinigung mit 6 N HCl behandelt, um den pH-Wert auf 11 bis 12 einzustellen. Dioxan (80 ml) und Fmoc-Cl (1,73 g, 6,76 mmol, 1,4 Äq.) wurden zu dieser Lösung (~40 ml) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann unter reduziertem Druck konzentriert, um das DME zu entfernen, mit 3 N HCl neutralisiert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie auf Silicagel (CH₂Cl₂/MeOH, 98/2 → 90/10) gereinigt, wobei sich das reine Produkt als ein weißer Feststoff (1,98 g, Ausbeute aus Bis-Boc-Hydantoin 87%) ergab. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,88 (d, 2H), 7,75 (d, 2H), 7,40 (td, 2H), 7,30 (td, 2H), 7,21 (m, 1H), 6,71-6,80 (m, 3H), 3,72 (s, 3H); MS (Elektrospray) m/e 494 (M+Na), ber. für C₂₉H₂₉NO₅, 471.
BEISPIEL 9
Herstellung von Fmoc-(D,L)-5-brom-2-aminotetralin-2-carbonsäure (Fmoc-(D,L)-5-Br-Atc-OH)
Schritt 1:
Ein Gemisch aus 3-(2-Bromphenyl)propansäure (aus 2-Brombenzylbromid, 2,0 g, 8,73 mmol, in 2 Schritten hergestellt), Oxalylchlorid (1,14 ml, 13,1 mmol) und Methylenchlorid (20 ml) wurde in einem Eisbad gekühlt, und N,N-Dimethylformamid (34 μl, 0,44 mmol) wurde tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Konzentrieren im Vakuum ergab 3-(2-Bromphenyl)propanoylchlorid, das in Methylenchlorid aufgenommen und in dem nächsten Schritt als Rohmaterial verwendet wurde. Schritt 2:
Eine Lösung des vorstehenden Säurechlorids (roh, 8,73 mmol) in Methylenchlorid wurde langsam zu einer in einem Eisbad gekühlten Lösung von Diazomethan (aus 5,70 g 1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidin erzeugt) in Ether (40 ml) gegeben. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert und durch Säulenchromatographie (10 → 20% Ethylacetat/Hexan) gereinigt, wobei sich 1-Diazo-4-(2-bromphenyl)butan-2-on (1,88 g, über 2 Schritte 85%) ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,50 (1H, d, Phenyl), 7,24 (2H, m, Phenyl), 7,06 (1H, m, Phenyl), 5,21 (1H, breites s, Diazo), 3,05 (2H, t, benzylisch), 2,62 (2H, m).
Schritt 3:
Eine Lösung des 1-Diazo-4-(2-bromphenyl)butan-2-ons (1,74 g, 6,85 mmol) in Methylenchlorid (30 ml) wurde langsam zu einem Gemisch von Rhodium(II)-acetatdimer (15 mg, 0,068 mmol) in Methylenchlorid (120 ml) unter Rückfluss gegeben. Nachdem die Zugabe beendet war, wurde das Gemisch zusätzliche zwanzig Minuten unter Rückfluss erhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, Trifluoressigsäure (1,5 ml) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt. Die Reaktion wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gestoppt. Die Schichten wurden getrennt, und die Methylenchloridschicht wurde noch einmal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die vereinigten wässrigen Schichten wurden mit Methylenchlorid zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, wobei sich ein braunes Öl ergab. Reinigung durch Säulenchromatographie (10 → 15% Ethylacetat/Hexan) ergab 5-Brom-β-tetralon (1,18 g, Ausbeute 77%) als ein farbloses Öl. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,46 (1H, t, Phenyl), 7,05-7,09 (2H, m, Phenyl), 3,58 (2H, s, benzylisch), 3,22 (2H, t, benzylisch), 2,54 (2H, t). Schritt 4:
Ein Gemisch aus 5-Brom-δ-tetralon (1,18 g, 5,24 mmol), Kaliumcyanid (512 mg, 7,86 mmol), Ammoniumcarbonat (3,0 g, 31,22 mmol), Ethanol (25 ml) und Wasser (5 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 4 Tage in einem Ölbad mit 80°C erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die weiße Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur einige Stunden gerührt. Filtration, gefolgt von Trocknen an der Luft ergaben Hydantoin (1,31 g, 85%). ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 10,71 (1H, breit, NH), 8,28 (1H, breites s, NH), 7,0-7,5 (3H, m, Phenyl). LRMS (Elektrospray): C₁₂H₁₁BrN₂O₂, ber.: 294; beobachtet: 293 (M-H), 295 (M-H). Schritt 5:
Ein Gemisch aus Hydantoin (1,287 g, 4,36 mmol) und Ba(OH)₂·H₂O (4,20 g, 22,2 mmol) in Wasser (25 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 4 Tage in einem Ölbad mit 125°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und unter Verwendung von 4 N Schwefelsäure auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem siedenden Wasserbad eine Stunde gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die weiße Suspension wurde filtriert, und die Niederschläge wurden mit Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate und Waschlösungen wurden im Vakuum auf ~20 ml konzentriert. Neutralisation mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung ergab einen weißen Niederschlag, der abfiltriert, mit Wasser gewaschen und über Nacht im Vakuum getrocknet wurde, wobei sich racemische 5-Brom-2-aminotetralin-2-carbonsäure (893 mg, Ausbeute 76%) ergab. LRMS (Elektrospray): C₁₁H₁₂BrNO₂, ber.: 269; beobachtet: 270 (M+H), 272 (M+H), 268 (M-H), 270 (M-H). Schritt 6:
Ein Gemisch aus racemischer 5-Brom-2-aminotetralin-2-carbonsäure (882 mg, 3,27 mmol), Triethylamin (0,60 ml, 4,30 mmol) und 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 1,32 g, 3,91 mmol) in Acetonitril (30 ml) und Wasser (30 ml) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Eine DC-Analyse des Reaktionsgemisches am nächsten Tag zeigte das Vorhandensein von Aminosäureausgangsmaterial an. 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (0,25 g), Triethylamin (0,6 ml) und Acetonitril (5 ml) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur einen weiteren Tag gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, um den größten Teil des Acetonitrils zu entfernen, mit 10%iger, wässriger Citronensäurelösung auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, und die weiße Emulsion wurde zweimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (mit 2 → 5 → 10% Methanol/Methylenchlorid eluiert) gereinigt wurde, wobei sich racemische Fmoc-5-brom-2-aminotetralin-2-carbonsäure (1,09 g, Ausbeute 68%) als ein weißer Feststoff ergab. HRMS (FAB): C₂₆H₂₂BrNNaO₄ (M+Na), ber.: 514,0630; beobachtet: 514,0643.
BEISPIEL 10
Herstellung von Fmoc-(D,L)-5-chlor-2-aminotetralin-2-carbonsäure (Fmoc-(D,L)-5-ClAtc-OH)
Schritt 1:
Ein Gemisch aus 3-(2-Chlorphenyl)propansäure (5,0 g, 27,1 mmol), Thionylchlorid (10,9 ml, 149 mmol) und Toluol (75 ml) wurde zwei Stunden unter Rückfluss erhitzt. Konzentrieren im Vakuum ergab 3-(2-Chlorphenyl)propanoylchlorid, das in Methylenchlorid aufgenommen und ohne weitere Reinigung in dem nächsten Schritt verwendet wurde. Schritt 2:
Eine Lösung des vorstehenden Säurechlorids (roh, 27,1 mmol) in Methylenchlorid wurde langsam zu einer in einem Eisbad gekühlten Lösung von Diazomethan (aus 17,8 g 1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidin erzeugt) in Ether (120 ml) gegeben. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert, wobei sich 1-Diazo-4-(2-chlorphenyl)butan-2-on (5,87 g, über 2 Schritte > 100%) als ein hellgelbes Öl ergab. Die Verbindung wurde ohne weitere Reinigung in dem nächsten Schritt verwendet. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,05-7,32 (4H, m, Phenyl), 5,13 (1H, breites s, Diazo), 3,00 (2H, t, benzylisch), 2,57 (2H, m). Schritt 3:
Eine Lösung des rohen 1-Diazo-4-(2-bromphenyl)butan-2-ons (5,87 g, theoretisch 27,1 mmol) in Methylenchlorid (50 ml) wurde langsam zu einem Gemisch von Rhodium(II)-acetatdimer (60 mg, 0,27 mmol) in Methylenchlorid (400 ml) unter Rückfluss gegeben. Nachdem die Zugabe beendet war, wurde das Gemisch zusätzliche zwanzig Minuten unter Rückfluss erhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, Trifluoressigsäure (6,0 ml) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur zwei Stunden gerührt. Die Reaktion wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gestoppt. Die Schichten wurden getrennt, und die Methylenchloridschicht wurde noch einmal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die vereinigten wässrigen Schichten wurden mit Methylenchlorid zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, wobei sich ein braunes Öl ergab. Reinigung durch Säulenchromatographie (10 → 15% Ethylacetat/Hexan) ergab 5-Chlor-β-tetralon (3,32 g, Ausbeute für die Schritte a bis c 68%) als ein hellbraunes Öl. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,30 (1H, m, Phenyl), 7,15 (1H, t, Phenyl), 7,05 (1H, d, Phenyl), 3,60 (2H, s, benzylisch), 3,22 (2H, t, benzylisch), 2,56 (2H, t). Schritt 4:
Ein Gemisch aus 5-Chlor-β-tetralon (880 mg, 4,87 mmol), Kaliumcyanid (500 mg, 7,67 mmol), Ammoniumcarbonat (2,85 g, 29,7 mmol), Ethanol (24 ml) und Wasser (6 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 66 Stunden in einem Ölbad mit 80°C erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur einige Stunden gerührt. Filtration, gefolgt von Trocknen an der Luft ergaben Hydantoin (0,92 g, 75%) als einen hellbeigen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 10,70 (1H, breit, NH), 8,25 (1H, breites s, NH), 7,0-7,3 (3H, m, Phenyl). LRMS (Elektrospray): C₁₂H₁₁ClN₂O₂, ber.: 250; beobachtet: 249 (M-H), 251 (M-H). Schritt 5:
Ein Gemisch aus Hydantoin (880 mg, 3,51 mmol) und Ba(OH)₂·H₂O (3,40 g, 18,0 mmol) in Wasser (50 ml, sehr verdünnt) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 2 Tage in einem Ölbad mit 125°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und unter Verwendung von 4 N Schwefelsäure auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem siedenden Wasserbad zwei Stunden gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die weiße Suspension wurde filtriert, und die Niederschläge wurden mit Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate und Waschlösungen wurden im Vakuum auf ~50 ml konzentriert. Neutralisation mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung ergab einen weißen Niederschlag, der abfiltriert, mit Wasser gewaschen und über Nacht im Vakuum getrocknet wurde, wobei sich racemische 5-Chlor-2-aminotetralin-2-carbonsäure (788 mg, Ausbeute 99%) ergab. LRMS (Elektrospray): C₁₁H₁₂ClNO₂, ber.: 225; beobachtet: 226 (M+H), 228 (M+H), 224 (M-H), 226 (M-H). Schritt 6:
Ein Gemisch aus racemischer 5-Chlor-2-aminotetralin-2-carbonsäure (402 mg, 1,78 mmol), Triethylamin (0,38 ml, 2,73 mmol) und 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 904 mg, 2,68 mmol) in Acetonitril (20 ml) und Wasser (20 ml) wurde bei Raumtemperatur zwei Tage gerührt. Eine DC-Analyse des Reaktionsgemisches nach 2 Tagen zeigte das Vorhandensein von Aminosäureausgangsmaterial an. 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (0,12 g) und Triethylamin (0,1 ml) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur einen weiteren Tag gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, um den größten Teil des Acetonitrils zu entfernen, mit 10%iger, wässriger Citronensäurelösung auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, und die weiße Emulsion wurde dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (mit 3 → 6 → 8% Methanol/Methylenchlorid eluiert) gereinigt wurde, wobei sich racemische Fmoc-5-chlor-2-aminotetralin-2-carbonsäure (540 mg, Ausbeute 68%) als ein weißer Feststoff ergab. HRMS (EI): C₂₆H₂₂ClNO₄ (M), ber.: 447,1237; beobachtet: 447,1234.
BEISPIEL 11
Herstellung von Fmoc-(D,L)-5-methoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (Fmoc-(D,L)-5-MeOAtc-OH)
Schritt 1:
Ein Gemisch aus racemischer 5-Methoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (gemäß Obrecht, D., et al., He/v. Chim Acta. 1992, 75, 1666, hergestellt) (802 mg, 3,62 mmol), Triethylamin (0,62 ml, 4,45 mmol) und 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 1,47 g, 4,36 mmol) in Acetonitril (25 ml) und Wasser (25 ml) wurde bei Raumtemperatur 30 Stunden gerührt. Eine DC-Analyse des Reaktionsgemisches zeigte das Vorhandensein von Aminosäureausgangsmaterial an. 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (370 ml) und Triethylamin (0,6 ml) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur weitere 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, um den größten Teil des Acetonitrils zu entfernen, mit 10%iger, wässriger Citronensäurelösung auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, und die weiße Emulsion wurde dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (mit 1 → 3 → 5 → 10% Methanol/Methylenchlorid eluiert) gereinigt wurde, wobei sich racemische Fmoc-5-methoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (1,14 g, Ausbeute 71%) als ein cremefarbener Feststoff ergab. HRMS (FAB): C₂₇H₂₆NO₅ (M+H), ber.: 444,1812; beobachtet: 444,1814.
BEISPIEL 12
Herstellung von Fmoc-(D,L)-5-ethoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (Fmoc-(D,L)-5-EtOAtc-OH)
Schritt 1:
Ein Gemisch aus 1,6-Dihydroxynaphthalin (5,02 g, 31,3 mmol), wasserfreiem Kaliumcarbonat (52,0 g, 376 mmol), N,N-Dimethylformamid (50 ml) und Iodethan (15 ml, 188 mmol) wurde 24 Stunden in einem Ölbad mit 35°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, und der feste Rückstand wurde sorgfältig mit Ethylether gespült. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert, um den größten Teil der Lösungsmittel zu entfernen. Der braune Rückstand wurde zwischen Wasser und Ether verteilt, und die Schichten wurden getrennt. Die Etherschicht wurde mit Wasser gewaschen. Die vereinigten wässrigen Schichten wurden mit Ether zurückextrahiert. Die Etherextrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben einen rohen, braunen Feststoff (6,74 g, Ausbeute 99%). Umkristallisation des Rohprodukts aus heißem Methanol ergab 1,6-Diethoxynaphthalin (4,36 g, Ausbeute 64%, erste Menge) als einen hellbraunen Feststoff. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 8,20 (1H, d, Phenyl), 7,06-7,36 (4H, m, Phenyl), 6,66 (1H, dd, Phenyl), 4,10-4,23 (4H, 2 Sätze von q, 2CH₂), 1,45-1,56 (6H, 2 Sätze von t, 2CH₃). Schritt 2:
Kleine Natriummetallstücke (6,8 g, 296 mmol) wurden während 60 Minuten vorsichtig zu einer unter Rückfluss erhitzten Lösung von 1,6-Diethoxynaphthalin (4,15 g, 19,2 mmol) in absolutem Ethanol (100 ml) gegeben. Das Gemisch wurde weitere 90 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Eine DC zeigte das Vorhandensein von nichtumgesetztem Ausgangsmaterial an. Zusätzliches Natriummetall (1,0 g, 43,5 mmol) wurde zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde weitere 60 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Wasser gelöscht und mit konzentrierter Salzsäure angesäuert. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert, um den größten Teil des Ethanols zu entfernen. Das wässrige Gemisch wurde dreimal mit Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben einen braunen Feststoff, der in Ethanol/Wasser, 1:1 (200 ml) gelöst wurde, und dann wurde p-Toluolsulfonsäure (400 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde 210 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Zusätzliche p-Toluolsulfonsäure (100 mg) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde weitere 60 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde der größte Teil des Ethanols unter reduziertem Druck entfernt. Das wässrige Gemisch wurde dreimal mit Ether extrahiert, und die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein braunes Öl, das durch Säulenchromatographie (7% Ethylacetat/Hexan) gereinigt wurde, wobei sich 5-Ethoxy-β-tetralon (2,43 g, Ausbeute 67%) als ein hellgelbes Öl ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,15 (1H, t, Phenyl), 6,76 (1H, d, Phenyl), 6,72 (1H, d, Phenyl), 4,05 (2H, q, CH₂), 3,56 (2H, s, benzylisch), 3,10 (2H, t, benzylisch), 2,53 (2H, t), 1,44 (3H, t, CH₃). Schritt 3:
Ein Gemisch aus 5-Ethoxy-β-tetralon (2,23 g, 11,7 mmol), Kaliumcyanid (1,20 g, 18,4 mmol), Ammoniumcarbonat (6,75 g, 70,2 mmol), Ethanol (80 ml) und Wasser (20 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 3 Tage in einem Ölbad mit 80°C erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur einige Stunden gerührt. Filtration, gefolgt von Trocknen an der Luft ergaben Hydantoin (2,69 g, 88%) als einen beigen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 10,65 (1H, breites s, NH), 8,22 (1H, breites s, NH), 7,06 (1H, t, Phenyl), 6,75 (1H, d, Phenyl), 6,65 (1H, d, Phenyl), 3,98 (2H, q, CH₂), 1,32 (3H, t, CH₃). LRMS (Elektrospray): C₁₄H₁₆N₂O₃, ber.: 259; beobachtet: 258 (M-H). Schritt 4:
Ein Gemisch aus Hydantoin (2,57 g, 9,87 mmol) und Ba(OH)₂·H₂O (9,40 g, 49,6 mmol) in Wasser (200 ml, sehr verdünnt) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 39 Stunden in einem Ölbad mit 105°C erwärmt. Zusätzliches Ba(OH)₂·H₂O (9,40 g, 49,6 mmol) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde weitere 21 Stunden in einem Ölbad mit 125°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und unter Verwendung von 4 N Schwefelsäure auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem siedenden Wasserbad eine Stunde gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die weiße Suspension wurde filtriert, und die Niederschläge wurden mit Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate und Waschlösungen wurden im Vakuum auf ~75 ml konzentriert. Neutralisation mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung ergab einen weißen Niederschlag, der abfiltriert, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet wurde, wobei sich racemische 5-Ethoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (2,34 g, quantitative Ausbeute) als ein hellbeiger Feststoff ergab. LRMS (Elektrospray): C₁₃H₁₇NO₃, ber.: 235; beobachtet: 236 (M+H), 234 (M-H). Schritt 5:
Ein Gemisch aus racemischer 5-Ethoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (2,22 g, 9,44 mmol), Triethylamin (2,00 ml, 14,3 mmol) und 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 4,81 g, 14,3 mmol) in Acetonitril (75 ml) und Wasser (75 ml) wurde bei Raumtemperatur zwei Tage gerührt. Eine DC-Analyse des Reaktionsgemisches zeigte das Vorhandensein von Aminosäureausgangsmaterial an. 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (645 mg) und Triethylamin (1,0 ml) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur einen weiteren Tag gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, um den größten Teil des Acetonitrils zu entfernen, mit 10%iger, wässriger Citronensäurelösung auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, und die weiße Emulsion wurde dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (mit 3 → 5 → 10% Methanol/Methylenchlorid eluiert) gereinigt wurde, wobei sich racemische Fmoc-5-ethoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (4,66 g, > quantitative Ausbeute) als ein weißer Feststoff ergab. HRMS (FAB): C₂₈H₂₈NO₅ (M+H), ber.: 458,1967; beobachtet: 458,1985.
BEISPIEL 13
Herstellung von Fmoc-(D,L)-5-isopropoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (Fmoc-(D,L)-5-iPrOAtc-OH)
Schritt 1:
Ein Gemisch aus 6-Methoxy-1-tetralon (5,07 g, 28,8 mmol) und 10% Pd/C (3,53 g, 3,32 mmol) in trockenemp-Cymol (250 ml) wurde unter Argon 38 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, über Celite filtriert, und der Rückstand wurde sorgfältig mit p-Cymol gespült. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt und zweimal mit 1 N Natriumhydroxidlösung (2 × 70 ml) extrahiert. Die vereinigten wässrigen Extrakte wurden mit 6 N Salzsäure auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert und dreimal mit Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben rohes 5-Hydroxy-6-methoxynaphthalin (2,31 g, Ausbeute 46%) als einen hellbraunen Feststoff, der ohne weitere Reinigung in dem nächsten Schritt verwendet wurde. LRMS (Elektrospray): C₁₁H₁₀O₂, ber.: 174; beobachtet: 173 (M-H). Schritt 2:
Ein Gemisch aus 5-Hydroxy-6-methoxynaphthalin (2,10 g, 12,1 mmol), Cäsiumcarbonat (19,7 g, 60,5 mmol), N,N-Dimethylformamid (12 ml) und 2-Brompropan (3,50 ml, 36,9 mmol) wurde über Nacht in einem Ölbad mit 40°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, und der feste Rückstand wurde sorgfältig mit Ethylether gespült. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert, um den größten Teil der Lösungsmittel zu entfernen. Der braune Rückstand wurde zwischen Wasser und Ether verteilt, und die Schichten wurden getrennt. Die Etherschicht wurde mit Wasser gewaschen. Die vereinigten wässrigen Schichten wurden mit Ether zurückextrahiert. Die Etherextrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein Rohmaterial, das durch Säulenchromatographie (2,5 → 5% Ethylacetat/Hexan) gereinigt wurde, wobei sich 1-Isopropoxy-6-methoxynaphthalin (2,23 g, Ausbeute 86%) als ein hellbraunes Öl ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 8,17 (1H, d, Phenyl), 7,05-7,38 (4H, m, Phenyl), 6,72 (1H, dd, Phenyl), 4,73 (1H, m, CH von iPr), 3,92 (3H, s, OCH₃), 1,42 (6H, d, 2CH₃ von iPr). Schritt 3:
Kleine Natriummetallstücke (3,6 g, 157 mmol) wurden während 45 Minuten vorsichtig zu einer unter Rückfluss erhitzten Lösung von 1-Isopropoxy-6-methoxynaphthalin (2,23 g, 10,3 mmol) in absolutem Ethanol (50 ml) gegeben. Das Gemisch wurde weitere 120 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Wasser gelöscht und mit konzentrierter Salzsäure angesäuert. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert, um den größten Teil des Ethanols zu entfernen. Das wässrige Gemisch wurde dreimal mit Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein rötliches Öl, das in Ethanol/Wasser, 1:1 (90 ml) gelöst wurde, und dann wurde p-Toluolsulfonsäure (200 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde 60 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde der größte Teil des Ethanols unter reduziertem Druck entfernt. Das wässrige Gemisch wurde zweimal mit Ether extrahiert, und die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein rötliches Öl, das durch Säulenchromatographie (8 → 15% Ethylacetat/Hexan) gereinigt wurde, wobei sich 5-Isopropoxy-β-tetralon (1,37 g, Ausbeute 65 %) als ein farbloses Öl ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,16 (1H, t, Phenyl), 6,78 (1H, d, Phenyl), 6,71 (1H, d, Phenyl), 4,53 (1H, m, CH von iPr), 3,56 (2H, s, benzylisch), 3,08 (2H, t, benzylisch), 2,50 (2H, t), 1,37 (6H, d, 2CH₃ von iPr). Schritt 4:
Ein Gemisch aus 5-Isopropoxy-β-tetralon (1,37 g, 6,71 mmol), Kaliumcyanid (660 mg, 10,1 mmol), Ammoniumcarbonat (3,87 g, 40,3 mmol), Ethanol (44 ml) und Wasser (9 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 42 Stunden in einem Ölbad mit 80°C erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur einige Stunden gerührt. Filtration, gefolgt von Trocknen an der Luft ergaben Hydantoin (1,64 g, 89%). Schritt 5:
Ein Gemisch aus Hydantoin (1,64 g, 5,98 mmol) und Ba(OH)₂·H₂O (5,66 g, 29,9 mmol) in Wasser (25 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 70 Stunden in einem Ölbad mit 100°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und unter Verwendung von 4 N Schwefelsäure auf einen pH-Wert von ~7 neutralisiert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem siedenden Wasserbad eine Stunde gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Sie wurde mit 1 N Natriumhydroxidlösung basisch eingestellt, und die weiße Suspension wurde filtriert, und die Niederschläge wurden mit Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate und Waschlösungen wurden im Vakuum auf ~75 ml konzentriert. Neutralisation mit konzentrierter Salzsäurelösung ergab einen weißen Niederschlag, der abfiltriert, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet wurde, wobei sich racemische 5-Isopropoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (3,48 g, feucht und anorganisches Salz enthaltend, > quantitative Ausbeute) ergab. LRMS (Elektrospray): C₁₄H₁₉NO₃, ber.: 249; beobachtet: 248 (M-H).
Schritt 6:
Ein Gemisch aus racemischer 5-Isopropoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (3,48 g, theoretisch 5,98 mmol), Triethylamin (1,10 ml, 7,89 mmol) und 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 2,62 g, 7,77 mmol) in Acetonitril (30 ml) und Wasser (30 ml) wurde bei Raumtemperatur einen Tag gerührt. Eine DC-Analyse des Reaktionsgemisches zeigte das Vorhandensein von Aminosäureausgangsmaterial an. 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (500 mg) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur einen weiteren Tag gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, um den größten Teil des Acetonitrils zu entfernen, mit 10%iger, wässriger Citronensäurelösung auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, und die weiße Emulsion wurde dreimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (mit 1 → 2 → 5 → 8% Methanol/Methylenchlorid eluiert) gereinigt wurde, wobei sich racemische Fmoc-5-isopropoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (0,50 g, Ausbeute über 2 Schritte 18%) als ein weißer Feststoff ergab. HRMS (FAB): C₂₉H₃₀NO₅ (M+H), ber.: 472,2124; beobachtet: 472,2117.
BEISPIEL 14
Herstellung von Fmoc-(D,L)-5-dimethylamino-2-aminotetralin-2-carbonsäure (Fmoc-(D,L)-5-DmaAtc-OH)
Schritt 1:
Ein Gemisch aus 5-Amino-2-naphthol (2,97 g, 18,6 mmol), Kaliumcarbonat (37,0 g, 268 mmol), Aceton (100 ml) und Iodmethan (10,0 ml, 161 mmol) wurde 2 Tage unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, filtriert, und der feste Rückstand wurde sorgfältig mit Ethylether und Aceton gespült. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert, um den größten Teil der Lösungsmittel zu entfernen. Der braune Rückstand wurde zwischen Wasser und Ether verteilt, und die Schichten wurden getrennt. Die Etherschicht wurde mit Wasser gewaschen. Die vereinigten wässrigen Schichten wurden mit Ether zurückextrahiert. Die Etherextrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben rohes 1-Dimethylamino-6-methoxynaphthalin (3,54 g, Ausbeute 94%) als ein dunkelbraunes Öl. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 8,16 (1H, t, Phenyl), 7,30-7,50 (2H, m, aromatisch), 7,10-7,20 (2H, m, aromatisch), 6,96 (1H, d, aromatisch), 3,93 (3H, s, OCH₃), 2,89 (6H, s, N(CH₃)₂). Schritt 2:
Kleine Natriummetallstücke (5,76 g, 251 mmol) wurden während 45 Minuten vorsichtig zu einer unter Rückfluss erhitzten Lösung von 1-Dimethylamino-6-methoxynaphthalin (2,99 g, 14,9 mmol) in absolutem Ethanol (100 ml) gegeben. Das Gemisch wurde weitere 45 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Eine DC zeigte das Vorhandensein von nichtumgesetzten Ausgangsmaterial an. Zusätzliches Natriummetall (7,09 g, 308 mmol) wurde zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluss erhitzt, bis eine DC den vollständigen Verbrauch des gesamten Ausgangsmaterials anzeigte. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und der pH-Wert wurde mit konzentrierter Salzsäure auf ~9 bis 10 eingestellt. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert, um den größten Teil des Ethanols zu entfernen. Das wässrige Gemisch wurde viermal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit gesättigtem Natriumhydrogencarbonat gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein dunkelbraunes Öl, das in Ethanol/Wasser, 1:1 (150 ml) gelöst wurde, und dann wurde p-Toluolsulfonsäure (3,05 g) zugegeben, um den pH-Wert auf ~2 bis 3 einzustellen. Das Gemisch wurde 3 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde der größte Teil des Ethanols unter reduziertem Druck entfernt. Der pH-Wert des Gemisches wurde mit 2 N Natriumhydroxidlösung auf ~9 bis 10 eingestellt, und das wässrige Gemisch wurde viermal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein dunkelbraunes Öl, das durch Säulenchromatographie (15% Ethylacetat/Hexan) gereinigt wurde, wobei sich 5-Dimethylamino-β-tetralon (834 mg, Ausbeute 30%) als ein braunes Öl ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,18 (1H, t, Phenyl), 6,96 (1H, d, Phenyl), 6,82 (1H, d, Phenyl), 3,57 (2H, s, benzylisch), 3,10 (2H, t, benzylisch), 2,70 (6H, s, N(CH₃)₂), 2,48 (2H, t). LRMS (Elektrospray): C₁₂H₁₅NO, ber.: 189; beobachtet: 190 (M+H). Schritt 3:
Ein Gemisch aus 5-Dimethylamino-β-tetralon (0,97 g, 5,13 mmol), Kaliumcyanid (510 mg, 7,82 mmol), Ammoniumcarbonat (2,98 g, 31,0 mmol), Ethanol (40 ml) und Wasser (10 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 29 Stunden in einem Ölbad mit 80°C erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die dunkelbraune Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur einige Stunden gerührt. Filtration, gefolgt von Trocknen an der Luft ergaben Hydantoin (885 mg, 67%) als einen dunkelbraunen Feststoff. LRMS (Elektrospray): C₁₄H₁₇N₃O₂, ber.: 259; beobachtet: 260 (M+H), 258 (M-H). Schritt 4:
Di-t-butyldicarbonat (2,51 g, 11,5 mmol), Triethylamin (0,50 ml, 3,59 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (17 mg, 0,14 mmol) wurden zu einer Lösung von Hydantoin (832 mg, 3,21 mmol) in THF (25 ml) gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, und das Rohmaterial wurde unter Verwendung von Säulenchromatographie (15% Ethylacetat/Hexan) gereinigt, wobei sich Bis-Boc-Hydantoin (1,02 g, Ausbeute 69%) als ein gelber Schaum ergab. LRMS (Elektrospray): C₂₄H₃₃N₃O₆, ber.: 459; beobachtet: 919 (2M+H). Schritt 5:
1 N Natriumhydroxidlösung (20 ml) wurde zu einer Lösung von Bis-Boc-Hydantoin (988 mg, 2,15 mmol) in Dimethoxyethan (15 ml) gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, um den größten Teil der Lösungsmittel zu entfernen, und Wasser wurde zu dem so erhaltenen hellbraunen Gemisch gegeben. Das wässrige Gemisch wurde zweimal mit Methylenchlorid und zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die wässrige Schicht wurde auf 20 ml konzentriert, mit 1 N Salzsäure auf einen pH-Wert von ~7 neutralisiert, wobei sich eine Aufschlämmung ergab. Die Aufschlämmung wurde filtriert, wobei sich racemische 5-Dimethylamino-2-aminotetralin-2-carbonsäure (1,33 g, noch feucht, > quantitative Ausbeute) als ein cremefarbener Feststoff ergab. LRMS (Elektrospray): C₁₃H₁₈N₂O₂, ber.: 234; beobachtet: 235 (M+H). Schritt 6:
Ein Gemisch aus 5-Dimethylamino-2-aminotetralin-2-carbonsäure (1,33 g, theoretisch 2,15 mmol), Triethylamin (0,40 ml, 2,87 mmol) und 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 0,92 g, 2,73 mmol) in Acetonitril (10 ml) und Wasser (10 ml) wurde bei Raumtemperatur einen Tag gerührt. Eine DC-Analyse des Reaktionsgemisches zeigte das Vorhandensein von Aminosäureausgangsmaterial an. 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (400 mg) und Triethylamin (0,2 ml) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur einen weiteren Tag gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, um den größten Teil des Acetonitrils zu entfernen, und das nahezu neutrale Gemisch wurde dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein Rohmaterial, das durch Säulenchromatographie (mit 2,5 → 6 → 10 → 15 → 20% Methanol/Methylenchlorid eluiert) gereinigt wurde, wobei sich racemische Fmoc-5-dimethylamino-2-aminotetralin-2-carbonsäure (602 mg, Ausbeute über 2 Schritte 61%) als ein cremefarbener Feststoff ergab. HRMS (FAB): C₂₈H₂₈N₂O₄ (M), ber.: 456,2049; beobachtet: 456,2056.
BEISPIEL 15
Herstellung von Fmoc-(D,L)-5-methyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (Fmoc-(D,L)-5-MeAtc-OH)
Schritt 1:
Ein Gemisch aus 2-Methylhydrozimtsäure (3,0 g, 18,3 mmol), Oxalylchlorid (3,19 ml, 36,6 mmol) und Methylenchlorid (30 ml) wurde in einem Eisbad gekühlt, und N,N-Dimethylformamid (0,14 ml, 1,81 mmol) wurde tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Konzentrieren im Vakuum ergab 3-(2-Methylphenyl)propanoylchlorid, das in Methylenchlorid aufgenommen und in dem nächsten Schritt als Rohmaterial verwendet wurde. Schritt 2:
Eine Lösung des vorstehenden Säurechlorids (roh, 18,3 mmol) in Methylenchlorid wurde langsam zu einer in einem Eisbad gekühlten Lösung von Diazomethan (aus 11,9 g 1-Methyl- 3-nitro-1-nitrosoguanidin erzeugt) in Ether (80 ml) gegeben. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert und durch Säulenchromatographie (10 → 20% Ethylacetat/Hexan) gereinigt, wobei sich 1-Diazo-4-(2-methylphenyl)butan-2-on (2,08 g, über 2 Schritte 60%) als ein hellgelbes Öl ergab. Schritt 3:
Eine Lösung des 1-Diazo-4-(2-methylphenyl)butan-2-ons (2,08 g, 11,1 mmol) in Methylenchlorid (50 ml) wurde während 180 Minuten langsam zu einem Gemisch von Rhodium(II)-acetatdimer (24 mg, 0,109 mmol) in Methylenchlorid (200 ml) unter Rückfluss gegeben. Nachdem die Zugabe beendet war, wurde das Gemisch zusätzliche zwanzig Minuten unter Rückfluss erhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, Trifluoressigsäure (2,40 ml) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt. Die Reaktion wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gestoppt. Die Schichten wurden getrennt, und die Methylenchloridschicht wurde noch einmal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die vereinigten wässrigen Schichten wurden mit Methylenchlorid zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, wobei sich ein rohes, braunes Öl ergab. Reinigung durch Säulenchromatographie (15% Ethylacetat/Hexan) ergab 5-Methyl-β-tetralon (1,48 g, Ausbeute 84%) als ein hellbraunes Öl. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 6,90-7,20 (3H, m, Phenyl), 3,58 (2H, s, benzylisch), 3,03 (2H, t, benzylisch), 2,55 (2H, t), 2,34 (3H, s, CH₃). Schritt 4:
Ein Gemisch aus 5-Methyl-β-tetralon (1,48 g, 9,24 mmol), Kaliumcyanid (902 mg, 13,9 mmol), Ammoniumcarbonat (5,33 g, 55,5 mmol), Ethanol (45 ml) und Wasser (9 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 3 Tage in einem Ölbad mit 80°C erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur einige Stunden gerührt. Filtration, gefolgt von Trocknen an der Luft ergaben rohes Hydantoin (1,81 g, Ausbeute 85%) als einen beigen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 10,66 (1H, breites s, NH), 8,22 (1H, breites s, NH), 6,85-7,05 (3H, m, Phenyl), 2,17 (3H, s, CH₃). Schritt 5:
Ein Gemisch aus Hydantoin (1,80 g, 7,82 mmol) und Ba(OH)₂·H₂O (7,40 g, 39,1 mmol) in Wasser (28 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 88 Stunden in einem Ölbad mit 125°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und unter Verwendung von 4 N Schwefelsäure auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem siedenden Wasserbad eine Stunde gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die weiße Suspension wurde filtriert, und die Niederschläge wurden mit Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate und Waschlösungen wurden im Vakuum auf ~50 ml konzentriert. Neutralisation mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung ergab einen weißen Niederschlag, der abfiltriert, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet wurde, wobei sich racemische 5-Methyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (1,05 g, Ausbeute 65%) als ein beiger Feststoff ergab. LRMS (Elektrospray): C₁₂H₁₅NO₂, ber.: 205; beobachtet: 206 (M+H). Schritt 6:
Ein Gemisch aus racemischer 5-Methyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (1,05 g, 5,12 mmol), Triethylamin (0,93 ml, 6,67 mmol) und 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 2,24 g, 6,64 mmol) in Acetonitril (30 ml) und Wasser (30 ml) wurde bei Raumtemperatur 2 Tage gerührt. Eine DC-Analyse des Reaktionsgemisches zeigte das Vorhandensein von Aminosäureausgangsmaterial an. 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (520 mg) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur weitere 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, um den größten Teil des Acetonitrils zu entfernen, mit 10%iger, wässriger Citronensäurelösung auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, und die weiße Emulsion wurde zweimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (mit 2 → 5 → 8% Methanol/Methylenchlorid eluiert) gereinigt wurde, wobei sich racemische Fmoc-5-methyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (1,62 g, Ausbeute 74%) als ein hellbrauner Feststoff ergab. HRMS (FAB): C₂₇H₂₆NO₄ (M+H), ber.: 428,1862; beobachtet: 428,1844.
BEISPIEL 16
Herstellung von Fmoc-(D,L)-5-ethyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (Fmoc-(D,L)-5-EtAtc-OH)
Schritt 1:
Ein Gemisch aus 3-(2-Ethylphenyl)propansäure (in 3 Schritten aus 1-Ethyl-2-iodbenzol hergestellt, 4,24 g, 23,8 mmol), Thionylchlorid (9,50 ml, 130 mmol) und Toluol (100 ml) wurde 2 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Konzentrieren im Vakuum ergab 3-(2-Ethylphenyl)propanoylchlorid, das in Methylenchlorid aufgenommen und in dem nächsten Schritt als Rohmaterial verwendet wurde. Schritt 2:
Eine Lösung des vorstehenden Säurechlorids (roh, 23,8 mmol) in Methylenchlorid wurde langsam zu einer in einem Eisbad gekühlten Lösung von Diazomethan (aus 15,6 g 1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidin erzeugt) in Ether (100 ml) gegeben. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert und durch Säulenchromatographie (10 → 20% Ethylacetat/Hexan) gereinigt, wobei sich 1-Diazo-4-(2-ethylphenyl)butan-2-on (3,47 g, über 2 Schritte 72%) ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,1-7,25 (4H, m, Phenyl), 5,21 (1H, breites s, Diazo), 2,97 (2H, m, CH₂ von Ethyl), 1,20 (3H, t, CH₃). Schritt 3:
Eine Lösung des 1-Diazo-4-(2-ethylphenyl)butan-2-ons (3,47 g, 17,2 mmol) in Methylenchlorid (50 ml) wurde während 90 Minuten langsam zu einem Gemisch von Rhodium(II)-acetatdimer (38 mg, 0,172 mmol) in Methylenchlorid (300 ml) unter Rückfluss gegeben. Nachdem die Zugabe beendet war, wurde das Gemisch zusätzliche zwanzig Minuten unter Rückfluss erhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, Trifluoressigsäure (3,75 ml) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur eine Stunde gerührt. Die Reaktion wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gestoppt. Die Schichten wurden getrennt, und die Methylenchloridschicht wurde noch einmal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die vereinigten wässrigen Schichten wurden mit Methylenchlorid zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, wobei sich rohes 5-Ethyl-β-tetralon (3,09 g, > quantitative Ausbeute) als ein rötlichbraunes Öl ergab. Die Verbindung wurde ohne weitere Reinigung in dem nächsten Schritt verwendet. ¹H- NMR (CDCl₃): δ 6,9-7,2 (3H, m, Phenyl), 3,58 (2H, s, benzylisch), 3,08 (2H, s, benzylisch), 2,70 (2H, q, CH₂ von Ethyl), 2,52 (2H, t, benzylisch), 1,20 (3H, t, CH₃ von Ethyl). Schritt 4:
Ein Gemisch aus 5-Ethyl-β-tetralon (3,09 g, 17,7 mmol), Kaliumcyanid (1,73 g, 26,6 mmol), Ammoniumcarbonat (10,2 g, 106 mmol), Ethanol (80 ml) und Wasser (16 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 48 Stunden in einem Ölbad mit 80°C erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die weiße Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur einige Stunden gerührt. Filtration, gefolgt von Trocknen an der Luft ergaben Hydantoin (3,85 g, Ausbeute über 2 Schritte 92%) als einen hellbeigen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 10,67 (1H, breites s, NH), 8,26 (1H, breites s, NH), 6,8-7,1 (3H, m, Phenyl), 1,13 (3H, t, CH₃). LRMS (Elektrospray): C₁₄H₁₆N₂O₂, ber.: 244; beobachtet: 243 (M-H). Schritt 5:
Ein Gemisch aus Hydantoin (1,00 g, 4,09 mmol) und Ba(OH)₂·H₂O (4,00 g, 21,1 mmol) in Wasser (20 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 48 Stunden in einem Ölbad mit 125°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und unter Verwendung von 4 N Schwefelsäure auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem siedenden Wasserbad zwei Stunden gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die weiße Suspension wurde filtriert, und die Niederschläge wurden mit Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate und Waschlösungen wurden im Vakuum auf ~50 ml konzentriert. Neutralisation mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung ergab einen weißen Niederschlag, der abfiltriert, mit Wasser gewaschen und über Nacht im Vakuum getrocknet wurde, wobei sich racemische 5-Ethyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (796 mg, Ausbeute 89%) ergab. LRMS (Elektrospray): C₁₃H₁₇NO₂, ber.: 219; beobachtet: 220 (M+H). Schritt 6:
Ein Gemisch aus racemischer 5-Ethyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (765 mg, 3,49 mmol), Triethylamin (1,0 ml, 7,17 mmol) und 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 1,79 g, 5,31 mmol) in Acetonitril (40 ml) und Wasser (40 ml) wurde bei Raumtemperatur 2 Tage gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, um den größten Teil des Acetonitrils zu entfernen, mit 10%iger, wässriger Citronensäurelösung auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, und die weiße Emulsion wurde zweimal mit Methylenchlorid und zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die Methylenchloridextrakte wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Ethylacetatextrakte wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (mit 2 → 5 → 8% Methanol/Methylenchlorid eluiert) gereinigt wurde, wobei sich racemische Fmoc-5-ethyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (330 mg, Ausbeute 21%) als ein weißer Feststoff ergab. HRMS (FAB): C₂₈H₂₈NO₄ (M+H), ber.: 442,2018; beobachtet: 442,2010.
BEISPIEL 17
Herstellung von Fmoc-(D,L)-5-isopropyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (Fmoc-(D,L)-5-iPrAtc-OH)
Schritt 1:
Ein Gemisch aus 3-(2-Isopropylphenyl)propansäure (in 3 Schritten aus 1-Isopropyl-2-iodbenzol hergestellt, 2,01 g, 10,5 mmol), Thionylchlorid (4,30 ml, 59,0 mmol) und Toluol (40 ml) wurde 2 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Konzentrieren im Vakuum ergab 3-(2-Isopropylphenyl)propanoylchlorid, das in Methylenchlorid aufgenommen und in dem nächsten Schritt als Rohmaterial verwendet wurde. Schritt 2:
Eine Lösung des vorstehenden Säurechlorids (roh, 10,5 mmol) in Methylenchlorid wurde langsam zu einer in einem Eisbad gekühlten Lösung von Diazomethan (aus 6,95 g 1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidin erzeugt) in Ether (50 ml) gegeben. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert und durch Säulenchromatographie (20% Ethylacetat/Hexan) gereinigt, wobei sich 1-Diazo-4-(2-isopropylphenyl)butan-2-on (1,87 g, über 2 Schritte 82%) als ein hellgelbes Öl ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,10-7,30 (4H, m, Phenyl), 5,21 (1H, breites s, Diazo), 3,15 (1H, m, CH von iPr), 3,00 (2H, t, benzylisch), 2,57 (2H, m), 1,24 (6H, d, 2CH₃ von iPr). Schritt 3:
Eine Lösung des 1-Diazo-4-(2-bromphenyl)butan-2-ons (1,87 g, 8,65 mmol) in Methylenchlorid (25 ml) wurde während 60 Minuten langsam zu einem Gemisch von Rhodium(II)-acetatdimer (20 mg, 0,091 mmol) in Methylenchlorid (160 ml) unter Rückfluss gegeben. Nachdem die Zugabe beendet war, wurde das Gemisch zusätzliche fünfzehn Minuten unter Rückfluss erhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, Trifluoressigsäure (1,90 ml) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 45 Minuten gerührt. Die Reaktion wurde mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gestoppt. Die Schichten wurden getrennt, und die Methylenchloridschicht wurde noch einmal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Die vereinigten wässrigen Schichten wurden mit Methylenchlorid zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, wobei sich ein rohes, braunes Öl ergab. Reinigung durch Säulenchromatographie (5% Ethylacetat/Hexan) ergab 5-Isopropyl-β-tetralon (1,57 g, Ausbeute 96%) als ein hellgelbes Öl. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 6,93-7,22 (3H, m, Phenyl), 3,59 (2H, s, benzylisch), 3,24 (1H, m, CH von iPr), 3,12 (2H, t, benzylisch), 2,52 (2H, t), 1,27 (6H, d, 2CH₃ von iPr). Schritt 4:
Ein Gemisch aus 5-Isopropyl-β-tetralon (1,57 g, 8,34 mmol), Kaliumcyanid (0,82 g, 12,6 mmol), Ammoniumcarbonat (4,81 g, 50,1 mmol), Ethanol (40 ml) und Wasser (10 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 48 Stunden in einem Ölbad mit 80°C erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die braune Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur einige Stunden gerührt. Filtration, gefolgt von Trocknen an der Luft ergaben rohes Hydantoin als einen beigen Feststoff, der ohne weitere Reinigung in dem nächsten Schritt verwendet wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 10,69 (1H, breites s, NH), 8,30 (1H, breites s, NH), 6,85-7,32 (3H, m, Phenyl), 1,15 (6H, t, CH₃). LRMS (Elektrospray): C₁₅H₁₈N₂O₂, ber.: 258; beobachtet: 539 (2M+Na). Schritt 5:
Ein Gemisch aus Hydantoin (roh, theoretisch 8,34 mmol) und Ba(OH)₂·H₂O (7,90 g, 41,7 mmol) in Wasser (40 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 38 Stunden in einem Ölbad mit 125°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und unter Verwendung von 4 N Schwefelsäure auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem siedenden Wasserbad zwei Stunden gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die weiße Suspension wurde filtriert, und die Niederschläge wurden mit Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate und Waschlösungen wurden im Vakuum auf ~50 ml konzentriert. Neutralisation mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung ergab einen weißen Niederschlag, der abfiltriert, mit Wasser gewaschen und über Nacht im Vakuum getrocknet wurde, wobei sich racemische 5-Isopropyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (1,23 g, Ausbeute über 2 Schritte 63%) als ein beiger Feststoff ergab. LRMS (Elektrospray): C₁₄H₁₉NO₂, ber.: 233; beobachtet: 232 (M-H). Schritt 6:
Ein Gemisch aus racemischer 5-Isopropyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (250 mg, 1,07 mmol), Triethylamin (1,2 ml, 8,61 mmol) und 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 2,70 g, 9,00 mmol) in Acetonitril (30 ml) und Wasser (30 ml) wurde bei Raumtemperatur 2 Tage gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, um den größten Teil des Acetonitrils zu entfernen, mit 10%iger, wässriger Citronensäurelösung auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, und die weiße Emulsion wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (mit 2 → 5 → 8% Methanol/Methylenchlorid eluiert) gereinigt wurde, wobei sich racemische Fmoc-5-isopropyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (208 mg, Ausbeute 43%) als ein cremefarbener Schaum ergab. HRMS (FAB): C₂₉H₃₀NO₄ (M+H), ber.: 456,2175; beobachtet: 456,2184.
BEISPIEL 18
Herstellung von Fmoc-4-amino-1-phenylpiperidin-4-carbonsäure (Fmoc-Appc-OH)
Schritt 1:
Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (91 mg, 0,1 mmol) und Tri-o-tolylphosphin (180 mg, 0,591 mmol) wurden zu einer Lösung von Iodbenzol (6,37 g, 3,5 ml, 31,2 mmol), 1,4-Dioxa-8-azaspiro[4.5]decan (10,32 g, 9,3 ml, 72,2 mmol, 2,3 Äq.) und Natrium-tert-butoxid (8,0 g, 83,3 mmol, 2,7 Äq.) in trockenem Dioxan (120 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 26 h auf 90°C erwärmt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wobei sich ein braunes Öl ergab. Dieses Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 bis 75/25) gereinigt, wobei das reine Produkt als ein schwach gelber Feststoff (6,08 g, 89%) bereitgestellt wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,25 (ddt, 2H), 6,95 (dd, 2H), 6,84 (t, 1H), 4,00 (s, 4H), 3,32 (t, 4H) und 1,84 (t, 4H); MS (Elektrospray) m/e 220 (M+H), ber. für C₁₃H₁₇NO₂, 219. Schritt 2:
6 N Salzsäure (50 ml) wurde zu einer Lösung des Ketals (3,22 g, 15,16 mmol) in Aceton (100 ml) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter Rückfluss erhitzt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde in EtOAc aufgenommen und mit wässriger 6 N NaOH-Lösung neutralisiert. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 80/20 60/40) gereinigt, wobei sich das Produkt als ein gelbes Öl (2,58 g, 97%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 176 (M+H), ber. für C₁₁H₁₃NO, 175. Schritt 3:
Ammoniumcarbonat (12,9 g, 134,3 mmol, 9 Äq.) und Kaliumcyanid (2,11 g, 32,5 mmol, 2 Äq.) wurden zu einer Lösung des Ketons (2,53 g, 14,46 mmol) in Ethanol (75 ml) und Wasser (25 ml) in einer Glasdruckflasche gegeben. Das Gemisch wurde 18 h auf 80 bis 90°C erwärmt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, und der Rückstand wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc (4 ×) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wobei sich das spektroskopisch reine Hydantoin als ein weißer Feststoff (3,36 g, Ausbeute 95%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 246 (M+H), ber. für C₁₃H₁₅N₃O₂, 245. Schritt 4:
Das Hydantoin (3,36 g) wurde in wässrigem NaOH (6 N, 100 ml) suspendiert und 2 bis 3 Tage auf 130°C erwärmt. Nach Beendigung der Hydrolyse (gemäß HPLC) wurde das Reaktionsgemisch mit konz. HCl bis zu schwach sauer (pH ~6) neutralisiert. Die so erhaltene Aufschlämmung wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich 4-Amino-1-phenylpiperidin-4-carbonsäure (APPC) als ein weißer Feststoff (5,26 g, Ausbeute > 100%, feucht und mit anorganischem Salz verunreinigt) ergab, der bei der HPLC einen einzelnen Peak zeigte und direkt für den nächsten Schritt verwendet wurde. MS (Elektrospray) m/e 221 (M+H), ber. für C₁₂H₁₆N₂O₂, 220. Schritt 5:
Die rohe Aminosäure APPC aus dem letzten Schritt wurde in Dioxan (80 ml) und wässrigem, 10%igem Na₂CO₃ (40 ml) suspendiert, mit Fmoc-Cl (5,3 g, 20,57 mmol, 1,5 Äq.) behandelt und über Nacht kräftig gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann konzentriert, um das Dioxan zu entfernen, mit 6 N HCl bis zu schwach sauer (pH 6) neutralisiert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab das Rohprodukt, das durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc bis CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt wurde, wobei sich reine APPC (4,91 g, Gesamtausbeute für zwei Schritte 81%) ergab. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,88 (d, 2H), 7,74 (d, 2H), 7,19-7,42 (m, 8H), 4,20-4,31 (m, M); HRMS m/e 465,1788, ber. für C₂₇H₂₆N₂O₄Na, 465,1791.
BEISPIEL 19
Herstellung von Fmoc-4-amino-1-(4-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure (Fmoc-4-MeAppc-OH)
Schritt 1:
Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (44,4 mg, 0,0485 mmol) und Tri-o-tolylphosphin (59,0 mg, 0,194 mmol) wurden zu einer Lösung von 4-Iodtoluol (2,12 g, 9,7 mmol), 1,4-Dioxa-8-azaspiro[4.5]decan (2,8 ml, 3,12 g, 21,82 mmol, 2,2 Äq.) und Natrium-tert-butoxid (2,6 g, 27,08 mmol, 2,8 Äq.) in trockenem Dioxan (40 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 26 h auf 90°C erwärmt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wobei sich ein braunes Öl ergab. Dieses Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 bis 75/25) gereinigt, wobei das reine Produkt als ein schwach gelber Feststoff (1,937 g, 85%) bereitgestellt wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,06 (d, 2H), 6,87 (d, 2H), 3,99 (s, 4H), 3,26 (t, 4H), 2,26 (s, 3H) und 1,85 (t, 4H). Schritt 2:
6 N Salzsäure (25 ml) wurde zu einer Lösung des Ketals (1,58 g, 6,79 mmol) in Aceton (50 ml) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter Rückfluss erhitzt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde in EtOAc aufgenommen und mit wässriger 6 N NaOH-Lösung neutralisiert. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 70/30) gereinigt, wobei sich das Produkt als ein gelbes Öl (1,27 g, 98%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 190 (M+H), ber. für C₁₂H₁₅NO, 189. Schritt 3:
Ammoniumcarbonat (4,74 g, 49,44 mmol, 8 Äq.) und Kaliumcyanid (1,01 g, 15,54 mmol, 2,5 Äq.) wurden zu einer Lösung des Ketons (1,17 g, 6,18 mmol) in Ethanol (60 ml) und Wasser (20 ml) in einer Glasdruckflasche gegeben. Das Gemisch wurde 22 h auf 90°C erwärmt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, und der Rückstand wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc (4 ×) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wobei sich das spektroskopisch reine Hydantoin als ein weißer Feststoff (1,554 g, Ausbeute 97%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 260 (M+H), ber. für C₁₄H₁₇N₃O₂, 259. Schritt 4:
Das Hydantoin (1,502 g) wurde in wässrigem NaOH (6 N, 40 ml) suspendiert und 4 Tage auf 130°C erwärmt. Nach Beendigung der Hydrolyse (gemäß HPLC) wurde das Reaktionsgemisch mit konz. HCl bis zu schwach sauer (pH ~6) neutralisiert. Die so erhaltene Aufschlämmung wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich 4-Amino-1-(4-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure (4-MeAPPC) als ein weißer Feststoff (2,10 g, Ausbeute > 100%, feucht und mit anorganischem Salz verunreinigt) ergab, der bei der HPLC einen einzelnen Peak zeigte und direkt in dem nächsten Schritt verwendet wurde. MS (Elektrospray) m/e 235 (M+H), ber. für C₁₃H₁₈N₂O₂, 234. Schritt 5:
Die rohe Aminosäure 4-MeAPPC aus dem letzten Schritt wurde in Dioxan (80 ml) und wässrigem, 10%igem Na₂CO₃ (40 ml) suspendiert, mit Fmoc-Cl (2,2 g, 8,59 mmol, 1,5 Äq.) behandelt und über Nacht kräftig gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann konzentriert, um das Dioxan zu entfernen, mit 6 N HCl bis zu schwach sauer (pH 6) neutralisiert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab das Rohprodukt, das durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc bis CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt wurde, wobei sich reine Fmoc-4-MeAPPC (2,16 g, Gesamtausbeute für zwei Schritte 82%) ergab. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,88 (d, 2H), 7,72 (d, 2H), 7,39 (t, 2H), 7,30 (td, 2H), 6,99 (d, 2H), 6,82 (d, 2H), 2,18 (s, 3H); MS (Elektrospray) m/e 457 (M+H), ber. für C₂₈H₂₈N₂O₄, 456.
BEISPIEL 20
Herstellung von Fmoc-4-amino-1-(4-chlorphenyl)piperidin-4-carbonsäure (Fmoc-4-ClAppc-OH)
Schritt 1:
Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (45,5 mg, 0,0497 mmol) und Tri-o-tolylphosphin (61 mg, 0,20 mmol) wurden zu einer Lösung von 1-Chlor-4-iodbenzol (2,38 g, 10,0 mmol), 1,4-Dioxa-8-azaspiro[4.5]decan (3,1 ml, 3,44 g, 24,0 mmol, 2,4 Äq.) und Natrium-tert-butoxid (2,68 g, 28,0 mmol, 2,8 Äq.) in trockenem Dioxan (40 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 9 h auf 90°C erwärmt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wobei sich ein braunes Öl ergab. Dieses Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 bis 75/25) gereinigt, wobei das reine Produkt als ein schwach gelber Feststoff (2,17 g, 86%) bereitgestellt wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,18 (dt, 2H), 6,85 (dt, 2H), 3,98 (s, 4H), 3,28 (t, 4H) und 1,82 (t, 4H). Schritt 2:
6 N Salzsäure (30 ml) wurde zu einer Lösung des Ketals (2,123 g, 8,39 mmol) in Aceton (75 ml) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter Rückfluss erhitzt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde in EtOAc aufgenommen und mit wässriger 6 N NaOH-Lösung neutralisiert. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 → 70/30) gereinigt, wobei sich das Produkt als ein gelber Feststoff (1,515 g, 86%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 210 (M+H), ber. für C₁₁H₁₂ClNO, 209. Schritt 3:
Ammoniumcarbonat (5,36 g, 55,88 mmol, 8 Äq.) und Kaliumcyanid (1,135 g, 17,46 mmol, 2,5 Äq.) wurden zu einer Lösung des Ketons (1,465 g, 6,986 mmol) in Ethanol (75 ml) und Wasser (25 ml) in einer Glasdruckflasche gegeben. Das Gemisch wurde 18 h auf 80 bis 90°C erwärmt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, und der Rückstand wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc (4 ×) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wobei sich das spektroskopisch reine Hydantoin als ein weißer Feststoff (1,817 g, Ausbeute 93%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 280 (M+H), ber. für C₁₃H₁₄ClN₃O₂, 279. Schritt 4:
Das Hydantoin (1,768 g) wurde in wässrigem NaOH (6 N, 50 ml) suspendiert und 4 Tage auf 130°C erwärmt. Nach der Beendigung der Hydrolyse (gemäß HPLC) wurde das Reaktionsgemisch mit konz. HCl bis zu schwach sauer (pH ~6) neutralisiert. Die so erhaltene Aufschlämmung wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich 4-Amino-1-(4-chlorphenyl)piperidin-4-carbonsäure (4-ClAPPC) als ein weißer Feststoff (2,05 g, Ausbeute > 100%, feucht und mit anorganischem Salz verunreinigt) ergab, der bei der HPLC einen einzelnen Peak zeigte und direkt für den nächsten Schritt verwendet wurde. MS (Elektrospray) m/e 253 (M-H), ber. für C₁₂H₁₅ClN₂O₂, 254. Schritt 5:
Die rohe Aminosäure 4-ClAPPC aus dem letzten Schritt wurde in Dioxan (100 ml) und wässrigem, 10%igem Na₂CO₃ (50 ml) suspendiert, mit Fmoc-Cl (2,0 g, 7,75 mmol, 1,2 Äq.) behandelt und über Nacht kräftig gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann konzentriert, um das Dioxan zu entfernen, mit 6 N HCl bis zu schwach sauer (pH 6) neutralisiert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab das Rohprodukt, das durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc bis CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt wurde, wobei sich reine Fmoc-4-ClAPPC (1,18 g, Gesamtausbeute für zwei Schritte 81%) ergab. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,87 (d, 2H), 7,71 (d, 2H), 7,39 (td, 2H), 7,30 (td, 2H), 7,20 (d, 2H), 6,92 (d, 2H), 3,44 (d, 2H), 2,93 (t, 2H); MS (Elektrospray) m/e 477 (M+H), ber. für C₂₇H₂₅N₂O₄, 476.
BEISPIEL 21
Herstellung von Fmoc-4-amino-1-(4-phenoxyphenyl)piperidin-4-carbonsäure (Fmoc-4-PhOAppc-OH)
Schritt 1:
Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (48,5 mg, 0,053 mmol) und Tri-o-tolylphosphin (64 mg, 0,4 mmol) wurden zu einer Lösung von 1-Iod-4-phenoxybenzol (3,15 g, 10,6 mmol), 1,4-Dioxa-8-azaspiro[4.5]decan (3,3 ml, 3,66 g, 25,6 mmol, 2,4 Äq.) und Natrium-tert-butoxid (2,85 g, 29,7 mmol, 2,8 Äq.) in trockenem Dioxan (40 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 9 h auf 90°C erwärmt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wobei sich ein braunes Öl ergab. Dieses Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 bis 80/20) gereinigt, wobei das reine Produkt als ein schwach gelber Feststoff (2,805 g, 85%) bereitgestellt wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,26-7,32 (m, 2H), 7,03 (t, 1H), 6,92-6,97 (m, 6H), 4,00 (s, 4H), 3,26 (t, 4H), 1,86 (t, 4H). Schritt 2:
6 N Salzsäure (45 ml) wurde zu einer Lösung des Ketals (2,755 g, 8,86 mmol) in Aceton (90 ml) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter Rückfluss erhitzt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde mit EtOAc verdünnt und mit wässrigem 6 N NaOH neutralisiert. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wobei sich das Rohprodukt ergab, das durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 bis 70/30) gereinigt wurde, wobei sich das Produkt als ein gelbes Öl (2,21 g, 93%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 268 (M+H), ber. für C₁₇H₁₇ClNO₂, 267. Schritt 3:
Ammoniumcarbonat (5,78 g, 60,0 mmol, 8 Äq.) und Kaliumcyanid (1,22 g, 18,80 mmol, 2,5 Äq.) wurden zu einer Lösung des Ketons (2,01 g, 7,52 mmol) in Ethanol (80 ml) und Wasser (25 ml) in einer Glasdruckflasche gegeben. Das Gemisch wurde 18 h auf 80 bis 90°C erwärmt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, und der Rückstand wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc (4 ×) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wobei sich das spektroskopisch reine Hydantoin als ein weißer Feststoff (2,34 g, Ausbeute 95%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 338 (M+H), ber. für C₁₉H₁₉N₃O₃, 337. Schritt 4:
Das Hydantoin (2,28 g, 6,76 mmol) wurde in wässrigem NaOH (6 N, 60 ml) suspendiert und 4 Tage auf 130°C erwärmt. Nach Beendigung der Hydrolyse (gemäß HPLC) wurde das Reaktionsgemisch mit konz. HCl bis zu schwach sauer (pH ~6) neutralisiert. Die so erhaltene Aufschlämmung wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich 4-Amino-1-(4-phenoxyphenyl)piperidin-4-carbonsäure (4-PhOAPPC) als ein weißer Feststoff (2,53 g, Ausbeute > 100%, feucht und mit anorganischem Salz verunreinigt) ergab, der bei der HPLC einen einzelnen Peak zeigte und direkt für den nächsten Schritt verwendet wurde. MS (Elektrospray) m/e 313 (M+H), ber. für C₁₈H₂₀N₂O₃, 312. Schritt 5:
Die rohe 4-PhOAPPC aus dem letzten Schritt wurde mit Fmoc-Cl (2,6 g, 1,25 Äq.) in Dioxan (50 ml) und wässrigem, 10%igem Na₂CO₃ (50 ml) behandelt und über Nacht kräftig gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Dioxan zu entfernen, mit 6 N HCl bis zu schwach sauer (pH 6) neutralisiert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab das Rohprodukt, das durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc bis CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt wurde, wobei sich reine 4-PhOAPPC (2,18 g, Gesamtausbeute für zwei Schritte 60%) ergab. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,87 (d, 2H), 7,72 (d, 2H), 7,38 (t, 2H), 7,30 (td, 4H), 7,02 (dt, 1H), 6,86-6,96 (m, 6H), 3,35 (m, 2H), 2,94 (t, 2H); MS (Elektrospray) m/e 535 (M+H), ber. für C₃₃H₃₀N₂O₅, 534.
BEISPIEL 22
Herstellung von Fmoc-4-amino-1-(2-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure (Fmoc-2-MeAppc-OH)
Schritt 1:
Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (91 mg, 0,1 mmol) und Tri-o-tolylphosphin (122 mg, 0,4 mmol) wurden zu einer Lösung von 2-Iodtoluol (4,36 g, 2,5 ml, 20,0 mmol), 1,4-Dioxa-8-azaspiro[4.5]decan (6,88 g, 6,2 ml, 48,1 mmol, 2,4 Äq.) und Natrium-tert-butoxid (5,3 g, 55,2 mmol, 2,8 Äq.) in trockenem Dioxan (80 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 26 h auf 90°C erwärmt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um die Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wobei sich ein braunes Öl ergab. Dieses Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 bis 75/25) gereinigt, wobei das reine Produkt als ein schwach gelber Feststoff (2,66 g, 57%) bereitgestellt wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,12-7,18 (m, 2H), 6,94-7,06 (m, 2H), 4,01 (s, 4H), 2,98 (t, 4H) und 1,88 (t, 4H). Schritt 2:
6 N Salzsäure (35 ml) wurde zu einer Lösung des Ketals (2,66 g, 11,4 mmol) in Aceton (70 ml) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht auf 85°C erwärmt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde mit EtOAc verdünnt und mit wässrigem NaOH (6 N) neutralisiert. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 bis 70/30) gereinigt, wobei sich das Produkt als ein gelbes Öl (2,04 g, 95%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 190 (M+H), ber. für C₁₂H₁₅NO, 189. Schritt 3:
Ammoniumcarbonat (4,69 g, 48,9 mmol, 6 Äq.) und Kaliumcyanid (800 mg, 12,2 mmol, 1,5 Äq.) wurden zu einer Lösung des Ketons (1,54 g, 8,15 mmol) in Ethanol (60 ml) und Wasser (20 ml) in einer Glasdruckflasche gegeben. Das Gemisch wurde 18 h auf 80 bis 90°C erwärmt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser (300 ml) gegeben und 30 min kräftig gerührt. Der so erhaltene Niederschlag wurde unter Vakuum abfiltriert, sorgfältig mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich das Hydantoin als ein weißer Feststoff (2,01 g, Ausbeute 95%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 260 (M+H), ber. für C₁₄H₁₇N₃O₂, 259. Schritt 4:
Di-tert-butyldicarbonat (2,25 g, 10,32 mmol, 2,5 Äq.), Triethylamin (0,63 ml, 460 mg, 4,54 mmol, 1,1 Äq.) und DMAP (36 mg, 0,29 mmol) wurden nacheinander zu einer Suspension des Hydantoins (1,07 g, 4,13 mmol) in trockenem THF (25 ml) gegeben. Etwa 15 Minuten nach der Zugabe verwandelte sich das Reaktionsgemisch in eine klare, gelbe Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wobei sich ein Feststoff ergab, der dann in EtOAc (300 ml) aufgenommen, mit 1 N HCl (3 × 30 ml), gesättigtem, wässrigem Na₂CO₃ (2 × 30 ml) und Salzlösung (2 × 30 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das hellgelbe Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 80/20) gereinigt, wobei sich das reine Bis-Boc-Hydantoin als ein weißer Feststoff (1,71 g, 90%) ergab. MS (Elektrospray) m/e 460 (M+H), ber. für C₂₄H₃₃N₃O₆, 459. Schritt 5:
Das Bis-Boc-Hydantoin (1,71 g, 3,72 mmol) wurde in DME (23 ml) gelöst, wobei sich eine klare Lösung ergab. 1 N NaOH (33 ml, 33 mmol) wurde zu dieser Lösung gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wobei sich ein ziemlich klares Gemisch ergab. Eine HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion an. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das DME zu entfernen, und mit Et₂O extrahiert. Die so erhaltene wässrige Schicht, die 4-Amino-1-(2-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure (2-MeAPPC) enthielt, wurde ohne Reinigung mit 6 N HCl behandelt, um den pH-Wert auf 11 bis 12 einzustellen. Diese Lösung (30 ml) wurde dann mit 1,4-Dioxan (30 ml) verdünnt und mit Fmoc-Cl (1,28 g, 4,96 mmol, 1,3 Äq.) behandelt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das Dioxan zu entfernen, mit 1 N HCl neutralisiert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc → CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt, wobei sich das reine Produkt als ein weißer Feststoff (1,09 g, Ausbeute aus dem Bis-Boc-Hydantoin 64%) ergab. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,87 (d, 2H), 7,74 (d, 2H), 7,40 (td, 2H), 7,31 (td, 2H), 7,12 (m, 2H), 6,97 (d, 1H), 6,92 (td, 1H), 2,72-2,88 (m, 4H) und 2,22 (s, 3H); MS (Elektrospray) m/e 457 (M+H), ber. für C₂₈H₂₈N₂O₄, 456.
BEISPIEL 23
Herstellung von Fmoc-4-amino-1-(2-isopropylphenyl)piperidin-4-carbonsäure (Fmoc-2-iPrAppc-OH)
Schritt 1:
Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (180 mg, 0,197 mmol) und Tri-o-tolylphosphin (244 mg, 0,80 mmol) wurden zu einer Lösung von 1-Iod-2-isopropylbenzol (10,0 g, 40,7 mmol), 1,4-Dioxa-8-azaspiro[4.5]decan (12,0 ml, 13,3 g, 93,0 mmol, 2,3 Äq.) und Natrium-tert-butoxid (10,0 g, 104,2 mmol, 2,6 Äq.) in trockenem Dioxan (160 ml) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 26 h auf 90°C erwärmt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen, mit Wasser behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wobei sich ein braunes Öl ergab. Dieses Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 → 75/25) gereinigt, wobei das reine Produkt als ein schwach gelber Feststoff (3,61 g, Ausbeute 35%) bereitgestellt wurde. MS m/z 262 (M+H), ber. für C₁₆H₂₃NO₂, 261. Schritt 2:
6 N Salzsäure (45 ml) wurde zu einer Lösung des Ketals (3,24 g, 12,4 mmol) in Aceton (90 ml) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter Rückfluss erhitzt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen, und der Rückstand wurde mit EtOAc verdünnt und mit wässrigem NaOH (6 N) neutralisiert. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 70/30) gereinigt, wobei sich das Produkt als ein gelbes Öl (2,42 g, 89%) ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,27 (m, 1H), 7,04-7,19 (m, 3H), 3,58 (m, 1H), 3,20 (t, 4H), 2,60 (t, 4H) und 1,25 (d, 6H); MS m/z 218 (M+H), ber. für C₁₄H₁₉NO, 217. Schritt 3:
Ammoniumcarbonat (8,1 g, 84,3 mmol, 8 Äq.) und Kaliumcyanid (1,72 g, 26,5 mmol, 2,5 Äq.) wurden zu einer Lösung des Ketons (2,30 g, 10,6 mmol) in Ethanol (90 ml) und Wasser (20 ml) in einer Glasdruckflasche gegeben. Das Gemisch wurde 18 h auf 80 bis 90°C erwärmt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser (400 ml) gegeben und 30 min kräftig gerührt. Der so erhaltene Niederschlag wurde unter Vakuum abfiltriert, sorgfältig mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich das Hydantoin als ein weißer Feststoff (2,78 g, Ausbeute 91%) ergab. MS m/z 288 (M+H), ber. für C₁₆H₂₁N₃O₂, 287. Schritt 4:
Di-tert-butyldicarbonat (5,2 g, 24,24 mmol, 2,5 Äq.), Triethylamin (1,5 ml, 1,07 g, 10,5 mmol, 1,1 Äq.) und DMAP (46 mg, 0,29 mmol) wurden nacheinander zu einer Suspension des Hydantoins (2,74 g, 9,54 mmol) in trockenem THF (100 ml) gegeben. Etwa 15 Minuten nach der Zugabe verwandelte sich das Reaktionsgemisch in eine klare, gelbe Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wobei sich ein Feststoff ergab, der dann in EtOAc (300 ml) aufgenommen, mit Salzlösung (3 × 30 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das hellgelbe Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 80/20) gereinigt, wobei sich das reine Bis-Boc-Hydantoin als ein weißer Feststoff (4,39 g, Ausbeute 94%) ergab. MS m/z 488 (M+H), ber. für C₂₆H₃₇N₃O₆, 487. Schritt 5:
Das Bis-Boc-Hydantoin (2,34 g, 4,8 mmol) wurde in DME (30 ml) gelöst, wobei sich eine klare Lösung ergab. 1 N NaOH (45 ml, 45 mmol) wurde zu dieser Lösung gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wobei sich ein ziemlich klares Gemisch ergab. Eine HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion an. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das DME zu entfernen, und mit Et₂O extrahiert. Die so erhaltene wässrige Schicht, die 4-Amino-1-(2-isopropylphenyl)piperidin-4-carbonsäure (2-iPrAPPC) enthielt, wurde ohne Reinigung mit 6 N HCl behandelt, um den pH-Wert auf 11 bis 12 einzustellen. Diese Lösung (~45 ml) wurde dann mit 1,4-Dioxan (45 ml) verdünnt und mit Fmoc-Cl (1,78 g, 6,89 mmol, 1,5 Äq.) behandelt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das Dioxan zu entfernen, mit 1 N HCl neutralisiert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc → CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt, wobei sich das reine Produkt als ein weißer Feststoff (1,46 g, Ausbeute aus dem Bis-Boc-Hydantoin 63%) ergab. HRMS m/z 507,2263, ber. für C₃₀H₃₂N₂O₄Na, 507,2260.
BEISPIEL 24
Herstellung von Fmoc-4-amino-1-(3-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure (Fmoc-3-MeAppc-OH)
Schritt 1:
Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (91 mg, 0,1 mmol) und Tri-o-tolylphosphin (122 mg, 0,4 mmol) wurden zu einer Lösung von 3-Iodtoluol (4,36 g, 2,6 ml, 20,0 mmol), 1,4-Dioxa-8-azaspiro[4.5]decan (6,88 g, 6,2 ml, 48,1 mmol, 2,4 Äq.) und Natrium-tert-butoxid (5,3 g, 55,2 mmol, 2,8 Äq.) in trockenem Dioxan (80 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 26 h auf 90°C erwärmt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wobei sich ein braunes Öl ergab. Dieses Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 bis 75/25) gereinigt, wobei das reine Produkt als ein schwach gelber Feststoff (3,21 g, 69%) bereitgestellt wurde. Schritt 2:
6 N Salzsäure (10 ml) wurde zu einer Lösung des Ketals (1,25 g, 5,36 mmol) in Aceton (20 ml) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter Rückfluss erhitzt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde mit EtOAc verdünnt und mit wässrigem NaOH (6 N) neutralisiert. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 bis 70/30) gereinigt, wobei sich das Produkt als ein gelbes 61(843 mg, Ausbeute 83%) ergab. MS m/z 190 (M+H), ber. für C₁₂H₁₅NO, 189. Schritt 3:
Ammoniumcarbonat (3,09 g, 32,21 mmol, 8 Äq.) und Kaliumcyanid (675 mg, 10,38 mmol, 2,5 Äq.) wurden zu einer Lösung des Ketons (763 mg, 4,03 mmol) in Ethanol (45 ml) und Wasser (15 ml) in einer Glasdruckflasche gegeben. Das Gemisch wurde 18 h auf 80 bis 90°C erwärmt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser (200 ml) gegeben und 30 min kräftig gerührt. Der so erhaltene Niederschlag wurde unter Vakuum abfiltriert, sorgfältig mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich das Hydantoin als ein weißer Feststoff (930 mg, Ausbeute 89%) ergab. MS m/z 260 (M+H), ber. für C₁₄H₁₇N₃O₂, 259. Schritt 4:
Di-tert-butyldicarbonat (1,64 g, 7,52 mmol, 2,5 Äq.), Triethylamin (0,42 ml, 305 mg, 3,01 mmol, 1,0 Äq.) und DMAP (20 mg, 0,164 mmol) wurden nacheinander zu einer Suspension des Hydantoins (780 mg, 3,012 mmol) in trockenem THF (22 ml) gegeben. Etwa 5 Minuten nach der Zugabe verwandelte sich das Reaktionsgemisch in eine klare, gelbe Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wobei sich ein Feststoff ergab, der dann in EtOAc (300 ml) aufgenommen, mit Salzlösung (3 × 30 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das hellgelbe Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 80/20) gereinigt, wobei sich das reine Bis-Boc-Hydantoin als ein weißer Feststoff (1,37 g, quantitativ) ergab. HRMS m/z 482,2261 (M+Na), ber. für C₂₄H₃₃N₃O₆Na, 482,2267. Schritt 5:
Das Bis-Boc-Hydantoin (1,29 g, 2,818 mmol) wurde in DME (20 ml) gelöst, wobei sich eine klare Lösung ergab. 1 N NaOH (25 ml, 25 mmol) wurde zu dieser Lösung gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wobei sich ein ziemlich klares Gemisch ergab. Eine HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion an. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das DME zu entfernen, und mit Et₂O extrahiert. Die so erhaltene wässrige Schicht, die 4-Amino-1-(3-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure (3-MeAPPC) enthielt, wurde ohne Reinigung mit 6 N. HCl behandelt, um den pH-Wert auf 11 bis 12 einzustellen. Diese Lösung (30 ml) wurde dann mit 1,4-Dioxan (30 ml) verdünnt und mit Fmoc-Cl (1,46 mg, 5,65 mmol, 2,0 Äq.) behandelt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das Dioxan zu entfernen, mit 1 N HCl neutralisiert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc → CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt, wobei sich das reine Produkt als ein weißer Feststoff (1,002 g, Ausbeute aus dem Bis-Boc-Hydantoin 78%) ergab. HRMS m/z 479,1940 (M+Na), ber. für C₂₈H₂₈N₂O₄Na, 479,1947.
BEISPIEL 25
Herstellung von Fmoc-4-amino-1-(3-methoxyphenyl)piperidin-4-carbonsäure (Fmoc-3-MeOAppc-OH)
Schritt 1:
Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (91 mg, 0,1 mmol) und Tri-o-tolylphosphin (122 mg, 0,4 mmol) wurden zu einer Lösung von 3-Iodanisol (4,68 g, 2,4 ml, 20,0 mmol), 1,4-Dioxa-8-azaspiro[4.5]decan (6,2 ml, 6,88 g, 48,1 mmol, 2,4 Äq.) und Natrium-tert-butoxid (5,3 g, 55,2 mmol, 2,8 Äq.) in trockenem Dioxan (80 ml) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 26 h auf 90°C erwärmt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen, und der Rückstand wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wobei sich ein braunes Öl ergab. Dieses Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 bis 75/25) gereinigt, wobei das reine Produkt als ein schwach gelber Feststoff (3,10 g, Ausbeute 62%) bereitgestellt wurde. MS m/z (M+H), 250 (M+H), ber. für C₁₄H₁₉NO₃, 249. Schritt 2:
6 N Salzsäure (45 ml) wurde zu einer Lösung des Ketals (3,10 g, 12,45 mmol) in Aceton (90 ml) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter Rückfluss erhitzt. Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde konzentriert, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der Rückstand wurde mit EtOAc verdünnt und mit wässrigem NaOH (6 N) neutralisiert. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 bis 70/30) gereinigt, wobei sich das Produkt als ein gelbes Öl (2,53 g, Ausbeute 99%) ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,20 (m, 1H), 6,58 (d, 1H), 6,39-6,56 (m, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,59 (m, 4H) und 2,58 (m, 4H). Schritt 3:
Ammoniumcarbonat (6,77 g, 70,52 mmol, 8 Äq.) und Kaliumcyanid (1,14 g, 17,6 mmol, 2,0 Äq.) wurden zu einer Lösung des Ketons (1,81 g, 8,82 mmol) in Ethanol (60 ml) und Wasser (20 ml) in einer Glasdruckflasche gegeben. Das Gemisch wurde 18 h auf 80 bis 90°C erwärmt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser (200 ml) gegeben und 30 min kräftig gerührt. Der so erhaltene Niederschlag wurde unter Vakuum abfiltriert, sorgfältig mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich das Hydantoin als ein weißer Feststoff (2,23 g, Ausbeute 92%) ergab. MS m/z 276 (M+H), ber. für C₁₄H₁₇N₃O₃, 275. Schritt 4:
Di-tert-butyldicarbonat (2,18 g, 10,0 mmol, 2,5 Äq.), Triethylamin (0,62 ml, 445 mg, 4,4 mmol, 1,1 Äq.) und DMAP (20 mg, 0,164 mmol) wurden nacheinander zu einer Suspension des Hydantoins (1,10 g, 4,00 mmol) in trockenem THF (50 ml) gegeben. Etwa 15 Minuten nach der Zugabe verwandelte sich das Reaktionsgemisch in eine klare, gelbe Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wobei sich ein Feststoff ergab, der dann in EtOAc (300 ml) aufgenommen, mit Salzlösung (3 × 30 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das hellgelbe Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 80/20) gereinigt, wobei sich das reine Bis-Boc-Hydantoin als ein weißer Feststoff (1,90 g, quantitativ) ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,16 (t, 1H), 6,57 (d, 1H), 6,24 (s, 1H), 6,19 (d, 1H), 3,77 (s, 3H), 1,58 (s, 9H), 1,42 (s, 9H); MS m/z 476 (M+H), ber. für C₂₄H₃₃N₃O₇, 475.
Schritt 5:
Das Bis-Boc-Hydantoin (1,06 g, 2,23 mmol) wurde in DME (20 ml) gelöst, wobei sich eine klare Lösung ergab. 1 N NaOH (20 ml, 20 mmol) wurde zu dieser Lösung gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wobei sich ein ziemlich klares Gemisch ergab. Eine HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion an. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das DME zu entfernen, und mit Et₂O extrahiert. Die so erhaltene wässrige Schicht, die 4-Amino-1-(3-methoxyphenyl)piperidin-4-carbonsäure (3-MeOAPPC) enthielt, wurde ohne Reinigung mit 6 N HCl behandelt, um den pH-Wert auf 11 bis 12 einzustellen. Diese Lösung (35 ml) wurde dann mit 1,4-Dioxan (35 ml) verdünnt und mit Fmoc-Cl (755 mg, 2,93 mmol, 1,3 Äq.) behandelt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um das Dioxan zu entfernen, mit 1 N HCl neutralisiert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc → CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt, wobei sich das reine Produkt als ein weißer Feststoff (668 mg, Ausbeute aus dem Bis-Boc-Hydantoin 63%) ergab. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,83 (d, 2H), 7,72 (d, 2H), 7,41 (td, 2H), 7,34 (dt, 2H), 7,16 (t, 1H), 6,52 (d, 1H), 6,42 (s, 1H), 6,36 (d, 1H), 4,25 (m, 3H), 3,68 (s, 3H), 3,23-3,40 (m, 2H), 2,96 (t, 2H) und 1,86-2,18 (m, 4H). HRMS m/z 495,1901 (M+Na), ber. für C₂₈H₂₈N₂O₅Na, 495,1896.
BEISPIEL 26
Herstellung von Fmoc-1-amino-4-cyclohexylcyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-Achc-OH)
Schritt 1:
Ein Gemisch aus 4-Cyclohexylcyclohexanon (3,00 g, 16,6 mmol), Kaliumcyanid (1,63 g, 25,0 mmol), Ammoniumcarbonat (9,59 g, 99,8 mmol), Ethanol (75 ml) und Wasser (15 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 15 Stunden in einem Ölbad mit 80°C erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die weiße Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur einige Stunden gerührt. Filtration und Trocknen an der Luft ergaben Hydantoin (6,10 g, noch feucht, Ausbeute > 100%) als einen weißen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 10,52 (1H, breit, NH), 8,43 (1H, breites s, NH), 0,80-1,80 (20H, m). LRMS (APCI): C₁₄H₂₂N₂O₂, ber.: 250; beobachtet: 249 (M-H), 251 (M+H). Schritt 2:
Ein Gemisch aus Hydantoin (1,39 g, 5,55 mmol) und 6 N Natriumhydroxidlösung (50 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 2 Tage in einem Ölbad mit 130°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eisbad abgekühlt und unter Verwendung von konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von ~7 neutralisiert. Die weiße Aufschlämmung wurde filtriert, und die Niederschläge wurden mit Wasser gespült, wobei sich rohe 1-Amino-4-cyclohexylcyclohexan-1-carbonsäure (48,3 g, feucht und anorganische Salze enthaltend, Ausbeute > 100%) ergab. LRMS (Elektrospray): C₁₃H₂₃NO₂, ber.: 225; beobachtet: 226 (M+H).
Schritt 3:
Ein Gemisch aus roher 1-Amino-4-cyclohexylcyclohexan-1-carbonsäure (48,3 g, theoretisch 5,55 mmol), Triethylamin (1,0 ml, 7,17 mmol) und 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 2,43 g, 7,20 mmol) in Acetonitril (75 ml) und Wasser (75 ml) wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, um den größten Teil des Acetonitrils zu entfernen, mit 10%iger, wässriger Citronensäurelösung auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, und die weiße Emulsion wurde dreimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (mit 1 → 5 → 8% Methanol/Methylenchlorid eluiert) gereinigt wurde, wobei sich Fmoc-1-amino-4-trans-cyclohexylcyclohexan-1-carbonsäure (250 mg, Ausbeute für zwei Schritte 10%) ergab. HRMS (FAB): C₂₈H₃₄NO₄ (M+H), ber.: 448,2488; beobachtet: 448,2497.
BEISPIEL 27
Herstellung von Fmoc-1-amino-4,4-diphenylcyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-Adpc-OH)
Schritt 1:
Ein Gemisch aus 4,4-Diphenylcyclohexanon (durch Hydrierung von 4,4-Diphenylcyclohexenon gemäß den Verfahren von Freeman, P. K., et al., J. Org. Chem. 1989, 54, 782–789, hergestellt) (1,55 g, 6,19 mmol), Kaliumcyanid (0,65 g, 9,97 mmol), Ammoniumcarbonat (3,60 g, 37,5 mmol), Ethanol (48 ml) und Wasser (12 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 24 Stunden in einem Ölbad mit 80°C erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die weiße Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur einige Stunden gerührt. Filtration und Trocknen an der Luft ergaben Hydantoin (1,89 g, Ausbeute 95%) als einen weißen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 10,57 (1H, breit, NH), 8,59 (1H, breites s, NH), 7,00-7,50 (10H, m, Phenyl). LRMS (Elektrospray): C₂₀H₂₀N₂O₂, ber.: 320; beobachtet: 319 (M-H). Schritt 2:
Ein Gemisch aus Hydantoin (1,88 g, 5,87 mmol), Bariumhydroxidmonohydrat (5,60 g, 29,6 mmol) und Wasser (100 ml, sehr verdünnt!) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 2 Tage in einem Ölbad mit 105°C erwärmt. Noch mehr Bariumhydroxidmonohydrat (5,60 g, 29,6 mmol) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde weitere 24 Stunden in einem Ölbad mit 105°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und unter Verwendung von 4 N Schwefelsäure auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem siedenden Wasserbad zwei Stunden gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die weiße Suspension wurde filtriert, und die Niederschläge wurden mit Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate und Waschlösungen wurden im Vakuum auf ~30 ml konzentriert. Neutralisation mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung ergab weiße Niederschläge, die abfiltriert, mit Wasser gewaschen und über Nacht im Vakuum getrocknet wurden, wobei sich rohe 1-Amino-4,4-diphenylcyclohexan-1-carbonsäure (0,52 g, Ausbeute 30%) als ein weißer Feststoff ergab. LRMS (Elektrospray): C₁₉H₂₁NO₂, ber.: 295; beobachtet: 294 (M-H), 296 (M+H). Schritt 3:
Ein Gemisch aus roher 1-Amino-4,4-diphenylcyclohexan-1-carbonsäure (510 mg, 1,73 mmol), Triethylamin (0,37 ml, 2,65 mmol) und 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 880 mg, 2,61 mmol) in Acetonitril (25 ml) und Wasser (25 ml) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Eine DC-Analyse des Reaktionsgemisches zeigte das Vorhandensein von Aminosäureausgangsmaterial an. 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (200 mg) und Acetonitril (5 ml) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur weitere 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, um den größten Teil des Acetonitrils zu entfernen, mit 10%iger, wässriger Citronensäurelösung auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, und die weiße Emulsion wurde dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (mit 1 → 4 → 8% Methanol/Methylenchlorid eluiert) gereinigt wurde, wobei sich Fmoc-1-amino-4,4-diphenylcyclohexan-1-carbonsäure (350 mg, Ausbeute 39%) als ein weißer Feststoff ergab. HRMS (FAB): C₃₄H₃₂NO₄ (M+H), ber.: 518,2331; beobachtet: 518,231.
BEISPIEL 28
Herstellung von Fmoc-1-amino-4-trans-t-butylcyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-Abc-OH)
Schritt 1:
Ein Gemisch aus 4-t-Butylcyclohexanon (2,00 g, 13,0 mmol), Kaliumcyanid (1,27 g, 19,5 mmol), Ammoniumcarbonat (7,48 g, 77,8 mmol), Ethanol (60 ml) und Wasser (12 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 15 Stunden in einem Ölbad mit 80°C erwärmt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die weiße Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur einige Stunden gerührt. Filtration ergab Hydantoin (2,78 g, Ausbeute 96%) als einen weißen Feststoff, der in dem nächsten Schritt als Rohmaterial verwendet wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆): δ 10,52 (1H, breit, NH), 8,50 (1H, breites s, NH), 0,81 (9H, s, t-Bu).
Schritt 2:
Ein Gemisch aus Hydantoin (2,78 g, 12,4 mmol), Bariumhydroxidmonohydrat (11,74 g, 62,0 mmol) und Wasser (50 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde 2 Tage in einem Ölbad mit 120°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und unter Verwendung von 4 N Schwefelsäure auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem siedenden Wasserbad eine Stunde gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die weiße Suspension wurde filtriert, und die Niederschläge wurden mit Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate und Waschlösungen wurden im Vakuum auf ~30 ml konzentriert. Neutralisation mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung ergab weiße Niederschläge, die abfiltriert, mit Wasser gewaschen und über Nacht im Vakuum getrocknet wurden, wobei sich 1-Amino-4-trans-t-butylcyclohexan-1-carbonsäure (2,10 g, Ausbeute 85%) als ein weißer Feststoff ergab. Schritt 3:
Ein Gemisch aus roher 1-Amino-4-trans-t-butylcyclohexyl-1-carbonsäure (2,10 g, 10,54 mmol) und 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 6,33 g, 7,20 mmol) in Dioxan (150 ml) und 10%iger Natriumcarbonatlösung (120 ml) wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, um den größten Teil des Dioxans zu entfernen, mit 3 N HCl auf einen pH-Wert von ~3 angesäuert, und die weiße Emulsion wurde zweimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Filtration und Konzentrieren ergaben ein Rohmaterial, das durch Säulenchromatographie (mit 1 → 4 → 5% Methanol/Methylenchlorid eluiert) gereinigt wurde, wobei sich Fmoc-1-amino-4-trans-t-butylcyclohexan-1-carbonsäure (1,42 g, Ausbeute 32%) ergab. HRMS (FAB): C₂₆H₃₂NO₄ (M+H), ber.: 422,2331; beobachtet: 422,23.
BEISPIEL 29
Herstellung von Fmoc-Linker-BHA-Harz
Man ließ ein vernetztes Harz aus Benzhydrylamincopolystyrol – 1% Divinylbenzol (10,0 g, 9,3 mÄq., Siebgröße 100 bis 200 ASTM, Advanced ChemTech) in 100 ml CH₂Cl₂ quellen, es wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 100 ml CH₂Cl₂, 6% DIPEA/CH₂Cl₂ (zweimal), CH₂Cl₂ (zweimal) gewaschen. Das Harz wurde mit p-[(R,S)-α-[1-(9H-Fluoren-9-yl)methoxyformamido]-2,4-dimethoxybenzyl]phenoxyessigsäure (Fmoc-Linker) (7,01 g, 13,0 mmol), N-Hydroxybenzotriazol (2,16 g, 16,0 mmol) und Diisopropylcarbodiimid (2,04 ml, 13,0 mmol) in 100 ml 25% DMF/CH₂Cl₂ 24 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 100 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol (zweimal), DMF und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Eine Ninhydrinanalyse nach Kaiser war negativ. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 16,12 g Fmoc-Linker-BHA-Harz ergab. Von einem Teil dieses Harzes (3,5 mg) wurde die Schutzgruppe Fmoc abgespalten, und eine quantitative UV-Analyse zeigte eine Beladung von 0,56 mmol/g.
BEISPIEL 30
Herstellung von Bu-His-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-His (Trt) (300 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Buttersäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 600 mg Bu-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Bu-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 130 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 52 mg (34%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₃₈H₅₀N₁₂O₆, ber.: 770, beobachtet: m/z (771 M+H).
BEISPIEL 31
Penta-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 580 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 145 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 61 mg (36%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₆₀N₁₀O₆, ber.: 849, beobachtet: m/z (850 M+H).
BEISPIEL 32
Phenylacetyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit Phenylessigsäure (82 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) in DMF behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 620 mg Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 155 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 55 mg (31%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₉H₅₈N₁₀O₆, ber.: 883, beobachtet: m/z (884 M+H).
BEISPIEL 33
Bu-Carbamoyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit n-Butylisocyanat (5 Äq.) in 6% DIPEA/DMF 12 Stunden behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 550 mg Butylharnstoff-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butylharnstoff-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 135 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 55 mg (31%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₆₁N₁₁O₆, ber.: 864, beobachtet: m/z (865 M+H).
BEISPIEL 34
Herstellung von Penta-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehenden Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Vier Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 600 mg Pentyl-Tetrapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Tetrapeptid-Harz wurde mit 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 110 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 40 mg (25%) eines weißen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₄H₅₇N₉O₅, ber.: 792, beobachtet: m/z (793 M+H).
BEISPIEL 35
Penta-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-2-Nal (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 580 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 145 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 61 mg (36%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₈H₆₁N₉O₆, ber.: 860, beobachtet: m/z (861 M+H).
BEISPIEL 36
Bu-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(2)Nal (265 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Essigsäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 600 mg Butyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 144 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 55 mg (32%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₇H₅₉N₉O₆, ber.: 846, beobachtet: m/z (847 M+H).
BEISPIEL 37
Ac-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(2)Nal(265 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Essigsäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 620 mg Ac-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Ac-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 150 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 62 mg (38%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₅H₅₅N₉O₆, ber.: 818, beobachtet: m/z (819 M+H).
BEISPIEL 38
Bu-Carbamoyl-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(2)Nal (265 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit n-Butylisocyanat (5 Äq.) in 6% DIPEA/DMF 12 Stunden behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 550 mg Butylcarbamoyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butylcarbamoyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 135 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 55 mg (31%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₈H₆₂N₁₀O₆, ber.: 875, beobachtet: m/z (876 M+H).
BEISPIEL 39
Benzoyl-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(2)Nal (265 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit Benzoesäureanhydrid in 6% DIPEA/DMF 12 Stunden behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 570 mg Benzoyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Benzoyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 130 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 50 mg (28%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₀H₅₇N₉O₆, ber.: 880, beobachtet: m/z (881 M+H).
BEISPIEL 40
3-Carboxylpropanoyl-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(2)Nal (265 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit Bernsteinsäure (71 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) in DMF behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 550 mg 3-Carboxypropanoyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das 3-Carboxypropanoyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 136 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 52 mg (30%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₇H₅₇N₉O₈, ber.: 876, beobachtet: m/z (877 M+H).
BEISPIEL 41
Phenylacetyl-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(2)Nal (265 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit Phenylessigsäure (82 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) in DMF behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 580 mg Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 132 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 49 mg (29%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₁H₅₉N₉O₆, ber.: 894, beobachtet: m/z (895 M+H).
BEISPIEL 42
Penta-4-ClApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-4-ClApc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 620 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 141 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 45 mg (26%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₅₉N₁₀O₆Cl, ber.: 883, beobachtet: m/z (884 M+H).
BEISPIEL 43
Penta-4-HOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-4-HOApc (280 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 620 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt.
Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 150 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 55 mg (31%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₆₀N₁₀O₇, ber.: 865, beobachtet: m/z (866 M+H).
BEISPIEL 44
Penta-4-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-4-MeOApc (300 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt.
Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 610 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 152 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 59 mg (33%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₇H₆₂N₁₀O₇, ber.: 879, beobachtet: 880 m/z (M+H).
BEISPIEL 45
Penta-3-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-3-MeOApc (300 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 610 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 152 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 59 mg (33%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₇H₆₂N₁₀O₇, ber.: 879, beobachtet: 880 m/z (M+H).
BEISPIEL 46
Penta-4-EtOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-4-EtOApc (320 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 615 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 160 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 63 mg (35%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₅H₆₄N₁₀O₇, ber.: 893, beobachtet: 894 m/z (M+H).
BEISPIEL 47
Penta-4-iPrOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-4-iPrOApc (285 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt.
Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 600 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 140 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 45 mg (26%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₉H₆₆N₁₀O₇, ber.: 907, beobachtet: m/z (908 M+H).
BEISPIEL 48
Penta-4-MeApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-4-MeApc (280 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 590 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 139 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 51 mg (30%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₇H₆₂N₁₀O₆, ber.: 863, beobachtet: m/z (864 M+H).
BEISPIEL 49
Penta-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Sar-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Sar (187 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 620 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 175 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 69 mg (40%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₇H₆₂N₁₀O₆, ber.: 863, beobachtet: 864 m/z (M+H).
BEISPIEL 50
Penta-Apc-(D)Phe-Arg-N-methyl-(2)Nal-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (700 mg, 0,385 mmol), das unter Verwendung des Verfahrens in Beispiel 29 hergestellt wurde, wurde unter Verwendung der DIC/HOBT-Kopplungsbedingungen einer Festphasensynthese unterzogen, und die Waschschritte wurden, wie in Vorschrift 1 gezeigt, durchgeführt. Alle Aminosäurekopplungen wurden unter Verwendung von DIC (5 Äq.) und HOBT (2,5 Äq.) als die Kopplungsreagenzien und der Fmoc-Aminosäure (2,5 Äq.) durchgeführt. Das Harz wurde nach jeder Peptidkopplung den Waschschritten 1 bis 6, wie in Vorschrift 1 gezeigt, unterzogen. Zwei Kopplungszyklen wurden mit jeweils Fmoc-Gly (286 mg, 0,96 mmol), gefolgt von Fmoc-(2)Nal (421 mg, 0,96 mmol) durchgeführt. Nach der Fmoc-Entfernung von dem 2-Nah-Rest wurde das so erhaltene Amin unter Verwendung von 2-Nitrobenzolsulfonylchlorid (5 Äq., 426 mg, 1,93 mmol) und DIPEA (5 Äq.) als die Base in DMF in dessen 2-Nitrobenzolsulfonylderivat umgewandelt. Die Waschschritte wurden unter Verwendung von DMF (6 × 30 ml), gefolgt von CH₂Cl₂ (3 × 30 ml) durchgeführt, und das Harz wurde unter Vakuum getrocknet. Das erhaltene Sulfonamid wurde unter Verwendung von Triphenylphosphin (5 Äq., 505 mg, 1,93 mmol), N,N- Diethylazodicarboxylat (5 Äq., 303 μl, 1,93 mmol) und Methanol (10 Äq., 156 μl, 3,85 mmol) in THF methyliert. Die Waschschritte wurden unter Verwendung von THF (6 × 30 ml), gefolgt von CH₂Cl₂ (5 × 30 ml) durchgeführt, und das Harz wurde unter Vakuum getrocknet. Die 2-Nitrobenzolsulfonylgruppe wurde dann unter Verwendung von 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (3 Äq., 173 μl, 1,16 mmol) und 2-Mercaptoethanol (5 Äq., 135 μl, 1,93 mmol) in DMF entfernt. Die Waschschritte wurden unter Verwendung von DMF (3 × 30 ml), Isopropanol (3 × 30 ml), gefolgt von Ethylether (3 × 30 ml) durchgeführt, und das Harz wurde unter Vakuum getrocknet. Der so erhaltene N-Me-(2)Nal-Rest wurde drei Kopplungszyklen mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Arg (Pmc) (638 mg, 0,96 mmol), Fmoc-(D)Phe (373 mg, 0,96 mmol) und Fmoc-Apc (170 mg, 0,96 mmol) unterzogen. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 300 μl Valeriansäureanhydrid und 245 μl Pyridin in 15 ml DMF 5 h behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 30 ml DMF (dreimal), Isopropanol, CH₂Cl₂ (dreimal) und Ethylether (dreimal) gewaschen. Das so erhaltene Pentyl-Peptid-Harz wurde unter Vakuum getrocknet und mit 7 ml 60% Trifluoressigsäure in CH₂Cl₂, 1% Wasser und 615 ml Triethylsilan (10 Äq., 3,85 mmol) 160 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~5 bis 7 ml CH₂Cl₂ gewaschen, und die Filtrate wurden auf einer Schnellvakuumpumpe von Savant konzentriert, wobei sich das Rohprodukt ergab.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 30 mg (~10%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₉H₆₃N₉O₆, ber.: 873, beobachtet: m/z (874 M+H).
BEISPIEL 51
Penta-Apc-(D)Phe-Arg-N-methyl(2)-Nal-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (700 mg, 0,385 mmol), das unter Verwendung des Verfahrens in Beispiel 29 hergestellt wurde, wurde unter Verwendung der DIC/HOBT-Kopplungsbedingungen einer Festphasensynthese unterzogen, und die Waschschritte wurden, wie in Vorschrift 1 gezeigt, durchgeführt. Alle Aminosäurekopplungen wurden unter Verwendung von DIC (5 Äq.) und HOBT (2,5 Äq.) als die Kopplungsreagenzien und der Fmoc-Aminosäure (2,5 Äq.) durchgeführt. Das Harz wurde nach jeder Peptidkopplung den Waschschritten 1 bis 6, wie in Vorschrift 1 gezeigt, unterzogen. Ein Kopplungszyklus wurde mit Fmoc-(2)Nal (421 mg, 0,96 mmol) durchgeführt. Nach der Fmoc-Entfernung von dem (2)Nal-Rest wurde das so erhaltene Amin unter Verwendung von 2-Nitrobenzolsulfonylchlorid (5 Äq., 426 mg, 1,93 mmol) und DIPEA (5 Äq.) als die Base in DMF in dessen 2-Nitrobenzolsulfonylderivat umgewandelt. Die Waschschritte wurden unter Verwendung von DMF (6 × 30 ml), gefolgt von CH₂Cl₂ (3 × 30 ml) durchgeführt, und das Harz wurde unter Vakuum getrocknet. Das erhaltene Sulfonamid wurde unter Verwendung von Triphenylphosphin (5 Äq., 505 mg, 1,93 mmol), N,N-Diethylazodicarboxylat (5 Äq., 303 μl, 1,93 mmol) und Methanol (10 Äq., 156 μl, 3,85 mmol) in THF methyliert. Die Waschschritte wurden unter Verwendung von THF (6 × 30 ml), gefolgt von CH₂Cl₂ (5 × 30 ml) durchgeführt, und das Harz wurde unter Vakuum getrocknet. Die 2-Nitrobenzolsulfonylgruppe wurde dann unter Verwendung von 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (3 Äq., 173 μl, 1,16 mmol) und 2-Mercaptoethanol (5 Äq., 135 μl, 1,93 mmol) in DMF entfernt. Die Waschschritte wurden unter Verwendung von DMF (3 × 30 ml), Isopropanol (3 × 30 ml), gefolgt von Ethylether (3 × 30 ml) durchgeführt, und das Harz wurde unter Vakuum getrocknet. Der so erhaltene N-Me-(2)Nal-Rest wurde drei Kopplungszyklen mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Arg (Pmc) (638 mg, 0,96 mmol), Fmoc-(D)Phe (373 mg, 0,96 mmol) und Fmoc-Apc (170 mg, 0,96 mmol) unterzogen. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 300 μl Valeriansäureanhydrid und 245 μl Pyridin in 15 ml DMF 5 h behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 30 ml DMF (dreimal), Isopropanol, CH₂Cl₂ (dreimal) und Ethylether (dreimal) gewaschen. Das so erhaltene Pentyl-Peptid-Harz wurde unter Vakuum getrocknet und mit 7 ml 60% Trifluoressigsäure in CH₂Cl₂, 1% Wasser und 615 ml Triethylsilan (10 Äq., 3,85 mmol) 160 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~5 bis 7 ml CH₂Cl₂ gewaschen, und die Filtrate wurden mit einer Schnellvakuumpumpe von Savant konzentriert, wobei sich das Rohprodukt ergab.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 43 mg (~14%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₇H₆₀N₈O₅, ber.: 817, beobachtet: m/z (818 M+H).
BEISPIEL 52
Penta-Apc-(D)Phe-Arg-N-methylTrp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (700 mg, 0,385 mmol), das unter Verwendung des Verfahrens in Beispiel 29 hergestellt wurde, wurde unter Verwendung der DIC/HOBT-Kopplungsbedingungen einer Festphasensynthese unterzogen, und die Waschschritte wurden, wie in der Vorschrift 1 gezeigt, durchgeführt. Alle Aminosäurekopplungen wurden unter Verwendung von DIC (5 Äq.) und HOBT (2,5 Äq.) als die Kopplungsreagenzien und der Fmoc-Aminosäure (2,5 Äq.) durchgeführt. Das Harz wurde nach jeder Peptidkopplung den Waschschritten 1 bis 6, wie in Vorschrift 1 gezeigt, unterzogen. Zwei Kopplungszyklen wurden mit jeweils Fmoc-Gly (286 mg, 0,96 mmol), gefolgt von Fmoc-Trp (461 mg, 0,96 mmol) durchgeführt. Nach der Fmoc-Entfernung von dem Trp-Rest wurde das so erhaltene Amin unter Verwendung von 2-Nitrobenzolsulfonylchlorid (5 Äq., 426 mg, 1,93 mmol) und DIPEA (5 Äq.) als die Base in DMF in dessen 2-Nitrobenzolsulfonylderivat umgewandelt. Die Waschschritte wurden unter Verwendung von DMF (6 × 30 ml), gefolgt von CH₂Cl₂ (3 × 30 ml) durchgeführt, und das Harz wurde unter Vakuum getrocknet. Das erhaltene Sulfonamid wurde unter Verwendung von Triphenylphosphin (5 Äq., 505 mg, 1,93 mmol), N,N-Diethylazodicarboxylat (5 Äq., 303 μl, 1,93 mmol) und Methanol (10 Äq., 156 μl, 3,85 mmol) in THF methyliert. Die Waschschritte wurden unter Verwendung von THF (6 × 30 ml), gefolgt von CH₂Cl₂ (5 × 30 ml) durchgeführt, und das Harz wurde unter Vakuum getrocknet. Die 2-Nitrobenzolsulfonylgruppe wurde dann unter Verwendung von 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (3 Äq., 173 μl, 1,16 mmol) und 2-Mercaptoethanol (5 Äq., 135 μl, 1,93 mmol) in DMF entfernt. Die Waschschritte wurden unter Verwendung von DMF (3 × 30 ml), Isopropanol (3 × 30 ml), gefolgt von Ethylether (3 × 30 ml) durchgeführt, und das Harz wurde unter Vakuum getrocknet. Der so erhaltene N-MeTrp-Rest wurde drei Kopplungszyklen mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Arg (Pmc) (638 mg, 0,96 mmol), Fmoc-(D)Phe (373 mg, 0,96 mmol) und Fmoc-Apc (170 mg, 0,96 mmol) unterzogen. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 300 μl Valeriansäureanhydrid und 245 μl Pyridin in 15 ml DMF 5 h behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 30 ml DMF (dreimal), Isopropanol, CH₂Cl₂ (dreimal) und Ethylether (dreimal) gewaschen. Das so erhaltene Pentyl-Peptid-Harz wurde unter Vakuum getrocknet und mit 7 ml 60% Trifluoressigsäure in CH₂Cl₂, 1% Wasser und 615 ml Triethylsilan (10 Äq., 3,85 mmol) 160 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~5 bis 7 ml CH₂Cl₂ gewaschen, und die Filtrate wurden mit einer Schnellvakuumpumpe von Savant konzentriert, wobei sich das Rohprodukt ergab.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 30 mg (~10%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₇H₆₂N₁₀O₆, ber.: 863, beobachtet: m/z (864 M+H).
BEISPIEL 53
Penta-Apc-(D)Phe-Arg-N-methylTrp-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (700 mg, 0,385 mmol), das unter Verwendung des Verfahrens in Beispiel 29 hergestellt wurde, wurde unter Verwendung der DIC/HOBT-Kopplungsbedingungen einer Festphasensynthese unterzogen, und die Waschschritte wurden, wie in der Vorschrift 1 gezeigt, durchgeführt. Alle Aminosäurekopplungen wurden unter Verwendung von DIC (5 Äq.) und HOBT (2,5 Äq.) als die Kopplungsreagenzien und der Fmoc-Aminosäure (2,5 Äq.) durchgeführt. Das Harz wurde nach jeder Peptidkopplung den Waschschritten 1 bis 6, wie in Vorschrift 1 gezeigt, unterzogen. Ein Kopplungszyklus wurde mit Fmoc-Trp (461 mg, 0,96 mmol) durchgeführt. Nach der Fmoc-Entfernung von dem Trp-Rest wurde das so erhaltene Amin unter Verwendung von 2-Nitrobenzolsulfonylchlorid (5 Äq., 426 mg, 1,93 mmol) und DIPEA (5 Äq.) als die Base in DMF in dessen 2-Nitrobenzolsulfonylderivat umgewandelt. Die Waschschritte wurden unter Verwendung von DMF (6 × 30 ml), gefolgt von CH₂Cl₂ (3 × 30 ml) durchgeführt, und das Harz wurde unter Vakuum getrocknet. Das erhaltene Sulfonamid wurde unter Verwendung von Triphenylphosphin (5 Äq., 505 mg, 1,93 mmol), N,N-Diethylazodicarboxylat (5 Äq., 303 μl, 1,93 mmol) und Methanol (10 Äq., 156 μl, 3,85 mmol) in THF methyliert. Die Waschschritte wurden unter Verwendung von THF (6 × 30 ml), gefolgt von CH₂Cl₂ (5 × 30 ml) durchgeführt, und das Harz wurde unter Vakuum getrocknet. Die 2-Nitrobenzolsulfonylgruppe wurde dann unter Verwendung von 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (3 Äq., 173 μl, 1,16 mmol) und 2-Mercaptoethanol (5 Äq., 135 μl, 1,93 mmol) in DMF entfernt. Die Waschschritte wurden unter Verwendung von DMF (3 × 30 ml), Isopropanol (3 × 30 ml), gefolgt von Ethylether (3 × 30 ml) durchgeführt, und das Harz wurde unter Vakuum getrocknet. Der so erhaltene N-MeTrp-Rest wurde drei Kopplungszyklen mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Arg (Pmc) (638 mg, 0,96 mmol), Fmoc-(D)Phe (373 mg, 0,96 mmol) und Fmoc-Apc (170 mg, 0,96 mmol) unterzogen. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 300 μl Valeriansäureanhydrid und 245 μl Pyridin in 15 ml DMF 5 h behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 30 ml DMF (dreimal), Isopropanol, CH₂Cl₂ (dreimal) und Ethylether (dreimal) gewaschen. Das so erhaltene Pentyl-Peptid-Harz wurde unter Vakuum getrocknet und mit 7 ml 60% Trifluoressigsäure in CH₂Cl₂, 1% Wasser und 615 ml Triethylsilan (10 Äq., 3,85 mmol) 160 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~5 bis 7 ml CH₂Cl₂ gewaschen, und die Filtrate wurden mit einer Schnellvakuumpumpe von Savant konzentriert, wobei sich das Rohprodukt ergab.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 43 mg (14%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₅H₅₉N₉O₅, ber.: 806, beobachtet: m/z (807 M+H).
BEISPIEL 54
Bu-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Ala-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Ala (187 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Buttersäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 580 mg Butyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 145 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 61 mg (36%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₆₀N₁₀O₆, ber.: 849, beobachtet: m/z (850 M+H).
BEISPIEL 55
Bu-Carbamoyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Ala-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Ala (187 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit n-Butylisocyanat (5 Äq.) in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 600 mg Bu-Carbamoyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Bu-Carbamoyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 143 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 65 mg (37%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₇H₆₃N₁₁O₆, ber.: 878, beobachtet: m/z (879 M+H).
BEISPIEL 56
Phenylacetyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Ala-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Ala (187 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit Phenylessigsäure (82 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) in DMF behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 600 mg Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 138 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 53 mg (30%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₀H₆₀N₁₀O₆, ber.: 897, beobachtet: m/z (898 M+H).
BEISPIEL 57
Bu-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-β-Ala-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-β-Ala (186 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit Buttersäureanhydrid in 6% DIPEA/DMF 12 Stunden behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 550 mg Butyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 135 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 55 mg (32%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₆₀N₁₀O₆, ber.: 848, beobachtet: m/z (850 M+H).
BEISPIEL 58
Bu-Carbamoyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-β-Ala-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-β-Ala (186 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit n-Butylisocyanat (5 Äq.) in 6% DIPEA/DMF 12 Stunden behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 550 mg Butylcarbamoyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butylcarbamoyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 135 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 55 mg (31%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₇H₆₃N₁₁O₆, ber.: 878, beobachtet: m/z (879 M+H).
BEISPIEL 59
Phenylacetyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-β-Ala-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-β-Ala (186 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit Phenylessigsäure (82 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) in DMF behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 550 mg Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 129 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 49 mg (27%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₀H₆₀N₁₀O₆, ber.: 897, beobachtet: m/z (898 M+H).
BEISPIEL 60
Bu-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-2-Aba-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-2-Aba (215 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Buttersäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 610 mg Butyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 140 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 47 mg (26%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₀H₆₀N₁₀O₆, ber.: 897, beobachtet: m/z (898 M+H).
BEISPIEL 61
Bu-Carbamoyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-2-Aba-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-2-Aba (215 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit n-Butylisocyanat (5 Äq.) in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 610 mg Butylcarbamoyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butylcarbamoyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 152 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 55 mg (30%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₁H₆₃N₁₁O₆, ber.: 926, beobachtet: m/z (927 M+H).
BEISPIEL 62
Phenylacetyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-2-Aba-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-2-Aba (215 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit Phenylessigsäure (82 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) in DMF behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 615 mg Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 142 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 53 mg (29%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₄H₆₀N₁₀O₆, ber.: 945, beobachtet: m/z (955 M+H).
BEISPIEL 63
Bu-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-3-Amb-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-3-Amb (230 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Buttersäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 590 mg Butyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 140 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 50 mg (27%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₁H₆₂N₁₀O₆, ber.: 911, beobachtet: m/z (912 M+H).
BEISPIEL 64
Bu-Carbamoyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-3-Amb-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-3-Amb (230 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit n-Butylisocyanat (5 Äq.) in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 600 mg Butylcarbamoyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butylcarbamoyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 143 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 53 mg (28%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₂H₆₅N₁₁O₆, ber.: 940, beobachtet: m/z (941 M+H).
BEISPIEL 65
Phenylacetyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-3-Amb-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-3-Amb (230 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit Phenylessigsäure (82 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) in DMF behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 580 mg Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 135 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 49 mg (26%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₅H₆₂N₁₀O₆, ber.: 959, beobachtet: m/z (960 M+H).
BEISPIEL 66
Bu-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-4-Amb-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-4-Amb (230 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Buttersäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 615 mg Butyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 153 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 55 mg (30%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₁H₆₂N₁₀O₆, ber.: 911, beobachtet: m/z (912 M+H).
BEISPIEL 67
Phenylacetyl-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-4-Amb-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-4-Amb (230 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit Phenylessigsäure (82 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) in DMF behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 585 mg Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 142 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 47 mg (26%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₅H₆₂N₁₀O₆, ber.: 959, beobachtet: m/z (960 M+H).
BEISPIEL 68
Bu-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Ala-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Ala (187 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(2)Nal (265 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Buttersäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 610 mg Butyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 149 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 57 mg (33%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₈H₆₁N9O₆, ber.: 860, beobachtet: m/z (861 M+H).
BEISPIEL 69
Bu-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-β-Ala-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-β-Ala (187 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(2)Nal (265 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Buttersäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 605 mg Butyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 142 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 54 mg (32%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₈H₆₁N₉O₆, ber.: 860, beobachtet: m/z (861 M+H).
BEISPIEL 70
Bu-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-3-Amb-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-3-Amb (230 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(2)Nal (265 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Buttersäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 550 mg Butyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 125 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 44 mg (27%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₃H₆₃N₉O₆, ber.: 922, beobachtet: m/z (923 M+H).
BEISPIEL 71
Bu-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-2-Aba-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-2-Aba (215 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(2)Nal (265 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Buttersäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 510 mg Butyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 114 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 36 mg (20%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₂H₆₁N₉O₆, ber.: 908, beobachtet: m/z (909 M+H).
BEISPIEL 72
Bu-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-4-Amb-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-4-Amb (230 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(2)Nal (265 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Buttersäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 620 mg Butyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 139 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 56 mg (31%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₃H₆₃N₉O₆, ber.: 922, beobachtet: m/z (923 M+H).
BEISPIEL 73
Penta-Apc-(D)Phe-acylguanidin-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Glu(allyl) (250 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 gerührt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Die Allylschutzgruppe wurde unter Verwendung von PdCl₂/Triphenylphosphin/Tributylzinnhydrid in DMF unter Argon entfernt. Die Guanidinylierung wurde unter Verwendung von Boc-Guanidin·HCl (100 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) erzielt.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 140 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 30 mg (15%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₅₈N₁₀O₇, ber.: 977, beobachtet: m/z (978 M+H).
BEISPIEL 74
Bu-Apc-(D)Phe-PhenylhomoArg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-PhenylhomoArg (295 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Buttersäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 570 mg Butyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 140 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 54 mg (30%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₂H64N₁₀O6, ber.: 925, beobachtet: m/z (926 M+H).
BEISPIEL 75
Penta-Apc-(D)Phe-Cit-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Cit (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Apc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 590 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 152 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 65 mg (38%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₅₆N₉O₇, ber.: 850, beobachtet: m/z (851 M+H).
BEISPIEL 76
Penta-Adpc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Adpc (320 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 610 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 142 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 47 mg (26%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₂H₆₄N₁₀O₆, ber.: 925, beobachtet: m/z (926 M+H).
BEISPIEL 77
Penta-Ape-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ (Peak 1)
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Ape (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 610 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 140 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der erste Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 25 mg (15%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₅₈N₁₀O₆, ber.: 847, beobachtet: m/z (948 M+H).
BEISPIEL 78
Penta-Ape-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ (Peak 2)
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Ape (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 610 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 140 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der zweite Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 22 mg (14%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₅₈N₁₀O₆, ber.: 847, beobachtet: m/z (948 M+H).
BEISPIEL 79
Penta-Abc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Abc (270 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 580 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 155 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 61 mg (36%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₄H₆₄N₁₀O₆, ber.: 829, beobachtet: m/z (830 M+H).
BEISPIEL 80
Penta-Achc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Achc (278 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 580 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 145 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 65 mg (38%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₆₆N₁₀O₆, ber.: 855, beobachtet: m/z (856 M+H).
BEISPIEL 81
Herstellung von Bu-Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehenden Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D,L)Atc (252 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Buttersäureanhydrid in 6% DEPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 550 mg Bu-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Bu-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 110 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der zweite Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 42 mg (26%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₃H₅₄N₁₀O₆, ber.: 807, beobachtet: m/z (808 M+H).
BEISPIEL 82
Penta-5-Br-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-5-Br-(D,L)Atc (310 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 600 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 135 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 45 mg (25%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₄H₅₅N₁₀O₆Br, ber.: 900, beobachtet: m/z (901 M+H).
BEISPIEL 83
Penta-5-Br-Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ (Peak 1)
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D,L)-5-BrAtc (310 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 590 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 130 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der erste Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 40 mg (22%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: Cl₄₄H₅₅N₁₀O₆Br, ber.: 900, beobachtet: m/z (901 M+H).
BEISPIEL 84
Penta-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ (Peak 2)
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D,L)-5-BrAtc (310 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 580 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 145 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der zweite Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 55 mg (30%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₄H₅₅N₁₀O₆Br, ber.: 900, beobachtet: m/z (901 M+H).
BEISPIEL 85
Penta-5-Cl-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226, mg, 0,6 mmol), Fmoc-5-ClAtc (290 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 620 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 150 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 48 mg (28%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₄H₅₅N₁₀O₆Cl, ber.: 855, beobachtet: m/z (856 M+H).
BEISPIEL 86
Penta-5-MeO-(D,L)Atc-(D)Phe-Ara-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-5-MeO(D,L)Atc (300 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 610 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 155 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 46 mg (27%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₅H₅₈N₁₀O₇, ber.: 851, beobachtet: m/z (852 M+H).
BEISPIEL 87
Penta-5-EtO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-5-EtO(D,L)Atc (310 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 594 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit 2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 145 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 41 mg (24%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₆₀N₁₀O₇, ber.: 865, beobachtet: m/z (866 M+H).
BEISPIEL 88
Penta-5-iPrO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-5-iPrO(D,L)Atc (310 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 580 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 142 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 43 mg (25%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₇H₆₂N₁₀O₇, ber.: 879, beobachtet: m/z (880 M+H).
BEISPIEL 89
Penta-5-Me-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-5-Me(D,L)Atc (290 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 610 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 143 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 40 mg (24%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₅H₅₈N₁₀O₆, ber.: 835, beobachtet: m/z (836 M+H).
BEISPIEL 90
Penta-5-Et-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-5-Et(D,L)Atc (285 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 620 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 154 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 53 mg (31%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₆₀N₁₀O₆, ber.: 849, beobachtet: m/z (850 M+H).
BEISPIEL 91
Penta-5-iPr-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-5-iPr(D,L)Atc (300 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 600 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisöl und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 149 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 47 mg (27%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₇H₆₂N₁₀O₆, ber.: 863, beobachtet: m/z (864 M+H).
BEISPIEL 92
Penta-5-DmaAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ (Peak 1)
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-5-Dma(D,L)Atc (300 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 610 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 149 eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der erste Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 22 mg (13%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₆₁N₁₁O₆, ber.: 864, beobachtet: m/z (865 M+H).
BEISPIEL 93
Penta-5-DmaAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ (Peak 2)
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-5-Dma(D,L)Atc (300 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 610 ml Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 149 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der zweite Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 27 mg (16%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₆₁N₁₁O₆, ber.: 864, beobachtet: m/z (865 M+H).
BEISPIEL 94
Bu-(D,L)-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-Trp-2-Aba-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-2-Aba (215 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D,L)-5-BrAtc (310 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Buttersäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 600 mg Butyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 141 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 35 mg (19%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₈H₅₅N₁₀O₆Br, ber.: 948, beobachtet: m/z (949 M+H).
Beispiel 95
Bu-Carbamoyl-(D,L)-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-Trp-2-Aba-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgefürt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-2-Aba (215 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D,L)-5-BrAtc (310 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit n-Butylisocyanat (5 Äq.) in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 12 Stunden behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 620 mg Butylcarbamoyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butylcarbamoyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 153 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 41 mg (21%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₉H₅₈N₁₁O₆Br, ber.: 977, beobachtet: m/z (978 M+H).
BEISPIEL 96
Phenylacetyl-(D,L)-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-Trp-2-Aba-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-2-Aba (215 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D,L)-5-BrAtc (310 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit Phenylessigsäure und HBTU in DMF behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 610 mg Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 148 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 38 mg (19%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₂H₅₅N₁₀O₆Br, ber.: 996, beobachtet: m/z (997 M+H).
BEISPIEL 97
Penta-(D,L)-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(2)Nal (265 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D,L)-5-BrAtc (310 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 620 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 162 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 60 mg (33%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₅₆N₉O₆Br, ber.: 911, beobachtet: m/z (912 M+H).
BEISPIEL 98
3-Carboxylpropanoyl-(D,L)-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(2)Nal (265 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D,L)-5-BrAtc (310 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit Bernsteinsäure und HBTU in DMF behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 610 mg 3-Carboxylpropanoyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das 3-Carboxylpropanoyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 158 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 55 mg (30%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₅H₅₂N₉O₈Br, ber.: 927, beobachtet: m/z (928 M+H).
BEISPIEL 99
Phenylacetyl-(D,L)-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(2)Nal (265 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D,L)-5-BrAtc (310 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit Phenylessigsäure und HBTU in DMF behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 600 mg Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Phenylacetyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 161 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 58 mg (30%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₉H₅₄N₉O₆Br_, ber.: 945, beobachtet: m/z (946 M+H).
BEISPIEL 100
Bu-(D,L)-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-2-Aba-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-2-Aba (215 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(2)Nal (265 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D,L)-5-BrAtc (310 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Buttersäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 590 mg Butyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Butyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 140 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 30 mg (16%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₀H₅₆N₉O₆Br, ber.: 959, beobachtet: m/z (960 M+H).
BEISPIEL 101
Penta-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Appc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 620 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 153 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 65 mg (38%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₅H₅₉N₁₁O₆, ber.: 850, beobachtet: m/z (851 M+H).
BEISPIEL 102
Penta-Appc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(2)Nal(265 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Appc (275 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 610 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 145 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 55 mg (32%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₇H₆₀N₁₀O₆, ber.: 861, beobachtet: m/z (862 M+H).
BEISPIEL 103
Penta-2-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-2-MeAppc (285 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 580 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit 2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 145 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 59 mg (35%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₆₁N₁₁O₆, ber.: 864, beobachtet: m/z (865 M+H).
BEISPIEL 104
Penta-2-iPrAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-2-iPrAppc (295 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 600 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 147 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 49 mg (27%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₈H₆₅N₁₁O₆, ber.: 892, beobachtet: m/z (893 M+H).
BEISPIEL 105
Penta-3-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-3-MeAppc (285 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 595 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 140 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 55 mg (32%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₆₁N₁₁O₆, ber.: 864, beobachtet: m/z (865 M+H).
BEISPIEL 106
Penta-3-MeOAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-3-MeOAppc (290 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 600 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 154 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 50 mg (29%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₆₁N₁₁O₇, ber.: 880, beobachtet: m/z (881 M+H).
BEISPIEL 107
Penta-4-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-4-MeAppc (285 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 600 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 150 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 57 mg (33%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₆H₆₁N₁₁O₆, ber.: 864, beobachtet: m/z (865 M+H).
BEISPIEL 108
Penta-4-ClAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-4-ClAppc (290 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 580 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 140 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 49 mg (28%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₄₅H₅₈N₁₁O6_Cl, ber.: 884, beobachtet: m/z (885 M+H).
BEISPIEL 109
Penta-4-PhOAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (360 mg, 0,2 mmol) aus Beispiel 29 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vorschrift 1 einer Festphasensynthese unterzogen. Alle Kopplungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als das Kopplungsmittel und DIPEA (3 Äq.) als Base durchgeführt. Fünf Kopplungszyklen wurden mit jeweils einem Zyklus mit Fmoc-Gly (180 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Trp (260 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (400 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-(D)Phe (240 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol), Fmoc-4-PhOAppc (325 mg, 0,6 mmol) und HBTU (226 mg, 0,6 mmol) durchgeführt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 der Vorschrift 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde abfiltriert und nacheinander mit jeweils 20 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 610 mg Pentyl-Pentapeptid-Harz ergaben.
Das Pentyl-Pentapeptid-Harz wurde mit 40 μl Ethandithiol, 40 μl Dimethylsulfid, 120 μl Anisol und 4 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate wurden in gekühltem Ethylether gefällt. Die Niederschläge wurden abzentrifugiert, und die Etherschicht wurde dekantiert. Der Rückstand wurde mit zwei oder drei Volumina Et₂O gewaschen und erneut abzentrifugiert, und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wobei sich 143 mg eines cremefarbenen Feststoffes ergaben.
Dieses Rohmaterial wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C₁₈-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 10 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 60 min, Fließgeschwindigkeit 8 ml/min, Nachweis bei 280 nm, eluiert. Der Hauptpeak wurde durch Analyse mittels analytischer HPLC von den gesammelten Fraktionen abgetrennt, vereinigt und lyophilisiert, wobei sich 41 mg (22%) eines weißen, amorphen Pulvers ergaben. Diese Verbindung war gemäß HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₁H₆₃N₁₁O₇, ber.: 942, beobachtet: m/z (943 M+H).
BEISPIEL FÜR BIOLOGISCHE AKTIVITAT:
Beispiel A: Agonistentest
Verfahren
Beschreibung: 293-Zellen (ATCC CRL-1573) wurden mit DNA-Konstrukten, umfassend entweder die MC-4-Rezeptor-DNA oder die MC-1-Rezeptor-DNA, transfiziert, und man ließ sie auf Platten mit 96 Vertiefungen wachsen. MC-4- und MC-1-codierende DNA und die entsprechenden Proteinsequenzen sind in dem Fachgebiet bekannt und z. B. in Cone et al., Rec. Prog. Hormone Res. (1996) 51: 287–318, beschrieben. Die Zellen wurden entweder mit 100 nM NDP-αMSH oder den zu untersuchenden Verbindungen stimuliert. Cyclisches AMP wurde aus den Zellen extrahiert, und die Konzentrationen wurden unter Verwendung eines cAMP-SPA-Tests von Biotrak bestimmt. Agonisten wurden als die Verbindungen identifiziert, die eine Zunahme an cAMP bewirkten.
Zellkultur: 293MC4-Zellen (die, wie vorstehend beschrieben, erhalten wurden) wurden in 75 cm² Kolben in D-MEM, das mit 10% FCS und 500 μg/ml G418 ergänzt war, gezüchtet. Die Zellen wurden trypsinisiert und auf mit Gewebekultur behandelten Platten mit flachem Boden und 96 Vertiefungen 1:3 verteilt. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz (2. bis 4. Tag) stimuliert.
cAMP-Antwort: In 100%igem DMSO in Reihe verdünnte Verbindungen wurden in D-MEM, das 10% FBS und 0,1 mM IBMX enthielt, 1:200 (2,5 μl Verbindungsverdünnung + 500 μl Medium) weiter verdünnt. Für nichtstimulierte Zellen wurden 2,5 μl DMSO zu 500 μl Medium gegeben. Für NDP-αMSH-stimulierte Zellen wurden 2,5 μl 20 μM NDP-αMSH in 100%igem DMSO zu 500 μl Medium gegeben (Endkonz. 100 nM).
Die Endkonzentration von DMSO in allen Vertiefungen betrug 0,5%.
Anmerkung: Jede Probe ließ man doppelt auf getrennten Platten laufen.
Das Kulturmedium wurde von den konfluent bewachsenen Kulturplatten mit 96 Vertiefungen entfernt und durch 200 μl der vorstehenden Verdünnungen in den geeigneten Vertiefungen ersetzt. Die Platten wurden 1 h bei RT inkubiert. Das Medium wurde entfernt, und die Platten wurden 1 × mit 200 μl PBS pro Vertiefung gewaschen. cAMP wurde durch die Zugabe von 60 μl 70%igem Ethanol (im Kühlschrank aufbewahrt) extrahiert. Nach einer Extraktionsdauer von 30 min wurden 10 μl Ethanolextrakt auf die cAMP-Testplatte überführt oder die Proben wurden bei –20°C aufbewahrt, bis der cAMP-Test durchgeführt wurde.
cAMP-Test: Die extrahierten Proben und alle in dem Kit enthaltenen Reagenzien wurden auf Raumtemperatur gebracht. 10 μl Ethanolextrakt, 40 μl Testpuffer, 50 μl [¹²⁵I]cAMP, 50 μl Antiserum und 50 μl SPA-Kügelchen wurden auf eine OptiPlate mit 96 Vertiefungen gegeben. Das Gesamtvolumen in den Vertiefungen betrug nach der Zugabe 200 μl. Die Platten wurden versiegelt und 15 bis 20 h bei Raumtemperatur inkubiert. Das an die SPA-Kügelchen bindende [¹²⁵I]cAMP wurde durch 2-mintütiges Zählen jeder Platte auf einem TopCount^TM von Packard bestimmt.
Anmerkung: Jede Platte enthielt Proben von Kontrollen für nichtstimulierte Zellen und NDP-αMSH für stimulierte Zellen.
Beispiel A
Tabletten, enthaltend die folgenden Bestandteile, können auf herkömmliche Art und Weise hergestellt werden:

Bestandteile pro Tablette

Verbindung der Formel I 10,0–100,0 mg

Lactose 125,0 mg

Maisstärke 75,0 mg

Talk 4,0 mg

Magnesiumstearat 1,0 mg
Beispiel B
Kapseln, enthaltend die folgenden Bestandteile, können auf herkömmliche Art und Weise hergestellt werden:

Bestandteile pro Kapsel

Verbindung der Formel I 25,0 mg

Lactose 150,0 mg

Maisstärke 20,0 mg

Talk 5,0 mg
Beispiel C
Injektionslösungen können die folgende Zusammensetzung aufweisen:

Verbindung der Formel I 3,0 mg

Gelatine 150,0 mg

Phenol 4,7 mg

Wasser für Injektionslösungen ad 1,0 ml

Claims

Verbindung umfassend die folgende Struktur (S1):
wobei R¹, R⁶, R⁷, R⁸, m, n, A und B wie in a) bis d) definiert sind und wobei die Verbindung ausgewählt ist aus a) einer Verbindung der Formel:
wobei m gleich 0 oder 1 ist; n gleich 0 oder 1 ist; R¹ ein unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; ein mit Phenyl oder Carboxyl mono-substituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; unsubstituiertes Phenyl; oder mit Fluor, Chlor oder geradkettigem oder verzweigtem Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen mono-substituiertes Phenyl ist; X
ist, wobei R², R³ und R⁴ unabhängig Wasserstoff oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind, wobei, wenn R³ Alkoxy ist, R² und R⁴ beide Wasserstoff sind; R⁹ Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder unsubstituiertes Phenoxy ist; R¹¹ Cyclohexyl, Cycloheptyl oder ein verzweigtes Alkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen ist; R⁶ Wasserstoff oder Methyl ist; R⁷
ist; Y -CH₂-, -CH₂CH₂- oder
ist; und R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist; oder Y
ist; und R⁸ Wasserstoff ist; b) einer Verbindung der Formel:
wobei m gleich 0 oder 1 ist; n gleich 0 oder 1 ist; R¹ ein unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; ein mit Phenyl oder Carboxyl mono-substituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; unsubstituiertes Phenyl; oder mit Fluor, Chlor oder geradkettigem oder verzweigtem Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen mono-substituiertes Phenyl ist; R², R³ und R⁴ unabhängig Wasserstoff; ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; Hydroxy; ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; oder Chlor sind, wobei, wenn R³ Alkyl, Hydroxy, Alkoxy oder Chlor ist, R² und R⁴ beide Wasserstoff sind; R⁶ Wasserstoff oder Methyl ist; R⁷
ist; Y -CH₂-, -CH₂CH₂- oder
ist; und R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist; oder Y
ist; und R⁸ Wasserstoff ist; c) einer Verbindung der Formel:
wobei m gleich 0 oder 1 ist; n gleich 0 oder 1 ist; R¹ ein unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen; ein mit Phenyl oder Carboxyl mono-substituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; oder unsubstituiertes Phenyl; oder mit Fluor, Chlor oder geradkettigem oder verzweigtem Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen mono-substituiertes Phenyl ist; R⁷
ist; Y -CH₂-, -CH₂CH₂- oder
ist; und R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist; oder Y
ist; und R⁸ Wasserstoff ist; R¹⁰ Wasserstoff, Halogen, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder -NR¹²R¹³ ist, wobei R¹² und R¹³ jeweils unabhängig ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen sind oder zusammen -(CH₂)_q- sind, wobei q gleich 3, 4 oder 5 ist; und d) einer Verbindung der Formel:
wobei R¹ unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen ist; R⁶ Wasserstoff oder Methyl ist; R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist; p gleich 2, 3 oder 4 ist und R¹⁴
ist, oder p gleich 4 ist und R¹⁴
ist, oder p gleich 3 ist und R¹⁴
ist, oder e)
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel:
wobei m gleich 0 oder 1 ist; n gleich 0 oder 1 ist; R¹ ein unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; ein mit Phenyl oder Carboxyl mono-substituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; unsubstituiertes Phenyl; oder mit Fluor, Chlor oder geradkettigem oder verzweigtem Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen mono-substituiertes Phenyl ist; X
ist, wobei R², R³ und R⁴ unabhängig Wasserstoff oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind, wobei, wenn R³ Alkoxy ist, R² und R⁴ beide Wasserstoff sind; R⁹ Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder unsubstituiertes Phenoxy ist; R¹¹ Cyclohexyl, Cycloheptyl oder ein verzweigtes Alkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen ist; R⁶ Wasserstoff oder Methyl ist; R⁷
ist; Y -CH₂-, -CH₂CH₂- oder
ist; und R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist; oder Y
ist; und R⁸ Wasserstoff ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R⁶ Wasserstoff ist und R⁸ Wasserstoff ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei n gleich 1 ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R⁷
ist.
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel:
wobei m gleich 0 oder 1 ist; n gleich 0 oder 1 ist; R¹ ein unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; ein mit Phenyl oder Carboxyl mono-substituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; unsubstituiertes Phenyl; oder mit Fluor, Chlor oder geradkettigem oder verzweigtem Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen mono-substituiertes Phenyl ist; R², R³ und R⁴ unabhängig Wasserstoff; ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; Hydroxy; ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen; oder Chlor sind, wobei, wenn R³ Alkyl, Hydroxy, Alkoxy oder Chlor ist, R² und R⁴ beide Wasserstoff sind; R⁶ Wasserstoff oder Methyl ist; R⁷
ist, Y -CH₂-, -CH₂CH₂- oder
ist; und R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist; oder Y
ist; und R⁸ Wasserstoff ist.
Verbindung nach Anspruch 6, wobei R⁷
ist.
Verbindung nach Anspruch 7, wobei n gleich 0 ist.
Verbindung nach Anspruch 7, wobei n gleich 1 ist.
Verbindung nach Anspruch 9, wobei Y -CH₂-, CH₂CH₂- oder
ist.
Verbindung nach Anspruch 10, wobei m gleich 1 ist.
Verbindung nach Anspruch 10, wobei m gleich 0 ist.
Verbindung nach Anspruch 12, wobei R², R³ und R⁴ Wasserstoff sind.
Verbindung nach Anspruch 13, wobei R¹ unsubstituiertes geradkettiges Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 13, wobei R¹ unsubstituiertes Phenyl ist.
Verbindung nach Anspruch 12, wobei R³ Alkyl, Hydroxy, Alkoxy oder Chlor ist.
Verbindung nach Anspruch 16, wobei R³ Hydroxy oder Alkoxy ist.
Verbindung nach Anspruch 12, wobei R² Alkoxy ist, R³ Wasserstoff ist und R⁴ Wasserstoff ist.
Verbindung nach Anspruch 9, wobei Y
ist.
Verbindung nach Anspruch 19, wobei m gleich 1 ist.
Verbindung nach Anspruch 19, wobei m gleich 0 ist.
Verbindung nach Anspruch 6, wobei R², R³ und R⁴ Wasserstoff sind und R⁷ ist.
Verbindung nach Anspruch 22, wobei n gleich 1 ist und m gleich 0 ist.
Verbindung nach Anspruch 23, wobei Y -CH₂, -CH₂CH₂- oder
ist.
Verbindung nach Anspruch 24, wobei R¹ ein unsubstituiertes geradkettiges Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 24, wobei R¹ ein unsubstituiertes Phenyl; oder mit Phenyl oder Carboxyl substituiertes Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 23, wobei R¹ unsubstituiertes Niederalkyl ist und Y
ist.
Verbindung nach Anspruch 2 der Formel:
wobei R¹ ein unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist; R⁷
ist, R¹¹ Cyclohexyl oder ein verzweigtes Alkyl mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen ist; und Y -CH₂- ist.
Verbindung nach Anspruch 2 der Formel:
wobei R¹ ein unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist; R⁷
ist, Y
ist; und R⁹ Wasserstoff, ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Fluor, Chlor oder unsubstituiertes Phenoxy ist.
Verbindung nach Anspruch 29, wobei R⁹ Wasserstoff ist.
Verbindung nach Anspruch 29, wobei R⁹ ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist.
Verbindung nach Anspruch 29, wobei R⁹ ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder unsubstituiertes Phenoxy ist.
Verbindung nach Anspruch 29, wobei R⁹ Chlor ist.
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel:
wobei m gleich 0 oder 1 ist; n gleich 0 oder 1 ist; R¹ ein unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen; ein mit Phenyl oder Carboxyl mono-substituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen; oder unsubstituiertes Phenyl; oder mit Fluor, Chlor oder geradkettigem oder verzweigtem Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen mono-substituiertes Phenyl ist; R⁷
ist; Y -CH₂-, -CH₂CH₂- oder
ist; und R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist; oder Y
ist; und R⁸ Wasserstoff ist; R¹⁰ Wasserstoff, Halogen, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder -NR¹²R¹³ ist, wobei R¹² und R¹³ jeweils unabhängig ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen sind oder zusammen -(CH₂)_q- sind, wobei q gleich 3, 4 oder 5 ist.
Verbindung nach Anspruch 34, wobei R⁶ und R⁸ jeweils Wasserstoff sind; R⁷
ist und n gleich 1 ist.
Verbindung nach Anspruch 35, wobei Y -CH₂- ist und m gleich 0 ist.
Verbindung nach Anspruch 36, wobei R¹⁰ Wasserstoff oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist.
Verbindung nach Anspruch 36, wobei R¹⁰ Halogen ist.
Verbindung nach Anspruch 36, wobei R¹⁰ geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist.
Verbindung nach Anspruch 36, wobei R¹⁰ -NR¹²R¹³ ist und R¹² und R¹³ beide Methyl sind.
Verbindung nach Anspruch 35, wobei Y
ist und R¹⁰ Halogen ist.
Verbindung nach Anspruch 34, wobei R⁶ und R⁸ Wasserstoff sind; R⁷
ist; und R¹⁰ Halogen ist.
Verbindung nach Anspruch 1 der Formel:
wobei R¹ unsubstituiertes geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen ist; R⁶ Wasserstoff oder Methyl ist; R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist; p gleich 2, 3 oder 4 ist und R¹⁴
ist, oder p gleich 4 ist und R¹⁴
ist, oder p gleich 3 ist und R¹⁴
ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 43, ausgewählt aus Penta-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Penta-4-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Penta-4-EtOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Bu-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-beta-Ala-NH₂, Penta-Apc-(D)Phe-Cit-Trp-Gly-NH₂, Penta-Abc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Penta-Achc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Penta-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, Penta-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂, und Penta-4-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂.
Verfahren zur Herstellung von Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 44, wobei das Verfahren Abspalten einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 44, die an einen festen Träger gebunden ist, von dem festen Träger mit einer Säure umfasst.
Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 44, die durch ein Verfahren nach Anspruch 45 hergestellt sind.
Arzneimittel umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 44 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Hilfsstoff.
Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 44 zur Verwendung als therapeutische Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Erkrankungen, die mit einem Melanocortin-4-Rezeptor in Zusammenhang stehen, wie Fettsucht.
Verwendung von Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 44 zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Krankheiten, die mit einem Melanocortin-4-Rezeptor in Zusammenhang stehen, wie Fettsucht.