DE60130799T2

DE60130799T2 - Synthese von 4-aminothalidomid enantiomeren

Info

Publication number: DE60130799T2
Application number: DE60130799T
Authority: DE
Inventors: Anthony Rockville TRESTON; Jamshed H. Columbia SHAH; Robert J. Lexington D'AMATO; Kimberly A. Germantown HUNSUCKER; John Germantown ROUGAS; Barry P. Laurel CONNER; Victor Silver Spring PRIBLUDA; Glenn M. Mt. Airy SWARTZ
Original assignee: Boston Childrens Hospital
Current assignee: Boston Childrens Hospital
Priority date: 2000-11-30
Filing date: 2001-11-30
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2021-12-01
Also published as: US20100280249A1; EP1353672A2; NZ526683A; US7812169B2; DE60130799D1; ATE374609T1; JP4242651B2; PT1353672E; US20080306113A1; EP1353672B1; MXPA03004699A; CA2430669A1; WO2002064083A2; AU2002253795B2; US20040147558A1; DK1353672T3; HK1061354A1; JP2009108077A; AU2007201928A1; CY1107074T1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Herstellen von Enantiomeren von 4-Aminothalidomid. Solche Enantiomere können verwendet werden, um eine unerwünschte Angiogenese in einem Menschen oder Tier zu verhindern. Genauer können solche Enantiomere verwendet werden, um eine unerwünschte Angiogenese, insbesondere bei von Angiogenese abhängigen oder damit verbundenen Krankheiten, durch die Verabreichung von Enantiomeren von 4-Aminothalidomid zu verhindern.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Unter Angiogenese versteht man die Bildung neuer Blutgefäße in ein Gewebe oder Organ hinein. Unter normalen physiologischen Bedingungen läuft die Angiogenese bei Menschen und Tieren nur in sehr spezifischen, beschränkten Situationen ab. Zum Beispiel wird die Angiogenese normalerweise bei der Wundheilung, bei der fötalen und embryonalen Entwicklung und bei der Bildung des Corpus luteum, des Endometriums und der Plazenta beobachtet.
Die Angiogenese wird über ein hochgradig reguliertes System von angiogenen Stimulatoren und Inhibitoren gesteuert. Von der Steuerung der Angiogenese wurde festgestellt, dass sie bei bestimmten Krankheitszuständen verändert ist, und dass in vielen Fällen ein mit den Krankheiten verbundener pathologischer Schaden mit einer ungesteuerten Angiogenese zusammenhängt. Sowohl von gesteuerter als auch ungesteuerter Angiogenese glaubt man, dass sie auf eine ähnliche Weise fortschreiten. Endotheliale Zellen und Perizyten, die von einer Basalmembran umgeben sind, bilden Kapillarblutgefäße. Die Angiogenese beginnt mit der Erosion der Basalmembran durch Enzyme, die von endothelialen Zellen und Leukozyten freigesetzt werden. Anschließend durchtreten endotheliale Zellen, die das Lumen von Blutgefäßen auskleiden, dann die Basalmembran. Angiogene Stimulanzien induzieren die endothelialen Zellen, die erodierte Basalmembran zu durchwandern. Die wandernden Zellen bilden ein von dem Elternblutgefäß abgehenden „Keim", bei dem die endothelialen Zellen die Mitose durchlaufen und proliferieren. Die endothelialen Keime fusionieren miteinander, um Kapillarschleifen zu bilden und dabei ein neues Blutgefäß zu bilden.
Eine hartnäckige, unregulierte Angiogenese tritt bei vielen Krankheitszuständen, Tumormetastasen und dem abnormalem Wachstum von endothelialen Zellen auf. Die diversen pathologischen Krankheitszustände, bei denen eine unregulierte Angiogenese vorliegt, wurden zusammen als von Angiogenese abhängige oder mit Angiogenese verbundene Krankheiten eingruppiert.
Ein Beispiel einer durch Angiogenese vermittelten Krankheit ist die okulare neovaskuläre Krankheit. Diese Krankheit ist durch das Eindringen neuer Blutgefäße in Strukturen des Auges, wie beispielsweise die Retina oder Cornea, gekennzeichnet. Sie ist die häufigste Ursache für Blindheit und an ungefähr zwanzig Augenkrankheiten beteiligt. Bei der altersabhängigen Makuladegeneration werden die mit ihr verbundenen visuellen Probleme durch ein Einwachsen von Aderhautkapillaren durch Schäden in der Bruch'schen Membran mit einer Proliferation von fibrovaskulärem Gewebe unter dem Netzhautpigmentepithel verursacht. Auch diabetische Retinopathie, Frühgeborenenretinopathie, corneale Transplantatabstoßung, neovaskuläres Glaukom und retrolentale Fibroplasie sind mit angiogenem Schaden verbunden. Andere Krankheiten, die mit einer cornealen Gefäßneubildung verbunden sind, umfassen epidemische Keratokonjunktivitis, Vitamin A-Mangel, übermäßiges Tragen von Kontaktlinsen, atopische Keratitis, oben liegende limbische Keratitis, ptegyriale Keratitis sicca, Sjögren'sche Krankheit, Akne rosacea, Phylectenulose, Syphilis, Infektionen mit Mycobakterien, Lipiddegeneration, chemische Verbrennungen, bakterielle Geschwüre, Pilzgeschwüre, Herpes simplex-Infektion, Herpes zoster-Infektionen, Infektionen mit Protozoen, Kaposi-Sarkom, Mooren'sches Geschwür, Terrien'sche marginale Degeneration, marginale Keratolyse, rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus, Polyarteriitis, Trauma, Wegener'sche Sarkoidose, Skleritis, Stevens-Johnson Krankheit, Pemphigoid und radiale Keratotomie.
Mit einer Gefäßneubildung der Retina/Aderhaut verbundene Krankheiten umfassen diabetische Retinopathie, Makuladegeneration, Sichelzellenanämie, Sarkoidose, Syphilis, Pseudoxanthoma elasticum, Paget'sche Krankheit, Venenverschluss, Arterienverschluss, obstruktive Karotiskrankheit, chronische Uveitis/Glaskörperentzündung, Infektionen mit Mycobakterien, Lyme'sche Krankheit, systemischen Lupus erythematosis, Frühgeborenenretinopathie, Eales'sche Krankheit, Behcet'sche Krankheit, Retinitis oder Choroiditis verursachende Infektionen, angenommene okulare Histoplasmosis, infantile Makuladegeneration, Myopie, Sehnerventrichter, Stargardt'sche Krankheit, granulomatöse Uveitis der Pars plana, chronisches Ablösen der Retina, Hyperviskositätssyndrome, Toxoplasmose, Trauma und Komplikationen nach einer Laserbehandlung. Andere die Augen betreffende Krankheiten umfassen Krankheiten, die mit Rubeosis (Gefäßneubildung des Angulus) und durch die abnormale Proliferation von fibrovaskulärem oder fibrösem Gewebe verursachte Krankheiten, die alle Formen von fruchtbarer Vitreoretinopathie umfassen.
Eine andere mit Angiogenese verbundene Krankheit ist die rheumatoide Arthritis. Die Blutgefäße in der Synovialauskleidung der Gelenke durchlaufen Angiogenese. Zusätzlich zum Bilden neuer vaskulärer Netzwerke setzen die endothelialen Zellen Faktoren und reaktive Sauerstoffspezies frei, die zu einem Wachstum des Pannus und zu einer Knorpelzerstörung führen. Die Angiogenese kann auch bei der Osteoarthritis eine Rolle spielen. Die Aktivierung der Chondrozyten durch die Angiogenese betreffende Faktoren trägt zur Zerstörung des Gelenkes bei. In einer späteren Phase fördern die angiogenen Faktoren ein neues Knochenwachstum. Ein therapeutisches Eingreifen, das die Knochenzerstörung verhindert, könnte das Fortschreiten der Krankheiten anhalten und Personen, die an Arthritis leiden, Erleichterung verschaffen.
An einer chronischen Entzündung kann auch eine pathologische Angiogenese beteiligt sein. Krankheiten wie beispielsweise Colitis ulcerosa und Crohn'sche Krankheit zeigen mit dem Einwachsen neuer Blutgefäße und den entzündeten Geweben histologische Veränderungen. Die Bartonelose, eine bakterielle Infektion, die in Südamerika gefunden wird, kann zu einer chronischen Phase führen, die durch eine Proliferation vaskulärer endothelialer Zellen gekennzeichnet ist. Bei der Atheriosklerose wird eine weitere pathologische Rolle festgestellt, die mit der Angiogenese verbunden ist. Von den innerhalb des Lumens von Blutgefäßen gebildeten Plaques wurde gezeigt, dass sie eine angiogene stimulierende Aktivität aufweisen.
Die Hypothese, dass das Wachstum von Tumoren von der Angiogenese abhängt, wurde erstmalig 1971 vorgeschlagen. (Folkman, New Eng. J. Med., 285:1182–86 (1971)). In ihrer einfachsten Form sagt diese Hypothese Folgendes aus: „Wenn erstmal eine „Annahme" eines Tumors stattgefunden hat, muss jeder Zunahme der Tumorzellpopulation eine Zunahme neuer Kapillaren vorangehen, die im Tumor zusammenlaufen." Unter der Tumor-„Annahme” versteht man zurzeit, dass sie eine vorvaskuläre Phase von Tumorwachstum anzeigt, in der eine Population von Tumorzellen, die einige Kubikmillimeter Volumen einnehmen und einige Millionen Zellen nicht überschreiten, auf der Grundlage von vorhandenen Mikrogefäßen des Wirtes überleben kann. Die Erweiterung des Tumorvolumens über diese Phase hinaus erfordert die Induktion neuer Kapillarblutgefäße. Zum Beispiel waren pulmonare Mikrometastasen in der frühen vorvaskulären Phase in Mäusen außer durch Mikroskopieuntersuchungen mit hoher Auflösung an histologischen Schnitten nicht nachweisbar.
Beispiele für die indirekten Belege, die dieses Konzept stützen, umfassen:
Die Wachstumsgeschwindigkeit von in subkutane durchsichtige Kammern in Mäusen implantierten Tumoren ist vor der Gefäßneubildung langsam und linear und nach der Gefäßneubildung schnell und nahezu exponentiell (Algire, et al., J. Nat. Cancer Inst., 6:73–85 (1945)).
In isolierten perfundierten Organen herangezogene Tumore, wo Blutgefäße nicht proliferieren, sind auf 1–2 mm³ begrenzt, aber expandieren schnell auf das mehr als 1000-fache dieses Volumens, wenn sie in Mäuse transplantiert werden und eine Gefäßneubildung stattfindet (Folkman, et al., Annals of Surgery, 164:491–502 (1966)).
Das Tumorwachstum in der gefäßlosen Cornea schreitet langsam und mit einer linearen Geschwindigkeit voran, aber wechselt nach der Gefäßneubildung zu exponentiellem Wachstum (Gimbrone, Jr., et al., J. Nat. Cancer Inst., 52:421–27 (1974)).
In der wässrigen Flüssigkeit der anterioren Kammer des Kaninchenauges suspendierte Tumoren bleiben lebensfähig, gefäßlos und auf eine Größe von < 1 mm³ beschränkt. Sobald sie in das vaskuläre Bett der Iris transplantiert werden, findet eine Gefäßneubildung statt und sie wachsen schnell und erreichen innerhalb von 2 Wochen das 16 000-fache ihres ursprünglichen Volumens (Gimbrone, Jr., et al., J. Exp. Med., 136:261–76).
Wenn Tumore auf die Chorioallantoismembran des Hühnerembryos implantiert werden, wachsen sie während einer gefäßlosen Phase von > 72 Stunden langsam, überschreiten aber nicht einen mittleren Durchmesser von 0,93 + 0,29 mm. 24 Stunden nach dem Beginn der Gefäßneubildung tritt eine schnelle Tumorerweiterung auf, und bis zum Tag 7 erreichen diese vaskularisierten Tumore einen mittleren Durchmesser von 8,0 + 2,5 mm (Knighton, British J. Cancer, 35:347–56 (1977)).
Vaskuläre Abdrücke von Metastasen in der Kaninchenleber zeigen eine Heterogenität bei der Größe der Metastasen, zeigen aber einen vergleichsweise einheitlichen Endpunkt hinsichtlich der Größe, bei der die Gefäßbildung vorliegt. Tumore sind im Allgemeinen bis zu einem Durchmesser von 1 mm gefäßlos, unterliegen aber bei einem größeren als diesem Durchmesser einer Gefäßneubildung (Lien, et al., Surgery, 68:334–40 (1970)).
Bei transgenen Mäusen, die Karzinome in den Betazellen der Langerhans'schen Inseln entwickeln, sind prävaskuläre hyperplastische Inseln auf ein Größe von < 1 mm begrenzt. Im Alter von 6–7 Wochen unterliegen 4–10% der Inseln einer Gefäßneubildung und aus diesen Inseln entstehen große vaskularisierte Tumore mit einem Volumen, das mehr als das 1000-fache des Volumens der vorvaskulären Inseln umfasst (Folkman, et al., Nature, 339:58–61 (1989)).
Ein spezifischer Antikörper gegen VEGF (vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor) verringert die Dichte der Mikrogefäße und bewirkt eine „signifikante oder dramatische" Inhibition des Wachstums von drei menschlichen Tumoren, die von VEGF als ihrem einzigen Vermittler der Angiogenese abhängen (bei Nacktmäusen). Der Antikörper inhibiert das Wachstum der Tumorzellen in vitro nicht (Kim et al., Nature, 362:841–44 (1993)).
Ein monoklonaler anti-bFGF-Antikörper bewirkt eine 70%-ige Inhibition des Wachstums eines Maustumors, der von der Sekretion von bFGF als seinem einzigen Vermittler der Angiogenese abhängt. Der Antikörper inhibiert nicht das Wachstum der Tumorzellen in vitro. (Hori, et al., Cancer Res., 51:6180–84 (1991)).
Eine intraperitoneale Injektion von bFGF verstärkt das Wachstum eines primären Tumors und seiner Metastasen durch das Stimulieren des Wachstums von endothelialen Kapillarzellen in dem Tumor. Den Tumorzellen selbst fehlen Rezeptoren für bFGF, und bFGF ist in vitro kein Mitogen für die Tumorzellen (Gross, et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 31:79 (1990)).
Ein spezifischer Inhibitor der Angiogenese (AGM-1470) inhibiert das Wachstum von Tumoren und Metastasen in vivo, ist aber beim Inhibieren der Tumorzellproliferation in vitro viel weniger aktiv. Er inhibiert die Proliferation von vaskulären endothelialen Zellen halbmaximal 4 Logarithmen unter der Konzentration, bei der er die Proliferation von Tumorzellen inhibiert (Ingber, et al., Nature, 48:555–57 (1990)). Es gibt auch indirekte klinische Belege dafür, dass ein Tumorwachstum von der Angiogenese abhängig ist.
Menschliche Retinoblastome, die hinsichtlich des Glaskörper metastatisch sind, entwickeln sich zu gefäßlosen Sphäroiden, die trotz der Tatsache, dass sie lebensfähig sind und ³H-Thymidin einbauen (wenn sie aus einem eingekapselten Auge entfernt und in vitro analysiert werden) auf weniger als 1 mm³ beschränkt sind.
Karzinome der Ovarien metastasieren zu der peritonealen Membran in der Form von winzigen gefäßlosen weißen Samen (1–3 mm³). Diese Implantate wachsen selten auf eine größere Größe heran, bis eines oder mehr als eines von ihnen einer Gefäßneubildung unterliegt.
Die Intensität der Gefäßneubildung beim Brustkrebs (Weidner, et al., New Eng. J. Med., 324:1–8 (1991); Weidner, et al., J. Nat. Cancer Inst., 84:1875–87 (1992)) und beim Prostatakrebs (Weidner, et al., Am. J. Pathol., 143(2):401–09 (1993)) korreliert stark mit dem Risiko einer zukünftigen Metastase.
Eine Metastase aus menschlichem Hautmelanom tritt vor einer Gefäßneubildung selten auf. Der Beginn der Gefäßneubildung führt zu einer größeren Dicke der Verletzung und zu einem erhöhten Risiko einer Metastase (Srivastava, et al., Am. J. Pathol., 133:419–23 (1988)).
Beim Blasenkrebs ist die Konzentration eines angiogenen Proteins, bFGF, im Urin ein empfindlicherer Indikator des Status und des Ausmaßes der Krankheit als die Zytologie. (Nguyen, et al., J. Nat. Cancer Inst., 85:241–42 (1993)).
Somit ist es klar, dass die Angiogenese bei der Metastase von Krebs eine wesentliche Rolle spielt. Wenn die angiogene Aktivität unterdrückt oder beseitigt werden könnte, dann würde der Tumor nicht wachsen, obwohl er anwesend ist. Im Krankheitszustand könnte die Verhinderung von Angiogenese den durch die Invasion des neuen mikrovaskulären Systems verursachten Schaden abwenden. Auf die Steuerung der angiogenen Vorgänge gerichtete Therapien könnten zum Abbruch oder Abwenden dieser Krankheiten führen.
Die Angiogenese wurde mit einer Anzahl verschiedener Krebsarten in Zusammenhang gebracht, einschließlich solider Tumoren und hämatogenen Tumoren. Solide Tumore, mit denen die Angiogenese in Verbindung gebracht wurde, umfassen Rhabdomyosarkome, Retinoblastom, Ewing-Sarkom, Neuroblastom und Osteosarkom. Die Angiogenese ist auch mit hämatogenen Tumoren verbunden, wie beispielsweise Leukämien, Lymphomen, multiplen Myelomen und jeglichen der verschiedenen akuten oder chronischen neoplastischen Krankheiten des Knochenmarks, bei denen eine unbeschränkte Proliferation weißer Blutzellen stattfindet, die normalerweise von einer Anämie, gestörten Blutgerinnung und Vergrößerung der Lymphknoten, der Leber und der Milz begleitet wird. Man glaubt, dass die Angiogenese eine Rolle bei den Abnormalitäten des Knochenmarks spielt, die zum Entstehen von Leukämie und Lymphomtumoren und multiplen Myelomkrankheiten führen.
Eine der häufigsten angiogenen Krankheiten der Kindheit ist das Hämangiom. Ein Hämangiom ist ein Tumor, der aus neu gebildeten Blutgefäßen zusammengesetzt ist. In den meisten Fällen sind die Tumore gutartig und bilden sich ohne ein Eingreifen zurück. In schwereren Fällen bilden sich die Tumore zu großen kavernösen und infiltrierenden Formen weiter und erzeugen klinische Komplikationen. Systemische Formen von Hämangiomen, Hämangiomatosen weisen hohe Sterblichkeitsraten auf. Es gibt gegen Therapien resistente Hämangiome, die mit den zurzeit verwendeten Therapeutika nicht behandelt werden können.
Die Angiogenese ist auch für den Schaden verantwortlich, der bei Erbkrankheiten, wie beispielsweise der Osler-Weber-Rendu-Krankheit oder erblicher hämorrhagischer Teleangiektasie festgestellt wird. Dabei handelt es sich um eine Erbkrankheit, die durch zahlreiche kleine Angiome, Tumore des Blutes oder der Lymphgefäße gekennzeichnet ist. Die Angiome werden in der Haut und in Schleimhautmembranen festgestellt und werden häufig von Epitaxie (Nasenbluten) oder gastrointestinalen Blutungen und manchmal von pulmonaren oder hepatitischen arteriovenösen Fisteln begleitet.
Was daher benötigt wird, ist eine Zusammensetzung, die die Angiogenese inhibieren kann. Was ebenfalls benötigt wird, ist eine Zusammensetzung, die das unerwünschte Wachstum von Blutgefäßen, besonders bei Tumoren, inhibieren kann.
Die Angiogenese ist auch an normalen physiologischen Vorgängen, wie beispielsweise der Reproduktion und der Wundheilung, beteiligt. Die Angiogenese ist ein wichtiger Schritt bei der Ovulation und auch bei der Einnistung der Blastula nach der Befruchtung. Die Verhinderung der Angiogenese könnte verwendet werden, um eine Amenorrhoe zu induzieren, die Ovulation zu blockieren, oder die Einnistung der Blastula zu verhindern.
Bei der Wundheilung kann ein übermäßiges Reparieren oder eine Fibroplasie eine schädliche Nebenwirkung von chirurgischen Eingriffen sein und durch Angiogenese verursacht oder verschlimmert werden. Adhäsionen sind eine häufige Komplikation bei chirurgischen Eingriffen und führen zu Problemen wie beispielsweise einem Dünndarmverschluss.
Es wurden mehrere Verbindungen verwendet, um Angiogenese zu inhibieren. Taylor, et al., (Nature, 297:307 (1982)) verwendeten Protamin, um Angiogenese zu inhibieren. Die Toxizität von Protamin begrenzt seine praktische Verwendung als Therapeutikum. Folkman, et al., (Science, 221:719 (1983) und US-Pat. Nrs. 5,001,116 und 4,994,443 ) haben die Verwendung von Heparin und Steroiden offenbart, um die Angiogenese zu steuern. Von Steroiden wie beispielsweise Tetrahydrocortisol, denen eine glucokortikosteroidartige und mineralkortikosteroidartige Aktivität fehlen, wurde festgestellt, dass sie Inhibitoren der Angiogenese sind.
Andere endogen in Tieren festgestellte Faktoren, wie beispielsweise ein 4 kDa-Glycoprotein aus der Flüssigkeit von Rinderglaskörpern und ein von Knorpel abgeleiteter Faktor, wurden verwendet, um die Angiogenese zu inhibieren. Zelluläre Faktoren, wie beispielsweise Interferon, inhibieren die Angiogenese. Zum Beispiel wurde von Interferon-alpha oder von menschlichem Interferon-beta gezeigt, dass sie die tumorinduzierte Angiogenese in der Mausdermis, die durch menschliche neoplastische Zellen stimuliert wird, inhibieren. Interferon-beta ist auch ein wirksamer Inhibitor der durch allogene Milzzellen induzierten Angiogenese (Sidky, et al., Cancer Res., 47:5155–61 (1987)). Von rekombinantem menschlichen Interferon (alpha/A) wurde berichtet, dass es erfolgreich bei der Behandlung von pulmonarer Hämangiomatose verwendet wurde, einer durch Angiogenese induzierten Krankheit (White, et al., New Eng. J. Med., 320:1197–1200 (1989)).
Andere Agenzien, die verwendet wurden, um Angiogenese zu inhibieren, umfassen Ascorbinsäureether und verwandte Verbindungen. (Japanese Kokai Tokkyo Koho No. 58-13 (1978)). Das sulfatierte Polysaccharid DS 4152 inhibiert die Angiogenese ebenfalls. (Japanese Kokai Tokkyo Koho No. 63-119500). Zusätzliche anti-angiogene Verbindungen umfassen Angiostatin^® ( U.S.-Patente mit den Nummern 5,639,725 ; 5,792,845 ; 5,885,795 ; 5,733,876 ; 5,776,704 ; 5,837,682 ; 5,861,372 und 5,854,221 ) und Endostatin^TM ( U.S.-Patent Nr. 5,854,205 ).
Die US-Patente Nrs. 5,635,517 und 6,316,471 und das internationale Patent Nr. WO 98/03502 der Celgene Corporation offenbaren substituierte 1-Oxo- und 1,3-Dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindoline, von denen angegeben wird, dass sie die Konzentrationen von TNF-α in Säugetieren verringern.
Eine andere Verbindung, von der gezeigt wurde, dass sie eine Angiogenese inhibiert, ist Thalidomid (D'Amato, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:4082–85 (1994)). Thalidomid ist ein Hypnosedativum, das erfolgreich verwendet wurde, um eine Anzahl von mit Angiogenese verbundenen Krankheiten zu behandeln, wie beispielsweise rheumatoide Arthritis (Gutierrez-Rodriguez, Arthritis Rheum., 27(10):1118–21 (1984); Gutierrez-Rodriguez, et al., J. Rheumatol., 16(2):158–63 (1989)), Behcet'sche Krankheit (Handley, et al., Br. J. Dermatol., 127 Ergänzungsbd., 40:67–8 (1992); Gunzler, Med. Hypotheses, 30(2):105–9 (1989)), die Graff-versus-host-Abstoßung (Field, et al., Nature, 211(55):1308–10 (1966); Heney, et al., Br. J. Haematol., 78(1):23–7 (1991)), mycobakterielle Krankheiten (Vicente, et al., Arch. Intern. Med., 153(4):534 (1993)), Herpes simplex- und Herpes zoster-Infektionen (Naafs, et al., Int. J. Dermatol., 24(2):131–4 (1985)), chronische Entzündung, Colitis ulcerosa (Meza, et al., Drug Ther, 23(11): 74–80, 83 (1993); Powell, et al., Br. J. Dermatol., 113 Ergänzungsbd. 28:141–4 (1985)), Lepra (Barnes, et al., Infect. Immun., 60(4):1441–46 (1992)) und Lupus (Burrows, BMJ, 307:939–40 (1993)).
Obwohl Thalidomid bei Erwachsenen minimale Nebenwirkungen aufweist, ist es ein wirksames Teratogen. Daher bestehen Bedenken hinsichtlich seiner Verwendung bei Frauen im gebärfähigen Alter. Obwohl sie minimal sind, gibt es eine Reihe von Nebenwirkungen, die den Wunsch nach der Verwendung von Thalidomid im Rahmen einer Behandlung begrenzen. Eine solche Nebenwirkung ist die Schläfrigkeit. Bei einer Anzahl von therapeutischen Studien musste die anfängliche Dosis Thalidomid verringert werden, weil die Patienten lethargisch wurden und Schwierigkeiten dabei hatten, normal zu arbeiten. Eine andere die Verwendung von Thalidomid begrenzende Nebenwirkung ist die periphere Neuropathie, bei der Patienten an Taubheit und einer Funktionsstörung ihrer Extremitäten leiden.
Daher werden verbesserte Zusammensetzungen benötigt, die einfach verabreicht werden und in der Lage sind, eine Angiogenese zu inhibieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Herstellen von Enantiomeren von 4-Aminothalidomid bereit. Spezifisch stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Herstellen der jeweiligen R(+)- und S(–)-Enantiomere von 4-Aminothalidomid bereit.
Die Enantiomere der vorliegenden Erfindung weisen die folgenden Strukturen auf
Es ist möglich, gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Enantiomere von 4-Aminothalidomid für viele Zwecke zu verwenden. Zusammensetzungen, die Enantiomere von 4-Aminothalidomid umfassen, sind beim Inhibieren einer abnormalen Mitose und/oder einer unerwünschten Angiogenese wirksam.
Diese Zusammensetzungen werden über verschiedene Wege leicht verabreicht, die den oralen Weg umfassen, und können in Dosierungen verabreicht werden, die sicher sind und an inneren Stellen eine mitotische und/oder angiogene Inhibition bereitstellen. Die Zusammensetzungen können zum Behandeln von Krankheiten von Säugetieren verwendet werden, die durch eine unerwünschte und ungesteuerte Mitose und/oder Angiogenese vermittelt werden, durch das Verabreichen einer Zusammensetzung, die eine anti-mitotische und/oder anti-angiogene Verbindung in einer Dosierung umfasst, die ausreichend ist, um die Angiogenese zu inhibieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUR
1 veranschaulicht die Ergebnisse einer XTT-Proliferation mit HS-Sultan-Zellen.
2 veranschaulicht die Ergebnisse von cornealen Mikrotaschen-Tests, die die Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwenden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren zum Herstellen von Enantiomeren von 4-Aminothalidomid gerichtet. Gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Enantiomere können in Zusammensetzungen zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden, die durch abnormale Mitose und/oder Angiogenese vermittelt werden. Wie unten beschrieben, zeigen gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Verbindungen anti-mitotische, anti-angiogene und/oder anti-Tumor-Eigenschaften. Weiterhin wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, um im Wesentlichen enantiomer reines S(–)-4-Aminothalidomid und R(+)-4-Aminothalidomid herzustellen. Die S(–)- und R(+)-Enantiomere von 4-Aminothalidomid weisen anti-mitotische und die Angiogenese inhibierende Eigenschaften auf und sind für die Behandlung einer Anzahl von Krankheiten nützlich, die verschiedene Krebsarten und Makuladegeneration umfassen. S(–)-4-Aminothalidomid zeigte in verschiedenen in vitro- und in vivo-Tumor-Modellen eine wirksame anti-angiogene und anti-Tumor-Aktivität.
Die Enantiomere der vorliegenden Erfindung weisen die folgenden Strukturen auf:
S(–)-4-Aminothalidomid und R(+)-4-Aminothalidomid werden aus den S(–)- bzw: R(+)-Enantiomeren von 4-Nitrothalidomid synthetisiert. S(–)-4-Aminothalidomid wird gemäß dem folgenden Reaktionsschema hergestellt: Synthese von S(–)-4-Aminothalidomid
Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten S(–)- und R(+)-Enantiomere von 4-Aminothalidomid können als pharmazeutisch und physiologisch akzeptable Formulierungen unter Verwendung von Verfahren und Techniken bereitgestellt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Diese Formulierungen können über Standard-Verabreichungswege verabreicht werden. Im Allgemeinen können die Kombinationen über den topischen, transdermalen, oralen, rektalen oder parenteralen (z. B. intravenösen, subkutanen oder intramuskulären) Verabreichungsweg verabreicht werden. Zusätzlich können die Kombinationen in bioabbaubare Polymere eingebaut werden, was eine anhaltende Freisetzung der Verbindung erlaubt, wobei die Polymere in die Nähe der Stelle implantiert werden, an der die Wirkstoffabgabe erwünscht wird, z. B. an der Stelle eines Tumors. Die bioabbaubaren Polymere und ihre Verwendung sind zum Beispiel detailliert in Brem et al., J. Neurosurg. 74:441–446 (1991) beschrieben.
Die Dosierung der Verbindung wird von dem behandelt werdenden Zustand, der besonderen Verbindung und anderen klinischen Faktoren, wie beispielsweise dem Gewicht und Zustand des Menschen oder Tieres und dem Verabreichungsweg der Verbindung abhängen. Es soll verstanden werden, dass die Verbindungen hier sowohl bei der menschlichen als auch bei der veterinärmedizinischen Verwendung Anwendung finden. Zur oralen Verabreichung an Menschen ist eine Dosierung von zwischen ungefähr 0,1 bis 300 mg/kg/Tag, bevorzugterweise zwischen ungefähr 0,5 und 50 mg/kg/Tag und am bevorzugtesten zwischen ungefähr 0,1 bis 2 mg/kg/Tag im Allgemeinen ausreichend.
Die Formulierungen umfassen diejenigen, die für eine orale, rektale, nasale, ophthalmische (umfassend intravitreale oder intracamerale), topische (umfassend bukkale und sublinguale), vaginale oder parenterale (umfassend subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intradermale, intraokulare, intratracheale und epidurale) Verabreichung geeignet sind. Die Formulierungen können praktischerweise in Einheitsdosierungsformen dargestellt werden und durch herkömmliche pharmazeutische Techniken hergestellt werden. Solche Techniken umfassen den Schritt des in-Verbindung-Bringens des aktiven Inhaltsstoffes und des/der pharmazeutischen Träger(s) oder des/der Bindemittel(s). Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch das einheitliche und nahe in-Verbindung-Bringen des aktiven Inhaltsstoffes mit flüssigen Trägern oder fein zerteilten festen Trägern oder beidem und dann, wenn nötig, dem in-Form-Bringen des Produktes hergestellt.
Für die orale Verabreichung geeignete Formulierungen, die die gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisierte Verbindung, nämlich 4-Aminothalidomid, umfassen, können als separate Einheiten, wie beispielsweise Kapseln, Cachet-Kapseln oder Tabletten dargestellt werden, von denen jede eine vorbestimmte Menge des aktiven Inhaltsstoffes umfasst; als ein Puder oder als Granula; als eine Lösung oder eine Suspension in einer wässrigen Flüssigkeit oder einer nicht-wässrigen Flüssigkeit; oder als eine flüssige Emulsion von Öl in Wasser oder eine Emulsion von Wasser in Öl und als Bolus etc.
Eine Tablette kann durch Kompression oder Formpressen hergestellt werden, optional mit einem oder mehr als einem Hilfsinhaltsstoff. Komprimierte Tabletten können durch Komprimieren des aktiven Inhaltsstoffes in einer frei fließenden Form, wie beispielsweise in der Form von Pulver oder von Granula, optional mit einem Binder, Schmiermittel, inerten Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel, oberflächenaktiven oder dispergierenden Agens vermischt in einer geeigneten Maschine hergestellt werden. Formgepresste Tabletten können durch das Formpressen einer Mischung der pulverisierten Verbindung, die mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel angefeuchtet ist, in einer geeigneten Maschine hergestellt werden. Die Tabletten können optional beschichtet oder markiert werden und können derart formuliert sein, dass sie eine langsame oder gesteuerte Freisetzung des darin enthaltenen aktiven Inhaltsstoffes bereitstellen.
Formulierungen, die zur topischen Verabreichung in den Mund geeignet sind, umfassen Pastillen, die die Inhaltsstoffe in einer mit Geschmack versehenen Basis umfassen, üblicherweise Saccharose und arabisches Gummi oder Tragacanth; Pastillen, die den aktiven Inhaltsstoff in einer inerten Basis, wie beispielsweise Gelatine oder Glycerin oder Saccharose oder arabischem Gummi umfassen; und Mundwasser, die den zu verabreichenden Inhaltsstoff in einem geeigneten flüssigen Träger umfassen.
Für die topische Verabreichung auf die Haut geeignete Formulierungen können als Salben, Cremes, Gele und Pasten dargestellt werden, die den zu verabreichenden Inhaltsstoff in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen. Ein transdermales Pflaster, das den zu verabreichenden Inhaltsstoff enthält, ist ein bevorzugtes topisches Abgabesystem.
Formulierungen zur rektalen Verabreichung können als Stuhlzäpfchen mit einer geeigneten Basis dargestellt werden, die zum Beispiel Kakaobutter oder ein Salicylat umfasst.
Zur nasalen Verabreichung geeignete Formulierungen, wobei der Träger ein Feststoff ist, umfassen ein grobes Pulver, das zum Beispiel eine Partikelgröße im Bereich von 20 bis 500 Mikrometer aufweist, das auf die Weise verabreicht wird, auf die Schnupftabak verabreicht wird, d. h. durch schnelle Inhalierung durch die Nasenwege aus einem Behälter des Pulvers, der nahe an die Nase gehalten wird. Geeignete Formulierungen, bei denen der Träger eine Flüssigkeit ist, zur Verabreichung, wie zum Beispiel ein Nasenspray oder Nasentropfen, umfassen wässrige oder ölige Lösungen des aktiven Inhaltsstoffes.
Zur vaginalen Verabreichung geeignete Formulierungen können als Pessarien, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Spray-Formulierungen dargestellt werden, die zusätzlich zu dem aktiven Inhaltsstoff solche Träger beinhalten, von denen auf dem Gebiet bekannt ist, dass sie geeignet sind.
Zur parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen umfassen wässrige und nicht-wässrige sterile Injektionslösungen, die Antioxidanzien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten, die die Formulierung zum Blut des beabsichtigten Empfängers isotonisch machen; und wässrige und nicht-wässrige sterile Suspensionen, die suspendierende Agenzien und verdickende Agenzien umfassen können. Die Formulierungen können in Behältern mit Einheits- oder Vielfachdosierungen dargestellt werden, zum Beispiel versiegelten Ampullen und Glasfläschchen, und können in gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zuständen gelagert werden, die lediglich das Zugeben des sterilen wässrigen Trägers, z. B. Wasser für Injektionen, unmittelbar vor der Verwendung erfordern. Unvorbereitete Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granula und Tabletten der vorangehend beschriebenen Art hergestellt werden.
Bevorzugte Einheitsdosierungsformulierungen sind diejenigen, die eine tägliche Dosis oder Einheit, tägliche Unterdosis, wie hierin oben angegeben, oder einen geeigneten Teil davon, des verabreichten Inhaltsstoffes enthalten.
Es sollte verstanden werden, dass die Formulierungen zusätzlich zu den Inhaltsstoffen, insbesondere den oben erwähnten, andere Agenzien, die auf dem Gebiet mit Bezug auf die Art der Formulierung, die in Frage kommt, üblich sind, umfassen können, zum Beispiel können diejenigen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, mit Geschmack versehende Agenzien umfassen.
Es können durch eine abnormale Zellmitose gekennzeichnete Krankheiten behandelt werden. Weiterhin kann jegliche Krankheit, die durch Angiogenese gekennzeichnet ist, behandelt werden. Solche Krankheiten umfassen: abnormale Stimulation von endothelialen Zellen (z. B. Artheriosklerose), solide Tumore und Tumormetastase, gutartige Tumore, z. B. Hämangiome, Akustikustumore, Neurofibrome, Trachome und pyrogene Granulome, vaskuläre Fehlfunktionen, abnormales Wundheilen, Entzündungs- und Immun-Störungen, Behcet'sche Krankheit, Gicht oder gichtartige Arthritis, abnormale Angiogenese, die Folgendes begleitet: rheumatoide Arthritis, Hautkrankheiten, wie beispielsweise Psoriasis, diabetische Retinopathie und andere okulare angiogene Krankheiten wie beispielsweise Frühgeborenenretinopathie (retrolentale Fibroplasie), Makuladegeneration, corneale Transplantatabstoßung, neuroskulares Glaukom, Leberkrankheiten und Oster-Webber-Syndrom (Osler-Weber-Rendu-Krankheit).
Mit cornealer Gefäßneubildung verbundene Krankheiten, die behandelt werden können, umfassen diabetische Retinopathie, Frühgeborenenretinopathie, corneale Transplantationsabstoßung, neovaskuläres Glaukom und retrolentale Fibroplasien, epidemische Keratokonjunktivitis, Vitamin A-Mangel, übermäßiges Tragen von Kontaktlinsen, atopische Keratitis, oben liegende limbische Keratitis, ptegyriale keratitis sicca, Sjögren'sche Krankheit, Akne rosacea, Phylectenulose, Syphilis, Infektionen mit Mycobakterien, Lipiddegeneration, chemische Verbrennungen, bakterielle Geschwüre, Pilzgeschwüre, Herpes simplex-Infektionen, Herpes zoster-Infektionen, Infektionen mit Protozoen, Kaposi-Sarkom, Mooren'sches Geschwür, Terrien'sche marginale Degeneration, marginale Keratolyse, Trauma, rheumatoide Arthritis, systemischen Lupus, Polyarteriitis, Wegener'sche Sarkoidose, Skleritis, Steven-Johnson'sche Krankheit, Pemphigoid, radiale Keratotonie und Corneatransplantatabstoßung.
Mit Gefäßneubildung der Retina/Aderhaut verbundene Krankheiten, die behandelt werden können, umfassen diabetische Retinopathie, Makuladegeneration, Sichelzellenanämie, Sarkoidose, Syphilis, Pseudoxanthoma elasticum, Paget'sche Krankheit, Venenverschluss, Arterienverschluss, obstruktive Karotiskrankheit, chronische Uveitis/Glaskörperentzündung, Infektionen mit Mycobakterien, Lyme'sche Krankheit, systemischer Lupus erythematosus, Frühgeborenenretinopathie, Eales'sche Krankheit, Behcet'sche Krankheit, Retinitis oder Choroiditis verursachende Infektionen, angenommene okulare Histoplasmosis, infantile Makuladegeneration, Myopie, Sehnerventrichter, Stargart'sche Krankheit, granulomatöse Uveitis der Pars plana, chronisches Ablösen der Retina, Hyperviskositätssyndrome, Toxoplasmose, Trauma und Komplikationen nach einer Laserbehandlung. Andere Krankheiten umfassen Krankheiten, die mit Rubeosis (Gefäßneubildung des Angulus) verbunden sind, und Krankheiten, die durch die abnormale Proliferation von fibrovaskulärem oder fibrösem Gewebe verursacht werden, die alle Formen von fruchtbarer Vitreoretinopathie umfassen, unabhängig davon, ob diese mit Diabetes verbunden ist oder nicht.
Eine andere Krankheit, die behandelt werden kann, ist die rheumatoide Arthritis. Man glaubt, dass die Gefäße in der Synovialauskleidung der Gelenke eine Angiogenese durchlaufen. Zusätzlich zum Bilden neuer vaskulärer Netzwerke setzen die endothelialen Zellen Faktoren und reaktive Sauerstoffspezies bei, die zu einem Wachstum des Pannus und zu einer Knorpelzerstörung führen. Die an der Angiogenese beteiligten Faktoren können aktiv zum chronisch entzündeten Zustand der rheumatoiden Arthritis beitragen oder dabei helfen, diesen aufrechtzuerhalten.
Andere Krankheiten, die behandelt werden können, sind Hämangiome, Osler-Weber-Rendu-Krankheit oder erbliche hämorrhagische Teleangiektasie, solide oder hämatogene Tumore oder erworbenes Immundefizienzsyndrom.
Studien der S(–)- und R(+)-Enantiomere von 4-Aminothalidomid, insbesondere von S(–)-4-Aminothalidomid zeigen, dass diese Verbindungen als Inhibitoren einer Angiogenese wirksam sind. Diese Studien zeigen, dass diese Verbindungen für die Behandlung von mit Angiogenese verbundenen Krankheiten nützlich sind. Wie oben angezeigt, umfasst eine Gruppe von Krankheiten, die mit Angiogenese verbunden ist, Krebs. Zahllose Tumore, die solide Tumore und hämatogene Tumore umfassen, erfordern Angiogenese, um über eine sehr geringe Größe hinaus zu wachsen. Die Inhibition der Angiogenese wird zur Inhibition des Wachstums des Tumors führen. Beispiele spezifischer Arten von Krebs, die mit den S(–)- und R(+)-Enantiomeren von 4-Aminothalidomid behandelt werden können, umfassen Prostatakrebs, Brustkrebs, Zervixkarzinom, Gebärmutterkrebs, Eierstockkrebs, Gliome, Hämangiome, Kaposi-Sarkom, Pankreaskrebs, Retinoblastome, Melanome, Blasenkrebs, Rhabdomyosarkome, Retinoblastome, Ewing-Sarkom, Neuroblastome, Osteosarkome, Leukämien, Lymphome, multiple Myelome und verschiedene akute und chronische neoplastische Krankheiten des Knochenmarks. Die S(–)- und R(+)-Enantiomere von 4-Aminohalidomid inhibieren auch Metastasen vorhandener Tumore. Beispiele für Metastasen, die inhibiert werden können, umfassen Knochenmarkmetastasen, Lungenmetastasen, Lebermetastasen und peritoneale Metastasen.
Diese Erfindung und Verwendungen von Enantiomeren von 4-Aminothalidomid, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, werden weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Die Tabelle unten stellt veranschaulichende Ausführungsformen bereit, während die Beispiele die Synthese von repräsentativen Verbindungen bereitstellen.
BEISPIELE
Die folgenden Verbindungen wurden durch die Modifikation von Verfahren synthetisiert, die in Shealy et al., J. Pharm. Sci., 1968, 57, 757–764; Polonski et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 1988, 639–648; Muller et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1999, 9, 1625–1630; Helm et al., Arzneim-Forsch./Drug Res., 1981, 31, 941–949; Shah et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 3014–3017; und Menard et al., Can. J. Che., 1963, 41, 1722–1725, beschrieben sind.
Beispiel 1
Synthese von S(–)-(2-Benzyloxycarbonylamino)-glutarimid:
Zu einer gerührten Lösung von Carboxybenzyloxy-L-glutamin (2,8 g, 10 mMol) in 40 ml wasserfreiem THF (Tetrahydrofuran) wird 1,1-Carbonyldiimidazol (1,92 g, 12 mMol) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde unter Rückfluss 18 Stunden lang erhitzt. Das THF wurde abgedampft, und das Produkt wurde in Chloroform gelöst. Die Chloroformschicht wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen und über wasserfreiem CaSO₄ getrocknet, gefiltert und abgedampft, um einen weißen Feststoff zu ergeben. Der Feststoff wurde aus Ethylether umkristallisiert, um 2,4 g kristallines Pulver zu ergeben (90%). Alternativ kann Carboxybenzyloxy-L-glutamin durch 1 Stunde langes Behandeln mit SOCl₂ in DMF (N,N-Dimethylformamid) bei –70°C bis 0°C zyklisiert werden, um S(–)-2-Benzyloxycarbonylamino)-glutarimid zu bilden. Die Reaktionsmischung wurde mit CHCl₃ verdünnt und mit 5% Na₂CO₃ gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet, gefiltert und abgedampft, um 2,5 g (90% Ausbeute) S(–)-(2-Benzyloxycarbonylamino)-glutarimid zu ergeben.
1H-NMR in CDCl₃ bestätigte, dass es sich bei dem Produkt um S(–)-(2-benzyloxycarbonylamino)-glutarimid handelte. 1H-NMR (CDCl₃, PPM), 8,2 (1H, s breit), 7,4 (5H, s, aromatisch), 5,8 (1H, d), 5,15 (2H, s), 4,4 (1H, dd, J = 4,5, 3), 2,95–2,4 (3H, m), 1,86 (1H, d, t, J = 11,5, 6,5). Schm.-Pkt. 122–124°C (lit = 122–124°C).
Beispiel 2
Synthese von S(–)-2-Aminoglutarimid.HBr:
Zu einer Lösung von S-(–)-(2-Benzyloxycarbonylamino)-glutarimid (1,2 g, 4,6 mMol) in 15 ml Eisessig wurden bei 20°C 8 ml 30% HBr/Essigsäurelösung hinzugegeben. Die Temperatur der Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erhöht, und sie wurde 1 Stunde lang gerührt. Weißes festes Pulver von S-(–)-2-Aminoglutarimid.HBr begann, sich in der Reaktionsmischung zu zeigen. Der Feststoff wurde gefiltert und mit 5 ml Eisessig und anschließend mit Ether gewaschen, um 1,8 g (80%) Produkt zu ergeben. Die Analyse des Produktes mit einem Polarimeter zeigte (–)-Rotation, [a]²⁵D (c = 1, Wasser) = –37,5° und bestätigte, dass es sich bei dem Produkt um S(–)-2-Aminoglutarimid handelte. 1H-NMR in DMSO-D6 bestätigte, dass es sich bei dem Produkt um 2-Amino-L-glutarimid.HBr handelte. 1H-NMR (DMSO-D6, PPM).
Beispiel 3
Synthese von S(–)-4-Nitrothalidomid:
Zu einer Lösung von (4,18 g, 20 mMol) 2-Aminoglutarimid-HBr in 50 ml wasserfreiem DMF wurden 3,8 g (20 mMol) 3-Nitrophthalanhydrid hinzugegeben. Nach dem Zugeben von 100 ml Essigsäure (Eisessig) wurde die Reaktionsmischung ungefähr 24 Stunden lang von etwa 70°C auf etwa 80°C erhitzt. Danach wurden die Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft, um einen gebrochen weißen Feststoff zu ergeben. Beim Hinzugeben von 10 ml Ethylalkohol zu dem Feststoff wurde ein Pulverprodukt mit einer gebrochen weißen Farbe gebildet. Das Produkt wurde abgetrennt und mit 20 ml Ethylalkohol gewaschen.
1H-NMR in DMSO-D6 bestätigte, dass es sich bei dem Produkt um S(–)-4-Nitrothalidomid handelte. Schmp. 228–229°C (lit = 228,5–229,5°C). 1H-NMR (DMSO-D₆, PPM), 11,25 (1H, s breit), 8,35 (1H, d, J = 7,2), 8,25 (1H, d, J = 7,0), 8,15 (1H, t, J = 8,0), 5,2 (1H, dd, J = 5,5, 7,2), 3,00–2,85 (1H, m), 2,65–2,4 (2H, m), 2,15–2,05 (1H, m).
Beispiel 4
Synthese von S(–)-4-Aminothalidomid:
4-Nitrothalidomid (1 g, 3,3 mMol) wurde in 50 ml einer 4:1-Mischung von Dioxan/Methanol aufgelöst und in einem Parr-Hydrogenator bei 40 psi Wasserstoff in Anwesenheit eines Pd/C 5%-Katalysators ungefähr 4 Stunden lang hydrogeniert. Nach dem Filtern der Reaktionsmischung durch ein Celite-Filteragens wurden die Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft, um ein gelbes Pulver zu ergeben. Das Pulver wurde aus Ethylacetat/Dioxan umkristallisiert, um 800 mg (85% Reinheit) S(–)-4-Aminothalidomid zu ergeben.
1H-NMR in DMSO-D₆ bestätigte, dass es sich bei dem Produkt um S(–)-4-Aminothalidomid handelte. Schmp. 318,2–319,5°C. 1H-NMR (DMSO-D₆, PPM), 11,10 (1H, s breit), 7,45 (1H, t, J = 7,5), 7,05 (1H, d, J = 5,2), 6,95 (1H, d, J = 5,2), 6,5 (2H, s breit), 5,05 (1H, dd, J = 5,0, 13,42), 2,95–2,80 (1H, m), 2,65–2,5 (2H, m), 2,05–1,05 (1H, m). Die absolute Konfiguration wurde durch Vergleich der spezifischen Rotation [a]²⁵D von R- und S-4-Aminothalidomid mit den analogen Verbindungen R(+)- und S(–)-Thalidomid bestimmt. Die Analyse des Produktes mit dem Polarimeter zeigte eine (–)-Rotation, [a]²⁵D (C = 0,5, Dioxan) = 27,7, 0° und bestätigte, dass es sich bei dem Produkt um S(–)-4-Aminothalidomid handelte.
Die beiden Enantiomere von 4-Aminothalidomid wurden durch die chirale HPLC-Säule Welk-01 (10 mm × 750 mm) aufgetrennt und mit einer CH3CN/MeOH/H2O 1:1:5-Mischung eluiert. Die Retentionszeit für das S(–)-Enantiomer betrug bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Min und bei 240 nm 33,74 Minuten bzw. für das R(+)-Enantiomer 35,62 Minuten.
Beispiel 5
Synthese von R(+)-4-Aminothalidomid:
Die Verbindung R-(+)-4-Aminothalidomid wurde mit der gleichen Vorgehensweise wie bei S-(–)-4-Aminothalidomid oben synthetisiert, abgesehen davon, dass die Synthese mit im Handel erhältlichen Carboxybenzyloxy-D-Glutamin begonnen wurde, das R(+)-4-Nitrothalidomid bildete (siehe Beispiel 1). Die Analyse des Produktes mit einem Polarimeter zeigte eine (+)-Rotation von [a]²⁵D (c = 1, Dioxan) = +37,1° und bestätigte, dass es sich bei dem Produkt um R(+)-4-Aminothalidomid handelte. 1H-NMR in DMSO-D₆ bestätigte, dass es sich bei dem Produkt um 4-Aminothalidomid handelte.
Beispiel 6
Synthese von S(–)-4-Aminothalidomid (theoretisches Beispiel):
S(–)-4-Aminothalidomid kann durch das Auflösen von S(–)-4-Nitrothalidomid in konzentrierter HCl und das anschließende Behandeln der Reaktionsmischung mit granuliertem Zinn synthetisiert werden. Nach dem ungefähr 2 Stunden langen Erhitzen der Reaktionsmischung von ungefähr 70°C auf ungefähr 80°C sollte die Reaktionsmischung gefiltert und die Säure unter Vakuum abgedampft werden, um ein gelbes Pulver zu ergeben. Das Produkt sollte aus Wasser und dann aus Ethylacetat/Dioxan umkristallisiert werden, um S(–)-4-Amino-thalidomid zu ergeben.
Beispiel 7 (Referenzbeispiel)
Der Roche Cell Proliferation Kit II (XTT) ist ein nützlicher Test für das Screenen der relativen Wirksamkeit von small molecules. Der Test bestimmt quantitativ die zelluläre Proliferation als Reaktion auf Agonisten und/oder Antagonisten der Proliferation. Er basiert auf der Spaltung des gelben Tetrazoliumsalzes (XTT) durch metabolisch aktive/lebensfähige Zellen, um einen orangefarbenen Formazanfarbstoff zu bilden. Die Bildung des löslichen Farbstoffes erlaubt die direkte Quantifizierung unter Verwendung eines Rasterspektrophotometers mit mehreren Näpfen. Eine Zunahme der Anzahl von lebenden Zellen (die sich aus der Proliferation ergeben) führt zu einer größeren Produktion des Formazan-Farbstoffs, was einer Zunahme des Extinktionswertes entspricht.
Beim Untersuchen von Analoga von Thalidomid oder dergleichen haben wir HS-Sultan-Zellen in einem in vitro-XTT-Test verwendet. In jedem Napf einer Mikrotiterplatte mit 96 Reaktionsnäpfen wurden Zellen bei einer Dichte von 15 000 Zellen pro 90 μl normalen Wachsstumsmediums ungefähr 16 Stunden vor den Behandlungen angesät. Während der Kultur und den Behandlungen werden die Zellen bei 37°C mit 5% CO₂ in einem Inkubator mit hoher Feuchtigkeit gehalten. Die Behandlungen (10X) werden in 10 μl-Aliquots hinzugegeben, um in jedem Reaktionsnapf eine Endbehandlungskonzentration von 1X zu erreichen. Jede Konzentration wird in dreifacher Ausführung ausgeführt. Die XTT-Markierungsmischung wird während den letzten vier Stunden der 72-stündigen Behandlungszeitspanne in 50 μl Aliquots zu jedem Napf hinzugegeben. Wenn die Behandlung/Markierungs-Zeitspanne abgeschlossen ist, wird die Platte auf einem spektrophotometrischen Plattenzähler bei einer Wellenlänge von 470 nm und einer 650 nm-Referenzwellenlänge abgelesen. Bei einzelnen Experimenten werden die durchschnittlichen Extinktionswerte (mit abgezogenem Hintergrund) für jede Behandlung gegen die Konzentration aufgetragen. Ein größerer Extinktionswert entspricht einer größeren Menge Proliferation. Eine Negativkontrolle (unbehandelte Zellen) wird als Referenzpunkt verwendet, ein Extinktionswert, der niedriger ist als die Kontrolle, spiegelt eine Inhibtion der Proliferation wieder.
Beim Vergleichen von Experimenten, die über eine bestimmte Zeitspanne ausgeführt wurden, können Extinktionswerte von jedem Experiment aufgrund einer Anzahl von Faktoren (der Abbau der XTT-Reagenzien im Verlauf der Zeit ist der häufigste Faktor) schwanken. Wenn die Reagenzien aus einem älteren XTT-Kit verwendet werden oder zu einem neuen Kit gewechselt wird, können die Gesamtextinktionswerte für das jeweilige Experiment höher oder niedriger sein, was einen direkten Vergleich zu einem anderen Experiment erschwert. Daher ist es eine übliche Praxis, die Extinktionswerte zu einem Verhältnis der behandelten Werte geteilt durch den Wert der Negativkontrolle (Behandlung über Kontrolle) umzuwandeln, wenn die Ergebnisse von mehreren Experimenten verglichen werden; die „Behandlung über Kontrolle"-Werte für jede Behandlung werden dann gegen die μM-Konzentration aufgetragen. 1 vergleicht die 4-Aminothalidomid-Enantiomere. Die R- und die R,S-Auftragungen repräsentieren aus 3 Experimenten gesammelte Daten. Die S- und Thalidomid-Auftragungen repräsentieren aus ungefähr 12 Experimenten gesammelte Daten. Wie in 1 veranschaulicht, zeigen sowohl die S(–)- und die R(+)-4-Aminothalidomid-Enantiomere eine gegen die zelluläre Proliferation gerichtete Aktivität.
Beispiel 8 (Referenzbeispiel)

Die Antitumor-Aktivität wurde für die S(–)- und R(+)-4-Aminothalidomid-Enantiomere wie folgt untersucht. Für die HsS-Zelllinie werden 2 Millionen Zellen in die Schwanzvene von 8 Wochen alten, weiblichen SCID-Mäusen injiziert. Die Behandlung wird nach zwei Wochen begonnen und täglich weitergeführt, bis die Mäuse sterben oder eine Paralyse der Hintergliedmaßen zeigen. Die Ergebnisse werden als mittlere Zeit bis zum Tod in behandelten Tieren gegen Kontroll-Tiere ausgedrückt. Beim Lewis-Lungenmodell werden 2,5 × 10(5) Zellen intravenös in die Schwanzvene von 6–8 Wochen alten, männlichen C57BL/6-Mäusen injiziert, und die Behandlung wird am Tag drei begonnen. Die Zeitspanne der Behandlung hat gewöhnlich eine Dauer von 11–15 Tagen. Nach dem Opfern durch CO₂-Erstickung werden die Lungen (wo die Tumore ansetzen und wachsen) entnommen, mit Wasser abgespült, trocken getupft und gewogen. Die mittleren Lungengewichte von Mäusen des gleichen Alters, die keine Tumore tragen, werden vom Gewicht der behandelten, Tumore tragenden Mäuse abgezogen, wobei die Ergebnisse als Lungengewichtszunahme bei behandelten Tieren gegen Kontrolltiere ausgedrückt werden. Tabelle 1 fasst Daten von in vivo-Experimenten in Tumorsystemen mit metastatischen Lungen- und Plasma-Zelltumoren zusammen und vergleicht die Antitumor-Aktivität der drei enantiomeren Präparationen von 4-Amino-Thalidomid. Diese Daten zeigen, dass das S(–)-Enantiomer in jedem Tumormodell das aktivste Enantiomer von 4-Aminothalidomid war. Tabelle 1

Tumormodell	Testagens	Dosis mg/kg/Tag	Aktivität
HsSultan-B-Zellen-Lymphom metastatisch in SCID-Mäusen	Vehikel (0,5% Methylzellulose)	-	26 Tage*
	R,S	50	41 Tage*
	R(+)	50	37 Tage*
	S(–)	50	47 Tage*
HsSultan-B-Zellen-Lymphom metastatisch in SCID-Mäusen	Vehikel (0,5% Methylzellulose)	-	26 Tage*
	R,S	200	28 Tage*
	R(+)	200	31 Tage*
	S(–)	200	47 Tage*
Lewis-Lungenkarzinom metastatisch in C67BL/6-Mäusen	Vehikel (0,5% Methylzellulose)	-	0,40 g#
	R,S	100	0,27 g#
	R(+)	100	0,42 g#
	S(–)	100	0,17 g#

* mittlere Zeit bis zum Tod
# Gewichtszunahme der Lunge

Beispiel 9 (Referenzbeispiel)
Ein Corneamikrotaschen-Test wurde wie in Kenyon et al., A Model of Angiogenesis in the Mouse Cornea, Invest. Ophtalmol. & Vis. Sci., 37, 1625–1632 (1996) beschrieben durchgeführt. Es wurden Pellets in C57BL/6J-Mäusen verwendet, die 80 ng bFGF oder rekombinantes menschliches VEGF (R&D Systems, Minneapolis, Minn) enthielten. Die behandelten Gruppen erhielten an fünf (bFGF) oder sechs (VEGF) aufeinanderfolgenden Tagen eine tägliche Verabreichung von Thalidomid, S(–)- und R(+)-4-Aminothalidomid [(3APG), S(–)-3APG und R(+)-3APG] (50 mg/kg), suspendiert in 0,5% Carboxymethylzellulose i. p. Die Behandlung wurde am Tag der Pelletimplantierung begonnen; die Kontrollmäuse erhielten nur Carboxymethylzellulose i. p. Die Fläche der vaskulären Reaktion wurde am fünften (bFGF) oder sechsten (VEGF) Tag nach der Operation unter Verwendung einer Schlitzlampe eingeschätzt. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt. Wie in 2 angegeben, waren die Unterschiede bei der mit bFGF induzierten Gefäßneubildung zwischen S(–)-3APG und der Kontrolle signifikant (n = jeweils 9, P < 0,0001), genauso wie die Unterschiede zwischen S(–)-3APG und Thalidomid (n = jeweils 9, P < 0,01). Die Unterschiede bei der mit VEGF induzierten Gefäßneubildung zwischen S(–)-3APG und der Kontrolle waren signifikant (n = jeweils 9, P < 0,001), genauso wie die Unterschiede zwischen S(–)-3APG und Thalidomid (n = jeweils 9, P < 0,01).
Mit „einer wirksamen Menge" ist eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge gemeint. Solche Mengen können durch eine in geeigneter Weise qualifizierte Person leicht bestimmt werden, wobei der zu behandelnde Zustand, der Verabreichungsweg und andere relevante Faktoren berücksichtigt werden. Eine solche Person wird leicht in der Lage sein, eine geeignete Dosis, einen geeigneten Verabreichungsmodus und eine geeignete Verabreichungshäufigkeit zu bestimmen.

Claims

Verfahren zum Herstellen von S(–)-4-Nitrothalidomid (5S), umfassend: 18–24 Stunden langes Kontaktieren von 3-Nitrophthalsäureanhydrid (4) mit S(–)-2-Aminoglutarimid-Hydrobromid (3S) in Gegenwart von HOAc und DMF bei 70–80°C, um S(–)-4-Nitrothalidomid (5S) zu erzeugen.
Verfahren zum Herstellen von S(–)-4-Aminothalidomid (6S), umfassend: (a) 18–24 Stunden langes Kontaktieren von 3-Nitrophthalsäureanhydrid (4) mit S(–)-2-Aminoglutarimid-Hydrobromid (3S) in Gegenwart von HOAc und DMF bei 70–80°C, um S(–)-4-Nitrothalidomid (5S) zu erzeugen; und (b) Reduzieren des S(–)-4-Nitrothalidomides (5S) unter Verwendung von 5% Pd-C und Hz in Gegenwart von Dioxan und MeOH, um S(–)-4-Aminothalidomid (6S) zu erzeugen.
Verfahren zum Herstellen von S(–)-4-Aminothalidomid (6S), umfassend: (a) 18–24 Stunden langes Kontaktieren von 3-Nitrophthalsäureanhydrid (4) mit S(–)-2-Aminoglutarimid-Hydrobromid (3S) in Gegenwart von HOAc und DMF bei 70–80°C, um S(–)-4-Nitrothalidomid (5S) zu erzeugen; und (b) ungefähr zwei Stunden langes Reduzieren des S(–)-4-Nitrothalidomides (5S) unter Verwendung von konzentrierter HCl und granuliertem Zinn bei 70–80°C, um S(–)-4-Aminothalidomid (6S) zu erzeugen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, weiterhin umfassend: Kontaktieren von S(–)-(2-Benzyloxycarbonylamino)glutarimid (2S) mit HBr in Gegenwart von HOAc, um S(–)-2-Aminoglutarimid-Hydrobromid (3S) zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 4, weiterhin umfassend: Kontaktieren von Carboxybenzyloxy-L-glutamin (1S) mit Carbonyldiimidazol in Gegenwart von THF, um S(–)-(2-Benzyloxycarbonylamino)-glutarimid (2S) zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 4, weiterhin umfassend: ungefähr einstündiges Kontaktieren von Carboxybenzyloxy-L-glutamin (1S) mit SOCl₂ in Gegenwart von DMF bei –70°C bis 0°C, um S(–)-(2-Benzyloxycarbonylamino)glutarimid (2S) zu erzeugen.
Verfahren zum Herstellen von R(+)-4-Nitrothalidomid (5R), umfassend: 18–24 Stunden langes Kontaktieren von 3-Nitrophthalsäureanhydrid (4) mit R(+)-2-Aminoglutarimid-Hydrobromid (3R) in Gegenwart von HOAc und DMF bei 70–80°C, um R(+)-4-Nitrothalidomid (5R) zu erzeugen.
Verfahren zum Herstellen von R(+)-4-Aminothalidomid (6R), umfassend: (a) 18–24 Stunden langes Kontaktieren von 3-Nitrophthalsäureanhydrid (4) mit R(+)-2-Aminoglutarimid-Hydrobromid (3R) in Gegenwart von HOAc und DMF bei 70–80°C, um R(+)-4-Nitrothalidomid (5R) zu erzeugen; und (b) Reduzieren des R(+)-4-Nitrothalidomides (5R) unter Verwendung von 5% Pd-C und H₂ in Gegenwart von Dioxan und MeOH, um R(+)-4-Aminothalidomid (6R) zu erzeugen.
Verfahren zum Herstellen von R(+)-4-Aminothalidomid (6R), umfassend: (a) 18–24 Stunden langes Kontaktieren von 3-Nitrophthalsäureanhydrid (4) mit R(+)-2-Aminoglutarimid-Hydrobromid (3R) in Gegenwart von HOAc und DMF bei 70–80°C, um R(+)-4-Nitrothalidomid (5R) zu erzeugen; und (b) ungefähr zwei Stunden langes Reduzieren des R(+)-4-Nitrothalidomides (5R) unter Verwendung von konzentrierter HCl und granuliertem Zinn bei 70–80°C, um R(+)-4-Aminothalidomid (6R) zu erzeugen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7–9, weiterhin umfassend: Kontaktieren von R(+)-(2-Benzyloxycarbonylamino)glutarimid (2R) mit HBr in Gegenwart von HOAc, um R(+)-2-Aminoglutarimid-Hydrobromid (3R) zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 10, weiterhin umfassend: Kontaktieren von Carboxybenzyloxy-D-glutamin (1R) mit Carbonyldiimidazol in Gegenwart von THF, um R(+)-(2-Benzyloxycarbonylamino)glutarimid (2R) zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 10, weiterhin umfassend: ungefähr eine Stunde langes Kontaktieren von Carboxybenzyloxy-D-glutamin (1R) mit SOCl₂ in Gegenwart von DMF bei –70°C bis 0°C, um R(+)-(2-Benzyloxycarbonylamino)glutarimid (2R) zu erzeugen.