DE60130743T2

DE60130743T2 - Mikrokugeln zur aktiven embolisierung

Info

Publication number: DE60130743T2
Application number: DE60130743T
Authority: DE
Inventors: Jean-Marie Lincoln VOGEL; Egisto Boschetti
Original assignee: Biosphere Medical Inc
Current assignee: Biosphere Medical Inc
Priority date: 2000-03-24
Filing date: 2001-03-23
Publication date: 2008-07-17
Anticipated expiration: 2021-03-24
Also published as: EP2286799B1; EP2286799A3; ES2551164T3; CN1430505A; EP1820495A3; EP1267839A2; CN101708165A; DE01918975T1; JP2013082743A; US8697137B2; ES2254042T3; JP2003528130A; US20080220077A1; KR100872884B1; WO2001072281A3; US20030211165A1; ATE374597T1; WO2001072281A2; EP2286799A2; US10265271B2

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen, einschließlich Krebs und verschiedener anderer Angiogenese-abhängiger Erkrankungen, und insbesondere auf Zusammensetzungen, die bioaktive therapeutische Faktoren in Assoziation mit Mikrosphären als Trägern (die mit solchen Faktoren beschichtet sind oder diese anderweitig enthalten) umfassen, sowie auf Verfahren zur Verwendung solcher Zusammensetzungen für eine aktive Embolisierungstherapie.
2. Hintergrund der Erfindung
2.1 Angiogenese-abhängige Erkrankungen
Angiogenese-abhängige Erkrankungen (d. h. Erkrankungen, die Gefäßwachstum erfordern oder induzieren) stellen einen signifikanten Anteil aller Erkrankungen dar, für die eine medizinische Behandlung gesucht wird. Beispielsweise ist Krebs weiterhin die zweithäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten und macht über ein Fünftel der Gesamtsterblichkeit aus. Kurz gesagt ist Krebs durch die unkontrollierte Teilung einer Zellpopulation gekennzeichnet, die besonders typisch zur Entstehung eines oder mehrerer Tumore führt. Solche Tumore sind auch durch das Einwachsen von Vaskulatur gekennzeichnet, die über den Blutkreislauf verschiedene Faktoren bereitstellen, welche ein weiteres Tumorwachstum ermöglichen. Obwohl Krebs im Allgemeinen einfacher diagnostiziert wird als in der Vergangenheit, sind einige Formen, auch wenn sie früh entdeckt werden, noch immer unheilbar.
Derzeit werden verschiedene Verfahren genutzt, um Krebs zu behandeln, wie beispielsweise verschiedene chirurgische Verfahren. Wenn sie jedoch allein mit Chirurgie behandelt werden, erfahren viele Patienten (insbesondere solche mit bestimmten Arten von Krebs, wie Brust-, Hirn-, Darm- und Leberkrebs) ein Rezidiv des Krebses. Daher werden einige Krebsarten zusätzlich zur Chirurgie auch mit einer Kombination von Therapien unter Beteiligung cytotoxischer, chemotherapeutischer Arzneimittel (z. B. Vincristin, Doxorubicin, Taxol, Vinblastin, Cisplatin, Methotrexat, 5-FU, usw.) und/oder Strahlentherapie behandelt. Eine Schwierigkeit dieses Ansatzes besteht jedoch darin, dass strahlentherapeutische und chemotherapeutische Mittel für normales Gewebe toxisch sind und häufig lebensbedrohliche Nebenwirkungen erzeugen. Zudem haben diese Ansätze häufig äußerst hohe Fehlschlags/Remissionsraten.
Neben chirurgischer Therapie, Chemo- und Strahlentherapie gab es andere Versuche, das eigene Immunsystem eines Individuums zu nutzen, um Krebszellen zu eliminieren. Beispielsweise schlugen manche die Verwendung bakterieller oder viraler Komponenten als Adjuvanzien vor, um das Immunsystem zum Zerstören von Tumorzellen zu stimulieren (siehe allgemein „Principles of Cancer Biotherapy", Oldham (Hrsg.), Raven Press, New York, 1987). Diese Agenzien waren allgemein als Adjuvanzien und als nicht-spezifische Stimulanzien in Tier-Tumormodellen nützlich, haben sich jedoch beim Menschen bisher noch nicht als allgemein wirksam erwiesen.
Eine zusätzliche Einschränkung gegenwärtiger Verfahren besteht darin, dass die Lokalrezidiv- und Lokalerkrankungskontrolle eine große Herausforderung bei der Behandlung von Malignomen bleibt. Insbesondere weisen insgesamt 630.000 Patienten jährlich (in den USA) zum Zeitpunkt der Präsentation eine lokalisierte Erkrankung auf (keine Anzeichen von Fernmetastasierung); dies stellt 64% aller Patienten dar, bei denen ein Malignom diagnostiziert wurde (dies umfasst keinen Hautkrebs ohne Melanom oder Karzinome in situ). Für die überwiegende Mehrheit dieser Patienten stellt eine chirurgische Resektion der Erkrankung die größte Chance auf Heilung dar, und tatsächlich werden 428.000 nach der Erstbehandlung geheilt sein –428.000. Leider kommt es bei 202.000 (oder 32% aller Patienten mit einer lokalisierten Erkrankung) nach der Erstbehandlung zu Rückfällen. Unter den Rückfälligen liegt die Anzahl derer, die wegen eines Lokalrezidivs der Erkrankung einen Rückfall haben, bei 133.000 Patienten jährlich (oder bei 21% all derer mit einer lokalisierten Erkrankung). Die Anzahl derer, die durch Fernmetastasierung einen Rückfall haben werden, liegt bei 68.000 Patienten jährlich (11% all derer mit einer lokalisierten Erkrankung). Weitere etwa 102.100 Patienten jährlich werden als unmittelbare Folge einer Unfähigkeit, das lokale Wachstum der Erkrankung zu kontrollieren, sterben. Beispiele für Krebsarten, die das Problem, mit dem die Patienten konfrontiert sind, veranschaulichen, sind Brustkrebs und Leberkrebs.
Brustkrebs
Besonders deutlich ist dieses Problem bei Brustkrebs, der eine Erkrankung ist, die in den USA jährlich etwa 186.000 Frauen betrifft und bei der die Sterblichkeitsrate seit 50 Jahren unverändert geblieben ist. Die chirurgische Resektion der Erkrankung durch radikale Mastektomie, modifizierte radikale Mastektomie oder durch Lumpektomie ist nach wie vor die Hauptstütze der Behandlung dieser Erkrankung. Leider wird sich bei 39% der mit Lumpektomie alleine Behandelten ein Rezidiv der Erkrankung entwickeln, was überraschenderweise auch bei 25% derjenigen der Fall sein wird, bei denen der histologische Befund des Resektionsrandes tumorfrei ist. Bis zu 90% dieser Lokalrezidive werden innerhalb von 2 cm der vorherigen Exzisionsstelle auftreten.
Leberkrebs
1999 starben über 1,2 Millionen Menschen an primärem Leberkrebs, die Mehrheit davon in Asien. Als primärer Leberkrebs wird Leberkrebs bezeichnet, bei dem die ursprünglichen Krebszellen in der Leber gebildet werden, und nicht von einem anderen Krebsherd im Körper zur Leber wandern. Patienten mit bestimmten Formen von Hepatitis, einschließlich Hepatitis C, einer viralen Erkrankung, die Entzündungen der Leber verursacht, unterliegen bekanntlich einem hohen Risiko für primären Leberkrebs. Beim Auftreten von primärem Leberkrebs wird mit einem drastischen Anstieg in den USA gerechnet, wo Schätzungen gezeigt haben, dass mehr als 4 Millionen Menschen nun Hepatitis C-positiv sind.
Über 70 Prozent der primären Leberkrebsarten sind inoperabel und werden mit Strahlen- oder Chemotherapie behandelt. Die aktuell verfügbaren Behandlungsoptionen umfassen die folgenden:
Chemotherapie: Die Chemotherapie versucht, den Krebs durch Abtöten sich rasch teilender Krebszellen zu kontrollieren. Allerdings erfolgt auch bei einer Reihe von nichtkrebsigen Zellen im Körper, wie Knochenmarkszellen, eine rasche Teilung, und daher ist es sehr wahrscheinlich, dass diese durch die Chemotherapie versentlich abgetötet werden. Somit verursachen Dosen, die ausreichen, um den Krebs zu beseitigen, häufig lebensbedrohliche Nebenwirkungen aufgrund der Zerstörung von nichtkrebsigen Zellen.
Chemoembolisierung und verschiedene in der Entwicklung befindliche Behandlungen: Die präkutane Ethanolinjektion ist beispielsweise eine schmerzhafte Prozedur, die nur bei kleinen Tumoren funktioniert, die auf weniger als 3–4 cm begrenzt sind.
Transplantation: Die Transplantation ist ebenfalls eine verfügbare Therapie, die teuer und durch die Verfügbarkeit von Organen begrenzt ist und noch immer zu einem Rezidiv des Tumors führen kann. Zudem gibt es wiederkehrende Gefahren im Zusammenhang mit der invasiven Chirurgie.
Darüber hinaus kann die Chemotherapie auch die natürliche Antitumor-Abwehr des menschlichen Körpers schädigen.
Uterine Fibroide
Ein relevantes Beispiel für einen nichtkrebsigen Tumor sind uterine Fibroide, die auch als Leinmyome bekannt sind. Dabei handelt es sich um nichtkrebsige Tumore, die aus bestimmen Arten von Muskelfasern und faserigem Bindegewebe bestehen. Die Ursache für uterine Fibroide ist unbekannt. Die meisten Patienten mit uterinen Fibroiden haben zunächst keine Symptome und bleiben unbehandelt, bis beim Patienten anormale Blutungen, Harnfrequenz, Schmerzen, Schwellungen und Schwierigkeiten mit der Fruchtbarkeit auftreten. In den USA haben jährlich etwa 25 Millionen Frauen uterine Fibroide, und etwa 5,5 Millionen dieser Frauen zeigen ausreichende Symptome, um sich in Behandlung zu begeben. Bisher hatten Frauen, die an uterinen Fibroiden leiden, wenige brauchbare Behandlungsmöglichkeiten, einschließlich Hysterektomie, Myomektomie und medizinischer Betreuung sowie „Watch and Wait". Die zur Behandlung von uterinen Fibroiden derzeit verfügbaren Therapien haben deutliche Nachteile, wie: vorübergehender oder dauerhafter Verlust der Fruchtbarkeit bei Frauen im gebärfähigen Alter, lange Erholungszeiten, nachteilige psychologische Effekte, die zu einer frühen Menopause führen können, hohe Kosten, einschließlich der Kosten für Medikamente, chirurgische Eingriffe, häufige und lange Krankenhausaufenthalte, Unwohlsein und Nebenwirkungen aufgrund von invasiven chirurgischen Eingriffen und Hormontherapie und/oder Gefahr einer Rückkehr der Fibroide.
Dies hat zur Folge, dass ein merklicher Bedarf für ein einheitlich wirksames Therapieprogramm für Patienten, unter anderem mit Brustkrebs, Leberkrebs, Pankreaskrebs und uterinen Fibroiden, besteht.
Passive Embolisierung
Ein Verfahren, das – wenn auch nur mit begrenztem Erfolg – für die Behandlung von Tumoren erprobt wurde, ist die passive Embolisierung. Dabei werden, kurz gesagt, Blutgefäße, die einen Tumor ernähren, durch Injektion eines embolischen Materials in die Gefäße gezielt blockiert. In dieser Hinsicht wurden verschiedene Materialien erprobt, einschließlich autologer Substanzen, wie Fett, Blutklumpen und gehackte Muskelfragmente, sowie künstlicher Materialien, wie Wolle, Baumwolle, Stahlkugeln, Kunststoff- oder Glasperlen, Tantalpulver, Silikonverbindungen, radioaktive Teilchen, steriler, absorbierbarer Gelatineschwamm (Sterispon, Gelfoam), oxidierte Cellulose (Oxycel), Stahlspiralen, Alkohol, lyophilisierte menschliche Dura mater (Lyodura), mikrofibrilläres Collagen (Avitene), Collagenfibrillen (Tachotop), Polyvinylalkoholschwamm (PVA; Ivalon), Bariumimprägnierte Siliciumsphären (Biss) und abnehmbare Ballone. Die Größe von Tumormetastasen kann mittels solcher Verfahren zwar vorübergehend verringert werden, aber Tumore reagieren typischerweise dadurch, dass sie das Einwachsen neuer Blutgefäße in den Tumor bewirken.
Ein mit der Krebstumorbildung zusammenhängendes Problem ist die Entwicklung krebsiger Blockaden, welche den Materialfluss durch Körperpassagen, wie die Gallengänge, die Luftröhre, die Speiseröhre, die Vaskulatur und die Harnröhre, inhibieren. Eine Vorrichtung, der Stent, wurde entwickelt, um die Passagen offen zu halten, die durch Tumore oder andere Substanzen blockiert sind. Repräsentative Beispiele für übliche Stents umfassen den Wall-Stent, den Strecker-Stent, den Gianturco-Stent und den Palmaz-Stent. Das Hauptproblem bei Stents ist jedoch, dass sie das Einwachsen von Tumormaterial oder entzündlichem Material durch die Zwischenräume des Stents nicht verhindern. Wenn dieses Material in das Innere eines Stents gelangt und das Stentlumen beeinträchtigt, kann dies zu einer Blockade der Körperpassage führen, in die er eingesetzt wurde. Zudem kann das Vorliegen eines Stents im Körper das Eindringen von reaktivem oder entzündlichem Gewebe (z. B. Blutgefäße, Fibroblasten, weiße Blutzellen) in den Stent-Behälter induzieren, was zu einem teilweisen oder vollständigen Verschluss des Stents führt.
2.2 Therapeutische oder aktive Embolisierung
Die Verabreichung eines cytotoxischen Arzneimittels in die Nähe eines Tumors erhöht die Abgabe an Tumore im Verhältnis zu normalem Gewebe. Eine solche regionale Verabreichung kann durch direkte Abgabe von Arzneimitteln in den Tumor über dessen Blutversorgung oder in die Körperhöhle, in welcher der jeweilige Tumor lokalisiert ist, erreicht werden. Eine regionale Arzneimittelperfusion hat den Vorteil, dass sie die Spitzen-Arzneimittelkonzentrationen im Zielgewebe erhöht, wobei jedoch die Exposition den ersten Blutdurchfluss durch das Organ, das perfundiert wird, beschränkt ist. Der Anteil des Arzneimittels, der nicht mit dem ersten Durchfluss aufgenommen wird, zirkuliert systemisch und wird dann von den normalen Geweben aufgenommen.
Therapeutische Gefäßkklusionen (Embolisierungen) sind Techniken, die dazu verwendet werden, bestimmte pathologische Zustände in situ zu behandeln. Sie werden meist mittels Kathetern praktiziert, die es ermöglichen, unter Bildsteuerung Okklusionsmittel in Teilchenform (Emboli) im Kreislaufsystem zu positionieren. Sie können auch die Gefäße verschiedener Prozesse betreffen: Tumore, Gefäßmissbildungen, hämorrhagische Prozesse, usw. Insbesondere bei Tumoren kann eine Gefäßokklusion Schmerz unterdrücken, Blutverlust beim chirurgischen Eingriff im Anschluss an die Embolisierung begrenzen oder auch eine Tumornekrose hervorrufen und die Operation vermeiden. Bei Gefäßmissbildungen ermöglicht sie eine Normalisierung des Blutflusses zu den normalen Geweben, unterstützt die Operation und begrenzt das Risiko eines Blutsturzes. Bei hämorrhagischen Prozessen erzeugt eine Gefäßokklusion eine Verringerung des Durchflusses, was die Vernarbung der Arterienöffnung(en) fördert.
Ferner kann eine Embolisierung abhängig von den zu behandelnden pathologischen Zuständen für vorübergehende wie auch für dauerhafte Zwecke durchgeführt werden.
Dem Fachmann sind verschiedene Arten von Emboli bekannt. Insbesondere können flüssige Mittel (Acrylkleber, Gele, viskose Suspensionen usw.) oder Mittel in Teilchenform (verschiedene Polymere, Dura mater, Gelatineschwämme, Sphären, Ballone, Spiralen usw.) beteiligt sein. Die Hauptnachteile der bekannten flüssigen Emboli liegen in ihrer Toxizität für Gewebe, die Nekrosephänomene erzeugen kann, und in der Gefahr eines Verklebens der Katheter. Eine weitere Einschränkung flüssiger Emboli besteht darin, dass sie nur passiv wirken und nicht zur Arzneimittelabgabe einsetzbar sind.
Die dualen Funktionen der regionalen Abgabe von Arzneimitteln an den Zielort und der Minimierung von Verlusten am Zielort können mit Mikrosphären erreicht werden. Wenn sie über eine regionale Arterie eingebracht werden, bleiben diese Mikrosphären in der Vaskulatur von Geweben hängen, wo sie ihre Arzneimittelladung freisetzen. Eine solche duale Wirkung wird als aktive Embolisierung bezeichnet. Mikrosphären können entweder eine feste oder eine poröse Zusammensetzung aufweisen und so ausgebildet sein, dass sie dispergierte Arzneimittelmoleküle in Lösung oder in fester Form enthalten (Zimmer und Kreuter, 1995). Mikrosphären finden besondere Anwendung bei der Behandlung von Tumoren, die sich in Organen befinden, die über eine einzige afferente, arterielle Blutversorgung versorgt werden, z. B. in der Leber (Chen et al. 1994). Von größtem Wert sind sie in Fällen, in denen der Tumor im Zielorgan die einzige Region ist, die eine Therapie erfordert. Die WO 99/34829 beschreibt die Verwendung von Ivalon^®- oder Gelfoam^®-Teilchen, die ein oberflächenaktives Mittel enthalten, zur Embolisierung.
Während auf die Verwendung von Mikrosphären zur Arzneimittel-basierten Embolisierungstherapie bezogene Studien bekannt sind, wurden relativ wenige Studien mit Mikrosphären zur Verwendung in der Gentherapie durchgeführt. Beispielsweise werden üblicherweise Glasperlen für die selektive Extraktion von DNA aus heterogenen Gemischen mittels elektrostatischer Anziehung verwendet. Während Hydroxyapatit auch zur Reinigung von Nukleinsäuren verwendet wurde (Kumazawa et al. 1992) und Hydroxyapatit-Sphären zur anhaltenden Freisetzung von Doxorubicin durch direkte, ultraschallgeführte Implantation in Lebertumore (Kunieda et al., 1993) verwendet wurden, zeigen andere Studien, dass eben diese Matrix tatsächlich für eine Exposition mit Sängergewebe ungeeignet sein kann (Dass et al., 1997a, 1997b). DNA wurde auch an PDB-Mikrosphären mit funktionalen Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppen an der Oberfläche gehalten (Katz et al., 1990; Maa et al., 1990).
Somit gibt es einen nachgewiesenen Bedarf zur Weiterentwicklung von Mikrosphären für die Genabgabe. Der gewünschte Hauptvorteil ist die Fähigkeit, das Antitumormittel über den Blutfluss spezifisch gegen die Tumorvaskulatur zu richten. Ferner ist die Obstruktion der Tumor-Blutversorgung bei gleichzeitiger Störung der Nährstoffversorgung und der Abfallabfuhr vielleicht das wünschenswerteste Ergebnis für die Zerstörung der Tumorzellen.
3. Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung einer im Wesentlichen kugelförmigen Mikrosphäre, die zur aktiven Embolisierung geeignet ist, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer Angiogenese-abhängigen Erkrankung durch Embolisierung vor, wobei die Mikrosphäre umfasst:

(a) ein biokompatibles und hydrophiles Polymer, enthaltend ein Acrylamid oder Acrylat, oder ein acrylisches Polymer, und
(b) ein Arzneimittel und/oder Vakzin,

Die Erfindung stellt auch eine kugelförmige Mikrosphäre, geeignet zur aktiven Embolisierung, bereit, umfassend:

(a) ein Polymer, enthaltend Acrylamid oder Acrylat, oder ein acrylisches Polymer, und
(b) ein Arzneimittel und/oder ein Vakzin, wobei das Arzneimittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus antineoplastischen Arzneimitteln, Antiangiogenese-Arzneimitteln, antifungalen Arzneimitteln, antiviralen Arzneimitteln, und Kombinationen daraus;

Gemäß einer Ausführungsform stellt die Erfindung Zusammensetzungen und Verfahren zur Abgabe von Arzneimitteln, Vakzinen, Polynukleotiden und Diagnose- oder Bilddarstellungsmitteln an einen Säuger unter Verwendung einer großen Vielzahl von Polymermaterialien als Träger für die vorgenannten Mittel bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung Mikroteilchen für die Abgabe dieser Mittel, insbesondere Mikrosphären, bereit. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung Mikroteilchen für die Abgabe von Polynukleotiden unter Verwendung eines Transfektionsmittels bereit.
In der bevorzugten Ausführungsform umfasst der Polymermaterialträger zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung insbesondere jedes Teilchen, das in der Lage sein muss, einen bioaktiven therapeutischen Faktor und ein Transfektionsmittel der vorliegenden Erfindung zu „tragen" oder damit assoziiert zu werden. Das bevorzugte Polymermaterial basiert auf im Wesentlichen kugelförmigen, im Wesentlichen hydrophilen, inerten, ionischen und vernetzten Polymeren einer Größe, die ausreicht, um den bioaktiven therapeutischen Faktor zu embolisieren und freizusetzen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der bioaktive therapeutische Faktor physikalisch mit dem Transfektionsmittel verknüpft, das ebenfalls mit dem Mikroteilchen verknüpft ist.
Gemäß einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung bioaktive therapeutische Zusammensetzungen sowie Verfahren und Vorrichtungen bereit, welche diese Zusammensetzungen zur Behandlung von Krebs und verschiedenen anderen Angiogenese-abhängigen Erkrankungen, einschließlich präkanzeröser Störungen, nutzen. Unter einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, umfassend (a) einen bioaktiven therapeutischen Faktor, (b) einen Polymermaterialträger und (c) ein Transfektionsmittel.
Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, umfassend (a) ein Polynukleotid, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, (b) einen Polymermaterialträger und (c) ein Transfektionsmittel.
Unter einem weiteren bevorzugten Aspekt der Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, umfassend (a) Polynukleotid, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, (b) einen Polymermaterialträger und (c) ein Lipopolyamin-Transfektionsmittel.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann eine große Vielzahl von Molekülen als bioaktive therapeutische Faktoren verwendet werden, wie z. B., ohne Einschränkung, antiangiogene Faktoren, antineoplastische Mittel, Peptide und Peptidanaloga, Antikörper oder Fragmente davon, Vakzine, Enzyme, Nukleinsäuren, RNA und DNA natürlicher oder synthetischer Herkunft, einschließlich rekombinanter RNA und DNA und Antisense-RNA und -DNA; Hammerkopf-RNA, Ribozyme, Antigennukleinsäuren, sowohl Einzel- als auch Doppelstrang-RNA und -DNA und Analoga davon.
Die Polymermaterialen der vorliegenden Erfindung enthalten Acrylpolymere, Acrylatpolymere, Polyacrylamide. Noch bevorzugter sind die Polymermaterialien im Wesentlichen hydrophile, vernetzte Copolymere aus der Acrylfamilie, wie Polyacrylamide und deren Derivate, Polyacrylate und deren Derivate. All diese Polymere sind vernetzt, so dass sie stabil und nicht-resorbierbar sind.
In den verschiedenen, hier beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist der bioaktive therapeutische Faktor physikalisch mit dem Transfektionsmittel assoziiert und der Komplex aus bioaktivem therapeutischem Faktor/Transfektionsmittel physikalisch mit dem Polymerträger assoziiert. Der bioaktive therapeutische Faktor ist vorzugsweise mittels Assoziationskräften adsorbiert, die in der Flüssigkeitsadsorptionschromatographie hinlänglich bekannt sind, einschließlich solcher Assoziationskräfte, wie – ohne Einschränkung – Ionenaustausch, Hydrophobizität, Molekülerkennung, oder Kombinationen daraus. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der bioaktive therapeutische Faktor mit dem Transfektionsmittel assoziiert, um vor dem Mischen oder Kontaktieren mit dem Polymerträger der vorliegenden Erfindung einen Komplex zu bilden.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird der gewählte bioaktive therapeutische Faktor mit dem Transfektionsmittel vermischt, um einen Komplex zwischen dem bioaktiven therapeutischen Faktor und dem Transfektionsmittel, das dem Komplex spezifische Eigenschaften, wie eine erhöhte Hydrophobizität, verleiht, zu bilden.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird das Polymermaterial mit einer ausreichenden Menge eines transfizierbaren, bioaktiven therapeutischen Faktors zusammengemischt. Die physikalische Assoziation zwischen dem bioaktiven therapeutischen Faktor und dem Polymermaterialträger ist das Ergebnis von ionischen und hydrophoben Assoziationen, die durch Zugabe von Salzen, wie z. B. – ohne Einschränkung – Natriumchlorid, oder Kontrastmitteln, wie Barium oder Iodid enthaltenden Salzen, verstärkt werden können.
Gemäß den verschiedenen, hier beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, werden die an der Oberfläche des embolischen Materials adsorbierten Komplexe aus bioaktivem therapeutischem Faktor/Transfektionsmittel, sobald sie an die entsprechende Stelle abgegeben wurden, fortschreitend desorbiert und durch verschiedene Mechanismen, wie z. B. – ohne Einschränkung – spontane Endocytose, Rezeptor-vermittelte Endocytose, Endosomolyse und Zellmembrandestabilisierung, oder Kombinationen daraus, in die umgebenden Zellen abgegeben. Die Desorption des bioaktiven therapeutischen Faktors wird durch natürliche Komponenten biologischer Flüssigkeiten induziert, die dazu dienen, die Adsorptionsstärke zwischen dem embolischen Material und dem bioaktiven therapeutischen Faktor zu schwächen, bis die vollständige Desorption des letzteren erreicht ist. Die Desorption des bioaktiven therapeutischen Faktors kann auch durch die Verwendung von in vivo hydrolisierbaren Bindungen, wie – ohne Einschränkung – Esterbindungen oder oxidischen Bindungen, moduliert werden. In verschiedenen anderen Ausführungsformen kann die Desorption des bioaktiven therapeutischen Faktors auch durch die Verwendung von Peptiden zusammen mit dem bioaktiven therapeutischen Faktor verwendet werden, wobei die Peptidbindung zur Spaltung mit zellulären, proteolytischen Enzymen befähigt ist.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Embolisierung eines Blutgefäßes bereitgestellt, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines bioaktiven therapeutischen Faktors an das Gefäß eines Patienten, der dessen bedarf, so dass das Blutgefäß wirksam okkludiert wird. Gemäß einer Ausführungsform wird der bioaktive therapeutische Faktor gleichzeitig oder nacheinander an ein Blutgefäß abgegeben, das einen Tumor ernährt.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Embolisierung von Blutgefäßen bei tumorigenen, Angiogenese-abhängigen Erkrankungen bereitgestellt, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die ein Polynukleotid umfasst, welches einen bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, an einen Patienten, der dessen bedarf, wobei das Polynukleotid mit einem Transfektionsmittel assoziiert ist und das Polynukleotid-Transfektionsmittel ferner mit einem Polymerträgermaterial assoziiert ist, so dass das Blutgefäß wirksam okkludiert wird.
Gemäß einem anderen, noch bevorzugteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Embolisierung von Blutgefäßen bei tumorigenen, Angiogenese-abhängigen Erkrankungen bereitgestellt, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die ein Polynukleotid umfasst, welches einen bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, an einen Patienten, der dessen bedarf, wobei das Polynukleotid mit einem Lipopolyamin-Transfektionsmittel assoziiert ist und das assoziierte Polynukleotid-Transfektionsmittel ferner mit einer im Wesentlichen hydrophilen Mikrosphäre assoziiert ist, so dass das Blutgefäß wirksam okkludiert wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren bereitgestellt zur Embolisierung von Blutgefäßen bei tumorigenen, Angiogenese-abhängigen Erkrankungen, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die einen viralen Vektor oder ein virusartiges Teilchen umfasst, das ein einen bioaktiven therapeutischen Faktor codierendes Polynukleotid enthält, an einen Patienten, der dessen bedarf, wobei der virale Vektor oder das virusartige Teilchen mit einem Transfektionsmittel assoziiert ist und das assoziierte Virusvektor-Transfektionsmittel ferner mit einer im Wesentlichen hydrophilen Mikrosphäre assoziiert ist, so dass das Blutgefäß wirksam okkludiert wird.
Gemäß einem weiteren, bevorzugteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren bereitgestellt zur Embolisierung von Blutgefäßen bei tumorigenen, Angiogenese-abhängigen Erkrankungen, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die einen viralen Vektor oder ein virusartiges Teilchen umfasst, das ein einen bioaktiven therapeutischen Faktor codierendes Polynukleotid enthält, an einen Patienten, der dessen bedarf, wobei der virale Vektor oder das virusartige Teilchen mit einem Lipolyamin-Transfektionsmittel assoziiert ist und das assoziierte Virusvektor-Transfektionsmittel ferner mit einer im Wesentlichen hydrophilen Mikrosphäre assoziiert ist, so dass das Blutgefäß wirksam okkludiert wird.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren bereitgestellt zum Inhibieren einer Angiogenese in Patienten mit nicht-tumorigenen, Angiogenese-abhängigen Erkrankungen, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Arzneimittels zusammen mit einem Polynukleotid, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, an einen Patienten mit einer nicht-tumorigenen, Angiogenese-abhängigen Erkrankung, der dessen bedarf, wobei das Polynukleotid mit einem Transfektionsmittel assoziiert ist und das assoziierte Polynukleotid-Transfektionsmittel ferner mit einem Polymermaterialträger assoziiert ist, so dass die Bildung neuer Blutgefäße inhibiert wird. Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung kann ein solches Arzneimittel in den Polymermaterialträger aufgenommen sein, um den Transfer des gleichzeitig verabreichten, bioaktiven therapeutischen Faktors nicht zu stören.
Gemäß wiederum einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren bereitgestellt zur Behandlung von Patienten mit nicht-tumorigenen, nicht-angiogeneseabhängigen Erkrankungen, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Arzneimittels zusammen mit einem Polynukleotid, das einen mit einem Transfektionsmittel assoziierten, bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, an einen Patienten, der dessen bedarf, wobei das Arzneimittel in dem Polymermaterialträger enthalten ist, um den Transfer des mit dem Polymermaterialträger assoziierten, bioaktiven therapeutischen Faktors, der gleichzeitig verabreicht wird, nicht zu stören, so dass die Symptome der nicht-tumorigenen, nicht-angiogeneseabhängigen Erkrankung gelindert werden.
Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung (a) ein Polynukleotid, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, (b) einen Polymermaterialträger und (c) ein Lipopolyamin-Transfektionsmittel zusammen mit einem leichteren Übergangsmetall der Gruppe d (z. B. einer Vanadiumspezies, Molybdänspezies, Wolframspezies, Titanspezies, Niobspezies oder Tantalspezies), das die Bildung neuer Blutgefäße inhibiert.
Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsformen umfassen die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung (a) ein Polynukleotid, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, (b) ein kationisches, vernetztes Mikroteilchen, und (c) ein Lipopolyamin-Transfektionsmittel zusammen mit einem transfektionsverstärkenden Mittel.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt zur Abgabe eines Polynukleotids an einen Säugetierwirt, welches die Verabreichung eines im Wesentlichen hydrophilen Polymermaterials, assoziiert mit einem Polynukleotid und einem Transfektionsmittel, an einen Säuger mit einer Erkrankung umfasst. Ausführungsformen des letzteren Verfahrens sind vorgesehen, bei denen die Verabreichung des im Wesentlichen hydrophilen Polymermaterials, das mit einem Polynukleotid und einem Transfektionsmittel assoziiert ist, zur Gentherapie dient, wobei die Polymermaterial-Mikrosphäre eine Größe hat, die ausreicht, um die Gefäße am Ort der Verabreichung zu embolisieren, und wobei das Polymermaterial keine Größe hat, die ausreicht, um die Gefäße am Ort der Verabreichung zu embolisieren, aber ausreicht, um sich im Tumor zu verankern.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein Verfahren zur aktiven Embolisierung in einem Wirtssäuger vorgesehen, umfassend die Verabreichung eines im Wesentlichen hydrophilen Polymermaterials, assoziiert mit einem bioaktiven therapeutischen Faktor, der in der Lage ist, ein antiangiogenes Material zu exprimieren, an einen Säuger mit einer Angiogenese-abhängigen Erkrankung, wobei der bioaktive therapeutische Faktor mit einem Transfektionsmittel assoziiert ist.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur Behandlung von Tumorexzisionsstellen vorgesehen, umfassend die Verabreichung eines auf einem Polymermaterialträger befindlichen, bioaktiven therapeutischen Faktors, assoziiert mit einer Transfektionsmittelzusammensetzung, wie oben beschrieben, an die Resektionsränder eines Tumors nach Exzision, so dass Lokalrezidive von Krebs und die Bildung neuer Blutgefäße an der Stelle inhibiert sind.
Gemäß anderen Aspekten sind Verfahren zur Embolisierung von Blutgefäßen bei nicht-tumorigenen, Angiogenese-abhängigen Erkrankungen vorgesehen, umfassend die Abgabe einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die ein Arzneimittel in Verbindung mit einem Polynukleotid umfasst, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, an das Gefäß, so dass das Blutgefäß wirksam okkludiert wird.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Verfahren zur Embolisierung von Blutgefäßen bei tumorigenen, Angiogenese-abhängigen Erkrankungen vorgesehen, umfassend die Abgabe einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die ein Arzneimittel in Verbindung mit einem Polynukleotid umfasst, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, an ein Gefäß, so dass das Blutgefäß wirksam okkludiert und das einen bioaktiven therapeutischen Faktor codierende Polynukleotid der Zelle zur Expression zugeführt wird.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur aktiven Embolisierung in einem Wirtssäuger vorgesehen, umfassend die Verabreichung eines im Wesentlichen hydrophilen Polymermaterials, das mit einem bioaktiven therapeutischen Faktor assoziiert ist, an einen Säuger mit einer Erkrankung, wobei der bioaktive therapeutische Faktor mit einem Transfektionsmittel assoziiert ist.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Mikroteilchen vorgesehen, das zur aktiven Embolisierung geeignet ist, umfassend ein zur Embolisierung eines Blutgefäßes befähigtes Polymermaterial, das Polymermaterial an ein Transfektionsmittel gebunden ist, das an ein genetisches Material gebunden ist.
Gemäß anderen Aspekten sind Verfahren zur Behandlung neovaskulärer Erkrankungen eines Organs, wie beispielsweise, ohne Einschränkung, des Auges, vorgesehen, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines bioaktiven therapeutischen Faktors an einen Patienten, der dessen bedarf, z. B. in das Auge, so dass die Bildung neuer Blutgefäße inhibiert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die zur Behandlung von Krebserkrankungen sowie anderen, nicht-tumorigenen, Angiogenese-abhängigen Erkrankungen geeignet sind, und bietet zudem andere damit zusammenhängende Vorteile. Diese Krebsarten umfassen, ohne Einschränkung, Leber-, Eierstock-, Nieren-, Pankreas-, Prostata- und Hautkrebs, Kopf- und Halstumore, Brusttumore und Kaposi-Sarkom, sowie superfizielle Formen von Blasenkrebs. Neben Krebs können jedoch auch zahlreiche andere, nicht-tumorigene, Angiogenese-abhängige Erkrankungen, die durch anormales Wachstum von Blutgefäßen gekennzeichnet sind, mit den bioaktiven therapeutischen Faktoren oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden. Repräsentative Beispiele für solche nicht-tumorigenen, Angiogenese-abhängigen Erkrankungen umfassen, ohne Einschränkung, hypertrophe Narben und Keloide, proliferative diabetische Retinopathie, rheumatoide Arthritis, arteriovenöse Missbildungen, atherosklerotische Plaques, verzögerte Wundheilung, Blutergelenke, Falschgelenkbildungen, Osier-Weber-Syndrom, Psoriasis, pyogene Granulome, Sclerodermie, Trachom, Menorrhagie und vaskuläre Adhäsionen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Kits zur Durchführung einer Embolisierungsgentherapie bereitgestellt, umfassend: (a) eine Suspension von Mikrosphären, die zur Embolisierung geeignet ist; und (b) ein Transfektionsmittel, das zur Abgabe von genetischem Material an eine Zelle geeignet ist. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Kits bereitgestellt, wobei das Polymermaterial in einem Fläschchen enthalten ist und das Transfektionsmittel, das mit einem den bioaktiven therapeutischen Faktor codierenden Polynukleotid assoziiert ist, in einem anderen Fläschchen enthalten ist, und wobei die Inhalte beider Fläschchen miteinander vermischt werden, um die pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden. Gemäß einer anderen, weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Kits bereitgestellt, wobei das Polymermaterial in einem Fläschchen enthalten ist, das Transfektionsmittel in einem anderen, separaten Fläschchen enthalten ist, und das Polynukleotid, das den bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, in einem anderen, separaten Fläschchen enthalten ist, wobei die Inhalte aller drei Fläschchen miteinander vermischt werden, um die pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden. Gemäß einer anderen, weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Kits bereitgestellt, wobei die Komponenten: (a) eine Suspension von Mikrosphären, die für die Embolisierung geeignet ist; und (b) ein Transfektionsmittel, das zur Abgabe von genetischem Material an eine Zelle geeignet ist, in einem einzigen Fläschchen vorliegen.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung ergeben sich unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen. Zudem sind nachfolgend verschiedene Literaturstellen angegeben, die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind.
4. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen:
In der vorliegenden Verwendung steht „im Wesentlichen kugelförmig" allgemein für eine Form, die einer perfekten Kugel nahe kommt, welche als ein Volumen definiert ist, das die kleinste äußere Oberfläche aufweist. Insbesondere bedeutet „im Wesentlichen kugelförmig" gemäß der vorliegenden Erfindung, dass bei Betrachtung eines beliebigen Querschnitts des Teilchens die Differenz zwischen dem größeren mittleren Durchmesser und dem kleineren mittleren Durchmesser weniger als 20% beträgt. Die Oberflächen der Mikrosphären der vorliegenden Erfindung sehen bei bis zu 1000-facher Vergrößerung glatt aus. Die Mikrosphären der vorliegenden Erfindung können neben den Teilchen auch andere Materialien umfassen, wie sie hier beschrieben und definiert sind.
In der vorliegenden Verwendung steht ein „Zelladhäsionspromoter" gemäß der vorliegenden Erfindung für ein beliebiges Material, das aufgrund seines Vorliegens in oder seiner Assoziation mit den Mikrosphären das Adhäsionsvermögen von Zellen an der Oberfläche der Mikrosphären fördert oder verstärkt. Diese Materialien sind häufig Proteine, die mit der Oberfläche der Mikrosphären durch kovalente Bindungen oder in einer völlig durchdrungenen, polymeren Weise assoziiert sind.
In der vorliegenden Verwendung bezieht sich ein „therapeutisches Mittel" gemäß der vorliegenden Erfindung auf jede Substanz, die therapeutische Effekte für den Prozess von Angiogenese-abhängigen Erkrankungen oder biologische oder physiologische Antworten auf die Angiogenese-abhängigen Erkrankungen ergibt. Ein Beispiel für ein therapeutisches Mittel ist ein entzündungshemmendes Mittel, das die Wirkung von Entzündungen im Zusammenhang mit Angiogenese-abhängigen Erkrankungen verhindert oder verringert.
In der vorliegenden Verwendung steht „chemische Modifikation" gemäß der vorliegenden Erfindung für die Veränderungen chemischer Eigenschaften und Merkmale der Mikrosphären während ihres Herstellungsverfahrens oder durch deren Vermischen oder Kontaktieren mit verschiedenen Mitteln oder Geweben, so dass die Mikrosphären in der Lage sind, neben der Tumorembolisierung auch andere Funktionen zu erfüllen, sobald sie in den Körper injiziert sind.
In der vorliegenden Verwendung bezeichnet ein „Stabilisierungsmaterial" oder eine „stabilisierende Verbindung" ein beliebiges Material, das in der Lage ist, die Stabilität von Zusammensetzungen, Prodrugs, zielgebenden Liganden und/oder anderen hier beschriebenen, bioaktiven therapeutischen Faktoren, wie z. B. Gemischen, Suspensionen, Emulsionen, Dispersionen, Vesikeln oder dergleichen, zu verbessern. In der Definition eines „Stabilisierungsmaterials" sind auch bestimmte der vorliegenden bioaktiven therapeutischen Faktoren und Prodrugs mit eingeschlossen. Ebenfalls in der Definition eines „Stabilisierungsmaterials" mit eingeschlossen sind bestimmte der vorliegenden Transfektionsmittel. Die verbesserte Stabilität umfasst beispielsweise das Beibehalten eines relativ ausgeglichenen Zustandes und kann beispielsweise durch eine erhöhte Beständigkeit der Zusammensetzung gegen Zerstörung, Zersetzung, Abbau und dergleichen beispielhaft erläutert werden. Beispielsweise verringert ein überhängender kationischer Kopf in einem Transfektionsmittel die Transfektionseffizienz, wie dies bei solchen Verbindungen, wie C₁₂GluPhC_nN⁺ und C₁₄GluPhC_nN⁺, zu beobachten ist, während Verbindungen, wie DOTB/DOSC, welche die kürzesten Spacer aufweisen, zur höchsten Oberflächenladungsdichte und zur besten Transfektionseffizienz führen.
In Falle bevorzugter Ausführungsformen, die Mikrosphären mit bioaktiven therapeutischen Faktoren, Prodrugs und/oder andere bioaktive Mittel umfassen, können die stabilisierenden Verbindungen dazu dienen, die Mikrosphären zu bilden oder zu stabilisieren, wobei sie in beiden Fällen dazu dienen, die Freisetzung bestimmter bioaktiver therapeutischer Faktoren, Prodrugs und/oder bioaktiver Mittel aus den Mikrosphären zu minimieren oder im Wesentlichen (einschließlich vollständig) zu verhindern, bis diese Freisetzung erwünscht ist. Der Begriff „im Wesentlichen", wie er im vorliegenden Zusammenhang des Verhinderns einer Freisetzung bioaktiver therapeutischer Faktoren, Prodrugs und/oder bioaktiver Mittel aus den Mikrosphären verwendet wird, bedeutet, dass mehr als etwa 50% mit der Oberfläche assoziiert oder in den Mikrosphären enthalten bleibt, bis eine Freisetzung erwünscht ist, und vorzugsweise mehr als etwa 60%, noch bevorzugter mehr als etwa 70%, sogar noch bevorzugter mehr als etwa 80%, wiederum noch bevorzugter mehr als etwa 90% an der Oberfläche assoziiert bleiben, oder alternativ dazu, im Falle von therapeutischen Arzneimittelformulierungen, in den Mikrosphären enthalten bleiben, bis eine Freisetzung erwünscht ist. In besonders bevorzugten Ausführungsformen bleiben mehr als etwa 95% der bioaktiven therapeutischen Faktoren, Prodrugs und/oder bioaktiven Mittel an der Oberfläche assoziiert oder alternativ dazu, im Falle von therapeutischen Arzneimittelformulierungen, in den Mikrosphären enthalten, bis eine Freisetzung erwünscht ist. Die bioaktiven therapeutischen Faktoren, Prodrugs und/oder bioaktiven Mittel können auch vollständig an der Oberfläche assoziiert oder in den Mikrosphären enthalten bleiben (d. h. etwa 100% bleiben an der Oberfläche assoziiert oder in den Mikrosphären enthalten), bis eine Freisetzung erwünscht ist.
Beispielhafte Stabilisierungsmaterialien umfassen z. B. Lipide, Proteine, Polymere, Kohlenhydrate und oberflächenaktive Mittel. Die resultierende Mischung, Suspension, Emulsion oder dergleichen kann Wände (d. h. Filme, Membranen und dergleichen) um den bioaktiven therapeutischen Faktor oder das bioaktive Mittel herum umfassen oder, falls erwünscht, im Wesentlichen frei von Wänden oder Membranen sein. Das Stabilisierungsmaterial kann, falls erwünscht, Tröpfchen bilden. Auch kann das Stabilisierungsmaterial Salze und/oder Zucker umfassen. In bestimmten Ausführungsformen können die Stabilisierungsmaterialien im Wesentlichen (einschließlich vollständig) vernetzt sein. Das Stabilisierungsmaterial kann eine neutrale, positive oder negative Ladung aufweisen.
In der vorliegenden Verwendung beziehen sich „Vernetzung", „vernetzt" und „Vernetzen" allgemein auf die Bindung von zwei oder mehr Stabilisierungsmaterialien, wie Lipid-, Protein-, Polymer-, Kohlenhydrat-, Tensidstabilisierungsmaterialien, bioaktiven therapeutischen Faktor und/oder bioaktive Mittel mittels einer oder mehrerer Brücken. Die Brücken können aus einem (einer) oder mehreren Elementen, Gruppen oder Verbindungen bestehen und allgemein zum Verbinden eines Atoms eines ersten Stabilisierungsmaterialmoleküls mit einem Atom eines zweiten Stabilisierungsmaterialmoleküls dienen. Die Vernetzungsbrücken können kovalente und/oder nicht-kovalente Bindungen umfassen. Beliebige von verschiedenen Elementen, Gruppen und/oder Verbindungen können Brücken in den Vernetzungen bilden, und die Stabilisierungsmaterialien können natürlich oder durch synthetische Mittel vernetzt sein. Beispielsweise kann eine Vernetzung in der Natur in Material auftreten, das aus Peptidketten formuliert ist, die über Disulfidbindungen von Cystinresten, wie in Keratinen, Insulinen und anderen Proteinen, miteinander verbunden sind. Alternativ dazu kann die Vernetzung durch eine geeignete chemische Modifikation, wie z. B. durch Kombinieren einer Verbindung, wie eines Stabilisierungsmaterials, und einer chemischen Substanz, die als Vernetzungsmittel dienen kann, erfolgen, was z. B. durch Beaufschlagung mit Wärme, Hochenergiestrahlung und dergleichen eine Reaktion verursachen kann. Beispiele umfassen eine Vernetzung mit Schwefel, um Disulfidbindungen zu bilden, Vernetzung mittels organischer Peroxide, Vernetzung ungesättigter Materialien mittels Hochenergiestrahlung, Vernetzung mit Dimethylolcarbamat und dergleichen. Falls erwünscht, können die Stabilisierungsverbindungen, der bioaktive therapeutische Faktor und/oder die bioaktiven Mittel im Wesentlichen vernetzt sein.
In der vorliegenden Verwendung bedeutet der Begriff „im Wesentlichen", dass mehr als etwa 50% der stabilisierenden Verbindungen Vernetzungsbrücken enthalten. Falls erwünscht, enthalten mehr als etwa 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder auch 100% der stabilisierenden Verbindungen solche Vernetzungsbrücken. Alternativ dazu können die Stabilisierungsmaterialien unvernetzt sein, d. h. dass mehr als etwa 50% der stabilisierenden Verbindungen frei von Vernetzungsbrücken sind, und falls erwünscht, mehr als etwa 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder auch 100% der stabilisierenden Verbindungen frei von Vernetzungsbrücken sind.
In der vorliegenden Verwendung bezieht sich „assoziiert" auf eine Bindung zwischen dem bioaktiven therapeutischen Mittel, dem Transfektionsmittel und der Mikrosphäre der Erfindung. Eine solche Assoziation kann im Falle des bioaktiven therapeutischen Mittels und des Transfektionsmittels gegebenenfalls zur Bildung eines Komplexes führen. Eine solche Assoziation soll ohne Einschränkung solche Assoziationen umfassen, die kovalent oder nicht-kovalent sind, sowie ionische Wechselwirkungen, elektrostatische Wechselwirkungen, Van der Waals'sche Kräfte, Wasserstoffbindungen, hydrophile Wechselwirkungen und hydrophobe Wechselwirkungen, die hier jeweils nachfolgend näher definiert sind.
In der vorliegenden Verwendung bezieht sich eine „kovalente Assoziation" auf eine intermolekulare Assoziation oder Bindung, welche die gemeinsame Nutzung von Elektronen in den Bindungsorbitalen zweier Atome beinhaltet.
In der vorliegenden Verwendung bezieht sich eine „nicht-kovalente Assoziation" auf eine intermolekulare Wechselwirkung zwischen zwei oder mehr separaten Molekülen, an der keine kovalente Bindung beteiligt ist. Die intermolekulare Wechselwirkung hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie z. B. der Polarität der beteiligten Moleküle und der Ladung (positiv oder negativ), sofern vorhanden, der beteiligten Moleküle. Nicht-kovalente Assoziationen sind ausgewählt unter ionischen Wechselwirkungen, Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, Van der Waals'schen Kräften und Kombinationen daraus.
In der vorliegenden Verwendung bezieht sich eine „ionische Wechselwirkung" oder „elektrostatische Wechselwirkung" auf eine intermolekulare Wechselwirkung zwischen zwei oder mehr Molekülen, deren jedes positiv oder negativ geladen ist. So bezieht sich z. B. „ionische Wechselwirkung" oder „elektrostatische Wechselwirkung" auf die Anziehung zwischen einem ersten, positiv geladenen Molekül und einem zweiten, negativ geladenen Molekül. Ionische oder elektrostatische Wechselwirkungen umfassen z. B. die Anziehung zwischen einem negativ geladenen Stabilisierungsmaterial, beispielsweise genetischem Material, und einem positiv geladenen Lipid, z. B. einem kationischen Lipid, wie Lauryltrimethylammoniumbromid.
In der vorliegenden Verwendung beziehen sich „Van der Waals'sche Kräfte" auf die Anziehungskräfte zwischen nichtpolaren Molekülen, die durch die Quantenmechanik bedingt sind. Van der Waals'sche Kräfte hängen meist mit vorübergehenden Dipolmomenten zusammen, die durch Nachbarmoleküle induziert werden und Veränderungen der Elektronenverteilung beinhalten.
In der vorliegenden Verwendung bezieht sich eine „Wasserstoffbindung" auf eine Anziehungskraft oder Brücke, die zwischen einem Wasserstoffatom, das kovalent an ein elektronegatives Atom, z. B. Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff, gebunden ist, und einem anderen elektronegativen Atom auftritt. Die Wasserstoffbindung kann zwischen einem Wasserstoffatom in einem ersten Molekül und einem elektronegativen Atom in einem zweiten Molekül (intermolekulare Wasserstoffbindung) auftreten. Die Wasserstoffbindung kann auch zwischen einem Wasserstoffatom und einem elektronegativen Atom auftreten, die beide in einem einzigen Molekül enthalten sind (intramolekulare Wasserstoffbindung).
In der vorliegenden Verwendung bezieht sich eine „hydrophile Wechselwirkung" auf Moleküle oder Teile von Molekülen, die im Wesentlichen an Wasser binden, Wasser absorbieren und/oder wasserlöslich sind. Dies kann zu einem Quellen und/oder zur Bildung reversibler Gele führen.
In der vorliegenden Verwendung bezieht sich eine „hydrophobe Wechselwirkung" auf Moleküle oder Molekülabschnitte, die im Wesentlichen nicht an Wasser binden, Wasser absorbieren und/oder wasserlöslich sind.
Die detaillierte Beschreibung der vorliegenden Erfindung ist wegen der Klarheit der Offenbarung, und nicht zur Einschränkung, in die nachfolgenden Unterabschnitte unterteilt.
Die vorliegende Erfindung stellt sichere und wirksame Verfahren für eine Embolisierungsgentherapie bereit, die zur Behandlung von Krebs und verschiedenen anderen Angiogenese-abhängigen Erkrankungen geeignet sind. Solche Verfahren der Embolisierungsgentherapie sind somit für Ärzte und/oder Chirurgen, wie, ohne Einschränkung, eingreifende Radiologen, von Nutzen. Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können von Chirurgen vor, während oder nach einer Operation eingesetzt werden.
Kurz gesagt werden bei der Gentherapie Gene als Moleküle von DNA oder RNA in die Zellen des Patienten abgegeben. Die Gene sind Teil von Expressionskonstrukt-Kassetten von Nukleinsäuren, die das interessierende Gen und ein Promoter/Enhancer-Element enthalten, welches die hohe Expression des Gens innerhalb der Zielzellen steuert. Die DNA wird von Enzymen in der Zelle zu RNA-Botenmolekülen transkribiert, welche die Matrize zur Translation der Gensequenz zum Proteinprodukt bilden. Dieses Protein erfüllt dann innerhalb der Zielzelle oder des umliegenden Gewebes die Funktion, einen Zelldefekt zu korrigieren oder solche Zellen, wie Tumorzellen, abzutöten.
Somit besteht die Gen- und Zelltherapie darin, einen Mangel oder eine Anormalität (Mutation, aberrante Expression und dergleichen) zu korrigieren oder die Expression eines Proteins von therapeutischem Interesse durch die Einführung einer genetischen Information in die Zelle oder das betroffene Organ sicherzustellen. Diese genetische Information kann entweder in vitro in eine aus dem Organ entnommene Zelle eingeführt werden, wobei die modifizierte Zelle dann wieder in den Körper eingeführt wird, oder direkt in vivo in das entsprechende Gewebe eingesetzt werden. Für den Transfer dieser genetischen Information wurden verschiedene Techniken beschrieben, darunter verschiedene Transfektionstechniken unter Beteiligung von Komplexen aus DNA und DEAE-Dextran (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), aus DNA und Kernproteinen (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), aus DNA und Lipiden (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), aus DNA und Polylysin, unter Verwendung von Liposomen (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431) und dergleichen.
Eine Embolisierung ist eine teilweise oder vollständige Okklusion von Gefäßen, die von Blut durchspült werden. Eine therapeutische Embolisierung ist eine Prozedur, mit der Arterien oder Venen okkludiert werden können, um entweder eine Dysfunktion, wie eine arteriovenöse Missbildung, zu korrigieren oder um den Blutfluss zu stoppen, mit dem Ziel, die Zufuhr eines für einen festen Tumor/das Krebswachstum essentiellen Elementes zu stoppen. Eine therapeutische Embolisierung ist meist ein „passiver" Vorgang in dem Sinne, dass keine aktiven Moleküle dorthin getragen und/oder abgegeben werden, wo embolisches Material abgelagert wird.
Die vorliegende Erfindung ist auf eine „aktive" Embolisierung gerichtet, welche die Verringerung des Blutflusses mit der lokalisierten Abgabe eines transfizierbaren genetischen Materials verbindet, die beide zum gleichen Zweck der Verringerung oder Beseitigung von Krebszellen wirksam sind.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, umfassend (a) einen bioaktiven therapeutischen Faktor, (b) einen Mikrosphärenträger und (c) ein Transfektionsmittel. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zur Gentherapie durch Verabreichung einer injizierbaren Zusammensetzung, umfassend (a) einen bioaktiven therapeutischen Faktor, (b) einen Mikrosphärenträger und (c) ein Transfektionsmittel, an einen Säuger bereit, der einer Behandlung gegen Krebs und verschiedene andere Angiogenese-abhängige Erkrankungen bedarf.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zur Gentherapie durch Verabreichung einer injizierbaren Zusammensetzung, umfassend (a) einen bioaktiven therapeutischen Faktor, (b) einen Mikrosphärenträger und (c) ein Transfektionsmittel, an einen Säuger bereit, der einer Behandlung gegen Krebs und verschiedene andere, Angiogenese-abhängige Erkrankungen bedarf, wobei die injizierbare Zusammensetzung direkt in den Tumor oder das erkrankte Gewebe über eine geeignete Hohlnadel verabreicht wird.
Bei wieder einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zur Gentherapie durch Verabreichung einer injizierbaren Zusammensetzung, umfassend (a) einen bioaktiven therapeutischen Faktor, (b) einen Mikrosphärenträger und (c) ein Transfektionsmittel, an einen Säuger bereit, der einer Behandlung gegen Krebs und verschiedene andere, Angiogenese-abhängige Erkrankungen bedarf, wobei die injizierbare Zusammensetzung an den Tumor oder das erkrankte Gewebe durch Injektion in das Gefäßsystem abgegeben wird.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren bereitgestellt zur Behandlung einer Tumorexzisionsstelle, umfassend die Verabreichung einer Zusammensetzung, umfassend ein antineoplastisches Arzneimittel, wie z. B. – ohne Einschränkung – Taxol, Doxorubicin, Cisplatin, Paclitaxel, an den Resektionsrand eines Tumors nach Exzision, so dass Lokalrezidive des Krebses und die Bildung neuer Blutgefäße an der Stelle inhibiert sind.
Die polymeren Träger oder vorzugsweise Mikrosphären der vorliegenden Erfindung können auch chemisch modifiziert werden, so dass sie therapeutischee Effekte, Vaskularisierungseffekte, Antivaskularisierungseffekte, Visualisierungseigenschaften, oder Kombinationen daraus aufweisen. Gemäß einer Ausführungsform wird die chemische Modifikation der Mikrosphären der vorliegenden Erfindung dadurch ermöglicht, dass die Mikrosphären Teilchen umfassen, die aus Polymeren bestehen, welche vernetzt sind, so dass sie in ihren Strukturen Chemikalien enthalten können, welche verschiedene Eigenschaften besitzen, und dass sie einmalige Merkmale im Zusammenhang mit kovalenten Oberflächenbindungen besitzen. Die chemische Modifikation der Mikrosphären der vorliegenden Erfindung kann auch durch die Wechselwirkungen zwischen den Mikrosphären und den/dem benachbarten Zellen und Gewebe nach der Verabreichung erfolgen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung haben die folgenden Vorteile: (1) die injizierten Materialien werden nicht einfach innerhalb der Gewebe, in die sie ursprünglich injiziert wurden, verdrängt, weshalb die beabsichtigte Gentherapie ohne wiederholte Verabreichung oder ohne Verursachen nachteiliger Effekte für den Patienten erreicht wird; (2) die injizierten Materialien werden nicht ohne weiteres verdaut, verdrängt oder eliminiert, sei es biochemisch oder durch das Immunsystem oder das lymphatische System, weshalb das Verfahren wirksamer und länger anhaltend ist; (3) die Materialien sind von ausreichender Größe, um durch 18- bis 26-Gauge-Nadeln oder 30-Gauge-Nadeln oder kleinere Nadeln injiziert zu werden, weshalb das Verfahren genauer, wirksamer und weniger intrusiv für den Patienten ist; (4) die injizierten Teilchen sind flexibel, aber nicht zerbrechlich, was eine einfache Injektion ohne Brechen ermöglicht und damit eine einfache und sichere Injektion ergibt, und (5) die injizierten Teilchen sind nicht unregelmäßig geformt und verklumpen nicht miteinander, was ebenfalls eine einfache und genaue Injektion ergibt. Diese Vorteile, ob alleine oder in Kombination, verstärken die Wirksamkeit der Behandlung und sind für Patienten sicher, zweckmäßiger und angenehm.
4.1 Polymermaterial
4.1.1 Mikroteilchen
Zur Abgabe der Polynukleotide oder anderer genetischer Materialien der vorliegenden Erfindung kann jedes beliebige Polymermaterial verwendet werden, das in der Lage ist, mit dem Polynukleotid oder anderem genetischem Material und dem Transfektionsmittel zu assoziieren, und das den Wirkungsort anzielen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform sollte das Material die Polynukleotide oder andere genetische Materialien tragen und embolisieren. Vorzugsweise wird bei der vorliegenden Erfindung ein Mikroteilchen, besonders bevorzugt eine Mikrosphäre, verwendet.
Eine große Vielzahl von Polymerträgern können bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden; Repräsentative Beispiele hierfür umfassen ohne Einschränkung Poly(ethylenvinylacetat) (40% vernetzt).
4.1.2 Mikrosphären
Für den Arzneimittelabgabeaspekt der Erfindung ist das bevorzugte Polymermaterial die Mikrosphäre. In der Arzneimittelabgabe-Ausführungsform ist die Verwendung eines Transfektionsmittels optional.
Die Mikroperlen oder Mikrosphären (hier kollektiv als Mikrosphären bezeichnet) zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung basieren vorzugsweise auf einem biokompatiblen, hydrophilen, im Wesentlichen sphärischen und nicht toxischen Polymer. Die Mikrosphären sind durch eine Nadel mit 18 Gauge oder kleiner injizierbar und können nicht vom Immun- oder Lymphsystem eliminiert werden. Die Polymere können vorzugsweise mit Mitteln beschichtet sein, welche die Zelladhäsion fördern. Lebende Zellen können ebenfalls an den Mikrosphären haften, wobei sie darin geschichtete Zellen bilden, welche sich mit umlegenden Geweben verbinden, um die Langzeitstabilität der Perlen zu verbessern.
Die Mikrosphären der vorliegenden Erfindung umfassen Elastomere, vorzugsweise Elastomere, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Acrylpolymeren, Vinylalkoholpolymeren, Acrylatpolymeren, Polysacchariden, Silikonen oder Gemischen davon. Noch bevorzugter sind die hydrophilen Copolymere, die für diese Anmeldung brauchbar sind, die aus der Acrylfamilie, wie Polyacrylamide und deren Derivate, Polyacrylate und deren Derivate, sowie Polyallyl- und Polyvinylverbindungen. In einer anderen Ausführungsform können die Mikrosphären der vorliegenden Erfindung auch auf der Kombination von Polyvinylacetat in Konjunktion mit einem kationischen, hydrophoben Polymer basieren. Alle diese Polymere sind vernetzt, so dass sie stabil und nicht-resorbierbar sind, und können in ihrer Struktur andere Chemikalien enthalten, die besondere Eigenschaften zeigen, wie chemotaktische Effekte, die Förderung der Zelladhäsion an Zellen oder Geweben.
Mikrosphären, die gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise mittels Injektion in verschiedene Stellen des Körpers implantiert werden sollen, bestehen aus einem nicht-resorbierbaren, hydrophilen Polymer, welches das geeignete Material für die Zelladhäsion enthält, und können zusätzlich strahlenundurchlässige Moleküle oder andere Markierungsmittel umfassen, um die Lokalisierung mittels Radiologie vor oder während des Eingriffs zu erleichtern.
Die Mikrosphären zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung sind nicht-toxisch für Gewebe und Zellen, sind biokompatibel und haften an verschiedenen Zellen und Geweben an der Implantationsstelle aufgrund des Zellwachstums, das sie fördern. Zudem sind diese Mikrosphären nicht-resorbierbar und nicht biologisch abbaubar und somit stabil, haltbar, und behalten ihre allgemeine Form und Lage bei, sobald sie an einer gewünschten Stelle implantiert sind. In einer alternativen Ausführungsform sind die Mikrosphären der vorliegenden Erfindung resorbierbar und somit biologisch abbaubar. Solche resorbierbaren und biologisch abbaubaren Mikrosphären beruhen z. B., ohne Einschränkung, auf Polysaccharid und Polysaccharidderivaten.
Im Allgemeinen können Mikrosphären zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung jede beliebige Form haben, wobei im Wesentlichen kugelförmige Mikrosphären bevorzugt sind. Mikrosphären zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung können Durchmesser in einem Bereich von etwa 10 μm bis etwa 2000 μm haben. Vorzugsweise haben Mikrosphären zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung, an deren Oberfläche Zellen haften, Durchmesser in einem Bereich von 40 μm bis 1000 μm.
Die elastischen Mikrosphären der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise durch Nadeln mit 18 Gauge oder kleiner injizierbar und werden durch Makrophagen oder andere Elemente des Immunsystems oder des Lymphsystems eliminiert. In solchen Fällen betragen die bevorzugten mittleren Durchmesser der Mikrosphären etwa 40 μm bis etwa 400 μm und noch bevorzugter etwa 50 bis etwa 200 μm. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegen die mittleren Durchmesser der injizierbaren Mikrosphären in einem Bereich von etwa 70 bis etwa 120 μm.
Bei einem anderen Aspekt der Erfindung basiert eine Untergruppe der Mikrosphären zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung auf nicht-toxischen, biokompatiblen, quellbaren, hydrophilen und im Wesentlichen sphärischen Teilchen, die verschiedene Polymere umfassen. Die quellbaren Mikrosphären sind vernetzte Polymere, die stark wasserabsorbierend und somit in der Lage sind, bei Kontakt mit einem wässrigen Medium unter bestimmten Bedingungen zu quellen. Wie für einen Fachmann ersichtlich ist, hängt der Quellgrad der vernetzten Polymere allgemein von den Eigenschaften der Polymermaterialien und vom Vernetzungsgrad ab. Eigenschaften, wie Salz- und Ionenkonzentration sowie der pH-Wert des Lösungsmittels, in dem die Mikrosphären suspendiert sind oder mit dem die Mikrosphären in Kontakt sind, beeinflussen ebenfalls den Quellgrad.
Durch sorgfältige Steuerung der Größe und des Quellgrades bestimmter vernetzter und quellbarer Polymere kann eine Embolisierung und Genabgabe unter Verwendung dieser Mikrosphären erreicht werden. Gemäß der Erfindung werden zuerst Polymermaterialien mit hohem Wasserabsorptionsvermögen ausgewählt. Die Quellbarkeit dieser Polymere kann ferner durch Steuern des Vernetzungsgrades manipuliert werden, was, wie dem Fachmann bekannt ist, entweder chemisch oder durch Strahlung erreicht werden kann.
Noch wichtiger kann das Quellen der Mikrosphären, welche diese Polymere umfassen, ferner durch Steuern des Lösungsmittels, in dem die Mikrosphären suspendiert sind, gesteuert werden. Dies wird durch zwei Schritte erreicht, wie sie hier offenbart sind. Zum ersten wird die Größe der Mikrosphären vor der Injektion sorgfältig gesteuert unter Verwendung entsprechender Lösungsmittel, Salzkonzentration und pH-Werte, gemäß den jeweils verwendeten Mikrosphären. Vor der Injektion können die Mikrosphären entweder ihre ursprüngliche Größe beibehalten oder durch ihren Kontakt mit dem Lösungsmittel auf ein gewisses Maß quellen. Die Aufquellung vor der Injektion wird so gesteuert, dass die Mikrosphären durch 30-Gauge-Nadeln oder kleineren Nadeln einfach injizierbar sind. Zum zweiten können. die Mikrosphären nach der Injektion und bei Kontakt mit Geweben an der Injektionsstelle bis zu einem gewissen Grad quellen oder ihre Größe vor der Injektion beibehalten, wobei es beide Größen ermöglichen, die Mikrosphären am Injektionsort zu sichern und den gewünschten Embolisierungs-Gentherapieeffekt zu erreichen. Der Grad des Quellens vor der Injektion und damit auch des Quellens nach der Injektion, wird durch die jeweils verwendeten Mikrosphären und die Art und Lage der zu behandelnden Hautdefekte bestimmt.
Mikrosphären zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung haben vor dem Quellen Durchmesser in einem Bereich von etwa 10 bis etwa 400 μm. Vorzugsweise betragen die Durchmesser der Mikrosphären vor dem Quellen etwa 10 bis etwa 200 μm und besonders bevorzugt etwa 10 bis etwa 120 μm. Nach der Injektion und dem Quellen haben die Mikrosphären Durchmesser von größer als etwa 40 μm, vorzugsweise größer als etwa 50 μm und besonders bevorzugt größer als etwa 70 μm. Die Mikrosphären der vorliegenden Erfindung können auf etwa das Fünfzehnfache ihrer ursprünglichen Größe quellen. Die volle Quellgröße der Mikrosphären nach der Injektion wird durch verschiedene Mittel, wie oben erörtert, so gesteuert, dass sie am Injektionsort gesichert sind, dabei aber keine potentiellen Verletzungen des Gewebes verursachen. Ferner sind die vollen Quellgrößen der Mikrosphären nach der Injektion durch solche Faktoren, wie die physiologischen Bedingungen des Injektionsortes, die ursprünglichen Mikrosphärengrößen, das verwendete Lösungsmittel und die Quellung der Mikrosphären vor der Injektion, vorbestimmt. Somit kann ein spezifischer Injektionsplan gemäß dem besonderen Bedarf an einer Embolisierungsgentherapie im jeweiligen Fall erstellt werden. Diese Größen und Eigenschaften der Mikrosphären sind insofern vorteilhaft, als sie es ermöglichen, dass die Mikrosphären einfach durch 30-Gauge-Nadeln oder kleinere Nadeln injizierbar sind, wobei die Mikrosphären jedoch groß genug sind, so dass sie am Injektionsort gesichert und nicht von Makrophagen oder anderen Elementen des Immunsystems verdaut oder eliminiert werden.
Mögliche Variationen der Mikrosphären der vorliegenden Erfindung umfassen das Ersetzen der Mikrosphären durch beliebige biokompatible, nicht-toxische, nicht-resorbierbare Polymerteilchen, Membranen, Fasern oder andere feste Substrate, die mit einem Mittel behandelt werden, das die Zelladhäsion fördert.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung von embolischem Material, bei dem es sich um eine flüssige, gelierbare Lösung handeln kann, wie sie im US-Patent Nr. 5,925,683 offenbart ist, dessen gesamter Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Die Erfindung umfasst auch lineare, lösliche Polymere, die sich nach der Injektion in situ vernetzen, um ein festes, die Zelladhäsion förderndes Füllmittel zu bilden. Die Herstellung und/oder Injektion leerer Mikrosphären (Mikroblasen), die vorab hergestellt oder an Ort und Stelle erzeugt werden, durch die Verwendung entsprechender Katheter, werden ebenfalls in dieser Erfindung in Betracht gezogen.
Die Mikrosphären oder andere feste Substrate zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung sind flexibel, so dass sie einfach in und durch Injektionsvorrichtungen und kleine Katheter eingebracht werden können, ohne dauerhaft verändert zu werden, wobei die Mikrosphären jedoch auch gegen Muskelkontraktionsbeanspruchung beständig sind, die während des Implantationsprozesses und danach erzeugt wird. Sie sind auch thermisch stabil, was eine einfache, zweckmäßige Sterilisation und Gefrierlagerung ermöglicht.
Die Mikrosphären oder andere feste Substrate zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung sind auch in Suspension stabil, so dass die Mikrosphären oder anderen festen Substrate in Suspension formuliert und gelagert sowie mit verschiedenen Flüssigkeiten injiziert werden können. Insbesondere gestattet es die hydrophile Beschaffenheit der Mikrosphären, dass sie in Suspension gebracht und insbesondere in Form von sterilen und pyrogenen (pyrogenfreien), injizierbaren Lösungen gebracht werden können, wobei gleichzeitig die Bildung von Aggregaten oder die Adhäsion an den Wänden von Lagerungsbehältern und Implantationsvorrichtungen, wie Kathetern, Spritzen, Nadeln und dergleichen, verhindert wird.
In einer Ausführungsform sind die bevorzugten Mikrosphären der vorliegenden Erfindung sowohl hydrophil als auch kationisch. Die Mikrosphären umfassen vorzugsweise ein Copolymer eines neutralen hydrophilen Monomers, eines difunktionellen Monomers, eines oder mehrerer Monomere mit kationischer Ladung und gegebenenfalls eines funktionalisierten Monomers, das die Mikrosphäre detektierbar machen kann. Die Mikrosphären können auch einen oder mehrere Zelladhäsionspromotoren und ein Markierungsmittel umfassen. Das Copolymer ist vorzugsweise ein hydrophiles Acryl-Copolymer, das in copolymerisierter Form etwa 25 bis etwa 98 Gew.-% neutrales, hydrophiles Acrylmonomer, etwa 2 bis etwa 50 Gew.-% bifunktionelles Monomer und etwa 0 bis etwa 50 Gew.-% eines oder mehrerer Monomere mit kationischer Ladung umfasst. Beispielshalber können die Copolymere, die im französischen Patent 2,378,808 beschrieben sind, welches hiermit durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird, gemäß dieser Erfindung zur Herstellung des Mikrosphären-Ausgangscopolymers verwendet werden. Als hydrophiles Acrylmonomer können Acrylamid und dessen Derivate, Methacrylamid und dessen Derivate oder Hydroxymethylmethacrylat verwendet werden. Beispiele für ein difunktionelles Monomer umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, N',N'-Methylen-bis-acrylamid, N',N'-Diallyltartiamid oder Glyoxal-bis-acrylamid. Ferner umfasst das Monomer mit kationischer Ladung, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, solche, die eine tertiäre oder quaternäre Aminfunktion tragen, vorzugsweise Diethylaminoethylacrylamid, Methacrylamidopropyltrimethylammonium oder Acrylamidoethyltriethylammonium. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein Copolymer, das etwa 25 bis etwa 98 Gew.-% Methacrylamid, etwa 2 bis etwa 50 Gew.-% N,N-Methylen-bis-acrylamid umfasst, verwendet.
Gemäß einem weiteren, ähnlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die Hydrophobizität oder der ionische Charakter des embolischen Materials nach Bedarf modifiziert werden, indem, z. B. ohne Einschränkung Kohlenwasserstoffketten und/oder hydrophile, ionisierbare chemische Gruppen eingeführt werden. Solche Modifikationen des embolischen Materials führen zu einer erhöhten Adsorptionsstärke zwischen dem bioaktiven, therapeutischen Faktor und dem Transfektionsmittel, die ausreicht, um die Zeitspanne für die Abgabe von bioaktivem, therapeutischem Faktor zu modulieren. Eine solche Modulation der Adsorptionsstärke zwischen dem bioaktiven, therapeutischen Faktor und dem Transfektionsmittel kann auch dazu eingesetzt werden, die absolute Menge des bioaktiven, therapeutischen Faktors, die mit dem embolischen Material assoziiert ist, zu kontrollieren.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist es möglich, die Stabilität der Mikrosphären durch Vernetzen des Adhäsionsmittels zu erhöhen. Beispielsweise kann im Falle von Gelatine das Vernetzungsmittel unter den bifunktionellen chemischen Mitteln ausgewählt werden, die auf die Gelatinamine reagieren (z. B. Glutaraldehyd, Formaldehyd, Glyoxal und dergleichen).
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, die Mikrosphäre bei Licht und im Körper sichtbar zu machen. Beispielsweise ist es auch möglich, die Mikrosphären nach ihrer Synthese zu markieren. Dies kann z. B. dadurch erfolgen, dass Fluoreszenzmarker-Derivate (wie z. B. Fluorescinisothyocyanat (FITC), Rhodaminisothiocyanat (RITC) und dergleichen) aufgepfropft werden. Das funktionalisierte Monomer wird meist durch chemische Kopplung des Monomers mit einem Marker erreicht, bei dem es sich um einen chemischen Farbstoff, wie Cibacron Blue oder Procion Red HE-3B, handeln kann, was eine direkte Visualisierung der Mikrosphären ermöglicht (Boschetti, J. Biochem-Biophys. Meth., 19: 21–36 (1989)). Beispiele für ein funktionalisiertes Monomer, das für diese Art der Markierung verwendbar ist, umfassen N-Acryloylhexamethylen-Cibacrone Blue oder N-Acryloylhexamethylen-Procion Red HE-3B, ein Magnetresonanz-Bildgebungsmittel (Erbium, Gadolinium oder Magnetit), ein Kontrastmittel, wie Barium- oder Iodsalze (einschließlich z. B. Acrylamino-e-propionamido)-3-triiod-2,4,6-benzoesäure, die unter den von Boschetti et al. (Bull. Soc. Chim., Nr. 4, Frankreich, (1986)) beschriebenen Bedingungen hergestellt werden können. Im Falle von Barium oder Magnetitsalzen können diese direkt in Pulverform in die anfängliche Monomerlösung eingebracht werden.
In der vorliegenden Erfindung können verschiedene Arten von Zelladhäsionspromotoren verwendet werden, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind. Insbesondere können die Zelladhäsionspromotoren ausgewählt sein unter Collagen, Gelatine, Glucosaminoglykanen, Fibronektinen, Lektinen, Polykationen (wie Polylysin, Chitosan und dergleichen), oder einem anderen natürlichen oder synthetischen biologischen Zelladhäsionsmittel.
Der Zelladhäsionspromoter ist in der Mikrosphäre oder einem anderen festen Substrat vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,1 bis 1 g pro ml abgesetzter Mikrosphären vorhanden.
Mikrosphären werden mittels Suspensionspolymerisation, tropfenweise Polymerisation oder einem anderen, dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt. Der gewählte Modus der Mikrosphärenherstellung hängt üblicherweise von den gewünschten Merkmalen, wie dem Mikrosphärendurchmesser und der chemischen Zusammensetzung, für die resultierenden Mikrosphären ab. Die Mikrosphären der vorliegenden Erfindung können mittels üblicher Polymerisationsverfahren hergestellt werden, wie sie im Stand der Technik beschrieben sind (siehe z. B. E. Boschetti, Microspheres for Biochromatography and Biomedical Applications. Part I, Preparation of Microbeads in: Microspheres, Microencapsulation and Liposomes, John Wiley & Sons, Arshady R., Herausgeber, Nummer 2, Seiten 171–189 (1999). Mikrosphären werden ausgehend von einer wässrigen Lösung von Monomeren, die Adhäsionsmittel, wie Collagen (Gelatine ist ein denaturiertes Collagen), enthält, hergestellt. Dann wird die Lösung mit einem nicht-wässrigen, kompatiblen Lösungsmittel vermischt, um eine Suspension von Tröpfchen zu erzeugen, die dann durch Polymerisation von Monomeren mittels entsprechender Katalysatoren in ein festes Gel umgewandelt werden. Dann werden die Mikrosphären durch Filtration oder Zentrifugation gesammelt und gewaschen.
Zelladhäsionspromotoren oder Markierungsmittel werden auf Mikrosphären durch chemische Kopplungsverfahren eingebracht, die in der Affinitätschromatographie hinlänglich bekannt sind und mit dem Begriff „Liganden-Immobilisierung" bezeichnet werden. Ein weiteres Verfahren zum Einbringen erfolgt durch Diffusion innerhalb des Gelnetzwerks, das die Mikrosphäre bildet, und anschließendes Festhalten der diffundierten Moleküle an Ort und Stelle mittels Präzipitation oder chemischer Vernetzung.
Die erfindungsgemäßen Mikrosphiren können auch mit üblichen Polymerisationsverfahren erhalten werden, die im Stand der Technik beschrieben sind, wie z. B. im französischen Patent 2,378,808 , in den US-Patenten Nr. 5,648,100 , 5,635,215 und 5,648,100 . Im Allgemeinen wird die Polymerisation von Monomeren in Lösung bei einer Temperatur in einem Bereich von etwa 0°C bis etwa 100°C und zwischen etwa 40°C und etwa 60°C in Gegenwart eines Polymerisationreaktions-Initiators durchgeführt.
Der Polymerisationsinitiator ist vorteilhafterweise ausgewählt unter den Redoxsystemen. Insbesondere ist es möglich, Kombinationen eines Alkalimetallpersulfats mit N,N,N',N',-Tetramethylethylendiamin oder mit Dimethylaminopropionitril, organischen Peroxiden, wie Benzoylperoxiden oder auch 2,2'-azo-bis-isobutyronitil, zu verwenden. Die Menge des verwendeten Initiators wird vom Fachmann an die Menge der Monomere und die angestrebte Polymerisationsrate angepasst. Die Polymerisation kann in Masse oder in Emulsion durchgeführt werden.
Im Falle einer Massepolymerisation durchlauft die wässrige Lösung, welche die verschiedenen gelösten Bestandteile und den Initiator enthält, eine Polymerisation in einem homogenen Medium. Dies ermöglicht es, zu einem Klumpen von wässrigem Gel zu gelangen, der dann in Mikrosphären getrennt werden kann, in dem er z. B. durch die Maschen eines Siebes geführt wird.
Die Emulsions- oder Suspensionspolymerisation ist das bevorzugte Herstellungsverfahren, da sie einen direkten Zugang zu Mikrosphären einer gewünschten Größe ermöglicht. Sie kann wie folgt durchgeführt werden: die wässrige Lösung, welche die verschiedenen gelösten Bestandteile (z. B. verschiedene Monomere, Zelladhäsionsmittel) enthält, wird durch Rühren mit einer flüssigen organischen Phase vermischt, die nicht mit Wasser mischbar ist, gegebenenfalls in Gegenwart eines Emulgators. Die Rührgeschwindigkeit wird so eingestellt, dass eine wässrige Phasenemulsion in der organischen Phase erhalten wird, die Tropfen mit einem gewünschten Durchmesser ergibt. Dann wird die Polymerisation durch Zugabe des Initiators gestartet. Sie wird von einer exothermen Reaktion begleitet, und ihre Entwicklung kann dann durch Messen der Temperatur des Reaktionsmediums verfolgt werden.
Es ist möglich, als organische Phase Pflanzen- oder Mineralöle, bestimmte Petroleumdestillationsprodukte, chlorierte Kohlenwasserstoffe oder ein Gemisch dieser verschiedenen Lösungen zu verwenden. Ferner ist es möglich, wenn der Polymerisationsinitiator mehrere Komponenten enthält (Redox-System), eine davon vor der Emulsionsbildung zu der wässrigen Phase zu geben.
Die so erhaltenen Mikrosphären können dann durch Kühlen, Dekantieren und Filtration gewonnen werden. Dann werden sie nach Größenkategorie getrennt und gewaschen, um jegliche Spur von Nebenprodukten zu beseitigen.
Auf die Polymerisationsstufe kann eine Stufe der Vernetzung des Zelladhäsionsmittels und möglicherweise eine Markierungsmittelstufe im Falle von Mikrosphären, die durch Aufpfropfen nach Synthese identifizierbar gemacht werden, folgen.
4.2 Bioaktive therapeutische Faktoren
Die bioaktiven therapeutischen Faktoren der vorliegenden Erfindung umfassen mindestens eine oder mehrere der folgenden Substanzen: Antineoplastische Mittel, Antiangiogenesemittel, Hormone und Steroide, Vitamine, Peptide und Peptidanaloga, Antikörper oder Fragmente davon, antimitotische Faktoren, Impfstoffe, Enzyme, antiallergene Mittel, zirkulatorische Arzneimittel, antituberkulöse Mittel, antivirale Mittel, antianginale Mittel, antibakterielle Mittel und antifungale Mittel, entzündungshemmende Mittel, antiprotozoische Mittel, antirheumatische Mittel, Narkotika, Herz-Glykosidmittel, Sedativa, Lokalanästhetika, antihistaminische Arzneimittel, strahlenempfindliche Mittel, Allgemeinanästhetika, oder Kombinationen daraus.
4.3 Bioaktive therapeutische Faktoren zur Verwendung in der Gentherapie
Bei der Polyonukleotid-basierten Embolotherapie-Gentherapie kann das Polynukleotid einen der bioaktiven therapeutischen Faktoren der vorliegenden Erfindung codieren, wobei das Polynukleotid mit einem Transfektionsmittel der vorliegenden Erfindung assoziiert ist. Genetische Materialien, welche die bioaktiven therapeutischen Faktoren der vorliegenden Erfindung codieren, umfassen beispielsweise, ohne Einschränkung, Nukleinsäuren, Polynukleotide, RNA und DNA, entweder natürlichen oder synthetischen Ursprungs, einschließlich rekombinanter RNA und DNA sowie Antisense-RNA und -DNA, Hammerkopf-RNA, Ribozyme, Antigennukleinsäuren, sowohl einsträngige als auch doppelsträngige RNA und DNA und Analoga davon, wie Phosphorthioat und Phosphordithioatoligodesoxynukleotide. Arten von genetischem Material, die verwendet werden können, umfassen z. B. Gene, die auf Expressionsvektoren getragen werden, wie Plasmide, Phagemide, Cosmide, künstliche Hefechromosomen (YAC) und fehlerhafte oder „Helfer"-Viren, sowie virusartige Teilchen, die das genetische Material tragen. Solche Polynukleotide können in Kombination mit anderen Elementen, wie z. B., ohne Einschränkung, gewebespezifischen Enhancern, Kernlokalisationssignalen, usw. verwendet werden.
Zusätzlich kann das genetische Material beispielsweise mit Proteinen oder anderen Polymeren kombiniert sein. In einer Ausführungsform sieht die Erfindung auch die Verwendung zielgerichteter polyklonaler und monoklonaler Antikörper in Konjunktion mit dem Polymermaterial-Träger, dem bioaktiven therapeutischen Faktor und dem Transfektionsmittel vor. Einige Beispiele für Gentherapeutika, die unter Verwendung der Mikrosphären der vorliegenden Erfindung angewandt werden können, umfassen DNA, die zumindest einen Teil eines HLA-Gens codiert, DNA, die zumindest einen Teil von Dystrophin codiert, DNA, die zumindest einen Teil des cystischen Fibrose-Transmembranregulators (CFTR) codiert, DNA, die zumindest einen Teil von IL-2 codiert, DNA, die zumindest einen Teil von TNF codiert, ein Antisense-Oligonukleotid, das in der Lage ist, DNA zu binden, die zumindest einen Teil von Ras codiert. DNA, die bestimmte Proteine codiert, kann zur Behandlung vieler verschiedener Arten von Erkrankungen verwendet werden. Beispielsweise kann Tumornekrosefaktor und/oder Interleukin-2 zur Behandlung von fortgeschrittenen Krebsformen vorgesehen sein; der HDL-Rezeptor kann zur Behandlung von Lebererkrankungen vorgesehen sein; Thymidinkinase kann zur Behandlung von Eierstockkrebs, Hirntumoren oder HIV-Infektion vorgesehen sein; HLA-B7 kann zur Behandlung maligner Melanome vorgesehen sein; Interleukin-2 kann zur Behandlung von Neuroblastomen, malignen Melanomen oder Nierenkrebs vorgesehen sein; Interleukin-4 kann zur Behandlung von Krebs vorgesehen sein; HIV env kann zur Behandlung einer HIV-Infektion vorgesehen sein; Antisense ras/p53 kann zur Behandlung von Lungenkrebs vorgesehen sein; Adenosindeaminase kann zur Behandlung von ADA-Defizienz vorgesehen sein; und Faktor VIII kann zur Behandlung von Hämophilie B vorgesehen sein, siehe z. B. Science 258, 744–746.
4.4 Bioaktive Therapeutische Faktoren zur Verwendung in der Arzneimitteltherapie
Für den Arzneimittel-basierten Embolotherapie-Aspekt der Erfindung umfassen die bioaktiven therapeutischen Faktoren eines oder mehrere der folgenden Mittel, assoziiert mit einer erfindungsgemäßen Mikrosphre.
Antineoplastische Mittel umfassen z. B., ohne Einschränkung, Platinverbindungen (z. B. Spiroplatin, Cisplatin, und Carboplatin), Adriamycin, Mitomycin c, Ansamitocin, Bleomycin, Bleomycinsulfat, Cytosinarabinosid, Arabinosyladenin, Mercaptopolylysin, Vincristin, Busulfan, Chlorambucil, Melphalan (z. B. PAM, L-PAM oder Phenylalanin-Mustard), Mercaptopurin, Mitotan, Procarbazinhydrochlorid, Dactinomycin (Actinomycin D), Daunorubicinhydrochlorid, Doxorubicinhydrochlorid, Taxol, Mitomycin, Plicamycin (Mithramycin), Aminoglutethimid, Estramustinphosphatnatrium, Flutamid, Leuprolidacetat, Megestrolacetat, Tamoxifencitrat, Testolacton, Trilostan, Amsacrin (m-AMSA), Asparaginase (L-Asparaginase), Erwina-Asparaginase, Etoposid (VP-16), Interferon α-2a, Interferon α-2b, Teniposid (VM-26), Vinblastinsulfat (VLB), Vincristinsulfat, Methotrexat und Carzelesin.
Blutprodukte umfassen beispielsweise ohne Einschränkung Erythropoietin, parenterales Eisen, Hämin, und Hämatoporphyrine und deren Derivate.
Biologische Antwortmodifikatoren umfassen z. B., ohne Einschränkung, Muramyldipeptid, Muramyltripeptid, Lymphokine (z. B. bakterielles Endotoxin, wie Lipopolysaccharid, Makrophagenaktivierungsfaktor), Untereinheiten von Bakterien (wie Mycobakterien, Corynebakterien), das synthetische Dipeptid, N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin und Prostaglandine.
Antifungale Mittel umfassen z. B., ohne Einschränkung, Ketoconazol, Nystatin, Griseofulvin, Flucytosin (5-fc), Miconazol, Amphotericin B, Ricin und .beta.-Lactam-Antibiotika (z. B. Sulfazecin).
Hormone und Steroide umfassen z. B., ohne Einschränkung, Wachstumshormon, Melanocyt-stimulierendes Hormon, adrenocortiotropisches Hormon, Dexamethason, Dexamethasonacetat, Dexamethasonnatriumphosphat, Cortison, Cortisonacetat, Hydrocortison, Hydrocortisonacetat, Hydrocortisoncypionat, Hydrocortisonnatriumphosphat, Hydrocortisonnatriumsukzinat, Prednison, Prednisolon, Prednisolonacetat, Prednisolonnatriumphosphat, Prednisolontebutat, Prednisolonpivalat, Triamcinolon, Triamcinolonacetonid, Triamcinolonhexacetonid, Triamcinolondiacetat, Methylprednisolon, Methylprednisolonacetat, Methylprednisolonnatriumsukzinat, Flunsolid, Beclomethasondipropionat, Betamethasonnatriumphosphat, Betamethason, Vetamethasondinatriumphosphat, Vetamethasonnatriumphosphat, Betamethasonacetat, Betamethasondinatriumphosphat, Chlorprednisonacetat, Corticosteron, Desoxycorticosteron, Desoxycorticosteronacetat, Desoxycorticosteronpivalat, Desoximethason, Estradiol, Fludrocortison, Fludrocortisonacetat, Dichlorisonacetat, Fluorohydrocortison, Fluormetholon, Fluprednisolon, Paramethason, Paramethasonacetat, Androsteron, Fluoxymesteron, Aldosteron, Methandrostenolon, Methylandrostendiol, Methyltestosteron, Norethandrolon, Testosteron, Testosteronenanthat, Testosteronpropionat, Equilenin, Equilin, Estradiolbenzoat, Estradioldipropionat, Estriol, Estron, Estronbenzoat, Acetoxypregnenolon, Anagestonacetat, Chlormadinonacetat, Flurogestonacetat, Hydroxymethylprogesteron, Hydroxymethylprogesteronacetat, Hydroxyprogesteron, Hydroxyprogesteronacetat, Hydroxyprogesteroncaproat, Melengestrolacetat, Normethisteron, Pregnenolon, Progesteron, Ethynylestradiol, Mestranol, Dimethisteron, Ethisteron, Ethynodioldiacetat, Norethindron, Norethindronacetat, Norethisteron, Fluocinolonacetonid, Flurandrenolon, Flunisolid, Hydrocortisonnatriumsukzinat, Methylprednisolonnatriumsukzinat, Prednisolonphosphatnatrium, Triamcinolonacetonid, Hydroxydionnatriumspironolacton, Oxandrolon, Oxymetholon, Prometholon, Testosteroncypionat, Testosteronephenylacetat, Estradiolcypionat und Norethynodrel.
Vitamine umfassen z. B., ohne Einschränkung, Cyanocobalaminneinonsäure, Retinoide und Derivate davon, wie Retinolpalmitat, alpha.-Tocopherol, Naphthochinon, Cholecalciferol, Folsäure und Tetrahydrofolat.
Peptide und Peptidanaloga umfassen z. B., ohne Einschränkung, Manganhyperoxiddismutase, Gewebeplasminogenaktivator (t-PA), Glutathion, Insulin, Dopamin, Peptidliganden, enthaltend RGD, AGD, RGE, KGD, KGE oder KQAGDV (Peptide mit Affinität für den GPIIBIIIa-Rezeptor), Opiatpeptide, Enkephaline, Endorphine und deren Analoga, menschliches Choriongonadotropin (HCG), Corticotropin Release Factor (CRF), Cholecystokinine und deren Analoga, Bradykinine und deren Analoga und Promotoren und Inhibitoren, Elastine, Vasopressine, Pepsine, Glucagon, Substanz P, Integrine, Captopril, Enalapril, Lisinopril und andere ACE-Inhibitoren, adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Oxytocin, Calcitonine, IgG oder Fragmente davon, IgA oder Fragmente davon, IgM oder Fragmente davon, Liganden für Effektorzellenproteaserezeptoren (alle Subtypen), Thrombin, Streptokinase, Urokinase, t-PA und alle aktiven Fragmente oder Analoga, Proteinkinase C und deren Bindungsliganden, Interferone (.alpha.-Interferon, .beta.-Interferon, .gamma.-Interferon), Kolonie-stimulierende Faktoren (CSF), Granulocytenkolonie-stimulierende Faktoren (GCSF), Granulocytenmakrophagenkolonie-stimulierende Faktoren (GM-CSF), Tumomekrosefaktoren (TNF), Nervenwachstumsfaktoren (NGF), thrombozytäre Wachstumsfaktoren (platelet-derived growth factors), Lymphotoxin, epidermale Wachstumsfaktoren, Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, vaskuläre Endothelzellen-Wachstumsfaktoren, Erythropoietin, transformierende Wachstumsfaktoren, Oncostatin M, Interleukine (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 und 12), Metallproteinkinaseliganden, Collagenasen und Agonisten und Antagonisten.
In der vorliegenden Verwendung umfassen Antikörper z. B., ohne Einschränkung, im Wesentlichen gereinigte Antikörper oder Fragmente davon, einschließlich nicht-menschlicher Antikörper oder Fragmente davon. In verschiedenen Ausführungsformen können die im Wesentlichen gereinigten Antikörper der Erfindung oder Fragmente davon menschliche, nicht-menschliche, chimäre und/oder humanisierte Antikörper sein. Solche nicht-menschlichen Antikörper können Ziegen-, Mause-, Schafs-, Pferde-, Hühner-, Kaninchen- oder Ratten-Antikörper sein. Alternativ dazu können die nicht-menschlichen Antikörper der Erfindung chimäre und/oder humanisierte Antikörper sein. Vollständig menschliche Antikörper sind besonders wünschenswert für eine therapeutische Behandlung menschlicher Patienten. Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, bei dem verschiedene Teile von verschiedenen Tierspezies stammen, wie diejenigen, die eine variable Region aufweisen, welche von einem Maus-mAb und einer konstanten Region von menschlichem Immunglobulin abgeleitet ist (Cabilly et al., U.S.-Patent Nr. 4,816,567 ; und Boss et al., U.S.-Patent Nr. 4,816397 ). Zusätzlich können die innerhalb des Umfangs der Erfindung in Betracht gezogenen, nicht-menschlichen Antikörper polyklonale Antikörper oder monoklonale Antikörper sein. Jeder der erfindungsgemäßen Antikbrper kann mit einer therapeutischen Einheit oder einer detektierbaren Substanz konjugiert sein. Nicht einschränkende Beispiele für detektierbare Substanzen, die mit den erfindungsgemäßen Antikörpern konjugiert sein können, sind ein Enzym, eine prosthetische Gruppe, ein fluoreszierendes Material, ein lumineszentes Material, ein biolumineszentes Material und ein radioaktives Material.
Die Erfindung sieht die Verwendung zielgerichteter polyklonaler und monoklonaler Antikörper in Konjunktion mit dem Polymermaterialträger, dem bioaktiven therapeutischen Faktor und dem Transfektionsmittel vor. Solche Antikörper sind für das Verfahren der Erfindung brauchbar und ermöglichen die zielgerichtete Abgabe des Polymermaterials und des bioaktiven therapeutischen Faktors, der mit dem Transfektionsmittel verbunden ist, an den Wirkort. Der Begriff "monoklonaler Antikörper" oder "monoklonale Antikörperzusammensetzung" bezieht sich, so wie er hier verwendet wird, auf eine Population von Antikörpermolekülen, die nur eine Spezies einer Antigenbindungsstelle aufweisen, welche zu einer Immunreaktion mit einem bestimmten Epitop in der Lage ist. Polyklonale Antikörper können, wie oben beschrieben, hergestellt werden durch Immunisieren eines geeigneten Subjektes mit einem Polypeptid der Erfindung als Immunogen. Bevorzugte polyklonale Antikörperzusammensetzungen sind diejenigen, welche für Antikörper gewählt wurden, die gegen ein oder mehrere Polypeptid/e z. B. eines Rezeptors an der Oberfläche einer Krebszelle eines Tumors gerichtet sind, der mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zu behandeln ist.
Anti-mitotische Faktoren umfassen ohne Einschränkung Estramustin und dessen phosphoryliertes Derivat, Estramustinphosphat, Doxorubicin, Amphethinil, Combretastatin A4 und Colchicin.
Vakzine umfassen z. B., ohne Einschränkung, Pneumokokkenvakzin, Poliomyelitisvakzin, Anthraxvakzin, Tuberkulose (BCG)-Vakzin, Hepatitis A-Vakzin, Choleravakzin, Meningokokken A, C, Y Vakzine, W135-Vakzin, Pestvakzin, Tollwut (Human-Diploid)-Vakzin, Gelbfiebervakzin, Japanencephalitis-Vakzin, Typhusvakzin (Phenol- und Hitzeabgetötet), Hepatitis B-Vakzin, Diptherievakzin, Tetanusvakzin, Keuchhustenvakzin, H. influenzae Typ B-Vakzin, Poliovakzin, Masernvakzin, Mumpsvakzin, Rubellavakzin, Varizellenvakzin, Streptokokkus pneumoniae Ty (lebendmutante Bakterien)-Vakzin, Vi (Vi-Kapselpolysaccharid)-Vakzin, DT (Toxoid)-Vakzin, Td (Toxoid)-Vakzin, aP (inaktives bakterielles Antigen/azelluläres (DtaP))-Vakzin, Hib (bakterielles Polysaccharid-Protein-Konjugat)-Vakzin, Hepatitis B-Virus (inaktiviertes, Serum-abgeleitetes virales Antigen/rekombinantes Antigen)-Vakzin, Grippevakzin, Rotavirus-Vakzin, respiratorisches Synzytialvirus (RSV)-Vakzin, Humanastrovirusvakzin, Rotavirusvakzin, Humaninfluenza A- und B-Virus-Vakzin, Hepatitis A-Virus-Vakzin, Parainfluenzavirus Typ 3 attenuiertes Lebendvakzin, Enterovirusvakzine, Retrovirusvakzine und Picomavirusvakzine.
Erkrankungen, die mit den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, umfassen z. B., ohne Einschränkung, Tumore, die in Zusammenhang stehen mit der Leber, der Niere, akuter lymphoblastischer Leukämie, akuter myeloider Leukämie, Ewing-Sarkom, gestationsbedingtem, trophoblastischem Karzinom, Hodgkin-Syndrom, Nicht-Hodgkin-Lymphom, Burkitt-Lymphom, diffusem großzelligem Lymphom, follikulärem gemischtem Lymphom, lymphoblastischem Lymphom, Rhabdomyosarkom, Hodenkarzinom, Wilms-Tumor, Analkarzinom, Blasenkarzinom, Brustkarzinom, chronischer lymphozytischer Leukämie, chronischer myelogener Leukämie, Haarzellleukämie, Kopf- und Halskarzinom, (kleinzelligem) Lungenkarzinom, multiplem Myelom, Nicht-Hodgkin-Lymphom, Follikellymphom, Eierstockkarzinom, Hirntumoren (Astrocytom), Zervixkarzinom, Kolorektalkarzinom, Leberzellkarzinom, Kaposi-Sarkom, (nicht-kleinzelligem) Lungenkarzinom, Melanom, Pankreaskarzinom, Prostatakarzinom, Weichteilsarkom, Brustkarzinom, Kolorektalkarzinom (Stufe III), osteogenem Sarkom, Eierstockkarzinom (Stufe III), Hodenkarzinom oder Kombinationen daraus, in Zusammenhang stehen.
Enzyme umfassen z. B., ohne Einschränkung, alkalische Phosphatase, Cyclooxygenase Typ I sowie Agonisten und Antagonisten.
Antiallergene Mittel umfassen z. B., ohne Einschränkung, Amelexanox.
Antikoagulationsmittel umfassen z. B., ohne Einschränkung, Phenprocoumon und Heparin.
Zirkulatorische Arzneimittel umfassen z. B., ohne Einschränkung, Propranolol.
Antituberkulöse Mittel umfassen z. B., ohne Einschränkung, para-Aminosalicylsäure, Isoniazid, Capreomycinsulfatcycloserin, Ethambutolhydrochloridethionamid, Pyrazinamid, Rifampin und Streptomycinsulfat.
Antivirale Mittel umfassen z. B., ohne Einschränkung, Acyclovir, Amantadinazidothymidin (AZT oder Zidovudin); Ribavirin und Vidarabinmonohydrat (Adeninarabinosid, ara-A).
Antianginale Mittel umfassen z. B., ohne Einschränkung, Diltiazem, Nifedipin, Verapamil, Erythritoltetranitrat, Isosorbiddinitrat, Nitroglycerin (Glyceryltrinitrat) und Pentaerythritoltetranitrat.
Antibiotika umfassen beispielsweise Dapson, Chloramphenicol, Neomycin, Cefaclor, Cefadroxil, Cephalexin, Cephradinerythromycin, Clindamycin, Lincomycin, Amoxicillin, Ampicillin, Bacampicillin, Carbenicillin, Dicloxacillin, Cyclacillin, Picloxacillin, Hetacillin, Methicillin, Nafcillin, Oxacillin, Penicillin G, Penicillin V, Ticarcillin, Rifampin und Tetracyclin.
Antiinflammatorische Mittel und Analgetika umfassen z. B. Diflunisal, Ibuprofen, Indomethacin, Meclofenamat, Mefenaminsäure, Naproxen, Oxyphenbutazon, Phenylbutazon, Piroxicam, Sulindac, Tolmetin, Aspirin und Salicylate.
Antiprotozoische Mittel umfassen z. B., ohne Einschränkung, Chloroquin, Metronidazol, Hydroxychloroquin, Chinin und Megluminantimonat.
Antirheumatische Mittel umfassen z. B., ohne Einschränkung, Penicillamin.
Narkotika umfassen z. B., ohne Einschränkung, schmerzstillende Mittel und Opiate, wie Codein, Heroin, Methadon, Morphium und Opium.
Herzglycosidmittel umfassen z. B., ohne Einschränkung, Deslanosid, Digitoxin, Digoxin, Digitalin und Digitalis.
Neuromuskuläre Blocker umfassen z. B., ohne Einschränkung, Atracuriummesylat, Gallamintriethiodid, Hexafluoreniumbromid, Metocuriniodid, Pancuroniumbromid, Succinylcholinchlorid (Suxamethoniumchlorid), Tubocurarinchlorid und Vecuroniumbromid.
Sedativa (Hypnotika) umfassen z. B., ohne Einschränkung, Amobarbital, Amobarbitalnatrium, Aprobarbital, Butabarbitalnatrium, Chloralhydrat, Ethchlorvynol, Ethinamat, Flurazepamhydrochlorid, Glutethimid, Methotrimeprazinhydrochlorid, Methyprylon, Midazolamhydrochloridparaldehyd, Pentobarbital, Pentobarbitalnatrium, Phenobarbitalnatrium, Secobarbitalnatrium, Talbutal, Temazepam und Triazolam.
Lokalanästhetika umfassen z. B., ohne Einschränkung, Bupivacainhydrochlorid, Chloroprocainhydrochlorid, Etidocainhydrochlorid, Lid ocainhydrochlorid, Mepivacainhydrochlorid, Procainhydrochlorid und Tetracainhydrochlorid.
Allgemeinanästhetika umfassen z. B., ohne Einschränkung, Droperidol, Etomidat, Fentanylcitrat mit Droperidol, Ketaminhydrochlorid, Methohexitalnatrium und Thiopentalnatrium.
Radioaktive Teilchen oder radioaktive Ionen umfassen z. B., ohne Einschränkung, Strontium, Rhenium, Yttrium, Technetium und Kobalt.
Vorzugsweise ist der bioaktive therapeutische Faktor ein antineoplastisches Mittel, ein Hormon, ein Steroid, ein antifungales Mittel, ein Peptid oder ein Peptidanalog. Noch bevorzugter ist das bioaktive Mittel Dexamethason, Amphotericin B, Adriamycin, Mitomycin c, Taxol, Doxorubicin oder Gewebeplasminogenaktivator (t-PA). Der bioaktive therapeutische Faktor, der bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist vorzugsweise in niedrigen Konzentrationen hochaktiv. Die Zielgebungsaspekte der Erfindung ermöglichen ferner die Anwendung verringerter Dosen zur Therapie, da die wirksame Konzentration an der therapeutischen Stelle im Körper unverdünnt bleibt. Die Menge des bioaktiven therapeutischen Faktors der vorliegenden Erfindung, die einem Patienten zu verabreichen ist, hängt z. B. ab vom jeweils verwendeten bioaktiven therapeutischen Faktor, vom Verfahren, mit dem der bioaktive therapeutische Faktor verabreicht wird, und von Alter, Geschlecht, Gewicht und körperlichem Zustand des Patienten. Allgemein wird die Behandlung mit geringen Dosen initiiert, die dann um kleine Inkremente erhöht werden können, bis der gewünschte Effekt unter diesen Umständen erreicht ist. Zusätzlich kann sich der Fachmann auf Referenzmaterialien stützen, wie The Physician's Desk Reference, veröffentlicht von der Medical Economics Company in Montvale, N. J. 07645-1742, um die geeignete Menge eines bestimmten bioaktiven therapeutischen Faktors und somit das entsprechende erfindungsgemäße Prodrug zu bestimmen, das einem Patienten im Falle einer Kombination aus therapeutischem Arzneimittel und Gentherapie unter Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verabreicht werden kann. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Prodrug dem Patienten (z. B. in einer Region des Patienten) beispielsweise zum Zwecke der Behandlung eines Zustandes (d. h. eines Erkrankungszustandes, einer Krankheit, Störung usw.) des Patienten verabreicht. Die Prodrugs können wie oben verwendet oder in andere Ausführungsformen, wie Emulsionen, integriert werden.
4.5 Transfektionsmittel zur Polynukleotidabgabe
Genetisches Material, umfassend Nukleinsäuren, Polynukleotide, RNA und DNA natürlichen oder synthetischen Ursprungs, wie rekombinante RNA und DNA sowie Antisense-RNA und -DNA; Hammerkopf-RNA, Ribozyme, Antigennukleinsäuren, sowohl einsträngige als auch doppelsträngige RNA und DNA und Analoga davon, gegebenenfalls in Kombination mit anderen Elementen, wie z. B., ohne Einschränkung, gewebespezifischen Enhancern und Kernlokalisationssignalen, können in eukaryontische Zellen über herkömmliche Transformations- oder Transfektionstechniken eingebracht werden. Gemäß der vorliegenden Verwendung sollen sich die Begriffe „Transformation" und „Transfektion" auf verschiedene im Stand der Technik anerkannte Techniken zum Einbringen von Fremdnukleinsäure in eine Wirtszelle beziehen, wie z. B., ohne Einschränkung, Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation. Geeignete Verfahren zum Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen finden sich in Sambrook, et al. (supra) und anderen Laborhandbüchern.
Für eine stabile Transfektion von Säugerzellen ist es bekannt, dass abhängig vom eingesetzten Expressionsvektor und Transfektionsverfahren nur eine kleine Fraktion der Zellen die Fremd-DNA in ihr Genom integrieren kann. Um diese Integratoren zu identifizieren und auszuwählen, wird ein Gen, das einen selektierbaren Marker codiert (z. B. für Resistenz gegen Antibiotika), allgemein zusammen mit dem interessierenden Gen in die Wirtszellen eingebracht. Bevorzugte selektierbare Marker umfassen diejenigen, die Arzneimitteln Widerstandsfähigkeit verleihen, wie G418, Hygromycin und Methotrexat. Zellen, die stabil mit der eingeführten Nukleinsäure transfiziert sind, können durch Arzneimittelselektion identifiziert werden (z. B. überleben Zellen, in die der selektierbare Marker integriert ist, während die anderen Zellen absterben).
Um einen wirksamen in vivo-Transfer der bioaktiven therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zu erhalten, werden verschiedene Transfektionsmittel eingesetzt. Repräsentative Beispiele für Transfektionsmittel, die zur Verwendung bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen, ohne Einschränkung, Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, quaternäres Ammonium, amphiphiles DOTMA ((Dioleoyloxypropyl)trimethylammoniumbromid, kommerziell erhältlich als Lipofectin von GIBCO-BRL)) (Felgner et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413–7417; Malone et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6077–6081); lipophile Glutamatdiester mit überhängenden Trimethylammoniumköpfen (Ito et al. (1990) Biochem. Biophys. Acta 1023, 124–132); die metabolisierbaren Grundlipide, wie das kationische Lipid Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS, Transfectam, Promega) und Dipalmitoylphosphatidylethanolamylspermin (DPPES) (J. P. Behr (1986) Tetrahedron Lett. 27, 5861–5864; J. P. Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982–6986); metabolisierbare quatemäre Ammoniumsalze (DOTB, N-(1-[2,3-Dioleoyloxy]propyl)-N,N,N-trimethylammoniummethylsulfat (DOTAP) (Boehringer Mannheim), Polyethylenimin (PEI), Dioleoylester, ChoTB, ChoSC, DOSC) (Leventis et al. (1990) Biochim. Inter. 22, 235–241); 3-beta[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterin (DC-Chol), Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE)/3-beta[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterin DC-Chol in Eins-zu-Eins-Gemischen (Gao et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065, 8–14), Spermin, Spermidin, Lipopolyamine (Gehr et al., Bioconjugate Chem., 1994, 5: 382–389), lipophile Polylysine (LPLL) (Zhou et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 939, 8–18), [[(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)cresoxy]ethoxy]ethyl]-dimethylbenzylammoniumhydroxid (DEBDA-Hydroxid) mit überschüssigem Phosphatidylcholin/Cholesterin (Ballas et al., (1988) Biochim. Biophys. Acta 939, 8–18), Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)/DOPE-Gemische (Pinnaduwage et al., (1989) Biochim. Biophys. Acta 985, 33–37), lipophiler Diester von Glutaminsäure (TMAG) mit DOPE, CTAB, DEBDA, Didodecylammoniumbromid (DDAB) und Stearylamin im Gemisch mit Phosphatidylethanolamin (Rose et al., (1991) Biotechnique 10, 520–525), DDAB/DOPE (TransfectACE, GIBCO BRL) und Oligogalactose, die Lipide trägt (Remy et al., wird noch veröffentlicht).
Ebenfalls in der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen ist die Verwendung verschiedener Transfektionsverstärkungsmittel zum Erhöhen der Wirksamkeit des Transfers des bioaktiven therapeutischen Faktors in die Zellen. Geeignete Transfektionsverstärkungsmittel umfassen z. B., ohne Einschränkung, DEAE-Dextran, Polybren, Lysosom-disruptives Peptid (Ohmori N I et al., Biochem Biophys Res Commun 1997 Jun 27; 235(3): 726–9), Chondroitan-basierte Proteoglykane, sulfatierte Proteoglykane, Polyethylenimin, Polylysin (Pollard H et al. J Biol Chem, 1998 273 (13): 7507–11), Integrin-bindendes Peptid CYGGRGDTP, lineares Dextrannonasaccharid, Glycerin, Cholesterylgruppen, verankert an der 3'-terminalen Internukleosidbindung eines Oligonukleotids (Letsinger, R. L. 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86: (17): 6553-6), Lysophosphatid, Lysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylethanolamin und 1-Oleoyllysophosphatidylcholin.
Bevorzugte Beispiele für geeignete Transfektionsmittel umfassen, ohne Einschränkung, die Lipopolyamine, wie sie in US-Patent 5,171,678 , erteilt an Behr, et al., am 15. Dezember 1992, US-Patent 5,476,962 , erteilt an Behr, et al., 19. Dezember 1995, und US-Patent 5,616,745 , erteilt an Behr, et al., am 1. April 1997, offenbart sind.
Besonders bevorzugte Transfektionsmittel der vorliegenden Erfindung umfassen Lipopolyamine der allgemeinen Formel (I), wie sie in US-Patent 5,171,678 , erteilt an Behr, et al., am 15. Dezember 1992, US-Patent 5,476,962 erteilt an Behr, et al., am 19. Dezember 1995, und US-Patent 5,616,745 , erteilt an Behr, et al., am 1. April 1997, offenbart sind.
Die Lipopolyamine der allgemeinen Formel (I) sind besonders brauchbar als Vektoren für die Transfektion eukaryontischer Zellen. Die Lipopolyamine der allgemeinen Formel (I) haben die Eigenschaft, dass sie, wenn sie in Wasser dispergiert sind, unilamellare Nanoteilchen bilden, die in einem ionischen Medium instabil sind und über ihren kationischen Abschnitt stark mit Plasmid- oder Oligonukleotid-DNA assoziieren, wobei sie letztere kompaktieren und mit einer Lipidschicht bedecken. Unter Verwendung eines Überschusses an kationischen Ladungen im Verhältnis zur Nukleinsäure können die Lipid/DNA-Komplexe an Zellmembranen adsorbiert werden, was die Aufnahme der DNA durch die Zellen erleichtert.
Solche Lipopolyamine der allgemeinen Formel (I) ermöglichen zudem, dass zerbrechliche Zellen (Beispiele hierfür umfassen ohne Einschränkung Zellen der mittleren oder der vorderen Hypophyse, Chromaffinzellen, periphere oder zentrale Neuronen), deren Transfektion durch die Anwendung klassischer Verfahren (Calciumphosphat-Copräzipitation oder Dextrantechniken) nicht möglich war, transfiziert werden.
4.6 Rekombinante Expressionsvektoren
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Abgabe von Vektoren mit oder ohne Embolisierung. Vorzugsweise enthalten die Expressionsvektoren eine Nukleinsäure, die einen bioaktiven therapeutischen Faktor oder ein Polypeptid der Erfindung (oder einen Abschnitt davon) codiert. In der vorliegenden Verwendung bezieht sich der Begriff „Vektor" auf ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure, mit der es verknüpft wurde, transportieren kann. Ein Vektortyp ist ein „Plasmid", was sich auf eine kreisförmige, doppelsträngige DNA-Schleife bezieht, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert sein können. Spezifische Beispiele für virale Vektoren umfassen ohne Einschränkung, Adenvirus- und Retrovirus-Vektoren für die Gentherapie unter Verwendung der Mikrosphären und Transfektionsmittel der Erfindung. Ebenso innerhalb der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird die Verwendung eines virusartigen Teilchens, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor umfasst, wobei das virusartige Teilchen physikalisch mit dem Transfektionsmittel verknüpft ist, das auch mit dem Mikroteilchen verknüpft ist. Ebenfalls innerhalb der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird die Verwendung eines virusartigen Teilchens, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor enthält, wobei das virusartige Teilchen physikalisch mit dem Transfektionsmittel verknüpft ist, das auch mit dem Mikroteilchen verknüpft ist. Solche virusartigen Teilchen können gestaltet werden unter Verwendung von Polyethylenimin (PEI), das über eine Disulfidbrückenbildung mit dem Integrin-bindenden Peptid CYGGRGDTP konjugiert ist. Solche PEI/RGD-enthaltendes Peptid-Komplexe teilen sich mit dem Adenvirus solche konstitutiven Eigenschaften, wie Größe und einen zentral geschützten Kern, sowie auch „frühe" Eigenschaften, wie Zelleintritt, vermittelt durch Integrine, und Säure-getriggerter Endosomen-Escape (Erbacher et al., wird noch veröffentlicht).
Bestimmte Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle befähigt, in die sie eingeführt werden (z. B. bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung und episomale Säugervektoren). Andere Vektoren (z. B. nicht-episomale Säugervektoren) werden bei Einführung in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Darüber hinaus sind bestimmte Vektoren, nämlich Expressionsvektoren, in der Lage, die Expression von Genen zu steuern, mit denen sie operabel verknüpft sind. Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren, die für rekombinante DNA-Techniken brauchbar sind, häufig in Form von Plasmiden (Vektoren) vor. Die Erfindung soll jedoch solche anderen Formen von Expressionsvektoren, wie virale Vektoren (z. B. replikationsunfähige Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren) umfassen, die äquivalente Funktionen erfüllen.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeigneten Form. Dies bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen umfassen, die auf der Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen ausgewählt und mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz operabel verknüpft ist/sind. Innerhalb eines rekombinanten Expressionsvektors soll „operabel verknüpft" bedeuten, dass die Nukleotidsequenz von Interesse mit der (den) regulatorischen Sequenz(en) in einer Weise verknüpft ist, welche die Expression der Nukleotidsequenz (z. B. in einem in vitro-Transkriptions/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingeführt wird) gestattet. Der Begriff „regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionssteuerelemente (z. B. Polyadenylierungssignale) umfassen. Solche regulatorischen Sequenzen sind zum Beispiel beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulatorische Sequenzen umfassen diejenigen, welche die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Arten von Wirtszellen lenken, und diejenigen, welche die Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen lenken (z. B. gewebespezifische regulatorische Sequenzen). Es versteht sich für den Fachmann, dass die Gestaltung des Expressionsvektors von solchen Faktoren, wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Expressionsgrad des gewünschten Proteins, usw., abhängen kann. Die Expressionsvektoren der Erfindung können in Wirtszellen eingeführt werden, um dadurch Proteine oder Peptide zu produzieren, einschließlich Fusionsproteine oder -peptide, die von Nukleinsäuren codiert werden, wie hier beschrieben.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können zur Expression eines Polypeptids der Erfindung in prokaryontischen Zellen (z. B. E. coli) oder eukaryontischen Zellen (z. B. Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefezellen, oder Säugerzellen) ausgelegt sein. Geeignete Wirtszellen sind weiter diskutiert in Goeddel, supra. Alternativ dazu kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert und translatiert werden, z. B. unter Verwendung regulatorischer T7-Promoter-Sequenzen und von T7-Polymerase.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Nukleinsäure der Erfindung in Säugerzellen unter Verwendung eines Säuger-Expressionsvektors exprimiert. Beispiele für Säuger-Expressionsvektoren umfassen pCDM8 (Seed (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187–195). Wenn er in Säugerzellen verwendet wird, werden die Steuerfunktionen des Expressionsvektors häufig von viralen regulatorischen Elementen bereitgestellt. Beispielsweise sind häufig verwendete Promotoren von Polyoma, Adenvirus 2, Cytomegalovirus und Simian Virus 40 abgeleitet. Andere geeignete Expressionssysteme sowohl für prokaryontische als auch für eukaryontische Zellen: siehe Kapitel 16 und 17 von Sambrook et al., supra.
In einer weiteren Ausführungsform ist der rekombinante Säuger-Expressionsvektor in der Lage, die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp zu lenken (z. B. werden gewebespezifische regulatorische Elemente verwendet, um die Nukleinsäure zu exprimieren). Gewebespezifische regulatorische Elemente sind dem Fachmann bekannt. Nicht einschränkende Beispiele für geeignete gewebespezifische Promotoren umfassen den Albuminpromoter (leberspezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268–277), lymphoidspezifische Promotoren (Calame und Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235–275), insbesondere Promotoren von T-Zellrezeptoren (Winoto und Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729–733) und Immunglobuline (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729–740; Queen und Baltimore (1983) Cell 33: 741–748), neuronenspezifische Promotoren (z. B. den Neurofilament-Promoter; Byrne und Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473–5477), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al. (1985) Science 230: 912–916), prostataspezifische Promotoren und/oder Enhancer ( US-Patente Nr. 5,830,686 und 5,871,726 , deren Inhalt hiermit durch Bezugnahme in vollem Umfang hier aufgenommen wird) und Mammardrüsen-spezifische Promotoren (z. B. Molke-Promoter; US-Patent Nr. 4,873,316 und europäische Anmeldung, Veröffentlichungsnr. 264 166 ). Entwicklungsregulierte Promotoren sind ebenfalls mit eingeschlossen, zum Beispiel die Maus-Hox-Promotoren (Kessel und Gruss (1990) Science 249: 374–379) und der α-Fötoprotein-Promoter (Campes und Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537–546).
Die Erfindung stellt ferner einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, umfassend ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül, das in den Expressionsvektor in Antisense-Ausrichtung kloniert ist. Dies bedeutet, dass das DNA-Molekül mit einer regulatorischen Sequenz in einer Weise operabel verknüpft ist, welche die Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls gestattet, das gegenläufig zur mRNA ist, die ein gegebenes Polypeptid codiert.
Regulatorische Sequenzen, die operabel mit einer Nukleinsäure verknüpft sind, welche in gegenläufiger Ausrichtung kloniert ist, können gewählt werden, welche die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Molekül in verschiedenen Zelltypen steuern, z. B. virale Promotoren und/oder Enhancer, oder es können regulatorische Sequenzen gewählt werden, welche die konstitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression von Antisense-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann vorliegen in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder abgeschwächten Virus, in dem Antisense-Nukleinsäuren unter der Steuerung einer hochwirksamen regulatorischen Region produziert werden, deren Aktivität durch den Zelltyp bestimmt werden kann, in den der Vektor eingeführt wird. Eine Diskussion der Regulation der Genexpression unter Verwendung von Antisense-Genen findet sich bei Weintraub et al. (Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986).
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können verschiedene Krebsformen behandelt werden durch Bereitstellen eines Toxingens auf einer DNA-Matrize mit einem gewebespezifischen Enhancer und/oder Promoter, um die Expression des Gens in den Krebszellen zu fokussieren. Beispielsweise umfassen Toxingene ohne Einschränkung das Diphtherie-Toxingen. Die intrazelluläre Expression des Diphtherietoxins tötet bekanntlich Zellen. Die Verwendung bestimmter Promotoren könnte gewebespezifisch sein, wie die Verwendung eines pankreasspezifischen Promoters bei Pankreaskrebs. Somit könnte ein funktionales Diphtherietoxin-Gen, das an Pankreaszellen abgegeben wird, theoretisch die gesamte Bauchspeicheldrüse beseitigen. Diese Strategie könnte als Behandlung für Pankreaskrebs verwendet werden. Der gewebespezifische Enhancer würde sicherstellen, dass die Expression des Diphtherietoxins nur in Pankreaszellen aufträte. DNA/Lipopolyamin/Mikrosphärenkomplexe, die das Diphtherietoxingen enthalten, würden unter der Steuerung eines gewebespezifischen Enhancers direkt in eine kanülierte Arterie eingeführt, welche die Bauchspeicheldrüse versorgt. Die Infusion würde nach einem Dosierungsplan solange wie nötig erfolgen, um das Pankreasgewebe zu beseitigen. Neben Diphtherietoxin könnten auch andere lethale Gene mit ähnlichem Effekt verwendet werden, wie Gene für Ricin oder Kobragiftfaktor oder Enterotoxin.
Ein weiteres spezifisches Beispiel wäre die Verwendung eines prostataspezifischen Antigenpromoters/-Enhancers zum Richten eines bioaktiven therapeutischen Faktors der vorliegenden Erfindung gegen die Prostata eines Patienten, der einer Behandlung gegen Prostatakrebs bedarf. Man könnte auch spezialisierte Krebsformen durch den Transfer von Genen, wie z. B., ohne Einschränkung, des p53-Gens, des Retinoblastomgens (und anderer aus dieser Genfamilie), welche die Krebseigenschaften bestimmter Krebsformen unterdrücken, behandeln.
4.7 Adenovirus-vermittelter Gentransfer
Für den Zweck der Gentherapie wurden Adenoviren, die Deletionen tragen, als geeignete Vehikel vorgeschlagen. Adenoviren sind nicht-eingehüllte DNA-Viren. Gentransfervektoren, die von Adenoviren abgeleitet sind (sogenannte adenovirale Vektoren) haben eine Reihe von Eigenschaften, die sie besonders brauchbar für einen Gentransfer für solche Zwecke machen.
Beispielsweise ist die Biologie der Adenviren im Detail charakterisiert, ist das Adenovirus nicht mit einer schweren menschlichen Pathologie assoziiert, ist das Virus äußerst effizient hinsichtlich der Einführung seiner DNA in die Wirtszelle, kann das Virus eine große Vielfalt von Zellen infizieren und hat einen breiten Wirtsbereich, kann das Virus relativ einfach in großen Mengen produziert werden, und kann das Virus durch Deletionen, unter anderem in der frühen Region 1 (E1) des viralen Genoms, replikationsunfähig gemacht werden.
Das Adenovirusgenom ist ein geradliniges, doppelsträngiges DNA-Molekül mit etwa 36.000 Basenpaaren, dessen 55-kDa-terminales Protein kovalent an den 5'-Terminus jedes DNA-Stranges gebunden ist. Die Ad-DNA enthält identische invertierte terminale Repeats (ITRs) von etwa 100 Basenpaaren, deren exakte Länge vom Serotyp abhängt. Die viralen Replikationsursprünge liegen innerhalb der ITRs genau an den Genomenden. Die DNA-Synthese erfolgt in zwei Stufen. Zuerst läuft die Replikation mittels Strangverschiebung ab, wodurch ein Tochter-Duplexmolekül und ein verschobener Elternstrang erzeugt werden. Der verschobene Strang ist einsträngig und kann eine sogenannte „Pfannenstiel"-Zwischenform bilden, welche die Replikationsinitiation und Erzeugung eines Tochter-Duplexmoleküls ermöglicht. Alternativ dazu kann die Replikation von beiden Enden des Genoms her gleichzeitig erfolgen, wodurch das Erfordernis der Ausbildung der Pfannenstielstruktur wegfällt.
Während des produktiven Infektionszyklus werden die viralen Gene in zwei Phasen exprimiert: der frühen Phase, bei der es sich um den Zeitraum bis zur Virus-DNA-Replikation handelt, und der späten Phase, die mit der Initiation der Virus-DNA-Replikation zusammenfällt. Während der frühen Phase werden nur die frühen Genprodukte, codiert von den Regionen E1, E2, E3 und E4, exprimiert, die eine Reihe von Funktionen ausführen, welche die Zelle auf die Synthese viraler Strukturproteine vorbereiten (Berk, 1986). Während der späten Phase werden die späten viralen Genprodukte zusätzlich zu den frühen Genprodukten exprimiert, und die Wirtszellen-DNA- und -Proteinsynthese werden unterbunden. Folglich wird die Zelle der Produktion viraler DNA und viraler Strukturproteine gewidmet (Tooze, 1981).
Es gibt verschiedene Adenovirus-Serotypen, deren Struktur und Eigenschaften ein wenig variieren. Unter diesen Serotypen ist die Verwendung menschlicher Adenoviren vom Typ 2 oder 5 (Ad 2 oder Ad 5) oder von Adenoviren tierischen Ursprungs (siehe Anmeldung WO94/26914 ) innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Unter den Adenviren tierischen Ursprungs, die innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, kommen Adenviren, die von Hunden, Rindern, Mäusen (Beispiel: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), Schafen, Schweinen, Vögeln oder, alternativ dazu, von Affen (Beispiel: SAV) stammen, in Betracht. Vorzugsweise ist das Adenovirus tierischen Ursprungs ein Hunde-Adenovirus, noch bevorzugter ein CAV-2-Adenovirus [beispielsweise vom Manhattan- oder A26/61-Stamm (ATCC VR-800)]. Vorzugsweise können für die erfindungsgemäßen Verfahren Adenviren, die vom Menschen oder vom Hund stammen, oder solche gemischten Ursprungs verwendet werden.
Die defekten rekombinanten Adenoviren zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Verfahren können mit einem dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573 ; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Insbesondere können sie durch homologe Rekombination zwischen einem Adenovirus und einem Plasmid, das unter anderem eine Kassette trägt, welche ein interessierendes Gen enthält, hergestellt werden. Die homologe Rekombination erfolgt nach Cotransfektion von Adenovirus und Plasmid in eine geeignete Zelllinie. Die verwendete Zelllinie sollte vorzugsweise (i) durch die besagten Elemente transformierbar sein, und (ii) die Sequenzen enthalten, die in der Lage sind, den defekten Adenovirusgenomteil zu vervollständigen, vorzugsweise in integrierter Form, um Risiken der Rekombination zu vermeiden. Als Beispiel für eine Zelllinie ist die menschliche Embryonen-Nierenlinie 293 zu nennen (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), die insbesondere, in ihr Genom integriert, den linken Teil des Genoms eines Ad5-Adenovirus (12%) enthält. Strategien zur Konstruktion von Vektoren, die von Adenoviren abgeleitet sind, sind ebenfalls in den Anmeldungen Nr. WO94/26914 und FR 2,707,664 beschrieben.
4.8 Retrovirusteilchen-vermittelter Gentransfer
Retrovirale Vektoren sind Gentransfervehikel für Säugetiere, welche die Merkmale des Retrovirus-Replikationszyklus ausnutzen, wie eine hohe Infektionswirksamkeit und eine stabile kolineare Integration der viral übertragenen Information in ein Zielzellenchromosom. Retrovirale Vektoren werden zu wichtigen Werkzeugen in der Grundlagenforschung, der Biotechnologie und der Gentherapie.
Die meisten der derzeit verwendeten retroviralen Vektoren sind von Mausleukämieviren (MLVs) abgeleitet. MLVs sind aufgrund ihres gut dokumentierten Transkriptionsmusters in diversen Zelltypen und ihrer relativ einfachen, modularen Genstruktur besonders als Vektoren geeignet.
Retrovirale Struktur: Die Retroviren gehören zu den eingehüllten Viren. Die Bilipidhülle ist von der Wirtszellmembran abgeleitet und durch die Insertion des viralen Oberflächenproteins (SU) und Transmembranproteins (TM) modifiziert. Das Matrixprotein (MA) liegt unmittelbar unter der äußeren Membran, die den inneren Kern umgibt. Der Kern besteht aus einem Capsidprotein (CA). Im Inneren des Capsids befinden sich zwei Kopien des retroviralen Genoms, die am 5'-Ende über eine Wasserstoffbindung aneinander haften. Das Viruskernteilchen enthält auch die viralen Enzyme: Reverse Transkriptase (RT), Protease (PR) und Integrase (IN), und das Nucleocapsidprotein (NC), das an das virale Genom gebunden ist. Neben diesen vom Virus codierten Proteinen enthält das Virion auch eine Reihe von tRNA-Molekülen, die von der Wirtszellen-tRNA-Population abgeleitet sind.
Mausleukämieviren (MLV) gehören zu den einfachen Retroviren. Retroviren haben eine charakteristische Genomkarte: Zwei lange terminale Repeats (LTRs), welche die drei Strukturgene gag, pol und env flankieren. Die LTRs lassen sich in drei Regionen unterteilen: Die U3-Region, die Enhancer- und Promoterelemente enthält, welche von der zellulären Transkriptionsmaschinerie erkannt werden, die R-Region, die eine wichtige Rolle während der reversen Transkription spielt und ferner das Polyadenylierungssignal enthält, und die U5-Region, die Sequenzen enthält, welche bei der reversen Transkription und Verpackung des retroviralen Genoms von Bedeutung sind. Zusätzlich enthalten die LTRs cis-Elemente, die invertierten Repeats, die während des Integrationsprozesses von Bedeutung sind.
Das integrierte Provirus erzeugt zwei mRNA-Transkripte, eine mRNA voller Länge, welche die gag- und die gag-pol-Polyproteine codiert, und eine gespleisste mRNA, welche die Hüllglycoproteine codiert. Die mRNA voller Länge dient auch als genomische RNA und enthält neben den bereits beschriebenen Komponenten der LTR-Einheiten drei wichtige cis-Elemente in der 5'-untranslatierten Sequenz. Die Primer-Bindungsstelle (PBS), die stromabwärts der U5-Region liegt, besteht aus 18 Nukleotiden, die komplementär zum 31 Ende des Primer-tRNA-Moleküls sind. Ebenfalls in der 5'-untranslatierten Region, zwischen der PBS und dem Anfang des offenen Leserahmens von gag, liegt das Packsignal (.PSI.). Die 5'-untranslatierte Region enthält ferner eine Dimerbindungsdomäne, die für die Dimerisierung der beiden viralen Genome im Virion verantwortlich ist. Unmittelbar stromaufwärts der U3-Region befindet sich ein weiteres wichtiges cis-Element, der Polypurintrakt (PP), der aus einem Stück von A- und G-Resten besteht. Dieses Element dient als Stelle zum Initiieren einer Plusstrang-DNA-Synthese während der reversen Transkription.
Der retrovirale Lebenszyklus: Zwei unterschiedliche Mechanismen wurden vorgeschlagen, um das Eintreten des Virusteilchens in das Wirtscytoplasma zu erklären. Es wird angenommen, dass die meisten Retroviren, einschließlich MLV, durch Rezeptor-vermittelte Endocytose, einen Prozess, bei dem das gesamte eingehüllte Virusteilchen in einem endosomalen Körper internalisiert wird, in die Wirtszelle gelangen. Das Rezeptormolekül für die ökotropen Mausleukämieviren wurde kloniert und als kationischer Aminosäure-Transporter identifiziert.
Nachdem das virale Kernteilchen in das Cytoplasma der Wirtszelle eingetreten ist, werden alle enzymatischen Funktionen, die zum integrierten Doppelstrang-DNA-Provirus führen, von viralen Proteinen gelenkt, die in der vorherigen Wirtszelle synthetisiert und in das Virion mitgebracht wurden. Das Schicksal der viralen Proteine nach dem Eintreten der Kernteilchen ist nicht klar, aber die reverse Transkriptase, die Integrase und das Capsidprotein bleiben bei dem RNA-Genom, das den Nucleoproteinkomplex bildet, in dem die reverse Transkription erfolgt. Vor kurzem wurde auch das Matrixprotein in Assoziation mit dem Nucleoproteinkomplex gefunden.
Nach der reversen Transkription migriert der Nucleoproteinkomplex zum Wirtszellkern. Der für die Kernlokalisation verantwortliche Mechanismus ist unklar, obwohl Anzeichen für das Rous-Sarkom-Virus (RSV) nahelegen, dass das IN-Protein wichtig ist, da das RSV IN-Protein, wenn es in Säugerzellen produziert wird, im Kern lokalisiert ist. Das Eintreten des Nucleoproteinkomplexes in den Kern erfordert eine Mitose, wahrscheinlich weil der Nucleoproteinkomplex die Kernhülle nicht durchdringen kann. Einmal im Kern, wird die Integration durch das IN-Protein vermittelt. Das IN-Protein erkennt die konservierten, invertierten Repeats an den Enden der LTRs und entfernt 2 Basen von den 3'-Hydroxyltermini beider Stränge. Das IN-Protein katalysiert auch eine Spaltung in der Wirts-DNA und vermittelt die Verbindungen zwischen der proviralen DNA und der Wirts-DNA. Bezüglich der Spezifität der Integration wurde keine Konsens-Wirts-DNA-Zielsequenz gefunden, obwohl von einer Tendenz zur Integration nahe DNase I-hypersensitiven Stellen berichtet wurde.
Bei den einfachen Retroviren (einschließlich MLV) werden Transkription und Translation von der Wirtszellenmaschinerie durchgeführt. Komplexe Viren (einschließlich HIV und HTLV) codieren transaktivierende Proteine, die an der transkriptionalen Regulierung beteiligt sind. Das Zusammensetzen von MLV-Teilchen erfolgt an der Wirtsmembran, und der Prozess fällt mit dem Keimungsprozess zusammen. Bei Säugerviren vom B- und C-Typ (MMTV bzw. HTLV) werden virale Kernteilchen im Wirtszellencytoplasma zusammengesetzt. Die Einkapselung der viralen Genom-RNA wird durch Bindung des cis-aktiven Einkapselungssignals und der NC-Einheit des Gag- oder des Gag-Pol-Vorläuferproteins vermittelt.
Nach dem Knospen werden die Gag- und Gag-Pol-Polyproteine durch virale Protease (PR) gespalten. Die Reifung der viralen Proteine führt zu einer allgemeinen Veränderung der Virionmorphologie. Zusätzlich zur proteolytischen Spaltung der viralen Polyproteine nach Knospung des Virusteilchens durchlauft die Genom-RNA ebenfalls einen Reifungsprozess, der zu einem kompakten, dimeren Genom führt.
Retrovirusvektoren: Retroviren, von denen retrovirale Plasmidvektoren abgeleitet werden können, umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Moloney-Mausleukämievirus, Milznekrosevirus, Retroviren, wie Rous-Sarkom-Virus, Harvey-Sarkom-Virus, Vogelleukämievirus, Gibbonaffen-Leukämievirus, menschliches Immunschwächevirus, Adenovirus, myeloproliferatives Sarkomvirus und Mammartumorvirus. Gemäß einer Ausführungsform ist der retrovirale Plasmidvektor vom Moloney-Mausleukämievirus abgeleitet.
Der Vektor umfasst einen oder mehrere Promotoren. Geeignete Promotoren, die eingesetzt werden können, umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die retrovirale LTR, den SV40-Promoter, und den menschlichen Cytomegalovirus (CMV)-Promoter, beschrieben in Miller et al., Biotechniques, Vol. 7, Nr. 9, 980–990 (1989), oder irgendeinen anderen Promoter (z. B. zelluläre Promotoren, wie eukaryontische zelluläre Promotoren, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, der Histon-, Pol III- und β-Actinpromotoren). Andere virale Promotoren, die eingesetzt werden können, umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Adenoviruspromotoren, Thymidinkinase (TK)-Promotoren und B19-Parvoviruspromotoren. Die Wahl eines geeigneten Promoters ist für den Fachmann aus den hier enthaltenen Lehren ersichtlich.
Die Nukleinsäuresequenz, die den interessierenden bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, wird unter die Kontrolle eines geeigneten Promoters gebracht. Geeignete Promotoren, die eingesetzt werden können, umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, adenovirale Promotoren, wie den späten Adenovirus-Hauptpromoter, oder hetorologe Promotoren, wie den Cytomegalovirus (CMV)-Promoter, den Promoter des respiratorischen Synzytialvirus (RSV), induzierbare Promotoren, wie den MMT-Promoter, den Metallthioneinpromoter, Hitzeschock-Promotoren, den Albuminpromoter, den ApoAI-Promoter, menschliche Globinpromotoren, virale Thymidinkinasepromotoren, wie den Herpes Simplex-Thymidinkinasepromoter, retrovirale LTRs (einschließlich der oben beschriebenen, modifizierten retroviralen LTRs), den β-Actinpromoter, und menschliche Wachstumshormon-Promotoren. Der Promoter kann auch der native Promoter sein, der die Gene steuert, welche den interessierenden bioaktiven therapeutischen Faktor codieren.
Der retrovirale Plasmidvektor wird eingesetzt, um Packungs-Zelllinien zu transduzieren, um Produzenten-Zelllinien zu bilden. Beispiele für Packungszellen, die transfiziert werden können, umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die PE501-, PA317.psi.-2-, .psi.-AM-, PA12-, T19-14X-, VT-19-17-H2-, .psi.CRE-, .psi.CRIP-, GP+E-86-, GP+envAm12- und DNA-Zelllinien, wie sie in Miller, Human Gene Therapy, Vol. 1, S. 5–14 (1990), beschrieben sind, das in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird. Der Vektor kann die Packungszellen durch jedes dem Fachmann bekannte Mittel transduzieren. Solche Mittel umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Elektroporation, die Verwendung von Liposomen und die CaPO₄-Präzipitation.
Die Produzenten-Zelllinie erzeugt infektiöse retrovirale Vektorteilchen, welche die Polynukleotidsequenz(en) umfassen, die den interessierenden bioaktiven therapeutischen Faktor codiert (codieren). Solche retroviralen Vektorteilchen können dann eingesetzt werden, um eukaryontische Zellen in vitro oder in vivo zu transduzieren. Die transduzierten eukaryontischen Zellen werden die Polynukleotidsequenz(en) exprimieren, die den interessierenden bioaktiven therapeutischen Faktor codiert (codieren). Eukaryontische Zellen, die transduziert werden können, umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Embryonenstammzellen, Embryonenkarzinomzellen, sowie hämatopoietische Stammzellen, Hepatocyten, Fibroblasten, Myoblasten, Keratinocyten, Endothelzellen und bronchiale Epithelzellen.
Gemäß einer Ausführungsform kann der retrovirale Plasmidvektor mit der (den) Polynukleotidsequenz(en), die den interessierenden bioaktiven therapeutischen Faktor codiert (codieren), mit einem Lipid der oben beschriebenen Art gekoppelt und dann einem Wirt verabreicht werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann der retrovirale Plasmidvektor mit einem Lipopolyamin-Transfektionsmittel der vorliegenden Erfindung assoziiert sein, um einen Komplex zu bilden, der dann vor Verabreichung an einen Patienten, der einer Embolisierungsgentherapie bedarf, mit den Mikrosphären der vorliegenden Erfindung vermischt wird.
4.9 Antisense-Gentherapie
Die vorliegende Erfindung umfasst zusätzlich die Abgabe von Antisense-Nukleinsäuremolekülen mit oder ohne Embolisierung. Antisense-Nukleinsäuremoleküle sind die Moleküle, die komplementär zu einer Sense-Nukleinsäure sind, welche ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, z. B. komplementär zum Codierungsstrang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Sequenz. Somit kann eine Antisense-Nukleinsäure eine Wasserstoffbindung mit einer Sense-Nukleinsäure eingehen. Die Antisense-Nukleinsäure kann komplementär zu einem gesamten Codierungsstrang oder nur zu einem Abschnitt davon sein, z. B. ganz oder teilweise komplementär zur Proteincodierungsregion (oder zum offenen Leserahmen). An Antisense-Nukleinsäuremolekül kann ganz oder teilweise gegenläufig zu einer nicht-codierenden Region des Codierungsstranges einer Nukleotidsequenz sein, die ein Polypeptid der Erfindung codiert. Die nicht-codierenden Regionen („5'- und 3'-untranslatierte Regionen") sind die 5'- und 3'-Sequenzen, welche die Codierungsregion flankieren, und werden nicht zu Aminosäuren translatiert.
Ein Antisense-Oligonukleotid kann z. B. etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide lang sein. Eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure kann mittels chemischer Synthese- und enzymatischer Ligationsreaktionen unter Verwendung dem Fachmann bekannter Verfahren konstruiert werden.
Beispielsweise kann eine Antisense-Nukleinsäure (z. B. ein Antisense-Oligonukleotid) chemisch synthetisiert werden unter Verwendung natürlich vorkommender Nukleotide oder verschiedentlich modifizierter Nukleotide, die dazu ausgelegt sind, die biologische Stabilität der Moleküle oder die physikalische Stabilität der zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuren gebildeten Duplex zu erhöhen, z. B. können Phosphorthioatderivate und Acridin-substitutierte Nukleotide verwendet werden.
Beispiele für modifizierte Nukleotide, die verwendet werden können, um die Antisense-Nukleinsäure zu erzeugen, umfassen 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, β-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, β-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin.
Alternativ dazu kann die Antisense-Nukleinsäure biologisch produziert werden, indem ein Expressionsvektor verwendet wird, in den eine Nukleinsäure in gegenläufiger Ausrichtung subkloniert wurde (d. h. von der insertierten Nukleinsäure transkribierte RNA wird eine gegenläufige Ausrichtung zu einer interessierenden Ziel-Nukleinsäure haben, wie dies im nachfolgenden Unterabschnitt näher beschrieben ist).
Die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuremoleküle werden typischerweise an ein Subjekt verabreicht oder in situ erzeugt, so dass sie mit zellulärer mRNA und/oder genomischer DNA, die ein ausgewähltes erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, hybridisieren oder an diese binden, um dadurch die Expression zu inhibieren, z. B. durch Inhibieren der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotid-Komplementarität, um eine stabile Duplex zu bilden, oder, z. B. im Fall eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls, das an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der Hauptfurche der Doppelhelix erfolgen. Ein Beispiel für einen Verabreichungsweg für erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuremoleküle umfasst eine direkte Injektion der Antisense-Nukleinsäuremolekül/Lipolpolyamin-Transfektionsmittel-Komplex/Mikrosphäre an einer bestimmten Gewebestelle.
Alternativ dazu können Antisense-Nukleinsäuremoleküle zur Abgabe an ausgewählte Zielzellen modifiziert und dann unter Verwendung der Mikrosphären und Transfektionsmittel der vorliegenden Erfindung systemisch verabreicht werden. Zur systemischen Verabreichung können Antisense-Moleküle beispielsweise so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene binden, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, z. B. durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuremoleküle mit Peptiden oder Antikörpern, die an Zelloberflächenrezeptoren oder Antigene binden. Solche Peptide oder Antikörper können dazu dienen, die verbesserte Abgabe zu verstärken, die mit den Mikrosphären und Transfektionsmitteln der vorliegenden Erfindung erhalten wird. Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle können auch unter Verwendung der oben beschriebenen Vektoren an Zellen abgegeben werden. Um ausreichende intrazelluläre Konzentrationen der Antisense-Moleküle zu erreichen, sind Vektorkonstrukte bevorzugt, bei denen das Antisense-Nukleinsäuremolekül unter die Kontrolle eines starken pol II- oder pol III-Promoters gebracht wird. Ein erfindungsgemäßes Antisense-Nukleinsäuremolekül kann ein α-Anomer-Nukleinsäuremolekül sein.
Ein α-Anomer-Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in der im Gegensatz zu den üblichen β-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6625–6641). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. (1987) FERS Lett. 215: 327–330) umfassen.
Die vorliegende Erfindung schließt zusätzlich Ribozyme mit ein. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonucleaseaktivität, die in der Lage sind, eine einsträngige Nukleinsäure, wie eine mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen, zu spalten. Somit können Ribozyme (z. B. Hammerkopf-Ribozyme (beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334: 585–591)) zum katalytischen Spalten von mRNA-Transkripten verwendet werden, um dadurch die Translation des durch die mRNA codierten Proteins zu inhibieren. Ein Ribozym mit Spezifität für ein Nukleinsäuremolekül, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert, kann ausgehend von der Nukleotidsequenz eines interessierenden Zielgens konstruiert werden. Beispielsweise kann ein Derivat einer Tetrahymena L-19 IVS-RNA konstruiert werden, bei dem die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zur zu spaltenden Nukleotidsequenz ist, siehe Cech et al., US-Patent Nr. 4,987,071 und Cech et al., US-Patent Nr. 5,116,742 . Alternativ dazu kann eine mRNA, die einen bioaktiven therapeutischen Faktor gemäß der Erfindung codiert, verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonucleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen auszuwählen, siehe z. B. Bartel und Szostak (1993) Science 261: 1411–1418.
Die Erfindung umfasst auch Nukleinsäuremoleküle, die Dreifachhelixstrukturen bilden. Beispielsweise kann die Expression eines bioaktiven therapeutischen Faktors der Erfindung durch Zielgebung von Nukleotidsequenzen inhibiert werden, die komplementär zur regulatorischen Region des Gens sind, welches das Polypeptid (z. B. den Promoter und/oder Enhancer) codiert, um Dreifachhelixstrukturen zu bilden, welche die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern, siehe allgemein Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569–84; Helene (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 27–36, und Maher (1992) Bioassays 14(12): 807–15.
In verschiedenen Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle an der basischen Komponente, der Zuckerkomponente oder der Phosphathauptkette modifiziert werden, um z. B. Stabilität, Hybridisierung oder Löslichkeit des Moleküls zu verbessern. Beispielsweise kann die Desoxyribosephosphat-Hauptkette der Nukleinsäuren modifiziert werden, um Peptidnukleinsäuren zu erzeugen (siehe Hyrup et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1): 5–23). In der vorliegenden Verwendung beziehen sich die Begriffe „Peptidnukleinsäuren" oder „PNAs" auf Nukleinsäuremimetika, z. B. DNA-Mimetika, in denen die Desoxyribosephosphat-Hauptkette durch eine Pseudopeptid-Hauptkette ersetzt ist und nur die vier natürlichen Nucleobasen erhalten bleiben. Die neutrale Hauptkette von PNAs ermöglicht, wie gezeigt wurde, eine spezifische Hybridisierung an DNA und RNA unter Bedingungen niedriger ionischer Stärke. Die Synthese von PNA-Oligomeren kann mittels üblicher Festphasen-Peptidsyntheseprotokolle durchgeführt werden, wie sie beschrieben sind in Hyrup et al. (1996), supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670–675.
PNAs können bei therapeutischen und diagnostischen Anwendungen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Beispielsweise können PNAs verwendet werden als Antisense- oder Antigenmittel für die sequenzspezifische Modulation der Genexpression, z. B. durch Induzieren eines Transkriptions- oder Translationsstillstandes oder durch Inhibieren der Replikation. PNAs können z. B. auch verwendet werden für die Analyse einzelner Basenpaarmutationen in einem Gen, z. B. durch PNA-gerichtetes PCR-Clamping, als künstliche Restriktionsenzyme, wenn sie in Kombination mit anderen Enzymen, z. B. S1-Nucleasen (Hyrup (1996), supra, verwendet werden, oder als Sonden oder Primer für DNA-Sequenz und -Hybridisierung (Hyrup (1996), supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670–675) verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform können PNAs modifiziert werden, z. B. um ihre Stabilität oder ihre Aufnahme in Zellen zu verbessern, indem lipophile oder andere Helfergruppen an PNA gebunden werden, durch die Bildung von PNA-DNA-Chimären oder besonders bevorzugt durch die Verwendung von Lipopolyaminen als Transfektionsmittel zur Komplexbildung mit den PNAs vor Assoziation mit den Mikrosphären der vorliegenden Erfindung. Beispielsweise können PNA-DNA-Chimären erzeugt werden, welche die vorteilhaften Eigenschaften von PNA und DNA vereinen können. Solche Chimären ermöglichen eine Wechselwirkung von DNA-Erkennungsenzymen, z. B. RNAse H und DNA-Polymerasen, mit dem DNA-Abschnitt, während der PNA-Abschnitt eine hohe Bindungsaffinität und -spezifität bereitstellen würde. PNA-DNA-Chimären können mittels Linker geeigneter Längen verknüpft werden, die hinsichtlich Basenstapelung, Anzahl der Bindungen zwischen den Nucleobasen, und ihrer Ausrichtung gewählt sind (Hyrup (1996), supra). Die Synthese von PNA-DNA-Chimären kann durchgeführt werden, wie in Hyrup (1996), supra, und Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17): 3357–63 beschrieben. Beispielsweise kann eine DNA-Kette auf einem festen Träger mittels üblicher Phosphoramidit-Kopplungschemie und modifizierter Nukleosidanaloga synthetisiert werden. Verbindungen, wie 5'-(4-Methoxytrityl)amino-5'-desoxythymidinphosphoramidit, können als Verbindung zwischen PNA und dem 5'-Ende der DNA verwendet werden (Mag et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 5973–88). PNA-Monomere werden dann schrittweise gekoppelt, um ein chimäres Molekül mit einem 5'-PNA-Segment und einem 3'-DNA-Segment zu bilden (Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17): 3357–63). Alternativ dazu können chimäre Moleküle mit einem 5'-DNA-Segment und einem 3'-PNA-Segment synthetisiert werden (Peterser et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5: 1119–11124).
Bei anderen Ausführungsformen kann das Oligonukleotid andere anhängige Gruppen, wie Peptide (z. B. zum Anzielen von Wirtszellenrezeptoren in vivo), oder Mittel umfassen, die den Transport durch die Zellmembranen (siehe z. B. Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553–6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648–652; PCT-Veröffentlichungsnr. WO 88/09810 ) oder durch die Blut-Hirn-Schranke erleichtern (siehe z. B. PCT-Veröffentlichungsnr. WO 89/10134 ). Zusätzlich können Oligonukleotide mit Hybridisierungs-getriggerten Spaltungsmitteln (siehe z. B. Krol et al. (1988) Bio/Techniques 6: 958–976) oder interkalierenden Mitteln (siehe z. B. Zon (1988) Pharm. Res. 5: 539–549) modifiziert werden. Zu diesem Zweck kann das Oligonukleotid vor oder auch nach Assoziation mit dem Lipolyamin-Transfektionsmittel und Mikrosphären der vorliegenden Erfindung mit einem anderen Molekül, z. B. einem Peptid, einem Hybridisierungs-getriggerten Vernetzungsmittel, einem Transportmittel, einem Hybridisierungs-getriggerten Spaltungsmittel usw., konjugiert werden.
4.10 Aktive Embolisierung zur Arzneimittelabgabe und Gentherapie
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verabreichung von Arzneimitteln, Impfstoffen und Diagnose- oder Bildgebungsmitteln an einen Säuger mittels Mikrosphären. Natürlich erfordert diese Ausführungsform nicht unbedingt die Verwendung eines Transfektionsmittels. Ein solches Mittel stellt jedoch aufgrund seiner Fähigkeit, mit der Mikrosphäre und dem bioaktiven Mittel zu assoziieren, d. h. als Linker zu wirken, oder seiner Fähigkeit, die Endocytose zu verbessern, eine Option dar.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zum Embolisieren eines Blutgefäßes bereitgestellt, umfassend den Schritt der Abgabe einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung aus bioaktivem therapeutischem Faktor, Transfektionsmittel und Mikrosphäre in das Gefäß, so dass das Blutgefäß wirksam okkludiert wird. Therapeutisch wirksame Mengen, die zum Okkludieren von Blutgefäßen geeignet sind, können ohne weiteres anhand der oben gegebenen Offenbarung bestimmt werden. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung aus bioaktivem therapeutischem Faktor, Transfektionsmittel und Mikrosphäre einem Blutgefäß zugeführt, das einen Tumor ernährt.
Kurz gesagt gibt es eine Reihe von klinischen Situationen (z. B. Blutung, Tumorentwicklung), in denen es erwünscht ist, die Blutzufuhr in ein Organ oder eine Region zu reduzieren oder zu unterbinden. Wie nachfolgend detaillierter beschrieben, kann dies durch Injizieren der Zusammensetzungen aus bioaktivem therapeutischem Faktor, Transfektionsmittel und Mikrosphäre der vorliegenden Erfindung in ein gewünschtes Blutgefäß durch eine(n) selektiv angeordnete(n) Nadel oder Katheter erreicht werden. Die Zusammensetzung wandert durch den Blutstrom, bis sie sich in der Vaskulatur verkeilt, wodurch sie das Blutgefäß physikalisch (oder chemisch) okkludiert. Der reduzierte oder unterbundene Blutfluss zum ausgewählten Bereich führt zu einem Infarkt (Zelltod aufgrund einer Unterversorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen) oder zu einem verringerten Blutverlust aus einem beschädigten Gefäß.
Zur Verwendung in der Embolisierungstherapie sind die Zusammensetzungen aus bioaktivem therapeutischem Faktor, Transfektionsmittel und Mikrosphäre gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise nicht-toxisch, thrombogen, einfach durch Gefäßkatheter zu injizieren, strahlenundurchlässig, von rascher und anhaltender Wirkung, steril und zum Zeitpunkt der Prozedur ohne weiteres in unterschiedlichen Formen oder Größen verfügbar. Zudem führen die Zusammensetzungen vorzugsweise zur langsamen Freisetzung (idealerweise über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis Monaten) des bioaktiven therapeutischen Faktors. Besonders bevorzugte Zusammensetzungen mit bioaktivem therapeutischem Faktor sollten eine vorhersagbare Größe von 15–200 μm nach Injektion in das Gefäßsystem aufweisen. Vorzugsweise sollten sie in Lösung oder nach Injektion nicht zu größeren Teilchen verklumpen. Zudem sollten bevorzugte Zusammensetzungen ihre physikalischen Eigenschaften während der Lagerung vor Gebrauch nicht verändern.
Die Embolisierungstherapie der vorliegenden Erfindung kann auf mindestens drei grundlegende Weisen genutzt werden, um die Handhabung von Neoplasmen zu unterstützen: (1) Zur definitiven Behandlung von Tumoren (üblicherweise gutartig); (2) zur präoperativen Embolisierung; und (3) zur palliativen Embolisierung. Kurz gesagt können gutartige Tumore manchmal durch eine Embolisierungstherapie alleine erfolgreich behandelt werden. Beispiele für solche Tumore umfassen Tumore vaskulären Ursprungs (z. B. Hämangiome), endokrine Tumore, wie Parathyroidadenome, und gutartige Knochentumore.
Bei anderen Tumoren (z. B. Nierenadenokarzinom) kann eine präoperative Embolisierung Stunden oder Tage vor der chirurgischen Resektion eingesetzt werden, um operativen Blutverlust zu verringern, die Dauer der Operation zu verkürzen, und das Risiko einer Ausbreitung lebensfähiger, bösartiger Zellen durch chirurgische Manipulation des Tumors zu senken. Zahlreiche Tumore können erfolgreich präoperativ embolisiert werden, wie z. B. nasopharyngeale Tumore, Glomus jugulare Tumore, Meningiome, Chemodektome, und Vagusneurinome.
Die Embolisierung kann auch als primärer Behandlungsmodus bei nicht operierbaren Malignomen eingesetzt werden, um die Überlebensdauer von Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung zu verlängern. Die Embolisierung kann eine deutliche Verbesserung der Lebensqualität von Patienten mit bösartigen Tumoren ergeben, indem sie unangenehme Symptome, wie Blutung, Venenverschluss und Trachealkompression, lindert. Der größte Nutzen der palliativen Tumorembolisierung ist jedoch bei Patienten zu sehen, die an den humoralen Effekten bösartiger, endokriner Tumore leiden, wobei Metastasen aus karzinoiden Tumoren und andere Neoplasmen, wie Insulinome und Glucagonome, langsam wachsen können und dennoch aufgrund der endokrinen Syndrome, die sie erzeugen, starke Schmerzen verursachen.
In allgemeinen wird eine Embolisierungstherapie unter Verwendung der Zusammensetzungen aus bioaktivem therapeutischem Faktor, Transfektionsmittel und Mikrosphäre der vorliegenden Erfindung typischerweise ortsunabhängig in gleicher Weise durchgeführt. Kurz gesagt wird dabei zunächst eine Angiographie des zu embolisierenden Bereichs durchgeführt, indem ein strahlenundurchlässiges Kontrastmittel durch einen in eine Arterie oder Vene eingeführten Katheter injiziert wird, während eine Röntgenaufnahme gemacht wird. Der Katheter kann entweder perkutan oder chirurgisch eingesetzt werden. Dann wird das Blutgefäß embolisiert mittels Rückfluss einer Zusammensetzung aus bioaktivem therapeutischem Faktor, Transfektionsmittel und Mikrosphäre der vorliegenden Erfindung durch den Katheter, bis ein Stillstand des Flusses zu beobachten ist. Die Okklusion kann durch Wiederholung des Angiogramms bestätigt werden.
Die Embolisierungstherapie führt allgemein zur Verteilung der Zusammensetzungen, die bioaktive therapeutische Faktoren enthalten, in allen Zwischenräumen des zu behandelnden Tumors oder der zu behandelnden Gefäßmasse. Die physikalische Masse der embolischen Teilchen, die das Arterienlumen verstopfen, führt zur Okklusion der Blutzufuhr. Zusätzlich zu diesem Effekt verhindert das Vorliegen eines bioaktiven therapeutischen Faktors (mehrerer bioaktiver therapeutischer Faktoren) die Bildung neuer Blutgefäße zur Versorgung des Tumors oder der Gefäßmasse, was den devitalisierenden Effekt der Unterbindung der Blutzufuhr verstärkt.
Daher sollte ersichtlich sein, dass eine große Vielzahl von Tumoren unter Verwendung einer Zusammensetzung aus bioaktivem therapeutischem Faktor, Transfektionsmittel und Mikrosphäre gemäß der vorliegenden Erfindung embolisiert werden kann. Kurz gesagt werden Tumore typischerweise in zwei Klassen unterteilt: gutartige und bösartige. Bei einem gutartigen Tumor behalten die Zellen ihre differenzierten Merkmale bei und teilen sich nicht völlig unkontrolliert. Zudem ist der Tumor lokalisiert und nicht-metastatisch. Bei einem bösartigen Tumor werden die Zellen undifferenziert, reagieren nicht auf die Wachstums- und Hormonsignale des Körpers, und vervielfachen sich in unkontrollierter Weise; der Tumor ist invasiv und in der Lage, sich bis zu entfernten Stellen auszubreiten (Metastasierung).
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können Metastasen (sekundäre Tumore) der Leber mittels Embolisierungstherapie behandelt werden. Kurz gesagt wird dabei ein Katheter über die Femoral- oder Brachialarterie eingesetzt und in die Leberarterie vorgeschoben, wobei er fluoroskopisch geführt durch das arterielle System gelenkt wird. Der Katheter wird so weit wie nötig in den Leberarterienbaum vorgeschoben, um eine vollständige Blockierung der den Tumor (die Tumore) versorgenden Blutgefäße zu ermöglichen, dabei gleichzeitig möglichst viele der Arterienzweige, die normale Strukturen versorgen, zu schonen. Idealerweise handelt es sich dabei um einen Segmentast der Leberarterie, aber es könnte auch sein, dass die gesamte Leberarterie, distal zum Ursprung der Gastroduodenalarterie oder auch mehrere separate Arterien blockiert werden müssen, was vom Ausmaß des Tumors und seiner individuellen Blutversorgung abhängt. Sobald die gewünschte Katheterposition erreicht ist, wird die Arterie embolisiert durch Injizieren antiangiogener therapeutischer Zusammensetzungen durch den Arterienkatheter, bis der Fluss in der zu blockierenden Arterie still steht, vorzugsweise auch noch nach 5-minütiger Beobachtung. Die Okklusion der Arterie kann bestätigt werden durch Injizieren eines strahlenundurchlässigen Kontrastmittels durch den Katheter und indem mittels Fluoroskopie oder Röntgenfilm gezeigt wird, dass das Gefäß, das sich zuvor mit Kontrastmittel füllte, dies nicht mehr tut. Der gleiche Vorgang kann bei jeder zu okkludierenden Versorgungsarterie wiederholt werden.
Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die aktive therapeutische Embolisierungsbehandlung während einer Operation eingesetzt werden, um einen Tumor oder Gefäßmasse oder ein kanzeöses Organ zu entfernen. Zusätzlich betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung den Einsatz einer aktiven therapeutischen Embolisierungsbehandlung, um Metastasen zu verhindern oder zu lindern.
Wie zuvor erwähnt, können sowohl gutartige als auch bösartige Tumore unter Verwendung antiangiogener therapeutischer Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung embolisiert werden. Repräsentative Beispiele für gutartige hepatische Tumore umfassen hepatozelluläres Adenom, kavernöses Hämangiom und fokale noduläre Hyperplasie. Andere gutartige Tumore, die seltener sind und häufig keine klinischen Manifestationen aufweisen, können ebenfalls behandelt werden. Diese umfassen Gallengangadenome, Gallengangcystadenome, Fibrome, Lipome, Leinmyome, Mesotheliome, Teratome, Myxome und noduläre regenerative Hyperplasie.
Bösartige hepatische Tumore sind allgemein in zwei Kategorien unterteilt: primäre und sekundäre. Primäre Tumore entstehen direkt aus dem Gewebe, in dem sie vorzufinden sind. So stammt ein primärer Lebertumor ursprünglich aus den Zellen, die das Lebergewebe bilden (wie Hepatocyten und Gallenzellen). Repräsentative Beispiele für primäre hepatische Malignome, die durch arterielle Embolisierung behandelt werden können, umfassen hepatozelluläres Karzinom, Cholangiokarzinom, Angiosarkom, Cystadenokarzinom, Schwammzellkarzinom und Hepatoblastom.
Ein sekundärer Tumor oder eine Metastase ist ein Tumor, der anderswo im Körper entstand, sich aber anschließend bis zu einem entfernten Organ ausgebreitet hat. Die üblichen Metastasierungswege sind direktes Einwachsen in benachbarte Strukturen, Ausbreitung durch die Gefäß- oder Lymphsysteme und Mitführung entlang Gewebeebenen und Körperräumen (Peritonealflüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit, usw.). Sekundäre hepatische Tumore sind eine der häufigsten Todesursachen bei Krebspatienten und die bei weitestem häufigste Form eines Lebertumors. Obwohl nahezu jedes Malignom zur Leber hin metastasieren kann, umfassen die Tumore, deren Ausbreitung in die Leber am wahrscheinlichsten ist: Magen-, Darm- und Pankreaskrebs; Melanome; Tumore der Lunge, des Oropharynx und der Blase; Hodgkin- und Nicht-Hodgkin-Lymphom; Brust-, Eierstock- und Prostatatumore. Jeder der oben erwähnten primären Tumore hat zahlreiche unterschiedliche Tumorarten, die mittels arterieller Embolisierung behandelt werden können (beispielsweise soll es, ohne Einschränkung, über 32 unterschiedliche Arten von Eierstockkrebs geben).
Wie oben erwähnt, kann die Embolisierungstherapie unter Verwendung der Zusammensetzungen aus bioaktivem therapeutischem Faktor, Transfektionsmittel und Mikrosphäre gemäß der vorliegenden Erfindung auch in verschiedenen anderen klinischen Situationen zur Anwendung kommen, in denen es erwünscht ist, Blutgefäße zu okkludieren. Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann eine arteriovenöse Missbildung durch Verabreichung einer der oben beschriebenen Zusammensetzungen aus bioaktivem therapeutischem Faktor, Transfektionsmittel und Mikrosphäre behandelt werden. Kurz gesagt beziehen sich arteriovenöse Missbildungen (vaskuläre Missbildungen) auf eine Gruppe von Erkrankungen, bei denen mindestens eine (und, besonders typisch, viele) anormale Kommunikation(en) zwischen Arterien und Venen erfolgen, die zu einer lokalen, tumorartigen Masse führen, welche vorwiegend aus Blutgefäßen besteht. Eine solche Erkrankung kann entweder angeboren oder erworben sein.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann eine arteriovenöse Missbildung behandelt werden, indem ein Katheter über die Femoral- oder Brachialarterie eingeführt und fluoroskopisch geführt bis in die Versorgungsarterie vorgeschoben wird. Der Katheter wird vorzugsweise so weit wie nötig vorgeschoben, um eine vollständige Blockierung der Blutgefäße, welche die vaskuläre Missbildung versorgen, zu ermöglichen, dabei aber gleichzeitig möglichst viele der Arterienverzweigungen zu schonen, die normale Strukturen versorgen (idealerweise handelt es sich dabei um eine einzelne Arterie, meist müssen jedoch möglicherweise mehrere separate Arterien okkludiert werden, was vom Ausmaß der vaskulären Missbildung und ihrer jeweiligen Blutversorgung abhängt). Sobald die gewünschte Katheterposition erreicht ist, kann jede Arterie unter Verwendung der Zusammensetzung aus bioaktivem therapeutischem Faktor, Transfektionsmittel und Mikrosphäre gemäß der vorliegenden Erfindung embolisiert werden.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung kann eine Embolisierung zur Behandlung von Zuständen mit übermäßigen Blutungen bewerkstelligt werden. Beispielsweise kann Menorrhagie (übermäßige Menstruationsblutung) ohne weiteres durch Embolisierung von Uterusarterien behandelt werden. Kurz gesagt sind die Uterusarterien Verzweigungen der bilateralen internen Iliacalarterien. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann ein Katheter über die Femoral- oder Brachialarterie eingeführt und in jede Uterusarterie vorgeschoben werden, wobei er fluoroskopisch geführt durch das Arteriensystem gelenkt wird. Der Katheter sollte so weit wie nötig vorgeschoben werden, um eine vollständige Blockierung der Blutgefäße des Uterus zu ermöglichen, dabei aber gleichzeitig möglichst viele Arterienverzweigungen zu schonen, die aus der Uterusarterie hervorgehen und normale Strukturen versorgen. Idealerweise kann eine einzige Uterusarterie auf jeder Seite embolisiert werden, aber gelegentlich müssen abhängig von der jeweiligen Blutversorgung möglicherweise mehrere separate Arterien blockiert werden. Sobald die gewünschte Katheterposition erreicht ist, kann jede Arterie mittels Verabreichung der Zusammensetzungen aus bioaktivem therapeutischem Faktor, Transfektionsmittel und Mikrosphäre embolisiert werden, wie dies oben beschrieben wurde.
In gleicher Weise kann eine arterielle Embolisierung bei verschiedenen anderen Zuständen erreicht werden, wie z. B., ohne Einschränkung, bei akuter Blutung, vaskulären Anormalitäten, Störungen des Zentralnervensystems und Hypersplenismus.
4.10.1 Aktive Embolisierung mit Gentherapie
Wie oben erwähnt, kann eine Embolisierungstherapie unter Verwendung der Zusammensetzungen aus bioaktivem therapeutischem Faktor, Transfektionsmittel und Mikrosphäre gemäß der vorliegenden Erfindung auch in verschiedenen anderen klinischen Situationen angewandt werden, in denen es erwünscht ist, gleichzeitig Blutgefäße zu okkludieren und einem Patienten, der die benötigt, eine Gentherapie zu verabreichen.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, umfassend (a) einen bioaktiven therapeutischen Faktor, (b) einen polymeren Träger und (c) ein Transfektionsmittel.
Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, umfassend (a) ein Polynukleotid, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, (b) einen polymeren Träger und (c) ein Transfektionsmittel.
Gemäß einem besonders bevorzugten Aspekt der Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, umfassend (a) ein Polynukleotid, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, (b) eine kationische, vernetzte Mikrosphäre und (c) ein Lipopolyamin-Transfektionsmittel.
Unter diesem besonders bevorzugten Aspekt der Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, umfassend (a) ein Polynukleotid, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, (b) eine kationische, vernetzte Mikrosphäre und (c) ein Lipopolyamin-Transfektionsmittel, wobei das Polynukleotid RNA und DNA natürlichen oder synthetischen Ursprungs umfasst, einschließlich rekombinanter RNA und DNA und Antisense-RNA und -DNA; Hammerkopf-RNA, Ribozyme, antigener Nukleinsäuren, einsträngiger und doppelsträngiger RNA und DNA und Analoga davon; wobei der bioaktive therapeutische Faktor antineoplastische Mittel, Hormone und Steroide, Vitamine, Peptide und Peptidanaloga, Antikörper oder Fragmente davon, Impfstoffe, Enzyme, antiallergene Mittel, zirkulatorische Arzneimittel, antituberkulöse Mittel, antivirale Mittel, antianginale Mittel, antiprotozoische Mittel, antirheumatische Mittel, Narkotika, Herz-Glycosidmittel, Sedativa, Lokalanästhetika und Allgemeinanästhetika umfasst; wobei die kationischen, vernetzten Mikrosphären basieren auf nicht-toxischen, biokompatiblen, quellbaren oder nicht-quellbaren, im Wesentlichen kugelförmigen, hydrophilen, inerten, ionischen vernetzten Polymeren einer Größe, die ausreicht, um den bioaktiven therapeutischen Faktor zu embolisieren und freizusetzen, und wobei die kationischen, vernetzten Mikrosphären vorzugsweise Polymere sind, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Natriumacrylatpolymer, Acrylamid- und Acrylamidderivat-Polymeren, Natriumacrylat-Vinylalkohol-Copolymer, Verseifungsprodukten von Copolymer aus Vinylacetat und Acrylsäureester, Vinylacetat-Acrylsäureester-Copolymer, Vinylacetat-Methylmaleat-Copolymer, vernetztem Isobutylen-Maleinanhydrid-Copolymer, Starke-Acrylnitril-Pfropfcopolymer und dessen Verseifungsprodukten, vernetztem Natriumpolyacrylatpolymer und vernetztem Polyethylenoxid; und wobei die bevorzugten Beispiele für geeignete Transfektionsmittel, ohne Einschränkung, umfassen: Lipopolyamine und Polyethylenimin (PEI). Besonders bevorzugte Transfektionsmittel der vorliegenden Erfindung umfassen Lipopolyamine der allgemeinen Formel (I), wie sie offenbart sind in US-Patent 5,171,678 , erteilt an Behr, et al., am 15. Dezember 1992, US-Patent 5,476,962 , erteilt an Behr, et al., am 19. Dezember 1995, und US-Patent 5,616,745 , erteilt an Behr, et al., am 1. April 1997.
Gemäß den bevorzugten und besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die hier offenbart sind, wird der bioaktive therapeutische Faktor physikalisch mit dem Transfektionsmittel assoziiert, um einen Komplex zu bilden, und der Komplex aus bioaktivem therapeutischem Faktor und Transfektionsmittel wird, dann physikalisch mit dem polymeren Träger assoziiert. Der bioaktive therapeutische Faktor wird vorzugsweise mittels Assoziationskräften adsorbiert, die in der Flüssigadsorptionschromatographie hinlänglich bekannt sind, einschließlich solcher Assoziationskräfte, wie (ohne Einschränkung) Ionenaustausch, Hydrophobizität, Molekülerkennung oder Kombinationen daraus. Der gewählte bioaktive therapeutische Faktor wird mit dem Transfektionsmittel vermischt, und das Transfektionsmittel verleiht dem bioaktiven therapeutischen Faktor/Transfektionsmittel spezifische Eigenschaften, wie erhöhte Hydrophobizität. Die Mikrosphäre, die das Embolisierungsmaterial (z. B. Embosphere^®) umfasst, wird mit einer ausreichenden Menge eines transfizierbaren, bioaktiven therapeutischen Faktors vermischt, wobei die physikalische Assoziation zwischen dem transfizierbaren, bioaktiven therapeutischen Faktor und dem embolischen Material von ionischen und hydrophoben Assoziationen herrührt, die durch Zugabe von Salzen, wie z. B. (ohne Einschränkung) Natriumchlorid, weiter verstärkt werden können.
Gemäß den bevorzugten und besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die hier offenbart sind, werden die Komplexe aus bioaktivem therapeutischem Faktor/Transfektionsmittel, die an der Oberfläche des embolischen Materials adsorbiert oder mit dieser assoziiert sind, fortschreitend desorbiert und durch verschiedene Mechanismen, wie z. B. (ohne Einschränkung), spontane Endocytose, Rezeptor-vermittelte Endocytose, Endosomolyse und Zellmembrandestabilisierung oder Kombinationen daraus in die umgebenden Zellen abgegeben. Die Desorption des bioaktiven therapeutischen Faktors wird durch natürliche Komponenten biologischer Flüssigkeiten induziert, die dazu dienen, die Adsorptionsstärke zwischen dem embolischen Material und dem bioaktiven therapeutischen Faktor zu schwachen, bis dessen völlige Desorption erreicht ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren bereitgestellt zum Embolisieren von Blutgefäßen bei tumorigenen, Angiogenese-abhängigen Erkrankungen, umfassend die Abgabe einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die ein Polynukleotid umfasst, welches einen mit einem Transfektionsmittel assoziierten, bioaktiven Faktor codiert, an das Gefäß eines Patienten, der dies benötigt, wobei das Polynukleotid, das einen mit einem Transfektionsmittel assoziierten, bioaktiven Faktor codiert, ferner mit einer Mikrosphäre assoziiert ist, so dass das Blutgefäß wirksam okkludiert und die tumorigene, Angiogenese-abhängige Erkrankung gelindert wird.
4.11 Diagnostische Bildgebung
Wie oben erörtert, kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung aus bioaktivem therapeutischem Faktor, Transfektionsmittel und Mikrosphären in Verbindung mit diagnostischer Bildgebung, therapeutischer Bildgebung und therapeutischer Arzneimittelabgabe eingesetzt werden, wie z. B. Ultraschall (US), Magnetresonanzbildgebung (I), Kernmagnetresonanz (NMR), Computertomographie (CT), Elektronenspinresonanz (ESR), nuklearer medizinischer Bildgebung, optischer Bildgebung, Elastographie, Arzneimittelabgabe mit Ultraschall-, Hochfrequenz (RF)- und Mikrowellenlaser. Die Abgabevehikel und Stabilisierungsmaterialien der vorliegenden Erfindung können in Kombination mit verschiedenen Kontrastmitteln verwendet werden, einschließlich herkömmlicher Kontrastmittel, die dazu dienen können, ihre Wirksamkeit als Kontrastmittel für die diagnostische und therapeutische Bildgebung zu verbessern.
Beispiele für geeignete Kontrastmittel zur Verwendung in Kombination mit den vorliegenden stabilisierenden Materialien umfassen z. B. stabile freie Radikale, wie stabile Nitroxide, sowie Verbindungen, umfassend Übergangs-, Lanthanid- und Actinidelemente, die auf Wunsch in Form eines Salzes vorliegen oder kovalent oder nicht-kovalent an komplexbildende Mittel, einschließlich lipophiler Derivate davon, oder an proteinhaltige Makromoleküle gebunden sein können. Bevorzugte Übergangs-, Lanthanid- und Actinidelemente umfassen beispielsweise Gd(III), Mn(II), Cu(II), Cr(III), Fe(II), Fe(III), Co(II), Er(II), Ni(II), Eu(III) und Dy(III). Noch bevorzugter können die Elemente Gd(III), Mn(II), Cu(II), Fe(II), Fe(III), Eu(III) und Dy(III), besonders bevorzugt Mn(II) und Gd(III) sein. Die vorstehenden Elemente können in Form eines Salzes, einschließlich anorganischer Salze, wie ein Mangansalz, z. B. Manganchlorid, Mangancarbonat, Manganacetat, und organischer Salze, wie Mangangluconat und Manganhydroxylapatit, vorliegen. Andere beispielhafte Salze umfassen Eisensalze, wie Eisensulfide, und Eisen(II)-Salze, wie Eisen(II)-chlorid.
Die obigen Elemente können auch, z. B. durch kovalente oder nicht-kovalente Assoziation, an komplexbildende Mittel, einschließlich lipophiler Derivate davon, oder an proteinhaltige Makromoleküle gebunden sein. Bevorzugte komplexbildende Mittel umfassen z. B. Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N',N'''-tetraessigsäure (DOTA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'-triessigsäure (DOTA), 3,6,9-Triaza-12-oxa-3,6,9-tricarboxymethylen-10-carboxy-13-phenyltridecansäure (B-19036), Hydroxybenzyl-ethylendiamindiessigsäure (HBED), N,N'-Bis(pyridoxyl-5-phosphat)ethylendiamin, N,N'-Diacetat (DPDP), 1,4,7-Triazacyclononan-N,N',N''-triessigsäure (NOTA), 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (TETA), Kryptanden (makrozyklische Komplexe), und Desferrioxamin. Noch bevorzugter sind die komplexbildenden Mittel EDTA, DTPA, DOTA, DO3A und Kryptande, besonders bevorzugt DTPA. Bevorzugte lipophile Komplexe umfassen alkylierte Derivate der komplexbildenden Mittel EDTA, DOTA, z. B. N,N'-Bis-(carboxydecylamidomethyl-N-2,3-dihydroxypropyl)ethylendiamin-N,N'-diacetat (EDTA-DDP); N,N'-Bis-(carboxyoctadecylamidomethyl-N-2,3-dihydroxypropyl)-ethylendiamin-N,N'-diacetat (EDTA-ODP), und N,N'-Bis(carboxylaurylamidomethyl-N-2,3-dihydroxypropyl)ethylendiamin-N,N'-diacetat (EDTA-LDP), einschließlich derjenigen, die in US-Pat. Nr. 5,312,617 beschrieben sind, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit hier aufgenommen wird. Bevorzugte proteinhaltige Makromoleküle umfassen z. B. Albumin, Collagen, Polyarginin, Polylysin, Polyhistidin, γ-Globulin und β-Globulin, wobei Albumin, Polyarginin, Polylysin und Polyhistidin bevorzugter sind. Geeignete Komplexe umfassen, daher Mn(II)-DTPA, Mn(II)-EDTA, Mn(II)-DOTA, Mn(II)-DO3A, Mn(II)-Kryptanden, Gd(III)-DTPA, Gd(III)-DOTA, Gd(III)-DO3A, Gd(III)-Kryptanden, Cr(III)-EDTA, Cu(II)-EDTA oder Eisendesferrioxamin, noch bevorzugter Mn(II)-DTPA oder Gd(III)-DTPA.
Nitroxide sind paramagnetische Kontrastmittel, welche sowohl die T1- als auch die T2-Relaxationsraten bei der MRI durch das Vorliegen eines ungepaarten Elektrons im Nitroxidmolekül erhöhen. Wie dem Durchschnittsfachmann bekannt ist, lässt sich die paramagnetische Wirksamkeit einer gegebenen Verbindung als MRI-Kontrastmittel zumindest teilweise zur Anzahl ungepaarter Elektronen im paramagnetischen Kern oder Molekül und insbesondere zum Quadrat der Anzahl ungepaarter Elektronen in Beziehung setzen. Beispielsweise weist Gadolinium sieben ungepaarte Elektronen auf, während ein Nitroxidmolekül ein ungepaartes Elektron hat. Somit ist Gadolinium allgemein ein deutlich stärkeres MRI-Kontrastmittel als ein Nitroxid. Jedoch verleiht die effektive Korrelationszeit, ein weiterer wichtiger Parameter zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Kontrastmittels, den Nitroxiden ein potentiell erhöhtes Relaxationsvermögen. Wenn die Taumelrate verlangsamt wird, beispielsweise durch Binden des paramagnetischen Kontrastmittels an ein großes Molekül, taumelt es langsamer und überträgt dadurch wirksamer Energie, was die Relaxation der Wasserprotonen beschleunigt. Bei Gadolinium ist die Elektronensein-Relaxationszeit jedoch kurz und begrenzt das Maß, in dem langsame Rotationskorrelationszeiten das Relaxationsvermögen erhöhen können. Bei Nitroxiden sind die Elektronenspin-Korrelationszeiten jedoch günstiger, und enorme Steigerungen des Relaxationsvermögens können durch Verlangsamen der Rotationskorrelationszeit dieser Moleküle erreicht werden. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie oder einen bestimmten Vorgang festlegen zu wollen, wird in Betracht gezogen, dass die resultierenden Korrelationszeiten optimiert werden können, da die Nitroxide zur Umfangsbeschichtung der Mikrosphären ausgelegt sein können, z. B. durch Herstellung von Alkylderivaten derselben. Darüber hinaus ist das resultierende Kontrastmittel der vorliegenden Erfindung als magnetische Sphäre zu sehen, also als eine geometrische Konfiguration, die das Relaxationsvermögen maximiert.
Beispielhafte superparamagnetische Kontrastmittel, die zur Verwendung in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Metalloxide und -sulfide, die eine magnetische Domäne aufweisen, ferro- oder ferrimagnetische Verbindungen, wie reines Eisen, magnetisches Eisenoxid, wie Magnetit, γ-Fe₂O₃, Fe₃O₄, Manganferrit, Cobaltferrit und Nickelferrit. Eine MR-Ganzkörperabbildung kann dann eingesetzt werden, um den Körper rasch zu untersuchen, z. B. auf Thrombose, und gewünschtenfalls kann Ultraschall angewandt werden, um eine Thrombolyse zu unterstützen.
Die Kontrastmittel, wie die oben beschriebenen paramagnetischen und superparamagnetischen Kontrastmittel, können als Komponente innerhalb der Mikrosphären und/oder als stabiliserende Materialien eingesetzt werden. Im Hinblick auf Vesikel können die Kontrastmittel in deren innerem Hohlraum eingeschlossen sein, als Lösung mit den Mikrosphären verabreicht werden, in zusätzliche stabilisierende Materialien aufgenommen oder auf die Oberfläche oder Membran des Vesikels aufgebracht werden. Gemische eines oder mehrerer der paramagnetischen Mittel und/oder superparamagnetischen Mittel können in den vorliegenden Zusammensetzungen verwendet werden. Die paramagnetischen und superparamagnetischen Mittel können auf Wunsch auch separat gleichzeitig verabreicht werden.
Auf Wunsch können die paramagnetischen oder superparamagnetischen Mittel als alkylierte oder andere Derivate abgegeben werden, die in die Zusammensetzungen, insbesondere die Lipidwände der Mikrosphären, aufgenommen sind. Insbesondere können die Nitroxide 2,2,5,5-Tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy, freies Radikal, und 2,2,6,6-Tetramethyl-1-piperidinyloxy, freies Radikal, Addukte mit langkettigen Fettsäuren an den Positionen des Rings, die nicht von den Methylgruppen besetzt sind, über verschiedene Bindungen, wie z. B. eine Acetyloxybindung, bilden. Solche Addukte sind sehr gut in die Zusammensetzungen aus bioaktivem therapeutischem Faktor, Transfektionsmittel und Mikrosphäre der vorliegenden Erfindung aufnehmbar.
Die stabilisierenden Materialien und/oder Mikrosphären der vorliegenden Erfindung, und insbesondere die Mikrosphären können nicht nur als wirksame Träger für die oben beschriebenen superparamagnetischen Mittel dienen, sondern auch den Effekt der Suszeptibilitätskontrastmittel verbessern. Superparamagnetische Kontrastmittel umfassen Metalloxide, insbesondere Eisenoxide, die aber Manganoxide umfassen, und Eisenoxide, die variable Mengen an Mangan, Cobalt und Nickel enthalten und eine magnetische Domäne aufweisen. Diese Mittel sind Nano- oder Mikrosphären und haben sehr hohe Massensuszeptibilitäten und transverse Relaxationsraten. Die größeren Teilchen, z. B. Teilchen mit Durchmessern von etwa 100 nm, haben ein deutlich höheres R₂-Relaxationsvermögen als das R₁-Relaxationsvermögen. Die kleineren Teilchen, z. B. Teilchen mit Durchmessern von etwa 10 bis etwa 15 nm, haben ein etwas geringeres R₂-Relaxationsvermögen, aber deutlich ausgewogenere R₁- und R₂-Werte. Deutlich kleinere Teilchen, z. B. monokristalline Eisenoxidteilchen mit Durchmessern von etwa 3 bis etwa 5 nm, haben ein geringeres R₂-Relaxationsvermögen, aber wohl die ausgewogensten R₁- und R₂-Relaxationsraten. Ferritin kann ebenfalls so formuliert werden, dass es einen Kern aus superparamagnetischem Eisen mit sehr hoher Relaxationsrate einkapselt.
Die Eisenoxide können einfach in die stabilisierenden Materialien und/oder Mikrosphären aufgenommen werden. Im Fall von aus Lipiden formulierten Mikrosphären können die Eisenoxide in die Wände der Mikrosphären aufgenommen werden, indem sie z. B. an die Oberflächen der Mikrosphären adsorbiert werden, oder im Inneren der Mikrosphären eingeschlossen werden.
4.12 Pharmazeutische Formulierungen
Therapeutische Formulierungen: Polynukleotidsalze: Die Verabreichung pharmazeutisch akzeptabler Salze der Polynukleotide, welche hier beschriebene, bioaktive therapeutische Faktoren codieren, liegt im Rahmen der Erfindung. Solche Salze können aus pharmazeutisch akzeptablen, nicht-toxischen Basen, einschließlich organischer und anorganischer Basen, hergestellt werden. Von anorganischen Basen abgeleitete Salze umfassen Natrium, Kalium, Lithium, Ammonium, Calcium, Magnesium und dergleichen. Von pharmazeutisch akzeptablen, organischen, nicht-toxischen Basen abgeleitete Salze umfassen Salze von primären, sekundären und tertiären Aminen, basischen Aminosäuren und dergleichen. Eine hilfreiche Erörterung pharmazeutischer Salze findet sich in S. M. Berge et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 66: 1–19 (1977).
Polynukleotide, die bioaktive therapeutische Faktoren codieren, welche mit einem geeigneten Transfektionsmittel der vorliegenden Erfindung, das mit einem zur Injektion geeigneten Mikroteilchen konjugiert ist, vermischt oder assoziiert sind, können in Einzeldosis-Ampullen oder in Mehrfachdosisbehältern hergestellt werden. Die Polynukleotide können in solchen Formen, wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder vorzugsweise wässrigen Vehikeln vorliegen. Alternativ dazu kann das Polynukleotidsalz in lyophilisierter Form zur Rekonstitution zum Abgabezeitpunkt mit einem geeigneten Vehikel, wie sterilem, pyrogenfreiem Wasser, vorliegen. Sowohl flüssige als auch lyophilisierte Formen, die zu rekonstituieren sind, umfassen Mittel, vorzugsweise Puffer, in Mengen, die notwendig sind, um den pH der injizierten Lösung entsprechend einzustellen. Für jedwede parenterale Verwendung, insbesondere wenn die Formulierung intravenös zu verabreichen ist, sollte die Gesamtkonzentration der gelösten Stoffe eingestellt werden, um das Präparat isotonisch, hypotonisch oder schwach hypertonisch zu machen. Nicht-ionische Materialen, wie Zucker, sind zum Einstellen der Tonizität bevorzugt, und Saccharose ist besonders bevorzugt. Jede dieser Formen kann ferner geeignete Formulierungsmittel, wie Stärke oder Zucker, Glycerin oder Kochsalzlösung, umfassen. Die Zusammensetzungen können pro Einzeldosis, sei es in flüssiger oder in fester Form, 0,1% bis 99% Polynukleotidmaterial enthalten.
Die Einzeldosis-Ampullen oder die Mehrfachdosisbehälter, in welchen die Polynukleotide, die bioaktive therapeutische Faktoren codieren, welche vermischt oder assoziiert sind mit einem geeigneten Transfektionsmittel der vorliegenden Erfindung, das mit einem Mikroteilchen konjugiert ist, vor der Verwendung verpackt sind, können einen hermetisch dicht verschlossenen Behälter umfassen, der Polynukleotide, die bioaktive therapeutische Faktoren codieren, welche vermischt oder assoziiert sind mit einem Transfektionsmittel der vorliegenden Erfindung, das mit einem Mikroteilchen konjugiert ist, oder eine Lösung, enthaltend Polynukleotide, die bioaktive therapeutische Faktoren codieren, welche vermischt oder assoziiert sind mit einem geeigneten Transfektionsmittel der vorliegenden Erfindung, das an ein Mikroteilchen konjugiert ist, in einer Menge, die für eine pharmazeutisch wirksame Dosis davon geeignet ist, oder das Mehrfache einer wirksamen Dosis enthält. Die Polynukleotide, die bioaktive therapeutische Faktoren, vermischt oder assoziiert mit einem geeigneten Transfektionsmittel der vorliegenden Erfindung, konjugiert an ein Mikroteilchen, codieren, sind als sterile Formulierung verpackt, und der hermetisch dicht verschlossene Behälter soll die Sterilität der Formulierung bis zur Verwendung bewahren.
Der Behälter, in dem die Polynukleotide, die bioaktive therapeutische Faktoren, vermischt oder assoziiert mit einem geeigneten Transfektionsmittel der vorliegenden Erfindung konjugiert an ein Mikroteilchen, codieren, verpackt sind, ist etikettiert, und das Etikett trägt einen Hinweis in der von einer Regierungsbehörde, beispielsweise der Food and Drug Administration (amerikanische Arzneimittelzulassungsbehörde), vorgeschriebenen Form, wobei dieser Hinweis die Genehmigung durch die Behörde gemäß Bundesrecht zur Herstellung, Verwendung oder zum Vertrieb der Polynukleotide, die bioaktive therapeutische Faktoren, vermischt oder assoziiert mit einem geeigneten Transfektionsmittel der vorliegenden Erfindung, konjugiert an ein Mikroteilchen darin, codieren, zur Verabreichung an Menschen widerspiegelt. Nach Bundesrecht ist es erforderlich, dass die Verwendung von pharmazeutischen Mitteln zur Therapie von Menschen durch eine Behörde der Bundesregierung genehmigt wird. Die Verantwortung für die Durchsetzung liegt bei der Food and Drug Administration, die entsprechende Verordnungen zum Sicherstellen einer solchen Genehmigung ausgibt, welche in 21 U. S. C. 301–392 im Detail angegeben sind. Die Verordnung für biologisches Material, umfassend Produkte, die aus Geweben von Tieren hergestellt sind, ist in 42 U. S. C § 262 geregelt. Eine ähnliche Genehmigung ist in den meisten anderen Ländern erforderlich. Die Verordnungen unterscheiden sich von Land zu Land, aber die jeweiligen Verfahren sind dem Fachmann hinlänglich bekannt.
Dosierung und Verabreichungsweg: Die zu verabreichende Dosis hängt in hohem Maße von Zustand und Größe des zu behandelnden Subjektes sowie von der Behandlungshäufigkeit und dem Verabreichungsweg ab. Plane für eine Dauerbehandlung, einschließlich Dosis und Häufigkeit, können sich nach dem anfänglichen Ansprechen und der klinischen Beurteilung richten. Der parenterale Injektionsweg in den Zwischenraum von Geweben ist bevorzugt, obwohl auch andere parenterale Wege, wie das Inhalieren einer Aerosolformulierung, bei einer spezifischen Verabreichung erforderlich sein können, wie z. B. an die Schleimhäute der Nase, des Rachens, der Bronchialgewebe oder der Lungen. Bei bevorzugten Protokollen wird eine Formulierung, umfassend das Polynukleotid, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, vermischt oder assoziiert mit einem geeigneten Transfektionsmittel der vorliegenden Erfindung, konjugiert mit einem Mikroteilchen in einem wässrigen Träger, in Gewebe in Mengen von 10 μl pro Stelle bis etwa 1 ml pro Stelle injiziert. Die Konzentration an Polynukleotid, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, in der Formulierung beträgt etwa 0,1 μg/ml bis etwa 20 mg/ml.
Bevorzugte Formulierungen zur Transfektion von Polynukleotiden und Peptiden in Zellen umfassen kationische Lipopolyamin-Transfektionsmittel der Erfindung, mit oder ohne eine wirksame, transfektionsfördernde Menge eines Lysophosphatids. Das Lysophosphatid kann eine neutrale oder eine negative Kopfgruppe aufweisen. Lysophosphatidylcholin und Lysophosphatidylethanolamin sind bevorzugt, wobei 1-Oleoyllysophosphatidylcholin besonders bevorzugt ist. Lysophosphatidlipide sind in der Formulierung vorteilhafterweise in einem Molverhältnis von Lysolipid zu kationischem Lipid von 0,5 vorhanden. Lysoformen von kationischen Lipiden, ausgewählt unter den neuen kationischen Lipiden der Erfindung, DOTMA oder DOTAP, können ebenfalls verwendet werden, um die Wirksamkeit der Transfektion zu erhöhen. Diese Lysoformen sind vorteilhafterweise in wirksamen Mengen von bis zu etwa einem Drittel des gesamten kationischen Lipids in den Mikrosphärenformulierungen der vorliegenden Erfindung vorhanden.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine Mikrosphärenzusammensetzung bereitgestellt, umfassend ein kationisches Lipid der Erfindung, wobei das kationische Lipid als Transfektionsmittel aufgenommen ist, das mit der Zusammensetzung des bioaktiven therapeutischen Faktors assoziiert ist. Die Lipide der Mikrosphärenzusammensetzung können ferner eine neutrale Lipidspezies, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Sphingomyelin oder Cholesterin, umfassen. Ein bevorzugtes Molverhältnis von kationischer zu neutraler Lipidspezies in diesen Mikrosphärenformulierungen beträgt etwa 9/1 bis 1/9; ein Molverhältnis von etwa 5/5 ist besonders bevorzugt. Die Mikrosphärenformulierung kann ferner ein Lysolipid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lysophosphatidylcholin, Lysophosphatidylethanolamin, oder eine Lysoform einer kationischen Lipidspezies umfassen.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung werden pharmazeutische Produkte bereitgestellt, umfassend die Mikrosphären, die mit einem bioaktiven therapeutischen Faktor mittels irgendeines der hier offenbarten kationischen oder amphiphilen Lipide, konjugiert sind, zusammen mit einer pharmakologisch wirksamen Menge eines zusätzlichen therapeutischen Mittels, wie eines therapeutischen Arzneimittels. Die kationischen oder amphiphilen Lipide, die in diesen Zusammensetzungen vorliegen, erleichtern die intrazelluläre Abgabe der bioaktiven therapeutischen Faktoren und/oder des zusätzlichen aktiven therapeutischen Mittels. Die Produkte sind zur topischen, enteralen und parenteralen Verwendung vorgesehen. Bei einem pharmazeutischen Produkt ist das zusätzliche therapeutische Mittel als nicht einschränkendes Beispiel ein Steroid; bei anderen ist das therapeutische Mittel als nicht einschränkendes Beispiel ein nichtsteroidales, entzündungshemmendes Mittel.
In anderen pharmazeutischen Produkten der Erfindung ist das zusätzliche therapeutische Mittel ein antivirales Nukleosidanalog oder vorzugsweise ein Lipidderivat eines antiviralen Nukleosidanalogs, bei dem es sich um ein Phosphatidylderivat oder ein Diphosphatdiglyceridderivat handelt. Das antivirale Nukleosid kann ein Dideoxynukleosid, ein Didehydronukleosid, ein halogeniertes oder Azido-Derivat eines Nukleosids oder ein azyklisches Nukleosid sein. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Lipidderivate antiviraler Nukleoside (3'-Azido-3'-deoxy)thymidin-5'-diphospho-3-diacylglycerin (AZT-Diphosphatdiglycerid) und Dideoxythymidindiphosphatdiglycerid. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das Lipidderivat eines antiviralen Nukleosids ein Acyclovir- oder Gancyclovirdiphosphatdiglycerid- oder Diphosphatdiglycerid-Derivat von 1-(2-Deoxy-2'-fluor-1-.beta.-D-arabinofuranosyl)-5-iodocytosin (FIAC) oder 1(2'-Deoxy-2'-fluor-1-.beta.-D-arabinofuranosyl)5-iodouracil (FIAU).
4.13 Kits
Die Erfindung bezieht sich ferner auf pharmazeutische Packungen und Kits, umfassend einen oder mehrere Behälter, gefüllt mit einem oder mehreren Bestandteilen der zuvor erwähnten Zusammensetzungen der Erfindung. An (einem) solchen Behälter(n) kann ein Hinweis in der von einer Regierungsbehörde vorgeschriebenen Form angebracht sein, der Herstellung, Verwendung oder Vertrieb pharmazeutischer oder biologischer Produkte regelt und die behördliche Genehmigung für Herstellung, Verwendung oder Vertrieb des Produktes zur Verabreichung an Menschen widerspiegelt. Auch die Reagenzien irgendeines der hier beschriebenen Assays oder Verfahren können als Komponenten eines Kits enthalten sein.
In einem Kit-Format sind die kommerziell erhältlichen Perlen oder Mikroteilchen der vorliegenden Erfindung vorhanden in einer flüssigen, physiologisch kompatiblen Lösung mit einem Transfektionsmittel und einem Polynukleotid, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, wobei alle drei Komponenten in einem einzigen Fläschchen vorliegen. In einem weiteren Kit-Format kann ein kommerziell erhältliches Mikroteilchen der vorliegenden Erfindung in einem Fläschchen verfügbar sein. Das Polynukleotid, das den bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, der mit einem Transfektionsmittel der vorliegenden Erfindung assoziiert ist, kann in einem anderen Fläschchen vorliegen, in dem das Mikroteilchen dann mit dem Polynukleotid-Transfektionsmittel-Komplex zusammengemischt wird. Schließlich sind bei einem weiteren Kit-Format kommerziell erhältliche Perlen oder Mikrosphären der vorliegenden Erfindung in einer flüssigen, physiologisch kompatiblen Lösung in einem Fläschchen vorhanden. Das kommerziell erhältliche Transfektionsmittel kann in einem anderen, separaten Fläschchen vorliegen. Das Polynukleotid, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor der vorliegenden Erfindung codiert, kann wiederum in einem weiteren Fläschchen vorliegen. Die drei Komponenten aus den separaten Fläschchen können dann vereinigt werden, um das Mikroteilchen-Polynukleotid zu bilden, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, welcher mit einem Transfektionsmittel der Erfindung assoziiert ist.
In noch einem weiteren Kit-Format liegen Perlen oder Mikroteilchen der vorliegenden Erfindung in einer flüssigen, physiologisch kompatiblen Lösung mit Polynukleotid vor, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, der mit einem Transfektionsmittel assoziiert ist, welches mit einem Transfektions-verstärkenden Mittel kombiniert ist. In wiederum einem weiteren Kit-Format liegen Perlen oder Mikroteilchen der vorliegenden Erfindung in einer flüssigen, physiologisch kompatiblen Lösung mit einem Polynukleotid vor, das einen bioaktiven therapeutischen Faktor codiert, der mit einem Transfektionsmittel assoziiert ist, welches mit einem Enhancer für die Absorption des bioaktiven therapeutischen Mittels kombiniert ist.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung gegeben.
5. BEISPIELE
BEISPIEL 1
In einem Becher, enthaltend 100 ml entmineralisiertes Wasser, sind 58 g Natriumchlorid und 27 g Natriumacetat gelöst. Dazu werden 400 ml Glycerin gegeben, und dann wird der pH zwischen 5,9 und 6,1 eingestellt. Anschließend werden 90 g N-Tris-hydroxymethylmethylacrylamid, 35 mg Diethylaminoethylacrylamid und 10 g N,N-Methylen-bis-acrylamid zugegeben. Dies wird bei 60–70°C erwärmt und mit 100 mo einer warmen 300 mg/ml Gelatinelösung versetzt. Das Gesamtvolumen des Gemisches wird mittels Zugabe von warmem Wasser bei 980 ml eingestellt, und dann werden 20 ml einer 70 mg/ml Ammoniumpersulfat-Lösung und 4 ml N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin zugegeben.
Diese Lösung wird bei 50–70°C unter Rühren in Paraffinöl gegossen. Nach mehreren Minuten manifestiert sich die Polymerisationsreaktion der Acrylmonomere durch einen Temperaturanstieg. Die Mikrosphären werden dann durch Dekantieren gewonnen, vorsichtig gewaschen, gesiebt und in einem Autoklaven in gepuffertem Medium sterilisiert.
Nach Siebkalibrierung besitzen diese Mikrosphären die für die Embolisierung erwünschten Merkmale, wie eine deutliche kationische Ladung und ein wirksames Adhäsionsmittel (Gelatine oder denaturiertes Collagen).
BEISPIEL 2
Die Vorgehensweise des Beispiels 1 wird befolgt, wobei Triethylaminoethylacrylamid statt Diethylaminoethylacrylamid verwendet wird. Nach Gewinnung der Sphären wird die Gelatine mittels einer 25%igen Glutaraldehydlösung vernetzt (100 ml aller Mikrosphären). Die Behandlung wird unter Rühren bei 4°C über Nacht durchgeführt. Darauf folgt Waschen mit entmineralisiertem Wasser.
BEISPIELE 3 UND 4
Die Vorgehensweise der Beispiele 1 und 2 wird befolgt, wobei die 10 g N-Tris-hydroxymethylmethylacrylamid durch 10 g Acrylsäure ersetzt werden. Die erhaltenen Mikrosphären besitzen eine hohe Quellbarkeit, die durch Salz- und Ionenkonzentration sowie den pH-Wert steuerbar ist. Diese Mikrosphären sind vorteilhafterweise zum Zeitpunkt der Handhabung für den Benutzer direkt sichtbar einsetzbar.
BEISPIELE 5 und 6
Die Vorgehensweise der Beispiele 1 und 2 wird befolgt, wobei N-tris-Hydroxymethylmethylacrylamid durch 10 g N-Acryloylhexamethylen-Procion Red HE-3B ersetzt wird. Die erhaltenen Mikrosphären besitzen aufgrund der Integration des acrylischen Farbstoffes in das Polymergitter eine intensive Rotfärbung. Diese Mikrosphären sind vorteilhafterweise zum Zeitpunkt der Handhabung für den Benutzer direkt sichtbar einsetzbar.
BEISPIELE 7 UND 8
Einhundert Milliliter der gemäß den Beispielen 1 bis 4 erhaltenen Mikrosphären werden mit 0,1 M Boratpuffer mit pH 8 gewaschen und dann in 50 ml einer 5 mg/ml Rhodaminisothiocyanatlösung suspendiert. Die Suspension wird dann mindestens 15 Stunden gerührt und anschließend mit einem neutralen Puffer zu einem farblosen Überstand gewaschen.
Diese fluoreszierenden, rot gefärbten Mikrosphären werden dann kalibriert und sterilisiert und können in der Embolisierungsgentherapie verwendet werden.
BEISPIELE 9 UND 10
Die Vorgehensweise der Beispiele 1 bis 4 wird befolgt, wobei die 10 g N-Tris-hydroxymethylmethylacrylamid durch 10 g eines für Röntgenstrahlen undurchlässigen Monomers, (Acrylamido-3-propionamido)-3-triiod-2,4,6-benzoesäure, ersetzt werden.
Die erhaltenen Mikrosphären besitzen die Eigenschaft, dass sie Röntgenstrahlen absorbieren, und sind daher von besonderem Interesse bei ihrer in vivo-Nachverfolgung nach Verwendung in der Embolisierungsgentherapie.
BEISPIELE 11 BIS 14
Die Vorgehensweise der Beispiele 1 bis 2 wird befolgt, wobei zur anfänglichen Monomerlösung 5 g eines strahlenundurchlässigen, löslichen geradkettigen Polymers, Acrylamino-3-triiod-2,4,6-benzoepolysäure (Beispiele 11 und 12) oder (Acrylamino-3-propionamido)-3-triiod-2,4,6-benzoepolysäure (Beispiele 13 und 14), gegeben werden.
Diese Polymere mit einem Molekulargewicht von mehr als 100.000 Dalton sind im Polymergitter eingeschlossen und ermöglichen es, ohne die allgemeinen Eigenschaften der Mikrosphären für die beanspruchten Anwendungen zu stören, eine Strahlenundurchlässigkeit zu erhalten, die für die in vivo-Nachverfolgung der Embolisierungsgentherapie nutzbar ist.
BEISPIELE 15 UND 16
Die Vorgehensweise der Beispiele 1 und 2 wird befolgt, wobei zu der anfänglichen Monomerlösung 200 g Bariumsulfatpulver gegeben werden. Die erhaltenen Mikrosphären sind sowohl für sichtbares Licht als auch für Röntgenstrahlen undurchlässig.
BEISPIELE 17 UND 18
Die Vorgehensweise der Beispiele 1 und 2 wird befolgt, wobei 50 mg Magnetit (Fe₃O₄) zu der anfänglichen Monomerlösung gegeben werden.
Die erhaltenen Mikrosphären haben die Eigenschaft, dass sie bei der Magnetresonanzbildgebung (MRI) detektiert werden.
BEISPIEL 21
HERSTELLUNG EINER INJIZIERBAREN SUSPENSION ZUR VERWENDUNG IN DER EMBOLISIERUNGSGENTHERAPIE
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst die Verwendung der Mikrosphären aus den oben beschriebenen Beispielen 1–20 und ferner das Vermischen der Mikrosphäre mit einem Polynukleotid, das für das p53-Gen codiert, gesteuert durch einen geeigneten Promoter, wobei das Polynukleotid mit einem Transfektionsmittel, wie Transfectam^® (Biosphere Medical), assoziiert ist. Solche Mikrosphäre/P53-Gen/Transfectam^®-Zusammensetzungen sind nützlich für die arteriolare Embolisierung und Linderung sowie die anschließende Eliminierung verschiedener Krebsarten, wie z. B. Krebs-, Nieren- und Pankreaskrebs.
BEISPIEL 22
HERSTELLUNG EINER INJIZIERBAREN SUSPENSION ZUR VERWENDUNG IN DER KOMBINIERTEN EMBOLISISERUNGSGENTHERAPIE UND ANTI-ANGIOGENESETHERAPIE
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst die Verwendung der Mikrosphären aus den oben beschriebenen Beispielen 1–20 und ferner das Vermischen der Mikrosphäre mit einem Anti-Angiogenesemittel, das von einem Polynukleotid (gesteuert durch einen geeigneten Promoter) codiert wird, wobei das Polynukleotid mit einem Transfektionsmittel, wie Transfectam^® (Biosphere Medical), assoziiert ist. Solche Mikrosphäre/Anti- Angiogenesemittel/Transfectam^®-Zusammensetzungen sind nützlich für die kombinierte arteriolare Embolisierung einer Krebsart und die anschließende Prävention von Angiogenese zur Linderung und anschließenden Eliminierung verschiedener Krebsarten, wie z. B. Prostatakrebs.
Die oben beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sollen lediglich als Beispiel dienen, und der Fachmann wird mittels lediglich routinemäßiger Experimente zahlreiche Äquivalente zu den hier beschriebenen, spezifischen Vorgehensweisen erkennen oder bestimmen können. Alle diese Äquivalente werden als in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung fallend betrachtet und sind durch die die nachfolgenden Ansprüche erfasst.

Claims

Verwendung einer im Wesentlichen kugelförmigen Mikrosphäre, die zur aktiven Embolisierung geeignet ist, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Angiogenese-abhängigen Erkrankung durch Embolisierung, wobei die Mikrosphäre umfasst: (a) ein biokompatibles und hydrophiles Polymer enthaltend ein Acrylamid, Acrylat oder acrylisches Polymer, und (b) ein Arzneimittel oder Vakzin, und wobei der Durchmesser der Mikrosphäre in einem Bereich von 10 μm bis 2000 μm liegt.
Die Verwendung, wie sie in Anspruch 1 beansprucht ist, wobei das Polymer ein Natriumacrylat-Polymer, Acrylamid-Derivat-Copolymer, Natriumacrylat und Vinylalkohol Copolymer, Vinylacetat und Acrylsäureester Copolymer, vernetztes Natriumpolyacrylatpolymer ist.
Die Verwendung, wie sie in einem der vorstehenden Ansprüche beansprucht ist, wobei das Polymer vernetzt ist.
Die Verwendung, wie sie in einem der vorstehenden Ansprüche beansprucht ist, wobei das Polymer ein Natriumacrylat und Vinylalkohol Copolymer ist.
Die Verwendung, wie sie in einem der vorstehenden Ansprüche beansprucht ist, wobei das Arzneimittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Anti-Tumor-Arzneimitteln, Anti-Angiogenese-Arzneimitteln, antifungalen Arzneimitteln, antiviralen Arzneimitteln, anti-inflammatorischen Arzneimitteln, antibakteriellen Arzneimitteln, anti-histaminischen Arzneimitteln, antineoplastischen Arzneimitteln, Enzymen, Antiallergikum.
Die Verwendung, wie sie in einem der vorstehenden Ansprüche beansprucht ist, wobei das Arzneimittel ein antineoplastisches bzw. anti-Krebs-Arzneimittel ist.
Die Verwendung, wie sie in Anspruch 6 beansprucht ist, wobei das antineoplastische Arzneimittel ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus einer Platinverbindung, Adriamycin, Mitomycin C, Ansamitocin, Bleomycin, Cytosinarabinosid, Arabinosyladenine, Mercaptopolylysin, Vincristin, Busulfan, Chlorambucil, Melphalan, Mercaptopurin, Mitotan, Procarbazin, Dactinomycin, Daunorubicin-Hydrochlorid, Doxorubicin, Plicamycin, Aminoglutethimid, Estramustin, Flutamid, Leuprolide, Megestrol, Tamoxifen, Testolacton, Trilostan, Amsacrin, Asparaginase, Asparaginase Erwinia, Etoposid, Interferon α-2a, Interferon α-2b, Teniposid, Vinblastin, Methotrexat, Carzelesin, Gewebe-Plasminogenaktivator, Dexamethason and Paclitaxel.
Die Verwendung, wie sie in Anspruch 7 beansprucht ist, wobei die Platinverbindung Spiroplatin, Cisplatin oder Carboplatin ist.
Die Verwendung, wie sie in Anspruch 7 beansprucht ist, wobei Melphalan PAM, L-PAM oder Phenylalanin-Mustard ist.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 beansprucht ist, wobei das Arzneimittel Paclitaxel, Cisplatin, Mitomycin C, Tamoxifen oder Doxorubicin ist.
Die Verwenduung, wie sie in irgendeinem der vorstehenden Ansprüche beansprucht ist, wobei das Arzneimittel auf die Mikrosphäre beschichtet ist oder innerhalb der Mikrosphäre enthalten ist.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der vorstehenden Ansprüche beansprucht ist, wobei das Arzneimittel durch die Mikrosphäre adsorbiert ist.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der vorstehenden Ansprüche beansprucht ist, wobei das Vakzin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pneumokokkenvakzin, Poliovakzin, Anthraxvakzin, Tuberkulose (BCG)-Vakzin, Hepatitis-A-Vakzin, Choleravakzin, Meningokokken A, C, Y Vakzine, W135-Vakzin, Pestvakzin, Tollwut (Human-Diploid)-Vakzin, Gelbfiebervakzin, Japanencephalitisvakzin, Typhusvakzin (Phenol- und Hitzeabgetötet), Hepatitis-B-Vakzin, Diphterievakzin, Tetanusvakzin, Keuchhustenvakzin, H. influenzae Typ B Vakzin, Poliovakzin, Masernvakzin, Mumpsvakzin, Rubellavakzin, Varizellenvakzin, Streptokokkus pneumoniae Ty (Lebendmutante) Vakzin, Vi (Vi-Kapselpolysaccharid) Vakzin, DT (Toxoid) Vakzin, Td (Toxoid) Vakzin, aP (inaktives bakterielles Antigen/azelluläres (DtaP)) Vakzin, Hib (bakterielles Polysaccharid-Protein-Kojugat) Vakzin, Hepatitis-B-Virus Vakzin (inaktiviertes Serum-abgeleitetes virales Antigen/rekombinantes Antigen), Grippevakzin, RSV ("respiratory syncytial virus") Vakzin, Humanastrovirusvakzin, Rotavirusvakzin, Humaninfluenza A- und B-Virus-Vakzin, Hepatitis-A-Virus-Vakzin, Parainfluenzavirus Typ 3 attenuiertes Lebendvakzin, Enterovirusvakzine, Retrovirusvakzine, und Picovirusvakzine.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der vorstehenden Ansprüche beansprucht ist, welche außerdem ein bildgebendes Mittel oder ein Kontrastmittel umfasst.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der vorstehenden Ansprüche beansprucht wird, welche außerdem einen Fluoreszenzmarker, einen chemischen Farbstoff, oder ein Magnetresonanzbildgebungsmittel umfasst.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der vorstehenden Ansprüche beansprucht wird, wobei das Polymer 0,5% bis 20%, gemessen am Molekulargewicht, Vernetzungsmittel umfasst.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der vorstehenden Ansprüche beansprucht ist, wobei der Durchmesser der Mikrosphären im Bereich von 50 μm bis 300 μm, 40 μm bis 400 μm, 50 μm bis 200 μm oder 70 μm bis 120 μm liegt.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der vorstehenden Ansprüche beansprucht wird, wobei die Mikrosphären vor der Injektion in einen Patienten schwellen oder wobei die Mikrosphären nach der Injektion in einen Patienten weiter schwellen.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der vorstehenden Ansprüche beansprucht wird, wobei das embolische Material injizierbar ist und die Mikrosphären und einen biokompatiblen Trägerstoff umfasst.
Die Verwendung, wie sie in Anspruch 19 beansprucht wird, wobei das embolische Material die Mikrosphären in einer Menge von 10 bis 90 Gew.-% und den biokompatiblen Trägerstoff in einer Menge von 10 bis 90 Gew.-% umfasst, bevorzugt wobei das embolische Material die Mikrosphären in einer Menge von 10 bis 50 Gew.-% und den biokompatiblen Trägerstoff in einer Menge von 50 bis 90 Gew.-% umfasst.
Die Verwendung, wie sie in einem der Ansprüche 19 bis 20 beansprucht wird, wobei die Mikrospären in dem biokompatiblen Trägerstoff suspendiert sind.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der Ansprüche 19 bis 21 beansprucht wird, wobei der biokompatible Trägerstoff (a) eine Emulsion; (b) eine organische Lösung; (c) eine nicht-wässrige Lösung; (d) eine wasserbasierte Lösung; (e) eine hydro-organische Lösung; oder (f) Gemische daraus ist/sind.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der Ansprüche 19 bis 22 beansprucht wird, wobei der biokompatible Trägerstoff Salze umfasst, die aus Kationen zusammengesetzt sind, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus Natrium, Kalium, Kalzium, Magnesium, Eisen, Zink und Ammonium, in einer Menge von 0,01 bis 5 M, wobei das Salz bevorzugt in Form eines Kontrastmittels bereitgestellt wird.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der Ansprüche 14 oder 19 bis 23, wobei das Kontrastmittel monomere (Acrylamido-3-propionamido)-3-triiod-2,4,6-benzoesäure ist.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der vorstehenden Ansprüche beansprucht wird, wobei die Mikrosphäre außerdem einen zielgebenden Antikörper umfasst.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der vorstehenden Ansprüche beansprucht wird, wobei das Arzneimittel in einen Bereich eines Patienten, der dies benötigt, zu injizieren ist.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der vorstehenden Ansprüche beansprucht wird, wobei die Angiogenese-abhängige Erkrankung Krebs oder ein Tumor ist.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der vorstehenden Ansprüche beansprucht ist, wobei der Krebs ein Leberkrebs, Eierstockkrebs, Nierenkrebs, Pankreaskrebs, Prostatakrebs, Hautkrebs, Blasenkrebs, Kopftumor, Halstumor, Brusttumor, Kaposi-Sarkom, akute lymphoblastische Leukämie, akute myeloide Leukämie, Ewing-Sarcom, gestationsbedingtes Trophoblastcarcinom, Hodgkin's Syndrom, non-Hodgkin-Lymphom, Burkitt-Lymphom, diffuses großzelliges Lymphom, follikuläres gemischtes Lymphom, lymphoblastisches Lymphom, Rhabdomyosarkom, Hodencarcinom, Wilm's-Tumor, Analcarcinom, Blasencarcinom, Brustcarcinom, chronische lymphozytische Leukämie, chronische myelogene Leukämie, Haarzellleukämie, Kopf-und-Hals-Carcinom, kleinzelliges Lungencarcinom, multiples Myelom, Follikellymphom, Eierstockcarcinom, Hirntumore, Astrocytom, Cervixcarcinom, Colorectalcarcinom, primäres Leberzellkarzinom, nicht-kleinzelliges Lungencarcinom, Melanom, Pankreascarcinom, Prostatacarcinom, Weichteilcarcinom, osteogenes Sarcom, Eierstockcarcinom Stufe III, Hypophysenadenom, Epithelkörperchenadenom, Nasopharynxtumor, Glomus jugulare- Tumor, Meningiom, Chemodectom, Vagusneurom, focale noduläre Hyperplasie, Gallengangadenom, Gallengangzystadenom, Fibrom, Lipom, Leiomyom, Mesotheliom, Teratom, Myxom, und noduläre regenerative Hyperplasie, Cholangiocarcinom, Angiosarcom, Cystadenocarcinom, Schwammzellcarcinom, Hepatoblastom.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der vorstehenden Ansprüche beansprucht wird, wobei die Angiogenese-abhängige Erkrankung ein Leberkrebs ist.
Die Verwendung, wie sie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 27 beansprucht wird, wobei die Angiogenese-abhängige Erkrankung eine nicht-tumorigene Angiogenese-abhängige Erkrankung ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus hypertrophen Narben, hypertrophen Keloiden, proliferative diabetische Retinopathie, rheumatoide Arthritis, arteriovenöse Missbildungen, atherosclerotische Plaques, verzögerte Wundheilung, Blutergelenken, nonunion-Frakturen, Osier-Weber Syndrom, Psoriasis, Granuloma pediculatum, Sclerodermie, Trachom, Menorrhagie, vasculäre Adhäsionen.
Kugelförmige Mikrosphäre, geeignet zur aktiven Embolisierung, umfassend: (a) ein Polymer enthaltend Acrylamid oder Acrylat, oder ein acrylisches Polymer; und (b) ein Arzneimittel und/oder ein Vakzin, wobei das Arzneimittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus anti-neoplastischen Arzneimitteln, anti-Angiogenese-Arzneimitteln, antifungalen Arzneimitteln, antiviralen Arzneimitteln, und Kombinationen daraus; wobei der Durchmesser der Mikrosphäre in einem Bereich von 10 bis 2000, oder von 50 bis 300 μm, oder von 40 bis 400 μm, oder von 50 bis 200 μm, oder von 70 bis 120 μm liegt.
Die Mikrosphäre nach Anspruch 31, weiterhin umfassend ein oder mehrere oder alle der Merkmale, die in Ansprüchen 2–4, 6–18, oder 25–30.
Die Mikrosphäre nach Anspruch 31 oder 32, wobei die in Form einer injizierbaren Zusammensetzung vorliegt, umfassend einen biocompatiblen Trägerstoff.
Kit umfassend die Mikrosphäre nach einem der Ansprüche 31 bis 32.
Die Mikrosphäre nach einem der Ansprüche 31 bis 34, wobei die Mikrosphre Polymere umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natriumacrylatpolymer, Natriumacrylat- und Vinylalkoholpolymer, Vinylacetat- und Acrylsäureester-Copolymer, vernetztes Natriumpolyacrylatpolymer, oder einer Kombination daraus.
Mikrosphäre nach Anspruch 31 bis 33, oder die Verwendung nach Ansprüchen 1 bis 30 oder der Kit nach Anspruch 34 bis 36, wobei die Mikrosphäre quellbar ist.