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DE60130866T2 - Wurzel-spezifische expression von ziel-genen in pflanzen - Google Patents

Wurzel-spezifische expression von ziel-genen in pflanzen Download PDF

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DE60130866T2
DE60130866T2 DE60130866T DE60130866T DE60130866T2 DE 60130866 T2 DE60130866 T2 DE 60130866T2 DE 60130866 T DE60130866 T DE 60130866T DE 60130866 T DE60130866 T DE 60130866T DE 60130866 T2 DE60130866 T2 DE 60130866T2
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plant
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University of Alberta
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Description

  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Die Schlüsselfaktoren in dem Prozess durch den Pflanzen wachsen und gedeihen, sind die Verfügbarkeit von Nährstoffen für die Pflanze und die Fähigkeit der Pflanze, diese Nährstoffe aufzunehmen und effektiv zu nutzen. Pflanzen im Allgemeinen weisen zwei Routen für die Aufnahme von den Nährstoffen auf: Die Wurzeln und die Blätter. Bei den meisten Pflanzen dienen ausgeklügelte Wurzelsysteme dazu, sich mit den Nährstoffen zu verbinden und sie oder Wasser aus dem umgebenden Erdboden, in dem die Pflanzen wachsen, zu absorbieren. Um die Fläche, die für das Kontaktieren und Absorbieren der Nährstoffe verfügbar ist, zu vergrößern, haben viele Pflanzen eine Wurzelstruktur entwickelt, welche eine große Anzahl von Wurzelhaaren enthält: besonders differenzierte, haarartige Wurzelepithelzellen, welche seitwärts von der Hauptstruktur der Wurzel in die umliegende Umgebung herausstehen. Nährstoffe, die ohne Weiteres in vielen auf Erde und Wasser basierenden Umgebungen vorgefunden und durch die Wurzel absorbiert werden, schließen zum Beispiel Wasser, Stickstoff, Phosphor, Magnesium, Kalium und Schwefel ein.
  • Ein Nährstoff, welcher jedoch nur unvollkommen über die Wurzeln erhalten wird, ist Kohlenstoffdioxid. Pflanzen binden Kohlenstoffdioxid durch Photosynthese als Glucose; deshalb ist die Aufnahme von Kohlenstoffdioxid kritisch und von großer Bedeutung für das kontinuierliche Wachstum und das Überleben der Pflanze. Der Hauptteil der Aufnahme von Kohlenstoffdioxid geschieht in den meisten Pflanzen über die Blätter aus der umgebenden Luft. Einige wenige Pflanzen (z. B. Orchideen) verzichten auf die auf den Wurzeln basierende Aufnahme von Nährstoffen zugunsten von einem ausschließlich auf den Blättern basierenden Aufnahmesystem (in welchem, zum Beispiel, Nährstoffe, die in Wasser gelöst sind, durch die Blätter aufgenommen werden), aber der Großteil der Pflanzen verwendet sowohl auf Wurzeln als ebenfalls auf Blättern basierende Aufnahmesysteme für Nährstoffe.
  • Viele Nährstoffe, die von den Pflanzen aufgenommen werden, benötigen eine Aufbereitung, bevor sie in den metabolischen Signalwegen der Pflanzen benutzbar werden. Stickstoff ist ein solcher Nährstoff und ist ebenfalls, zusammen mit Phosphor und Kalium, einer von den drei Nährstoffen, die im Wesentlichen das Pflanzenwachstum einschränken. Stickstoffquellen sind oftmals die Hauptbestandteile von Düngemitteln (Hageman und Lambert, 1988, in: Corn and Corn Improvement, 3. Ausgabe, Sprague & Dudley, American Society of Agronomy, pp. 431–461). Weil Stickstoff gewöhnlich das geschwindigkeitsbegrenzende Element im Pflanzenwachstum ist, weisen die meisten Ackerfrüchte eine grundsätzliche Abhängigkeit von anorganischen, stickstoffhaltigen Düngemitteln auf. Die Stickstoffquelle in Düngemitteln ist gewöhnlich Ammoniumnitrat, Kaliumnitrat oder Harnstoff. Ein wesentlicher Prozentsatz von den Kosten, die mit der Produktion von Ackerfrüchten verbunden sind, resultiert aus den notwendigen Anwendungen von Düngemitteln. Es ist jedoch bekannt, dass das meiste des angewendeten Stickstoffs schnell durch Kleinstlebewesen des Erdbodens, Auswaschen und andere Faktoren vermindert wird, als dass es durch Pflanzen aufgenommen wird.
  • Stickstoff wird durch Pflanzen hauptsächlich entweder als Nitrat (NO3 –) oder Ammonium (NH4 +) aufgenommen. Einige Pflanzen sind in der Lage den atmosphärischen Stickstoffpool durch eine symbiotische Assoziation mit stickstofffixierenden Bakterien oder Ascomyceten zu verwenden. In gut durchlüfteten, nichtsauren Erdböden nehmen Pflanzen NO3 – auf, das zu NH4 + umgewandelt wird. In sauren Erdböden, ist NH4 + die vorherrschende Form des vorliegenden anorganischen Stickstoffs und kann direkt durch die Pflanzen aufgenommen werden. NH4 + wird dann zu Glutamin und Glutamat durch die Enzyme Glutaminsynthetase (GS) und Glutamatsynthase (GOGAT) umgewandelt. Das Glutamin und das Glutamat können, wie in 1 gezeigt, in verschiedene Aminosäuren umgewandelt werden.
  • Obwohl etwas Nitrat und Ammoniak in den Transportgefäßen (Xylem und Phloem) nachgewiesen werden kann, wird die Mehrheit des Stickstoffs zuerst in organischer Form (z. B. Aminosäuren) aufgenommen, die dann darin innerhalb der Pflanze transportiert werden. Glutamin, Asparagin und Aspartat stellen sich als wichtig heraus für das Bestimmen der Fähigkeit einer Pflanze, Stickstoff aufzunehmen, weil sie die hauptsächlichen Transportverbindungen des Stickstoffs für lange Entfernungen in Pflanzen darstellen und in dem Phloemsaft reichlich vorhanden sind. Abgesehen von ihrer allgemein bekannten Rolle als Stickstoffüberträger, besitzen diese Aminosäuren leicht unterschiedliche Rollen in dem Stickstoffstoffwechsel von Pflanzen. Glutamin ist eher metabolisch aktiv und kann seinen Aminstickstoff direkt an eine große Anzahl von Substraten abgeben. Aufgrund dieser Reaktivität wird Glutamin im Allgemeinen durch Pflanzen nicht dazu benutzt, um Stickstoff zu speichern. Im Gegensatz dazu ist Asparagin aufgrund seines höheren N:C-Verhältnisses, verglichen mit Glutamin, eine wirksamere Verbindung für Transport und Lagerung von Stickstoff. Weiterhin ist Asparagin ebenfalls stabiler als Glutamin und kann in Vakuolen mit höheren Spiegeln akkumulieren. In der Tat scheint Asparagin in Pflanzen, die hohe assimilatorische Stickstoffkapazitäten aufweisen, eine dominante Rolle in dem Transport und Stoffwechsel von Stickstoff zu spielen (Lam et al., 1995, Plant Cell 7: 887–898). Aufgrund seiner relativen Stabilität, nimmt Asparagin nicht direkt an dem Stickstoffstoffwechsel teil, sondern muss zuerst durch das Enzym Asparaginase (ANS) hydrolysiert werden, um Aspartat und Ammoniak zu ergeben, welche dann in der Synthese von Aminosäuren und Proteinen verwendet werden können.
  • Jedoch kann zusätzlich zu Aspartat und Asparagin eine Anzahl von anderen Aminosäuren als Speicherverbindungen für Stickstoff fungieren. Für die Gesamtmenge an freien Aminosäuren ist gezeigt worden, dass sie sich mit spezifischen Stressbedingungen, sowohl biotischen als ebenfalls abiotischen, unterschiedlichen Düngungsregimen und anderen Faktoren ändert (Bohnert et al., 1995, Plant Cell 7: 1099–1111). Zum Beispiel halten viele Pflanzen während des Trockenheitsstresses ihren Turgor durch osmotische Anpassung aufrecht (Turner, 1979, Stress Physiology in Crop Plants, pp. 181–194). Die osmotische Anpassung, d. h. eine Nettozunahme von gelösten Substanzen, die zu einer Erniedrigung des osmotischen Potentials führt, ist eine der Hauptmechanismen wodurch Kulturpflanzen sich an eine eingeschränkte Wasserverfügbarkeit anpassen können (Turner, ibid; Morgan, 1984, Annu. Rev. Plant Physiol. 35: 299–319). Die gelösten Substanzen, die während der osmotischen Anpassung akkumulieren können, beinhalten Zucker, organische Säuren und Aminosäuren, wie Alanin, Aspartat und Prolin und Glycinbetain (Good und Zaplachinski, 1994, Physiol. Plant 90: 9–14; Hanson und Hitz, 1982, Annu. Rev. Plant Physiol. 33: 163–203; Jones und Turner, 1978, Plant Physiol. 61: 122–126). Mais, Baumwolle, Sojabohne und Weizen haben alle eine osmotische Anpassung während der Trockenheit demonstriert (Morgan, ibid.). Eine der am besten charakterisierten osmoregulatorischen Reaktionen ist die Akkumulation von Prolin (Hanson und Hitz, ibidem). In einigen Geweben steigen die Prolinspiegel bis zu 100-fach als Antwort auf den osmotischen Stress (Voetberg und Sharp, 1991, Plant Physiol. 96: 1125–1130). Die Akkumulation von Prolin resultiert aus einem verstärkten Fluss von Glutamat zu Pyrrolin-5-carboxylat und Prolin in dem Prolin-Biosyntheseweg sowie verringerten Geschwindigkeiten des Prolinkatabolismus (Rhodes et al., 1986, Plant Physiol. 82: 890–903; Stewart et al., 1977, Plant Physiol. 59: 930–932). Für die Konzentrationen von Alanin und Aspartat ist gezeigt worden, dass sie 3,6-, beziehungsweise 4,6-fach während des Trockenstresses in den Blättern von Brassica napus ansteigen, während hingegen die Glutamatspiegel 5,5-fach ansteigen (Good und Maclagan, 1993, Can. J. Plant Sci. 73: 525–529). Die Alaninspiegel nahmen nach dem erneuten Bewässern von den Pflanzen ab, während hingegen die Aspartatspiegel hoch blieben. Die Pyruvatspiegel zeigten ein ähnliches Muster, wobei sie 2,2-fach nach 4 Tagen Trockenheit anstiegen, gefolgt durch die Rückkehr zu den Kontrollwerten nach erneuter Bewässerung. Jedoch blieben die 2-Oxoglutaratspiegel während des Trockenstresses und der erneuten Bewässerung relativ konstant. Einer der Faktoren, welcher den Wert von einer spezifischen Aminosäure als eine osmotische Schutzsubstanz bestimmen mag, kann ihre Verwendung als Kohlenstoff- oder Stickstoff-Speicherverbindung sein.
  • Alanin ist eine der verbreiterteren Aminosäuren in Pflanzen. In Brassica Blättern sind unter normalen Bedingungen die Alanin- und Aspartat-Konzentrationen annähernd gleich und es ist gefunden worden, dass sie das doppelte von den Konzentrationen an Asparagin betragen. Im Vergleich dazu betragen die Glutamatspiegel das doppelte von denen von Alanin oder Aspartat (Good und Zaplachinski, ibidem). Alanin wird durch das Enzym Alanin-Aminotransferase (AlaAT) aus Pyruvat und Glutamat in einer reversiblen Reaktion synthetisiert (Goodwin und Mercer, 1983, Introduction to Plant Biochemistry 2. Ausgabe, Pergamon Press, New York, N. Y., pp. 341–343), wie in 2 gezeigt. Für Alanin ist bekannt, dass es, zusätzlich zur Trockenheit, unter anderen spezifischen Umweltbedingungen wie anaerober Stress ansteigt (Muench und Good, 1994, Plant Mol. Biol. 24: 417–427; Vanlerberge et al, 1993, Plant Physiol. 95: 655–658). Für Alaninspiegel ist bekannt, dass sie wesentlich im Wurzelgewebe unter anaerobem Stress ansteigen. Als ein Beispiel steigen in Gerstenwurzeln die Alaninspiegel 20-fach nach 24 Stunden von anaerobem Stress an. Für das Alanin-Aminotransferase-Gen ist ebenfalls gezeigt worden, dass es durch Licht in Rispenhirse induziert wird und wenn Pflanzen sich von Stickstoffstress erholen (Son et al., 1992, Arch. Biochem. Biophys. 289: 262–266). Vanderberge et al. (1993) haben gezeigt, dass in stickstoff-mangelernährten anaeroben Algen der Zusatz von Stickstoff in der Form von Ammoniak darin resultierte, dass 93% von einer N15-Markierung direkt in Alanin eingebaut wurden. Demzufolge scheint Alanin eine wichtige Aminosäure in der Stressreaktion von Pflanzen zu sein.
  • Die Gene für die Nitrattransporter Nitratreduktase (NR) und Nitritreduktase (NiR) (Crawford, 1995, Plant Cell 7: 859–868; Cheng et al., 1988, EMBO J. 7: 3309–3314) sind kloniert und untersucht worden, so wie viele von den Genen, die Enzyme kodieren, die in der Stickstoff-Assimilation und dem Stickstoffstoffwechsel von Pflanzen eingebunden sind. Glutamin synthetase (GS) und Glutamatsynthetase (GOGAT) sind kloniert worden (Lam et al., ibid.; Zehnacker et al, 1992, Planta 187: 266–274; Peterman und Goodman, 1991, Mol. Gen. Genet. 230: 145–154), ebenso wie Asparaginase (ANS) und Aspartat-Aminotransferase (AspAT) (Lam et al., ibid; Udvardi und Kahn, 1991, Mol. Gen. Genet. 231: 97–105). Ein Asparaginsynthetase- (AS) Gen ist von Erbsen kloniert worden (Tsai und Coruzzi, 1990, EMBO J. 9: 323–332). Die Glutamatdehydrogenase ist aus Mais kloniert worden (Sakakibara et al., 1995, Plant Cell Physiol. 36(5): 789–797). Die Alanin-Aminotransferase ist durch Son et al. (1993, Plant Mol. Biol. 20: 705–713) und durch Muench und Good (1994, Plant Mol. Biol. 24: 417–427) kloniert worden. Die Gene für die Glutaminsynthetase und die Asparaginsynthetase sind unter den Pflanzengenen für die Stickstoff-Assimilation und -Verwertung die Gene, die am ausführlichsten untersucht wurden.
  • In Pflanzen hat die Genmanipulation von Stickstoffassimilationsprozessen unterschiedliche Ergebnisse hervorgebracht. Zahlreiche Untersuchungen, welche die konstitutive Überexpression von der Glutaminsynthetase (GS) begutachtet haben, konnten eine positive Wirkung ihrer Überexpression auf das Pflanzenwachstum nicht berichten. Diese Untersuchungen schließen zum Beispiel ein: Eckes et al. (1989, Molec. Gen. Genet. 217: 263–268), die transgene Tabakpflanzen verwendeten, die Alfalfa-GS überexprimierten; Hemon et al. (1990, Plant Mol. Biol. 15: 895–904), die transgene Tabakpflanzen verwendeten, die Bohnen-GS in dem Cytoplasma oder den Mitochondrien überexprimierten; und Hirel et al. (1992, Plant Mol. Biol. 20: 207–218), die transgene Tabakpflanzen verwendeten, die Sojabohnen-GS überexprimierten. Eine Untersuchung durch Temple et al. (1993, Mol. Gen. Genet. 236: 315–325) hat von Zunahmen in dem Gesamtgehalt der löslichen Proteine in transgenen Tabakpflanzen berichtet, die ein Alfalfa-GS-Gen überexprimieren und ähnliche Zunahmen im Gesamtgehalt der löslichen Proteine in transgenen Tabakpflanzen, die eine Antisens-RNA für ein GS-Gen exprimieren. WO 97/30163 berichtet von einer gesteigerten Biomasse in Pflanzen, die mit dem Alanin-Aminotransferase-Gen un ter der Kontrolle von dem Promotor des Brassica Turgorgen-26 transfiziert waren und unter Bedingungen mit niedrigem Stickstoff, verglichen mit Kontrollen, wuchsen.
  • Es ist berichtet worden, dass Pflanzen, die gentechnisch verändert wurden, um ein Alfalfa-GS-Gen konstitutiv zu überexprimieren, schneller wachsen als Kontroll-, Wildtyppflanzen (Eckes et al., 1988, veröffentlichte Australische Patentanmeldung Nr. 17321/88 ). Ein weiterer Bericht (Coruzzi und Brears 1994, WO 95/09911 ) führte GS-, GOGAT- und AS-Konstrukte unter der Kontrolle von einem Promotor des konstitutiven Blumenkohl-Mosaikvirus 35S (CaMV35S) ein. Dieses Dokument zeigte, dass die transgenen Pflanzen ein erhöhtes Frischgewicht und einen Wachstumsvorteil gegenüber Kontrollpflanzen aufwiesen. Dementsprechend scheint es keine klare Richtung für die Wirkung der konstitutiven Überexpression von Enzymen der Stickstoffassimilation auf das Pflanzenwachstum zu geben.
  • Wie Stickstoff repräsentiert Wasser einen weiteren kritisch bedeutenden Pflanzennährstoff. Die Aufrechterhaltung von normalem Wachstum und normaler Funktion in Pflanzen ist von einem relativ hohen intrazellulären Wassergehalt abhängig. Trockenheit, niedrige Temperatur und hoher Salzgehalt sind alles Umweltbelastungen, die den intrazellulären Wasserhaushalt verändern und signifikant das Pflanzenwachstum und den Ernteertrag einschränken (Morgan, ibid.). Viele physiologische Prozesse ändern sich als Reaktion auf Bedingungen, die das zelluläre Wasserpotential vermindern, einschließlich der Photosynthese, der Öffnung der Stomata und das Blatt-, Stamm- und Wurzelwachstum (Hanson und Hitz, ibidem). Zusammen mit physiologischen Reaktionen können auch metabolische Veränderungen während des Wasserverlustes auftreten. Einer der bemerkenswertesten Änderungen ist in der Synthese und Akkumulation von osmotisch aktiven Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, wie oben angemerkt.
  • Änderungen in der Genexpression treten ebenfalls während dem osmotischen Stress auf. Eine Anzahl von Genen, die durch Trockenheit induziert werden, sind kürzlich beschrieben worden (rezensiert durch Skiver und Mundy, 1990, Plant Cell 2: 503– 512).
  • Es ist eine Aufgabe von der Erfindung, die Nachteile des Standes der Technik zu überwinden.
  • Die oben erwähnte Aufgabe wird durch die Kombinationen von Merkmalen von dem Hauptanspruch erfüllt, die Unteransprüche offenbaren weitere vorteilhafte Ausführungsformen von der Erfindung.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zum Lenken einer Wurzel-spezifischen Expression von einem Zielgen, umfassend: Erzeugen einer Pflanze aus einer transformierten Pflanzenzelle derart, dass die Expression von einem Zielgen vorzugsweise in der Wurzel stattfindet, wobei die transformierte Pflanzenzelle ein Zielgen in Wirkverbindung mit einem Promotorelement des Brassica Turgorgens 26, wie es in SEQ-ID NR. 1 definiert ist, oder einem Fragment desselben aufweist, wobei dieses Fragment die Expression des Zielgens vorzugsweise in die Wurzel lenkt.
  • Die Expression von dem Zielgen kann weiterhin umweltbedingt und entwicklungsbedingt reguliert werden. Das Zielgen kann ein Enzym kodieren, das in der Stickstoffassimilation und/oder dem Stickstoffstoffwechsel eingebunden ist. Zum Beispiel kann das Enzym Alanindehydrogenase, Glutaminsynthetase, Asparaginsynthetase, Glutamatsynthase, Asparaginase, Alanin-Aminotransferase, Aspartat-Aminotransferase oder Glutamatdehydrogenase sein.
  • Das Verfahren der Erfindung kann in einer Pflanze wie Raps, Gerste, Mais, Reis, Tabak, Sojabohne, Baumwolle, Luzerne, Tomate, Weizen oder Kartoffel durchgeführt werden.
  • Das Fragment von einem Promotorelement des Brassica Turgorgens 26, wie in SEQ-ID NR. 1 definiert, welches die Expression von dem Zielgen vorzugsweise in die Wurzel lenkt, kann, zum Beispiel, ein Fragment sein, welches in irgendeiner der SEQ-ID Nummern 2, 3, 4, 5 oder 6 definiert ist.
  • Pflanzen werden mit einer großen Vielzahl von nichtoptimalen Umgebungsbedingungen während dem Wachstum und der Entwicklung konfrontiert. Solche Bedingungen können Einschränkung von Wasser, überschüssiger Salzgehalt, alkalischer oder saurer Erdboden, Befall durch Pflanzenschädlinge, Krankheit oder Temperaturstress einschließen, wobei jedes einzeln das Kulturpflanzenwachstum und/oder die Ernteerträge signifikant behindern kann. Die vorliegende Erfindung stellt neuartige Verfahren bereit durch die Pflanzen, und die Samen davon, technisch verändert werden können, um unter Umgebungsbedingungen, die gewöhnlich nicht für die Entwicklung der Pflanze förderlich sind, zu wachsen und zu gedeihen. Die Erfindung stellt Verfahren bereit, durch die ein oder mehr ausgewählte Gene (z. B. Gene, deren Produkte die Fähigkeit von der Pflanze verbessern können, unter einer oder mehr nachteiligen Umweltbedingungen zu wachsen und zu gedeihen) in der Wurzel exprimiert werden können. Es ist weiterhin möglich, dass, gemäß den Verfahren der Erfindung, das ausgewählte Gen oder die Gene in der Wurzel in einer induzierbaren Art und Weise derart exprimiert werden, dass die Expression von dem Genprodukt nur unter den gewünschten ökologischen, zeitlichen oder entwicklungsgemäßen Bedingungen, oder als Reaktion auf ein spezifisches Ereignis (z. B. Verletzung durch einen Pflanzenschädling) stattfinden kann. Durch Verwendung der Verfahren der Erfindung können Pflanzen verbessert werden für das Wachstum und die Entwicklung unter Umweltbedingungen, die normalerweise nicht für das Wachstum von der Pflanze geeignet sind. Darüber hinaus erlauben die Verfahren von der Erfindung die Genmanipulation von einer Pflanze, um eine oder mehr Pflanzeneigenschaften nur in ausgewählten Geweben der Pflanze zu verändern.
  • Die Expression von dem Zielgen kann weiterhin umweltabhängig und entwicklungsabhängig reguliert werden. Die umweltabhängig oder entwicklungsabhängig regulierte Expression kann unter Bedingungen von osmotischen Stress stattfinden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung wird das Zielgen ausgewählt aus der Gruppe enthaltend: Gene, die Proteine kodieren, welche den Nähstoffgehalt verändern, Gene, die Proteine kodieren, die an der Phytoremediation beteiligt sind, Gene, die Proteine kodieren, die Pestizidresistenz verleihen, Gene, die Strukturproteine kodieren, Gene, die pharmazeutische Proteine oder Enzyme kodieren, welche pharmazeutische Verbindungen herstellen, Gene, die Proteine kodieren, die an der Aufnahme oder Verwertung von den Nährstoffen beteiligt sind und Gene, die Proteine kodieren, die im Pflanzenwachstum eingebunden sind. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Expression von dem Zielgen ebenfalls umweltabhängig oder entwicklungsabhängig reguliert.
  • Ebenfalls ist hierin ein Samen offenbart, der ein Gen in Wirkverbindung mit einem genetischen Regulatorelement enthält, welches die wurzelspezifische Expression von dem Zielgen lenkt. Das Zielgen kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: Gene, die Proteine kodieren, welche den Nährstoffgehalt verändern, Gene, die Proteine kodieren, die an der Phytoremediation beteiligt sind, Gene, die Proteine kodieren, die Pestizidresistenz verleihen, Gene, die Strukturproteine kodieren, Gene, die pharmazeutische Proteine oder Enzyme kodieren, welche pharmazeutische Verbindungen herstellen, Gene, die Proteine kodieren, die an der Aufnahme oder Verwertung von den Nährstoffen beteiligt sind und Gene, die Proteine kodieren, die im Pflanzenwachstum eingebunden sind. Die Expression von dem Zielgen kann weiterhin umweltabhängig und entwicklungsabhängig reguliert werden.
  • Ein Verfahren zum Vergrößern der Biomasse von einer Pflanze, die unter einer oder mehr nachteiligen Umweltbedingungen wächst, kann umfassen:
    Das Transformieren einer Pflanze mit einem Zielgen in Wirkverbindung mit einem btg-26 Promotorelement, um eine transformierte Pflanze zu produzieren, wobei das Zielgen ein Enzym kodiert, das in der Stickstoffassimilation oder dem Stickstoffstoffwechsel eingebunden ist; und
    das Anpflanzen der transformierten Pflanze. Das Enzym ist bevorzugt AlaAT.
  • Ein Verfahren zum Vergrößern der Biomasse von einer Pflanze, die unter ein oder mehr nachteiligen Umweltbedingungen wächst, kann umfassen:
    Das Transformieren einer Pflanze mit einem Zielgen in Wirkverbindung mit einem btg-26 Promotorelement, um eine transformierte Pflanze zu produzieren, wobei das Zielgen ein Enzym kodiert, das in der Stickstoffassimilation eingebunden ist; und
    das Anpflanzen der transformierten Pflanze. Das Enzym ist bevorzugt AlaAT.
  • Ein Verfahren zum Vergrößern der Biomasse von einer Pflanze, die unter einer oder mehr nachteiligen Umweltbedingungen wächst, kann umfassen:
    Das Transformieren einer Pflanze mit einem Gen, das AlaAT kodiert, in Wirkverbindung mit einem Promotorelement, um eine transformierte Pflanze zu produzieren, und
    das Anpflanzen der transformierten Pflanze. Der Promotor ist bevorzugt btg-26.
  • Ein Verfahren zum Erhöhen der Samenausbeute von einer Pflanze kann umfassen:
    Das Transformieren der Pflanze mit einem Zielgen in Wirkverbindung mit einem btg-26 Promotorelement, um eine transformierte Pflanze zu produzieren, wobei das Zielgen ein Enzym kodiert, das in der Stickstoffassimilation oder dem Stickstoffstoffwechsel eingebunden ist; und
    das Anpflanzen der transformierten Pflanze. Das Enzym ist bevorzugt AlaAT.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Diese und andere Merkmale von der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung offensichtlicher werden, in welcher Bezug genommen wird auf die angehängten Zeichnungen, wobei:
  • 1 die Hauptsignalwege der Stickstoff-Assimilation und des -Stoffwechsels in Pflanzen zeigt. (Bearbeitet nach Lam et al., 1995, Plant Cell 7: 889, wobei Arabidopsis als Modellsystem verwendet worden ist). Einige von den Enzymen der Signalwege der Stickstoff-Assimilation und des Aminosäure-Stoffwechsels sind dargestellt. Unterschiedliche Isoenzyme sind bekannt für einige von diesen Enzymen, welche verschiedene Rollen unter unterschiedlichen Umgebungs- und Gewebebedingungen spielen können. Die Stickstoffassimilation geschieht primär durch die Aktivitäten von Glutaminsynthetase (GS) und Glutamatsynthase (GOGAT). Während es nicht als solches angezeigt ist, katalysiert die Aspartat-Aminotransferase auch die rückwärtige Reaktion. Die Funktionen der Glutamatdehydrogenase (GDH) werden postuliert, wie es durch die gestrichelten Linien angedeutet wird.
  • 2 zeigt den Signalweg für die Alanin-Biosynthese durch das Enzym Alanin-Aminotransferase (AlaAT) (aus Goodwin und Mercer, 1983)
  • 3 zeigt die DNA-Sequenz des Brassica napus btg-26 Promotors.
  • 4 zeigt die quantitative Northern Blot-Analyse von der Expression von btg-26. 4A zeigt die Northern Blot-Analyse der btg-26 Expression während Trockenstress. Die Gesamt-RNA (10 mg) von Blattgewebe, das von Kontrollpflanzen, die einen relativen Wassergehalt von 97% (97% RWC) aufwiesen und von Pflanzen, die auf die angegebenen % RWC dehydriert wurden, genommen wurde, wurde auf einem 1,2% Agarose-Formaldehyd-Gel fraktioniert und mit genomischer DNA von btg-26 als Sonde untersucht. 4B zeigt die quantitative Analyse von der btg-26 Induktion. Jeder Zeitpunkt repräsentiert den Mittelwert der Induktion, der aus drei unabhängigen Slot-Blots und zwei Northern Blots bestimmt wurde. Alle Blots wurden zur Korrektur von Beladungsfehlern nochmals mit einer Cyclophilin-cDNA-Kontrolle als Sonde untersucht. Die Induktion ist relativ zu dem Level der Expression in vollständig hydratisierten Pflanzen (97%) bestimmt. 4C zeigt die Northern Blot-Analyse von der btg-26 Expression während der Kälteakklimatisierung und dem Hitzeschock. Die Gesamt-RNA (10 mg) wurde von Blattgewebe aus Kontrollpflanzen (C) oder Pflan zen, die 4°C für einen Tag oder vier Tage ausgesetzt waren oder 40°C für zwei oder vier Stunden ausgesetzt waren, genommen. Die RNA wurde auf einem 1,2% Agarose-Formaldehyd-Gel fraktioniert und mit genomischer DNA von btg-26 als Sonde untersucht. 4D zeigt die Northern Blot-Analyse der btg-26 Expression während des Salzstresses. Die Gesamt-RNA (10 mg) wurde von Blattgewebe aus Kontrollpflanzen (C) oder aus Pflanzen, die einem Salzstress durch Bewässern mit 50 mM NaCl (S50), 150 mM NaCl (S150) oder 450 mM NaCl (S450) für einen Tag oder vier Tage ausgesetzt waren, genommen. Die RNA wurde auf einem 1,2% Agarose-Formaldehyd-Gel fraktioniert und mit genomischer DNA von btg-26 als Sonde untersucht. 4E zeigt die Northern Blot-Analyse der btg-26 Expression während des Aussetzens zu Abscisinsäure (ABA). Die Gesamt-RNA (10 mg) wurde von Blattgewebe aus Pflanzen genommen, die für einen Tag in einer Lösung eingeweicht waren, die entweder 0 μM (–) oder 100 μM ABA (+) enthielt. Die RNA wurde auf einem 1,2 Agarose-Formaldehyd-Gel fraktioniert und mit genomischer DNA von btg-26 als Sonde untersucht.
  • 5 zeigt die Nukleotid- und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz von der AlaAT-cDNA aus Gerste.
  • 6 zeigt das Plasmidkonstrukt p25.
  • 7 zeigt die Konstrukte, welche den AlaAT-kodierenden Bereich und die CaMV-, btg-26- und trg-31-Promotoren enthalten, die für die Transformation der Brassica napus-Pflanzen verwendet wurden. 7A zeigt pCa2/AlaAT/NOS; 7B zeigt pbtg-26/AlaAT/NOS; und 7C zeigt ptrg-31/AlaAT/NOS.
  • 8 zeigt das Plasmidkonstrukt pCGN1547, das in der Herstellung der AlaAT-überexprimierenden oder der durch Trockenheit induzierbaren AlaAT-Transformanten verwendet wurde.
  • 9 zeigt Brassica napus Pflanzen, die unter Stickstoffmangelernährungs-Bedingungen für drei Wochen, ge folgt von einer Trockenheit für 3 Tage, wachsen lassen wurden. Die Pflanzen werden als A, B und C wie folgt identifiziert: Pflanze A ist eine Wildtyp-Kontrollpflanze, Pflanze B enthält ein CaMV/AlaAT-Konstrukt und Pflanze C enthält ein btg-26/AlaAT-Konstrukt.
  • 10 zeigt die in vivo Anfärbung von GUS in btg-26/GUS transgenen Pflanzen. Feld A zeigt die Wildtyp-Pflanzen auf der linken und die transgenen Pflanzen auf der rechten Seite. Feld B zeigt die Wurzelspitzen von angefärbten transgenen Pflanzen. Feld C zeigt einen Querschnitt der Absorptionszone von den Wurzelspitzen der transgenen Pflanzen. Feld D zeigt einen Querschnitt der Teilungszone von den Wurzelspitzen der transgenen Pflanzen.
  • 11 zeigt die GUS-Aktivität in den Schösslingen gegenüber der GUS-Aktivität in den Wurzeln von btg-26/GUS transgenen Pflanzen. Diese Figur zeigt ein Säulendiagramm von dem Betrag der GUS-Aktivität, die in den Extrakten von den Wurzeln und den Schösslingen von Pflanzen vorhanden ist, die das btg-26/GUS-Transgen exprimieren und das Wurzel/Spross-Verhältnis der GUS-Aktivität in diesen Pflanzen.
  • 12 zeigt die Southern Blot-Analyse von den RT-PCR-Reaktionen, welche AlaAT aus der Gesamt-RNA von Blatt (B) und Wurzel (W) vervielfältigte. Die relative densitometrische Analyse von dem 381-bp Produkt der RT-PCR Reaktion ist unterhalb jeder Spur angegeben.
  • 13 zeigt die AlaAT-Aktivität in transgenen (btg-26/AlaAT) und Kontroll- (Wildtyp) Blättern unter Bedingungen von niedrigem und hohem Stickstoff.
  • 14 zeigt die AlaAT-Aktivität in Schösslingen von Wildtyp-, cv. Westar- und transgenen btg-26/AlaAT-Pflanzen der Linie 81B, die in Hydrokultur mit 0,5 mM Nitrat nach 36 Stunden Salzbehandlung gewachsen waren.
  • 15 zeigt die AlaAT-Aktivität in den Wurzeln von Wildtyp-, cv. Westar- und transgenen btg-26/AlaAT Pflanzen der Linie 81B, die in Hydrokultur mit 0,5 mM Nitrat nach 36 Stunden Salzbehandlung gewachsen waren.
  • 16 zeigt den Effekt des Salzgehaltes auf die Akkumulation der Biomasse von Wildtyp-, cv. Westar- und transgenen btg-26/AlaAT Pflanzen der Linie 81B. Feld A zeigt die Wildtyp-Schösslinge, Feld B zeigt die btg-26/AlaAT Schösslinge, Feld C zeigt die Wildtyp-Wurzeln und Feld D zeigt die btg-26/AlaAT-Wurzeln.
  • 17 zeigt den Effekt des Salzgehaltes auf das Wachstum von Wildtyp-, cv. Westar- und transgenen btg-26/AlaAT Pflanzen der Linie 81B. Die Wildtyp-Pflanzen sind auf der linken Seite des Bildes und die transgenen Pflanzen sind auf der rechten Seite des Bildes.
  • 18 zeigt die Immunolokalisation von exprimiertem AlaAT-Protein in Wildtyp- und transgenen (btg-26/AlaAT) Pflanzen. Feld A zeigt die als Kontrolle dienende unbehandelte Wildtyp-Wurzel, Feld B zeigt eine transgene unbehandelte Wurzel, Feld C zeigt eine Wildtyp-Wurzel, die mit 150 mM NaCl behandelt wurde, und Feld D zeigt eine transgene Wurzel, die mit 150 mM NaCl behandelt wurde.
  • 19 zeigt die Zunahme in der Pflanzenbiomasse in den transgenen Pflanzen, die btg-26/AlaAT unter Freilandbedingungen exprimieren und mit einem Düngemittel behandelt wurden, das niedrige oder hohe Stickstoffkonzentrationen enthält. 19A zeigt das Trockengewicht, das von transgenen Pflanzen, die btg-26/AlaAT (53F und 81B) exprimieren, und Kontrollpflanzen (Westar) erhalten wurde. 19B zeigt die Samenausbeute (g/abgeerntetem Grundstück), die von transgenen Pflanzen, die btg-26/AlaAT (53F und 81B) exprimieren, und Kontrollpflanzen (Westar) erhalten wurde.
  • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
  • Die nachfolgende Beschreibung von einer bevorzugten Ausführungsform ist nur als Beispiel gedacht und ohne Einschränkung auf die Kombination der Merkmale, die notwendig ist, um die Erfindung zu verwirklichen.
  • I. Definitionen
  • Der Ausdruck „Gewebespezifische Expression von einem Zielgen" ist in dem Fachgebiet bekannt und beinhaltet die Expression von einem Zielgen nur in ausgewählten Geweben; obwohl das Zielgen in mehreren Geweben vorhanden sein kann, wird es nur in einer Teilmenge von diesen Geweben exprimiert. Solch eine selektive Expression kann auf den Einfluss von einem oder mehr genetischen Regulatorelementen, z. B. Promotor-, Repressor- oder Enhancer-Elemente, zurückzuführen sein.
  • Der Ausdruck „Zielgen" ist fachspezifisch und beinhaltet ein beliebiges Gen, welches wünschenswerterweise in einem oder mehr ausgewählten Pflanzengeweben exprimiert wird. Beispiele für Zielgene, die vorteilhafterweise in Verbindung mit den Verfahren der Erfindung verwendet werden können, enthalten Stickstoffassimilations- und/oder Stickstoffverwertungs-Gene, Stressresistenz-Gene, Krankheits- und Pflanzenschädlings-Resistenzgene und Gene, welche die Nährstoff-Aufnahme und – Verwertung betreffen.
  • Der Ausdruck „Pflanze" ist fachspezifisch und beinhaltet jede einkeimblättrige oder zweikeimblättrige Pflanze. Bevorzugte Pflanzen für die Verwendung in der Erfindung beinhalten Raps, Gerste, Mais, Reis, Tabak, Sojabohne, Baumwolle, Luzerne, Tomate, Weizen, Kartoffel und bestimmte Baumgattungen einschließlich Koniferen und Populus Spezies.
  • Der Ausdruck „Wirkverbindung" ist fachspezifisch und beinhaltet das Platzieren von einem Zielgen relativ zu einer regulatorischen Nukleinsäuresequenz derart, dass die Expression von dem Zielgen durch die Regulatorsequenz kontrolliert wird. Diese regulatorische Sequenz kann eine positive Wirkung auf die Expression von dem Zielgen aufweisen (z. B. ist die Regulatorsequenz ein Promotor oder ein Enhancer-Element) oder die Regulatorsequenz kann eine negative Wirkung auf die Expression von dem Zielgen aufweisen (z. B. ist die Regulatorsequenz ein Repressor-Element). Die Regulatorsequenz kann physikalisch 5' oder 3' von dem Zielgen lokalisiert sein, sie kann sich innerhalb der kodierenden Sequenz von dem Zielgen befinden oder kann auf einem Intron innerhalb des Zielgens enthalten sein.
  • Der Ausdruck „Phytoremediation" ist fachspezifisch und beinhaltet die Verwendung von einer oder mehr Pflanzen zum Zwecke des Extrahierens von Verbindungen aus dem Erdboden oder Wasser, welche für Menschen oder Tiere gesundheitsgefährdend sind und entweder a) das Lagern dieser Verbindungen in der Pflanzenmasse als eine zweckdienlichere Entsorgung oder bevorzugt b) das Umwandeln dieser Verbindungen in weniger gesundheitsgefährdende Substanzen innerhalb der Pflanze.
  • Verfahren der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ist auf die Produktion von Pflanzen bezogen, welche ein oder mehr Zielgene in einer wurzelspezifischen Art und Weise exprimieren. Es werden Samen beschrieben, die ein oder mehr Zielgene unter der Kontrolle von einem Promotor-Element enthalten, welches speziell die wurzelspezifische Expression von dem Gen lenkt. Durch die Verfahren der Erfindung ist es möglich, Pflanzen zu produzieren, die ein oder mehr Charaktermerkmale oder Eigenschaften in ausgewählten Geweben aufweisen, z. B. um spezifisch die genetischen und/oder physiologischen Eigenschaften von den Wurzeln der Pflanze zu verändern. Die Erfindung stellt unter Verwendung des Promotor-Elementes des Brassica Turgorproteins-26 Verfahren zur Produktion von Pflanzen bereit, die eine wurzelspezifische Expression von ein oder mehr erwünschten Genen aufweisen. In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Lenken der wurzelspezifischen Expression von einem oder mehr Zielgenen in einer Pflanze bereit, in welchem eine Pflanze aus einer Pflanzenzelle erzeugt wird, die das Zielgen in Wirkverbindung mit einem genetischen Regulatorelement enthält, welches die wurzelspezifische Expression von dem/den Zielgen(en) derart lenkt, dass die Pflanze die Expression des Zielgens innerhalb einer Wurzel aufweist. Das genetische Regulatorelement ist ein Promotorelement des Brassica Turgorgen-26.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Lenken der wurzelspezifischen und umwelt- oder entwicklungsspezifischen Expression von einem oder mehr Genen in einer Pflanze bereit, in welchem eine Pflanze aus einer Pflanzenzelle erzeugt wird, die das Zielgen in Wirkverbindung mit einem genetischen Regulatorelement enthält, welches die wurzelspezifische und umwelt- oder entwicklungsspezifische Expression von dem/den Zielgen(en) derart lenkt, dass die Pflanze die Expression des Zielgens nur unter den ausgewählten umweltabhängigen oder entwicklungsabhängigen Bedingungen und innerhalb der Wurzel von der Pflanze aufweist. Das genetische Regulatorelement ist ein Promotorelement des Brassica Turgorgen-26 und die gewünschte Umweltbedingung ist vorzugsweise Trockenheit oder Salzstress. Samen, die Konstrukte enthalten, in welchen ein Promotor sowohl die gewebespezifische und wahlweise ebenfalls die umwelt- oder entwicklungsspezifische Expression von ein oder mehr Zielgenen lenkt, sind hierin offenbart.
  • Die Verfahren von der Erfindung sind unten weiter erläutert.
  • Genetische Konstrukte der Erfindung
  • A. Genetische Regulatorelemente
  • Die Verfahren für das Erzeugen von Pflanzen, die eine gewebespezifische Expression von ein oder mehr Zielgenen aufweisen, werden durch die Verwendung von einem genetischen Regulatorelement durchgeführt, das die gewebespezifische Expression von dem/den Zielgenen) lenkt. Die Regulatorelemente können entweder negativ oder positiv in ihrer Aktivität sein: Ein Pflanzengewebe-spezifisches Promotor- oder ein Enhancer-Element gestattet die Expression von dem/den Zielgen(en) in einem oder mehr spezifischen Geweben, wohingegen ein Pflanzengewebe-spezifischer Repressor die Expression von den Zielgenen in einem oder mehr Geweben unterdrückt, während die Expression in dem/den anderen Gewebe(n) unvermindert fortdauert. Für die Zwecke von der Erfindung ist zu verstehen, dass die Promotorsequenzen die genetischen Regulatorelemente der Erfindung ausmachen.
  • Die gewebespezifischen Promotoren können entweder homolog oder heterolog zu der Pflanze sein, für die sie verwendet werden sollen. Zum Beispiel können Promotoren verwendet werden, welche die gewebespezifische Expression von einem Gen in Pflanzen lenken, die aber z. B. aus Viren, Bakterien, Insekten oder Tieren erhalten werden. Promotoren, welche die Expression von einem Gen in Wirkverbindung in einem oder mehr Pflanzengeweben lenken, während sie die Expression des verbundenen Gens in einem oder mehr Pflanzengeweben ausschließen, können verwendet werden. Entsprechende Pflanzengewebe beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf z. B. Wurzel, Blatt, Blütenblatt, Kelchblatt, Staubgefäß, Staubbeutel, Narbe, Fruchtknoten, Griffel, Stempel, Epidermis, Phloem, Xylem, Rinde, Mark, Zellbildungsgewebe, Stängel oder Stamm, Wurzelhaar, Blattstiel, Frucht oder Knolle.
  • Es wird durch einen Fachmann verstanden werden, dass Veränderungen an den Promotoren, die in den Verfahren von der Erfindung nützlich sind, vorgenommen werden können, welche die Aktivität von dem Promotor verbessern oder verändern. Mehrere Kopien von einem ausgewählten Promotor können funktionsmäßig mit einem einzelnen Zielgen verbunden sein, um dadurch den Expressionspegel von dem verbundenen Gen zu verändern oder ein ausgewählter Promotor kann funktionsmäßig mit ein oder mehr Zielgenen derart verbunden sein, dass die Expression von jedem Zielgen koordiniert reguliert wird. Ein Promotor kann von jeder Größe sein, die angemessen ist, das gewebespezifische Funktionieren von dem Promotor zu gestatten. Ein Promotor kann verändert werden (z. B. durch Mutagenese, Deletion, Insertion oder Verkürzung), um das Ausmaß zu ändern, bis zu dem das funktionsmäßig verbundene Gen in dem ausgewählten Gewebe exprimiert wird oder um die Spezifität der Gewebeexpression, die durch den Promotor gelenkt wird, zu ändern. Ferner kann die Platzierung von dem Promotor relativ zu dem funktionsmäßig verbundenen Zielgen verändert werden (z. B. weiter weg oder näher zusammen bewegt), um einen erwünschten Pegel der Promotor-gelenkten Expression zu erzielen.
  • In einer Ausführungsform lenkt der Promotor nicht nur die Expression von einem funktionsmäßig verbundenen Gen in einem oder mehr ausgewählten Geweben von der Pflanze, sondern lenkt ebenfalls die Expression des Gens als Reaktion auf eine spezifische Umwelt- oder physiologische Bedingung. Zum Beispiel kann der Promotor unter Stressbedingungen (z. B. Trockenstress, Salzstress, Temperaturstress, Sauerstoffstress, pH-Stress oder Schwermetallstress), unter Bedingungen von Nährstoffmangel, unter Bedingungen von Einflüssen durch Krankheit oder Pflanzenschädlinge oder unter spezifischen Entwicklungsbedingungen (z. B. nach dem Keimen, dem Fruchttragen oder der Samenproduktion) aktiviert werden. Durch die Verwendung von einem solchen Promotor ist es möglich, die Expression von einem Zielgen sowohl in einer gewebespezifischen als auch bedingungsspezifischen Art und Weise zu aktivieren.
  • Der Promotor für die Verwendung in Verfahren der Erfindung ist der Promotor des Brassica Turgor-Gen-26 (btg-26), dessen Sequenz als SEQ-ID NR:1 dargelegt ist, und die Expression des funktionsmäßig verbundenen Gens wird unter Bedingungen von osmotischem Stress in die Wurzel von der transgenen Pflanze gelenkt. Ein oder mehr Fragmente (z. B. CAACGG (SEQ-ID NR:2), GGACACGTGAC (SEQ-ID NR:3), CAACAG (SEQ-ID NR:4), CAACTT (SEQ-ID NR:5) und TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCACTCACTTCCTCTT (SEQ-ID NR:6)) von dem btg-26 Promotor können funktionsmäßig mit dem Zielgen verbunden sein und die spezifische Expression von dem Zielgen lenken.
  • B. Zielgene
  • Ein Zielgen von der Erfindung kann jedes Gen sein, welches wünschenswerterweise in einer gewebespezifischen Art und Weise in einer Pflanze exprimiert ist. Allgemeine Klassen von Zielgenen, welche vorteilhafterweise in den Verfahren und Konstrukten von der Erfindung eingesetzt werden können beinhalten Gene, die Strukturproteine von Pflanzen kodieren, Gene, die Proteine kodieren, welche in den Transport und/oder die Aufnahme von Nährstoffen eingebunden sind, Gene, die Enzyme und Proteine kodieren, welche an der Verwertung von Nährstoffen beteiligt sind, Gene, die Proteine kodieren, welche an der Resistenz von Pflanzen gegenüber Pestiziden oder Herbiziden beteiligt sind, Gene, die Proteine kodieren, welche an der Resistenz der Pflanzen gegenüber Nematoden, Viren, Insekten oder Bakterien beteiligt sind, Gene, die Proteine kodieren, welche an der Resistenz der Pflanzen gegenüber Stress (z. B. osmotischer, Temperatur-, pH- oder Sauerstoffstress) beteiligt sind, Gene, die Proteine kodieren, welche in der Stimulation oder Fortdauer des Pflanzenwachstums eingebunden sind, Gene, die Proteine kodieren, welche an der Phytoremediation beteiligt sind, oder Gene, die Proteine kodieren, welche pharmazeutische Eigenschaften aufweisen oder Enzyme kodieren, die Verbindungen produzieren, welche pharmazeutische Eigenschaften aufweisen. Ferner muss das Zielgen keinesfalls ein Gen sein, sondern kann eine genetische Sequenz sein, welche, wenn sie transkribiert wird, antisense zu der nativen Sequenz ist, wobei es erwünscht ist, dass die Transkription und Translation von dieser unterdrückt wird.
  • In einer Ausführungsform sind derartige Gene von Interesse, die Enzyme kodieren, welche in der Assimilation und/oder dem Stoffwechsel von Stickstoff eingebunden sind und, im Besonderen, solche, welche Ammoniak in Aminosäuren assimilieren oder die gebildeten Aminosäuren in Biosynthesereaktionen verwenden. Diese Enzyme beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, Alanindehydrogenase, Glutaminsynthetase (GS), Asparaginsynthetase (AS), Glutamatsynthase (ebenfalls bekannt als Glutamat-2:Oxogluturat-Aminotransferase und GOGAT), Asparaginase (ANS), Glutamatdehydrogenase (GDH), Aspartat-Aminotransferase (AspAT) (die Aktivitäten sind in 1 gezeigt) und Alanin-Aminotransferase (AlaAT) (die Aktivität ist in 2 dargestellt).
  • Das Zielgen kann ein Gen sein, das natürlich in der ausgewählten Pflanze exprimiert wird oder es kann heterolog zu der ausgewählten Pflanze sein. Das Gen kann aus irgendeiner Quelle abstammen, einschließlich viralen, bakteriellen, pflanzlichen oder tierischen Quellen. Vorzugsweise ist das Gen heterolog zu dem Promotor, mit welchem es verbunden ist, damit es nicht mit einem unveränderten, induzierbaren Promotor verbunden ist, mit dem das Gen naturgemäß verbunden ist.
  • Das Zielgen kann auf irgendeine geeignete Weise verändert werden, um ein Gen oder eine Pflanze mit erwünschten Eigenschaften zu konstruieren. In einer Ausführungsform wird das Gen verändert, um in einem Pflanzensystem transkribierbar und übersetzbar zu sein; zum Beispiel kann das Gen derart verändert werden, dass es alle die notwendigen Polyadenylierungssequenzen, Startpunkte und Terminationsstellen enthält, welche es gestatten, dass die kodierende Sequenz in mRNA (Boten-Ribonukleinsäure) transkribiert wird und die mRNA in dem ausgewählten Pflanzensystem übersetzt wird. Ferner kann das Zielgen derart verändert werden, dass die Verwendung seines Kodons der des nativen Gens der ausgewählten Pflanze ähnelt. Solche Veränderungen des Zielgens und die Verfahren durch die sie gemacht werden, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
  • Vektoren
  • Die gewebespezifischen Promotor-Zielgen-Konstrukte werden in eine Pflanzenzelle oder einen Pflanzenprotoplasten am effizientesten durch die Verwendung von einem Vektor eingeführt. Beispiele für die Klonierungs- oder Expressionsvektoren, die für die Verwendung in der Erfindung geeignet sind, sind Plasmide, Cosmide, virale DNA oder RNA und Minichromosome. Geeignete Pflanzenvektoren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (siehe z. B. Clark, M., ed. (1997) Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual. Springer Verlag, ISBN: 3540584056).
  • Vektoren können vorteilhafterweise ein oder mehr bakteriell oder pflanzlich exprimierbare, auswählbare oder überprüfbare Markierungen derart enthalten, dass die Aufnahme von dem Vektor in eine Pflanzenzelle oder einen Protoplasten kontrolliert werden kann. Es ist bevorzugt, dass solche auswählbaren oder überprüfbaren Markierungen einen leicht nachweisbaren Phänotyp verleihen, wie Resistenz gegenüber einer ansonsten toxischen Verbindung (z. B. Kanamycin-Resistenz) oder eine kolorimetrische oder lumineszente Reaktion nach der Inkubation der Pflanze mit einem entsprechenden Substrat ergeben (z. B. a-Glucuronidase- (GUS-) oder Luziferase-Gene). Derartige Markierungsgene sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
  • Entweder der gewebespezifische Promotor oder das Zielgen können in einen Vektor eingebaut und in eine ausgewählte Pflanze eingeführt werden. Die 5'- und die 3'-flankierenden Sequenzen, die homolog zu den auf- und abwärts liegenden genetischen Sequenzen von dem Einbauort sind, wo die Rekombination von der eingebauten Promotorsequenz oder dem Gen gewünscht ist, können den Promotor oder das Zielgen in dem Vektor derart umgeben, dass eine homologe Rekombination nach der Einführung von dem Vektor in die Pflanze oder den Protoplasten stattfindet. Durch eine derartige homologe Rekombination können Pflanzen produziert werden, die ein heterologes Zielgen unter der Kontrolle von einem arteigenen gewebespezifischen Promotor oder einen heterologen gewebespezifischen Promotor in Wirkverbindung mit einem arteigenen Zielgen aufweisen.
  • D. Transformation von Pflanzenzellen
  • Das Genkonstrukt kann in eine Pflanzenzelle durch jedes verwendbares Verfahren eingeführt werden. Es stehen eine große Anzahl von Prozessen zur Verfügung und sie sind gut bekannt für das Einbringen von Genen in Pflanzenzellen. Eine von den am besten bekannten Methoden beinhaltet die Verwendung von Agrobacterium oder ähnlichen Bodenbakterien als einen Vektor. Die Zielgewebe werden zusammen mit Agrobacterium kultiviert, welches das Gen von Interesse in das Pflanzengenom einsetzt, wie es durch die US-Patentschrift Nr. 4,940,838 (Schilperoort et al.) und Horsch et al., 1985, Science 227: 1229–1231, beschrieben worden ist. Die alternativen Gentransfer- und Transformationsmethoden, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Liposomen, Elektroporation oder chemisch-vermittelte Aufnahme von freier DNA, Calciumphosphat-Copräzipitationstechniken, zielge richtete Mikroprojektile und Mikro- oder Makroinjektion. Derartige Transformationsmethoden sind gut auf dem Fachgebiet dokumentiert und werden, zum Beispiel, offenbart in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York und darin enthaltenen Verweisen. Es wird von einem Fachmann verstanden werden, dass die Methode, welche für die Pflanzenzell- oder Protoplasten-Transformation ausgewählt wurde, in großem Umfang durch die Beschaffenheit von dem gewebespezifischen Promotor-Zielgen-Konstrukt und/oder dem Vektor, der es enthält, bestimmt wird.
  • Pflanzen
  • Die Verfahren und genetischen Konstrukte, die hierin offenbart sind, können verwendet werden, um eine Pflanze von irgendeiner Spezies zu erzeugen, die in der Lage ist, den Promoter derart zu nutzen, dass die transgene Pflanze eine gewebespezifische Expression von einem oder mehr der erwünschten Gene aufweist. Sowohl einkeimblättrige als auch zweikeimblättrige Pflanzen sind für derartige Veränderungen zugänglich. Die Erfindung ist vorgesehen insbesondere anwendbar zu sein, zum Beispiel, auf Kulturpflanzen (besonders solche von der Gattung Brassica), Zierpflanzen und Bäume (insbesondere Koniferen und die Gattung Populus). Besonders geeignete Pflanzen für die Anwendung von der vorliegenden Erfindung beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, Raps, Gerste, Mais, Reis, Tabak, Sojabohne, Baumwolle, Luzerne, Tomate, Weizen, Kartoffel, Zitterpappel, Schwarzpappel, Koniferen und Pappeln allgemein.
  • Die transgenen Pflanzen und Samen, die gemäß der vorliegenden Erfindung produziert werden, können ferner in Züchtungsprogrammen für die Herstellung von Pflanzenspezies verwendbar sein, die mehr als eine erwünschte Eigenschaft aufweisen (z. B. können zwei transgene Pflanzen der Erfindung, von denen jede die Expression eines erwünschten Transgens in unterschiedlichen Pflanzengeweben aufweist, miteinander gekreuzt werden, um Abkömmlinge der transgene Pflanzen zu ergeben, welche die gewebespezifische Expression beider Transgene aufweisen; oder es können zwei transgene Pflanzen der Erfindung, von denen jede die Expression eines erwünschten, unterschiedlichen Transgens in demselben Pflanzengewebe aufweist, miteinander gekreuzt werden, um Abkömmlinge der transgenen Pflanzen zu ergeben, welche die gewebespezifische Expression von beiden Transgenen aufweisen). Auf diese Art und Weise ist es möglich, Pflanzen zu produzieren, die eine Kombination von erwünschten Eigenschaften in ausgewähltem/ausgewählten Gewebe(n) der Pflanze aufweisen.
  • Darüber hinaus wird es durch den Fachmann verstanden werden, dass unterschiedliche Pflanzenspezies für genetische Manipulationen im Allgemeinen mehr oder weniger zugänglich sind und das es deshalb vorteilhaft sein kann, zuerst eine verwandte Spezies der gewünschten Pflanze mittels der Verfahren der Erfindung und mit den hierin beschriebenen Konstrukten zu transformieren und dann nachträglich die gewebespezifische Expression von dem Zielgen in der gewünschten Pflanze durch Verkreuzungs-Techniken einzuführen. Solche Techniken und die entsprechend verwandten Pflanzenspezies sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Pflanzenzellen oder Protoplasten, die mit dem hierin beschriebenen Genkonstrukt transformiert worden sind, können in differenzierte Pflanzen unter Verwendung von Standardnährstoffmedien, die mit spross- oder wurzelinduzierenden Hormonen angereichert sind, durch Verwenden von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, umgewandelt werden (siehe zum Beispiel Shahin, E. A. US-Patentschrift Nr. 4,634,674 und darin enthaltene Verweise). Zusätzlich können die Samen von solchen transgenen Pflanzen unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Methoden geerntet werden und ferner verwendet werden, um wieder transgene Pflanzen und Hybriden zu züchten.
  • Verwendungen der Erfindung
  • Die Verfahren der Erfindung gestatten die Produktion von Pflanzen und Saatgut, welche die Expression von einem oder mehr erwünschten Genen in einem ausgewählten Gewebe von der Pflanze aufweisen. Demzufolge erlauben die Verfahren der Erfindung die Produktion von Pflanzen, die eine oder mehr er wünschte Eigenschaften aufweisen, die auf ausgewählte Pflanzengewebe beschränkt sind, wodurch der gezielte Einbau von einer Eigenschaft in das Gewebe ermöglicht wird, oder die Expression von einem erwünschten Gen in einem Gewebe, wo seine Wirkungen nicht erwünscht sind, zu vermeiden. Es gibt eine große Anzahl von spezifischen Anwendungen der Erfindung, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, der Produktion von Pflanzen, die eine gesteigerte Stresstoleranz aufweisen, die eine verstärkte Resistenz gegenüber Herbiziden und Pestiziden besitzen, die eine verbesserte Nährstoffaufnahme und/oder Verwertung aufweisen, die einen verbesserten Nährstoffgehalt und/oder Erträge der erwünschten Verbindungen aufweisen, die eine gesteigerte Resistenz gegenüber Pflanzenschädlingen oder Erkrankungen besitzen und die Eigenschaften für den Einsatz in der Phytoremediation aufweisen. Spezifische Anwendungen von der Erfindung sind weiter unten erläutert.
  • Umweltbelastungen, einschließlich Trockenstress, Salzstress, Lichtstress, pH-Stress, Temperaturstress und Sauerstoffstress, besitzen einen signifikanten Einfluss auf die Fähigkeit von Pflanzen, zu wachsen und zu gedeihen. Viele Erdböden erlauben nicht das Wachstum der erwünschten Pflanzen, aufgrund einer oder mehr der vorangehend erwähnten Umweltbelastungen. Durch die Verfahren der Erfindung ist es möglich, Pflanzen und Samen von Pflanzen zu produzieren, welche eine verbesserte Toleranz gegenüber solchen Stressbedingungen aufweisen, wodurch das Wachstum in Umgebungen ermöglicht wird, welche normalerweise das Wachstum der Pflanze nicht unterstützen würden. Zum Beispiel ist es unter Verwendung eines wurzelspezifischen Pflanzenpromotors möglich, Pflanzen zu produzieren, die zusätzliche Transportermoleküle aufweisen, um die Aufnahme von Wasser aus dem umgebenden Erdboden zu verbessern, wodurch das Wachstum der Pflanze unter Trockenheitsbedingungen verbessert wird. Ähnlich kann die Kombination von einem wurzelspezifischen Promotor und Genen, welche Transportmoleküle kodieren, die Absonderung von Salzen und alkalischen oder sauren Verbindungen in den Erdboden, der die Pflanze umgibt, verbessern, wodurch das Wachstum unter Salzstress oder in al kalischem oder saurem Erdboden ermöglicht wird. Die Verwendung von blattspezifischen Promotoren in Kombination mit veränderten Genen des photosynthetischen Apparates kann die Produktion von Pflanzen ermöglichen, die fähig sind, die Photosynthese unter unterschiedlichen Lichtbedingungen durchzuführen, wodurch Lichtstress abgebaut wird.
  • Pflanzen sind zahlreichen Pflanzenschädlingen, einschließlich Insekten, Nematoden, Pilzen, Bakterien und Viren ausgesetzt. Erdböden, die mit irgendeiner der obigen Erkrankungen oder irgendeinem Pflanzenschädling befallen sind, sind herkömmlich nicht in der Lage gewesen, das Wachstum von wertvollen Kulturpflanzen und erwünschten Pflanzen zu fördern. Ferner hat die Behandlung solcher Krankheiten oder die Entfernung solcher Pflanzenschädlinge Maßnahmen erfordert wie die Anwendung von Pestiziden, welche nachteilig für das Wachstum der Pflanze als ebenfalls gesundheitsgefährdend für die umgebende Umwelt oder den Endverbraucher der Pflanze sein können. Durch die Verfahren der Erfindung ist es möglich, Pflanzen zu produzieren, die Gene für die Resistenz gegenüber Pflanzenschädlingen und Krankheiten dort zu exprimieren, wo sie am meisten benötigt werden, um die Pflanze gegen den Angriff von Krankheiten oder Pflanzenschädlingen zu verteidigen. Zum Beispiel ist es durch Konstruieren einer Pflanze mit einem Konstrukt, das einen gewebespezifischen Promotor und ein oder mehr erwünschte Strukturgene kombiniert, möglich, ein oder mehr Gewebe von der Pflanze gegen den Verzehr oder den Angriff durch ein Insekt zu schützen (z. B. durch Verstärkung der Zellwände von den Epithelzellen in dem Blatt, der Wurzel oder dem Stängel derart, dass blatt-, wurzel- oder stängelzerstörende Insekten nicht länger in der Lage sind, diese Gewebe zu schädigen oder sich von ihnen zu ernähren. Ferner ist es möglich, unter Verwendung der Verfahren von der Erfindung, spezifisch Proteine für die Immunität der Pflanzen (z. B. die N-, M-, L6-, RPP1- und RPP5-Gene von Monokotyledonen und die RPS2-, RPM1-, I2-, Mi-, Dm3-, PiB-, Xal-, RPP8- und RPS5-Gene sowohl von Monokotyledonen und Dikotyledonen (siehe z. B. Meyers et al. (1999) Plant J: 20(3): 317–332)) in Geweben zu expri mieren, in die typischerweise Bakterien und/oder Viren (Wurzeln) eindringen.
  • Außer der vorangehend erwähnten schützenden und prophylaktischen Expression von Struktur- oder Immunitätsproteinen in speziellen erwünschten Geweben von der Pflanze ist es ebenfalls möglich, Verbindungen und Proteine zu exprimieren, welche aktiv die Insekten und andere Schädlinge der Pflanze ausrottet. Zum Beispiel können toxische Verbindungen wie Bakterientoxine oder Enzyme, welche spezifisch auf essentielle Insektenproteine oder Membranbestandteile von Pflanzenpathogenen (z. B. Delta-Endotoxin von Bacillus thuringiensis (Parker und Luttrell (1999) J. Econ. Entomol. 92 (4): 837–845) und Chitinase (Ding et al. (1998) Transgenic Research 7(2): 77–84)) ausgerichtet sind, in den Wurzeln, Stängeln oder Blättern von einer Pflanze exprimiert werden, um spezifisch einen Pflanzenschädling anzuvisieren, von dem bekannt ist, dass er die Pflanze an einem von diesen Geweben angreift. Gleichzeitig wird die Expression der ausgewählten toxischen Verbindung in anderen Geweben, wie zum Beispiel der Frucht oder der Blüte der Pflanze, vermieden, wodurch der Kontakt von dem Endverbraucher der Pflanze mit der Chemikalie oder dem Protein eingeschränkt wird. Ferner bietet die Fähigkeit, gewebespezifische Abwehr- und aktive Widerstandsmechanismen gegen Pflanzenschädlinge und Mikroben zu konstruieren, ermöglicht durch die vorliegende Erfindung, das Potenzial, die Notwendigkeit für die Pestizidverwendung in der Schädlings- und Krankheitskontrolle zu verringern, wodurch eine geringere Verschmutzung von der Umwelt und weniger ungewollte Nebenwirkungen auf andere Spezies von Pflanzen und Tieren resultiert.
  • Eine weitere Anwendung der Erfindung besteht in der Erzeugung von Pflanzen, die besser in der Lage sind, auf nährstoffarmen Erdböden zu gedeihen. Es ist auf dem Fachgebiet gut bekannt, dass bestimmte Pflanzenspezies, insbesondere Kulturpflanzen, den Erdboden an Nährstoffen wie Stickstoff, Phosphat und Kalium erschöpfen, die für das Aufrechterhalten des Wachsturns notwendig sind. Um die fehlenden Nährstoffe wieder zuzuführen, ist es notwendig entweder den Erdboden zu düngen (eine teure und umweltschädigende Prozedur) oder Pflanzen zu kultivieren, von denen bekannt ist, dass sie die erschöpften Nährstoffe wieder in dem Erdboden deponieren (z. B. Klee oder Sojabohnen im Falle der Stickstoffverarmung), was weniger ökonomisch ist oder nahrhafte erwünschte Kulturpflanzen. Die Verfahren der Erfindung ermöglichen in der Wurzel die zielgerichtete Expression von Genen, die in der Nährstoffaufnahme (z. B. Transportmoleküle) in solchen Geweben eingebunden sind, in welchen die Aufnahme stattfindet, um dadurch die Fähigkeit der Pflanze zu verbessern, die Nährstoffe aus der Umgebung zu absorbieren. Die Erfindung kann ebenfalls verwendet werden, um Pflanzen zu erzeugen, welche heterologe oder native Nährstoffverwertungs-Gene in der Wurzel exprimieren, die eine effizientere Verwendung von dem Nährstoff derart ermöglichen, dass weniger von dem Nährstoff für das normale Wachstum und die Funktion von der Pflanze benötigt wird. Ferner ist es unter Verwendung der Verfahren der Erfindung möglich, in der Wurzel Gene zu exprimieren, die an der Verwendung und der Aufnahme von Nährstoffen beteiligt sind, die normalerweise nicht von der Pflanze in solchen Pflanzengeweben verwendet werden, welche direkt dem unterschiedlichen Nährstoff ausgesetzt sind. Auf diese Art und Weise können Pflanzen erzeugt werden, welche in der Lage sind, auf unterschiedlichen Nährstoffquellen (z. B. unterschiedlichen Stickstoffquellen) zu wachsen und zu gedeihen. Insbesonders nützliche Zielgene für die Optimierung der Stickstoffwirksamkeit von der Pflanze schließen ein: Glutaminsynthetase (GS), Asparaginsynthetase (AS), Glutamatsynthase (ebenfalls bekannt als Glutamin-2-oxogluturat-aminotransferase und GOGAT), Asparaginase (ANS), Glutamatdehydrogenase (GDH), Alanindehydrogenase, Aspartat-Aminotransferase (AspAT) (die Aktivitäten sind in 1 gezeigt) und Alanin-Aminotransferase (AlaAT) (die Aktivität ist in 2 dargestellt).
  • Ferner ermöglichen die Verfahren der Erfindung die Erzeugung von Pflanzen mit verändertem Nährstoffgehalt (z. B. Proteingehalt, Zuckergehalt, Vitamin- oder Mineralgehalt, Ölgehalt, Fettgehalt, Kohlenhydratgehalt, Stärkegehalt oder Phyto chemikalien (z. B. bioaktive Pflanzenverbindungen wie Steroide, Antikrebs-Verbindungen, Aufputschmittel, psychoaktive Verbindungen oder andere Verbindungen, die pharmazeutische Eigenschaften aufweisen) in der Wurzel. Die selektive Expression von einem Vitaminsyntheseprotein in Knollen- oder Fruchtgewebe kann in Früchten oder Knollen mit erhöhtem Vitamingehalt resultieren. Ähnlich kann die selektive Expression von Enzymen, die an der Zuckerproduktion beteiligt sind, in der Knolle oder der Frucht die Süße von diesen Geweben steigern, was sie für den Verzehr attraktiver macht oder den Nährwert von dem Gewebe heraufsetzt. Ähnlich kann für solche Pflanzen, von denen eine oder mehr erwünschte Verbindungen extrahiert werden, und die in der Lage sind, die Produktion von der erwünschten Verbindung heraufzusetzen (z. B. ein Zucker (wie in Zuckerrohr) oder eine andere erwünschte Pflanzenverbindung (wie Kakao oder Pflanzenverbindungen mit pharmazeutischen Eigenschaften)) in den Geweben von der Pflanze, aus denen die Verbindung leicht extrahiert wurde (z. B. Blattgewebe oder Wurzelgewebe), der Ertrag der erwünschten Verbindung der Pflanze gesteigert werden.
  • Eine weitere Anwendung der Erfindung besteht in der Erzeugung von Pflanzen, die resistent gegenüber Herbiziden und/oder Pestiziden sind. Sowohl Herbizide als ebenfalls Pestizide werden gewöhnlich verwendet, um das kontinuierliche Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen unter Bedingungen des Befalls mit Pflanzenschädlingen oder anderen parasitären Erkrankungen zu ermöglichen. Durch das Erzeugen einer Pflanze, welche spezifisch ein Protein exprimiert das in der Lage ist, die Herbizide oder Pestizide in solchen Pflanzengeweben mit dem größten Kontakt (z. B. der Wurzel der Pflanze) mit der Verbindung zu entgiften (z. B. ein Transportprotein, welches die spezifische Absonderung von dem Herbizid oder Pestizid ermöglicht, oder ein Enzym, welches das Herbizid oder das Pestizid in eine harmlose Verbindung umwandelt), ist es möglich, Pflanzen zu erzeugen, die resistent gegenüber den Wirkungen von dem Pestizid oder dem Herbizid sind.
  • Die Erfindung ermöglicht ferner die Erzeugung von Pflanzen, die unerwünschte Verbindungen (z. B. Kohlenwasserstoffe oder Schwermetallabfälle) in der Umgebung (z. B. Erdboden, Wasser oder Luft) entgiften können und somit nützlich in der Phytoremediation sind. Zum Beispiel könnten transgene Pflanzen, die ein Protein exprimieren, welches in der Lage ist, Schwermetalle zu chelieren oder enzymatisch eine potenziell gesundheitsgefährdende Verbindung (z. B. einen Kohlenwasserstoff wie Petroleum oder Benzol) in ein eher gutartiges Abbauprodukt umzuwandeln, nützlich und kostengünstig in den Bestrebungen sein, Lagerstätten für gefährliche Abfälle zu säubern.
  • Die Erfindung ermöglicht ferner die Verwendung von Pflanzen in der Produktion von erwünschten Chemikalien oder Proteinen. In vielen Fällen ist die Synthese von einer erwünschten Chemikalie oder einem Protein nicht leicht durchführbar und die Isolierung der Verbindung aus natürlichen Quellen ist ein kostspieliger, schwerfälliger oder zeitaufwändiger Prozess. Unter Verwendung der Verfahren der Erfindung ist es möglich, eine ausgewählte Pflanze derart zu konstruieren, dass die Pflanze ein oder mehr ausgewählte Gene (z. B. Gene, in welchen das Expressionsprodukt wünschenswert ist oder Gene, die Enzyme kodieren, welche an der Produktion der erstrebenswerten Verbindung beteiligt sind) in der Wurzel (z. B solche Pflanzengewebe, von denen die Extraktion und die nachfolgende Reinigung der Verbindung am einfachsten ist) exprimieren. Beispiele für Verbindungen, die vorteilhafterweise durch die Anwendung von den Verfahren und Zusammenstellungen der Erfindung produziert werden, beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, Vitamine, Enzyme, Aminosäuren, Zucker, Fette, Kohlenhydrate und Verbindungen, welche pharmazeutische Eigenschaften aufweisen, wie Aufputschmittel, Antikrebs-Verbindungen und dergleichen.
  • Die selektive Hemmung der Genexpression in einem oder mehr ausgewählten Pflanzengeweben kann durch die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen erreicht werden. Die Technologie der Antisense-Nukleinsäuren ist dem Fachmann gut bekannt; für eine allgemeine Diskussion der Antisense-Technologie in Pflanzen siehe z. B. Shewmaker et al., US-Patentschrift Nr. 5,453,566 . Nukleinsäuresequenzen, deren Transkriptionsprodukte mRNA sind, die antisense zu einem Ziel gen oder Zielgenen sind, werden vielleicht nur in solchen Pflanzengeweben exprimiert werden, in welchen die Expression von dem Zielgen oder den Zielgenen unerwünscht ist. Nach der Transkription von der eingeführten Nukleinsäure in den ausgewählten Geweben hybridisiert die resultierende Antisense-mRNA an die mRNA des Zielgens/der Zielgene, wodurch die Translation der Zielgen-mRNA verhindert wird. Dies kann zum Beispiel nützlich sein, wenn bestimmte Gewebe von der Pflanze strukturell derart verändert werden, dass Chemikalien wie Pestizide leichter durch die Pflanze aufgenommen werden können, oder die Ernährungseigenschaften der Pflanze verändert werden, zum Beispiel durch Hemmung der Expression von einer oder mehr toxischen Verbindungen in der Frucht der Pflanze. Andere nützliche Anwendungen werden für den sachkundigen Fachmann offensichtlich sein.
  • Die hierin beschriebenen genetischen Konstrukte können ebenfalls transformierte Pflanzen bereitstellen, die ein erwünschtes Gen exprimieren können, wenn es am meisten gebraucht wird oder nutzbringend ist. Da der Promotor von btg-26 aus Brassica napus, wie in Beispiel 1 diskutiert und in 3 und SEQ-ID NR:1 gezeigt, stress-induzierbar ist, wird, wenn das Zielgen ein Stickstoffassimilations- oder Stickstoffverwertungs-Gen ist, die Pflanze nach der Anwendung von dem Stress induziert, Stickstoff zu assimilieren und/oder zu verstoffwechseln. Solch eine Pflanze kann dadurch eine gesteigerte Stresstoleranz aufweisen, wie zum Beispiel durch verbesserte Osmoregulation. Andere Anwendungen werden leicht für den Fachmann offensichtlich sein.
  • In einem weiteren Beispiel, wo der Promotor durch die Anwesenheit von Nitrat induziert ist, wie zum Beispiel der Nitratreduktase-Promotor (Cheng et al., 1988, ibid.; Cheng et al., 1991, Plant Physiol. 96: 275–279), wird die Pflanze nach der Anwendung von einem stickstoffhaltigen Düngemittel induziert werden, Stickstoff zu assimilieren und/oder zu verwenden. Wahlweise, oder zusätzlich, kann der Promotor zum Beispiel durch eine exogen angewendete Chemikalie wie Alkohol oder ABA (siehe z. B. Marcotte et al., 1989, Plant Cell 1: 969 –976) induzierbar sein. Diese Chemikalie könnte in dem stickstoffhaltigen Düngemittel einbegriffen sein. Auf diese Weise können Pflanzen den Düngemitteleinsatz durch schnellere Aufnahme des Stickstoffs in dem Düngemittel effizienter ausnutzen und ihn zur Zeit der Anwendung speichern, um dadurch die Mengen an stickstoffhaltigem Düngemittel zu vermindern, die durch Auswaschung usw. verloren gehen. Dies kann die Verringerung in der Menge des stickstoffhaltigen Düngemittels gestatten, die für die Anwendung bei einer Kulturpflanze benötigt wird, um Anbauerträge zu erhalten, die vergleichbar zu denen sind, die unter Verwendung normaler Kultivierungstechniken und Pflanzen erhalten werden, die nicht gemäß der vorliegenden Erfindung verändert worden sind. Zusätzliche ackerbauliche Vorteile können schnelleres Wachstum und Anbauertrag einschließen, wo der Einsatz stickstoffhaltiger Düngemittel auf einem Level aufrechterhalten wird, dass in gewöhnlichen Kultivierungstechniken von Kulturpflanzen verwendet wird.
  • Transformierte Brassica napus Pflanzen, die ein Gen ektopisch exprimieren, das ein Enzym kodiert, welches in der Assimilation oder dem Stoffwechsel von Stickstoff eingebunden ist, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf Alanindehydrogenase, Glutaminsynthetase, Asparaginsynthetase, Glutamatsynthase, Asparaginase, Glutamatdehydrogenase, Aspartat-Aminotransferase und Alanin-Aminotransferase (1 und 2), wurden unter Freilandbedingungen wachsen lassen (Beispiel 6), um zu bestimmen, ob die günstigen Auswirkungen auf das Pflanzenwachstum und den Ertrag unter kontrollierten Anbaubedingungen (Beispiel 3 und 4) beibehalten werden würden. Es wurde zum Beispiel untersucht, ob die Menge des verfügbaren Stickstoffs eine Auswirkung auf die Pflanzenbiomasse und den Saatgutertrag bei Pflanzen haben würde, die btg-26/AlaAT exprimieren und unter Freilandbedingungen gewachsen sind. Es muss jedoch verstanden werden, dass Pflanzen, die unter Freilandbedingungen wachsen, einer Reihe von nachteiligen Umweltbedingungen unterworfen sind, einschließlich Salzstress, Temperaturstress, Nährstoffstress, pH-Stress, Trockenstress, Schwermetallstress und dergleichen und während die Stickstoffmengen verschieden sein können, werden diese Pflanzen ebenfalls anderen Umweltbelastungen ausgesetzt sein.
  • Wie unter Bezugnahme auf 19A zu sehen ist, zeigten transgene Pflanzen, die ein Gen exprimieren, das ein Enzym kodiert, welches in der Assimilation oder dem Stoffwechsel von Stickstoff eingebunden ist, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf AlaAT (Pflanzen 53F und 81B), einen ähnlichen Ertrag in der Biomasse, unabhängig von der Stickstoffverfügbarkeit. Die Kontrollpflanzen weisen jedoch unter Bedingungen mit niedrigem Stickstoff geringere Erträge auf. Darüber hinaus war die Pflanzenbiomasse, die bei den transgenen Pflanzen in der Anwesenheit („hoch") oder der Abwesenheit („niedrig”) von zusätzlichem Stickstoff beobachtet wurde, äquivalent zu den Kontrollpflanzen, die Stickstoff (N) („hoch") erhielten. Diese Ergebnisse zeigen, dass die ektopische Expression von einem Gen, das ein Enzym kodiert, welches in der Assimilation oder dem Stoffwechsel von Stickstoff eingebunden ist, in gesteigerter Pflanzenbiomasse unter einer Reihe von Umweltbedingungen resultiert, einschließlich variabler Stickstoffverfügbarkeit. In der Abwesenheit von zugesetztem Stickstoff produzierten die transgenen Pflanzen höhere Erträge als die Kontrollpflanzen, was darauf hindeutet, dass die transgenen Pflanzen besser in der Lage sind unter nachteiligen Umweltbedingungen zu wachsen.
  • Folglich kann ein Verfahren zum Vergrößern der Biomasse von einer Pflanze, die unter ein oder mehr nachteiligen Umweltbedingungen wächst, wie zum Beispiel Bedingungen von niedrigem Stickstoff, umfassen:
    Das Transformieren einer Pflanze mit einem Zielgen in Wirkverbindung mit einem Promotorelement, um eine transformierte Pflanze zu erzeugen, wobei das Zielgen ein Enzym kodiert, das in der Stickstoffassimilation oder dem Stickstoffstoffwechsel eingebunden ist und das Anpflanzen der transformierten Pflanze.
  • Der Saatgutertrag in Kontroll- und transgenen Pflanzen, die unter Freilandbedingungen gewachsen waren, wurde untersucht (19B). Die Kontrollpflanzen produzierten höhere Saatguterträge, wenn sie mit zusätzlichem Stickstoff versorgt wurden. Die transgenen Pflanzen, die ein Gen exprimieren, welches ein Enzym kodiert, das in der Assimilation oder dem Stoffwechsel von Stickstoff eingebunden ist, wiesen höhere Erträge auf als Kontrollpflanzen in der Anwesenheit oder Abwesenheit von zusätzlichem Stickstoff. Ebenfalls ist in 19B gezeigt, dass die Ausbeuten, die mit den transgenen Pflanzen beobachtet wurden, äquivalent waren in Pflanzen, die entweder auf hohem oder niedrigem Stickstoff wachsen lassen wurden. Zusammengefasst weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass transgene Pflanzen, die ektopisch ein Enzym exprimieren, das in der Assimilation oder dem Stoffwechsel von Stickstoff eingebunden ist, in der Lage sind, die Verwertung von zur Verfügung stehendem Stickstoff unter einer Reihe von Umweltbedingungen zu optimieren, wodurch eine Steigerung in der Pflanzenbiomasse, dem Saatgutertrag oder einer Kombination daraus resultiert.
  • Ein Verfahren zum Erhöhen der Samenausbeute von einer Pflanze kann demzufolge umfassen:
    Das Transformieren einer Pflanze mit einem Zielgen in Wirkverbindung mit einem Promotorelement, um eine transformierte Pflanze zu erzeugen, wobei das Zielgen ein Enzym kodiert, das in der Stickstoffassimilation oder dem Stickstoffstoffwechsel eingebunden ist; und das Anpflanzen der transformierten Pflanze.
  • Mit der oben erwähnten Beschreibung ist nicht beabsichtigt, die beanspruchte Erfindung auf irgendeine Weise einzuschränken, darüber hinaus könnte die diskutierte Kombination von Merkmalen für die erfinderische Lösung nicht absolut notwendig sein.
  • Die vorliegende Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen weiter dargestellt. Es muss jedoch verstanden werden, dass diese Beispiele nur veranschaulichenden Zwecken dienen und sie sollten nicht verwendet werden, um den Bereich der vorliegenden Erfindung auf irgendeine Weise einzuschränken.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Isolierung und Charakterisierung von einem durch osmotischen Stress induzierten Promotor
  • Eine genomische DNA-Bibliothek aus Brassica napus (cv. Bridger) (Clontech, Palo Alto, Kalifornien) wurde unter Verwendung von Standardtechniken (Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, Wiley N. Y.) mit dem Pisum sativum 26g cDNA- (komplementäre Desoxyribonukleinsäure) Klon (Guerrero et al., ibidem), der mit einem Random-Primer-Kit (Boehringer Mannheim, Laval, Quebec) 32P-markiert wurde, überprüft. Ein 4,4 kb SalI-Fragment, welches das gesamte btg-26 Gen enthält, wurde für die weiteren Analysen in den handelsüblich erhältlichen pT7T3-19U-Vektor (Pharmacia Canada, Inc., Baie d'Urfe, Quebec, Kanada) subkloniert.
  • Identifizierung eines durch osmotischen Stress induzierten Promotors in Brassica napus
  • Mehrere Gene, die während Trockenstress aktiviert werden, sind aus unterschiedlichen Pflanzenspezies isoliert und charakterisiert worden. Die meisten davon repräsentieren verzögernd reagierende, ABA-induzierbare Gene (Übersichtsartikel verfasst von Skiver und Mundy, ibid.) Kürzlich wurde jedoch von einem ABA- und Cycloheximid-unabhängigen Transkript, 26g, in Pisum sativum berichtet (Guerrero und Mullet, ibid.; Guerrero et al., ibid.). Da dieses Gen keine Proteinsynthese zur Aktivierung benötigt, wird postuliert, dass es einen frühen Faktor in dem Trockenheits-Signaltransduktionsweg repräsentiert. Um einen durch osmotischen Stress induzierten Promotor aus Brassica napus zu isolieren, wurde der cDNA-Klon verwendet, der das P.sativum 26g-Gen repräsentiert (Guerrero et al., ibid.). Die Gesamt-RNA wurde aus dem dritten Blatt der Gesamtpflanzen isoliert, welche entweder kontinuierlich gewässert worden sind oder für vier Tage unter Wasserentzug gehalten wurden. Unter Verwendung der Hybridisierung mit niedriger Stringenz, wurde über die RNA-Blot-Analyse ein einzelnes 1,75 kb Transkript identifiziert, das sehr stark in austrocknungs gefährdeten Pflanzen induziert wird (Daten nicht gezeigt). Um zu bestimmen, ob diese mRNA ein Single-Copy-Gen in B. napus repräsentiert, wurde die genomische DNA mit EcoRI, HindIII oder BglII verdaut und durch DNA-Blot-Hybridisierung unter Verwendung der P. sativum 26g-cDNA analysiert. Eine einzelne Bande wurde in jeder Spur identifiziert (Daten nicht dargestellt).
  • Es wurde daraus geschlossen, dass dieses Iranskript ein Einzel-Kopie-, trockenheitsinduziertes Gen in B. napus repräsentiert. Dieses Gen wird als btg-26 (Brassica Turgor-Gen 26) bezeichnet.
  • Struktur des btg-26 Gens
  • Um das btg-26 Gen zu isolieren, wurde eine genomische DNA-Bibliothek von B. napus in EMBL-3 (Clontech, Palo Alto, Kalifornien) mit der P. sativum 26g cDNA untersucht. Aus 40.000 analysierten Plaques wurde ein einzelner positiver Klon mit einer Insert-Größe von ungefähr 16 kb identifiziert. Ein 4,4 kb SalI-Fragment, welches das gesamte Gen enthielt, wurde subkloniert. Die Promotor-Sequenz wurde durch die Identifikation von der mRNA-Startstelle unter Verwendung der Primerextension (Ausubel, ibidem) bestimmt und ist in 3 und SEQ ID NR. 1 dargestellt. In 3 ist der Transkriptionsstart fett gedruckt, unterstrichen und durch +1 gekennzeichnet. Die TATA-Box und die CAAT-Box sind fett gedruckt und doppelt unterstrichen. Die postulierten funktionellen Bereiche sind unterstrichen. Die Sequenz von dem btg-26 Promotor, der kodierende Bereich und der 3'-Bereich sind in Stroeher et al., (1995, Plant Mol. Biol. 27: 541–551) dargestellt worden.
  • Expressionsanalyse von btg-26
  • Die Induktion von der btg-26 Expression während Trockenheit wurde durch RNA-Blot-Analyse untersucht. Die eingetopften B. napus Pflanzen wurden natürlich durch Zurückbehaltung des Wassers für verschiedene Zeitspannen dehydriert. Ganze Blätter wurden entweder für die Bestimmung des relativen Wassergehaltes (RWC; relative water content) von individuellen Pflanzen oder für die Isolierung der Gesamt-RNA verwendet. Wie in den
  • 4A und 4B dargestellt, wird die btg-26 Expression schnell während des Wasserverlustes induziert, wobei sie eine sechsfache Steigerung gegenüber der Expression in vollständig hydratisierten Pflanzen bei 81% RWC erreicht, die bis zu einer elffachen Induktion bei 63% RWC ansteigt. Weitere Abnahmen in RWC waren mit einer Abnahme in der Gesamtmenge an btg-26 Transkript verbunden. Bei 30% RWC war die Expression nur 3,5-fach über dem der vollständig hydratisierten Werte.
  • Da andere physiologische Stressfaktoren den intrazellulären Wassergehalt ändern, wurde die btg-26 Expression in B. napus Pflanzen untersucht, die einem Kälte-, einem Hitzeschock- und einem Salzstress ausgesetzt waren. Die RNA-Blot-Analyse wies darauf hin, dass es keine Änderung in der btg-26 Expression gab, wenn die Pflanzen für einen Tag von normalen Wachstumsbedingungen auf 4°C umgesetzt wurden. Jedoch zeigten Pflanzen, die für vier Tage bei 4°C gelassen wurden, eine vier – fünffache Induktion in der btg-26 mRNA. Eine ähnliche Zunahme konnte beobachtet werden, wenn Pflanzen für zwei oder vier Stunden auf 40°C versetzt wurden. Die Ergebnisse sind in 4C dargestellt und demonstrieren, dass die Expression von btg-26 während Temperaturstress induziert wird. Um die Wirkung von Salzstress zu untersuchen, wurden die Pflanzen bis zur Aufnahmefähigkeit für einen oder für vier Tage mit 50 mM, 150 mM oder 450 mM NaCl gewässert. Die Höhe der btg-26 Expression wurde durch 50 mM NaCl unabhängig von der Dauer der Exposition nicht beeinflusst. Das Wachstum in 150 mM NaCl verursachte jedoch eine zweifache Steigerung in der btg-26 mRNA nach vier Tagen. Die Exposition zu 450 mM NaCl verursachte die bemerkenswerteste Induktion, zwölffach nach einem Tag, die auf vierfach nach vier Tagen wieder abfiel. Es wird hier auf 4D hinsichtlich der Northern-Blots verwiesen, welche diese Ergebnisse zeigen.
  • Letztendlich reagieren viele trockenheits-induzierte Gene ebenfalls auf ABA. Um die Rolle von ABA in der btg-26 Expression zu untersuchen, wurde die Gesamt-RNA von einzelnen Blättern isoliert, die mit oder ohne ABA behandelt waren. In diesen Experimenten wurden die Blätter an dem Blattstiel abge schnitten und in eine Lösung aus 0 μM, 50 μM oder 100 μM ABA (gemischte Isomere, Sigma), 0,02% Tween-20 und pH 5,5 für 24 Stunden gelegt. Wie in 4E dargestellt, wird die btg-26 Expression 2,5-fach induziert, wenn eine Exposition mit 100 μM ABA durchgeführt wird. Es wird jedoch keine Expression beobachtet, wenn die Blätter 50 μM ABA ausgesetzt werden (Daten nicht dargestellt). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass btg-26 auf ABA reagiert, aber dass diese Ansprechbarkeit konzentrationsabhängig ist.
  • Beispiel 2: Erzeugung von trockenheits-induzierter Stickstoff-Assimilation
  • Konstrukte
  • Dieser Schritt beinhaltet die Herstellung von entweder konstitutiven oder trockenheits-induzierten AlaAT-Konstrukten und die Einführung von ihnen in Brassica napus unter Verwendung von Agrobacterium-vermittelter genetischer Transformation. Der Ansatz des Einführens von spezifischen Sense- oder Antisense-cDNA-Konstrukten in Pflanzen, um spezielle metabolische Signalwege zu verändern, ist in einer Anzahl von Spezies verwendet worden und ebenfalls um eine Anzahl von unterschiedlichen Signalwegen zu verändern. (Für einen Übersichtsartikel siehe Stitt & Sonnewald 1995; Ann. Rev. of Plant Physiol. und Plant Mol. Biol. 46: 341–368). Die AlaAT-cDNA wurde unter der Kontrolle von drei verschiedenen Promotoren eingeführt: (1) Dem CaMV-Promotor, von dem gezeigt wurde, dass er ein starker konstitutiver Promotor in einer Anzahl von unterschiedlichen Pflanzenspezies ist; (2) Dem btg-26-Promotor, welcher in Beispiel 1 beschrieben wurde und (3) dem trg-31-Promotor, der aus der Tabakpflanze durch Guerrero und Crossland (ibidem) isoliert wurde. Der CaMV-Promotor sollte in der konstitutiven Überexpression von AlaAT resultieren, während hingegen btg-26 und trg-31 eine Überexpression von AlaAT nur unter den Bedingungen von einem spezifischen Stress, einschließlich Trockenstress, induzieren sollten.
  • Plasmid-Konstrukte
  • Der AlaAT-cDNA-Klon 3A aus der Gerste (wie in 5 dargestellt und Muench und Good, ibidem) wurde in den pT7T3-19U-Vektor (Pharmacia, Kanada) geklont und für die ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung von zwei spezifischen Primern eingesetzt. Primer 1 führte eine BamH1-Restriktionsseite zwischen den Nukleotiden 48–53 ein, während Primer 2 verwendet wurde, um eine zweite BamH1-Restriktionsseite zwischen den Nukleotiden 1558–1563 einzuführen (siehe 5). Das 1510 bp Fragment wurde anschließend in den Vektor p25 (6) geklont, der mit BamH1 geschnitten worden war. Der p25 war ein Geschenk von Dr. Maurice Moloney (Univ. of Calgary, Calgary, Alta., Kanada). Dieses Konstrukt enthält den doppelten CaMV35S-Promotor, von welchem gezeigt worden ist, dass er hohe konstitutive Spiegel der Expression ergibt, und den NOS-Terminator, der in der Kpn1- und Pst1-Seite von pUC19 mit einem BamH1-, XbaI- und PvuI-Polylinker zwischen der CaMV- und der NOS-Region von dem Plasmid eingesetzt worden ist. Das sich ergebende Plasmid wurde pCa2/AlaAT/NOS genannt, wie in 7A gezeigt.
  • Die Plasmide ptrg-31/AlaAT/NOS und pbtg-26/AlaAT/NOS wurden wie folgt erzeugt. Der trg-31 Promotor wurde als ein 3,0 kb XbaI/BamH1-Fragment in die XbaI/BamH1-Stelle von pCa2/AlaAT/NOS subkloniert, der mit XbaI/BamH1 verdaut worden war, um nur den CaMV-Promotor freizusetzen, was in einem 3 kb Promotorfragment resultierte, das vor den AlaAT-kodierenden Bereich eingesetzt wurde. Btg-26/AlaAT/NOS wurde erzeugt durch Einsetzen von einer BamH1-Seite bei den Nukleotiden +9 bis +14 (siehe 3) und subklonieren von dem 330 bp Kpn1/BamH1-Fragment (von –320 bis +10 in 3) in die Kpn1/BamH1-Seite von pCa2/AlaAT/NOS, welcher verdaut worden war, um den CaMV-Promotor freizusetzen. Die Plasmidkonstrukte pbtg-26/AlaAT/NOS und ptrg-31/AlaAT/NOS können in den 7B, beziehungsweise 7C angesehen werden.
  • Transformation und Analyse von Brassica napus Pflanzen mit AlaAT-Konstrukten Sobald die drei Plasmide, wie in den 7A, 7B und 7C dargestellt, welche das AlaAT-Gen enthalten, durch die Restriktionsanalyse und Sequenzierung bestätigt worden waren, wurden sie in den Transformationsvektor pCGN1547 (8) subkloniert. PCGN1547 ist ein binärer Vektor aus Agrobacterium, der durch McBride und Sunlmerfelt (1990, Plant Mol. Biol. 14: 269–276) entwickelt wurde. pCGN1547 enthält das Neomycin-Phosphotransferase-II Gen (NPTII), welches die Kanamycin-Resistenz kodiert. Diese Konstrukte wurden anschließend in den Agrobacterium Stamm EHA101 mittels Elektroporation unter Verwendung von dem Protokoll von Moloney et al. (1989, Plant Cell Reports 8: 238–242) eingeführt. Die Bestätigung, dass Agrobacteri um mit dem pCGN1547-Vektor, der das spezifische Konstrukt enthält, transformiert worden war, wurde mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt.
  • Es wurden transgene Pflanzen unter Verwendung eines Keimblatt-Transformationsansatzes, wie bei Moloney et al. (ibidem) beschrieben, hergestellt. Die Kanamycin-resistenten Pflänzchen wurden auf Erdboden übertragen und dann wachsen lassen. Die Anfangsgeneration, oder die primären Transformanten, wurden als die T0-Generation bezeichnet und es wurde ihnen gestattet, sich durch Selbstbestäubung zu vermehren. Jede nachfolgende Generation wurde in Tüten eingepackt, um die Selbstung zu gewährleisten und als die T1-, beziehungsweise T2-Generation bezeichnet. Alle vermeintlichen T0-transgenen Pflanzen wurden auf die Einführung von dem Agrobacterium-Konstrukt unter Verwendung von PCR-Primern, welche das NPTII-Gen amplifizieren, hin untersucht und durch Testen auf NPTII-Aktivität wie durch Moloney et al. (ibidem) beschrieben.
  • Analyse von transformierten Brassica Pflanzen, welche die AlaAT-Konstrukte enthalten
  • Die transgenen Pflanzen wurden auf ihre AlaAT-Aktivität folgendermaßen untersucht. Es wurden die Extraktionen auf Eis durchgeführt, wie es kürzlich beschrieben wurde (Good und Crosby, 1989, Plant Physiol. 90: 1305–1309). Das Blattgewebe wurde gewogen und mit Sand in einem Mörser mit dem Pistill in einem Extraktionspuffer vermahlen, der 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5), 10 mM Dithiothreitol, 15% Glycerol und 10% (w/v) PVPP enthielt. Der Extrakt wurde durch Zentrifugation bei 6.000 min–1 geklärt und der Überstand wurde auf die Enzymaktivität hin untersucht. Die AlaAT-Tests wurden in der Alanin-zu-Pyruvat-Richtung, wie es kürzlich beschrieben wurde (Good und Crosby, ibidem), durchgeführt, unter Verwendung von Alanin zum Starten der Reaktion.
  • Nach der Transformation von 20 Ca2/AlaAT/NOS, 24 btg-26/AlaAT/NOS und 21 trg-31/AlaAT/NOS wurden Pflanzen hergestellt, welche transformiert zu sein schienen, basierend auf der Amplifikation von einem NPTII PCR-Produkt und der NPT-Aktivität. Die AlaAT-Aktivität wurde, unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens, in dem Blattgewebe von verschiedenen von diesen Transformanten gemessen. Wie es aus Tabelle 1 ersichtlich ist, wiesen die btg-26/AlaAT/NOS Pflanzen AlaAT-Aktivitätsspiegel auf, welche in dem Bereich von dem 1,63- bis 3,89-fachen von dem der Wildtyp-Kontrollpflanzen lag. Die CA2/AlaAT/NOS-Pflanzen wiesen Aktivitätsspiegel auf, welche in dem Bereich von dem 1,51- bis 2,95-fachen von dem der Wildtyp-Kontrollpflanzen lag. Die Western-Blots bestätigten, dass die transgenen Pflanzen erhöhte Spiegel von AlaAT aufwiesen, basierend auf der Kreuzreaktivität von einer Bande mit dem AlaAT-Antiköper aus Gerste (nicht dargestellt).
    Tabelle 1: Alanin-Aminotransferase-(AlaAT) Aktivität in primären Transformanten
    Pflanze Aktivität*
    Btg-26/AlaAT/NOS
    Transformant #4 3,89 x
    Transformant #5 1,63 x
    Transformant #7 1,93 x
    Transformant #8 1,98 x
    Transformant #18 1,63 x
    Ca2/AlaAT/NOS
    Transformant #1 1,51 x
    Transformant #2 2,77 x
    Transformant #6 1,61 x
    Transformant #7 2,95 x
    Transformant #9 2,14 x
    Transformant #12 1,91 x
    Transformant #13 177 x
    * Die Enzymaktivität ist relativ zu den Wildtyp-Kontrollen ausgedrückt.
  • Beispiel 3: Wachstum von primären Transformanten unter normalen Bedingungen
  • Die T1-Saat von den primären Transformanten aus den Gruppen CaMV/AlaAT und btg-26/AlaAT wurde zusammen mit den Wildtyp-Kontrollpflanzen unter normalen Bedingungen wachsen lassen, einschließlich dem Einpflanzen bei einer Tiefe von 1 cm in Kunststofftöpfe mit einem Durchmesser von 13 cm, welche eine Erd- und Düngermischung, wie bei Good und Maclagan (ibidem) beschrieben, enthalten. Diese Töpfe wurden in Wachstums-Kammern unter den folgenden Bedingungen platziert: i) 16 Stunden bei 265 mmol m2 Sek–1, bereitgestellt durch VITA-LITE U.H.O. Fluoreszenzlampen, ii) Tag- und Nacht-Temperaturen von 21°C, beziehungsweise 15°C, iii) relative Luftfeuchtigkeit von 85–97% und iv) tägliches Bewässern mit Hoagland's-Lösung der 1/2 Stärke. Der einzige beobachtbare Unterschied, der zwischen den Pflanzen festgestellt wurde, war, dass die btg-26/AlaAT-Pflanzen dickere Stängel aufwiesen, wenn sie mit den Kontrollen und den CaMV/AlaAT-Pflanzen verglichen wurden.
  • Keine bedeutungsvollen Unterschiede wurden zwischen den drei Gruppen hinsichtlich der Wachstumsgeschwindigkeit, der Pflanzen- oder Blattgröße oder der Seneszenz des Blattes bei identischen Zeitpunkten, der Zeit bis zur Reife, der Saatgutgröße oder dem Saatgutertrag festgestellt.
  • Beispiel 4: Wachstum von primären Transformanten unter Stickstoffmangelernährungs-/Trockenheits-Bedingungen
  • Die Tl-Saat von den primären Transformanten aus den Gruppen CaMV/AlaAT und btg-26/AlaAT wurde zusammen mit den Wildtyp-Kontrollpflanzen für vier Wochen unter normalen Bedingungen wachsen lassen wie oben angemerkt), und danach einem Stickstoffmangel unterworfen wurden, indem für drei Wochen nur mit Wasser bewässert wurde, gefolgt von Trockenheit für 3 Tage. Die 9 zeigt repräsentative Pflanzen aus den drei Gruppen nach der Behandlung bei identischen Zeitpunkten. Die Pflanze A ist eine Wildtyp-Kontrollpflanze, die Pflanze B enthält ein CaMV/AlaAT-Konstrukt und die Pflanze C enthält ein btg-26/AlaAT-Konstrukt. Es kann festgestellt werden, dass die Pflanze C (btg-26) deutlich eine schnellere Wachstumsgeschwindigkeit aufweist als die Pflanzen A (Kontrolle) und B (CaMV/AlaAT). Darüber hinaus sind Blätter mit Seneszenz (durch Pfeile gekennzeichnet) an den Pflanzen A und B vorhanden, während die Pflanze C keine Blätter mit Seneszenz aufweist. Zusammengefasst, in den behandelten btg-26/AlaAT-Pflanzen wurde das folgende beobachtet, wenn sie mit den behandelten CaMV/AlaAT- und Kontrollpflanzen verglichen wurden: eine schnellere Wachstumsgeschwindigkeit, größere Pflanzen bei ähnlichen Zeitpunkten, weniger Seneszenz in den unteren Blättern, eine frühere Reife, dickere Stängel, größeres Saatgut und höhere Saatguterträge.
  • Beispiel 5: Gewebe-spezifische Expression von Genen unter Verwendung des btg-26 Promotors
  • Um zu bestimmen, ob die Gene unter der regulatorischen Kontrolle von dem btg-26-Promotor in einer gewebespezifischen Art und Weise exprimiert werden, wurden Experimente durchgeführt, in denen die Spiegel von dem exprimierten Proteinprodukt von einem Transgen, das unter die Kontrolle von dem btg-26-Promotor gestellt wurde, entweder in den Schösslingen oder den Wurzeln von einer transgenen Pflanze, die das btg-26-Konstrukt enthält, gemessen wurden. Es wurden sowohl ein Reportergen (GUS) als ebenfalls ein funktionelles Gen von Inte resse (AlaAT) verwendet und die Expression von ihren entsprechenden Proteinprodukten entweder in den Pflanzenschösslingen oder den Wurzeln der transgenen Pflanzen sowohl qualitativ als ebenfalls quantitativ bestimmt.
  • Herstellung der btg-26/GUS transgenen Pflanzen
  • Die Pflanzen, welche das GUS-Reportergen unter der regulatorischen Kontrolle von dem btg-26-Promotor exprimieren, wurden hergestellt. Zuerst wurde ein btg-26/GUS-Plasmid durch Einfügen von einem 300 bp Kpn1/BamH1 btg-26-Promotor-Fragment in die Kpn1/BamH1-Stelle von pBI101, welches verdaut worden war, um den CaMV-Promotor freizusetzen, erzeugt. Dieses Plasmid wurde anschließend in den Transformationsvektor pCGN1547 subkloniert, welcher in den Agrobacterium-Stamm EHA101 mittels Elektroporation unter Verwendung von dem Protokoll von Moloney et al. (ibidem) eingeführt wurde. Die Bestätigung, dass die Brassica-Pflanzen transformiert worden waren, wurden erhalten durch a) die PCR-Amplifikation von dem NPTII-Gen, welches für die Neomycin-Phosphotransferase kodiert, und b) mittels Testen auf NPTII-Aktivität, wie beschrieben bei Moloney et al. (ibidem). Es wurde den transgenen Pflanzen die Selbstbestäubung ermöglicht und danach die T1-Pflanzen der Selbstung unterzogen, um das T2-Saatgut zu produzieren. Das T2-Saatgut wurde unter Verwendung von einem Kanamycin-Resistenztest (Moloney et al., 1989, supra) untersucht, um zu gewährleisten, dass das Saatgut homozygot war.
  • GUS-Anfärbung von btg-26/GUS transgenen Linien in vivo
  • Um die Gewebeverteilung von der Expression des GUS-Gens aus dem btg-26/GUS-Konstrukt innerhalb der transgenen Pflanzen, die in dem vorherigen Abschnitt beschrieben wurden, zu bestimmen, wurde die Aktivität von GUS in den unterschiedlichen Geweben durch die Verwendung von einer kolorimetrischen Reaktion nachgeprüft, deren Ergebnisse visuell abgeschätzt werden können. Die Pflanzen wurden gekeimt und hydroponisch unter sterilen Bedingungen in modifiziertem Long Ashton-Medium (Savidov et al. 1998) in Magenta-Gläsern, welche mit Luft durchsprudelt wurden, wachsen lassen. Die fünf Wochen alten Pflanzen wurden auf in vivo GUS-Aktivität angefärbt durch Ersetzen der MS-Medien mit 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7,5), der 0,2 mM X-Gluc (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-glucuronsäure) enthielt, und Inkubieren der Pflanzen in diesem Medium für 24 Stunden. Das Wurzelgewebe wurde dann unter einem Sezier-Mikroskop bei der angegebenen Vergrößerung betrachtet und danach Fotos davon gemacht. Wie in 10 dargestellt, lenkt der btg-26 Promotor die Expression von einem Reportergen (GUS) in den Wurzelhaaren (Feld B) und einer einzelnen Schicht von epidermalen Zellen in den Wurzeln (Felder C und D). Darüber hinaus lenkt der Promotor die Expression in der Wurzelspitze, dem Zellteilungsbereich und dem Bereich der Zellexpansion (Felder A–D).
  • GUS-Anfärbung von btg-26/GUS transgenen Linien in vitro
  • Der oben beschriebene Anfärbungs-Test gestattete eine qualitative, visuelle Analyse von dem Expressionsmuster von dem btg-26/GUS-Konstrukt in den unterschiedlichen Geweben von der transgenen Pflanze. Um eine quantitative Analyse von der Gewebeverteilung der btg-26-gelenkten Expression zu erhalten, wurden die Spiegel von der GUS-Aktivität in den unterschiedlichen Geweben von der transgenen Pflanze ebenfalls gemessen. Die Pflanzen wurden wie oben beschrieben (GUS-Anfärbung von transgenen btg-26/GUS-Linien in vivo) wachsen lassen und das Gewebe wurde geerntet und in GUS-Testpuffer zerrieben. Die in vitro GUS-Aktivität wurde wie bei Gallagher, S. R. (1992) GUS Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression. Academic Press: New York, ISBN 0-12-274010-6, gemessen. Wie in 11 dargestellt, lenkt der btg-26-Promotor die Expression von einem Reportergen (GUS) in dem Wurzelgewebe signifikant stärker als in dem Schösslings- (Blatt-) Gewebe (zwischen etwa zweifach und etwa 20-fach stärker).
  • Unterschiedliche Expression von dem AlaAT-Transgen in den Wurzeln und Blättern von den transgenen btg-26/AlaAT-Linien Um zu bestimmen, ob das btg-26/AlaAT-Konstrukt, welches kürzlich beschrieben wurde, in einer gewebespezifischen Art und Weise, ähnlich zu der von dem btg-26/GUS-Konstrukt, exprimiert wird, wurde die Expression von AlaAT in dem Wurzel- und Blattgewebe von den transgenen Pflanzen durch Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) festgestellt. Diese Methodologie ermöglicht den sensitiven Nachweis des Vorhandenseins von AlaAT-mRNA und, gekoppelt mit densitometrischen Methoden, gestattet sie die Quantifizierung von dem translatierten Produkt in einem bestimmten Gewebe von der transgenen Pflanze.
  • Die unterschiedliche Expression von dem AlaAT-Transgen in den Wurzeln und Blättern von den transgenen btg-26/AlaAT-Linien wurde unter Verwendung von RT-PCR wie in den gewöhnlichen Molekularprotokollen beschrieben, durchgeführt. 12 stellt eine Southern-Blot-Analyse von den RT-PCR-Produkten aus der Blatt- und Wurzel-RNA dar. Das Blattgewebe wurde von 5 Wochen alten Pflanzen geerntet, welche wie oben beschrieben (GUS-Anfärbung von transgenen btg-26/GUS-Linien in vivo) wachsen lassen wurden, während hingegen das Wurzelgewebe von Pflanzen geerntet wurde, die wie nachfolgend beschrieben (Unterschiedliche Expression von dem AlaAT-Transgen in dem Wurzelgewebe von den transgenen btg-26/AlaAT-Linien) wachsen lassen wurden. Mit Primern wurde ein 381 bp Produkt an dem 5'-Ende von dem AlaAT-Transgen und ein 311 bp Produkt amplifiziert, welches keine Homologie zu der AlaAT-cDNA aufweist. Basierend auf der relativen Densitometrie von dem 381 bp Produkt (gekennzeichnet unterhalb von jeder Spur in 12) ist es offensichtlich, dass der btg-26-Promotor die Expression von dem Transgen vorzugsweise (1,25- bis 2,8-fach größere Expression) in dem Wurzelgewebe in denjenigen transgenen Linien lenkt, welche den N-effizienten Phänotyp aufweisen (und infolgedessen bekannt sind, das AlaAT-Proteinprodukt zu exprimieren).
  • Unterschiedliche Expression von dem AlaAT-Transgen in dem Wur zelgewebe von transgenen btg-26/AlaAT-Linien
  • Die visuelle Bestätigung von den obigen Ergebnissen wurde mittels der Immunolokalisation von dem AlaAT-Proteinprodukt in den Wurzelgeweben von Pflanzen, welche das btg-26/AlaAT-Konstrukt enthielten, erreicht. Die Pflanzen wurden hydroponisch in modifiziertem Long Ashton-Medium (Savidov et al. 1998, Plant Sci. 133: 33–45) in einer Anzuchtkammer (18 Grad Celsius, 350 uE, 16 Std. Licht/8 Stunden Dunkelheit) wachsen lassen. Die Wurzeln wurden nach 5 Wochen herausgeschnitten und unter der Verwendung von einem AlaAT-Antikörper angefärbt. Das Anfärben beinhaltet das Einbetten der Wurzeln in Paraffin, das Schneiden mit einem Mikrotom und das anschließende Verwenden von einem AlaAT-spezifischen Antikörper (Muench, D. G. und A. G. Good (1994) Plant Mol. Biol. 24: 417–427) und einem Ziege-Anti-Kaninchen Peroxidase-Sekundärantikörper, wie in den gebräuchlichen Immunolokalisierungsprotokollen beschrieben.
  • Spezifischer, die Gewebe wurden in FAA (50% Ethanol, 5% Essigsäure, 10% Formalin) fixiert, in tert-Butanol entwässert und in Paraffin eingebettet. Schnitte mit einer Dicke von 10 Mikrometern wurden in Xylol entparaffiniert, anschließend wurden sie rehydriert und mit PBS, das 3% Trockenmilch ohne Fett enthält, für 3 Stunden geblockt. Die Schnitte wurden auf Glas-Objektträgern, die mit Poly-L-Lysin beschichtet waren, um die Adhäsion zu unterstützen, aufgezogen. Der Antikörper wurde 1:100 mit PBS verdünnt und dieser verdünnte Antikörper wurde anschließend mit den auf Objektträgern aufgezogenen Schnitten für 1 Stunde inkubiert. Nach der Inkubation wurden diese Gewebeschnitte äußerst gründlich mit PBS gewaschen. Die Gewebeschnitte wurden darauf folgend für 1 Stunde mit einem Anti-IgG-Sekundärantikörper (verdünnt 1:300 in PBS) inkubiert, der mit alkalischer Phosphatase gekoppelt ist. Die Farbentwicklung wurde in AP-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) unter der Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) (0,005% [w/v]) und Nitroblautetrazolium (NBT) (0,01% [w/v]) als Substrate durchgeführt. Die entwickelten Schnitte wurden entwässert und aufgezogen. Wie in 18 dargestellt, exprimierten die btg-26/AlaAT-Pflanzen das AlaAT-Gen in einer ähnlichen Art und Weise zu derjenigen, die in den transgenen btg-26/GUS-Pflanzen zu sehen war, wobei das gewebespezifische Expressionsmuster identisch war (siehe 18).
  • Unterschiedliche Expression von dem AlaAT-Transgen in dem Blattgewebe von den transgenen btg-26/AlaAT-Linien Die gewebespezifische Expression von dem AlaAT-Transgen in den Blättern von transgenen Pflanzen, welche das btg-26/AlaAT-Konstrukt enthielten, das davor mittels RT-PCR (siehe oben) identifiziert worden war, wurde durch die Verwendung von spektroskopischen Tests bestätigt, welche die enzymatische Aktivität von AlaAT in den Extrakten von den Blättern aus den transgenen und den Kontrollpflanzen messen. Die Pflanzen wurden in einer Standard-Eintopfmischung (Sand, Torfmoos, Erde und langsam freisetzender Dünger, N/P/K) mit oder ohne eine zusätzliche Stickstoff-Behandlung wachsen lassen. Die Pflanzen wurden für 5 Wochen in einer Anzuchtkammer unter Standardbedingungen wachsen lassen und danach wurden FG (Frischgewicht), TG (Trockengewicht), Blattfläche und Stängeldurchmesser gemessen. Die Blattproteine wurde mittels Zermahlen des Blattgewebes (0,2 Gramm/ml) mit dem Pistill in einem Mörser in Extraktionspuffer (0,1 M Tris-HCl, pH 8,0), der 10 mM Dithiothreitol und 10% Glycerol enthält, extrahiert. Die AlaAT-Aktivität wurde im Wesentlichen wie beschrieben (Good und Muench, supra) spektralphotometrisch untersucht. Die Reaktionsmischung enthielt 5 mM 2-Oxoglutarat, 0,1 mM NADH, 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 Einheiten an LDH (Sigma L1254) und 20 μl Enzymextrakt auf ein Endvolumen von 1 mL. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 25 mM Alanin gestartet und die Absorptionsänderung wurde bei 340 nm und 21°C gemessen. Wie aus 13 ersichtlich ist, weisen die transgenen btg-26/AlaAT-Pflanzen gesteigerte Spiegel der AlaAT-Aktivität in dem Blattgewebe auf.
  • Unterschiedliche Induktion von dem AlaAT-Transgen in den Pflanzenschösslingen und Wurzeln unter der Verwendung von Salz
  • Es war demonstriert worden (Beispiel 1), dass die Expression von Genen unter der Kontrolle von dem btg-26-Promotor durch die Behandlung mit NaCl, in einer konzentrationsabhängigen Art und Weise, angeschaltet werden konnte. Um zu bestimmen, ob die gewebespezifische Expression von AlaAT in Pflanzen, welche für das btg-26/AlaAT-Konstrukt transgen sind, ebenfalls durch eine Salzbehandlung herbeigeführt werden könnte, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Die Pflanzen wurden hydroponisch in einer modifizierten Long Ashton's Nährlösung, welche 0,5 mM Nitrat enthielt, innerhalb von Anzuchtskammern in 60-Liter Tanks wachsen lassen. Nach einem Alter von 4 Wochen wurden unterschiedliche Konzentrationen an Salz zu den Medien hinzugefügt und der Spiegel von der AlaAT-Aktivität 36 Stunden nach der Zugabe von NaCl gemessen, wie beschrieben bei Good und Muench (1992, ibidem). Die Ergebnisse sind in den 14 und 15 dargestellt. während in den Schösslingen und den Wurzeln des Wildtyps, die salzbehandelten Pflanzen eine erniedrigte AlaAT-Aktivität gegenüber den nicht behandelten Kontrollen aufwiesen, offenbaren sowohl die salzbehandelten transgenen btg-26/AlaAT Schösslinge als ebenfalls die Wurzeln bedeutungsvolle Zunahmen in der AlaAT-Aktivität gegenüber den nicht behandelten Kontrollen (siehe z. B 18). Dies demonstriert, dass die Expression von dem AlaAT-Gen in dem Wurzel- und Schösslings-Gewebe durch die Zugabe von einer induzierenden Verbindung, in diesem Falle NaCl, angeschaltet werden kann.
  • Die unterschiedliche Expression des AlaAT-Gens, wenn sie durch Salz induziert wird, resultiert in gesteigerten Wachstumsraten, verglichen mit den nicht-transformierten Kontrollen Es war vorangehend sichergestellt worden (Beispiel 4), dass die Pflanzen, welche das btg-26/AlaAT-Konstrukt in sich tragen, in ihrem Wachstum sichtbar gegenüber den Konztrollpflanzen unter den Bedingungen wie Stickstoffmangel oder Trockenheit verbessert waren. Die oben wiedergegebenen Ergebnisse veranschaulichen, dass die AlaAT-Expression, wie sie durch den btg-26-Promotor gelenkt wird, nicht nur für die Pflanzenschösslinge (siehe 14), sondern ebenfalls für die Wurzeln (siehe 18) gewebespezifisch ist. Es wurden Experimente durchgeführt, um quantitativ zu bestimmen, ob die unmittelbare Behandlung von transgenen Pflanzen, welche das btg-26/AlaAT-Konstrukt enthalten, mit NaCl in einer ähnlichen Wachstumswirkung in einem oder in beiden von den Pflanzengeweben resultiert, von denen nachgewiesen wurde, dass sie eine signifikante AlaAT-Expression aufweisen (z. B. in Schösslingen und Wurzeln). Die Pflanzen wurden hydroponisch innerhalb von Anzuchtskammern in 60-Liter Tanks (wie oben beschrieben) in einer modifizierten Long Ashton's Nährlösung, welche 0,5 mM Nitrat enthielt, wachsen lassen. Nach einem Alter von 4 Wochen wurden unterschiedliche Konzentrationen an Salz zu den Medien hinzugefügt und das Frischegewicht und das Trockengewicht von den Wurzeln gemessen. Wie in 16 dargestellt, findet ein verstärktes Wachstum (wie durch die Biomasse gemessen) in Pflanzen, welche das AlaAT-Gen in dem Wurzelgewebe (Felder B und D) exprimieren, durch das Hinzufügen von einer induzierenden Verbindung (wie zum Beispiel NaCl) statt, wenn mit den Wildtyp-Kontrollpflanzen unter gleichartigen Bedingungen (Felder A und C) verglichen wird. Diese Wachstumswirkung ist so hinreichend signifikant, dass sie optisch wahrgenommen wird (17); die btg-26/AlaAT-Pflanzen, welche für 2 Wochen nach einem Alter von 4 Wochen mit 100 mM NaCl behandelt wurden, dargestellt auf der rechten Seite von der Figur, sind sichtbar im Wachstum gegenüber den Wildtyp-Pflanzen verbessert, die unter denselben Bedingungen behandelt wurden, dargestellt auf der linken Seite von der Figur.
  • Beispiel 6: Wirkung der Expression von btg-26/AlaAT in Pflanzen auf die Biomasse und den Saatgutertrag.
  • Die transformierten Brassica napus Pflanzen, die btg26/AlaAT enthalten, wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. Die transgenen und die nativen Pflanzen (Westar) wurden innerhalb von Parzellen unter ackerbaulichen Standard verfahren gepflanzt und unter Freilandbedingungen in der Anwesenheit oder Abwesenheit von zugesetztem Stickstoff wachsen lassen. Zu dem Zeitpunkt der Pflanzung enthielt der Erdboden 15,9 bis 22,7 kg (35 bis 50 lbs) an verfügbarem Stickstoff/Morgen Ackerland. Die Kontrollgruppe von den Pflanzen (gekennzeichnet als „niedrig" in den 19A und B) wurde mit etwa 9 kg (20 lbs)/Morgen Kalium (K), 20,4 kg (45 lbs)/Morgen Phosphor (P) und 0 kg (0 lbs)/Morgen Stickstoff (N) gedüngt. Die behandelten Pflanzen (gekennzeichnet als „hoch" in den 19A und B) wurden mit etwa 9 kg (20 lbs)/Morgen Kalium (K), 20,4 kg (45 lbs)/Morgen Phosphor (P) und 45,3 kg (100 lbs)/Morgen Stickstoff (N) gedüngt. Das Pflanzenmaterial, das während der generativen Entwicklungsphase erhalten wurde, wurde für die Bestimmungen der Gesamtmenge der Pflanzenbiomasse (Frisch- und Trockengewichte wurden bestimmt) verwendet. Der Saatgutertrag wurde auf einer Pro-Parzellen-Basis bestimmt.
  • Wie unter Bezugnahme auf 19A gesehen werden kann, nahm die gesamte Pflanzenbiomasse in den Kontrollpflanzen in der Anwesenheit von „hoch" Stickstoff zu, wenn sie mit der von Pflanzen verglichen wurde, die keinen zusätzlichen Stickstoff (N) („niedrig" in 19A) erhalten hatten. Die transgenen Pflanzen, welche btg-26/AlaAT exprimieren (53F und 81B), weisen jedoch ähnliche Erträge auf, ungeachtet der Verfügbarkeit von Stickstoff (N). Darüber hinaus waren die Erträge, die bei den transgenen Pflanzen in der Anwesenheit („hoch") oder der Abwesenheit („niedrig") von zusätzlichem Stickstoff (N) beobachtet wurden, äquivalent zu den Kontrollpflanzen, die Stickstoff (N) („hoch") erhielten. 19A stellt die Ergebnisse von der Pflanzenbiomasse auf der Basis des Trockengewichtes dar, ähnliche Ergebnisse wurden auf der Basis des Frischgewichtes beobachtet. Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass die ektopische Expression von einem Gen, welches ein Enzym kodiert, das mit der Assimilation oder dem Stoffwechsel von Stickstoff verbunden ist, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf AlaAT, in einer gesteigerten Pflanzenbiomasse unter einer Reihe von Stickstoff- (N-) Bedingungen resultiert.
  • Unter Bezugnahme auf 19B kann erkannt werden, dass die Kontrollpflanzen, welche zusätzlichen Stickstoff (N) erhalten hatten, einen höheren Ertrag an Saatgut produzierten als diejenigen Pflanzen, die unter gleichartigen Bedingungen wachsen lassen wurden, die aber keinen zusätzlichen Stickstoff (N) erhielten. Die transgenen Pflanzen, welche btg-26/AlaAT exprimierten, wiesen jedoch höhere Erträge auf als die Kontrollpflanzen in der Anwesenheit oder Abwesenheit von zusätzlichem Stickstoff (N). Darüber hinaus waren die Erträge, welche bei den transgenen Pflanzen beobachtet wurden, mit entweder hohem oder niedrigem Stickstoff (N) gleichwertig. Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass die ektopische Expression von einem Gen, welches ein Enzym kodiert, das mit der Assimilation oder dem Stoffwechsel von Stickstoff verbunden ist, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf AlaAT, in einem gesteigerten Saatgutertrag unter einer Reihe von Stickstoff- (N-) Bedingungen resultiert.
  • Zusammengefasst weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass transgene Pflanzen, die ektopisch ein Enzym exprimieren, das in der Assimilation oder dem Stoffwechsel von Stickstoff eingebunden ist, in der Lage sind, die Verwertung von zur Verfügung stehendem Stickstoff unter einer Reihe von Bedingungen für den zur Verfügung stehenden Stickstoff zu optimieren, wodurch eine Steigerung in der Pflanzenbiomasse, dem Saatgutertrag oder einer Kombination daraus resultiert.

Claims (12)

  1. Ein Verfahren zum Lenken einer Wurzel-spezifischen Expression eines Zielgens, umfassend: Erzeugen einer Pflanze aus einer transformierten Pflanzenzelle derart, dass die Expression eines Zielgens vorzugsweise in der Wurzel stattfindet, wobei die transformierte Pflanzenzelle ein Zielgen in Wirkverbindung mit einem Brassica-Turgor-Gen-26-Promotor-Element, wie es in SEQ ID No. 1 definiert ist, oder einem Fragment desselben, welches die Expression des Zielgens vorzugsweise in die Wurzel lenkt, aufweist.
  2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Expression des Zielgens ferner umweltabhängig oder entwicklungsabhängig reguliert ist.
  3. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Zielgen ein an der Stickstoffassimilation und/oder dem Stickstoffstoffwechsel beteiligtes Enzym kodiert.
  4. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Enzym aus Alanindehydrogenase, Glutaminsynthetase, Asparaginsynthetase, Glutamatsynthase, Asparaginase, Alaninaminotransferase, Aspartataminotransferase und Glutamatdehydrogenase ausgewählt ist.
  5. Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Enzym ausgewählt ist aus Alaninaminotransferase und Aspartataminotransferase.
  6. Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Enzym Alaninaminotransferase ist.
  7. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Pflanze eine Raps-, Gerste-, Mais-, Reis-, Tabak-, Sojabohnen-, Baumwoll-, Luzerne-, Tomaten-, Weizen- oder Kartoffelpflanze ist.
  8. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Fragment von SEQ ID No. 1 das in SEQ ID No. 2 definierte Fragment ist.
  9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Fragment von SEQ ID Nr. 1 das in SEQ ID Nr. 3 definierte Fragment ist.
  10. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Fragment von SEQ ID Nr. 1 das in SEQ ID Nr. 4 definierte Fragment ist.
  11. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Fragment von SEQ ID Nr. 1 das in SEQ ID Nr. 5 definierte Fragment ist.
  12. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Fragment von SEQ ID Nr. 1 das in SEQ ID Nr. 6 definierte Fragment ist.
DE60130866T 2000-01-28 2001-01-29 Wurzel-spezifische expression von ziel-genen in pflanzen Expired - Lifetime DE60130866T2 (de)

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