DE60131670T2

DE60131670T2 - Impfstoffe gegen Krebskrankheiten

Info

Publication number: DE60131670T2
Application number: DE60131670T
Authority: DE
Inventors: Nathalie Garcon; Catherine Marie Ghieslaine Gerard; Jean Stephenne
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2000-10-18
Filing date: 2001-10-16
Publication date: 2008-10-30
Anticipated expiration: 2021-10-17
Also published as: ATE534401T1; DK1889630T3; ES2377077T3; PT1326638E; HK1147673A1; EP2266603B1; CY1113735T1; KR20030044015A; CY1108526T1; HK1057992A1; ES2392943T3; SI2266603T1; IL155282A; KR100831139B1; CY1112658T1; US20050019340A1; EP2266603A1; DK2266603T3; JP2008285487A; DE60131670D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Formulierung, die eine Kombination aus einem Krebsantigen oder einem Derivat davon und einer kombinierten Adjuvanszusammensetzung umfaßt, die ein Lipopolysaccharid, ein immunstimulierendes Oligonukleotid und ein Saponin wie in Anspruch 1 definiert, umfaßt. Das Antigen ist vorzugsweise ein Her-2/neu-Derivat oder P501S, und konsequenterweise haben die Formulierungen der Erfindung Nützlichkeit in der Behandlung und Prävention von Menschen, die solche Antigene exprimieren.
Trotz enormer finanzieller und personeller Investitionen bleibt Krebs eins der Haupttodesursachen. Zum Beispiel ist Krebs die Haupttodesursache bei Frauen im Alter zwischen 35 und 74. Brustkrebs ist der am häufigsten vorkommende bösartige Tumor und die Häufigkeit der Brustkrebsentwicklung ist im Steigen. Es wird geschätzt, daß eine von neun Frauen mit dieser Krankheit diagnostiziert werden wird. Standardansätze zur Heilung von Brustkrebs haben sich um eine Kombination aus Chirurgie, Bestrahlung und Chemotherapie zentriert. Diese Ansätze haben bei bestimmten bösartigen Tumoren zu einigen drastischen Erfolgen geführt. Jedoch ist Brustkrebs sehr häufig unheilbar, wenn es über ein bestimmtes Stadium hinaus diagnostiziert wird. Alternative Ansätze für die Früherkennung und Therapie sind notwendig.
Immunstimulierende Oligonukleotide, die unmethylierte CpG-Dinukleotide ("CpG") enthalten, sind auf diesem Gebiet als Adjuvantien bekannt, wenn sie sowohl auf dem systemischen als auch auf dem mukosalen Weg verabreicht werden ( WO 96/02555 , EP 468520 , Davis et al., J. Immunol., 1998, 160(2): 870–876; McCluskie und Davis, J. Immunol., 1998, 161(9): 4463–6). CpG ist eine Abkürzung für in DNA vorhandene Cytosin-Guanosin-Dinukleotid-Motive. Historisch wurde beobachtet, daß die DNA-Fraktion von BCG eine Antitumorwirkung ausüben konnte. In weiteren Untersuchungen wurde gezeigt, daß synthetische Oligonukleotide, die aus BCG-Gensequenzen stammen, immunstimulierende Wirkungen (sowohl in vitro als auch in vivo) induzieren können. Die Autoren dieser Untersuchungen schlossen, daß bestimmte Palindromsequenzen, einschließlich eines zentralen CG-Motivs, diese Aktivität tragen. Die zentrale Rolle des CG-Motivs in der Immunstimulation wurde später in einer Veröffentlichung von Krieg aufgeklärt, Nature 374, S. 546, 1995. Eine ausführliche Analyse hat gezeigt, daß das CG-Motiv in einem gewissen Sequenzkontext sein muß, und daß solche Sequenzen üblich in bakterieller DNA sind, aber selten in Wirbeltier-DNA sind. Die immunstimulierende Sequenz ist häufig, Purin, Purin, C, G, Pyrimidin, Pyrimidin; worin das Dinukleotid-CG-Motiv nicht methyliert ist, aber andere unmethylierte CpG-Sequenzen sind als immunstimulierend bekannt und können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
In bestimmten Kombinationen der 6 Nukleotide ist eine Palindromsequenz vorhanden. Verschiedene dieser Motive, entweder als Wiederholungen eines Motivs oder als eine Kombination unterschiedlicher Motive, können im gleichen Oligonukleotid vorhanden sein. Die Gegenwart eines oder mehrerer dieser Oligonukleotide, die eine immunstimulierende Sequenz enthalten, kann verschiedene Immununtergruppen aktivieren, einschließlich natürlicher Killerzellen (die Interferon-γ erzeugen und cytolytische Aktivität besitzen) und Makrophagen (Wooldrige et al. Bd. 89 (Nr. 8), 1977). Dennoch wurde jetzt gezeigt, daß andere unmethyliertes CpG-enthaltende Sequenzen, die nicht diese Konsensus-Sequenz aufweisen, immunmodulatorisch sind.
Bei Formulierung zu Impfstoffen wird CpG allgemein in freier Lösung zusammen mit freiem Antigen ( WO 96/02555 ; McCluskie und Davis, supra) oder kovalent an ein Antigen konjugiert (PCT-Veröffentlichung WO 98/16247 ) oder mit einem Träger wie Aluminiumhydroxid formuliert verabreicht ((Hepatitis-Oberflächenantigen) Davis et al., supra; Brazolot-Millan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1988, 95(26), 15553–8).
Die Adjuvanszusammensetzung der vorliegenden Erfindung schließt in bevorzugten Ausführungsformen mindestens ein Adjuvans ein, das von enterbakteriellem Lipopolysaccharid abstammt.
Es war lange bekannt, daß enterobakterielles Lipopolysaccharid (LPS) ein wirksamer Stimulator des Immunsystems ist, obwohl seine Verwendung in Adjuvantien durch seine toxischen Effekte eingeschränkt worden ist. Ein nicht-toxisches Derivat von LPS, Monophosphoryl-Lipid A (MPL), das durch Entfernung der Kern-Kohlenhydrat-Gruppe und des Phosphats vom reduzierenden Ende des Glucosamins hergestellt wird, ist von Ribi et al. (1986, Immunology und Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp. NY, S. 407–419) beschrieben worden und hat die folgende Struktur:
Eine weitere entgiftete Version des MPLs wird durch Entfernung der Acyl-Kette aus der 3-Stellung des Disaccharid-Gerüsts erhalten und wird als 3-O-desacyliertes Monophosphoryl-Lipid A (3D-MPL) bezeichnet. Es kann durch in die GB 2122204B erläuterten Verfahren gereinigt und hergestellt werden, wobei dieses Bezugsdokument auch die Herstellung von Diphosphoryl-Lipid A und 3-O-desacylierten Varianten davon offenbart. Eine bevorzugte Form des 3D-MPL ist in der Form einer Emulsion, die eine kleine Partikelgröße von weniger als 0,2 μm im Durchmesser hat, und das Verfahren zu ihrer Herstellung wird in WO 94/21292 offenbart. Wäßrige Formulierungen, die ein Monophosphoryl-Lipid A und ein Tensid umfassen, wurden in WO 98/43670A2 beschrieben.
Die von den bakteriellen Lipopolysaccharid abgeleiteten Adjuvantien, die in den Adjuvantien der vorliegenden Erfindung formuliert werden, können aus bakteriellen Quellen gereinigt und hergestellt werden, oder sie können alternativ synthetisch sein. Beispielsweise wird ein gereinigtes Monophosphoryl-Lipid A in Ribi et al. 1986 (siehe oben) beschrieben, und das von Salmonella sp. abstammende 3-O-desacylierte Monophosphoryl-Lipid A oder Diphosphoryl-Lipid A wird in GB 2220211 und US 4,912,094 beschrieben. Andere gereinigte und synthetische Lipopolysaccharide wurden beschrieben ( WO 98/01139 ; US 6,005,099 und EP 0 729 473 B1 ; Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4): 392–6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1): 141–6; und EP 0 549 074 B1 ). Besonders bevorzugte bakterielle Lipo polysaccharid-Adjuvantien sind die in US 6,005,099 und EP 0 729 473 B1 beschriebenen 3D-MPL und die β(1-6)Glucosamindisaccharide.
Entsprechend sind die LPS-Derivate, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, Diphosphoryl-Lipid A, MPL oder 3D-MPL.
Ein Disaccharid-Adjuvans ist ein gereinigtes oder synthetisches Lipid A der folgenden Formel:
worin R² H oder PO₃H₂ sein kann; R³ eine Acyl-Kette oder β-Hydroxymyristoyl oder ein 3-Acyloxyacyl-Rest sein kann, der die folgende Formel hat:
und worin X und Y einen Wert von 0 bis zu etwa 20 haben.
Kombinationen aus 3D-MPL und Saponin-Adjuvantien, die aus der Rinde der Quillaja Saponaria molina stammen, sind in EP 0 761 231 B beschrieben worden. WO 95/17210 offenbart ein Adjuvans-Emulsionssystem, das auf Squalen, α-Tocopherol und Polyoxyethylensorbitanmonooleat (TWEEN80) basiert, formuliert mit dem Immunstimulans QS21, gegebenenfalls mit 3D-MPL.
Saponine sind als Adjuvantien in Impfstoffen zur systemischen Verabreichung bekannt. Die Adjuvans- und hämolytische Aktivität individueller Saponine wurde umfassend auf diesem Gebiet untersucht (Lacaille-Dubois und Wagner, siehe oben). Zum Beispiel werden Quil-A (das aus der Rinde des südamerikanischen Baums Quillaja Saponaria Molina stammt) und Fraktionen davon in US 5,057,540 und "Saponins as vaccine adjuvants", C. R. Kensil, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12(1,2): 1–55; und in EP 0 362 279 B1 beschrieben.
Partikuläre Strukturen, die als immunstimulierende Komplexe (ISCOMS) bezeichnet werden, die Fraktionen von Quil-A umfassen, sind hämolytisch und wurden in der Herstellung von Impfstoffen verwendet (B. Morein, EP 0 109 942 B1 ). Es wurde berichtet, daß diese Strukturen Adjuvansakvitität besitzen ( EP 0 109 942 B1 ; WO 96/11711 ).
Die hämolytischen Saponine QS21 und QS17 (HPLC-gereinigte Fraktionen von Quil-A) wurden als wirksame systemische Adjuvantien beschrieben, und das Verfahren zu ihrer Herstellung wird in US-Patent-Nr. 5,057,540 und EP 0 362 279 B1 offenbart. Ebenfalls in diesen Zitaten wird die Verwendung von QS7 (eine nicht-hämolytische Fraktion von Quil-A) beschrieben, das als wirksames Adjuvans für systemische Impfstoffe wirkt. Die Verwendung von QS21 wird ferner in Kensil et al. beschrieben (1991, J. Immunology Bd. 146, 431–437). Kombinationen aus QS21 und Polysorbat und Cyclodextrin sind ebenfalls bekannt ( WO 99/10008 ). Partikuläre Adjuvanssysteme, die Fraktionen von Quil-A umfassen, wie QS21 und QS7, werden in WO 96/33739 und WO 96/11711 beschrieben.
Andere Saponine, die in den systemischen Impfungsuntersuchungen verwendet wurden, schließen diejenigen ein, die aus anderen Pflanzenarten stammen, wie Gypsophila und Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10(9): 572–577, 1992).
Es ist ebenfalls bekannt, daß Saponine in mukosalen eingesetzten Impfstoffuntersuchungen verwendet wurden, die unterschiedlichen Erfolg in der Induzierung von Immunantworten hatten. Es wurde zuvor gezeigt, daß Quil-A-Saponin keine Wirkungen auf die Induzierung einer Immunantwort hat, wenn Antigen intranasal verabreicht wurde (Gizurarson et al. 1994, Vaccine Research 3, 23–29). Dagegen haben andere Autoren dieses Adjuvans mit Erfolg verwendet (Maharaj et al., Can. J. Microbiol., 1986, 32(5): 414–20; Chavali and Campbell, Immunobiology, 174(3): 347–59). ISCOMs, die Quil-A-Saponin umfassen, wurden in intragastrischen und intranasalen Impfstoffformulierungen verwendet und wiesen Adjuvansaktivität auf (McI Mowat et al., 1991, Immunology, 72, 317–322; McI Mowat und Donachie, Immunology Today, 12, 383–385).
QS21, die nicht-toxische Fraktion von Quil-A, wurde ebenfalls als orales oder intranasales Adjuvans beschrieben (Sumino et al., J. Virol., 1998, 72(6): 4931–9; WO 98/56415 ).
Saponine werden in M. Lacaille-Dubois und H. Wagner (1996. A review of the biologocal and pharmacological activities of saponins. Pytomedicine Bd. 2, S. 363–386) gelehrt. Saponine sind Steroid- oder Triterpenglycoside, die im Pflanzenreich und im Reich der marinen Tiere weitverbreitet sind. Saponine sind bekannt für die Bildung kolloidaler Lösungen in Wasser, die beim Schütteln schäumen, und für die Ausfällung von Cholesterin. Wenn Saponine nahe an Zellmembranen sind, erzeugen sie porenartige Strukturen in der Membran, die das aufbrechen der Membran verursachen. Die Hämolyse von Erythrozyten ist ein Beispiel für dieses Phänomen, das eine Eigenschaft bestimmter, aber nicht aller Saponine ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft das überraschende Auffinden, das Kombinationen aus immunstimulierenden Oligonukleotiden (CpG), Saponin und einem Lipopolysaccharid äußerst wirksame Adjuvantien sind. Dementsprechend wird eine Impfstoffkombination bereitgestellt, die eine Kombination aus Saponin und einem immunstimulierenden Oligonukleotid und einem Lipopolysaccharid mit einem Krebs-Antigen oder einem Derivat davon, wie in Anspruch 1 definiert, umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Adjuvans-Formulierung ein Saponin, vorzugsweise QS21, ein immunstimulierendes Oligonukleotid und ein 3D-MPL.
Vorzugsweise kann der Impfstoff der vorliegenden Erfindung ferner einen Träger umfassen. In einer bevorzugten Form der vorliegenden Erfindung wirken die Oligonukleotide mit dem vereinigten Saponin/Lipopolysaccharid synergetisch in der Induzierung der Antigen-spezifischer Immunantworten, was zu einer gesteigerten Tumorregression führt. Die Formulierungen sind wirksam in der Induzierung von Immunantworten, die herkömmlich mit dem Immunsystem des Th1-Typs assoziiert sind. Entsprechend sind die Adjuvanskombinationen nicht nur geeignet zur Immunprophylaxe von Krankheiten, sondern überraschend auch zur Immuntherapie von Krankheiten wie Krebs.
Die Formulierungen enthalten ein Anti-Tumor-Antigen und sind für die immuntherapeutische Behandlung von Krebs nützlich. Zum Beispiel findet die Adjuvansformulierung Nützlichkeit mit Tumorabstoßungs-Antigenen, wie solche für Prostata-, Brust-, kolorektalen, Lungen-, Bauchspeicheldrüsen-, Nieren- oder Melanoma-Krebs. Beispielhafte Antigene schließen MAGE 1, 3 und MAGE 4 oder andere MAGE-Antigene, wie in WO 99/40188 beschrieben, PRAME, BAGE, Lage (ebenfalls bekannt als NY-Eos1), SAGE und HAGE ( WO 99/53061 ) oder GAGE (Robbins und Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, Seiten 628–636; van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (submitted 1997); Correale et al. (1997), Journal of National Cancer Institute 89, S. 293). Tatsächlich werden diese Antigene in einem weiten Bereich von Tumorarten wie Melanom, Lungenkarzinom, Sarkom und Blasenkarzinom exprimiert.
MAGE-Antigene zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden als Fusionsproteine mit einem heterologen Fusionspartner exprimiert, der ein Expressions-verstärkender oder ein immunologischer Fusionspartner ist. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Derivat ein Fusionsprotein, das ein Antigen aus der MAGE-Proteinfamilie, das an einen heterologen Fusionspartner gebunden ist, umfaßt, vorzugsweise MAGE 3. Die Proteine werden als rekombinante Fusionsproteine exprimiert, was das Erzeugen steigender Mengen in einem Expressionssystem im Vergleich mit einem nicht-fusionierten Protein ermöglicht. Daher kann der Fusionspartner im Bereitstellen von T-Helfer-Epitopen (immunologischer Fusionspartner) unterstützen, vorzugsweise T-Helfer-Epitope, die durch Menschen erkannt werden, oder im Exprimieren des Proteins (Expressionsverstärker) mit höheren Ausbeuten als das native rekombinante Protein unterstützen. Vorzugsweise wird der Fusionspartner sowohl ein immunologischer Fusionspartner als auch ein Expressions-verstärkender Partner sein.
In einer bevorzugten Form der Erfindung stammt der immunologische Fusionspartner vom Protein D ab, einem Oberflächenprotein des Gramnegativen Bakteriums Haemophilus influenza B ( WO 91/18926 ). Vorzugsweise umfaßt das Protein D-Derivat ungefähr das erste Drittel des Proteins, insbesondere ungefähr die ersten 100–110 N-terminalen Aminosäuren. Vorzugsweise ist das Protein D-Derivat lipidiert. Vorzugsweise sind die ersten 109 Reste des Lipoprotein D-Fusionspartners am N-Terminus beinhaltet, um das Impfstoff-Kandidaten-Antigen mit zusätzlichen exogenen T-Zell-Epitopen bereitzustellen und die Expressionsmenge in E. coli zu erhöhen (daher wirkt es ebenfalls als ein Expressionsverstärker). Der Lipidschwanz stellt eine optimale Präsentierung des Antigens für die Antigen-präsentierenden Zellen sicher.
Andere Fusionspartner schließen das nicht-strukturelle Protein des Influenzavirus, NS1 (Hämagglutinin), ein. Typischerweise werden die 81 N-terminalen Aminosäuren verwendet, obwohl verschiedene Fragment verwendet werden können, vorausgesetzt, daß sie T-Helfer-Epitope einschließen.
In einer anderen Ausführungsform ist der immunologische Fusionspartner das Protein, das als LYTA bekannt ist. Vorzugsweise wird der C-terminale Teil des Moleküls verwendet. LYTA stammt von Streptococcus pneumoniae ab, das eine N-Acetyl-L-alaninamidase synthetisiert, Amidase LYTA (codiert durch das lytA-Gen {Gene, 43 (1986), Seite 265–273}, ein Autolysin, das spezifisch bestimmte Bindungen im Peptidoglycan-Gerüst abbaut. Die C-terminale Domäne des LYTA-Proteins ist für die Affinität zum Cholin oder zu einigen Cholin-Analoga wie DEAE verantwortlich. Diese Eigenschaft wurde für die Entwicklung von E. coli C-LYTA-Expressionsplasmiden ausgenutzt, die für die Expression der Fusionsproteine nützlich sind. Eine Aufreinigung der Hybrid-Proteine, die das C-LYTA-Fragment an ihrem Amino-Terminus enthalten, ist beschrieben worden {Biotechnology: 10 (1992), Seiten 795–798}. Wie hier verwendet, verwendet eine bevorzugte Ausführungsform den Wiederholungsteil des LYTA-Moleküls, das sich am C-terminalen Ende, ausgehend von Rest 178 befindet. Eine besonders bevorzugte Form bezieht Reste 188–305 ein.
Die zuvor angegebenen immunologischen Fusionspartner sind ebenfalls vorteilhaft im Unterstützen der Expression. Insbesondere werden solche Fusionen in höheren Ausbeuten exprimiert als native rekombinante MAGE-Proteine. Solche Konstrukte sind in WO 99/40188 offenbart.
Ein bevorzugtes Prostata-Antigen ist als P501S bekannt, die Sequenz ID Nr. 113 der WO 98/37814 . Immunogene Fragmente und Teile davon umfassen mindestens 20, vorzugsweise 50, besonders bevorzugt 100 zusammenhängende Aminosäuren, wie in der zuvor angegebenen Patentanmeldung offenbart. Siehe zum Beispiel PS108 ( WO 98/50567 ).
Ein anderes Tumor-assoziiertes Antigen, das im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung nützlich ist, ist Cripto (Salomon et al., Bioassays 199, 21 61–70, US-Patent 5,654,140 ).
Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls nützlich in Kombination mit den Brustkrebs-Antigen Her-2/neu. Her-2/neu-Antigene sind unter anderem in dem US-Patent 5,801,005 offenbart. Das Her-2/neu muß ohne einen substantiellen Teil der Transmembrandomäne sein und kann die gesamte extrazelluläre Domäne (umfassend ungefähr Aminosäure 1–645) oder Fragmente davon und mindestens einen immunogenen Teil der oder die gesamte intrazelluläre Domäne (ungefähr die 580 C-terminalen Aminosäuren) umfassen. Insbesondere sollte der intrazelluläre Teil die Phosphorylierungsdomäne oder Fragmente davon umfassen. Solche Konstrukte sind in WO 00/44899 offenbart. Ein besonders bevorzugtes Konstrukt ist als ECD-PD und ein zweites als ECD-ΔPD bekannt, siehe WO 00/44899 .
Das hier verwendete Her-2/neu kann von der Ratte, der Maus oder dem Menschen stammen.
Das Her-2/neu-Antigen kann das gesamten Her-2/neu-Antigen ohne eine funktionelle Transmembrandomäne oder Teile davon sein. Bevorzugte Teile umfassen die extrazelluläre Domäne. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein Fusionsprotein bereitgestellt, das eine extrazelluläre Domäne umfaßt, die an einen Teil der intrazellulären Domäne gebunden ist, wie in WO 00/44899 offenbart.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Formulierungen, die in der Lage sind, die Immunität zu dem Proteinprodukt der Her-2/neu-Onkogen-Expression zu modulieren, vorzugsweise diese auszulösen oder zu verstärken, einschließlich für bösartige Tumore in warmblütigen Tieren, bei denen ein amplifiziertes Her-2/neu-Gen mit einem bösartigen Tumor es nicht erforderlich macht, daß das Protein-Expressionsprodukt des Gens auf dem Tumor vorliegt. Zum Beispiel kann eine Überexpression des Gens an der Initiierung und frühen Stadien der Tumorbildung beteiligt sein, jedoch kann die Protein-Expression anschließend reduziert sein oder fehlen. Die vorliegende Erfindung kann zusätzlich zum Verhindern der Bildung von Her-2/neu-positiven Tumoren und Verursachen der Regression der existierenden Her-2/neu-positiven Tumoren zum Auslösen oder Verstärken einer effektiven Immunantwort verwendet werden, um einen Her-2/neu-positiven Tumor in einen Her-2/neu-negativen umzuwandeln.
Die folgenden Abkürzungen werden über die gesamte Beschreibung hinweg verwendet: "ECD" bezieht sich auf die extrazelluläre Domäne, "ICD" bezieht sich auf die intrazelluläre Domäne, "PD" bezieht sich auf die Phosphorylierungsdomäne (d. h. die Domäne die phosphoryliert wird), die innerhalb der intrazellulären Domäne liegt, "ΔPD" bezieht sich auf ein Fragment der Phosphorylierungsdomäne, das innerhalb der Phosphorylierungsdomäne liegt, und "KD" bezieht sich auf die Kinasedomäne, die innerhalb der intrazellulären Domäne liegt. Das Produkt der Expression des Her-2/neu-Gens wird hier als das "Her-2/neu-Protein" bezeichnet, das ebenfalls als "p185" oder "c-erbB2" bekannt und bezeichnet wird.
Das "Her-2/neu-ECD-ICD-Fusionsprotein", das hier ebenfalls als "ECD-ICD" oder "ECD-ICD-Fusionsprotein" bezeichnet wird, bezieht sich auf ein Fusionsprotein (oder Fragmente davon), das die extrazelluläre Domäne (oder Fragmente davon) und die intrazelluläre Domäne (oder Fragmente davon) des Her-2/neu-Proteins umfaßt. Diese stellen bevorzugt Antigene zur Verwendung im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung dar. Wie hier verwendet, schließt das ECD-ICD-Fusionsprotein nicht einen substantiellen Teil der Her-2/neu-Transmembrandomäne ein, und schließt vorzugsweise nicht die Her-2/neu-Transmembrandomäne ein.
Die Begriffe "Her-2/neu-ECD-ICD-Fusionsprotein" und "Her-2/neu-ECD-PD-Fusionsprotein" und ihre abgeleiteten Begriffe beziehen sich selbstverständlich ebenfalls auf Fragmente davon, Homologe davon und funktionelle Äquivalente davon (kollektiv als "Varianten" bezeichnet), wie solche mit einer oder mehreren Aminosäuren, die in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung entweder (i) das Auslösen oder Verstärken einer Immunantwort im Vergleich zum Her-2/neu-Protein erhöhen oder (ii) das Auslösen oder Verstärken einer Immunantwort im Vergleich zum Her-2/neu-Protein nicht wesentlich beeinflussen (z. B. stimuliert eine Variante eine Antwort durch T-Helferzellen oder cytotoxische T-Zellen oder stimuliert die Herstellung von Antikörpern). Spezifische nicht-limitierende Beispiele von Varianten, die beispielhafte Fragmente, Homologe und funktionelle Äquivalente des Her-2/neu-ECD-ICD-Fusionsproteins und des Her-2/neu-ECD-PD-Fusionsproteins einschließen, werden hier ausführlicher beschrieben. Varianten können "im wesentlichen identisch" oder "im wesentlichen ähnlich" zu einem Fusionsprotein sein, das die nativen Polypeptidkomponenten umfaßt, und behalten die Fähigkeit eine Immunantwort zu stimulieren.
Das 268 Aminosäure lange Her-2/neu-PD ist intrazellulär und kann durch Proteintyrosinkinasen phosphoryliert werden. Die Region teilt keine Identität mit dem entsprechenden Teil anderer Tyrosinkinase-Rezeptoren. Daher macht die Spezifität und Einzigartigkeit dieser Domäne diese besonders bevorzugt für die Verwendung als ein Tumor-Impfstoff. Jedoch ist die Expression dieser Domäne in bakteriellen und Säugetierzellen alleine problembehaftet. Zum Beispiel ist das resultierende PD-Protein labil und für die Massenfertigung ungeeignet. In einer Ausführungsform verwendet diese Erfindung daher vorzugsweise eine Fusion, die die gesamte oder einen Teil der intrazellulären Domäne oder die Phosphorylierungsdomäne bis zur gesamten oder Teil der extrazellulären Domäne des Her-2/neu umfaßt. Die ECD-ICD-Fusionsproteine und die ECD-PD-Fusionsproteine sind löslich, werden sezerniert und sind im Kulturmedium stabil.
Die Impfstoffe der Erfindung werden nützlich gegen jeden Krebs sein, der durch eine Tumor-assoziierte Expression von MAGE, P501S, Cripto und Her-2/neu charakterisiert ist. Zusätzlich zum Ermöglichen einer zunehmenden Expression der intrazellulären Domäne oder der Phosphorylierungsdomäne, oder Varianten davon, als ein Fusionsprotein mit der extrazellulärer Domäne oder seiner Varianten, gewährleisten die ECD-ICD- und ECD-PD-Fusionsproteine eine verbesserte Impfstoffformulierung.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine Impfstoffformulierung bereit, die eine Adjuvanszusammensetzung umfaßt, wobei das Adjuvans ein Lipopolysaccharid, wie in Anspruch 1 definiert, ein Saponin und ein immunstimulierendes Oligonukleotid und ein Her-2/neu-Antigen ohne dessen Transmembrandomäne umfaßt. Das Her-2/neu-Molekül kann von der Ratte, der Maus, dem Menschen oder ein Hybrid davon sein. Vorzugsweise umfaßt das Her-2-Molekül im wesentlichen alles der extrazellulären Domäne. Mit im wesentlichen alles ist gemeint, daß nicht mehr als 100 Aminosäuren von der extrazellulären Domäne entfernt worden sind, vorzugsweise weniger als 75, besonders bevorzugt weniger als 50 Aminosäuren. Es wird bevorzugt, daß die vollständige extrazelluläre Domäne vorliegt. Die extrazelluläre Domäne im menschlichen Her-2/neu-Konstrukt der vorliegenden Erfindung umfaßt vorzugsweise im wesentlichen alle 600 N-terminalen Aminosäuren, besonders bevorzugt die 630 N-terminalen Aminosäuren, darüber hinaus bevorzugt etwa 650 Aminosäuren. Das menschliche ICD verläuft von Aminosäure 676 bis Val 1255. Die Phosphorylierungsdomäne ist im N-terminalen Teil der ICD lokalisiert. Es wird bevorzugt, daß die Konstrukte, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die Phosphorylierungsdomäne umfassen, jedoch schließen sie keine funktionelle Transmembrandomäne ein. Vorzugsweise ist die Transmembrandomäne vollkommen entfernt.
Konstrukte, die besonders nützlich zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind, werden in WO/0044899 beschrieben.
Es ist eine bevorzugte Ausführungsform, worin das Her-2/neu-Antigen mit 3D-MPL, QS21 und CpG-Oligonukleotid zusammen mit einem Liposom- oder einem Öl-in-Wasser-Emulsionsträger formuliert wird. Solche Formulierungen erzeugen sowohl eine humoral- als auch eine zellulär-vermittelte Antwort. Im Vergleich zu einer Adjuvansformulierung, die nur QS21 und 3D-MPL umfaßt, führte die Formulierung der Erfindung in Mäusen vorteilhafterweise zu einer starken TH1-Antwort. Formulierungen mit CpG alleine erzeugten keine signifikante Zell-vermittelte Immunantwort.
Die Formulierungen können Antigene enthalten, die mit Tumor-Unterstürzungsmechanismen (z. B. Angiogenese, Tumorinvasion) assoziiert sind, zum Beispiel TIE-2 und VEGF.
Die bevorzugten Oligonukleotide zur Verwendung in Adjuvantien oder Impfstoffen der vorliegenden Erfindung enthalten bevorzugt zwei oder mehr Dinukleotid-CpG-Motive, die durch mindestens 3, besonders bevorzugt mindestens 6 oder mehr Nukleotide getrennt sind. Die Oligonukleotide sind typischerweise Desoxynukleotide. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Internukleotid im Oligonukleotid Dithiophosphat und besonders bevorzugt eine Thiophosphat-Bindung, obwohl Phosphodiester und andere Internukleotid-Bindungen im Umfang der Erfindung liegen, einschließlich Oligonukleotide mit gemischten Internukleotid-Bindungen. Verfahren zur Herstellung von Thiophosphat-Oligonukleotiden oder Dithiophosphat werden in US 5,666,153 , US 5,278,302 und WO 95/26204 beschrieben.
Beispiele für bevorzugte Oligonukleotide haben die folgenden Sequenzen. Sie Sequenzen enthaltenen bevorzugt Thiophosphat-modifizierte Internukleotid-Bindungen.
Alternative CpG-Oligonukleotide können die obigen bevorzugten Sequenzen umfassen, indem sie folgenlos (inkonsequente) Deletionen oder Additionen daran aufweisen. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten CpG-Oligonukleotide können durch jedes fachbekannte Verfahren synthetisiert werden (z. B. EP 468520 ). Zweckmäßig können solche Oligonukleotide unter Verwendung eines Syntheseautomaten synthetisiert werden. Sie sind typischerweise zwischen 10–50 Basen lang.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Oligonukleotide sind typischerweise Desoxynukleotide. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Internukleotid-Bindung im Oligonukleotid Dithiophosphat oder besonders bevorzugt eine Thiophosphat-Bindung, obwohl Phosphodiester im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen. Oligonukleotide, die unterschiedliche Internukleotid-Bindungen umfassen, werden erwogen, z. B. gemischte Thiophosphat-Phosphodiester. Andere Internukleotid-Bindungen, die das Oligonukleotid stabilisieren, können verwendet werden.
Die Saponine, die in den erfindungsgemäßen Adjuvanskombinationen verwendet werden können, schließen diejenigen ein, die aus der Rinde von Quillaja Saponaria Molina stammen, bezeichnet als Quil-A und Fraktionen davon, beschrieben in US 5,057,540 und "Saponine as vaccine adjuvans", C. R. Kensil, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12(1-2): 1–55; und EP 0 362 279 B1 . Besonders bevorzugte Fraktionen von Quil-A sind QS21, QS7 und QS17.
β-Escin ist ein anderes bevorzugtes hämolytisches Saponin zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Adjuvanszusammensetzungen. Escin wird im Merck-Index (12. Auflage, Eintrag 3737) als eine Mischung von Saponinen beschrieben, die in den Samen der Roßkastanie, Lat.: Aesculus hippocastanum auftreten. Seine Isolierung wird durch Chromatographie und Reinigung (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)) und durch Ionen-Austauscherharzen (Erbing et al., US 3,238,190 ) beschrieben. Fraktionen von Escin, alpha und beta, wurden gereinigt, und es wurde gezeigt, daß sie biologisch aktiv sind (M. Yoshikawa et al. (Chem. Pharm. Bull (Tokyo) Aug. 1996; 44(8): 1454–1464)). β-Escin ist ebenfalls als Aescin bekannt.
Ein anderes bevorzugtes hämolytisches Saponin zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist Digitonin. Digitonin wird im Merck-Index (12. Auflage, Eintrag 3204) als Saponin beschrieben, das aus den Samen von Digitalis purpurea stammt und gemäß dem Verfahren gereinigt wird, das beschrieben wird von Gisvold et al., J. Am. Pharm. Assoc. 3, 1934, 23, 664; und Ruhenstroth-Bauer, Physiol. Chem., 1955, 301, 621. Seine Verwendung als klinisches Reagens zur Cholesterin-Bestimmung wird beschrieben.
Die Adjuvanskombinationen der vorliegenden Erfindung können ferner einen Träger umfassen, so daß das Saponin oder CpG oder das Lipopolysaccharid mit einer partikulären Trägereinheit verbunden sein kann, um die Adjuvansaktivität der Kombination zu steigern. Besonders bevorzugte systemische Impfstoffe umfassen zum Beispiel ein Trägermolekül.
Das in den erfindungsgemäßen Adjuvanskombinationen verwendete CpG kann in freier Lösung sein oder an partikuläre Träger komplexiert sein, wie zum Beispiel Mineralsalze (zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Aluminium- oder Calciumsalze), Liposome, ISCOMs, Emulsionen (Öl-in-Wasser, Wasser-in-Öl, Wasser-in-Öl-in-Wasser), Polymere (wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polyphosphazin, Polyaminosäure, Alginat, Chitosan) oder Mikropartikel. Bevorzugt sind diese Träger kationisch. Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung umfassen ferner ein Antigen, das mit dem CpG-Träger-Komplex verbunden oder nicht mit dem CpG-Träger-Komplex verbunden sein kann. In diesem Fall kann das Antigen eine freie Suspension sein oder mit einem separaten Träger verbunden sein.
Die Saponine, die einen Teil der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung bilden, können in Form von Mizellen getrennt sein oder können in Form von großen geordneten Strukturen sein, wie ISCOMs ( EP 0 109 942 B1 ) oder Liposomen ( WO 96/33739 ), wenn sie mit Cholesterin und Lipid formuliert werden, oder in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion ( WO 95/17210 ). Die Saponine können bevorzugt mit einem Metallsalz verbunden sein, wie Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat ( WO 98/15287 ). Alternativ kann das Saponin mit einem partikulären Träger wie Chitosan verbunden sein. Das Saponin kann ebenfalls in einem trockenen Zustand sein, wie zum Beispiel als Pulver. Die fertigen Formulierungen besitzen in der Form, in der sie an die Schleimhautoberfläche des Impflings verabreicht werden, bevorzugt eine hämolytische Natur. Das Saponin kann mit den Antigen entweder durch eine direkte Bindung oder durch Wechselwirkung mit dem gleichen partikulären Trägermolekül physikalisch verbunden sein oder nicht ( GB 9822712.7 ; WO 98/16247 ).
Das CpG und Saponin und Lipopolysaccharid in den Adjuvantien oder Impfstoffen der vorliegenden Erfindung können selbst separat oder assoziiert sein. Zum Beispiel können das CpG und Saponin in einer freien Suspension sein oder können über einen Träger assoziiert sein, besonders bevorzugt einen partikulären Träger, wie Aluminiumhydroxid, oder durch ein kationisches Liposom oder ISCOM.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Adjuvanskombination ist aus einem oder mehreren CpG-Oligonukleotiden zusammengesetzt, die wenigstens 3, bevorzugt wenigstens 6 Nukleotide zwischen zwei benachbarten CG-Motiven enthalten, zusammen mit QS21 und einem partikulären Träger, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die Öl-in-Wasser-Emulsion oder DQ umfaßt. Es wird bevorzugt, daß das Lipopolysaccharid ein Di- oder Monophosphoryl-Lipid-Derivat, vorzugsweise 3-O-desacyliertes, insbesondere 3-O-desacyliertes Monophosphoryl-Lipid A ist. Am meisten bevorzugt umfaßt die Adjuvanskombination CpG 2006 (SEQ ID NO: 4) oder CpG 1758 (SEQ ID NO: 2) oder CpG 1826 (SEQ ID NO: 1), vermischt mit QS21 und einem partikulärem Träger, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die eine Öl-in-Wasser-Emulsion oder DQ umfaßt. Entsprechend umfassen besonders bevorzugte Impfstoffe zum Beispiel solche Adjuvanskombinationen und ein Antigen wie in Anspruch 1 definiert. Der bevorzugte Impfstoff der vorliegenden wird verwendet, um systemische Immunreaktionen nach Verabreichung an einer Individuum durch den systemischen Weg zu erzeugen.
Die immunogenen Kombinationen der vorliegenden Erfindung können eine Öl-basierende Emulsion umfassen. Öl-Emulsionsadjuvantien sind seit mehreren Jahren bekannt, einschließlich Arbeiten an Freund's vollständigen und unvollständigen Mineralöl-Emulsionsadjuvantien. Seit dieser Zeit ist viel Arbeit durchgeführt worden, um stabile und wohltolerierbare Alternativen zu diesen wirksamen, jedoch reaktogenen Adjuvansformulierungen zu entwickeln.
Viele Einzel- oder Mehrphasen-Emulsionssysteme sind beschrieben worden. Öl-in-Wasser-Emulsion-Adjuvantien sind selbst als nützliche Adjuvanszusammensetzungen vorgeschlagen worden ( EP 0 399 843B ). Ebenfalls wurden Kombinationen aus Öl-in-Wasser-Emulsionen und anderen aktiven Mitteln als Adjuvantien für Impfstoffe beschrieben worden ( WO 95/17210 ; WO 98/56414 ; WO 99/12565 ; WO 99/11241 ). Andere Öl-Emulsionsadjuvantien sind beschrieben worden, wie zum Beispiel Wasser-in-Öl-Emulsionen ( US 5,422,109 ; EP 0 480 982 B2 ) und Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionen ( US 5,424,067 ; EP 0 480 981 B ).
Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Öl-Emulsionsadjuvantien können natürlich oder synthetisch sein, und können mineralisch oder organisch sein. Beispiele für mineralische und organische Öle werden dem Fachmann leicht ersichtlich sein.
Damit eine beliebige Öl-in-Wasser-Zusammensetzung zur menschlichen Verabreichung geeignet ist, muß die Öl-Phase des Emulsionssystems ein metabolisierbares Öl umfassen. Die Bedeutung des Begriffs metabolisierbares Öl ist in diesem Fach bekannt. Metabolisierbar kann als "in der Lage zur Umwandlung durch Metabolismus" definiert werden (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W. B. Sanders Company, 25. Auflage (1974)). Das Öl kann jedes pflanzliche Öl, Fischöl, Tieröl oder synthetische Öl sein, das nicht toxisch für den Empfänger ist und durch Metabolismus umgewandelt werden kann. Nüsse (wie zum Beispiel Erdnußöl), Samen und Körner sind übliche Quellen für pflanzliche Öle. Synthetische Öle sind ebenfalls Teil dieser Erfindung und können handelsübliche Öle wie NEOBEE^® und andere einschließen. Squalen (2,6,10,15,19,,23-Hexamethyl-2,6,10,14,18,22-tetracosahexan) ist ein ungesättigtes Öl, das in großen Mengen in Haileber-Öl und in geringen Mengen in Olivenöl, Weizenkeimöl, Reiskleieöl und Hefe gefunden wird, und ist ein besonders bevorzugtes Öl zur Verwendung in dieser Erfindung. Squalen ist ein aufgrund der Tatsache metabolisierbares Öl, das es eine Zwischenstufe in der Biosynthese von Cholesterin ist (Merck Index, 10. Auflage, Eintrag 8619).
Besonders bevorzugte Öl-Emulsionen sind Öl-in-Wasser-Emulsionen und insbesondere Squalen-in-Wasser-Emulsionen.
Zusätzlich umfassen die am meisten bevorzugten Öl-Emulsionsadjuvantien der vorliegenden Erfindung ein Antioxidationsmittel, das vorzugsweise das Öl α-Tocopherol ist (Vitamin E, EP 0 382 271 B1 ).
WO 95/17210 und WO 99/11241 offenbaren Emulsionsadjuvantien, die auf Squalen, α-Tocopherol und TWEEN 80 basieren, gegebenenfalls mit den Immunstimulantien QS21 und/oder 3D-MPL formuliert. WO 99/12565 offenbart eine Verbesserung zu diesen Squalen-Emulsionen mit der Zugabe eines Sterols in die Ölphase. Zusätzlich kann ein Triglycerid wie Tricaprylin (C₂₇H₅₀O₆) zu der Ölphase hinzugegeben werden, um die Emulsion zu stabilisieren ( WO 98/56414 ).
Die Größe der Öltropfchen, die innerhalb der stabilen Öl-in-Wasser-Emulsion zu finden sind, sind vorzugsweise weniger als 1 μm und können im Bereich von im wesentlichen 30 bis 600 nm sein, vorzugsweise im wesentlichen ca. 30 bis 500 nm im Durchmesser und am meisten bevorzugt im wesentlichen 150 bis 500 nm im Durchmesser, und im besonderen ca. 150 nm im Durchmesser, wie durch Photonen-Korrelationsspektroskopie gemessen. In dieser Hinsicht sollten 80% der Öltröpfchenzahl innerhalb der bevorzugten Bereiche sein, besonders bevorzugt mehr als 90% und am meisten bevorzugt sind mehr als 95% der Öltröpfchenzahl innerhalb der definierten Größenbereiche. Die Mengen der Komponenten, die in den Öl-Emulsionen der vorliegenden Erfindung vorliegen, sind herkömmlich im Bereich von ca. 2 bis 10% Öl, wie zum Beispiel Squalen, und falls vorliegend von 2 bis 10% alpha-Tocopherol; und von 0,3 bis 3% Tensid, wie zum Beispiel Polyoxyethylensorbitanmooleat. Vorzugsweise ist das Verhältnis von Öl:alpha-Tocopherol gleich oder weniger als 1, da diese eine stabilere Emulsion bereitstellt. Span 85 kann ebenfalls in einer Menge von ca. 1% vorliegen. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, daß die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung ferner einen Stabilisator enthalten werden.
Das Verfahren zum Herstellen von Öl-in-Wasser-Emulsionen ist dem Fachmann wohlbekannt. Im allgemeinen umfaßt das Verfahren das Vermischen der Ölphase mit einem Tensid wie einer PBS/TWEEN80^TM-Lösung, gefolgt von Homogenisierung unter Verwendung eines Homogenisators. Es wird dem Fachmann klar sein, daß ein Verfahren das Passieren des Gemisches zweimal durch eine Spritzennadel für das Homogenisieren kleiner Flüssigkeitsvolumina geeignet sein würde. Ebenso könnte das Emulgierungsverfahren im Mikrofluidisierer (M110S Mikrofluidisierungsmaschine, maximal 50 Passagen, für einen Zeitraum von 2 Minuten bei einem maximalen Einlaßdruck von 6 bar (Auslaßdruck ca. 850 bar)) durch den Fachmann angepaßt werden, um kleinere oder größere Volumina der Emulsion herzustellen. Diese Anpassung könnte durch Routineexperimentierung erreicht werden, die das Messen der resultierenden Emulsion umfaßt, bis eine Zubereitung mit Öltröpfchen mit dem benötigten Durchmesser erreicht wurde.
Die immunogenen Kombinationen der vorliegenden Erfindung können sowohl als systemisches als auch als mukosales Adjuvans verwendet werden. In einer besonderen Form der Erfindung wird ein systemischer Impfstoff zur Verabreichung durch den systemischen oder parenteralen Weg bereitgestellt, wie zum Beispiel durch intramuskuläre, intradermale, transdermale, subkutane, intraperitoneale oder intravenöse Verabreichung. Ein bevorzugter Weg der Verabreichung ist über den transdermalen Weg, zum Beispiel durch Hautpflaster.
Die systemischen Impfstoffzubereitungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um ein Säugetier zu schützen oder zu behandeln, das anfällig für eine Krankheit ist oder daran leidet, mittels Verabreichung des Impfstoffs durch intramuskuläre, intraperitoneale, intradermale, transdermale, intravenöse oder subkutane Verabreichung. Verfahren der systemischen Verabreichung der Impfstoffzubereitungen können herkömmliche Spritzen und Nadeln einschließen, oder Vorrichtungen, die zur ballistischen übertragung fester Impfstoffe entwickelt wurden ( WO 99/27961 ), oder eine nadellose Druckflüssigkeitsstrahlvorrichtung ( US 4,596,556 ; US 5,993,412 ), oder transdermale Pflaster ( WO 97/48440 ; WO 98/28037 ). Die vorliegende Erfindung kann ebenfalls zur Steigerung der Immunogenität von auf die Haut aufgetragenen Antigenen verwendet werden (transdermale oder transkutane Übertragung WO 98/20734 ; WO 98/28037 ).
Alternativ kann die erfindungsgemäße Impfstoffzubereitung verwendet werden, um ein Säugetier zu schützen oder zu behandeln, das an einer Krankheit leidet oder dafür anfällig ist, mittels Verabreichen des Impfstoffs auf dem mukosalen Weg, wie dem oralen/Ernährungs- oder nasalen Weg. Alternative mukosale Wege sind intravaginal und intrarektal. Der bevorzugte mukosale Weg der Verabreichung ist über den nasalen Weg, bezeichnet als intranasale Impfung. Verfahren der intranasalen Impfung sind allgemein fachbekannt, einschließlich der Verabreichung einer Tröpfchen-, Spray- oder trockenen gepulverten Form des Impfstoff in den Nasenrachen des zu immunisierenden Individuums. Vernebelte oder aerosolisierte Impfstoffformulierungen bilden ebenfalls einen Teil dieser Erfindung. Enterische Formu lierungen wie magensaftresistente Kapseln und Granalien zur oralen Verabreichung, Suppositorien zur rektalen oder vaginalen Verabreichung, bilden ebenfalls einen Teil dieser Erfindung.
Die immunogenen Kombinationen der vorliegenden Erfindung stellen eine Klasse von mukosalen Adjuvantien dar, die zur Anwendung bei Menschen geeignet sind, um die systemische Impfung durch die mukosale Impfung zu ersetzen.
Die Adjuvanskombinationen der vorliegenden Erfindung werden in der Formulierung von Impfstoffen verwendet, wobei die Impfstoffe auf dem systemischen oder mukosalen Weg verabreicht werden können. Wenn die Impfstoffe zur mukosalen Verabreichung verwendet werden, umfassen die Adjuvanskombinationen bevorzugt ein hämolytisches Saponin.
Zur mukosalen Verabreichung umfaßt die erfindungsgemäße Zusammensetzung bevorzugt ein hämolytisches Saponin. Hämolytisches Saponin oder hämolytische Saponin-Zubereitung innerhalb der Bedeutung dieser Erfindung wird unter Bezugnahme auf den folgenden Test bestimmt.

1. Frisches Blut aus Meerschweinchen wird mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) 3-mal in einer Tisch-Zentrifuge gewaschen. Nach Resuspendieren auf das ursprüngliche Volumen wird das Blut weiter 10-fach in PBS verdünnt.
2. 50 μl dieser Blutsuspension werden zu 800 μl PBS gegeben, das Zweifach-Verdünnungen an Tensid oder Saponin enthält.
3. Nach 8 Stunden wird die Hämolyse visuell oder durch Messung der optischen Dichte des Überstands bewertet. Die Gegenwart eines roten Überstands, der Licht bei 570 nm absorbiert, zeigt die Gegenwart von Hämolyse an.
4. Die Ergebnisse werden als Konzentration in der ersten Saponin-Verdünnung ausgedrückt, bei der keine Hämolyse mehr auftritt.

Für die Zwecke dieser Erfindung ist die Saponin-Adjuvanszubereitung hämolytisch, falls die Erythrozyten bei einer Konzentration von weniger als 0,1% lysieren. Als Bezugsmittel sind im wesentlichen reine Proben von Quil-A, QS21, QS7, Digitonin und β-Escin als hämolytische Saponine, wie sie in diesem Test definiert werden. Innerhalb der inhärenten experimentellen Varians eines solchen biologischen Tests besitzen die Saponine der vorliegenden Erfindung bevorzugt eine hämolytische Aktivität von etwa 0,5 bis 0,00001%, besonders bevorzugt von 0,05 bis 0,00001%, noch mehr bevorzugt von 0,005–0,00001% und am meisten bevorzugt von 0,001–0,0004%. Idealerweise sollten die Saponine eine hämolytische Aktivität ähnlich (d. h. innerhalb eines 10-fachen Unterschieds) derjenigen von QS21 haben.
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können ebenfalls auf dem oralen Weg verabreicht werden. In solchen Fällen kann der pharmazeutisch annehmbare Exzipient ebenfalls alkalische Puffer oder enterische Kapseln oder Mikrogranalien einschließen. Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können ebenfalls auf dem vaginalen Weg verabreicht werden. In solchen Fällen können die pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten ebenfalls Emulgatoren, Polymere wie CARBOPOL^®, und andere bekannte Stabilisator für Vaginalcremes und -suppositorien einschließen. Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können ebenfalls auf dem rektalen Weg verabreicht werden. In solchen Fällen können die Exzipienten ebenfalls Wachse und Polymere einschließen, die fachbekannt zur Bildung rektaler Suppositorien sind.
Zubereitungen aus mehr als einem Saponin in den Adjuvanskombinationen der vorliegenden Erfindung bilden ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung. Zum Beispiel Kombinationen aus wenigstens zwei der folgenden Gruppe, die QS21, QS7, Quil-A, β-Escin oder Digitonin umfaßt. Zusätzlich können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung Kombinationen aus mehr als einem immunstimulierenden Oligonukleotid umfassen.
Alternativ können die Formulierungen mit Impfstoffträgern kombiniert werden, die zusammengesetzt sind aus Chitosan oder anderen polykationischen Polymeren, Polylactid und Polylactid-Co-Glycolid-Partikeln, Polymermatrix auf Basis von Poly-N-acetylglucosamin, Partikeln, die aus Polysacchariden oder chemisch modifizierten Polysacchariden zusammengesetzt sind, Liposomen und Partikeln auf Lipidbasis, Partikeln, die aus Glycerin-Monoestern zusammengesetzt sind, etc. Die Saponine können ebenfalls in Gegenwart von Cholesterin formuliert werden, um partikuläre Strukturen zu bilden wie Liposome oder ISCOMs. Außerdem können die Saponine zusammen mit einem Polyoxyethylenether oder -ester formuliert werden, entweder in einer nichtpartikulären Lösung oder Suspension, oder in einer partikulären Struktur wie paucilamelaren Liposomen oder ISCOM. Die Saponine können ebenfalls mit Exzipienten wie Carbopol^® formuliert werden, um die Viskosität zu erhöhen, oder können in einer Trockenpulverform mit einem Pulverexzipienten wie Lactose formuliert werden.
Besonders bevorzugte Adjuvantien sind Kombinationen aus 3D-MPL und QS21 ( EP 0 671 948 B1 ), Öl-in-Wasser-Emulsionen, die 3D-MPL und QS21 umfassen ( WO 95/17210 , WO 98/56414 ), oder 3D-MPL formuliert mit anderen Trägern ( EP 0 689 454 B1 ) in Kombination mit den hier beschriebenen CpG-Oligonukleotiden. Die Menge von CpG oder immunstimulierenden Oligonukleotiden in den Adjuvantien oder Impfstoffen der vorliegenden Erfindung ist allgemein klein, aber kann abhängig von der Impfstoffformulierung im Bereich von 1 bis 1000 μg pro Dosis sein, bevorzugt 1 bis 500 μg pro Dosis und besonders bevorzugt zwischen 1 und 100 μg pro Dosis.
Die Saponinmenge zur Verwendung in den Adjuvantien der vorliegenden Erfindung kann im Bereich von 1 bis 1000 μg pro Dosis sein, bevorzugt 1 bis 500 μg pro Dosis, besonders bevorzugt 1 bis 250 μg pro Dosis und am meisten bevorzugt zwischen 1 und 100 μg pro Dosis. Das Verhältnis CpG:Saponin (G/G) wird deshalb im Bereich von 1:1000 bis 1000:1 sein und wird typischerweise im Bereich von 1:100 zu 100:1 und bevorzugt im Bereich von 1:10 bis 1:1 oder 1:1 bis 10:1 und am meisten bevorzugt 1:1, 4:1 oder 10:1 sein.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung können sowohl für prophylaktische als auch für therapeutische Zwecke verwendet werden. Entsprechend wird die Verwendung einer Kombination aus einem Saponin, einem Lipopolysaccharid und einem CpG-Molekül zusammen mit einem Krebs-Antigen, wie in Anspruch 1 definiert, bei der Herstellung eines Impfstoffs zur Prophylaxe und Behandlung von Krebs, insbesondere Brust- und Prostatakarzinoma bereitgestellt. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Impfstoff- oder Adjuvanskombination bereitgestellt, die ein Lipopolysaccharid, ein Saponin und CpG, wie hier zur Verwendung als Medikament beschrieben, umfaßt. Die Impfstoffherstellung wird allgemein beschrieben in New Trends and Developments in Vaccines, herausgegeben von Voller et al., University Park Press, Baltimore, Mayrland, USA 1978.
Die Erfindung stellt daher ein Verfahren bereit, womit ein Individuum daran gehindert wird, sich mit einer Krankheit zu infizieren, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die Prostata-, Brust-, kolorektalem, Lungen-, Bauchspeicheldrüsen-, Nieren-, Eierstock- oder Melanomkrebs umfaßt; wobei das Verfahren das Verabreichen einer Zusammensetzung, wie im wesentlichen hier beschrieben, durch den systemischen Weg an das Individuum umfaßt.
Beispiele für geeignete pharmazeutisch annehmbare Exzipienten zur Verwendung in den Kombinationen der vorliegenden Erfindung schließen Wasser, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung und isotonische Pufferlösung ein.
Beispiel 1:

• ECD-PD wurde in CHO-Zellen gemäß dem Verfahren der WO 00/44899 hergestellt. Die Formulierungen wurden in Mäusen und Hasen getestet.
• Die Formulierungen wurden mit einer Anzahl von Kontrollen verglichen.

SBAS1 + SBAS7:
ECD-PD, formuliert mit CpG-Oligonukleotid 2006, 3D-MPL, QS21 in Liposomen.
SBAS1-Formulierung

umfassend QS21 in Liposomen und 3D-MPL, assoziiert mit den Liposomen, wurden gemäß den Verfahren der EP 0822831 hergestellt.

SBAS1 + SBAS7-Formulierung
Zu der vorherigen Formulierung wurde CpG-Oligonukleotid 2006 hinzugegeben. Das Antigen wurde zu der Adjuvansforumulierung vor der Verwendung hinzugemischt.
SBAS7 + SBAS2-basierende Formulierungen (Mäuse)
Für eine 50 μl-Dosis des Impfstoffs wurde das ECD-PD-Protein (25 μg) in 10-fach konzentriertem PBS, pH 6,8, und H₂O vor der nachfolgenden Zugabe einer Öl-in-Wasser-Emulsion, umfassend SB62, verdünnt: die hergestellt ist durch und 5% Squalen, 5% Tocopherol, 2,0% Tween 80 umfaßt; die Teilchengröße war 180 nm.
Herstellung der Emulsion SB62 (2-fach-Konzentrat)
Tween 80 wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst, um eine 2%ige Lösung in PBS zu ergeben. Um 100 ml bereitzustellen, werden die Emulsion (2-fach Konzentrat), 5 g DL-alpha-Tocopherol und 5 ml Squalen gevortext, um gründlich vermischt zu werden. 90 ml der PBS/Tween-Lösung wird hinzugegeben und gründlich vermischt. Die resultierende Emulsion wird dann durch eine Spritze geleitet und schließlich unter Verwendung einer M110S-Mikrofluidisierungsmaschine mikrofluidisiert. Die resultierenden Öltröpfchen haben eine Größe von ca. 180 nm. 3D-MPL (10 μg), QS21 (10 μg) und 50 μg CpG-ODN 2006 wurden dann hinzugegeben, gefolgt 30 Minuten später von der Zugabe von 50 μg/ml Thiomersal als Konservierungsmittel. Alle Inkubationen wurden bei Raumtemperatur unter maschinellem Rühren durchgeführt.
SBAS2-Formulierungen wurden wie oben hergestellt, jedoch ohne die Zugabe des CpG-Oligonukleotids.
SBAS7 ist CpG Oligonukleotid 2006.
SBAS7 + SBAS2-basierende Formulierungen (Hase)
Für eine 500 μl-Dosis des Impfstoffs wurde das ECD-PD-Protein (100 μg) in 10-fach konzentrierter PBS, pH 6,8, und H₂O vor der nachfolgenden Zugabe von 250 μl SB62, 3D-MPL (100 μg), QS21 (100 μg) und 500 μg CpG-ODN 2006 verdünnt, gefolgt 30 Minuten später durch die Zugabe von 50 μg/ml Thiomersal als Konservierungsmittel. Alle Inkubationen wurden bei Raumtemperatur unter maschinellem Umrühren durchgeführt.
Beispiel 2: Tumorexpositionsexperiment
Gruppen von F1(C57 × Balb c)-Mäusen (8 Mäuse/Gruppe) wurden mit 1/10 der humanen Dosis des Antigene (25 μg) an den Tagen 0-14-28-42 injiziert und an Tag 56 mit TC1-Zellen, die Her2 exprimieren, bei einer Dichte von 2 × 10⁶ TC1-Her2-Zellen/Tier exponiert, subkutan verabreicht.
TC1-Zellen für die Hälfte der Milzen der Tiere wurden an Tag 56 gesammelt und die Tiere ausgeblutet.
Wie in 1 gezeigt, verstärkt die Zugabe eines CpG-Oligonukleotids zu einer 3D-MPL/QS21-Formulierung synergetisch die Tumorregression, und nur diese Formulierungen bewirkten eine vollständige Tumorregression in Mäusen.
Beispiel 3: Immunogenität von ECD-PD in unterschiedlichen Adjuvantien in Hasen
6 Gruppen, bestehend aus 4 Hasen, wurden an den Tagen 0, 21 und 42 mit 100 μg ECD-PD in AS02, AS01, AS05, AS06 (CpG 2006 auf Alaun absorbiert), AS07 und AS02B + AS07 immunisiert.
Die Serologie wurde 14 Tage nach III analysiert, Tabelle 1 zeigt, daß die Formulierungen der vorliegenden Erfindung besser waren als andere Formulierungen, die auf das Steigern hoher Antikörperantworttiter getestet wurden. Tabelle 1

vor 14 nach III

AS02B 50 96923

AS01B 173 196637

AS5 144 76221

AS6 142 74180

AS07A 480 3904

AS02B + AS07A 94 362713
Beispiel 4: Immunogenität von Her-2/neu, ECD-PD in erwachsenen Rhesusaffen
Erwachsene Rhesusaffen wurden mit ECD-PD in verschiedenen Adjuvansformulierungen immunisiert:

AS02B: – AS21, 3D-MPL, Öl-in-Wasser-Emulsion
AS01: – QS21, 3D-MPL in Liposom
AS05: – QS21 in Liposom
AS06: – CpG 2006 Alaun
AS07: – CpG 2006
AS02B + AS07: – siehe Beispiel 1 für Einzelheiten

Die Impfung lösten eine höhere Antikörperantwort mit den Formulierungen der vorliegenden Erfindung (AS02 + AS07) aus. Siehe 1.
Weitere Analyse zeigte, daß die Antikörperantwort polyklonal war, und zeigt eine inhibitorische Aktivität auf das In-vitro-Wachstum einer humanen Brustkrebszelllinie (SKBR3), die das Her-2/neu-Molekül überexprimiert. Herceptin, ein monoklonaler Antikörper für die Behandlung von Her-2/neuexprimierenden Tumoren, ist in der Lage, das Wachstum dieser Zelllinie zu inhibieren.
Die Antikörper, die nach der aktiven Impfung mit der Formulierung erzeugt wurden, wurden daher als funktionell angesehen.
Beispiel 5: Immunisierung von Mäusen mit ECD-PD-Antigen

Dieses Experiment wurde entwickelt, um eine Reihe von Adjuvansformulierungen mit dem Antigen zu untersuchen, das eine Fusion der extrazellulären Domäne von Her-2/neu, verbunden mit der Phosphorylierungsdomäne (ECD-PD) ist, die in CHO-Zellen gemäß den Verfahren der WO 00/44899 hergestellt wurde.

Gruppe	Antigen (25 μg)	Adjuvans
1	ECD-PD	keine (phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS))
2	ECD-PD	Liposome mit QS21 und 3D-MPL in der Membran
3	ECD-PD	Tocol-haltige 3D-MPL Öl-in-Wasser-Emulsion mit QS21 und
4	ECD-PD	CpG
5	ECD-PD	Liposome mit QS21 und 3D-MPL in der Membran + CpG
6	ECD-PD	Tocol-haltige 3D-MPL + CpG Öl-in-Wasser-Emulsion mit QS21 und
7	ECD-PD	3D-MPL + CpG
8	ECD-PD	QS21 + CpG
9	ECD-PD	Tocol-haltige Öl-in-Wasser-Emulsion + CpG
10	ECD-PD	Liposome mit QS21 in der Membran + CpG
11	ECD-PD	Liposome mit 3D-MPL in der Membran + CpG

Die Tocol-haltigen Öl-in-Wasser-Emulsionen, die in den oben aufgeführten Gruppen verwendet wurden, verwendeten D,L-Tocopherol (CAS Nr. 10191-41-0; chemischer Name: (2RS,4'RS,8'RS)-2,5,7,8-Tetramethyl-2-(4',8',12'-trimethyl-tridecyl)-6-chromanol)); das kommerziell von ROCHE^TM erhältlich ist. Falls vorliegend, lag das Tocol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion vor, umfassend 2,5 Vol.%, in Kombination mit 2,5 Vol.% Squalen. Beide Öle wurden vermischt und Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween 80^TM) wurde vor der Mikrofluidisierung (M110S-Mikrofluidisierungsmaschine, maximal 50 Passagen, für einen Zeitraum von 2 Minuten bei maximalen Einlaßdruck von 6 bar (Auslaßdruck von ca. 850 bar), wie in WO 95/17210 beschrieben), zugegeben. Entsprechend basierten die Gruppen 3, 6 und 9 auf der oben aufgeführten Tocol-Emulsion mit dem Zusatz von wäßrigem QS21, 3D-MPL oder CpG.
QS21 und 3D-MPL, falls in jedweder der oben genannten Impfstoffgruppen vorliegend, wurden bei 5 μg/Dosis inkubiert; CpG (OLIGO 4 (SEQ ID NO: 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT) wurde bei 50 μg Dosis hinzugegeben.
Die Adjuvantien wie für Gruppe 2, 5, 10 verwendet, wurden gemäß den in EP 0 822 831 B1 beschriebenen Techniken hergestellt (die Inhalte dieser werden hier durch Referenz eingeführt). Gruppe 11 umfaßte 3D-MPL in der Membran eines Liposoms. Kurz gesagt, das 3D-MPL, Dioleoylphosphatidylcholin und Cholesterin wurden zusammen vermischt und in unilamellare Liposome mikrofluidisiert (wie in EP 0 822 831 B1 beschrieben – mit dem Weglassen von QS21).
Die Adjuvantien, die in Gruppen 4, 7 und 8 verwendet wurden, waren in wäßriger Suspension oder Lösung.
Impfungsverfahren
Gruppen von B6F1-Mäusen wurden bei vier Gelegenheiten geimpft (in 50 μl Volumina), intramuskulär, 14 Tage auseinander. 14 Tage nach der 4. Impfdosis wurden die Mäuse subkutan mit 2 × 10⁶ TC1-Tumorzellen, die das Her-2/neu exprimieren, exponiert.
Die Her-2/neu-TC1-Tumor-Zelllinien wurden durch Transduktion der TC1-zellen durch retrovirale Vektoren, die für Her-2/neu codieren, hergestellt. Nach einem Selektionszeitraum mit Blastocydin, wurden resistente Klone isoliert und durch FACS auf Her-2/neu-Expression durchmustert. Der Klon mit der höchsten Her-2/neu-Expression wurde ausgewählt, und eine Expositionsdosis von 2 × 10⁶ wurde als eine identifiziert, die eine ähnliche Wachstumskinetik wie die der Wildtyp-TC1-Zellen hat, und die zu einem sich entwickelnden Tumor in 100% der Kontrolltiere führte.
Die Größe der individuellen Tumore wurde zweimal wöchentlich gemessen und als ein Gruppendurchschnitt ausgedrückt.
Resultate
3 zeigt die Tumorwachstumsresultate für Gruppen 1, 2, 4, 5 und 6. 4 zeigt die Tumorwachstumsresultate für Gruppen 1, 5, 6, 7 und 11. 5 zeigt die Tumorwachstumsresultate für Gruppe, 1, 5, 6, 8, 9 und 10. Die einzigen Impfstoffe, die eine vollständige Regression des Tumors induzierten, waren Impfstoffe, die sowohl ein immunstimulierendes Oligonukleotid als auch ein Saponin enthielten.
6 und 7 zeigen die In-vitro-Lymphoproliferation von Splenozyten nach der Inkubierung mit 5 μg/ml des Immunogens (ECD-PD) oder extrazelluläre Domäne (ECD) oder intrazelluläre Domäne (ICD) oder Her-2/neu.
8 und 9 zeigen die humorale Immunantwort auf das Immunogen (ECD-PD) in Hinsicht auf Gesamt-Ig, wie durch ELISA (8) oder IgG-Isotyp-Verteilung innerhalb dieser Antworten (9) gemessen.
Schlußfolgerung:
Nach 3 Injektionen ist die Antikörperinduktion wie folgt: AS02B + AS07A > AS01B > AS02B = AS06 = AS05 > AS07A
Allgemeine Schlußfolgerung
Die getesteten Adjuvantien (AS1, AS2, AS7) haben ähnliche Effekte. Jedoch sind die Kombinationen aus AS1 und AS7 oder AS2 und AS7 effektive Adjuvantien. CMI wird eindeutig nach 4 Impfungen in Tieren nachgewiesen, die das kombinierte Adjuvans mit dem gesamten ECD-PD-Molekül, jedoch ebenfalls mit jedem getrennten Teil (ECD und ICD) erhielten. Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung sind sehr effektiv im Induzieren der Tumorregression.
Beispiel 6: Immunisierung von Mäusen mit P703P-Antigen

Dieses Experiment wurde entwickelt, um eine Reihe von Adjuvansformulierungen mit dem Antigen zu untersuchen, das eine Fusion des Antigens Prostase (Ferguson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114–3119)) und des N-terminalen 1–81-Fragments von NS1 aus dem Influenzavirus (P703P-NS1) ist.

Gruppe	^Antigen (25 μg)	Adjuvans
1	P703P-NS1	keine (phosphatgepufferte Saline (PBS))
2	P703P-NS1	CpG
3	P703P-NS1	Liposome mit QS21 in der Membran + CpG
4	P703P-NS1	Liposome mit QS21 und 3D-MPL in der Membran + CpG
5	P703P-NS1	Tocol-haltige Öl-in-Wasser-Emulsion mit QS21 und 3D-MPL + CpG
6	P703P-NS1	Tocol-haltige Ö1-in-Wasser-Emulsion + CpG

Die Tocol-haltigen Öl-in-Wasser-Emulsionen, die in den oben aufgeführten Gruppen verwendet wurden, verwendeten D,L,α-Tocopherol (CAS Nr. 10191-41-0; chemischer Name: (2RS,4'RS,8'RS)-2,5,7,8-Tetramethyl-2-(4',8',12'-trimethyl-tridecyl)-6-chromanol)); das kommerziell von ROCHE^TM erhältlich ist. Falls vorliegend, lag das Tocol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion vor, umfassend 2,5 Vol.%, in Kombination mit 2,5 Vol.% Squalen. Beide Öle wurden vermischt und Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween80^TM) wurde vor der Mikrofluidisierung (M110S-Mikrofluidisierungsmaschine, maximal 50 Passagen, für einen Zeitraum von 2 Minuten bei maximalen Einlaßdruck von 6 bar (Auslaßdruck ca. 850 bar) wie in WO 95/17210 beschrieben), hinzugegeben. Entsprechend basierten die Gruppen 5 und 6 auf der oben aufgeführten Tocol-Emulsion mit dem Zusatz an wäßrigem QS21, 3D-MPL und/oder CpG.
QS21 und 3D-MPL, falls in jeder der oben aufgeführten Impfstoffgruppen vorliegend, wurden bei 5 μg/Dosis eingeschlossen; CpG (OLIGO 4 (SEQ ID NO: 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT) wurde bei 50 μg Dosis hinzugegeben.
Die Adjuvantien, wie für Gruppe 3 und 4 verwendet, wurden gemäß den in EP 0 822 831 B1 beschriebenen Techniken hergestellt (dessen Inhalte hier durch Referenz eingeführt sind).
Impfungsverfahren
Gruppen von B6F1-Mäusen wurden bei vier Gelegenheiten (in 50 μl-Volumina) geimpft, intramuskulär, 14 Tage auseinander.
Resultate
10 und 11 zeigen die In-vitro-Lymphoproliferation von Splenozyten nach der zweiten und 14 Tage nach der vierten Impfung, nach einer In-vitro-Inkubation mit 3 μg/ml Immunogen (NS1-P703P) oder Pichia-exprimiertes P703P (15 μg/ml) oder einem nicht-spezifischen NS1-OspA-Fusionsprotein.
12 und 13 zeigen die humorale Immunantwort auf das Immunogen (NS1-P703P) in Hinsicht auf Gesamt-Ig wie durch Mid-Punkt-Titer-ELISA (10) oder IgG-Isotyp-Verteilung innerhalb dieser Antworten (11) gemessen. Sequenzprotokoll

Claims

Immunogene Zusammensetzung, die ein Krebsantigen, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: i) ein Antigen aus der MAGE-Proteinfamilie, das an einen heterologen Fusionspartner gebunden ist; ii) P501S; iii) Cripto; iv) Her-2/neu-Antigenderivat ohne einen substantiellen Teil der Her-2/neu-Transmembrandomäne, eine Hilfsstoffzusammensetzung, die ein Saponin zusammen mit einem immunstimulierenden Oligonukleotid umfasst, und ein Lipopolysaccharid, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: a) Monophosphoryl-Lipid A b) 3-O-desacyliertes Monophosphoryl-Lipid A c) Disphosphoryl-Lipid A, und umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das Saponin QS21 ist.
Immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das immunstimulierende Oligonukleotid mindestens zwei CpG-Motive enthält.
Immunogene Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das immunstimulierende Oligonukleotid aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: SEQ. ID. NR. 1 – TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) SEQ. ID. NR. 2 – TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) SEQ. ID. NR. 3 – ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC AAC ACG SEQ. ID. NR. 4 – TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) SEQ. ID. NR. 5 – TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668).
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Saponin formuliert ist, um ISCOMS oder Liposome zu bilden.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Saponin in einer Öl- oder Wasseremulsion vorliegt.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, die im Wesentlichen alles der extrazellulären Domäne von Her-2/neu umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, worin das Her-2/neu-Molekül ohne eine funktionelle Transmembrandomäne ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7 oder 8, die zusätzlich die Phosphorylierungsdomäne von Her-2/neu umfasst.
Verwendung einer Kombination aus einem Saponin, einem immunstimulierenden Oligonukleotid, einem Lipopolysaccharid, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: a) Monophosphoryl-Lipid A b) 3-O-desacyliertes Monophosphoryl-Lipid A c) Disphosphoryl-Lipid A, und einem Krebsantigen, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: i) ein Antigen aus der MAGE-Proteinfamilie, das an einen heterologen Fusionspartner gebunden ist; ii) P501S; iii) Cripto; iv) Her-2/neu-Antigenderivat ohne einen substantiellen Teil der Her-2/neu-Transmembrandomäne, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von Tumoren.