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DE60133708T2 - Verfahren zur Analyse von Nicht-Protein Komponenten mittels Verwendung einer Protease aus einem Bacillus-Stamm - Google Patents

Verfahren zur Analyse von Nicht-Protein Komponenten mittels Verwendung einer Protease aus einem Bacillus-Stamm Download PDF

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DE60133708T2
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protein
nucleic acid
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Thomas Dr. Meier
Johnny Staepels
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Description

  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse einer Nichtprotein-Zielkomponente eines aus einer biologischen Probe stammenden Gemischs aus Nichtprotein- und Protein-Komponenten mit einer Protease aus einem Bacillus-Stamm. Die Erfindung betrifft zudem ein Verfahren zur Analyse einer Nukleinsäure-Zielkomponente eines Gemischs aus Nukleinsäuren umfassenden Nichtprotein-Komponenten und Protein-Komponenten, wobei das Gemisch aus einer biologischen Probe stammt, wobei man in den Verfahrensschritten das Gemisch mit einer Protease aus einem Bacillus-Stamm inkubiert, gegebenenfalls die Nukleinsäure-Zielkomponente amplifiziert und die Nukleinsäure-Zielkomponente bestimmt oder nachweist.
  • Stand der Technik
  • Viele biologische Substanzen, insbesondere Nukleinsäuren, bieten spezielle Herausforderungen hinsichtlich der Isolation aus ihrer natürlichen Umgebung. Einerseits sind sie oft in sehr geringen Konzentrationen zugegen, und andererseits findet man sie oft in der Anwesenheit vieler anderer fester und gelöster Substanzen, beispielsweise nach der Lyse von Zellen. Dadurch werden sie schwer zu isolieren oder zu messen, insbesondere in biospezifischen Tests, die die Erfassung spezifischer Analyten, beispielsweise Nukleinsäuren, oder spezifischer Analyt-Eigenschaften ermöglichen, und sie spielen eine größere Rolle auf dem Gebiet der Diagnostik und Bioanalytik in Forschung und Entwicklung. Beispiele für biospezifische Tests sind Hybridisierungstests, Immuntests und Rezeptor-Liganden-Tests. Hybridisierungstests verwenden die spezifische Basenpaarung für den molekularen Nachweis von Nukleinsäure-Analyten, beispielsweise RNA und DNA. Somit können Oligonukleotid-Sonden mit 18 bis 20 Nukleotiden Länge die spezifische Erkennung einer ausgewählten komplementären Sequenz, beispielsweise im Humangenom, ermöglichen. Ein weiterer Test, der die selektive Bindung von zwei Oligonukleotid-Primern verwendet, ist die Polymerasekettenreaktion (PCR), die in US 4 683 195 beschrieben ist. Dieses Verfahren ermöglicht die selektive Amplifikation eines spezifischen Nukleinsäure-Bereichs auf nachweisbare Mengen durch eine thermostabile Polymerase in der Anwesenheit von Desoxynukleotidtriphosphaten in mehreren Zyklen.
  • Wie vorstehend beschrieben, können die biologischen Substanzen vor ihrer Analyse in einer der vorstehend genannten Tests oder ihrer Verwendung für andere Verfahren isoliert oder aus biologischen Proben gereinigt werden, die komplexe Gemische verschiedener Komponenten enthalten, wie beispielsweise Protein- oder Nicht-Protein-Komponenten. Für die ersten Schritte werden oft Verfahren verwendet, die die Anreicherung der interessierenden Komponente ermöglichen, beispielsweise des Nichtprotein-Materials, wie Nukleinsäuren. Diese sind oft in einer Bakterienzelle, einer Pilzzelle, einem Viruspartikel oder der Zelle eines komplexeren Organismus enthalten, wie einer Humanblutzelle oder einer Pflanzenzelle. Die interessierende Komponente kann auch als "Zielkomponente" bezeichnet werden.
  • Zur Freisetzung der Zellen oder Partikel können diese mit Enzymen oder mit Chemikalien behandelt werden, so dass die Zellwände dieser Organismen gelöst, abgebaut oder denaturiert werden. Dieses Verfahren wird allgemein als Lyse bezeichnet. Die resultierende Lösung, die ein solches lysiertes Material enthält, wird als Lysat bezeichnet. Ein Problem, dem man oft bei der Lyse begegnet, ist, dass andere Enzyme die interessierende Nichtprotein-Komponente abbauen, beispielsweise kommen Nukleinsäuren abbauende Desoxyribonukleasen oder Ribonukleasen mit der interessierenden Komponente während der Lyse in Kontakt. Diese abbauenden Enzyme können auch außerhalb der Zellen zugegen sein, oder können in verschiedenen Zellkompartimenten vor der Lyse räumlich getrennt sein und dann mit der interessierenden Komponente in Kontakt kommen. Andere Komponenten, die bei diesem Verfahren freigesetzt werden, können beispielsweise Endotoxine sein, die zur Familie der Lipopolysaccharide gehören, die für Zellen toxisch sind und Probleme für Produkte verursachen können, die bei der Therapie von Mensch oder Tier verwendet werden sollen.
  • Es gibt eine Reihe von Maßnahme zur Behebung dieses vorstehend genannten Problems. Es werden üblicherweise chaotrope Mittel verwendet, wie beispielsweise Guanidiniumthiocyanat oder anionische, kationische, zwitterionische oder nichtionische Detergenzien, wenn Nukleinsäuren freigesetzt werden sollen. Es ist ebenfalls vorteilhaft, Proteasen zu verwendet, die diese Enzyme oder ungewünschten Proteine rasch zersetzen. Dieses kann jedoch ein anderes Problem erzeugen, da die Substanzen oder Enzyme die Reagenzien oder Komponenten in den nachfolgenden Schritten stören können.
  • Enzyme, die vorteilhafterweise in solchen Lyse- oder Probenpräparationsverfahren verwendet werden können, sind Enzyme, die die Amidbindungen in Proteinsubstraten spalten und die als Proteasen (oder austauschbar) Peptidasen klassifiziert werden können (siehe Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms, W. H. Freeman and Company, San Francisco, Kapitel 3). Proteasen, die im Stand der Technik verwendet werden, sind beispielsweise alkalische Proteasen ( WO 98/04730 ) oder saure Proteasen ( US 5 386 024 ). Die allgemein im Stand der Technik verwendete Protease für die Probenpräparation zur Isolation von Nukleinsäuren ist Proteinase K aus Tritirachium album (siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989), die bei etwa neutralem pH-Wert aktiv ist und zur Familie von Proteasen gehört, die dem Fachmann als Subtilisine bekannt sind. Ein Subtilisin ist eine Serinprotease, die durch grampositive Bakterien oder Pilze produziert wird.
  • Bakterien der Bacillus-Art sezernieren zwei extrazelluläre Spezies der Protease, eine neutrale oder Metalloprotease, und eine alkalische Protease, die funktionell eine Serin-Endopeptidase ist, welche als Subtilisin bezeichnet wird. Eine Serinprotease ist ein Enzym, das die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysiert, worin sich ein essentieller Serin-Rest an der aktiven Stelle befindet (White, Handler und Smith, 1973, "Principles of Biochemistry," 5. Auflage, McGraw-Hill Book Company, N. Y., S. 271–272). Die Serinproteasen haben Molekulargewichte im Bereich von 25,000 bis 30,000 Da (Dalton). Sie hydrolysieren einfache terminale Ester und haben ähnliche Aktivität wie eukaryotisches Chymotrypsin, das auch eine Serinprotease ist. Der alternative Begriff, alkalische Protease, spiegelt das hohe pH-Optimum der Serinproteasen, von pH 9,0 bis 11,0 wider (für einen Überblick siehe Priest, 1977, Bacteriological Rev. 41: 711–753).
  • Es wurde eine große Vielzahl an Subtilisinen identifiziert (siehe beispielsweise Kurihara et al., 1972, J. Biol. Chem. 247: 5629–5631; Stahl und Ferrari, 1984, J. Bacteriol. 158: 411–418; Vasantha et al., 1984, J. Bacteriol. 159: 811–819, Jacobs et al., 1985, Nucl. Acids Res. 13: 8913–8926; Nedkov et al., 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366: 421–430; Svendsen et al., 1986, FEBS Lett 196: 228–232; Meloun et al., 1985, FEBS. Lett. 183: 195–200) einschließlich Proteinase K aus Tritirachium album (Jany und Mayer, 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366: 584–492). Subtilisine sind durch ihre Primär- und ihre Tertiärstruktur gut charakterisiert (siehe beispielsweise Kraut, 1977, Ann. Rev. Biochem. 46: 331–358; Kurihara et al., 1972, J. Biol. Chem. 247: 5629–5631; Stahl und Ferrari, 1984, J. Bacteriol. 158: 411–418; Vasantha et al., 1984, J. Bacteriol. 159: 811–819; Jacobs et al., 1985, Nucl. Acids Res. 13: 8913–8926; Nedkov et al., 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366: 421–430; Svendsen et al., 1986, FEBS Lett. 196: 228–232; Meloun et al., 1985, FEBS Lett. 183: 195–200; Jany und Mayer, 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366: 485–492).
  • Im erfindungsgemäßen Zusammenhang sind die Aminosäure- und DNA-Sequenzen von zwei weiteren Serinproteasen von besonderem Interesse. Diese Proteasen stammten aus zwei Bacillus lentus Varianten, 147 und 309, die bei der NCIB hinterlegt sind und mit den Zugriffsnummern NCIB 10147 bzw. NCIB 10309, bezeichnet werden (siehe WO 89/06279 und US 3,723,250 ). Der Einfachheit halber werden die durch diese Stämme produzierten Subtilisine als Subtilisin 147 bzw. Subtilisin 309 bezeichnet, and die Gene, die diese Proteine codieren, werden als die Subtilisin 147- und 309-Gene bezeichnet. Die Offenbarung dieser Sequenzen findet sich in WO 89/06279 . Die Äquivalente dazu sind EP 396608 und US 5 741 694 . Subtilisine werden häufig in der Industrie verwendet, insbesondere in Detergenzformulierungen, die zum Wäschewaschen verwendet werden.
  • In den nächsten Schritten der Probenpräparation, die auf den Lyseschritt folgen, wird die interessierende Komponente weiter angereichert. Wenn die Nichtprotein-Komponenten von Interesse beispielsweise Nukleinsäuren sind, werden sie gewöhnlich aus dem komplexen Lysegemisch extrahiert, bevor sie in einem Test auf Sondenbasis verwendet werden.
  • Es gibt verschiedene Verfahren zur Extraktion von Nukleinsäuren:
    • – Sequenzabhängige oder biospezifische Verfahren, wie beispielsweise:
    • • Affinitätschromatographie
    • • Hybridisierung an immobilisierte Sonden
    • – Sequenzunabhängige oder physikalisch-chemische Verfahren, wie beispielsweise:
    • • Flüssigkeits-Flüssigkeits-Extraktion mit beispielsweise Phenol-Chloroform
    • • Fällung mit beispielsweise reinem Ethanol
    • • Extraktion mit Filterpapier
    • • Extraktion mit micellenbildenden Mitteln, wie Cetyl-Trimethyl-Ammoniumbromid
    • • Bindung an immobilisierte, interkalierende Farbstoffe, beispielsweise Acridin-Derivate
    • • Adsorption an Silicagel oder Diatomeenerde
    • • Adsorption an magnetische Glaspartikel (MGP) oder Organosilanpartikel unter chaotropen Bedingungen
  • Besonders interessant für Extraktionszwecke ist die Adsorption von Nukleinsäuren an eine Glasoberfläche, obgleich auch andere Oberflächen möglich sind. Viele Verfahren zur Isolation von Nukleinsäuren aus ihrer natürlichen Umgebung wurden in den letzten Jahren durch die Verwendung ihres Bindungsverhalten an Glasoberflächen vorgeschlagen.
  • Wie bereits erwähnt, ist die Protease, die weithin im Stand der Technik zur Probenpräparation zur Isolation von Nukleinsäuren verwendet wird, Proteinase K aus Tritirachium album. Diese Protease hat jedoch den Nachteil, dass die Produktion relativ teuer ist. Proteinase K ist zudem nachteilig bei Verfahren, die Magnetglasteilchen zur Nukleinsäure-Isolation aus EDTA-, Heparin- oder Citrat-Blut-Plasma verwenden, da die Partikel oft aneinander kleben. Dies ist sehr nachteilig für automatische Prozesse, die zur Analyse einer sehr großen Probenzahl verwendet werden.
  • Daher war eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Analyse der Nichtprotein-Zielkomponenten, insbesondere Nukleinsäuren, mit einer Protease, die relativ billig ist, gleich bleibende Qualität hat, und in einer Reihe von Verfahren verwendet werden kann. Es sollte daher möglich sein, diese zur Analyse von (mindestens) einer Nukleinsäure-Zielkomponente aus einer Reihe verschiedener Matrizen zu verwenden, beispielsweise EDTA-, Citrat-, oder Heparin-Blutplasma oder Blutserum. Dieses Verfahren sollte sich besonderes in automatisierten Verfahren eignen. Idealerweise ist die Protease sehr aktiv in Anwesenheit chaotroper Mittel, die häufig bei den Verfahren zur Reinigung von Nukleinsäuren verwendet werden.
  • Dieses Problem wurde durch die Befunde der vorliegenden Erfindung gelöst, die durch die beigefügten Ansprüche definiert ist, und die ein Verfahren zur Analyse einer (mindestens einer) Nichtprotein-Ziel-Bestandteil eines aus einer biologischen Probe stammenden Gemischs aus Nichtprotein- und Protein-Komponenten betrifft, wobei man in einem Verfahrensschritt das Gemisch mit einer (mindestens einer) eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 80% Identität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 aufweisenden Protease der Protease Subtilisin 147 aus Bacillus lentus inkubiert. Aus dem Beispiel geht hervor, dass die Protease in der Anwesenheit chaotroper Mittel sehr aktiv ist oder gleichermaßen aktiv ist für die Spaltung von Citrat- oder EDTA-Blutplasma. Dies war aus dem Stand der Technik nicht abzusehen.
  • Zusammengefasst betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Analyse einer (mindestens einer) Nicht-Protein-Zielkomponente eines aus einer biologischen Probe stammenden Gemischs aus Nicht-Protein- und Protein-Komponenten, mit der Protease aus einem Bacillus-Stamm gemäß der Definition in den beigefügten Ansprüchen. Die Erfindung betrifft zudem ein Verfahren zur Analyse einer (mindestens einer) Nukleinsäure-Zielkomponente aus einem Gemisch von Nukleinsäuren umfassenden Nicht-Protein-Komponenten und Protein-Komponenten, wobei das Gemisch aus einer biologischen Probe stammt, wobei man in den Verfahrensschritten das Gemisch mit einer (mindestens einer) eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 80% Identität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 aufweisenden Protease der Protease Subtilisin 147 aus Bacillus lentus inkubiert, die (mindestens eine) Nukleinsäure-Zielkomponente amplifiziert und die (mindestens eine) Nukleinsäure-Zielkomponente bestimmt oder nachweist. Gegebenenfalls sind die Nukleinsäuren und die (wenigstens eine) Nukleinsäure-Zielkomponente an ein Material mit einer Affinität dazu gebunden, die gegebenenfalls gewaschen werden und gegebenenfalls aus dem Material mit einer Affinität dazu freigesetzt werden, wobei das Material mit einer Affinität zu den Nukleinsäuren und der (mindestens einen) Nukleinsäure-Zielkomponente ein Material mit einer Siliciumdioxid-Oberfläche, insbesondere magnetische Glaspartikel umfasst. Die Erfindung betrifft zudem die Verwendung der erfindungsgemäßen Protease in der Diagnostik, Forschung und Bioanalytik beispielsweise zur Reinigung von Nukleinsäuren, zur Analyse einer (mindestens einer) Nicht-Protein-Zielkomponente aus einem aus einer biologischen Probe stammenden Gemisch von Nicht-Protein- und Protein-Komponenten, zur Anreicherung einer (mindestens einer) Nicht-Protein-Zielkomponente aus einem aus einer biologischen Probe stammenden Gemisch von Nicht-Protein- und Protein-Komponenten, oder zur Reinigung oder Isolation einer (mindestens einer) Nicht-Protein-Zielkomponente aus einem aus einer biologischen Probe stammenden Gemisch von Nicht-Protein- und Proteinkomponenten. Die Erfindung betrifft auch ein Kit, das die erfindungsgemäße Protease umfasst und die Verwendung eines erfindungsgemäßen Kits in der Diagnostik und/oder zur Reinigung von Nukleinsäuren. Die Erfindung wird nachstehend eingehender beschrieben.
  • Figurenlegenden:
  • Es zeigt:
  • 1a: Vergleich der Spaltung von EDTA-Plasma gegen Citrat-Plasma mit Esperase wie durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert;
  • 1b: Vergleich der Spaltung von EDTA-Plasma vs Citrat-Plasma mit Proteinase K wie durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert;
  • 2: Bestimmung des pH-Wert-Optimums von Esperase;
  • 3: Bestimmung der Restaktivität von Esperase vs Proteinase K in Abhängigkeit von der Konzentration eines chaotropen Mittels. Die höchste Aktivität wird auf einen Wert von 100% eingestellt und die anderen Konzentrationen relativ zum höchsten Wert berechnet.
  • 4: Bestimmung der Stabilität der Esperase vs Proteinase K in Abhängigkeit von der Konzentration von Guanidiniumthiocyanat. Die Aktivität der Protease wird direkt nach der Zugabe von Guanidiniumthiocyanat und nach 15 min bei 25°C in der Anwesenheit von Guanidiniumthiocyanat gemessen. Der Prozentsatz der Restaktivität bei verschiedenen Guanidiniumthiocyanat-Konzentrationen ist in dieser Figur gezeigt.
  • 5 Stabilität im Aufbewahrungspuffer (Zusammensetzung: 10 mM Tris-Acetat, 5 mM Calciumchlorid, 5 mM Calciumacetat, 1 mM EDTA, 50% (Vol/Vol) Glycerin) mit einem pH-Wert von 5,5) von Esperase vs Proteinase K.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Eine Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Analyse einer (mindestens einer) Nicht-Protein-Zielkomponente eines aus einer biologischen Probe stammenden Gemischs aus Nicht-Protein und Proteinkomponenten, wobei man in einem Verfahrensschritt das Gemisch mit einer eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 80% Identität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 aufweisenden Protease inkubiert. Der Begriff "stammt" bedeutet, dass eine biologische Probe so manipuliert oder behandelt wird, dass man ein Gemisch aus Nicht-Protein- und Protein-Komponenten erzeugt, die ursprünglich in der biologischen Probe enthalten sind. Aus diesem Gemisch sollte man spezifische Nicht-Protein-Komponenten analysieren, isolieren, anreichern oder reinigen können. Der Begriff "Analyse" bedeutet, dass die Anwesenheit oder die Menge der Nicht-Protein-Zielkomponente untersucht wird, d. h. die Nicht-Protein-Zielkomponente wird nachgewiesen oder bestimmt, oder die Menge davon wird bestimmt. Die Manipulations- oder Behandlungsschritte umfassen chemische oder physikalische Manipulationsschritte, die dem Fachmann bekannt sind. Dies kann insbesondere durch Lysieren der biologischen Probe erfolgen. Biologische Proben sind Proben, die einer Pflanze oder einem Tier (einschließlich einem Mensch) entnommen werden und die fest oder flüssig sind. Spezifische Beispiele werden nachstehend eingehender beschrieben.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung hat das Verfahren weitere Schritte nach der Inkubation, wie die Bindung der Nicht-Protein-Zielkomponente an ein Material mit einer Affinität dazu, gegebenenfalls waschen und gegebenenfalls Freisetzen der Nicht-Protein-Zielkomponenten aus dem Material mit einer Affinität dazu. Danach kann die Nicht-Protein-Zielkomponente durch Standard-Analyseverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, und beispielsweise beschrieben sind in Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor University Press, New York, NY USA oder in "Bioanalytik", Lottspeich und Zorbas (Hrsg.), 1. Auflage, 1998, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Deutschland, bestimmt oder nachgewiesen werden. Die Menge der Nicht-Protein-Zielkomponente wird vorzugsweise durch die hier beschriebenen Verfahren bestimmt. Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise in der Forschung, Bioanalytik, insbesondere in der Diagnostik oder in Diagnoseuntersuchungen in der Medizin, d. h. in Verfahren, die zur Bestimmung der Ursache für eine Krankheit oder eine Beschwerde in Menschen oder Tieren verwendet werden, eingesetzt.
  • Daher ist eine Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zur Analyse einer Nicht-Protein-Zielkomponente eines aus einer biologischen Probe stammenden Gemischs aus Nicht-Protein- und Protein-Komponenten, wobei man in den Verfahrensschritten:
    • a) das Gemisch mit der erfindungsgemäßen Protease inkubiert,
    • b) die Nicht-Protein-Zielkomponente an ein Material mit einer Affinität dazu bindet,
    • c) die Nicht-Protein-Zielkomponente gegebenenfalls wäscht und aus dem Material mit einer Affinität dazu gegebenenfalls freisetzt und
    • d) die Nicht-Protein-Zielkomponente bestimmt oder nachweist.
  • In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist der Schritt c) nicht wahlfrei, d. h. die gebundene Nicht-Protein-Zielkomponente wird gewaschen und aus dem Material mit einer Affinität dazu freigesetzt. Die Menge der Nicht-Protein-Zielkomponente wird vorzugsweise bestimmt.
  • Die erfindungsgemäße Protease baut die Proteinkomponenten ab, d. h. die Komponenten, die Peptidbindungen enthalten, die hydrolysiert werden sollen, wenn die Nicht-Protein-Zielkomponente der biologischen Probe angereichert, isoliert oder gereinigt werden soll. Die erfindungsgemäße Protease kann in fester Form, beispielsweise als Tablette oder als Pulver, oder in einer gelösten Form in einer gepufferten oder ungepufferten Lösung auf ähnliche Weise wie für Proteinase K beschrieben zugegeben werden.
  • Für den Zweck der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "Esperase" die erfindungsgemäße Protease bedeuten, d. h. die Protease Subtilisin 147, die aus der Bacillus lentus Variante 147 stammt, die bei der NCIB unter der Zugriffs-Nr. NCIB 10147 hinterlegt wurde. Die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 ist die Volllängen-Aminosäuresequenz der Protease Subtilisin 147 (oder Esperase), einschließlich einer Signalsequenz, die nach der Sekretion durch die Wirkung der Proteasen entfernt wird. Eine Signalsequenz ist eine Sequenz, die die Sekretion eines exprimierten Proteins aus der Wirtszelle steuert und nach der Sekretion proteolytisch entfernt wird. Die SEQ ID NO 2 ist die Sequenz der Esperase ohne Signalsequenz. Der Begriff "Esperase" soll auch proteolytische Derivate der SEQ ID NO 1, die durch unvollständige oder ungenaue Verarbeitung der Signalsequenz erzeugt werden können, und die noch die proteolytische Aktivität zwar mit einer niedrigeren, aber noch genügend hohen Aktivität aufweisen, umfassen. Die Aminosäuresequenz des Proteins kann durch das Subtilisin 147-Gen codiert sein, d. h. die Nukleotidsequenz SEQ ID NO 3, Teile davon oder eine degenerierte Version davon. Degenerierte Sequenzen sind innerhalb der Bedeutung des genetischen Codes insofern degeneriert, als eine uneingeschränkte Anzahl von Nukleotiden durch andere Nukleotide ersetzt wird, ohne dass die ursprünglich codierte Aminosäuresequenz geändert wird.
  • Erfindungsgemäß soll der Begriff "Proteinmaterial" Material beschrieben, das eine (mindestens eine) Peptidbindung enthält, daher ist "Proteinmaterial" vorzugsweise eine Zusammensetzung aus Substanz, die ein (mindestens ein) Protein mit natürlichen Aminosäuren enthält. Die meisten dieser Peptidbindungen können je nach der chemischen Natur der benachbarten chemischen Gruppen (oder Aminosäuren) und der Zugänglichkeit der Peptidbindung durch die erfindungsgemäße Protease hydrolysiert werden, d. h. das Proteinmaterial ist ein Substrat für die erfindungsgemäße Protease. Folglich beschreibt der Begriff "Nicht-Proteinmaterial" ein Material, das keine Peptidbindung enthält und das kein Substrat für die erfindungsgemäße Protease ist.
  • Die Protease Subtilisin 147 aus Bacillus lentus ist dem Fachmann auf dem Gebiet z. B. von Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland oder von Novo Nordisk, Dänemark, zugänglich. Eine weitere Möglichkeit zur Gewinnung dieser Protease ist, das Gen aus dem hinterlegten Mikroorganismus zu isolieren, oder das Gen, das diese Protease codiert, gemäß Standardverfahren zu synthetisieren, siehe z. B. Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor University Press, New York, NY, USA. Die Aminosäure-Sequenz des Pro-Proteins, das eine Signalsequenz umfasst (SEQ ID NO 1), die Aminosäure-Sequenz der sezernierten Protease (SEQ ID NO 2) und die DNA Sequenz (siehe SEQ ID NO 3) dieses Proteins sind aus WO 89/06279 , EP 396 608 und WO 98/20115 bekannt. Die Hauptform des sezernierten Proteins wird durch die Nukleotide 280 bis 1083 von SEQ ID NO 3 codiert, d. h. das Signalpeptid wird durch die Nukleotide 1 bis 279 von SEQ ID NO 3 codiert. Die Isolierung des Mikroorganismus ist in US 3 723 250 beschrieben. Der isoliert Stamm ist unter NCIB 10147 hinterlegt. Kundenspezifische Gen-Synthese kann beispielsweise von Operon Technologies, Alameda, CA, USA durchgeführt werden, die vor kurzem von Qiagen, Deutschland erworben wurden. Mit Standard-Methodik kann der Fachmann einen Expressionsvektor konstruieren, das Gen-Produkt exprimieren und das Protein im Wesentlichen isolieren, wie in WO 89/06279 oder in WO 98/20115 beschrieben.
  • Mit dieser verfügbaren Information kann der Fachmann auf dem Gebiet auch ein Gen konstruieren und exprimieren, das eine Protease mit einer Aminosäure-Sequenz mit 80% Identität mit der Aminosäure-Sequenz von Subtilisin 147 codiert, indem er verschiedene Aminosäuren ersetzt. Dafür setzt er Standard-Verfahren ein, wie in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor University Press, New York, NY, USA beschrieben oder Verfahren, wie in WO 89/06279 oder in WO 98/20115 beschrieben. Die Tests für die proteolytische Aktivität werden in diesen beiden internationalen Anmeldungen oder in dieser Erfindung beschrieben.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein erfindungsgemäßes Verfahren offenbart, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz der Protease die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1, ein proteolytisches Derivat davon mit Proteaseaktivität oder die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 2 ist. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein erfindungsgemäßes Verfahren offenbart, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Protease von der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 3, einem Teil davon, der eine aktive Protease gemäß der Erfindung codiert, oder einer degenerierten Version der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 3 codiert.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung soll die biologische Probe Viren oder Bakterienzellen, sowie isolierte Zellen aus mehrzelligen Organismen wie z. B. menschliche und tierische Zellen, wie Leukozyten und immunologisch aktive chemische Verbindungen mit niedrigem und hohem Molekulargewicht, wie Haptene, Antigene, Antikörper und Nukleinsäuren, Blut-Plasma, Liquor, Sputum, Stuhl, Biopsie-Proben, Knochenmark, Mund-Spülungen, Blutserum, Gewebe, Urin oder Gemische davon umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die biologische Probe eine Flüssigkeit aus einem menschlichem oder tierischen Körper, vorzugsweise ist die biologische Probe Blut, Blutplasma, Blutserum oder Urin. Das Blutplasma ist vorzugsweise EDTA-, Heparin- oder Citratblutplasma. In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die biologische Probe Bakterienzellen, eukaryontische Zellen, Viren oder Gemische davon.
  • Die biologische Probe kann auch von einem Typ sein, der für Umweltanalyse, Nahrungsmittelanalyse oder Molekularbiologie-Forschung verwendet wird, z. B. aus Bakterienkulturen, Phagenlysaten. In bestimmten Fällen kann die Probe ohne Vorbehandlung im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. In vielen Fällen sollte die Probe jedoch mit einem geeigneten Verfahren lysiert werden und die in der Probe enthaltenen biologischen Substanzen freigesetzt werden, wodurch ein aus der biologischen Probe stammendes Gemisch von Protein- und Nicht-Protein-Komponenten erhalten wird. Verfahren zum Lysieren der Proben sind dem Fachmann bekannt und können chemischer, enzymatischer oder physikalischer Natur sein. Eine Kombination dieser Verfahren ist außerdem anwendbar. Die Lyse kann beispielsweise mit Ultraschall, hohem Druck, durch Scherkräfte, mit Alkali, Detergenzien oder chaotropen Kochsalzlösungen oder mittels der Proteasen oder Lipasen durchgeführt werden. In Bezug auf das Lyse-Verfahren zur Gewinnung von Nukleinsäuren wird speziell Bezug genommen auf Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, USA und Ausubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY, USA.
  • Es ist zudem ein Fall beschrieben, bei dem die biologische Probe ein (mindestens ein) glykosyliertes Protein umfasst, das teilweise oder völlig durch die erfindungsgemäße Protease abgebaut wird. Folglich ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Protease für den partiellen oder vollständigen Abbau der glykosylierten Proteine, d. h. Proteine mit kovalent gebundenen Kohlenhydrat-Einheiten, beschrieben.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann weitere Schritte nach der Inkubation wie die Bindung der Nicht-Protein-Zielkomponente an ein Material mit einer Affinität dazu, gegebenenfalls Waschen und gegebenenfalls Freisetzen der Nicht-Protein-Zielkomponente vom Material mit einer Affinität dazu aufweisen. Danach kann die Nicht-Protein-Zielkomponente durch dem Fachmann bekannte und z. B. in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor University Press, New York, NY, USA oder in "Bioanalytik", Lottspeich und Zorbas (Hrsg.), 1. Auflage 1998, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, Deutschland, beschriebene analytische Standardverfahren bestimmt oder nachgewiesen werden.
  • Zur Bindung der Nicht-Protein-Zielkomponente an ein Material mit einer Affinität dazu wird das Gemisch der Nicht-Protein- und Protein-Komponenten mit dem Material mit einer Affinität zur Nicht-Protein-Zielkomponente unter Bedingungen zusammengebracht, in denen die Nicht-Protein-Zielkomponent an die Oberfläche des Materials bindet. Die Bedingungen dafür hängen vom Typ der beteiligten Nicht-Protein-Zielkomponente ab, sind aber im Allgemeinen dem Fachmann auf dem Gebiet geläufig. Sie hängen auch von dem Verfahren ab, durch das die Nicht-Protein-Zielkomponente an die Oberfläche gebunden wird. Z. B. wenn modifizierte Nukleinsäuren die Nicht-Protein-Zielkomponenten sind, kann die Bindung über die Gruppen der Nukleinsäuren erfolgen, die die Modifikation darstellen, z. B. Biotin über die Bindung mit Streptavidin-beschichteten Oberflächen.
  • Wenn unmodifizierte Nukleinsäuren die Nicht-Protein-Zielkomponenten sind, wird eine direkte Bindung der Nukleinsäuren an ein Material mit einer Siliciumdioxid-Oberfläche bevorzugt, weil ansonsten die Nukleinsäuren nicht modifiziert werden müssen und sogar native Nukleinsäuren gebunden werden können. Diese Verfahren werden im Detail durch verschiedene Dokumente beschrieben. In Proc. Natl. Acad. USA 76, 615–691 (1979) wird zum Beispiel ein Verfahren zur Bindung von Nukleinsäuren aus Agarosegelen in Anwesenheit von Natriumiodid an gemahlenes Flintglas vorgeschlagen. Die Reinigung von Plasmid DNA aus Bakterien auf Glasstaub in Anwesenheit von Natriumperchlorat wird in Anal. Biochem. 121, 382–387 (1982) beschrieben. In DE-A 37 34 442 wird die Isolierung von einzelsträngiger M13 Phagen DNA auf Glasfaserfiltern beschrieben, wobei man Phagenpartikel mit Essigsäure fällt und die Phagenpartikel mit Perchlorat lysiert. Die an die Glasfaserfiltern gebundenen Nukleinsäuren werden gewaschen und dann mit einem Methanol enthaltenden Tris/EDTA Puffer eluiert. Ein ähnliches Verfahren zur Reinigung von DNA aus Lambda-Phagen ist in Anal. Biochemie. 175, 196–201 (1988) beschrieben. Das Verfahren bewirkt die selektive Bindung der Nukleinsäuren an die Glasoberflächen in den chaotropen Salzlösungen und die Trennung der Nukleinsäuren von Kontaminanten wie Agarose, Proteinen oder Zellresten. Zur Trennung der Glaspartikel von den Kontaminanten können die Partikel entweder zentrifugiert werden, oder Flüssigkeiten werden durch Glasfaserfilter gezogen. Dies ist ein limitierender Schritt, jedoch verhindert dies, dass das Verfahren zur Verarbeitung großer Mengen Proben verwendet wird. Der Gebrauch von Magnetpartikeln zur Immobilisation von Nukleinsäuren nach der Ausfällung, durch Zugabe von Salz und Ethanol ist vorteilhafter und z. B. beschrieben in Anal. Biochem. 201, 166–169 (1992) und PCT GB 91/00212 . In diesem Verfahren werden die Nukleinsäuren zusammen mit den Magnetpartikeln agglutiniert. Das Agglutinat wird vom ursprünglichen Lösungsmittel abgetrennt, indem ein Magnetfeld angelegt und ein Waschschritt durchgeführt wird. Nach einem Waschschritt werden die Nukleinsäuren in einem Tris-Puffer gelöst. Dieses Verfahren hat jedoch insofern einen Nachteil, als die Fällung für Nukleinsäuren nicht selektiv ist. Es wird eher ebenfalls eine Anzahl von Feststoffen und gelösten Substanzen agglutiniert. Infolgedessen kann dieses Verfahren nicht verwendet werden, um möglicherweise anwesende bedeutende Mengen irgendwelcher Inhibitoren der spezifischen Enzymreaktionen zu entfernen. Magnetisches poröse Glas ist auch auf dem Markt erhältlich, das Magnetpartikel in einer porösen, speziellen Glasmatrix enthält und mit einer Streptavidin enthaltenden Schicht beschichtet ist. Dieses Produkt kann zur Isolation biologischer Materialien, z. B. Proteine oder Nukleinsäuren, verwendet werden, wenn sie in einem komplexen Herstellungs-Schritt modifiziert werden, damit sie kovalent an Biotin binden. Magnetisierbare spezielle Adsorbtionsmittel erwiesen sich für die automatische Proben-Präparation als sehr leistungsfähig und geeignet. Ferrimagnetische und ferromagnetische sowie superparamagnetische Pigmente werden zu diesem Zweck verwendet. Die am stärksten bevorzugte MGPs sind in WO 01/37291 beschrieben.
  • Im Detail kann das Verfahren zur Bindung der Zielnukleinsäure an Glaspartikel wie folgt beschrieben werden. Es wird vorzugsweise in Anwesenheit chaotroper Salze mit einer Konzentration zwischen 1 und 8 mol/l und vorzugsweise zwischen 2 und 6 Mol/l durchgeführt. Chaotrope Salze können Natriumiodid, Natrium-Perchlorat, Guanidiniumthiocyanat, Guanidiniumisothiocyanat oder Guanidiniumhydrochlorid sein. Andere Substanzen sind auch möglich. Der Reinigungeffekt resultiert aus dem Verhalten von DNA oder von RNA, zur Bindung an Material mit einer Glasoberfläche unter diesen Bedingungen, d. h. in Anwesenheit bestimmter Konzentrationen eines chaotropen Mittels, höheren Konzentrationen organischer Lösungsmittel oder unter sauren Bedingungen. Zum Zusammenbringen der Probe mit dem Material mit einer Affinität zur Nicht-Protein-Zielkomponente wird die Probe mit dem Material gemischt und so lange inkubiert, dass die Bindung erfolgt. Dem Fachmann ist die Dauer des Inkubationsschritts aus Verfahren zur Durchführung der Behandlung mit nichtmagnetischen Partikeln geläufig. Dieser Schritt kann optimiert werden, indem man die Menge des immobilisierten biologischen Materials auf der Oberfläche an verschiedenen Zeitpunkten feststellt. Inkubationszeiten zwischen 10 Sekunden und von 30 Minuten können für Nukleinsäuren angebracht sein. Nach Inkubation wird die gebundene Nicht-Protein-Zielkomponente von der Flüssigkeit abgetrennt. Dieses kann im Allgemeinen durch Schwerkraft erzielt werden, oder im einfachen Fall von Nukleinsäuren, die an magnetische Glaspartikel gebunden sind, durch Trennen des an die Magnetpartikel gebundenen Materials, durch Anlegen eines Magnetfelds. Zum Beispiel können die magnetischen Partikel zur Wand des Behälters gezogen werden, in dem die Inkubation durchgeführt wurde. Die Flüssigkeit, welche den Probe-Inhalt enthält, der nicht an die Magnetpartikel gebunden ist, kann dann entfernt werden. Das verwendete Entfernungs-Verfahren hängt vom Typ des Behälters ab, in dem die Inkubation durchgeführt wurde. Geeignete Schritte umfassen das Entfernen der Flüssigkeit durch Pipettieren oder Absaugen. Das Material mit der gebundenen DNA oder der RNA kann dann mindestens einmal vorzugsweise mit einem Gemisch von 70 Volumen-Teilen Ethanol mit 30 Volumen-Teilen Wasser ("70% Ethanol") gewaschen werden. Es wird eine Wasch-Lösung verwendet, die es nicht bewirkt, dass die (mindestens eine) Nicht-Protein-Zielkomponente von der Materialoberfläche freigesetzt wird, aber die die unerwünschten Kontaminanten so gänzlich wie möglich wegwäscht. Dieser Waschschritt findet vorzugsweise statt, indem das Material mit der gebundenen Nicht-Protein-Zielkomponente mit der Waschlösung inkubiert wird. Das Material wird während dieses Schritts vorzugsweise resuspendiert. Die verschmutzte Wasch-Lösung wird vorzugsweise genau wie im oben für die Bindung des biologischen Materials beschriebenen Schritt entfernt. Nach dem letzten Waschschritt kann das Material in einem Vakuum kurz getrocknet werden oder man lässt die Flüssigkeit verdunsten. Ein Vorbehandlungsschritt mit Aceton kann auch durchgeführt werden. Danach können die Bedingungen umgekehrt werden, z. B. wird die Konzentration des chaotropen Mittels oder des organischen Lösungsmittels verringert, um die am Material gebundene DNA oder RNA zu eluieren. Vorzugsweise wird das Verfahren zum Trennen der magnetischen Glaspartikel vom Rest der Probe durchgeführt, indem man das immobilisierte biologische Material pelletiert, z. B. durch Schwerkraft oder durch die Verwendung eines Magnets im Falle der magnetischen Glaspartikel, und Entfernung des Überstands. Dann werden die magnetischen Glaspartikel mit dem immobilisierten biologischen Material in einer Lösung ohne oder nur mit einer niedrigen Menge des chaotropen Mittels und/oder des organischen Lösungsmittels resuspendiert. Alternativ kann die Suspension mit einer Lösung ohne oder nur mit einer geringen Menge des chaotropen Mittels und/oder des organischen Lösungsmittels verdünnt werden. Derartige Puffer sind aus DE 3724442 und Analytical Biochemistry 175, 196–201 (1988) bekannt. Die Elutionspuffer mit einem niedrigen Salzgehalt sind insbesondere Puffer mit einem Gehalt von weniger als 0,2 Mol/l. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält der Elutionspuffer die Substanz Tris für Pufferzwecke. In einer anderen speziellen Ausführungsform ist der Elutionspuffer entmineralisiertes Wasser. Die Lösung, die gereinigte DNA oder RNA enthält, kann jetzt für andere Reaktionen verwendet werden.
  • Für Wasch- und Bindungs-Schritte werden vorzugsweise Flüssigkeiten verwendet, die für Verfahren in der Molekularbiologie geeignet sind, insbesondere Reinigungsverfahren für Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA), die die Bindung dieser Substanzen an Glaspartikel unter bestimmten Bedingungen nutzen. Bevorzugte Flüssigkeiten umfassen Alkohole und/oder Ketone oder alle möglichen Gemische davon mit Wasser. Alkohole sollen erfindungsgemäß vorzugsweise primäre, sekundäre oder tertiäre Alkohole der allgemeinen Formel R-OH, worin R für die allgemeine Formel -(-CH2)n-CH3 mit n >= 0 steht, umfassen. Jedoch können auch andere Alkohole verwendet werden, wenn sie für Molekularbiologie-Zwecke geeignet sind wie z. B. Glycerin. Besonders geeignet sind die Alkohole Isopropanol, Ethanol oder Gemische davon mit Wasser, vorzugsweise ein Gemisch von 80 Volumen-Teilen Isopropanol mit 20 Volumen-Teilen Wasser. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst die Flüssigkeit Ketone, wie z. B. Aceton.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten magnetischen Glaspartikel können in unterschiedlichen Formulierungen zur Verfügung gestellt werden. Man kann sie in Form einer Tablette, als Pulver oder vorzugsweise als Suspension bereitstellen. Diese Suspensionen können zwischen 5 bis 60 mg/ml magnetische Glaspartikel (MGPs) enthalten. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Siliciumdioxid-enthaltende Material in wässrigen Puffer-Lösungen, die gegebenenfalls ein chaotropes Mittel in einer Konzentration zwischen 2 und 8 mol/l, und vorzugsweise zwischen 4 und 6 Mol/l, beliebig enthalten können, suspendiert. Chaotrope Salze sind Natriumiodid, Natriumperchlorat, Guanidiniumthiocyanat, Guanidiniumisothiocyanat oder Guanidiniumhydrochlorid. Andere Verbindungen, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, sind auch möglich. Ein erfindungsgemäßes chaotropes Mittel ist eine beliebige chemische Substanz, die die geordnete Struktur von flüssigem Wassers stört und die bewirkt, dass DNA oder RNA an die magnetischen Glaspartikel bindet, wenn dieses Mittel in der DNA oder in der RNA enthaltenden Lösung vorliegt. Dem Fachmann ist die Herstellung geeigneter wässriger Pufferlösungen geläufig. Puffersysteme, die für Molekularbiologie-Zwecke geeignet sind, finden sich z. B. in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor University Press, New York, NY, USA. Bevorzugte Puffersubstanzen sind Tris-(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), Phosphat, N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure) (HEPES), Salze davon oder andere geeignete Substanzen. Zusätzlich können Substanzen vorhanden sein, die die Ionenstärke der Lösung modifizieren, wie z. B. NaCl, KCl oder CaCl2 oder die Metallkation-Komplexbildner sind, wie z. B. Ethylen-Diamin-Tetraessigsäure (EDTA) oder die Salze davon. Andere biologische Substanzen, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, können auch zugegen sein. Das erfindungsgemäße Verfahren ist für die Reinigung von Nukleinsäuren, d. h. RNA oder DNA, aus komplexen Gemischen mit anderen biologischen Substanzen, die sie enthalten, geeignet. Dadurch können auch Gemische unterschiedlicher Nukleinsäuren gereinigt werden, sogar Gemische, die eine interessierende Nukleinsäure in niedriger Abundanz enthalten. In einer Ausführungsform der Erfindung werden Gemische der spezifischen Nukleinsäuren gereinigt, in denen die Zielnukleinsäure(n) ein kleinerer Bestandteil in Bezug auf die Konzentration sein können (oder kann in niedriger Abundanz zugegen sein).
  • Das beschriebene Verfahren kann zur Isolation von nativem oder modifiziertem biologischen Material verwendet werden. Unter nativem biologischen Material versteht man ein Material, dessen Struktur verglichen mit den natürlich vorkommenden biologischen Materialien nicht irreversibel verändert war. Dies bedeutet jedoch nicht, dass andere Komponenten der Probe modifiziert werden können. Modifizierte biologische Materialien umfassen Materialien, die nicht in der Natur auftreten z. B. Nukleinsäuren, die modifiziert werden, indem Gruppen daran gebunden werden, die reaktiv, nachweisbar oder zur Immobilisierung fähig sind. Ein Beispiel hierfür sind biotinylierte Nukleinsäuren.
  • Nach den oben beschriebenen Schritten können die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierten Nicht-Protein-Komponenten jetzt weiter verwendet werden, falls erforderlich. Zum Beispiel können sie als Substrat für verschiedene Enzymreaktionen verwendet werden. Wenn Nukleinsäuren beteiligt sind, können sie für Sequenzierung, radioaktive oder nicht-radioaktive Markierung, Amplifikation von einer oder mehrer Sequenzen, die sie enthalten, Transkription, Hybridisierung mit markierten Sonden-Nukleinsäuren, Translation oder Ligation verwendet werden. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird bei einem Verfahrensschritt folglich die (mindestens eine) gebundene Nicht-Protein-Zielkomponente vom Material mit einer Affinität dazu freigesetzt. Wenn gewünscht, kann die auf diese Weise gereinigte (mindestens eine) Nicht-Protein-Zielkomponente, wie oben beschrieben vom Material abgetrennt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird bei einem Verfahrensschritt eine Nicht-Protein-Zielkomponente nachgewiesen oder bestimmt. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist folglich das oben beschriebene Reinigungsverfahren, dem ein Bestimmungs- oder Nachweisschritt folgt, oder Reinigungsverfahren, dem ein Amplifikations- und Bestimmungs- oder Nachweisschritt folgt. Im Falle von Nukleinsäuren können die Zielnukleinsäure oder die interessierenden Nukleinsäuren in einer Matrix der Nicht-Zielnukleinsäuren enthalten sein, und können sogar ein kleiner Bestandteil in dem Gemisch von spezifischen Nukleinsäuren sein. Geeignete DNA Nachweis-Verfahren sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und sind in den Standardlehrbüchern beschrieben wie Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, und Ausubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Wiley and Sons, NY. Es kann auch weitere Reinigungsschritte geben, bevor der DNA Nachweis-Schritt durchgeführt wird, wie z. B. ein Fällungsschritt. Die Nachweis-Verfahren können umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf die Bindung oder Interkalation spezifischer Farbstoffe wie Ethidiumbromid, das in Doppelstrang-DNA interkaliert und danach seine Fluoreszenz ändert. Die gereinigte DNA kann auch durch Elektrophorese-Verfahren gegebenenfalls nach einer Restriktionspaltung abgetrennt und danach sichtbar gemacht werden. Es gibt auch Tests auf Sondenbasis, die die Oligonukleotidhybridisierung an die spezifischen Sequenzen und den nachfolgenden Nachweis des Hybrids ausnutzen. Man kann auch die DNA nach den weiteren Schritten sequenzieren, die dem Fachmann auf dem Gebiet geläufig sind. Andere Verfahren wenden viele verschiedene DNA Sequenzen auf einem Siliciumchip an, an den spezifische Sonden gebunden sind und ein Signal ergeben, wenn komplementäre Sequenzen binden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Gemisch aus Nicht-Protein- und Protein-Komponenten Nukleinsäuren, wobei die Nukleinsäuren DNA oder RNA oder beide umfassen.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse einer Nukleinsäure-Zielkomponente eines aus einer biologischen Probe stammenden Gemischs aus Nukleinsäuren umfassenden Nicht-Protein-Komponenten und Protein-Komponenten, wobei man in den Verfahrensschritten:
    • a) das Gemisch mit einer wenigstens 80% Identität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 aufweisenden Protease inkubiert,
    • b) die Nukleinsäure-Zielkomponente gegebenenfalls amplifiziert
    • c) die Nukleinsäure-Zielkomponente gegebenenfalls bestimmt oder nachweist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Menge der Nukleinsäure-Zielkomponente bestimmt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Aminosäuresequenz der Protease die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1, ein proteolytisches Derivat davon mit Proteaseaktivität oder die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 2. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Protease von der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 3, einem Teil davon oder einer degenerierten Version der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 3 codiert. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung soll die biologische Probe Viren oder Bakterienzellen, sowie isolierte Zellen aus mehrzelligen Organismen, wie z. B. menschliche und tierische Zellen wie Leukozyten und immunologisch aktive chemische Verbindungen mit niedrigem und hohem Molekulargewicht, wie Haptene, Antigene, Antikörper und Nukleinsäuren, Blutplasma, Liquor, Sputum, Stuhl, Biopsieproben, Knochenmark, Mund-Spülungen, Blutserum, Gewebe, Urin oder Gemische davon umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die biologische Probe eine Flüssigkeit aus dem menschlichen oder tierischen Körper, vorzugsweise handelt es sich bei der biologischen Probe um Blut, Blutplasma, Blutserum oder Urin. Das Blutplasma ist vorzugsweise EDTA-, Heparin- oder Citratblutplasma. In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die biologische Probe Bakterienzellen, eukaryontische Zellen, Viren oder Gemische davon.
  • In einer bevorzugten Ausbildung der Erfindung umfasst das Gemisch aus Nukleinsäuren und Protein-Material Desoxyribonukleinsäure (DNA), oder Ribonukleinsäure (RNA) oder beide, vorzugsweise stammt die DNA oder die RNA oder beide aus einem (wenigstens einem) Virus oder einem (wenigstens einem) Mikroorganismus. Bei dem Virus kann es sich um das Hepatitis-A-Virus (HAV), das Hepatitis-B-Virus (HBV), das Hepatitis-C-Virus (HCV), das menschliche Immunschwächevirus (HIV), das menschliche Papilloma-Virus (HPV) oder Parvovirus B19 handeln.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden eine (wenigstens eine) Nukleinsäure-Zielkomponente und die anderen Nukleinsäuren im Wesentlichen wie oben beschrieben gereinigt. Dann wird die (wenigstens eine) Nukleinsäure-Zielkomponente, verarbeitet und nachgewiesen, d. h. mit der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert, die spezifisch Zielsequenzen auf nachweisbare Mengen amplifiziert. Andere mögliche Amplifikations-Reaktionen sind die Ligase-Kettenreaktion (LCR, Wu und Wallace, 1989, Genomics 4: 560–569 und Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189–193); Polymerase Ligase-Kettenreaktion (Barany, 1991, PCR Methods and Applic. 1: 5–16); Gap-LCR (PCT Patent Veröffentlichung No. WO 90/01069 ); Repair-Kettenreaktion ( Europäische Patentveröffentlichung No. 439,182 A2 ), 3SR (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173–1177; Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874–1878; PCT Patent Publication No. WO 92/0880 A ), und NASBA ( U.S. Pat. No. 5,130,238 ). Zudem gibt es Strang-Verdrängungsamplifikation (SDA), transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA) und Qβ-Amplification (für einen Überblick siehe beispielsweise Whelen und Persing (1996). Annu. Rev. Microbiol. 50, 349–373; Abramson und Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4: 41–47).
  • Ein besonders bevorzugtes Nachweisverfahren ist das TaqMan®-Verfahren, das in WO 92/02638 und in den entsprechenden US Patenten US 5 210 015 , US 5 804 375 , US 5 487 972 offenbart ist. Dieses Verfahren nutzt die Exonuklease-Aktivität einer Polymerase zur Erzeugung eines Signals. Im Detail wird die Nukleinsäure-Zielkomponente durch ein Verfahren nachgewiesen, bei dem die Probe mit einem Oligonukleotid nachgewiesen wird, das eine zu einem Bereich der Nukleinsäure-Zielkomponente komplementäre Sequenz enthält, und einem markierten Oligonukleotid, das eine zu einem zweiten Bereich des gleichen Nukleinsäure-Zielkomponenten-Sequenz-Strangs komplementäre Sequenz enthält, jedoch nicht die Nukleinsäuresequenz, welche die durch das erste Oligonukleotid definierte Sequenz umfasst, so dass man ein Gemisch aus Doppelsträngen unter Hybridisierungsbedingungen erzeugt, worin die Doppelstränge die Zielnukleinsäure umfassen, die an das erste Oligonukleotid und an das markierte Oligonukleotid hybridisieren, so dass das 3'-Ende des ersten Oligonukleotids nahe dem 5'-Ende des markierten Oligonukleotids ist. Dann wird dieses Gemisch mit einer Matrizen-abhängigen Nukleinsäure-Polymerase mit einer 5'→3'-Nuklease-Aktivität unter Bedingungen behandelt, die es ermöglichen, dass die 5'→3'-Nuklease-Aktivität der Polymerase das hybridisierte markierte Oligonukleotid spaltet und die markierten Fragmente freisetzt. Das durch die Hydrolyse des markierten Oligonukleotids erzeugte Signal wird nachgewiesen und/oder gemessen. Die TaqMan® Technologie beseitigt die Notwendigkeit, dass sich ein an einer Festphase gebundener Reaktionskomplex bildet und nachweisbar gemacht wird. Allgemeiner ausgedrückt wird ein Verfahren zur Reinigung einer Nukleinsäure-Zielkomponente, gefolgt von einem Nachweisschritt offenbart, worin die Amplifikations- und/oder Nachweis-Reaktion eine homogene Lösungsphase ist.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die die Nukleinsäure-Zielkomponente umfassenden Nukleinsäuren an ein Material mit einer Affinität dazu gebunden, bevor sie gegebenenfalls amplifiziert oder bestimmt oder gewiesen werden. Nach der Bindung werden sie gegebenenfalls gewaschen und gegebenenfalls vom Material mit einer Affinität dazu freigesetzt, im Wesentlichen wie oben beschrieben. Folglich betrifft eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zu Analyse einer Nukleinsäure-Zielkomponente eines aus einer biologischen Probe stammenden Gemischs aus Nukleinsäuren umfassenden Nicht-Protein-Komponenten und Protein-Komponenten wobei man in den Verfahrensschritten:
    • a) das Gemisch mit einer erfindungsgemäßen Protease inkubiert
    • b) die Nicht-Protein-Zielkomponente an ein Material mit einer Affinität dazu bindet,
    • c) die Nukleinsäure-Zielkomponente gegebenenfalls wäscht und aus dem Material mit einer Affinität dazu gegebenenfalls freisetzt,
    • d) die Nukleinsäure-Zielkomponente gegebenenfalls amplifiziert und
    • e) die Nukleinsäure-Zielkomponente gegebenenfalls nachweist.
  • In der am stärksten bevorzugten Ausführungsform, sind die Schritte c) und d) nicht wahlfrei, d. h. dass die gebundene Nukleinsäure-Zielkomponente gewaschen und vom Material mit einer Affinität dazu freigesetzt wird, und die Nukleinsäure-Zielkomponente wird amplifiziert, bevor sie bestimmt oder nachgewiesen wird. Vorzugsweise wird die Menge der Nukleinsäure-Zielkomponente bestimmt.
  • Das Material mit einer Affinität zu den Nukleinsäuren und zur Nukleinsäure-Zielkomponente umfasst ein Material mit einer Siliciumdioxid-Oberfläche, vorzugsweise ist das Material mit einer Siliciumdioxid-Oberfläche ein Glas, am stärksten bevorzugt ist das Material mit einer Affinität zu den Nukleinsäuren eine Zusammensetzung, die magnetische Glaspartikel umfasst. Die Schritte werden im Wesentlichen wie bereits oben beschrieben durchgeführt. Zusammenfassend werden magnetische Glaspartikel zum Lyse-Gemisch mit den Nukleinsäuren, die die Nukleinsäure-Zielkomponente umfassen, zugegeben.
  • Nach einem geeigneten Zeitraum für die Durchführung der Adsorption – die durch mechanische Bewegung optimiert werden kann – werden die Teilchen von der umgebenden Flüssigkeit abgetrennt, die zusätzliche Bestandteile enthält, welche nicht nachgewiesen werden sollen. Dieses erfolgt vorzugsweise durch Anlegen eines Magnetfelds, indem man einen Magnet an der Gefäßwand platziert und die verbleibende Flüssigkeit aus dem Röhrchen entfernt. Zum Entfernen weiterer noch vorhandener Kontaminanten wird vorzugsweise ein Waschschritt mit einer Flüssigkeit durchgeführt, die nicht bewirkt, dass die Nukleinsäuren und die (wenigstens eine) Nukleinsäure-Zielkomponente von der Glasoberfläche freigesetzt werden. Ein Elutionspuffer mit Reagenzbedingungen, unter denen die Nukleinsäuren und die Nukleinsäure-Zielkomponente nicht an die Glasoberfläche gebunden werden und eluiert werden, wird zugegeben, um die Nukleinsäuren einschließlich der Nukleinsäure-Zielkomponente von der Glasoberfläche zu entfernen. Diese Bedingungen sind insbesondere Niedrigsalzbedingungen. Je nach der beabsichtigten weiteren Verwendung der Nukleinsäuren und der Nukleinsäure-Zielkomponente, kann die Flüssigkeit jetzt von den Partikeln abgetrennt und weiter verarbeitet werden. Dieser Trennungsschritt wird vorzugsweise über das Anlegen eines Magnetfelds durchgeführt, damit die Teilchen vom Eluat abgetrennt werden. Die am stärksten bevorzugten magnetischen Glaspartikel für dieses Verfahren sind in WO 01/37291 beschrieben.
  • Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren- für diagnostische Analyse oder Bioanalytik verwendet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die erfindungsgemäße Protease in der Forschung, in der Bioanalytik oder in der Diagnostik verwendet. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen wird die erfindungsgemäße Protease für die Analyse einer Nicht-Protein-Zielkomponente aus einem aus einer biologischen Probe stammenden Gemisch von Nicht-Protein- und Protein-Komponenten, zur Anreicherung einer Nicht-Protein-Zielkomponente eines Gemischs aus einem aus einer biologischen Probe stammenden Gemisch von Nicht-Protein- und Protein-Komponenten oder zur Reinigung oder Isolation einer Nicht-Protein-Zielkomponente aus einem aus einer biologischen Probe stammenden Gemisch von Nicht-Protein- und Protein-Komponenten verwendet. Vorzugsweise ist die Nicht-Protein-Zielkomponente eine Nukleinsäure, vorzugsweise aus einem Virus oder einem Mikroorganismus, oder das Gemisch der Nicht-Protein- und Protein-Komponenten umfasst Nukleinsäuren. Bevorzugte Viren sind das Hepatitis-B-Virus, das Hepatitis-C-Virus oder das menschliche Immunschwächevirus oder die anderen oben beschriebenen Viren.
  • Die Erfindung betrifft zudem ein Kit of parts, das sich zur Verwendung in der Diagnostik und/oder zur Aufreinigung von Nukleinsäuren eignet, dadurch gekennzeichnet, dass darin eine eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 80% Identität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1, aufweisende Protease enthalten ist. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Aminosäuresequenz der Protease die Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO 1, ein proteolytisches Derivat davon mit Proteaseaktivität oder die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 2, vorzugsweise wird die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Protease von der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 3, einem Teil davon, der eine aktive Protease codiert, oder einer degenerierten Version des Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 3 codiert. Solche Kits des Standes der Technik umfassen weiter Kunststoffwaren, die während des Proben-Präparations-Verfahrens verwendet werden können, wie z. B. Mikrotiterplatten im Format mit 96 oder 384 Vertiefungen oder einfach gewöhnliche Reaktionsröhrchen, die z. B. von Eppendorf, Hamburg, Deutschland hergestellt werden, und alle sonstigen Reagenzen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Daher kann das Kit zusätzlich ein Material mit einer Affinität zu Nukleinsäuren (und zur Nukleinsäure-Zielkomponente) enthalten, vorzugsweise umfasst das Material mit einer Affinität zu Nukleinsäuren (und zur Nukleinsäure-Zielkomponente) ein Material mit einer Siliciumdioxid-Oberfläche. Das Material mit einer Siliciumdioxid-Oberfläche ist vorzugsweise ein Glas. Am stärksten bevorzugt ist das Material mit einer Affinität zu den Nukleinsäuren eine Zusammensetzung, die magnetische Glaspartikel umfasst. Das Kit kann weiter oder zusätzlich einen Lysepuffer umfassen, der z. B. chaotrope Mittel, Detergenzien oder Alkohole oder Gemische davon enthält, die die Lyse der Zellen ermöglichen. Diese Komponenten des erfindungsgemäßen Kits können separat in den Röhrchen oder Aufbewahrungsbehältern geliefert werden. Je nach der Natur der Komponenten können diese sogar in einem einzelnen Röhrchen oder in einem Aufbewahrungsbehälter zur Verfügung gestellt werden. Das Kit kann weiter oder zusätzlich eine Waschlösung umfassen, die für den Waschschritt der magnetischen Glasteilchen geeignet ist, wenn DNA oder RNA daran gebunden ist. Diese Waschlösung kann Ethanol und/oder chaotrope Mittel in einer gepufferten Lösung oder in Lösungen mit einem sauren pH-Wert ohne Ethanol und/oder chaotrope Mittel, wie oben beschrieben enthalten. Häufig werden die Waschlösung oder anderen Lösungen als Stammlösungen geliefert, die vor Gebrauch verdünnt werden müssen. Das Kit kann weiter oder zusätzlich ein Elutionsmittel oder einen Elutionspuffer umfassen, d. h. eine Lösung oder einen Puffer (z. B. 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH-Wert 8,0) oder reines Wasser, zur Elution von DNA oder RNA, die an die magnetischen Glaspartikel gebunden sind. Weiter können zusätzliche Reagenzien oder Pufferlösungen zugegen sein, die für das Reinigungsverfahren einer Nukleinsäure, d. h. DNA oder RNA, verwendet werden können.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens oder Kits in automatisierbaren Verfahren, wie beispielsweise beschrieben in WO 99/16781 . Automatisierbare Verfahren bedeutet, dass sich die Schritte des Verfahrens zur Durchführung mit einer Vorrichtung oder einer Maschine eignen, die mit wenig oder keiner externer Steuerung oder Einfluss durch einen Menschen arbeiten kann. Automatisiertes Verfahren bedeutet, dass die Schritte des automatisierten Verfahrens mit einer Vorrichtung oder Maschine durchgeführt werden, die mit wenig oder keiner externer Steuerung oder Einfluss durch einen Menschen arbeiten kann. Nur die Präparations-Schritte für das Verfahren können eigenhändig erfolgen, z. B. müssen die Aufbewahrungsbehälter aufgefüllt und an Ort und Stelle untergebracht werden, die Wahl der Proben muss durch einen Menschen erfolgen und weitere Schritte, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, z. B. der Betrieb des Steuerungscomputers. Die Vorrichtung oder die Maschine können z. B. automatisch Flüssigkeiten zugeben, die Proben mischen oder die Inkubations-Schritte bei bestimmten Temperaturen durchführen. Gewöhnlich ist eine solche Maschine oder Vorrichtung ein Roboter, der ein Programm durchführt, in dem einzelne Schritte und Befehle festgelegt sind. Bevorzugte automatisierte Verfahren werden in einem Hoch-Durchsatz-Format durchgeführt, was bedeutet, dass die Verfahren und die verwendete Maschine oder Vorrichtung für einen Hoch-Durchsatz der Proben in einer kurzen Zeitspanne optimiert sind. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen Verfahren oder Kits in halb-automatisiertem verfahren verwendet, was bedeutet, dass einige Reaktionsschritte manuell erfolgen müssen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, wird eine Suspension, die erfindungsgemäße MGPs enthält, aus einem Vorratsbehälter entnommen, und partielle Volumen werden unterschiedlichen Reaktionsbehältern hinzugefügt. Reaktionsgefäße können Reaktionsröhrchen sein, die aus Kunststoffen bestehen, möglicherweise im Mikrotiterplatten-Format und 96 oder 384 oder Vertiefungen enthalten, in denen eine Reaktion durchgeführt werden kann. Jedoch können diese Behälter auch aus anderem Material hergestellt sein, z. B. aus Stahl.
  • In den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird das erfindungsgemäße Kit zur Aufreinigung von Nukleinsäuren in der Forschung, Bioanalytik oder in der Diagnostik verwendet. Das erfindungsgemäße Kit oder das erfindungsgemäße Verfahren kann in einem Hoch-Durchsatz-Format verwendet werden, d. h. in einem automatisierten Verfahren, das die Analyse einer hohen Anzahl unterschiedlicher Proben in einer sehr kurzen Zeitspanne erlaubt.
  • Der Fachmann weiß von den Lehren und dem erfindungsgemäßen Beispiel, wie man die anderen Proteasen identifiziert, die in einer äquivalenten Weise wie die erfindungsgemäße Protease, d. h. die Protease Esperase, arbeiten. Dadurch ist es auch möglich, variante oder mutierte Proteine der Esperase zu identifizieren, die auf äquivalente Weise wie Esperase arbeiten. "Mutierte Aminosäure-Sequenz" "mutiertes Protein" oder "mutiertes Polypeptid" bezieht sich ein auf Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz von einer nativen Sequenz abweicht oder von einer Nukleotidsequenz codiert wird, die von einer nativen Sequenz absichtlich variant gemacht wurde. "Mutiertes Protein" "Variantes Protein" oder "Mutein" steht für ein Protein, das eine mutierte Aminosäure-Sequenz umfasst und Polypeptide aufweist, die sich von der Aminosäuresequenz der nativen Esperase aufgrund von Aminosäuredeletionen, -substitutionen oder -beiden unterscheiden. "Native Sequenz" bezieht sich auf eine Aminosäure- oder eine Nukleinsäuresequenz, die zu einem Wild-Typ oder zu einer nativen Form eines Gens oder Proteins identisch ist.
  • Zum Auffinden dieser varianten oder mutierten Proteine stellt man Lösungen her, die zu den in Beispiel 1 beschriebenen Reagenzien und zu den Puffern identisch sind, wobei Esperase als Standard für die Bestimmung der Proteaseaktivität verwendet wird. Hauptsächlich analysiert der Fachmann auf dem Gebiet die interessierende Protease, wie im Protokoll zur chromatographischen Analyse der Plasma-Protein-Spaltung beschrieben (siehe Beispiel 3). Die fragliche Protease wird weiter durch seine Eigenschaften in der Proben-Präparation mit nachfolgender PCR-Amplifikation und Nachweis des amplifizierten Produkts analysiert (siehe Beispiel 2). Für einen Vergleich mit dem offenbartem Enzym Esperase ist die die Untersuchung der Aufbewahrungsstabilität (siehe Beispiel 6) oder die Auswertung der Enzymaktivität in Anwesenheit der chaotropen Mittel (siehe Beispiel 5) von weiterem Interesse. Berücksichtigt man die Resultate dieser Untersuchungen, kann der Fachmann auf dem Gebiet entscheiden, ob eine interessierende Protease in einer äquivalenten Weise als Protease Esperase arbeitet, die durch die Erfindung offenbart wird.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine wässrige Zusammensetzung einer erfindungsgemäßen Protease, d. h. einer Protease, die wenigstens 80% Identität zur Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1 aufweist, wobei die Zusammensetzung 10 mM Tris-Acetat, 5 mM Calciumchlorid, 5 mM Calciumacetat, 1 mM EDTA, 50% (V/V = Volumen/Volumen) Glycerin mit einem pH-Wert von 5,5 umfasst. Diese Zusammensetzung ist ein idealer Aufbewahrungspuffer für Esperase (siehe Beispiel 6). Der Fachmann kann unter Berücksichtigung der Lehren von Beispiel 5 auch die Zusammensetzung des Puffers modifizieren, solange die erfindungsgemäße Protease in der modifizierten Puffer-Zusammensetzung gleichmäßig stabil ist. In einer weiteren Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz der Protease in der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1, ein proteolytisches Derivat davon mit Proteaseaktivität oder die Aminosäuresequenz SEQ ID NO 2. In einer weiteren Ausführungsform wird die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Protease in der oben beschriebenen Zusammensetzung von der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 3, einem Teil davon oder einer degenerierten Version der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 3 codiert. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann bei der Proben-Präparation oder in den Proben-Präparationsverfahren, insbesondere im erfindungsgemäßen Verfahren, zur Aufreinigung der Nukleinsäuren oder bei der Diagnostik oder in der diagnostischen Analyse verwendet werden.
  • Die folgenden Beispiele, Literaturstellen, das Sequenzprotokoll und die Figuren sollen das Verständnis der Erfindung lediglich unterstützen, dessen wahrer Schutzbereich in den beigefügten Ansprüchen festgelegt wird.
  • Beispiel 1: Reagenzien und Puffers
  • 1.1 Proteasen
  • Die folgenden Proteasen wurden auf ihre Eignung bei dem Probenherstellungsverfahren untersucht
    Alcalase (Novo Nordisk)
    Proteinase K (60 mg/ml) Roche Diagnostics, Cat. No. 1 964 372
    Subtilisin A (19 mg/ml) (Novo Nordisk)
    Esperase (24 mg/ml) (Novo Nordisk)
    Chirazym (31 mg/ml)
    Novozym 539 (Novo Nordisk)
    Novo 47002 (Novo Nordisk)
    Novocor PL (Novo Nordisk)
    Pronase (Roche Diagnostics, Cat. No. 165 921)
  • 1.2 Puffer:
  • 1.2.1 Lyse- und Bindungspuffer:
  • Lyse- und Bindungspuffer wurden hergestellt aus:
    5 M Guanidiumthiocyanat
    15% Polydocanol
    1% Dithiothreitol (DTT)
    15 mM Bis-TRIS, pH-Wert 6,0
  • 1.2.2 Waschpuffer:
  • Der Waschpuffer hatte die folgende Zusammensetzung:
    50% Ethanol
    50 mM NaCl
    10 mM Bis-TRIS, pH 6,0
  • 1.2.3 Elutionspuffer:
  • Der Elutionspuffer war RNase-freies destilliertes Wasser.
  • 1.3 Magnetische Glas-Partikel:
  • Magnetische Glaspartikel wie beschrieben in WO 01/37291 wurden in Isopropanol bei einer Konzentration von 6 mg/ml suspendiert. Die magnetischen Glaspartikel können auch aus dem MagNA Pure LC DNA Isolations-Kit I (Roche, Mannheim, Deutschland) entnommen werden.
  • 1.4 Puffer für den Protease-Activitätstest
  • Puffer:
    • 50 mM Tris/HCl pH-Wert 8,2
    • 10 mM Calciumchlorid
  • Substratlösung:
    • 200 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Nitroanilid in Dimethylsulfoxid (DMSO)
  • Beispiel 2 Probenpräparationsverfahren und Polymerasekettenreaktion
  • 2.1 Protease-Spaltung und Lyse:
  • 80 μl Protease-Lösung wird mit 420 μl Probenmaterial (beispielsweise Plasma mit einer spezifischen Viruskonzentration) versetzt und gemischt. 500 μl Lyse- und Bindungspuffer werden zugegeben, und die Lösung wird 10 min bei Raumtemperatur gemischt.
  • 2.2 Bindung:
  • 500 μl der Suspension der magnetischen Glaspartikel in Isopropanol werden zugegeben, und die Lösung wird 20 min bei Raumtemperatur gemischt.
  • 2.3 Waschen:
  • Nach dem Bindungsschritt werden die magnetischen Glaspartikel von der Lösung mit einem Magnet getrennt und fünfmal mit 750 μl Waschpuffer pro Waschzyklus gewaschen.
  • 2.4 Elution:
  • Nach dem letzten Waschzyklus werden die magnetischen Glaspartikel mit einem Magnet aus der Suspension getrennt und der Waschpuffer wird von den magnetischen Glaspartikeln abgesaugt, und es werden 100 μl Elutionspuffer zugegeben. Die Suspension wird für 15 min bei 80°C gemischt und inkubiert. Nach dem Elutionsschritt werden die magnetischen Glaspartikel wieder mit einem Magnet getrennt, und der Überstand, der die virale Nukleinsäure enthält, wird geerntet.
  • 2.5 Protokoll Amplifikation/Nachweis:
  • Mit Ausnahme der Primer wurde alle Reagenzien von Roche Molecular Biochemicals bezogen. Master Mix HCV:
    Reagenz konz./PCR
    Bicine-Puffer (pH 8,3) 1×
    MnOAc 2,5 mM
    dNTP Mix mit dUTP
    dUTP 0,6 mM
    dATP/dCTP/dGTP jeweils 0,2 mM
    Primer KY 80 (F) 300 nMol
    Primer KY 78-bio (R) 300 nMol
    Tth-Polymerase 10 U
    Uracil-N-glycosylase (UNG) 2 U
    Master Mix HIV:
    Reagenz konz./PCR
    Bicine-Puffer (pH 8,3) 1×
    MnOAc 1,25 mM
    dNTP Mix with dUTP
    dUTP 0,6 mM
    dATP/dCTP/dGTP jeweils 0,2 mM
    Primer SK 462-bio (F) 200 nMol
    Primer SK 431-bio (R) 200 nMol
    Tth-Polymerase 15 U
    UNG 2 U
    Master Mix HBV:
    Reagenz konz./PCR
    DNA-Master Mix 1×
    MgCl2 3,0 mM
    Primer 1 (F) 200 nMol
    Primer 2 (bio (R)) 200 nMol
    UNG 2 U
  • 20 μl des Eluats aus dem Probenherstellungsverfahren, das die Zielnukleinsäure, beispielsweise Virus-RNA (HCV, HIV) oder Virus-DNA (HBV) enthält, werden mit 100 μl Mastermix gemischt. Die Amplifikation erfolgt mit einem Perkin-Elmer Thermocycler 9600 mit den folgenden Thermocycler Programmen: HCV:
    UNG Schritt 1× 10 min 37°C
    RT Schritt 1× 30 min 60°C
    1× 1 min 95°C
    PCR 2× 10 sec 95°C
    20 sec 60°C
    33× 15 sec 90°C
    20 sec 60°C
    1× 7 min 72°C
    HIV:
    UNG Schritt 1× 10 min 37°C
    RT Schritt 1× 30 min 60°C
    PCR 4× 10 sec 95°C
    10 sec 55°C
    10 sec 72°C
    31× 10 sec 90°C
    10 sec 60°C
    10 sec 72°C
    HBV:
    UNG Schritt 1× 10 min 37°C
    PCR 35× 30 sec 92°C
    30 sec 55°C
    40 sec 72°C
  • Für den Nachweis des amplifizierten Materials wurde ein sehr empfindlicher nicht-isotroper Ansatz auf der Basis der Elektrochemilumineszenz (ECL) verwendet. Ruthenium-tris(bipyridyl)-markierte Oligonukleotide (Fangproben) wurden spezifisch an die biotinylierten denaturierten Amplikons hybridisiert. Anschließend wurde das Hybrid an die Oberfläche der von mit Streptavidin beschichteten Magnetkügelchen gebunden. Nach dem Fangen der Kügelchen auf einer Elektrode mit einem permanenten Magnet wurde die ECL-Reaktion der Rutheniummarkierung durch Anlegen von Spannung getriggert. Für Einzelheiten des ECL-Nachweisverfahrens siehe Hoyle et al. (13). Der gesamte automatisierte ECL-Nachweis erfolgte an einer Instrumentalplattform (Präprototyp von Elecsys 1010); Boehringer Mannheim GmbH). HCV:
    KY80 SEQ ID NO: 4
    KY78 SEQ ID NO: 5
    Sonde SEQ ID NO: 6
    HIV:
    SK 462 SEQ ID NO: 7
    SK 431 SEQ ID NO: 8
    Sonde SEQ ID NO: 9
    HBV:
    Primer 1 SEQ ID NO: 10
    Primer 2 SEQ ID NO: 11
    Sonde SEQ ID NO: 12
    Ergebnis
    Virus Proteinase K (ECL Zählungen × 10–3) Pronase (ECL Zählungen × 10–3) Subtilisin A (ECL Zählungen × 10–3) Esperase (ECL Zählungen × 10–3) Chirazym (ECL Zählungen × 10–3)
    HIV 278 62 62 210 214
    HCV 184 22 49 179 249
    HBV 371 30 241 300 446
  • Nur die Verwendung von Esperase und Chirazym für den Abbau von Plasmaproteinen bei dem Probenpräparationsverfahren ergibt ein ECL-Signal, das mit dem Signal vergleichbar ist, das durch die Verwendung von Proteinase K in dem Probenpräparationsverfahren erzeugt wird.
  • Example 3 Protokoll Chromatographie-Analysis der Plasmaprotein-Spaltung:
  • Die Proteinspaltung und die Lysis erfolgten wie beschrieben. Jeweils 100 μl der lysierten Lösung wurden in ein Hochdruckflüssigkeitschromatographie-Gerät (HPLC) (Dionex, Gynkothek) gespritzt und auf einer Umkehrphasensäule (C4, Vydac, 4,6 mm × 150 mm) in einem linearen Gradient von 0–80% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) getrennt. Peaks wurden bei einer Wellenlänge von 220 nm und 280 nm nachgewiesen.
    Protease Plasma-Proteinspaltung
    mit ungestresster Protease mit Protease, gestresst durch Wärmebehandlung (nach 3 Tagen Inkubation bei 45°C in Aufbewahrungspuffer*
    Esperase ++ ++
    Proteinase K ++ ++
    Pronase ++ –
    Subtilisin A ++/+ +
    Alcalase + nicht untersucht
    Novozym 539 + nicht untersucht
    Novo 47002 – nicht untersucht
    Novocor PL – nicht untersucht
    • * Aufbewahrungspuffer-Zusammensetzung: 10 mM Tris-Acetat, 5 mM Calciumchlorid, 5 mM Calciumacetat, 1 mM EDTA, 50% (V/V) Glycerin mit einem pH-Wert von 5,5
  • In der 1 ist der Vergleich der Spaltung von EDTA-Plasma gegen Citratplasma mit Esperase (siehe 1a) und Proteinase K (siehe 1b) gezeigt.
  • Beispiel 4 Bestimmung des pH-Wert-Optimums
  • Das pH-Wert-Optimum von Esperase wurde mit dem pH-Wert-Optimum der Proteinase K mit den Puffern wie grundlegend beschrieben unter 1.1.4 mit variierendem pH-Wert verglichen. Das pH-Wert-Optimum war mehr im neutralen pH-Wert-Bereich als bei Proteinase K (siehe 2).
  • Probe: 10 mg Protein werden in 1 ml dest. Wasser gelöst. Vor der Bestimmung wird die Probe mit dest. Wasser verdünnt, so dass der Anstieg der Extinktion in dem Test zwischen 0,02 und 0,05 E ist.
  • Probenpuffer:
    • • pH-Bereich: 5,5 bis 7,5: 50 mM Bis-Tris + 10 mM CaCl2 werden mit 2 N HCl oder 2 N NaOH auf den jeweiligen pH-Wert eingestellt.
    • • pH-Bereich 7,5 bis 9,5: 50 mM Tris-Base + 10 mM CaCl2 werden mit 2 N HCl oder 2 N NaOH auf den jeweiligen pH-Wert eingestellt.
  • Substrat: Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Nitroanilid (200 mM gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO)). Messung:
    • Pipettierschema: 2,00 ml Probenpuffer
    0,02 ml Substrate
    0,05 ml Probe
    • Messtemperatur: 25°C
    • Messwellenlänge: 405 nm
    • Bestimmung: Der lineare Anstieg der Extinktion (de/min) wird zwischen 2 und 6 min bestimmt.
    • Schichtdicke: 1 cm
  • Figure 00410001
  • Relative Aktivität: Für jede Probe wird die höchste gemessene Aktivität als der Wert für 100% angesehen, und die Aktivitäten bei anderen pH-Wert-Werten werden durch Bestimmen der prozentualen Beziehung zu diesem Wert ermittelt.
  • Beispiel 5 Bestimmung der Enzymaktivität in Anwesenheit chaotroper Mittel
  • Die Enzymaktivität der Esperase wurde mit der Enzymaktivität von Proteinase K in der Anwesenheit chaotroper Mittel mit den Puffern, wie grundlegend beschrieben unter 1.1.4 beschrieben, mit steigenden Mengen an chaotropem Mittel verglichen. Die Esperase hielt mehr Aktivität in der Anwesenheit von chaotropen Mitteln (siehe 3 und 4). Diese niedrigere Restaktivität ist vorteilhaft, da die Proteinspaltung durch Esperase sehr rasch in der Anwesenheit von chaotropen Mitteln (≤ 1 min) verläuft. Dies ist von Vorteil, da weniger aktive Esperase in die Amplifikationsreaktion überführt wird, wo sie die Amplifikationsreaktion stören könnte.
    • • Protease-Lösung: 20 mg/ml Protease
    • • Probe: 500 μl chaotropes Mittel 50 μl Protease-Lösung.
    • • Die Aktivität der Protease wird in verschiedenen Lösungen bestimmt. Dann wird die Probe für 15 min bei 25°C inkubiert, und die Restaktivität in verschiedenen Mitteln bestimmt.
  • Bestimmung der Aktivität:
    • • Testpuffer: 50 mM Tris·HCl pH-Wert = 8,2; 10 mM CaCl2
    • • Substrat: 200 mM Suc-Ala-Ala-Prp-Phe-p-Nitroanilid in DMSO
    • • Messtemperatur: 25°C
    • • Messwellenlänge: 405 nm
  • Bestimmung: siehe Bestimmung des pH-Wert-Optimums.
  • Beispiel 6 – Aufbewahrungsstabilität:
  • Die Stabilität der Proteasen wurde durch Beobachten der proteolytischen Aktivität unter thermischem Stress in Aufbewahrungspuffer (Zusammensetzung: 10 mM Tris-Acetat, 5 mM Calciumchlorid, 5 mM Calciumacetat, 1 mM EDTA, 50% (V/V) Glycerin mit einem pH-Wert von 5,5) bestimmt. Ein kinetischer Test mit Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Nitroanilid als Substrat wurde verwendet. Kurz vor der Verwendung muss die Proteaseprobe auf eine Konzentration von 1–3 μg/ml mit destilliertem Wasser verdünnt werden. 2 ml Puffer wurden mit 0,02 ml Substrat und 0,05 ml verdünnter Probe gemischt. Die Freisetzung von p-Nitroanilin aus dem Substrat bei 25°C wurde photometrisch bei 405 nm gemessen. Die Zeitkurve der Stabilität der Esperase im Vergleich mit Proteinase K ist in der 5 gezeigt. Als Ergebnis dieses Experiments konnte gezeigt werden, dass die Esperase in Aufbewahrungspuffer sogar nach einem längeren Zeitraum sehr stabil ist.
    Protease Restaktivität nach 3 Tagen Inkubation bei 45°C in Aufbewahrungspuffer (Zusammensetzung siehe oben)
    Esperase 88%
    Proteinase K 94%
    Pronase 89%
    Subtilisin A 45%
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    • WO 89/06279
    • WO 90/01069
    • WO 92/02638
    • WO 92/0880 A
    • WO 98/04730
    • WO 98/20115
  • SEQUENCE LISTING
    Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • ((Key for Sequence listing))
  • Page 1
    • SEQUENCE LISTING = SEQUENZPROTOKOLL
    • Methods for the analysis... = Verfahren zur Analyse von Nicht-Protein-Komponenten mit einer Protease aus einem Bacillus-Stamm
  • Page 5
    • modified_base = modifizierte_Base
    • Biotin derivatization = Biotinderivatisierung
  • Page 6
    • modified_base = modifizierte_Base ((3×))
    • -derivatisation = -Derivatisierung
    • Human immunodeficiency virus = Menschlicher Immunschwächevirus ((2×))
    • Biotin derivatization = Biotinderivatisierung ((2×))
  • Page 7
    • Human immunodeficiency virus = Menschlicher Immunschwächevirus
    • modified_base = modifizierte_Base ((2×))
    • -derivatisation = -Derivatisierung
    • Biotin derivatization = Biotinderivatisierung
    • Figure = Figur ((6×))
  • 3/6
    • relative activity = relative Aktivität
  • 4/6
    • relative activity = relative Aktivität
  • 5/6
    • relative activity after 15' at 25°C = relative Aktivität nach 15' bei 25°C
  • 6/6
    • Stability in Storage Buffer at 45°C = Stabilität in Aufbewahrungspuffer bei 45°C
    • Recovery = Ausbeute
    • Incubation time (days) = Inkubationszeit (Tage)

Claims (40)

  1. Verfahren zur Analyse einer Nicht-Protein-Zielkomponente eines aus einer biologischen Probe stammenden Gemischs aus Nicht-Protein- und Protein-Komponenten, wobei man in einem Verfahrensschritt das Gemisch mit einer eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 80% Identität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1, einem proteolytischen Derivat davon mit Proteaseaktivität oder der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 2 aufweisenden Protease inkubiert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz der Protease mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1, einem proteolytischen Derivat davon mit Proteaseaktivität oder der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 2 identisch ist.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz der Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 2 von der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 3, einem Teil davon oder einer degenerierten Version der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 3 codiert ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der biologischen Probe um eine Flüssigkeit aus dem menschlichen oder tierischen Körper handelt.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der biologischen Probe um Blut, Blutplasma, Blutserum oder Urin handelt.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe Bakterienzellen, eukaryontische Zellen, Viren oder Gemische davon umfaßt.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Nicht-Protein-Zielkomponente nach dem Inkubationsschritt an ein Material mit einer Affinität dafür gebunden, gegebenenfalls gewaschen und gegebenenfalls von dem Material mit einer Affinität dafür freigesetzt wird.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch aus Nicht-Protein- und Protein-Komponenten Nukleinsäuren umfaßt.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuren DNA oder/und RNA umfassen.
  10. Verfahren zur Analyse einer Nukleinsäure-Zielkomponente eines Gemischs aus Nukleinsäuren umfassenden Nicht-Protein-Komponenten und Protein-Komponenten, wobei das Gemisch aus einer biologischen Probe stammt, wobei man in den Verfahrensschritten a) das Gemisch mit einer eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 80% Identität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1, einem proteolytischen Derivat davon mit Proteaseaktivität oder der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 2 aufweisenden Protease inkubiert, b) die Nukleinsäure-Zielkomponente gegebenenfalls amplifiziert und c) die Nukleinsäure-Zielkomponente bestimmt oder nachweist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz der Protease mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1, einem proteolytischen Derivat davon mit Proteaseaktivität oder der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 2 identisch ist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz der Protease von der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 3, einem Teil davon oder einer degenerierten Version der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 3 codiert ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der biologischen Probe um eine Flüssigkeit aus dem menschlichen oder tierischen Körper handelt.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der biologischen Probe um Blut, Blutplasma, Blutserum oder Urin handelt.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuren DNA oder/und RNA umfassen.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA oder/und die RNA aus einem Virus oder einem Mikroorganismus stammt.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Virus um das Hepatitis-B-Virus, das Hepatitis-C-Virus oder das menschliche Immunschwächevirus handelt.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure-Zielkomponente mit der Polymerasekettenreaktion amplifiziert wird.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuren und die Nukleinsäure-Zielkomponente nach Schritt a) an ein Material mit einer Affinität für Nukleinsäuren gebunden, gegebenenfalls gewaschen und gegebenenfalls von dem Material mit einer Affinität für Nukleinsäuren freigesetzt werden.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Material mit einer Affinität für Nukleinsäuren und die Nukleinsäure-Zielkomponente ein Material mit einer Siliciumdioxidoberfläche umfaßt.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Material mit einer Siliciumdioxidoberfläche um ein Glas handelt.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Material mit einer Affinität für Nukleinsäuren und der Nukleinsäure-Zielkomponente um eine magnetische Glaspartikel umfassende Zusammensetzung handelt.
  23. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 22 für die diagnostische Analyse.
  24. Verwendung einer Protease mit der in einem der Ansprüche 10 bis 12 angegebenen Bedeutung in der Diagnostik.
  25. Verwendung einer Protease mit der in einem der Ansprüche 10 bis 12 angegebenen Bedeutung zur Analyse einer Nicht-Protein-Zielkomponente eines aus einer biologischen Probe stammenden Gemischs aus Nicht-Protein- und Protein-Komponenten.
  26. Verwendung einer Protease mit der in einem der Ansprüche 10 bis 12 angegebenen Bedeutung zur Anreicherung einer Nicht-Protein-Zielkomponente eines aus einer biologischen Probe stammenden Gemischs aus Nicht-Protein- und Protein-Komponenten.
  27. Verwendung einer Protease mit der in einem der Ansprüche 10 bis 12 angegebenen Bedeutung zur Aufreinigung oder Isolierung einer Nicht-Protein-Zielkomponente eines aus einer biologischen Probe stammenden Gemischs aus Nicht-Protein- und Protein-Komponenten.
  28. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Nicht-Protein-Zielkomponente um eine Nukleinsäure handelt.
  29. Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure aus einem Virus oder einem Mikroorganismus stammt.
  30. Kit-of-parts, dadurch gekennzeichnet, daß darin eine eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 80% Identität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1, einem proteolytischen Derivat davon mit Proteaseaktivität oder der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 2 aufweisende Protease sowie ein ein Material mit einer Siliciumdioxidoberfläche umfassendes Material mit einer Affinität für Nukleinsäuren enthalten ist.
  31. Kit nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz der Protease mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1, einem proteolytischen Derivat davon mit Proteaseaktivität oder der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 2 identisch ist.
  32. Kit nach einem der Ansprüche 30 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz der Protease nach einem der Ansprüche 30 bis 31 von der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 3, einem Teil davon oder einer degenerierten Version der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 3 codiert ist.
  33. Kit nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Material mit einer Siliciumdioxidoberfläche um ein Glas handelt.
  34. Kit nach einem der Ansprüche 30 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Material mit einer Affinität für Nukleinsäuren um eine magnetische Glaspartikel umfassende Zusammensetzung handelt.
  35. Kit nach einem der Ansprüche 30 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß der Kit zusätzlich einen Lysepuffer, einen Waschpuffer und einen Elutionspuffer umfaßt.
  36. Wässrige Zusammensetzung einer Protease mit wenigstens 80% Identität mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1, einem proteolytischen Derivat davon mit Proteaseaktivität oder der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung 10 mM Tris-Acetat, 5 mM Calciumchlorid, 5 mM Calciumacetat, 1 mM EDTA, 50 Vol.-% Glycerin bei einem pH-Wert von 5,5 umfaßt.
  37. Zusammensetzung nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz der Protease mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 1, einem proteolytischen Derivat davon mit Proteaseaktivität oder der Aminosäuresequenz SEQ ID NO 2 identisch ist.
  38. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 36 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz der Protease nach einem der Ansprüche 36 bis 37 von der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 3, einem Teil davon oder einer degenerierten Version der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO 3 codiert ist.
  39. Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 30 bis 35 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 36 bis 38 zur Aufreinigung von Nukleinsäuren.
  40. Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 30 bis 35 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 36 bis 38 in der Diagnostik.
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